JPH07509141A - 細塵を含まない酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な酵素顆粒およびその製造方法に関する。

発明の背景 多くの商業的に有用な酵素は微生物、例えば細菌、酵母および真菌によって製造 される。これらの酵素は洗剤、澱粉および織物の加工、並びに飼料および食品へ の応用に特に有用である。

洗剤への応用に有用な酵素の例はプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびセ ルラーゼを含む。酵素は醗酵によって製造され、続いて回収、精製されさらに液 体として濃縮されるかまたは乾燥形とされる。適切な回収技術は濾過、遠心分離 、膜濾過、沈澱、結晶化、クロマトグラフィー、噴霧乾燥などを含む。

乾燥酵素、特に乾燥プロテアーゼ調製物に関連して生じる可能性がある皮膚科学 上および他の健康上の問題のために、そのような調製物の細塵レベルは可能な限 り低くなければならない。これを達成するために、乾燥酵素は通常顆粒形にされ るが、そのためにいくつかの顆粒化技術が開発された（例えば米国特許第４００ ９０７６号、４０１６０４０号、４０７８３６８号、４２４２２１９号など参照 ）。

酵素の細塵遊離をさらに減少させるために、さらに顆粒を保護するために、顆粒 の殆どを顆粒製造後に薄膜形成巨大分子物質で被覆する。

基本的には２種類の顆粒が区別される。第一の種類では、問題の化合物は顆粒中 に混合され、第二の種類では問題の化合物は顆粒の芯の回りに局在している。

後者の種類では、問題の化合物（例えば酵素）の芯表面の濃度は、化合物が顆粒 全体に混合されている場合の顆粒と比較して非常に高いことは明らかであろう。

結果として、被覆が不適切または損傷を受けたとき、該化合物は、問題の化合物 が均一に分布している顆粒の場合よりもより高レベルで外界に曝される。

日本国特許出願公開公報５Ｂ−１７９４９２号は保護被覆を有する酵素顆粒の調 製を開示する。ここでは演法ドライヤーを用いて、例えば液体酵素濃縮物を芯物 質に第一に噴霧し、続いてセルロース誘導体を含有する被覆物質を顆粒上に噴霧 する。一方、乾燥は全工程の間進行する。

欧州特許出願公開公報第０１９３８２９号は、水和可能な芯粒子を酵素で、続い て薄膜形成物質で被覆することによって、細塵を含まない酵素を含有する粒子の 製造方法を開示する。被覆は、芯粒子を流動床ドライヤーに懸濁し、その懸濁の 間に酵素の水性スラリーを芯粒子に噴霧し、さらに水を蒸発させて粒子上に乾燥 酵素被覆を残すことによって実施される。未だ流動床に懸濁しているときに、生 じた酵素被覆粒子に巨大分子物質の溶液または懸濁液を噴霧し、乾燥させて溶媒 を除去し、巨大分子物質の被覆を残す。

国際特許出願Ｗ０９０１０９４２８号は洗剤添加顆粒を開示する。これは−次洗 剤添加物（例えば酵素）をもつ芯を含み、これは二次洗剤添加物（例えば別の酵 素）、結合剤および顆粒化剤、さらに場合によって充填剤を含む殻、並びに芯と 殻の間の保護被覆に囲まれ、それによって殻は場合によってセルロースまたは人 工繊維を含み、さらにそれによって芯は場合によってまたセルロースまたは人工 繊維を含む。洗剤添加顆粒は大きい物理的強度を示すと言われており、−次およ び二次洗剤添加物は互いに分断されているか、および／または有害な環境因子か ら分断されている。

国際特許出願Ｗ０９３１０７２６３号は、芯、酵素層および外層被覆を含む顆粒 酵素組成物を開示する。酵素層、および場合によって芯と被覆層はビニルポリマ ーを含む。顆粒酵素組成物は細塵を形成する傾向が少なく残渣を生じる傾向が少 ないと言われており、より優れた安定性と遊離が延長するという特性を示す。

そのような酵素を含む顆粒を製造する方法は加工時間を大きく減少させると言わ れている。

本発明は改善された特性を有する新規な酵素顆粒を提供する。上記に引用した先 行技術と比較して、本発明の顆粒は、問題の化合物は顆粒表面に存在するだけで はないという利点を有する。

