JPH07505479A - 免疫的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫的分析方法 技術分野 本発明は、所望の抗体を対応する抗原とともにインキュベートし、その抗原の一 部は、水不溶性担体へ結合しているか、あるいは結合され、及びその抗原の他の 部分は、ラベルされているか、あるいはラベルされ、次いで固相を液相に分離し 、及び、固相中または液相中のいずれかのラベルの程度を測定する、免疫反応に よって試験区の生体液中の抗体の検出又は定量を行う診断方法に関この種の方法 は、マイオリニ（Ｍａｉｏｌｉｎｉ）他、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ、Ｍｅ　ｔｈ、 、Ｖｏ　１．２０　（１９７８）ｐｐ、２５−３４によって既知である。さらに 本発明は、この方法の利用とともに、一定の抗原に対するある種の抗体の検出ま たは定量に関する。

この種の方法においては、生体液を用いる場合、非特異的反応を予想しなければ ならないため、結果が無効となる可能性がある。分析サンプルの成分中に起こる 前記反応は、ラベルされた抗体を非特異的な様式で不溶性担体へと結合し、それ により抗体の存在を不正確に示し、そして誤った反応結果へ導く。

本発明の目的は、有効な結果を得ること、又は対応する様式での最終結果を証明 するため、所望の抗体の検出または定量期間中に、分析サンプルの一定の成分の 望ましくない影響を検出することである。

本発明の他の目的は、診断方法によって検出または定量され、そして抗原に対し て向けられ、また特定され、順にヒｈＴリンパ球に対する抗体機能を発揮する抗 体を特定することである。

本発明による第１の目的は、試験区での試験前、試験中又は試験後に、試験区の 反応と同じだが、インキュベーションが過剰の未結合及び非ラベル化抗原の存在 下で実施され、前記固相が液相から分離され、ラベルの程度が測定されまた抗体 の定性評価又は定量の期間中考慮される点で異なる反応を別個の対照区において 実施することにおいて満たされる。

発明の開示 本発明方法は、検出または測定される抗体を、最初から、結合抗体と、及び、対 照区の場合は、過剰の未結合かつ非ラベル化抗原と、−緒にインキュベートする ように、さらに展開される。

しかし、検出または測定される抗体の、結合抗原及びラベル化抗原とのインキュ ベーションが、それぞれの場合において、間に洗浄段階が入った二つの分離段階 中に行われ、及び、対照区においては、結合抗原及び／又はラベル化抗原とのイ ンキュベーション段階が、過剰の未結合及び非ラベル化抗原の存在下で行われる ように、本発明方法を実施することも可能である。

本発明方法は、検出または測定される抗体として、ウサギグロブリンに対するヒ ト抗体を用いることが好ましい。

さらに本発明を実施する場合、酵素、好ましくは西洋ワサビのペルオキシダーゼ を抗原のラベル化に用いるのが有利であることが見い出されている。

本発明の他の目的は、本方法において、抗原としてウサギグロブリンに対するヒ ト抗体及びウサギグロブリンを用いて行うことによって満たされる。これに関し て、ウサギグロブリンに対するヒト抗体と、その抗原としてのウサギグロブリン のインキュベーションを、最初から一緒に行うことができ、前記抗体の結合及び ラベル化抗原とのインキュベーションを、それぞれの場合において、間に洗浄段 階が入った二つの別個の段階において実施できる。但し、最初に記載した方法が より好ましい。

本発明で提案された方法は、免疫抑制を確保するために腎臓移植等の組織移植に おいて用いるように、ヒトＴリンパ球グロブリンに対する免疫血清からの抗体を 用いる治療の前、治療中及び治療後に、免疫血清の抗体と反応する抗抗体の存在 または形成を調節する目的に特に適したものである。

