CH679672A5 - - Google Patents
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- CH679672A5 CH679672A5 CH3435/89A CH343589A CH679672A5 CH 679672 A5 CH679672 A5 CH 679672A5 CH 3435/89 A CH3435/89 A CH 3435/89A CH 343589 A CH343589 A CH 343589A CH 679672 A5 CH679672 A5 CH 679672A5
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Description
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CH 679 672 A5 CH 679 672 A5
Description Description
La présente invention concerne un procédé de synthèse peptidique en phase solide. The present invention relates to a solid phase peptide synthesis process.
Les abréviations utilisées ci-après sont conformes aux recommandations de 1983 de la Commission Conjointe à la Nomenclature Biochimique de l'IUPAC-IUB, comme cela est indiqué dans Eur. J. Biochem, 138, 9-37 (1984). Les abréviations suivantes sont également utilisées: The abbreviations used below are in accordance with the 1983 recommendations of the Joint Commission on the Biochemical Nomenclature of IUPAC-IUB, as indicated in Eur. J. Biochem, 138, 9-37 (1984). The following abbreviations are also used:
TFA acide trifluoroacétique DCM dichlorométhane DMF diméthylformamide NMP N-méthylpyrrolidine DMAc diméthylacétamide TFA trifluoroacetic acid DCM dichloromethane DMF dimethylformamide NMP N-methylpyrrolidine DMAc dimethylacetamide
En l'absence d'indication expresse, les acides aminés et leurs restes sont de série L: par exemple Ala = L-alanine, mais DAla = D-alanine. Le terme (meth)acrylique est utilisé pour indiquer soit acrylique ou méthacryiique. In the absence of an express indication, the amino acids and their residues are of series L: for example Ala = L-alanine, but DAla = D-alanine. The term (meth) acrylic is used to indicate either acrylic or methacryic.
Les méthodes habituelles de synthèse peptidique en phase solide comprennent la séquence d'opérations suivantes: The usual methods of peptide synthesis in solid phase include the following sequence of operations:
1. - Déprotection du groupement Boc; 1. - Deprotection of the Boc group;
2. - Lavages; 2. - Washes;
3. - Neutralisation du NH2 en position a; 3. - Neutralization of NH2 in position a;
4. - Lavages; 4. - Washes;
5. - Couplages et, 5. - Couplings and,
6. - Lavages. 6. - Washes.
Les étapes de la déprotection et de la neutralisation sont réalisées en traitant le peptide-résine avec des solutions de TFA et de diisopropyléthylamine dans le DCM. Ce même solvant est également utilisé lors des lavages intermédiaires. Quelle que soit la technique utilisée (anhydride symétrique, dicyclo-hexylcarbodiimide, hydroxybenzotriazole, etc.) le couplage est réalisé, soit dans le DCM, soit dans le DMF. The deprotection and neutralization steps are carried out by treating the peptide-resin with solutions of TFA and diisopropylethylamine in DCM. This same solvent is also used during intermediate washes. Whatever the technique used (symmetrical anhydride, dicyclohexylcarbodiimide, hydroxybenzotriazole, etc.) the coupling is carried out either in DCM or in DMF.
En conséquence, la synthèse peptidique en phase solide nécessite l'utilisation d'importantes quantités de solvants et de réactifs relativement onéreux tels que le TFA, si bien que le coût d'un peptide est directement lié à celui du DCM, NMP, DMF, DMAc et du TFA utilisés dans la synthèse. Consequently, solid phase peptide synthesis requires the use of large quantities of relatively expensive solvents and reagents such as TFA, so that the cost of a peptide is directly linked to that of DCM, NMP, DMF, DMAc and TFA used in the synthesis.
Il serait donc particulièrement intéressant de trouver des solvants et réactifs moins coûteux afin d'abaisser de manière significative le coût de fabrication des peptides. It would therefore be particularly advantageous to find less expensive solvents and reagents in order to significantly lower the cost of manufacturing the peptides.
