JPH07505881A

JPH07505881A - 軟骨基質たんぱく質及びその使用方法

Info

Publication number: JPH07505881A
Application number: JP5518392A
Authority: JP
Inventors: ゲーティンク，ポール　エフ．; トンドラビ，メールダッド
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1992-04-10
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1995-06-29
Also published as: CA2117780A1; EP0635029A4; EP0635029A1; WO1993021226A1; AU3972793A; US5686059A; US5741670A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】軟骨基質たんばく質及びその使用方法１１匹１１本発明は、軟骨基質たんばく質に関する。

軟質基質たんばく質（ＣＭＰ）は軟骨の細胞外基質の非膠原性たんばく質である。ＣＭＰはジスルフィド結合で連結されたサブユニットのホモトリマーである。

アルグラベス代地（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、ＳＣｉ、ＵＳＡ　８４：４６４，１９８７）及びキス代地（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：８１２６゜１９８９）は、ニワトリＣＭＰが上皮成長因子と有意に相同性である領域（残基１４８−１８３）及び２個の相同性の反復配列（残基３０−２２０及び２６２−４５０）を含むことを開示している。相同性の反復体（それぞれＣＭＰ−１及びＣＭＰ−２）はホンウィルランド因子、補足因子Ｂ、補足因子Ｃ２、タイプｖ■コラーゲン、そしてインテグリンＭ　ａ　ｃ　−１、ｐ１５０，９５及びＬＦＡ−１のα鎖の内部の領域に相同性である（上述のキス代地の文献を参照されたい）。

ヒトＣＭＰは、全体的に見てニワトリＣＭＰに７９％同一性である。ヒトＣＭＰ −１とニワトリＣＭＰ−１の領域は７９％同一性であり、ヒトＣＭＰ−２とニワトリＣＭＰ−２の領域は８４％同一性である（ジエンキンス代地、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５：１９６２４゜１９９０）。

ＣＭＰは、プロテオグリカン及びコラーゲンの両者と相互作用し得る（ジエオチンク代地、Ａｎｎａｌｓ　。

ｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　５９９：２９，１９９０）。

また、ボナルド代地（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：１２４５．１９９０）は、タイプＶＩコラーゲンがＣＭＰに相同性のいくつかの反復体を有すること、これらの反復体を含む領域がタイプＶＩコラーゲンとタイプエコラーゲンとの間の相互作用に加わることを報告している。

泣１Ｊυｉ盟一般的には、本発明は、コラーゲンを結合できろ、軟骨基質たんばく質のフラグメント又はアナログであるポリペプチド（好ましくは、実質的に純粋の）を主題とする。

種々の好ましい具体例において、本発明のポリペプチドはＣＭＰ−１又はＣＭＰ −２を含む、また、本発明のポリペプチドはＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２のフラグメント又はアナログを含む、さらに、本発明のポリペプチドはその全部又は一部がＣＭＰ−１であり、例えば、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメント又はほぼ８−１０個の残基のコラーゲン結合性配列１　（ＣＢＳＩ、以下において定義する）モチーフを含む、さらに、ポリペプチドはその全部又は一部がＣＭＰ−２であり、例えば、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−２のＮ末端フラグメント又はＣＭＰ−２のほぼ８−１０個の残基のＣＢＳ　Ｌモチーフを含む、また、ポリペプチドは、ＣＢＳ　Ｌモチーフであるか又はこれを含む、さらに、本発明のポリペプチドは、その全部又は一部がＣＭＰ− １及びＣＭＰ−２からなる。

また、関連した観点からみれば、本発明は、コラーゲンフィブリルを形成させる方法を特徴とする。この方法は、軟骨基質たんばく質、即ち本発明のポリペプチドをコラーゲンと接触させることからなる。

この方法の好ましい具体例においては、本発明のポリペプチドは、軟骨基質たんばく質のフラグメント又はアナログである。また、ポリペプチドは、軟骨基質たんばく頁領域ＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２のフラグメント又はアナログである。さらに、ポリペプチドはＣＢＳＩモチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらにポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ポリペプチドはＣＭＰ−１のＣＢＳ　１モチーフを本質的に含み又は本質的にこれからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−２のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ポリペプチドは、ＣＭＰ−２のＣＢＳＩモチーフを含み又は本質的にこれからなる。

さらに関連する観点からみれば、本発明は、ある化合物をある組織、例えば膠原質組織に送り込む方法であって、本発明のポリペプチドに結合させた該化合物を患者に投与することを包含する方法を特徴とする。

この方法の好ましい具体例においては、本発明のポリペプチドは、軟骨基質たんばく質のフラグメント又はアナログである。また、ポリペプチドは、軟骨基質たんばく頁領域ＣＭＰ−１又はＣＭ　Ｐ−２のフラグメント又はアナログである。

さらに、ポリペプチドはＣＢＳＩモチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらにポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ポリペプチドはＣＭＰ−１のＣＢＳＩモチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭ　Ｐ　’−２のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。

また、ポリペプチドは、ＣＭＰ−２のＣＢＳＬモチーフを含み又は本質的にこれからなる。

さらに他の観点からみれば、本発明は、軟骨基質たんばく質のコラーゲン結合性フラグメントであるポリペプチドと造影剤又は治療剤とを含む分子複合体を特徴とする。

この複合体の好ましい具体例において、本発明のポリペプチドは、軟骨基質たんばく質のフラグメント又はアナログである。また、ポリペプチドは、軟骨基質たんぽく頁領域ＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２のフラグメント又はアナログである。さらに、ポリペプチドはＣＢＳ　１モチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ポリペプチドはＣＭＰ− １のＣＢＳ　１モチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−２のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる、また、ポリペプチドは、ＣＭＰ−２のＣＢＳＩモチーフから本質的になり又はこれを含む。

またさらに他の観点からみれば、本発明は、ある表面に対するコラーゲンの結合を促進させる方法であて、該表面に軟骨基質たんばく質のコラーゲン結合性フラグメントを被覆し、被覆された表面をコラーゲンと接触させることを包含する、コラーゲンの結合の促進方法を特徴とする。

この方法の好ましい具体例において、ポリペプチドは軟骨基質たんばく質のフラグメント又はアナログである、また、ポリペプチドは、軟骨基質たんばく頁領域ＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２のフラグメント又はアナログである。さらに、ポリペプチドはＣＢＳＬモチーフを含み又は本質的にこれからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ボリベブチドはＣＭＰ−１のＣＢＳ　１モチーフを含み又は本質的にこむからなる。さらに、ポリペプチドは、長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−２のＮ末端フラグメントを含み又は本質的にこれからなる。また、ポリペプチドは、ＣＭＰ−２のＣＢＳＩモチーフから本質的になり又はこれを含む。

さらに他の観点からみれば、本発明は、本発明のポリペプチドと製薬上許容できる担体を含有する製薬組成物を包含する。

また、本発明は、他の観点からみれば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する細胞を媒質中で培養して該ポリペプチドを発現させることからなる、本発明のポリペプチドの製造方法を特徴とする。

ニワトリＣＭＰのヌクレオチド配列はゲンバンク（商標）／ＥＭＢＬデータバンクから受け入れ番号Ｘ１２３４６−ＸＩ　２３５４として入手できる。ヒトＣＭＰのヌクレオチド配列はゲンバンク（商標）／ＥＭＢＬデータバンクから受け入れ番号ＪＯ５６６６及びＪＯ５６６７として入手できる。