従って、本発明方法は、特にウサギグロブリンに対するヒト抗体の検出及び定量 に用いることができる。本発明方法は、以下において、ウサギグロブリンに対す るヒト抗体についてより詳細に説明される。分析サンプルのウサギグロブリンに 対する抗体は、一方において固相へ吸着結合し、他方において可溶性ウサギグロ ブリンペルオキシダーゼ複合化合物として試験培地へ加えられるウサギグロブリ ンとの結合標準溶液の抗体と同様に、−回のインキュベーション段階において反 応させることが好ましい。しかし、それらを間に洗浄段階を入れて、連続して反 応させることもできる。未結合物質を次いで洗浄段階で分離し、ラベルの程度を 固相又は液相中のいずれかで判定する。この酵素的指標反応によって生じた発色 強度は、光度計で測定され、又用いたウサギグロブリン抗体の濃度に直接的に比 例する。水不溶性担体上に吸着せず、また酵素でラベルされない、実質的に過剰 な一遊離のウサギグロブリンの試験培地への添加の結果として、存在するウサギ グロブリン抗体は完全に無力化されるので、それらはウサギグロブリン酵素複合 化合物をウサギグロブリン増感担体へ結合できない。それゆえ、添加された基質 は、前記酵素反応によって後続の分析の期間中に発色しない。しかし、発色反応 が起こる場合は、これは基質が反応していることを示すものであり、それはウサ ギグロブリン酵素複合化合物の水溶性担体への非特異的結合に帰せられるもので ある。正確な結果を得るためには、結果の評価時に、対応して反応した基質量を 考慮に入れなければならない。

可能な最高の試験感度を達成するため、免疫反応のために、１５℃〜２５℃での １６〜２４時間の培養期間が提案されている。

一つの試験を通しての濃度は３〜７％、及び、日ごとの濃度は５〜１５％である ことが見出されている。

全グロブリン群の抗体は、それらが人間あるいは動物種において生成されている か否かに拘らず、本発明方法によって分析できる。

本発明の他の利点、特徴及び詳細は、以下の実施例の記載において明らかにされ る。

試験区と対照区（よ同時に試験を行い、同一サンプル及び同一試薬を用いる。こ れら二つの試験は、固相二重抗原サンドイツチ法を基本として、一段階方法で行 う。従来のポリスチレンのマイクロプレートを、水不溶性担体として用いる。（ ウサギ）抗ヒトＴ　ＩＪンパ球（ＡＴＧ。

フレセニウス（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）社、フランクフルトより入手）を処理した 腎臓移植患者から得たプラズマを、サンプルとして供試した。試験前に、サンプ ルを、０．２モル／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）；５０　ｍ　ｌ　／　 ｌの子牛血清（ボエリンガーマンハイム（Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；１．Ｏｇ／ｌのフェノール及び０．２ ｇ／ｌのケトン（Ｋａｔｈｏｎ）ＭＷ／ＷＴ　（クリスト　（Ｃｈｒｉｓｔ）、 Ａｅｓｃｈ。

スイスより入手）から成る試験希釈緩衝液で５倍に希釈した。ウサギグロブリン 溶液及びウサギグロブリンペルオキシダーゼ複合体溶液を、試験試薬として用い る。この第１の試薬は、１．０ｍｇ／ｍｌのウサギグロブリンの２０ミリモル／ ｌトリス塩酸溶液（ｐＨ７，５）　、１５０ミリモル／ｌの食塩及び０．２ｍｌ ／Ｉのケトン（Ｋ　ａ　ｔ　ｈ　ｏ　ｎ　）　ＭＷ／ＷＴを含む。第２の試薬は 、５０μ／　ｍ　Ｉのウサギグロブリンペルオキシダーゼ複合物質の０．１モル ／１トリス塩酸溶液（ｐＨ７，５）　、５゜０　ｇ　／　ｌの牛血清アルブミン 、１．０ｇ／ｌのフェノール及び０．２ｍｌ／ｌのケトン（Ｋａ　ｔｈｏｎ）Ｍ Ｗ／ＷＴを含む。フェノール及びケトン（Ｋａｔｈｏｎ）ＭＷ／ＷＴは第２の試 薬の安定化に働く。前記第２の試薬を、即使用可能なペルオキシダーゼ試験溶液 として用いられるように、前記試験希釈緩衝液を用いて、５０倍に希釈する。ウ サギグロブリンに対する抗体の標準溶液は、１０μｇ／ｌの（ヒツジ）抗つサギ Ｉｇ抗体（ノルディック（Ｎｏｒｄｉｃ）、Ｔｉ　ｌｂｕｒｇ、オランダより入 手）の０．１モル／ｌのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６，５）　、５．０ｇ／ｌ の牛血清アルブミン及び０．２ｍ　ｌ　／　ｌのケトン（Ｋ　ａ　ｔ　ｈ　ｏ　 ｎ　）　ＭＷ／ＷＴを含む。