Le Brevet Europeén No. 0 079 842 décrit des résines polyacryliques qui sont des copolymères des trois monomères définis comme suit: European Patent No. 0 079 842 describes polyacrylic resins which are copolymers of the three monomers defined as follows:
(i) un premier monomère constituant la matrice du copolymère et choisi parmi les corps suivants: (i) a first monomer constituting the matrix of the copolymer and chosen from the following bodies:
(meth)acryloyl-l -Pyrrolidine, (meth) acryloyl-1 -Pyrrolidine,
(meth)acryloyM -pipéridine, (meth) acryloyM -piperidine,
(meth)acryloyl-l -perhydroazépine, (meth) acryloyl-l -perhydroazepine,
(meth)acryloyl-1-méthyI-4-pipérazine, (meth) acryloyl-1-methyI-4-piperazine,
(meth)acryloyl-4-morpholine, (meth) acryloyl-4-morpholine,
N,N-diméthyl-(meth)acrylamide et N,N-diéthyl-(meth)acrylamide N, N-dimethyl- (meth) acrylamide and N, N-diethyl- (meth) acrylamide
(ii) un second monomère constituant l'agent de réticulation du copolymère et choisi parmi les corps suivants: (ii) a second monomer constituting the crosslinking agent for the copolymer and chosen from the following bodies:
N,N'-di(meth)acryloyl-diamino-1,2-méthane et N,N'-di(meth)acryioyl-diamino-1,2-éthane, et N, N'-di (meth) acryloyl-diamino-1,2-methane and N, N'-di (meth) acryioyl-diamino-1,2-ethane, and
(iii) un troisième monomère activant le copolymère et choisi parmi les acides suivants: (iii) a third monomer activating the copolymer and chosen from the following acids:
acide (meth)acrylamido-2 acétique, (meth) acrylamido-2 acetic acid,
acide (meth)acrylamido-3 propionique, (meth) acrylamido-3-propionic acid,
acide (meth)acrylamido-4 butyrique acide (meth)acrylamido-6 hexanoique, (meth) acrylamido-4 butyric acid (meth) acrylamido-6 hexanoic acid,
N-(meth)acryloyl-L-alanine, N- (meth) acryloyl-L-alanine,
N-(meth)acryloyl-L-valine, N- (meth) acryloyl-L-valine,
N-(meth)acryloyl-L-leucine, N- (meth) acryloyl-L-leucine,
N-(meth)acryloyl-L-phénylalanine, N- (meth) acryloyl-L-phenylalanine,
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CH 679 672 A5 CH 679 672 A5
N-(meth)acryloyl-L-tyrosine, N- (meth) acryloyl-L-tyrosine,
N-(meth)acryloyl-L-méthionine, N- (meth) acryloyl-L-methionine,
N-(meth)acryloyl-L-lysine, et N- (meth) acryloyl-L-lysine, and
N-(meth)acryloyl-L-proline ou l'ester méthylique d'un de ces acides. N- (meth) acryloyl-L-proline or the methyl ester of one of these acids.
Ces copolymères ont des groupements carboxy ou méthoxy-carboniques libres provenant du troisième monomère. Le Brevet Européen No. 81 408 décrit d'autres résines polyacryliques dans lesquelles ces groupements sont amidifiés avec de l'éthylène diamine. Il décrit également l'utilisation de ces autres résines polyacryliques lors de la synthèse peptidique en phase solide, mais seulement en relation avec les solvants coûteux utilisés en général avec les résines polystyrènes, comme cela est décrit ci-dessus. These copolymers have free carboxy or methoxy-carbonic groups originating from the third monomer. European Patent No. 81,408 describes other polyacrylic resins in which these groups are amidified with ethylene diamine. It also describes the use of these other polyacrylic resins during solid phase peptide synthesis, but only in relation to the expensive solvents generally used with polystyrene resins, as described above.
L'invention concerne une méthode pour la synthèse peptidique en phase solide, cette méthode comprenant la fixation d'un premier reste d'acide aminé à une résine polyacrylique, le couplage d'un ou de plusieurs autres restes d'acides aminés pour obtenir le peptide voulu et la séparation du peptide de la résine, caractérisée en ce que le protocole de couplage englobe des étapes de lavage de la résine dans l'eau et/ou dans une solution aqueuse. The invention relates to a method for peptide synthesis in solid phase, this method comprising the attachment of a first amino acid residue to a polyacrylic resin, the coupling of one or more other amino acid residues to obtain the desired peptide and the separation of the peptide from the resin, characterized in that the coupling protocol includes steps of washing the resin in water and / or in an aqueous solution.
La méthode de l'invention tire avantage des propriétés hydrophiles des résines polyacryliques à l'inverse des résines polystyrènes. Les résines polyacryliques utilisées dans le procédé de l'invention sont, de préférence, celles décrites dans les Brevets Européens No. 0 079 842 et 0 081 408. The method of the invention takes advantage of the hydrophilic properties of polyacrylic resins unlike polystyrene resins. The polyacrylic resins used in the process of the invention are preferably those described in European Patents Nos. 0 079 842 and 0 081 408.
Le premier reste d'acide aminé est fixé sur la matrice à l'aide du maillon glycolamidique (B. CALAS et al., Tetrahedron, 1985,41,5331). Les essais précédents avec d'autres restes labiles tels que: The first amino acid residue is attached to the matrix using the glycolamide link (B. CALAS et al., Tetrahedron, 1985,41,5331). Previous tests with other labile remains such as:
dans lesquels X = Br, Cl ou OH n'ont pas donné de résultats satisfaisants. in which X = Br, Cl or OH have not given satisfactory results.