ＣＭＰ−１（ＣＭＰ−１領域）は、ニワトリＣＭＰのアミノ酸３０−２２０に相当する配列である。ＣＭＰ−２（ＣＭＰ−２領域）は、ＣＭＰのアミノ酸２６２ −４５０に相当する配列である（上述のキス代地に従う番号付け）、また、ＣＭＰ−１はヒトＣＭＰのアミノ酸２３−２２２に相当する配列であり、ＣＭＰ−２はヒトＣＭＰのアミノ酸２６４−４５３に相当する配列である（上述のジエンキンス代地に従う番号付け）、また、用語「ＣＭＰ−１」は、たんばく頁中にホンウィルランド因子、補足因子Ｂ、補足因子Ｃ２、タイプＶｌコラーゲン、並びにヒト又はニワトリＣＭＰ−１領域に相同性であるインテグリンＭ　ａ　ｃ　−１、ｐ１５０．９５及びＬＦＡ−１のα鎖のような領域に相当するポリペプチドを含む。

さらに、用語ｒＣＭＰ−２４は、たんばく頁中にホンウィルランド因子、補足因子Ｂ、補足因子Ｃ２、タイプＶＩコラーゲン、並びにヒト又はニワトリＣＭＰ− ２領域に相同性であるインテグリンＭａｃ−１、ｐ１５０．９５及びＬＦＡ−１のα鎖のような領域に相当するポリペプチドを含む、このような相同性の領域は、標準的な方法によって同定された（上述のギス代地の文献を参照されたい）。

このような領域は、ヒトＣＭＰ−１領域又はニワトリＣＭＰ−２領域に７０％相同性であり、好ましくは８０％相同性であり、さらに好ましくは９０％相同性である。

ＣＢＳＩモチーフは、ＣＭＰ−１、ＣＭＰ−２及び多数のその他のたんばく質（そのいくつか又は多くはコラーゲンを結合する）中に見い出される８−１０個のアミノ酸配列である。ＣＢＳＩモチーフは、ニワトリＣＭＰのアミノ酸３８−４７　（ＣＭＰ−１の場合）（ＴＤＬＶＦＩＩＤＳＳ）（配列番号：　）及びアミノ酸２７１−２８０　（ＣＭＰ−２（７）場合）（ＬＤＬＶＦＬＩＤＧＳ）（配列番号：　）に位置している（上述のキス代地に従う番号付け）、ＣＢ５１モチーフは、ヒトＣＭＰのアミノ酸４０−４９　（ＣＭＰ−１（７）場合）（ＴＤＬＶＦＶＶＤＳＳ）（配列番号：　）及びアミノ酸２７４−２８３（ＣＭＰ−２の場合）（ＴＤＬＶＦＬＩＤＧＳ）（配列番号：　）に位置している（上述のジエンキンス代地に従う番号付け）に相当する。また、ＣＢＳＩモチーフは、その他のたんばく質、特にコラーゲン結合性たんばく質のＣＭＰ−１様及びＣＭＰ−２様領域、例えばホンウィルランド因子、補足因子Ｂ、補足因子Ｃ２、タイプ■Ｉコラーゲン、並びにインテグリンＭａｃ−１、ｐ１５０．９５及びＬＦＡ−１の α鎖中に見い出される相同性の８−１０個のアミノ酸残基配列を含む。このような相同性の領域は、標準的な方法により同定された（上述のキス代地の文献を参照）。このような領域は、ＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２領域のヒトＣＢＳＬに好ましくは６０−７０％相同性であり、さらに好ましくは８０％相同性であり、最も好ましくは９０％相同性である。

本発明は、下記のたんばく質からのＣＢＳＩ領域を含む（まず、たんばく質を示し、次にＣＢＳ　１領域の残基２−１０をリストする）。

ａｌ　（ＸＩ　Ｉ）ｖＷｌ　：ＤＩＶＦＬＴＤＡＳ　（配列番号、）；ａｌ　（ＸＩ　Ｉ）ｖＷ２：ＤＩＶＬＬＶＤＧＳ　（配列番号　）　：ａｌ　（ＸＩＩ）ＶＡ：ＬＩＶＦＬＶＤＧＳ　（配列番号：）；ａ　１　（Ｘ　Ｉ　Ｉ）ＶＢ　：　ＤＶＶＦＬＶＤＧＳ　（配列番号、）；ａｌ　（ＸＩＶ）ｖＷｌ　：ＤＬＶＦＬＶＤＧＳ　（配列番号：）：ＣＭＰ　１　：　ＤＬＶＦ　Ｉ　Ｉ　ＤＳＳ　（配列番号：）；ＣＭＰ２　：　ＤＬＶＦＬ　Ｉ　ＤＧＳ　＜配列番号：）；α１　（ＶＩ）Ａ’　１　：ＤＩＭＩ−ＬＶＤＳＳ　（配列番号：）：ａ　１　（ＶＩ）Ａ’　２　：ＤＬＬＦＶＬＤＳＳ　（配列番号：）；ａｌ　（ＶＩ）Ａ’　３：ＤＬＦＦＶＬＤＴＳ　（配列番号：）；ａ２　（ＶＴ）Ｄ３　：ＤＩＶＦＬＬＤＧＳ　（配列番号：）　；ａ２　（ＶＩ）Ｄ２　：ＤＩＭＦＶＩＤＳＳ　（配列番号：）　：ａ３　（ＶＩ）Ａ’　１　：ＤＩＡＦＩＭＤＳＳ　（配列番号・　）；ａ３　（ＶＩ）Ａ’　２　：ＥＬＡＦＡＩＤＴＳ　（配列番゛号：）。

α３（ＶＴ）Ａ’３・ＤＶＩＬＧＦＤＶＳ　（配列番号：）。

α３　（ＶＩ）Ａｌ　：ＤＩＶＦＬＬＤＧＳ　（配列番号：）； α３　（ＶＩ）Ａ２　：ＤＶＶＦＬＩＤＳＳ　（配列番号：）： α３　（Ｖ　Ｉ　）Ａ３　：　ＤＶＶＦＬＶＤＧＳ　（配列番号：）；ａ３　（ＶＩ）Ａ４　：　ＤＶＶＦＬＩＤＧＳ　（配列番号：）； α３　（ＶＩ）Ａ５　：ＤＩＬＦＬＩＤＧＳ　（配列番号：）： α３　（Ｖｌ）Ａ６　：ＤＩ　ＩＦＬＬＤＧＳ　（配列番号：）；ａ　３　（Ｖ　Ｉ　）　Ａ　７　：　Ｄ　Ｉ　Ｖ　Ｆ　Ｉ−Ｉ　Ｄ　Ｇ　Ｓ　（配列番号；）； α３　（Ｖｌ）Ａ８　：ＤＬＴＦＬＩＤＧＳ　（配列番号：）；ＨＵＭ　ｖＷＦ　Ａ１：ＤＬＶＦＬＬＤＧＳ（配列番号：）。

ＨＵＭ　ｖＷＦ　Ａ２　：　ＤＶＡＦＶＬＥＧＳ　（配列番号：）：ＨＵＭ　ｖＷＦ　Ａ３：ＤＶＩＬＬＴ、、ＤＯ３（配列番号、）；ＨＵＭ　Ｍａｃ−１：ＤＩＶＦＬＩＤＧＳ　（配列番号・　）。