発明の要旨 本発明の第一の特徴によれば、溶液中の酵素が吸着される多孔性芯を含む酵素顆 粒が提供される。

該酵素含有顆粒は好ましくは薄膜形成巨大分子物質で被覆される。そのような顆 粒は改善された機械強度を有する。

本発明はさらに該新規な酵素顆粒の能率的な製造方法を提供する。

詳細な説明と好ましい実施態様 本発明の顆粒は良好なポアーサイズとポアーサイズ分布を有する芯粒子をペース にし、酵素溶液が粒子内に入ることを可能にする。したがって芯物質は液状形の 酵素を含み、その結果加工粉末酵素の欠点は排除される。

今日まで利用可能な芯物質は所望の特性をもたない。ポアーの直径はとりわけ粒 子の強度を減少させるので大きすぎてもいけないし、さらに問題の化合物（例え ば酵素）がポアーに侵入するのを妨げるので小さすぎてもいけない。

欧州特許出願公開公報第０５４２３５１号（１９９３年５月１９日公告、すなわ ち本特許出願の優先８後）は塩顆粒の調製方法を開示する。この方法で得ること ができる生成物は酵素に応用する芯物質としての使用に非常に適している。多孔 性の程度は工程の経済性という点で重要である。

本発明の別の特徴では、以下の工程を含む新規な酵素顆粒を能率的に製造する方 法が提供される： （ａ）非水性酵素溶液を調製し、 （ｂ）当該酵素溶液を多孔性芯物質に用い、それによって酵素溶液を多孔性芯物 質に吸収させ、 （Ｃ）生じた酵素顆粒を乾燥させ、さらに場合によって、（ｄ）酵素顆粒を薄膜 形成巨大分子で被覆する。

酵素溶液は種々の方法で調製できるが、主に使用される酵素の物理的特性に依存 する。本発明の目的のために適切な溶媒は、エチレングリコール、プロピレング リコール、液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ’　ｓ）（例えばＰＥＧ２００ およびＰＥＧ４００）およびグリセロールを含む。ある場合には、初めに酵素水 溶液を調製し、さらに非水性溶媒を加えても有用であろう。続いて例えば蒸発に よって水を部分的または完全に除去する。“非水性”酵素溶液は一定量の水（例 えばｔｏ−２０％）を含むことはできるが、顆粒の種々の成分、特に多孔性芯物 質に不利な影響を与えるものであってはいけない。酵素溶液の代わりに酵素スラ リーも当業者には明白な一定の場合に用いることができる。

粒子内への酵素の吸収は種々の方法で実施できる。酵素含有水性液もしくはスラ リー（例えば濃縮醗酵ブロス）、酵素含有非水性液もしくはスラリー（例えば非 イオン性物質、アルコールなど）の両方から、またはその組み合わせから実施で きる。

適切な多孔性芯物質は、ソーダ、塩化ナトリウムおよびシリカを含み、市販され ている。多孔性芯物質は好ましくは欧州特許出願公開公報第０５４２３５１号に 記載された方法で製造される。

酵素溶液は種々の方法で多孔性芯物質にもたらされるが、その方法は全て当該技 術分野で既知である。例えば混合装置もしくは流動床またはミキサー−流動床ド ライヤーの組み合わせが用いられる。処理工程（ｂ）および（Ｃ）は適切に組み 合わされる。

所望の場合は、１つまたはそれ以上の保護被覆層を芯の上に適用し、細塵非含有 酵素を得ることができる。適切な被覆物質は文献にしばしば記載されている（例 えば日本国特許出願公開公報第５８−１７９４９２号および欧州特許出願公開公 報第０１９３８２９号参照）。それらには、セルロース被覆またはセルロースを 基剤とする被覆を含むヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒド ロキシプロピルメチルセルロースおよび／またはヒドロキシエチルセルロースが 含まれる。ＥＵＤＲＡＧＩＴ■（レームファーマ社製）のようなアクリルポリマ ーもまた利用できる。適用する被覆量はそこそこに広い範囲で変動させることが できるが、通常は重量で０．　１から２５％で、セルロースを基剤とする被覆に ついては好ましくは５から２５重量％である。