La résine est alors lavée dans l'eau. L'acide aminé suivant de la séquence peptidique à construire est alors introduit de la manière suivante (applicable quand le groupement protégé est Boc): The resin is then washed in water. The following amino acid of the peptide sequence to be constructed is then introduced in the following manner (applicable when the protected group is Boc):
1. - Lavage: eau distillée - 2 à 4 fois 2 min; 1. - Washing: distilled water - 2 to 4 times 2 min;
2. - Déprotection : HCl (6N) en solution dans l'eau -1 fois 2 min puis une nouvelle fois 30 min; 2. - Deprotection: HCl (6N) in solution in water -1 time 2 min then again 30 min;
3. - Lavage: eau distillée - 4 à 6 fois 2 min; 3. - Washing: distilled water - 4 to 6 times 2 min;
4. - Neutralisation: 1 équivalent de tampon borate 12,5 mM pH 8,5-9,0 -1 fois, 1 à 2 min et une nouvelle fois 1 à 2 min; 4. - Neutralization: 1 equivalent of 12.5 mM borate buffer pH 8.5-9.0 -1 times, 1 to 2 min and once again 1 to 2 min;
5. - Lavage: eau distillée - 4 à 6 fois, 1 à 2 min; 5. - Washing: distilled water - 4 to 6 times, 1 to 2 min;
6. - Lavage: DMF - 2 fois, 1 à 2 min; 6. - Washing: DMF - 2 times, 1 to 2 min;
7. - Couplage: Anhydride symétrique (2 équivalents, 2 fois dans le DMF); 7. - Coupling: Symmetrical anhydride (2 equivalents, 2 times in the DMF);
8. - Lavage: DMF ou NMP - 2 fois, 2 min; et 8. - Washing: DMF or NMP - 2 times, 2 min; and
9. - Lavage: eau distillée - 4 fois, 2 min. 9. - Washing: distilled water - 4 times, 2 min.
La progression du couplage est suivie grâce aux tests à la ninhyndrine ou à la fluorescamine. Alternativement, quand le groupement protégé est Fmoc, le processus d'élongation est le suivant: The progress of the coupling is monitored using ninhyndrin or fluorescamine tests. Alternatively, when the protected group is Fmoc, the elongation process is as follows:
1. Lavage: eau distillée - 4 à 6 fois, 2 min; 1. Washing: distilled water - 4 to 6 times, 2 min;
2. Déprotection: pipéridine ou diéthylamine en solution dans l'eau; 2. Deprotection: piperidine or diethylamine in solution in water;
3. Lavage: isopropanol - 2 fois, 2 min; eau distillée - 4 à 6 fois, 2 min; 3. Washing: isopropanol - 2 times, 2 min; distilled water - 4 to 6 times, 2 min;
4. Lavage facultatif: DMF -1 fois, 2 min; 4. Optional washing: DMF -1 times, 2 min;
5. Couplage: anhydride symétrique - 3 fois en excès dans le DMF) et, 5. Coupling: symmetrical anhydride - 3 times in excess in the DMF) and,
6. Lavage: DMF (2 fois, 2 min); eau distillée - 6 fois, 2 minutes. 6. Washing: DMF (2 times, 2 min); distilled water - 6 times, 2 minutes.
Lorsque la synthèse est terminée, le peptide est séparé de la matrice par une coupure sélective de la liaison glycolamidique obtenue par l'un des traitements suivants: When the synthesis is complete, the peptide is separated from the matrix by selective cleavage of the glycolamide linkage obtained by one of the following treatments:
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- NaOH dans l'isopropanol, - NaOH in isopropanol,
- NH3 dans le trifluoroéthanol ou dans le méthanol ou dans l'éthanol ou dans l'isopropanol, - NH3 in trifluoroethanol or in methanol or in ethanol or in isopropanol,
- N2H4 dans le DMF et, - N2H4 in the DMF and,
- CH3OH dans le triéthylamine. - CH3OH in triethylamine.
Avec cette méthode, on obtient, par exemple, le peptide de Dorman (Leu Ala Gly Val) et des analogues du LHRH avec des rendements supérieurs à 50%. With this method, one obtains, for example, the Dorman peptide (Leu Ala Gly Val) and analogues of LHRH with yields greater than 50%.
L'invention sera mieux comprise grâce à la description des exemples qui suivent. The invention will be better understood from the description of the examples which follow.
EXEMPLE 1 EXAMPLE 1
DTrp6-LHRH : pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DTrp-Leu-Arg-Pro-Gly. DTrp6-LHRH: pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DTrp-Leu-Arg-Pro-Gly.
5 g d'une résine polyacrylique (0,55 mmol NHz/g) préparés par copolymérisation d'acryloylpyrroiidine- 5 g of a polyacrylic resin (0.55 mmol NHz / g) prepared by copolymerization of acryloylpyrroiidine-
1 de N,N'-diacryloyl diamino-1,2 éthane et d'acryl-2 amidoacétate de méthyle comme cela est décrit dans l'exemple 19 du Brevet Européen 0 079 842 sont traités de la manière suivante: 1 of N, N'-diacryloyl-1,2-diamino ethane and 2-acrylyl amidoacetate as described in Example 19 of European Patent 0 079 842 are treated as follows:
1. Lavages avec du DCM (4 fois, 2 min), 1. Washes with DCM (4 times, 2 min),
2. Neutralisation avec 5% de diisopropyléthylamine dans du DCM (2 fois, 2 min), 2. Neutralization with 5% diisopropylethylamine in DCM (2 times, 2 min),