ＨＵＭ　ｐ−１５０，９５：ＤＩＶＦＬＩＤＧＳ（配列番号　）。

ＨＵＭ　ＬＦＡＩ：ＤＬＶＦＬＦＤＧＳ（配列番号：）；ＲＡＴ　ＶＬＡ−１：ＤＩＶＩＶＬＤＧＳ（配列番号：）：ＨＵＭ　ＶＬＡ−２：　ＤＶＶＬＶＣＤＥＳ　（配列番号：）：ＨＵＭ　ＶＬＡ−４：ＤＩＳＦＬＬＤＶＳ（配列番号：）。

コラーゲンを結合できるＣＭＰのフラグメント又はアナログは、以下に記載の検定法を使用して同定することができる。コラーゲン原線維を形成させるのに有用なＣＭＰのフラグメント又はアナログは、以下に記載の原線維光生検定法により検定するときに原線維の形成に影響を及ぼすものを包含する。原線維発生に実質上影響するどんなフラグメント又はアナログもこの検定において光学密度の変化を生じさせるであろう、その場合には、生じた原綿雑の顕微鏡検査（以下に記載）を使用して原線維の形態に対するＣＭＰフラグメント又はアナログの正確な影響を決定することができる。

本発明は、ヒトＣＭＰ並びにその他の天然型の哺乳動物及び鳥類ＣＭＰに実質上相同性であるＣＭＰ及びＣＭＰポリペプチドを包含する。また、対立遺伝子変異体、自然突然変異体及び誘発突然変異体も包含される。さらに、高いか又は低い（例えば、少なくとも４０個のヌクレオチチドのプローブ長で４０℃で２ＸＳＳＣで洗浄）厳重な条件下で天然型の核酸にハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるＣ　Ｍ　Ｐ及びＣＭＰポリペプチドも包含される（高い及び低い厳重な条件の詳細については、ｒＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪジョンウイリーア：ノトソンズ社、１９８９．６．３．１−６．３．６を参照されたい、ここで引用することによりこの内容を本明細書に含めるものとする）。

また、本発明は、天然型のＣＭＰポリペプチドのアナログを包含する。このようなアナログは、アミノ酸配列の相違により、配列に影響しない修飾により、又はこの両者により天然型のＣＭＰと異なることができる。本発明のアナログは、− Ｇに、天然型のＣＭＰ配列（そのまま（７）ＣＭＰ、ＣＭＰ−１又ＬｉＣＭＰ− ２）（７）全部又は一部と少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を示す。

比較配列の長さは、−Ｍに少なくとも約６−８個のアミノ酸残基、通常は少なくとも２０個のアミノ酸残基、さらには少な（とも２４個のアミノ酸残基、典型的には少なくとも２８個のアミノ酸残基、好ましくは３５個以上のアミノ酸残基である。修飾法としてはポリペプチドのインビボ又はインビトロでの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化が含まれる。また、グリコジル化修飾法、例えば、その合成中にポリペプチドのグリコジル化パターンを修飾し、次いで処理し又はその後の処理工程において、例えばこのような処理を通常与える細胞から誘導されるグリコジル化に影響する酵素（例えば、哺乳動物グリコジル化酵素）にポリペプチドを暴露させることによる修飾化法も含まれる。また、ホスホリル化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンを有する同じ第一アミノ酸配列の変形も含まれる。さらに、アナログは、その−次配列を変更させることにより天然型のＣＭＰと異なることができる。これらは、天然型の及び誘発型の遺伝的突然変異体を包含する。誘発型突然変異体は、照射又はエタンメチルザルフェート　（ＥＭＳ）への暴露を使用するコード化用核酸のランダムな突然変異生成を含む各種の技術により誘導させることができ、或いは分子生物学の部位特異性の突然変異生成又はその他の技術により生成される変化を含めることができる。また、天然型Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は非天然型若しくは合成アミノ酸、例えばβ若しくはγ−アミノ酸を含むアナログも包含される。ペプチドの安定性を高めるためのＮ末端又はＣ末端修飾を有するペプチドも本発明の範囲内に含まれる０本発明のポリペプチドの環状形態も本発明の範囲内である。

実質上全長のポリペプチドの他に、本発明は、ポリペプチドの生物学的に活性な、例えばコラーゲン結合性のフラグメントを包含する。用語「フラグメント」とは、本発明のポリペプチドに適用するときは、長さが通常は少なくとも約６−１０個の隣接アミノ酸、典型的には少なくとも約２０個の隣接アミノ酸、さらに典型的には少なくとも約３０個の隣接アミノ酸、通常は少なくとも約４Ｑ個の隣接アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の隣接アミノ鎖、最も好ましくは少なくとも約６０〜８０個又はそれ以上の隣接アミノ酸である。ＣＭＰのフラグメントは、当業者に既知の方法により発生させることができる。候補のフラグメントがＣＭＰの生物学的活性を示す能力は、当業者に既知の方法により評価することができる。また、たんばく質の処理中に通常除去されるアミノ酸（ポリペプチドの生物学的活性のためには要求されない追加のアミノ酸或いは代替ｍＲＮＡスプライシング又は別のたんばく質処理の事故により生じる追加のアミノ酸を含めて）を含有するＣＭＰポリペプチドも包含される。

また、本発明は、本発明のポリペプチドをコート化するＤＮＡ、好ましくは実質上純粋なりＮＡを包含する。

また、本発明は、本発明のポリペプチドに対して有向性の抗体、例えばモノクロナール抗体を包含する。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドを包含する。

ＣＭＰポリペプチド、フラグメント又はアナログは、これが天然型ＣＭＰの生物学的活性、例えばコラーゲンを結合し又は原線維発生に影響するという活性を示すならば生物学的に活性である。

実質上純粋なりＮＡとは、本発明のＤＮＡを導く生体の天然型ゲノム中においては直接隣接しているコード配列の両者（即ち、一つは５°末端で、他方は３°末端で）と直接隣接していないＤ　Ｎ　Ａである。

相同性とは、２個のポリペプチド分子の間又は２個の核酸分子の間の配列の類似性をいう、２個の対比される配列の両者の位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットによって占めれているとき、例えば２個のＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンにより占められているならば、この場合には分子はその位置において相同性である。２個の配列の開の相同性は、２個の配列により共有される整合した又は相同性の位置の数の関数である。

例えば、２個の配列の１０個の位置のうち６個が整合した又は相同性であるならば、２個の配列は６０％の相同性テアル。例エバ、Ｄ　Ｎ　Ａ　配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣ５０％の相同性を共有している。

ポリペプチドの実質上純粋な標本は、細胞中でそれと一緒に自然に生じるたんばく質を実質土倉まない標本である。

本発明のその他の特徴及び利点は、以下の好ましい具体例の説明から明らかとなろう。

１鼠ｌ旦１殴ｉ立亙工ｍまず、図面を概説する。

図１は、原線維発生検定法の結果を示すグラフである、４００ｎｍでの光学密度（ｘｔｏｏｏ）を、軟骨基質たんばく質の存在下（下の線）及び不存在下（上の線）で行った反応の時間（分）の関数としてプロットしたものである。

図２は、コラーゲン結合検定法の結果を示すグラフである。相対的結合をＣＭＰ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数としてプロットしたものである。

図３は、ヒトｃＭＰのアミノ酸配列（配列番号：　）を示す。

たんばくＣＭＰを細菌細胞内に産生させる方法、所定のＣＭＰフラグメントがコラーゲンに結合するかどうかを決定する方法、所定のＣＭＰフラグメントが原線維発生に影響するかどうかを決定する方法並びにＣＭＰ及びそのフラグメントを使用する方法を以下に記載する。