被覆層はまた他の有用な化合物を顆粒に添加するためにもまた用いることができ る。多層顆粒を製造することもまた可能であるが、この場合は、種々の被覆層は 異なる機能（例えば存在する化合物を安定化させる機能、着色機能など）を有す る。

当業者には明白な一定の応用については、多孔性芯物質は、ゆっくりと溶解させ るか、または吸収される酵素をゆっくりと遊離させて、適切に用いられる。被覆 技術と組み合わせたこの技術は、幾つかの化合物を必要に応じて連続して遊離さ せることができる顆粒組成物を可能にする。本明細書の実施例は、プロテアーゼ が多孔性芯に吸収され、リパーゼが芯に被覆され、最後に被覆層がこの顆粒上に 適用される顆粒である。

本発明の酵素顆粒を製造するための全工程（吸収、被覆物質および他の化合物に よる被覆）は、１つの装置（例えばミキサーまたは流動床）で適切に実施するこ とができる。本発明の工程はいくつかの利点を有する。本工程が１工程より多い 工程で実施されるとき、（酵素）細塵形成は粒子の装置間移動の間減少させられ る。その上、酵素溶液またはスラリーの多孔性粒子中の吸収は、例えば酵素溶液 またはスラリーを演法中の芯に噴霧するよりも、または酵素を無孔性担体と混合 するよりもはるかに速い。

本多孔性物質を用いて、被覆層の組成または位置を調節する以外の技術手段によ って連続的な遊離または制御遊離を得ることもまた可能である。

以下の実施例は説明の手段として提供され、制限のためではない。

四 本実施例で用いるプロテアーゼは高アルカリプロテアーゼＰＢ９２（米国特許Ｒ ｅ３０Ｂ０２号参照、商品名ＭＡＸＡＣＡＬ■でＧ１５ｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ　 Ｎ、Ｖ、がら市販）である。

本実施例で用いるリパーゼは、シュードモナス−シュードアルカリゲネス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　Ｍ−１（ＣＢＳ　 ４７３．８５）から得ることができるリパーゼである（欧州特許第８−０２１８ ２７２号および米国特許第４９３３２８７号および５１５３１３５号参照）。

本実施例で用いるキモシンはクルベロミセス＝ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙ ｃｅｓｌａｃｔｉｓ）の形質転換酵母菌株によって産生され、さらに商品名ＭＡ ＸＩＲＥＮＯでＧ１５ｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ　ＮＪ、から市販されている（欧州 特許第８−００９６４３０号およびＢ−０３０１６６９号並びに米国特許第４８ ５９５９６号参照）。

実施例１ それぞれ多孔度６　（Ｓｏｄａ　ａｓｈ　Ｄｅｎｓｅ＠）、ｌ　６　（Ｓｏｄａ 　ａｓｈ　Ｃｏｍｐａｃｔ■）および３８％（Ｓｏｄａ　ａｓｈ　５ｏｒｂｅｎ ｔ＠）のソーダをアクシー社（Ａｋｚｏ　Ｎ、　Ｖ）から入手した一７１０μｍ の粒子サイズを得た。

それぞれエチレングリコールおよびプロピレングリコールを濃縮プロテアーゼ水 溶液となるよう添加して酵素液を調製した。続いて蒸発によって該液体の水分含 量を約ｌθ％まで減少させた。液体のプロテアーゼ濃度は３．７ＭＡＤＵ　（＝ ３、７　Ｘ　１０　’　ＡＤＵ／ｇ）であった。続いて液体をソーダ粒子に噴霧 した。粒子は、粒子によって規定された多孔度レベルまで完全に液体で充填され た。

噴霧および吸収は容器を回転させることによって実施した（酵素液注入口温度３ ０−５０℃）。続いて物質を演法ドライヤー中で、本質的には日本国特許出願公 開公報第５８−１７９４９２号または欧州特許出願公開公報第０１９３８２９号 に記載された方法にしたがって被覆し、細塵を含まない酵素顆粒を得た。

プロテアーゼ活性が３．４から３．７ＭＡＤＵ／ｇで変動する非水性プロテアー ゼ溶液をエチレングリコール、プロピレングリコール、ＰＥ０４００およびグリ セロールで調製した。液体吸収処理は、非水性溶液の水分含量にしたがって、酵 素活性を基準にして６１％から９８％の酵素収量をもたらした。試験は、６％、 １６％および３８％多孔度のソーダ芯（上記参照）を用いて実施した。