3. Lavages avec du DCM (4 fois, 2 min). 3. Washes with DCM (4 times, 2 min).
On ajoute à la résine 4,29 g (0,0165 mol) d'anhydride bromoacétique en solution dans 50 ml de DCM. Après avoir laissé sous agitation pendant 45 min, la solution de DCM est filtrée et le support brome est lavé de la manière suivante: 4.29 g (0.0165 mol) of bromoacetic anhydride dissolved in 50 ml of DCM are added to the resin. After stirring for 45 min, the DCM solution is filtered and the bromine support is washed as follows:
1. DCM (4 fois, 2 min) 1. DCM (4 times, 2 min)
2. DMF (4 fois, 2 min). 2. DMF (4 times, 2 min).
On dissout du sel de césium de BocGIyOH (4,22 g, 0,0137 mol) préparé selon la méthode de Mery et al. (IntJ.Protein Peptide Res. 1988, 31,412) dans 75 ml de DMF et on ajoute cette solution à la résine. Le mélange est mis sous agitation pendant 2 jours à température ambiante. Le DMF est drainé et le polymère est lavé avec: Cesium salt of BocGIyOH (4.22 g, 0.0137 mol) prepared according to the method of Mery et al. (IntJ.Protein Peptide Res. 1988, 31,412) in 75 ml of DMF and this solution is added to the resin. The mixture is stirred for 2 days at room temperature. The DMF is drained and the polymer is washed with:
1. DMF (10 fois, 2 min), 1. DMF (10 times, 2 min),
2. Méthanol (4 fois, 2 min), 2. Methanol (4 times, 2 min),
3. DCM (4 fois, 2 min) 3. DCM (4 times, 2 min)
4. Ether éthylique (4 fois, 2 min). 4. Ethyl ether (4 times, 2 min).
La résine est séchée sous vide poussé en présence de pastilles KOH pendant 12 heures. Le total de Gly liés représente de 0,483 mmol/g; il est déterminé par l'analyse d'acides aminés après hydrolyse HCl 6N, dans des tubes scellés sous vide à 110°C pendant 24 heures. The resin is dried under high vacuum in the presence of KOH pellets for 12 hours. The total of Gly bound represents 0.483 mmol / g; it is determined by the analysis of amino acids after hydrolysis 6N HCl, in vacuum-sealed tubes at 110 ° C for 24 hours.
On lave la résine-BocGIy (4,47 g) avec de l'eau (4 fois, 2 min) et le groupement Boc est clivé par traitement HCl 6N en solution dans l'eau (2 fois, une fois 2 min et une autre fois 30 min). Le HCl est éliminé par filtration et la résine lavée à l'eau (6 fois, 2 min). Pour la neutralisation, on utilise du tampon borate (12,5 mmol, pH 9), la résine étant traitée 2 fois 1 min avec 50 ml du tampon. Après avoir lavé avec de l'eau (6 fois, 2 min) et du DMF (2 fois, 2 min), on ajoute à la résine l'anhydride symétrique de BocProOH en solution dans 50 ml de DMF. The resin-BocGIy (4.47 g) is washed with water (4 times, 2 min) and the Boc group is cleaved by treatment of 6N HCl in solution in water (2 times, once 2 min and one other time 30 min). The HCl is removed by filtration and the resin washed with water (6 times, 2 min). For neutralization, borate buffer (12.5 mmol, pH 9) is used, the resin being treated twice 1 min with 50 ml of the buffer. After washing with water (6 times, 2 min) and DMF (2 times, 2 min), the symmetrical anhydride of BocProOH dissolved in 50 ml of DMF is added to the resin.
La solution d'anhydride symétrique est préparée de la manière suivante: BocProOH (3,55 g, 0,0165 mol) dissous dans 40 ml de DMF, la solution est refroidie à 0°C et on ajoute du dicyclohexylcarbo-diimide (1,69 g, 8,25 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. Après avoir laissé sous agitation à 0°C pendant 30 min et filtration, la solution est évaporée sous vide poussé sans élévation de la température et le résidu est dissous dans du DMF et ensuite ajouté à la résine. Le mélange est mis sous agitation pendant 30 min après quoi on contrôle que, le test qualitatif à la ninhydrine de Kaiser et al. (Anal. Biochem.1970, 34.575) se révèle négatif - indiquant un rendement de couplage supérieur à 99,6% -. The symmetrical anhydride solution is prepared as follows: BocProOH (3.55 g, 0.0165 mol) dissolved in 40 ml of DMF, the solution is cooled to 0 ° C and dicyclohexylcarbo-diimide (1, 69 g, 8.25 mmol) in solution in 10 ml of DCM. After stirring at 0 ° C for 30 min and filtration, the solution is evaporated under high vacuum without raising the temperature and the residue is dissolved in DMF and then added to the resin. The mixture is stirred for 30 min after which it is checked that the qualitative ninhydrin test by Kaiser et al. (Anal. Biochem. 1970, 34.575) turns out to be negative - indicating a coupling efficiency greater than 99.6% -.
Le DMF est alors éliminé et le support est lavé deux fois avec du DMF (2 min) et de l'eau (4 fois, The DMF is then removed and the support is washed twice with DMF (2 min) and water (4 times,
2 min). 2 min).