隻主食五会はＣＭ　ＰとタイプＩＩコラーゲンとの皿り止ユニ（・後記のように実施したＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａは、ＣＭＰがタイプＩＩコラーゲンと相互作用することを証明した。この検定法は、タイプＩＩコラーゲンに対する還元されアルキル化されたＣＭＰの結合を証明するのにも使用した。抗−ＣＭＰｍＡｂ　（ＩＩＴ−Ｄ５）により検出されるように、ＣＭＰ及び還元されアルキル化されたＣＭＰは濃度に依存する態様で結合した。また、ＣＭＰとコラーゲンとの相互作用は、ＣＭＰが不動化され且つ可溶性タイプＩＩコラーゲンの結合がｍＡｂ　（これはタイプＩＩコラーゲン（Ｉ−Ｂ４）を認識する）により検出されたときに証明することができた。不動化されたＣＭＰに対するコラーゲンの結合は、可溶性ＣＭＰにより阻害されたが、これは相互作用が特異的であることを証明している。

還元されアルキル化されたＣＭＰはこの阻害に同様に有効であった。ウシ血清アルブミンはこの検定において結合を阻害しなかったが、比較的高濃度のリンクたんばく質はわずかな阻害を示したが、これはリンクたんばく質の製造中に残存する微量のＣＭＰに起因するためであろう。しかし、リンクたんばく質はタイプＩ及びＩＩコラーゲンに結合することが既に示されている（チャンドラセカール代地、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：６２２６．１９８３）が、高濃度ではこの結合はコラーゲンに対するＣＭＰの結合を妨害する可能性がある。

からのＣＭＰの　王− ＣＭＰの部分ｃＤＮＡクローンの単離は既に報告されたおり、また全体のＣＭＰコード配列もこれらのｃＤＮＡクローン及びゲノムクローンのエクソンフラグメントから決定されている（上述のアルグラブス代地、上述のキス民地の文献を参照）。最長のｃＤＮＡクローンｐＣＭＰ４　（長さが１．３０４個のヌクレオチド）は複写停止コドンに対して３′方向にＥｃｏＲＩを５３個のヌクレオチドまで拡げ、コード配列の１，４８２個のヌクレオチドから１，２５１個のヌクレオチドを含有するように５゛方向に伸びている。全長のＣＭＰｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドブライマーを使用して次のように構成した。ｐＣＭＰ４クローンの５°末端近くのユニークな５ｓｔＩ部位なオーバーラツプさせてこの５ｓｔＩ部位からｍＲＮＡの５″末端まで伸びる第一ストランドｃＤＮＡを合成した０次いで、ＣＭＰのＡＵＧ開始コドンをオーバーラツプさせかっｐＵｃ１１９のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と同じ読み取り枠内でＣＭＰｃＤＮＡのクローニングを容易にするように制限部位を発生させる第二のオリゴヌクレオチドを使用（）てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってこのフラグメントを増幅させた。

このＰＣＲ生成物をＫｐｎ　ｌ−５ｓ　ｔ　ＩフラグメントとしてｐＵｃ１１９の同じ部位にクローン化し、逆転写酵素又はＰ　’ＣＲ反応中に突然変異が偶然に導入されないように配慮して配列させた。このクローンをｐＣＭＰ５゜という０次いで、ｐＣＭＰ４の５ｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをゲルで精製し、ｐＣＭＰ５°の５ｓｔＩ−ＥｃｏＲ１部位にクローンさせて全長の０ＭＰｃＤＮＡクローン、ｐＣＭＰ−Ｆｌを発生させた。全長の成熟ＣＭＰたんばく質を発現させるためには、たんば〈質の成熟末端（アラニン２４）からＣＭＰｃＤＮＡインサートの末端までのｐＣＭＰ−ＦｌのフラグメントをＰＣＲにより増幅させた。

５°　ＰＣＲオリゴマーは、Ｎｃｏ　Ｉ部位の一部として組み入れられたＡＴＧ開始コドンを包含した。また、３’　ＰＣＲオリゴマーにはＰＣＲフラグメントの３′末端でＮｃｏ　Ｉ部位が導入された。このフラグメントを精製し、Ｎｃｏ　Ｉにより切断し、Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ−１ｉｄ（ノバゲン社）のＮｃ。

工部位にクローンさせた。正確な配位にインサートを含有するクローンｐＥＴ− ＣＭＰＩを選別し、クローニング操作中に偶発的な突然変異が導入されないようにして配慮して配列させた。Ｅ、ｃｏｌ　ｉ、菌株ＢＬ２１（Ｄ３）ｐＬｙｓＳ　（ノバゲン社）をｐＥＴ−ＣＭＰ−１により適当な温度で転換転換させ、ＣＭＰ発現をＩ　ＰＴＧにより誘発させた。

鳳昼ポリクロナール抗血清をウサギにおいてＣＭＰに対して発生させ、ＣＭＰの残基ｐｈｅ！１１０−ｖａ１４２４　（アミノ酸を同定する数は第一複写生成物内の残基の数をいう）に相当する合成ペプチドをゴーチンク代地（Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１０５：２４０３，１９８７）により報告されたようにキーホールリンペットヘモシアニンと複合させた。生後４〜６週間のニワトリからの胸肋軟骨の粗グアニジン塩酸塩抽出物に対してモノクロナール抗体を生成させた。ＥＬＩＳＡ−スクリーニングは、ｍＡｂｌｌｌ−Ｄ５がＣＭＰを認識しかっＩ−Ｂ４がタイプＩＩコラーゲンを認識したことを示した。

電子顕微鏡で使用するために、　ＩＩＩ−Ｄ５腹水流体及びウサギ抗−Ｐｈｅ口１１−　Ｖ　ａｌ　４２４血清をＣＭＰ−セファロースカラムでの親和性クロマトグラフィーにより精製した。蛍光抗体法による研究で使用されたニワトリ軟骨タイプＩＩコラーゲン及びアグレヵンに対するポリクロナール抗血清は以前に報告された通りあった（ペルチル代地のＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：１２６１．１９７９．アップホルト他のＰｒｏｃ。

Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：４８４７．１９７９）。

隨會二■ＩＣＭＰとコラーゲンとの相互作用なＥＬ　ｒ　ＳＡを使用して研究した。ミクロタイトレージョンプレート（ＥＩＡ、リンプロ：フローラボラトリーズ社、マツクリアン市、ＶＡ）に対するＣ　Ｍ　、Ｐの不動化を０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ９，６（６０μｍ／ウェル）、室温で終夜行った。コラーゲン（タイプＩ、コラボレーチブ・リサーチ社、ベッドホード市、ＭＡ、タイプＩＩ、新田ゼラチン社、大阪市：タイブＩＩ１．ＩＶ及びＶ、カルビオケム社、ラジョラ市、ＣＡ、タイプＶＩ、テリオス・ファルマシューチカルズ社、サンジエゴ市、ＣＡ　；　Ｃ１’ｑ、センター・ホー・ブラッドリサーチ、ポストン市、ＭＡ）を同じ緩衝液において被覆された溶液を３７℃で終夜乾燥させることにより不動化させた。その後の全ての添加は、０．０５％ツイーン−２ｏを含有するＰＢＳ　（ＰＢｓ−Ｔ）内で１時間で行った。それぞれの添加の後、プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄した。プラスチック又は不動化されたＣＭＰに対するコラーゲンの結合をｍＡｂ　ｌ−８４により検出した。また、プラスチック又は不動化されたコラーゲンに対するＣＭＰの結合をｍＡｂｌｌｌ−Ｄ５により検出した。各場合とも検出されているモノクロナールをペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）により、次いでペルオキシダーゼ−基質（ビオラド・ラボラトリーズ社）により追跡した。４０５ｎｍでの吸収をミクロタイトレージョンプレートリーダー（タイターチック・マルチスキャン・プラス・フローラボ社、マクリアン市、ＶＡ）を使用して決定し、記録した。