プロテアーゼ含有液の添加後、粒子を流動床被覆装置（入口空気温度６５℃、出 口温度４０℃）中で被覆した。酵素活性を高（維持したまま良好な物質収量が得 られた。

実施例２ プロテアーゼ顆粒を、多孔性塩化ナトリウム芯をソーダ芯の代わりに使用した点 を除き、実施例１に記載したのと同じ方法で調製した。これら塩化ナトリウム芯 は本質的には欧州特許出願公開公報第０５４２３５１号に記載された方法にした がって調製したが、多孔度は１５％であった。これらの芯を酵素活性が４４０、 　０００ＡＤＵ／ｇの非水性液含有プロテアーゼで充填した（酵素収量〉９７％ ）。セルロースを基剤とする被覆（２０％Ｗ／Ｗ）を用いて、上記に述べたのと 同じ条件下で流動床中で被覆後、３９７．５００ＡＤＵ／ｇの活性をもつ被覆顆 粒を得た。再び良好な物質収量を得たく〉９２％）。

実施例３ 同様な実験をキモシンで実施した。キモシンはプロピレングリコールで溶解した 。液体は多孔性塩化ナトリウム中に良好に吸収されたが、これは重量で１５％の 吸収であろう。これによって同様な良好な酵素収量と多孔性物質の重点が得られ た。

実施例４ 粒子サイズが３００−７１０μｍの多孔性芯物質（Ｓｏｄａ　ａｓｈ　Ｃｏｍｐ ａｃｔ■、６００ｇ）を流動床ドライヤーに導入した。リパーゼと非イオン性物 質（トリトンＸ１１４０）を含むエチレングリコール溶液を３８℃の温度で演法 ドライヤーに導入し、多孔性粒子に噴霧した。水を蒸発させ、非イオン性物質お よびリパーゼを粒子に吸収させた。続いて被覆層を粒子に噴霧し、細塵を含まな い顆粒を得た。

実施例５ 実施例４に記載したのと同様な方法でプロテアーゼ顆粒を作製した。プロテアー ゼを含むエチレングリコールおよびプロピレングリコールのそれぞれの溶液を、 流動化した（粒子サイズ、４００−６００μｍ）多孔性物質の最上層の流動床に 直接噴霧した。プロテアーゼをエチレングリコールおよびプロピレングリコール に溶かしたときいずれも液体は該物質に良く吸収された。

流動床被覆装置でさらにセルロースを基剤とする被覆（ＳＥＰＩＦＩＬＭ■、５ ｅｐｐｉｃ）を適用し、３００および６００μｍを越える篩でふるい分けた後、 細塵レベルはさらに減少した。

上記で述べたのと同じ方法で調製し、セルロースを基剤とする被覆物質で被覆２ ０％ｗ／ｗ）した４種のプロテアーゼ顆粒をホイバック摩擦試験で細塵形成につ いて調べた（国際特許出願公開公報第９３１０７２６３号参照）。この試験では 、０．５ｍｇ／２０ｇ以下の酵素細塵レベルは極めて低いと考えられる。１０ｍ ｇ７２０ｇ以下の総細塵数は同様に極めて低いと考えられる。結果は表１に示す 。

ホイパック摩擦レベル サンプル番号　ｌ　２　３　４ 酵素細塵（ｍｇ／２０ｇサンプル、 ３００、０ＯＯＡＵＤ／ｇを基準にする］　０．４５　０．３１　０．１４　０ ．２０総細塵（ｍｇ／ｚｏｇサンプル）　？、３　５．６　７．６　５．９非被 覆類粒はこの試験条件下ではシミになるようであった。対照的に、それらの低い 細塵レベルからはずれる被覆粒子はホイパックの摩擦試験のスチール球の破砕力 に対抗するに十分強かった。

実施例６ 種々の多孔性芯物質（ソーダ、塩化ナトリウムおよびシリカ）を非水性プロテア ーゼ溶液で充填した。溶媒としてエチレングリコールおよびポリエチレングリコ ールを用いた。

５ｏｄａ　ａｓｈ　５ｏｒｂｅｎｔ＠’　（実施例１参照）は液体を３７重量％ まで吸収することができ、使用した塩化ナトリウムはその重重の１５％を吸収し 、一方シリカは１００％吸収できる。