Ce protocole est utilisé pour introduire les acides aminés suivants de la séquence DTrp6-LHRH. Pour préparer les anhydrides symétriques, on utilise: BocArg (Mts) OH (7,52 g, 0,0165 mol), BocLeuOH (4,11 g, 0,0165 mol), BocDTrpOH (5,02 g, 0,0165 mol), BocTyr (2,6 dichlorobenzyl)OH ou BocTyr (2,6 DCB)OH (7,26 g, 0,0165 mol), BocSer (Bzl)OH (4,86 g, 0,0165 mol), BocTrpOH (5,02 g, 0,0165 mol), Bo-cHis (Dinitrophényle)OH ou BocHis (Dnp)OH (6,94 g, 0,0165 mol), pyro-GluOH (2,13 g, 0,0165 mol). This protocol is used to introduce the following amino acids of the DTrp6-LHRH sequence. To prepare symmetrical anhydrides, the following are used: BocArg (Mts) OH (7.52 g, 0.0165 mol), BocLeuOH (4.11 g, 0.0165 mol), BocDTrpOH (5.02 g, 0.0165 mol ), BocTyr (2.6 dichlorobenzyl) OH or BocTyr (2.6 DCB) OH (7.26 g, 0.0165 mol), BocSer (Bzl) OH (4.86 g, 0.0165 mol), BocTrpOH ( 5.02 g, 0.0165 mol), Bo-cHis (Dinitrophenyl) OH or BocHis (Dnp) OH (6.94 g, 0.0165 mol), pyro-GluOH (2.13 g, 0.0165 mol) .
Après avoir incorporé du pyro-GluOH, la résine est lavée avec du méthanol (4 fois, 2 min), de l'éther éthylique (4 fois, 2 min) et est séchée sous vide poussé à température ambiante pendant 48 heures. After incorporating pyro-GluOH, the resin is washed with methanol (4 times, 2 min), ethyl ether (4 times, 2 min) and is dried under high vacuum at room temperature for 48 hours.
On traite alors le peptide-résine avec 10 ml de thiophénol en solution dans 50 ml de DMF pour séparer le groupement dinitrophényl sur la chaîne latérale histidine. The peptide-resin is then treated with 10 ml of thiophenol in solution in 50 ml of DMF to separate the dinitrophenyl group on the histidine side chain.
Après avoir laissé sous agitation pendant 45 min, la solution de thiophénol est drainée et la résine est After stirring for 45 min, the thiophenol solution is drained and the resin is
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CH 679 672 A5 CH 679 672 A5
lavée avec du DMF (4 fois, 2 min), du DCM (4 fois, 2 min) et avec de l'éther éthylique (4 fois, 2 min). La résine est séchée sous vide poussé pendant 12 heures. Elle est traitée 2 fois 30 min at 0°C avec 50 ml de la solution suivante préalablement refroidie: acide trifluorométhanesulfonique (3,6 ml), anisole (4 ml), thioanisole (4 ml), métacrésol (4 ml) et acide trifluoroacétique (40 ml). A la fin de la séquence de déprotection, on lave la résine avec du DCM (2 fois, 2 min), du DCM/DMF (50/50) (2 fois, 2 min), du diisopro-pyléthylamine en solution à 5% dans du DCM (2 fois, 1 min), du DMF (3 fois, 2 min), de l'isopropanol/eau (70/30) (3 fois, 2 min). Le peptide-résine est mis en suspension dans 250 ml d'une solution trifiuoroétha-nolique saturée en NH3. washed with DMF (4 times, 2 min), DCM (4 times, 2 min) and with ethyl ether (4 times, 2 min). The resin is dried under high vacuum for 12 hours. It is treated twice 30 min at 0 ° C. with 50 ml of the following solution, previously cooled: trifluoromethanesulfonic acid (3.6 ml), anisole (4 ml), thioanisole (4 ml), metacresol (4 ml) and trifluoroacetic acid (40 ml). At the end of the deprotection sequence, the resin is washed with DCM (2 times, 2 min), DCM / DMF (50/50) (2 times, 2 min), diisopro-pylethylamine in 5% solution in DCM (2 times, 1 min), DMF (3 times, 2 min), isopropanol / water (70/30) (3 times, 2 min). The peptide-resin is suspended in 250 ml of a trifiuoroétha-nolic solution saturated with NH3.