種々の濃度の阻害剤をコラーゲンと混合し、この混合物を１時間放置してからＣＭＰ被覆プレートに添加することによりコラーゲン−ＣＭＰ結合の阻害を開始させた、結合したコラーゲンを前記のように検出した。

ロー土　ヅ゛去による　六は、ＣＭＰとタイプＴＩコーーゲンとの　日らかに　る。

ＣＭＰとコラーゲンとの相互作用の分子部位を特徴づけるために、成分の回転増影法を使用して（後記のように実施）電子顕微鏡による研究を開始した。単離されたＣＭＰ分子は、曲がった棒により連結された２又は３個の球形状領域からなる球状たんばく質として現れた０時々観察された変形は、異なった視角のためであろう、単離されたタイプＩＩコラーゲン分子は、長さが２８０ｎｍの典型的な棒状構造を示した。ＣＭＰとタイプＩＩコラーゲンとの混合物中では、ＣＭ、Ｐはコラーゲン分子の両端に局在化し、連鎖状体を形成した。単純な連鎖状化の他に、コラーゲン分子の網状構造であって枝の点にＣＭＰの小球があるようなものも観察された。

１転ユｌ精製されたＣＭＰ又はコラーゲンの標本をＯ，１Ｍ酢酸アンモニウム液（ＨＰＬＣ等級、シグマ社）ｐＨ７゜４に向けて透析し、グリセリン（４０％）と混合して２５−５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　ｌの濃度とし、新たに襞間された雲母支持体上に噴霧した（エングバル代地、Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、１０２ニア０３，１９８６）、各支持体をニドワードＥ３０６真空蒸発器（１０”’トール）の回転台に試料からほぼ１０ｃｍ離れた対の電子ビーム源に対して５−１０’の角度で取り付けた。レプリカは、水冷した（石英結晶）膜厚モニター（ＦＴＭ４）により測定したときに１９−３０人の厚みまで付着させた純タンゲスアンの蒸発により生じさせた（ビータ−氏、Ｂ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｎｍｉｋｒｏｓｋｏｐ、Ｄｉｒｅｋｔａｂｈ、０ｂｅｒｆ１．１２：３７７．１９７９）、生じたフィルムに炭素蒸着により裏打ちし、奇麗な水面上に浮かせ、電子顕微鏡用の３００メツシユ格子上に拾い上げた。試料を日立Ｈ−６００ＳＴＥＭで目視し、写真撮影した。

小枝症突然変異について異形接合の親の間で交配させることにより生じる妊性卵から小肢症胚を得た。これらの卵は、コネチカット大学の動物遺伝学科からルイスＪ、ベトロ博士の好意により入手した。

。　゛による　六は、　でのＣＭＰ　びタイプＩＩコラーゲンの　日　る。

以下に記載のような二重免疫蛍光染色反応を使用してニワトリ胸骨軟骨細胞の５日間培養物中でＣＭＰとタイプＩＩコラータン及びアグレカンとの共局在化を検査した。軟骨細胞は、細胞外タイプＩＩコラーゲン原線維の付着を容易にするためにアスコルビン酸の存在下に増殖させた。ＣＭＰに対するモノクロナール抗体ＩＩＩ−Ｄ５の細胞外局在化をタイプＩＩコラーゲンに対するポリクロナール抗血清の場合と比較した。ＣＭＰ及びタイプＩＩコラーゲンの双方に対して密な糸状細胞外基質パターンが観察された。別の実験では、ＣＭＰの細胞外局在化はアグレカンのそれと対照的であった。細胞外ＣＭＰの糸状分布はアグレカンの非晶質パターンと共局在化しなかった。軟骨細胞外基質にアグレカンが存在しないことが特徴である遺伝子欠陥小枝症を有する軟骨細胞培養物の免疫蛍光染色法は、ＣＭＰとタイプＩＩコラーゲンとの類似の共局在化を証明した。

正常な軟骨細胞の培養物にはＣＭＰとアグレカンとの明らかな共局在化は存在しなかった。しかし、電光ヒアルロニダーゼで処理した後に残る物質はアグレカンコアたんばく質に対する抗体と反応し、糸状ＣＭＰ／タイプＩＩコラーゲンパターンで共局在化した。

ＣＭＰと軟骨細胞外基質との超微細構造的な会合な検査するために、イムノペルオキシダーゼ反応の後に培養物中の軟骨細胞を調査した。コラーゲン原線維の網状構造に沿ったＣＭＰの周期的な分布が低及び高倍率の双方で観察された。タイプＩＩコラーゲンについての超微細構造的な免疫染色パターンは同様に周期的であった。定量分析によりＣＭＰについては５９．３％ｍ　（標準誤差＝±０．６ｎｍ）の周期的反復、タイプＩＩコラーゲンについては６０．３％ｍ　（標準誤差＝±０．６ｎｍ）の周期的反復であることが示された。この観察された反復は、タイプＩＩコラーゲンの特徴であることが知れている６６０−６５ｎの周期と一致する。正常な血清対照例は非反応性であることがわかった。

敬ｎ竺１カーン代地によりｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ　（ウイルト代地著、クロウウェル社、ＮＹ、ｐ、４９３−５３０　（１９６７））に記載のようにして、生後１５日の白色レグホン系ニワトリの胚の胸骨から軟骨細胞を得た。免疫蛍光法の研究のために、細胞をゼラチンを入れた炭素被覆カバーガラス上で直径６０ｍｍの組織培養皿１個当たり６×１０５個の細胞の密度で、１０％の胎児ウシ血清と１％の抗生物質−抗かび創部合物を含有する３ｍｌのハムの（Ｈａｍ’　５）Ｆ−１２媒質中で単層で培養した。培養物には５０ｍＭのアスコルビン酸を含有する新しい媒質を３及び４日日に与え、そして７５％のエタノールで固定化する２時間前に再度与えた。また、免疫電子顕微鏡検査のために、細胞をゼラチンを入れた３５ｍｍの組織培養皿で１．５ｍｌの上記と同じ媒質中で同等の密度で培養した。細胞培養物には上記のようにアスコルビン酸塩を含有する新しい媒質を与えてから５日日に２．５％のグルタルアルデヒドにより固定化した。

た炎１立ゑＬｌ５日間培養してから軟骨細胞をバンクの（Ｈａｎｋ’Ｓ）平衡塩溶液（ＨＥＳＳ）により数回洗浄し、７５％エタノールで固定化し、ペルチル代地によりｒＪ、Ｃｅ１１、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７：２１５　（１９８５）Ｊに記載のように免疫蛍光染色法の準備をした。いくつかの実験では、細胞外アグレカンからグリコサミノグリカンを除去してから電光ヒアルロニダーゼによる短時間消化によって固定化した（ペルチル代地、１９８５）。