表２は、種々の芯物質にいろいろな酵素を含む液体を吸収させた後の残留酵素活 性を示す。

表２ 吸収液体の重量％ 製品　５　１０　１５　２０　２５　３０　３７　１００残留　５ｏｄａ　ａｓ ｈ　５ｏｒｂｅｎｔ■　１００　１０２　９０　９３　９３　９２　９４酵素 活性　塩化ナトリウム　９５　ｌｏｔ　９７（％） シリカ　１０２ 実施例７ 得られた物質をそのプロテアーゼ安定性について７℃で（周囲の相対湿度で）種 々の非水性液体を用いて調べた。表３はソーダに吸収されたプロテアーゼの安保 存期間 プロテアーゼの溶解液’ｌ　０　２　３残留　ＥＧ　１００　９２　８５ 活性　ＰＧ　１００　１０３　１０２ （％）　ＰＥＧ　１００　１０２　９８”　：　ＥＧ＝エチレングリコール、Ｐ Ｇ＝プロピレングリコール、ＰＥＧ−ポリエチレングリコール４００本明細書に 記載した刊行物（特許および特許出願を含む）（ヨ全て、本発明【こ関係がある 当業者の技術水準を示している。本明細書に記載しｔこ全てのＴ（Ｈテ物Ｇｉ参 照により本明細書に含まれる。

前述の発明は理解を明瞭にするために解説と実施例によっである程度詳細に８己 載したが、当業者にとって多くの変更と改良が添付の請求の範囲の本職またｉｔ 範囲を外れることなく為しえることは明瞭であろう。

１．１ｐｆｇ、、Ｎ（ＡｅｃｌｌｅｓｌｌＭ　Ｎ６ρＣＴ／ＥＰ９４１０１６７ １２フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ、　ＣＡ、　ＣＨ，ＣＮ 、　ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　 ＫＲ，ＫＺ、　ＬＫ。

ＬＵ、　ＬＶ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　 ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ、ＵＺ、ＶＮ （７２）発明者　ディリッセン　マルクベルギー　ベー９０００　サン　アマン ドベール　アントワールプスステーンヴ工−り

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．芯が多孔性物質から成る顆粒であって、該顆粒に存在する酵素（の部分）が 当該芯に吸収されている当該顆粒。
2. ２．保護外層で被覆されている請求の範囲第１項の顆粒。
3. ３．芯が多孔性物質から成る顆粒であって、該顆粒に存在する酸素（の部分）が 該芯に吸収されており、さらに幾つかの被覆層で被覆されている当該顆粒。これ らの層は例えば（他の）酵素、安定剤、着色剤、制御遊離を得るための層を含む ことができる。
4. ４．該顆粒が多孔性物質から成り、該酵素が該顆粒に吸収されるように水性もし くは非水性酸素溶液またはスラリーと接触させ、必要な場合には、請求の範囲第 １項および第２項に記載の生成物を得るために、該顆粒を保護外層もしくは幾つ かの被覆層で被覆する、細塵を含まない酵素顆粒を製造する方法。
5. ５．該顆粒が多孔性物質から成り、ミキサー中で該酸素が該顆粒に吸収されるよ うに水性もしくは非水性酵素溶液またはスラリーと接触させる請求の範囲第４項 の顆粒。
6. ６．該装置が液床ドライヤーである請求の範囲第５項の方法。
7. ７．請求の範囲第２項および第３項に記載の生成物を得るために、該顆粒を保護 外層または幾つかの被覆層で被覆し、ミキサー中で該被覆が実施される請求の範 囲第４項の方法。
8. ８．該被覆が液床ドライヤー中で行われる請求の範囲第７項の方法。
9. ９．全工程が１つの装置で実施される請求の範囲第４項の方法。
10. １０．全工程が液床ドライヤーで実施される請求の範囲第９項の方法。
11. １１．多孔性担体と組み合わされた被覆層であって、該被覆層が修飾セルロース （の混合物）から成り、被覆工程中に凝集および粘着を防止するために化合物が 添加される当該被覆層。
12. １２．添加化合物がタルクである請求の範囲第１１項の被覆層。
13. １３．酸素含有水性または非水性液で充填した多孔性物質に被覆を応用すること によって、粒子の強度は極めて増強されることが分かった。