Après avoir laissé sous agitation le mélange à température ambiante pendant 15 heures, on sépare la solution trifluoroéthanolique contenant le DTrpS-LHRH déprotégé et on lave le support avec de l'eau (4 fois, 2 min), puis du méthanol (4 fois, 2 min) et une nouvelle fois avec de l'eau (6 fois, 2 min). Les filtrats sont rassemblés, le pH est porté à 4 environ avec de l'acide chlorhydrique 1N puis, ils sont concentrés sous vide sans élévation de la température. Le résidu est fractionné sur une colonne de carboxymé-thyle cellulose (Wathman CM 52,10 x 2 cm) ayant un gradient linéaire de NaCI (10 mM AcONa pH 5,0 à 10 mM AcONa, 0,15M NaCI pH 5,0). Les fractions appropriées sont rassemblées, lyophilisées et désalées par filtration du gel sur une colonne (100 x 2,5 cm) de Sephadex G10 dans 10 M HCl. La fraction peptidique est ensuite purifiée par traitement CLHP sur une colonne (270 x 20 mm) de Lichrosorb RP 18 (10 |im) avec 0,01% d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,01% en solution dans l'eau et de i'acétonitrile en tant qu'éluants. After stirring the mixture at room temperature for 15 hours, the trifluoroethanolic solution containing the deprotected DTrpS-LHRH is separated and the support is washed with water (4 times, 2 min), then methanol (4 times, 2 min) and again with water (6 times, 2 min). The filtrates are combined, the pH is brought to about 4 with 1N hydrochloric acid and then they are concentrated in vacuo without raising the temperature. The residue is fractionated on a carboxymethyl cellulose column (Wathman CM 52.10 x 2 cm) having a linear gradient of NaCI (10 mM AcONa pH 5.0 to 10 mM AcONa, 0.15M NaCI pH 5.0) . The appropriate fractions are combined, lyophilized and desalted by filtration of the gel on a column (100 x 2.5 cm) of Sephadex G10 in 10 M HCl. The peptide fraction is then purified by HPLC treatment on a column (270 × 20 mm) of Lichrosorb RP 18 (10 μm) with 0.01% trifluoroacetic acid (TFA) 0.01% in solution in water and acetonitrile as eluents.
Rendement: 51% (basé sur les groupements aminés du support initial). Yield: 51% (based on the amino groups of the initial support).
Analyse d'acides aminés: Glu 0,99 (1), Leu 1,0 (1), His 1,0 (1), Trp 1,89 (2), Ser0,96 (1), Tyr0,97 (1), Pro 0,99 (1), Gly 1,07(1). Amino acid analysis: Glu 0.99 (1), Leu 1.0 (1), His 1.0 (1), Trp 1.89 (2), Ser0.96 (1), Tyr0.97 (1 ), Pro 0.99 (1), Gly 1.07 (1).
Pour certains des acides aminés qui sont moins stables en milieu acide, les valeurs analytiques sont inférieurs à celles attendues en raison de leur dégradation. For some of the amino acids which are less stable in an acid medium, the analytical values are lower than those expected due to their degradation.
On utilise le même procédé pour la préparation des peptides suivants: The same process is used for the preparation of the following peptides:
- Peptide de Dorman: Leu Ala Giy ValOH Rendement = 46,6% - Dorman peptide: Leu Ala Giy ValOH Yield = 46.6%
Gly: 0,96, Ala = 0,94, Val = 1,05, Leu = 1,04 Gly: 0.96, Ala = 0.94, Val = 1.05, Leu = 1.04
- Laminine: Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 Rendement = 35,6% - Laminin: Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 Yield = 35.6%
Ser = 0,75, Gly = 1,03, Ile = 0,99, Tyr = 1, Arg = 0,99 Ser = 0.75, Gly = 1.03, Ile = 0.99, Tyr = 1, Arg = 0.99
- CDC 28 protéine kinose du cycle cellulaire de levure «Pombee» - CDC 28 protein kinose from the yeast cell cycle "Pombee"
Rendement = 44,1 % (peptide à l'état brut) Yield = 44.1% (unprocessed peptide)
Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH
Asp = 1, Gly = 1,08, Ala = 1, Leu = 1,05 x 2, Tyr = 0,99, Asp = 1, Gly = 1.08, Ala = 1, Leu = 1.05 x 2, Tyr = 0.99,
Arg = 0,99, Lys = 1, Pro = 1. Arg = 0.99, Lys = 1, Pro = 1.
- Tyrosine phosphatase - Tyrosine phosphatase
Rendement = 58,6% (peptide à l'état brut) Yield = 58.6% (peptide in the raw state)
Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH
Asp = 0,95 *3, Ser = 0,58 x3,Glu = 0,67,Ile = 1,1, Leu = 1,1. Asp = 0.95 * 3, Ser = 0.58 x3, Glu = 0.67, Ile = 1.1, Leu = 1.1.
- Oncogène: Phe Arg Gly Thr Leu Arg Rendement = 53,4% - Oncogene: Phe Arg Gly Thr Leu Arg Yield = 53.4%
Phe = 0,97, Arg = 2 x 1,1, Gly = 1,02,Thr = 0,99, Leu = 1. Phe = 0.97, Arg = 2 x 1.1, Gly = 1.02, Thr = 0.99, Leu = 1.