細胞は、図の凡例に示すように第−抗体及びＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣ−カップリング第二抗体と共に室温でインキュベートした。抗体とのインキュベートの間は細胞はＨＢＳＳにより十分に洗浄した。ざらにＨＢＳＳにより洗浄した後、カバーガラスをりん酸塩緩衝液／グリセリン（１：９、ｖ　／　ｖ　）中に取り付けた０位相及びエビフルオレセンス光学系を備えたライブ・オルソラックス顕微鏡を使用して試料を観察し、写真撮影した。視野は二重染色試験片から選択し、ＴＩＴＣ及びＴＲＩＴＣ染色について逐次写真撮影した。

た疫１ｊ」ｌ象鶏上記のように５日間培養した後、軟骨細胞を２．５％のグルタルアルデヒド中で３０分間固定化した。ブラウン代地の方法（Ｃｅｌ　１．３６：２９５，１９８４）に従い、若干修正して（ペルチル代地、Ｊ、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、ｌＯ８：　１３２７，１９８９）　、マウスモノクロナールＩＩＩ−Ｄ５抗−ＣＭＰ及びウサギ抗−タイブＩＩコラーゲンを使用してイムノペルオキシダーゼによる研究を行った。試料は、レイノルドくえん酸鉛により５分間対比染色し、ツアイス１０電子顕微鏡を使用して観察し、写真撮影した。

ＣＭＰ及びタイプＩＩコラーゲンの免疫染色の周期性の分析は、コンピュタ−で助成した画像分析装置及びミクロコンブソフトウェア−を使用して達成した。実際の読みは、４．６５倍に拡大された電子顕微鏡写真ネガの写真プリントから直接読み取った。各拡大物から７個の試料を測定した。各グループで２００個以上の試料の測定を使用した。絶対目盛定めは炭素レプリカ標準物の使用に基づいていた。全ての顕微鏡写真及び拡大物を、同じ写真処理期間中は同じ倍率で写真撮影し、拡大し、プリントした。

電ｊ冒虹勲図の凡例に示すように種々のアクリルアミド濃度のゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ラエムリ氏、１９７０）を行い、イモピロン−Ｐ（ミリポア社、ベッドフォード市、ＭＡ）によりプロットしくトービン代地、１９７９）、上記の抗体、次いで適当ならばアルカリホスファターゼ複合化ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）又はヤギ抗ウサギＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）（ビオラド・ラボラトリーズ社）を使用し、かつ、発色体として６−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩／ニトロブルーテトラゾクロムクロリト（ギブコＢＲＬ社、ガイセルバーブ市、ＭＤ）を使用して染色した。

ＣＭＰは７、２・　にｌ　ぼす。

原線維発生検定法（下記のように実施）は、ＣＭＰが原線維発生に影響を及ぼすことを証明した。原線維発生をＣＭＰの存在下及び不存在下にタイブエエコラー・ゲン溶液の濁度を測定することによりモニターした検定の結果を図示する図１を参照すれば、ＣＭＰは濁度を実質上増大させた。タイプＩコラーゲンを使用して同様な結果が観察された１両方の場合とも、顕微鏡検査により、ＣＭＰの存在下に形成された原線維はＣＭＰの不存在下に形成されたものよりも細いことが証明された。

ｌ緩１又土並１］この検定法は、実質的にはヘボム代地（Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、２６４：６８９８，１９８９）により報告されたように行った。

概略すれば、原線発生生用緩衝液（６０ｍＭのＮａＣ１，３０ｍＭのＮａＰＯ４，ｐＨ＝７．３）にＣＭＰの存在下又は不存在下にタイプＩＩコラーゲンを添加することにより原線維発生を開始させた。最終のタイプＩＩコラーゲン濃度は２００μｓ／ｍ１であり、最終Ｃ，Ｍ　Ｐ濃度は２０μｇ　／　ｍ　］であった。

原線維発生は、混合物の光学密度を４００ｎｍで７時間にわたり周期的に測定することによりモニタ・−シた９反応は３７℃で行った。

ＣＭＰ−１びＣＭＰ−２はタイプＩＩコラーゲン■藍１光工（・ＣＭＰ−１（ＣＭＰ（７）アミノ酸３Ｏ−２２０）及びＣＭＰ−２（ＣＭＰのアミノ酸２６２−４５０）はコラーゲンの結合にとって重要である。前記のように行ったインビトロでの検定は、ＣＭＰ−１及びＣＭＰ−２の両者がタイプＩＩコラーゲンを結合できることを証明した。

これらの実験において、種々の割合のＣＭＰコード配列を使用してＥ、ｃｏｌｉ、マルトース結合性たんばく質（ＭＢＰ）／ＣＭＰ融合たんばく質にューイングランド・バイオラブズ社、ビバリー市、ＭＡ）を生じさせた。この融合たんばく質はＥ、ｃｏｌｉ、で発現させ、アミロース−セファロースカラムを使用して精製した。溶出物を不動化されたタイプＩＩコラーゲンのプレートに適用した。次いで、抗マルｌ−−ス結合性たんばく質か又は抗−ＣＭ　Ｐモノクロナール抗体をアルカリホスファターゼ複合化第二抗体と共に使用して融合たんばく質を検出した。

図２は、３個の異なる融合たんばく質の検定の結果を例示する。結合の相対的な量を、ニワトリＣＭＰのアミノ酸１−４５０に融合したＭＢＰ（各グループの一番目の棒グラフ）、ニワトリＣＭＰ−１に融合したＭＢＰ　（各グループの二番目の棒グラフ）及びニワトリＣＭＰ−２に融合したＭＢＰ　（各グループの王国の棒グラフ）についての融合たんばく質の濃度の関数として示す、結合は、抗− ＭＢＰ抗血清によって検出した。

ユラーゲン七への　宝プレートに２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのタイブエエコラーゲン（新田ゼラチン製、大阪市）のＰＢＳ−Ｔ中の１ニア５希釈物を塗布し、次いで３７℃で約１８時間乾燥した。上記のように精製した融合たんばく質をコラーゲン塗布プレートに適用し、３７℃で１時間インキュベートした。抗−ＭＢＰ抗血清にューイングラント・バイオラブズ社、ビバリー市、ＭＡ）又は抗−〇ＭＰ抗体（上記）及び実質」二前記のような第二抗体により融合たんばく質を検出した。

ＭＢＰ−ＣＭＰ−１びＭＢＰ−ＣＭＰ−２豆亙入ぶく　のＣＭＰ−Ｊ　びＣＭＰ −２のコラーゲン＋Ａ１ユユグΣ２± アミノ酸残基２４（成熟たんばく質の第一アミノ酸）からアミノ酸残基３０までに相当する５′プライマ一配列及びアミノ酸残基２１４から２２０までに相当する３′プライマ一配列を使用してＣＭＰ−１領域をＰＣＨにより合成した。ＣＭＰ−２ラグメントは、アミノ酸残基２６２−２６８に相当する５°プライマ一配列及びアミノ酸残基４４４−４５０に相当する３°プライマ一配列を使用することにより増幅させた。このＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＭＡＬ−Ｃ２にニューイングランド・バイオラブズ社、ビバリー市、ＭＡ）をコードするマルトース結合性たんばく質の５ｔｕＩクロ一ニング部位に鈍端結紮によってクローニングした。微量調製ＤＮＡ試料を制限酵素ＢａｍＨＩ　（ＢａｍＨＩ部位はインサートされたＣＭＰフラグメントの５°及び３′端部のＭＢＰポリリンカーに位置している）により消化し、適当なりローンを所期の大きさのインサートフラグメントの存在についてスクリーニングした０次に陽性クローンを５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離たんばく質のウェスタンプロット並びに抗−ＣＭＰ抗体及びアルカリホスファターゼリンク第二抗体による交叉反応性についての試験によって融合たんばく質の発現についてスクリーニングした。