EXEMPLE 2 EXAMPLE 2
Leu-Ala-Gly-Val Leu-Ala-Gly-Val
On traite 1 g de la résine polyacrylique utilisée dans l'exemple 1 de la manière suivante: 1 g of the polyacrylic resin used in Example 1 is treated as follows:
1. Lavages avec du DCM (4 fois, 2 min), 1. Washes with DCM (4 times, 2 min),
2. Neutralisation avec 5% de diisopropyléthylamine dans du DCM, 2. Neutralization with 5% diisopropylethylamine in DCM,
3. Lavages avec du DCM (4 fois, 2 min). 3. Washes with DCM (4 times, 2 min).
On ajoute à la résine 0,858 g d'anhydride bromoacétique en solution dans 10 ml de DCM. Après avoir laissé sous agitation pendant 45 min, la solution de DCM est éliminée par filtration et le support bromé est lavé de la manière suivante: 0.858 g of bromoacetic anhydride dissolved in 10 ml of DCM is added to the resin. After stirring for 45 min, the DCM solution is removed by filtration and the brominated support is washed as follows:
1. DCM (4 fois, 2 min) 1. DCM (4 times, 2 min)
2. DMF (4 fois, 2 min) 2. DMF (4 times, 2 min)
5 5
5 5
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
CH 679 672 A5 CH 679 672 A5
On dissout du sel de césium de FmocValOH (1,29 g, 2,75 mmol) préparé selon la méthode de Meiy et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 1988, 31, 412) dans 15 ml de DMF et on ajoute cette solution à la résine. La suspension est mise sous agitation à température ambiante pendant 3 jours. Le DMF est ensuite drainé et le polymère est lavé avec: Cesium salt of FmocValOH (1.29 g, 2.75 mmol) prepared according to the method of Meiy et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 1988, 31, 412) in 15 ml of DMF and this solution is added to the resin. The suspension is stirred at room temperature for 3 days. The DMF is then drained and the polymer is washed with:
1. DMF (10 fois, 2 min) 1. DMF (10 times, 2 min)
2. Méthanol (4 fois, 2 min) 2. Methanol (4 times, 2 min)
3. DCM (4 fois, 2 min) 3. DCM (4 times, 2 min)
4. Ether italique (4 fois, 2 min) 4. Italic ether (4 times, 2 min)
La résine est séchée sous vide poussé en présence de paillettes de KOH pendant 12 heures. Le total de Val liés représente de 0,492 mmol/g; il est déterminé par l'analyse des acides aminés, après hydrolyse dans du HCL 6N dans des tubes scellés sous vide pendant 24 heures. The resin is dried under high vacuum in the presence of KOH flakes for 12 hours. The total of bound Val represents 0.492 mmol / g; it is determined by amino acid analysis, after hydrolysis in 6N HCL in sealed tubes under vacuum for 24 hours.
On lave la Résine-FmocVal (1,1 g) avec de l'eau (4 fois, 2 min) et le groupement Fmoc est clivé par traitement à la pipéridine ou à la diéthylamine (10%) en solution dans de l'eau (2 fois, 2 min). La résine est ensuite lavée avec de l'isopropanol (2 fois, 2 min) et avec de l'eau (4 fois, 2 min). The Resin-FmocVal (1.1 g) is washed with water (4 times, 2 min) and the Fmoc group is cleaved by treatment with piperidine or diethylamine (10%) in solution in water (2 times, 2 min). The resin is then washed with isopropanol (2 times, 2 min) and with water (4 times, 2 min).
On ajoute au support de l'anhydride symétrique de FmocGIyOH en solution dans 15 ml de DMF. La solution d'anhydride symétrique est préparée de la manière suivante: Symmetrical anhydride of FmocGIyOH dissolved in 15 ml of DMF is added to the support. The symmetrical anhydride solution is prepared as follows:
On dissout le FmocGIyOH (0,981 g, 3,3 mmol) dans 15 ml de DCM, la solution est refroidie à 0°C et on ajoute du dicyclohexylcarbodiimide (0,339 g, 1,65 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. Le mélange opaque obtenu est mis sous agitation pendant 20 min à 0°C et le précipité de dicyclohexylurée est éliminé par filtration. Le filtrat est concentré sous vide à température ambiante. Le résidu huileux est dissous dans 15 ml de DMF et la solution obtenue est ajoutée à la résine. Le mélange est mis sous agitation à température ambiante pendant 45 min après quoi on contrôle que Je test qualitatif à la ninhydrine de Kaiser et al. (Anal. Biochem. 1970, 34. 575) se révélé négatif. Le DMF est éliminé par filtration et le support est lavé avec du DMF (2 fois, 2 min) et ensuite avec de l'eau (6 fois, 2 min). The FmocGIyOH (0.981 g, 3.3 mmol) is dissolved in 15 ml of DCM, the solution is cooled to 0 ° C. and dicyclohexylcarbodiimide (0.339 g, 1.65 mmol) is added in solution in 10 ml of DCM. The opaque mixture obtained is stirred for 20 min at 0 ° C and the precipitate of dicyclohexylurea is removed by filtration. The filtrate is concentrated under vacuum at room temperature. The oily residue is dissolved in 15 ml of DMF and the solution obtained is added to the resin. The mixture is stirred at room temperature for 45 min after which it is checked that the qualitative ninhydrin test by Kaiser et al. (Anal. Biochem. 1970, 34, 575) is found to be negative. The DMF is removed by filtration and the support is washed with DMF (2 times, 2 min) and then with water (6 times, 2 min).
Ce protocole est utilisé pour introduire les acides aminés Leu et Ala. Les anhydrides symétriques sont préparées à partir de 1,16 g (3,3 mmol) de FmocLeuOH et 1,02 g (3,3 mmol) de FmocAlaOH. Après la synthèse, l'ensemble peptide-résine est lavé avec de l'isopropanol (4 fois, 2 min), avec de l'eau (4 fois, 2 min) et, enfin avec un mélange isopropanol/eau (70/30) (4 fois, 2 min). This protocol is used to introduce the amino acids Leu and Ala. The symmetrical anhydrides are prepared from 1.16 g (3.3 mmol) of FmocLeuOH and 1.02 g (3.3 mmol) of FmocAlaOH. After synthesis, the whole peptide-resin is washed with isopropanol (4 times, 2 min), with water (4 times, 2 min) and, finally with an isopropanol / water mixture (70/30 ) (4 times, 2 min).
Le peptide-résine est ensuite mis en suspension dans un mélange isopropanol/eau (70/30) auquel on ajoute 1,1 ml de NaOH 1N. Après avoir mis sous agitation le mélange à température ambiante pendant 5 heures, on sépare le mélange isopropanol-eau contenant le Leu-Ala-Gly-Val et on lave le support avec de l'eau (4 fois, 2 min), du méthanol (4 fois, 2 min) et avec de l'eau (4 fois, 2 min). Les filtrats sont rassemblés et le pH est porté à 4 avec du HCl 1N; la solution est concentrée sous vide à température ambiante. Le réside est purifié par traitement CLHP sur une colonne (250 x 20 mm) de Lichrosorb RP 18 (10 um) avec du TFA (0,1%) en solution dans l'eau et de l'acétonitrile comme éluants. The peptide-resin is then suspended in an isopropanol / water mixture (70/30) to which 1.1 ml of 1N NaOH is added. After stirring the mixture at room temperature for 5 hours, the isopropanol-water mixture containing the Leu-Ala-Gly-Val is separated and the support is washed with water (4 times, 2 min), methanol (4 times, 2 min) and with water (4 times, 2 min). The filtrates are combined and the pH is brought to 4 with 1N HCl; the solution is concentrated under vacuum at room temperature. The residue is purified by HPLC treatment on a column (250 × 20 mm) of Lichrosorb RP 18 (10 μm) with TFA (0.1%) in solution in water and acetonitrile as eluents.
Rendement: 54% (basé sur les groupements aminés du du support initial). Yield: 54% (based on amino groups of the initial support).
Analyse d'acides aminés: Leu 1,02 (1), Ala 0,99 (1), Gly 1,1 (1), Val 1,0 (1). Amino acid analysis: Leu 1.02 (1), Ala 0.99 (1), Gly 1.1 (1), Val 1.0 (1).
On utilise la même méthode pour la synthèse des peptides suivants: The same method is used for the synthesis of the following peptides:
- Peptide de Dorman: Leu Ala Gly ValOH Rendement = 46,6% - Dorman peptide: Leu Ala Gly ValOH Yield = 46.6%
Gly = 0,93, Ala = 0,91, Val = 1,01, Leu = 1. Gly = 0.93, Ala = 0.91, Val = 1.01, Leu = 1.
- Laminine: Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 Rendement = 46,3% - Laminin: Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 Yield = 46.3%
Ser = 0,79, Gly = 1,01, Ile = 0,96, Tyr = 0,89, Ser = 0.79, Gly = 1.01, Ile = 0.96, Tyr = 0.89,
Arg = 0,93 Arg = 0.93
- CDC 28 protéine kinase du cycle cellulaire de levure «Pombee». - CDC 28 protein kinase from the yeast cell cycle "Pombee".
Rendement = 48,6% (peptide à l'état brut) Yield = 48.6% (unprocessed peptide)
Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH
Asp = 0,97, Gly = 1,02, Ala = 0,98, Leu = 1,02 x 2, Asp = 0.97, Gly = 1.02, Ala = 0.98, Leu = 1.02 x 2,
Tyr = 0,98, Arg = 0,96, Lys = 1, Pro = 0,97. Tyr = 0.98, Arg = 0.96, Lys = 1, Pro = 0.97.
-Tyrosine phosphatase -Tyrosine phosphatase
Rendement = 61,6% (peptide à l'état brut) Yield = 61.6% (unprocessed peptide)
Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH
Asp = 0,99 x 3, Ser = 0,63 x 3, Glu = 0,73, Ile = 1,03, Leu = 1. Asp = 0.99 x 3, Ser = 0.63 x 3, Glu = 0.73, Ile = 1.03, Leu = 1.
- Oncogène: Phe Arg Gly Thr Leu Arg Rendement = 49,2% - Oncogene: Phe Arg Gly Thr Leu Arg Yield = 49.2%
Phe = 1, Arg = 2 x 1,04, Gly = 1, Thr = 0,96, Leu = 0,98. Phe = 1, Arg = 2 x 1.04, Gly = 1, Thr = 0.96, Leu = 0.98.
6 6
5 5
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PL | Patent ceased |