ＭＢＰ−ＣＭＰ−１びＭＢＰ−ＣＭＰ−２”たんばく　の　び　１ＭＢＰベクターにおけるＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２融合たんばく質の発現を、ニューイングランド・バイオラブズ社のｐＭＡＬプロトコールに記載のようにして、対数関数的に増殖しているＥ、ｃｏｌｉ、培養物中にＩＰＴＧを添加することにより誘発させた。発現されたたんばく質をニューイングランド・バイオラブズ社のプロトコールに記載のようにして、アミロース樹脂上で精製した。概説すれば、細胞を遠心分離（５０００Ｐ　ＰＭ、ツルポル５Ｓ３４０−ター、１０分間、４℃）によりベレットにし、カラムにおいて緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７，４，２００ｍＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのナトリウムアジド）で洗浄し、同じ緩衝液中で細胞を元の媒質容積の１／１００の媒質に再懸濁し音波処理することにより溶菌した。細胞残渣を２０，０ＯＯＧで３０分間遠心分離することによりベレットにした。上澄み液を、細菌培養物１リットル当たり５０ｍ１の樹脂を使用してアミロースカラムに適用した。カラム容積の１０倍のカラム用緩衝液によりカラムを洗浄し、結合した融合たんばく質を１０ｍＭのマルトースを補給したカラム用緩衝液により溶出させた。

ＭＢＰ−ＣＭＰ−１びＭ１ヱーＣＭＰ−２（７）入天辺」成ＣＭＰのコラーゲン結合性部位の描写を一層正確にするためにＭＢＰ−ＣＭＰ− １及びＭ　Ｂ　Ｐ　−ＣＭ　Ｐ　−２の欠失を作った。ＭＢＰ−ＣＭＰ−２（又はＭＢＰ−ＣＭＰ−１）プラスミドをそのユニークなＸｂａ　Ｉ部位（この部位はＣＭＰ−２（又はＣＭＰ−１）フラグメントの３′においてｐＭＬＡ−ｃのポリリンカー配列に−している）で線状化した。線状化されたプラスミドをＢａｔ３１エキソヌクレアーゼ（１個の末端につき毎分１００個の塩基対の速度でＤＮＡを理論的に消化するであろう酵素濃度で）により消化し、反応混合物の一定量を１分間隔で取り出した。ＥＧＴＡの添加によりＢａ１３１消化を停止させた。

フェノール及びフェノール／クロロホルム抽出を行い、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）によりＤＮＡの末端を修復し、５０モル過剰の「ファルマシア制限性停止リンカ−」　（ファルマシア社、ビスキャタウエイ市、ＮＪ）により結紮した。このオリゴヌクレオチドの配列は３個の読み取り枠のそれぞれに關訳停止コドンを含有し、ユニークなＸ、　ｂ　ａ　Ｉ制限部位をクローンに導入した。Ｅ、ｃｏｌｉ、ＸＬ、ｌブルー細胞（ストラタジェン社、サンジエゴ市、ＣＡ）を結紮Ｄ　Ｎ　Ａと電気窄孔法により形質転換させた。

微量調製ＤＮＡをＸｂａ　Ｉにより消化させることによりコロニーを短縮ＭＢＰ −ＣＭＰ−２の存在についてスクリーニングした。短縮されたプラスミドを含有する推定されるクローンをＩ　ＰＴＧにより誘発させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより融合たんばく質の発現についてスクリーニングした。融合たんばく質を選定されたコロニーから精製し、タイプＴＩコラーゲンに対する結合能力についてスクリーニングした（ＥＬＩＳＡにより）。

ＣＭＰフラグメントによるコラー乞と肱豆立ゑ」コラーゲンに対するＣＭＰ構成体の結合の測定を前記したＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を使用して行った。

ＭＢＰ−ＣＭＰ　びＭＢＰ−ＣＭＰ−含た〜ザ／−策１づ辷モ１」肩友Ｚ精製されたＭＢＰ−ＣＭＰ−１及びＭ　Ｂ　Ｐ　−ＣＭ　Ｐ　−２融合たんばく質並びにそれらのＢａ１３１により生成された切断バージョンの分子量を１０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の後にたんばく質により移動した距離から推定した。既知の分子量を有するたんばく質標準物質を同じゲルの別のレーンにおいて電気泳動させた。標準物質の分子量をその移動距離の関数としてプロットした。ＭＢＰ融合たんばく質の分子量をこれらのゲル上で移動した距離から推定した。

ＭＢＰ−ＣＭＰ虫Ａたんばく　のＣＭＰ坦立王月１びにこの名城におけるアミノ　の寮の汰亙融合たんばく質はＭＢＰ領域（４３，０００ダルトン）とＣＭＰ領域（又はそのフラグメント）の両方を含有するので、融合たんばく質のＣＭＰ成分の分子量は、融合たんば〈質の分子量からＭＢＰの分子量を減算することによて決定した。この正味の分子量（即ち、ＣＭＰ成分の分子量）をアミノ酸の平均分子量（１１０）で割ってＣＭＰ領域のアミノ酸の数の推定値を得た。

コラーゲンに・　る１含４υ１個−ζ−望−Ｗニ二鼠ヱーニュ１区旦ＭＰ−２，でのζ【Δ図ＩＭＢＰ＝ＣＭＰ−１及びＭＢＰ−ＣＭＰ−２をコードする融合遺伝子をＢａ　ｌ　３１による消化に付して融合遺伝子のＣＭＰ−領域をコードする領域に末端欠失を生じさせた。融合たんばく質を、切断ＣＭＰ領域と共に、コラーゲンを結合する能力について試験した０表Ｉに示すように、融合たんばく質のＣＭＰ領域のＣ末端から１４５残基までの欠失はコラーゲンに対する結合を妨害しなかった。

従って、ＣＭＰ−１及びＣＭＰ−２のＮ末端にあるほぼ４５個のアミノ酸残基がコラーゲン結合にとって臨界的な領域でり又はそういう領域を含有する。このほぼ４５個のアミノ酸残基の領域は、ニワトりたんばく質においては（キス代地の番号付は方式により）ＣＭＰ−１のアミノ酸残基２４−６８　（ＡＰＰＱＰＲＧＴＬＣＲＴＫＰＴＤＬＶＦ　Ｉ　Ｉ　ＤＳＳＲ３ＶＲＰＱＥＦＥＫＶＫＶＦＬＳＲＶＩ　ＥＧ　（配列番号：　）及びＣＭＰ−２のアミノ酸残基２６２−３０６　（ＡＣ３ＧＧＳＧＳＡＬＤＬＶＦＬＩＤＧＳＫＳＶＲＰＥＮＦＥＬＶＫＫＦＩＮＱ、ＩＶＥＳＬＥＶＳＥ　（配列番号：　）並びにヒトたんばく質については（ジェンキンス代地の番号付は方式により）ＣＭＰ−１のアミノ酸残基２７−７１　（ＡＰＱＳＲＧＨＬＣＲＴＲＰＴＤＬＶＦＶＶＤＳＳＲＳＶＲＰＶＥＦＥＫＶＫＶＦＬＳＱＶＩＥＳＬＤ　（配列番号：　）及びＣＭＰ−２（７）アミノ酸残基２６４−３０９　（ＶＣ３ＧＧＧＧＳＳＡＴＤＬＶＦＬ　Ｉ　ＤＧＳＫＳＶＲＰＥＮＸＥＬＶＫＫＦＩＳＱＩＶＤＴＬＤＶＳＤ　（配列番号：）にほぼ相当する。

コラーゲン′ｌ′Ａ’　Ｗ＋　Ｉ　ＣＢＳ　１　モチーフこの４５個のアミノ酸領域内には、長さがこれよりも短いほぼ８〜１０個の残基の領域（これをコラーゲン結合性配列１　（ＣＢＳＩ）モチーフという）が存在するが、これはコラーゲンを結合する多くのたんばく質に共通している。その配列は、ニワトリＣＭＰ −１遺伝子では、Ｔ−Ｄ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｉ　−Ｉ−Ｄ−Ｓ−３である。また、ニワトリＣＭＰ−２遺伝子における配列は、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｉ−Ｄ−Ｇ −３Ｔある。コノ配列は、ニワトリたんばく質では（キス代地の番号付は方式により）ＣＭＰ−１のほぼアミノ酸残基３８−４７、ＣＭＰ−２のアミノ酸残基２７１−２８０に位置し、またヒトたんばく質では（ジェンキンス代地の番号付は方式により）ＣＭＰ−１（］：ｆぼ７ミ／酸残基４０−４９、ＣＭＰ−２のアミノ酸残基２７４−２８３に位置している。

■ 本発明のコラーゲン結合性ＣＭＰポリペプチドは、膠原質組織に治療剤、診断剤、化粧品又はその他の化合物を送り込むのに使用することができる０例えば、蛍光物質又は放射性標識物質のような造影剤をコラーゲン結合性ポリペプチドに結合させ、この複合体を使用して膠原質組織の構造を可視化させ分析することができる。膠原質組織の構造に影響し得る治療剤、例えば、コラゲナーゼをコラーゲン結合性ＣＭＰポリペプチドに結合させ、しかし７て膠原質組織に送り込むことができる。同様に、抗ガン剤を膠原質組織に送り込むことができる。化粧目的のための化合物、例えば水和又は保水のための化合物は、コラーゲン結合性ＣＭＰポリペプチドに共有結合させることにより膠原質組織、例えば皮膚に送り込むことができる。

送り込みを行うためには、化合物、例えばたんばく質は、−Ｇに、コラーゲン結合性ＣＭＰポリペプチドに共有結合される。ポリペプチドを共有結合させるための多くの方法が当業者に知られている６例えば、スクシンイミジルオキシカルボニル−〇−メチルーα−（２−ピリジルジチオ）トルエン及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ピアース社、ロックホード市、ＩＬ）は、たＡ／ばく質を段階的に結合させ、ホモ重合体の形成やその他の望ましくない副反応を回避することができるヘテロニ官能性の架橋剤である。

別法として、遺伝子工学的に細工した融合たんばく質を作り出してＣＭＰと膠原質組織に送り込もうとするたんばく質を結合させることができる。さらに、ＣＭＰ又はそのポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列を修飾して特定の化合物を結合させることができる０例えば、部位が指向された突然変異生成を使用してＣＭＰにグリコサミノグリカンのための結合部位を導入することができよう。ＥＧＦ様領域を修飾してこのような結合部位を導入することができよう。ＥＧＦ様領域の修飾はコラーゲンに対するＣＭＰの結合を妨害する傾向はない。

本発明のポリペプチドはある表面、例えば、組織の表面、その−例として歯又は歯肉の表面或いは医療器具、例えば体内に移植すべき器具の表面に対してコラーゲンの結合（例えば、共有結合又は非共有結合による）を促進するために適用することができる。

また、原線維発生に影響するＣＭＰ又はそのフラグメントは、コラーゲン原線維を形成させるのに使用することができる。そのように形成された原線維は、皮膚又はその他の膠原質組織の成分を置換するための補綴材として又は補綴器具の生体親和性を高める被覆材として使用することができる。

その他の具体例が本発明の範囲内で実施できる。

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Claims

【特許請求の範囲】１．軟骨基質たんぱく質領域ＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２のフラグメント又はアナログであるポリペプチドであって、コラーゲンに結合できるポリペプチド。２．該フラグメントがＣＢＳ１モチーフを含む請求の範囲１記載のポリベブチド。３．該フラグメントがＣＢＳｌモチーフから本質的になる請求の範囲１記載のポリペプチド。４．ポリペプチドが長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントを含む請求の範囲１記載のポリペプチド。５．ポリペプチドが長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−ＩのＮ末端フラグメントから本質的になる請求の範囲１記載のポリベブチド。６．ポリベブチドがＣＭＰ−１のＣＢＳ１モチーフから実施的になる請求の範囲１記載のポリペプチド。７．ポリベブチドがＣＭＰ−１のＣＢＳ１モチーフを含む請求の範囲１記載のポリペプチド。８．ポリベブチドが長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−２のＮ末端フラグメントを含む請求の範囲１記載のポリベブチド。９．ポリペプチドが長さがほぼ４５個のアミノ酸残基のＣＭＰ−１のＮ末端フラグメントから本質的になるポリベブチド。１０．ポリペプチドがＣＭＰ−２のＣＢＳ１モチーフから実施的になる請求の範囲１記載のポリベブチド。１１．ポリペプチドがＣＭＰ−２のＣＢＳ１モチーフを食む請求の範囲１記載のポリペプチド。１２．軟骨基質たんばく質又はそのコラーゲン結合性フラグメントをコラーゲンと接触させることからなるコラーゲン原線維の形成方法。１３．該フラグメントがＣＭＰ−１又はＣＭＰ−２である請求の範囲１２記載の方法。１４．ある化合物を膠原質組織に送り込む方法であって、コラーゲン基質たんぱく質のコラーゲン結合性フラグメントに結合させた該化合物を患者に投与することからなる、化合物を膠原質組織に送り込む方法。１５．軟骨基質たんぱく質のコラーゲン結合性フラグメントと造影剤又は治療剤とからなる分子複合体。１６．ある表面に対するコラーゲンの結合を促進させる方法であって、該表面にコラーゲン基質たんぱく質のコラーゲン結合性フラグメントを被覆し、被覆された表面をコラーゲンと接触させることからなる、表面に対するコラーゲンの結合を促進させる方法。１７．該表面が被移植者の身体に移植すべき器具の表面である請求の範囲１６記載の方法。１８．請求の範囲１記載のポリベブチドをコードする本質的に精製されたＤＮＡ。１９．請求の範囲１８記載のＤＮＡ配列を含むベクタ２０．請求の範囲１８記載のＤＮＡを含有する細胞。２１．細胞が請求の範囲１記載のポリペプチドを発現させることができる請求の範囲２０記載の細胞。２２．それぞれが請求の範囲１８記載のＤＮＡを含む細胞の本質的に均質な集団。２３．請求の範囲１８記載の単離されたＤＮＡの発現により産生されたポリベブチド。２４．請求の範囲１記載のポリペプチドと製薬上許容できる担体を含む治療用組成物。２５．請求の範囲２０記載の細胞を媒質中で培養してポリベブチドを発現させることからなる請求の範囲１記載のポリベブチドの製造方法。