分画１０ミリモル／ｌの３，３°、５．５°　−テトラメチルベンジジン、１０ ０　ｍ　ｌ　／　Ｉのアセトン、９００ｍ１／ｌのエタノール及び８０　ｍ　ｌ 　／　ｌの過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）過酸化水素溶液 、及び３０ミリモル／ｌのコハク酸カリ緩衝液（ｐＨ４゜１）及び０．１５ｍ１ ／１のケトン（Ｋａｔｈｏｎ）ＭＷ／ＷＴを含む基質緩衝液も使用する。ＴＭＢ ／過酸化水素／即使用可能な基質緩衝液の混合液を、ＴＭＢ／過酸化水素溶液の １容量部と、基質緩衝液の２容量部を混合して調製する。

マイクロプレートの適当数のウェルを第１試薬を用いて増感し、マイクロプレー ト中で第１試薬からのウサギグロブリン溶液に対応する量を、ｐＨが９．５で、 １００ミリモル／１の炭酸水素ナトリウムを含有する増感溶液で希釈して、１． ０μｇ／ｌのウサギグロブリンを含む増感溶液を調製する。増感溶液の調製直後 に、その０゜２　ｍ　ｌをマイクロプレートの対応するウェル中ヘビペットで移 す。そのマイクロプレートに蓋をし、１５〜２５℃で１６〜２４時間静置する。

次に増感溶液をマイクロプレートから取り除き、捨てる。ウサギグロブリンで増 感されているマイクロプレートを、脱イオン水で３回洗浄する。残存している増 感されたマイクロプレートのタンパク質結合能を飽和するため、０．２モル／ｌ のトリス塩酸（ｐＨ７，５）　、Ｌｏｇ／Ｊの牛血清アルブミン及び０．２ｍｌ ／ｌのケトン（Ｋ　ａ　ｔ　ｈ　ｏ　ｎ）　ＭＷ／ＷＴを含む飽和緩衝液０．２ ｍｌを各ウェルへ加える。マイクロプレートを接着性のアルミホイルでシールし 、次の使用まで１５〜２５℃で少なくとも１日間静置する。

試験希釈緩衝液での試験の実施に先立ち、標準溶液を以下の一連の（ヒツジ）ウ サギ抗体希釈液を調製するため希釈する。

１１００ｎ／ｍ＋　抗つサギＩｇ抗体 ５０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　抗つサギＩｇ抗体２５ｎｇ／ｍｌ　抗つサギＩｇ抗体 Ｏｎｇ／ｍｌ　抗つサギＩｇ抗体 同様に試験の実施前、前記第２試薬のウサギグロブリンペルオキシダーゼ複合化 合物を前記希釈緩衝液で５０倍に希釈して、試験区用の即使用可能なペルオキシ ダーゼ試験溶液を調製した。

平行して、第２試薬のウサギグロブリンペルオキシダーゼ複合化合物を５０倍に 希釈して、対照区用の即使用可能なペルオキシダーゼ試験溶液を調製し、第１試 薬からのウサギグロブリンを、１０μｇ／ｌの遊離ウサギグロブリン濃度となる ように、さらに該溶液へ加える。

試験を実施するため、前記飽和緩衝液を、増感されたマイクロプレートの対応す る数のウェルから取り除いた。

さらに洗浄することなく、（ヒツジ）抗ウサギ抗体の各溶液（４濃度）及び希釈 した分析サンプル（４濃度）の各２００ｍ１を対応するウニ中ヘビペットで加え る。各試験において、５０μｌの試験区用即使用可能なペルオキシダーゼ試験溶 液を二つのウェル（２濃度）へ混合し、及び５０ｍ１の対照区用の即使用可能な ペルオキシダーゼ試験溶液を二つのウェル（２濃度）へ混合する。マイクロプレ ートを、次に再度接着性アルミホイルでシールし、１５〜２５℃で１６〜２４時 間インキュベートする。

次に試験溶液を取り除き、ウェルを脱イオン水を用いて６〜８回洗浄する。酵素 反応直前に調製した２００ｍＪの即使用可能なＴＭＢ／過酸化水素基質緩衝液を 、対応するウェル中ヘビペットで入れ、１０分間１５〜２５℃でインキュベート する。ペルオキシダーゼ活性を止め、又生じた発色濃度を強め、安定させるため 、１００μｌの反応停止液（１モル／ｌの硫酸）を対応するウェル中へ混合する 。

酵素反応の停止開始後３０分以内に、各ウェル中の発色度をマルチチャンネル光 度計を用いて波長４５０ｎｍで測定する。図１中に示されるように、標準曲線を プロットする際に、（ヒツジ）抗ウサギグロブリン抗体の各濃度について得られ た吸光度を記録する。分析サンプルの抗ウサギグロブリン抗体の含量を対応する 標準曲線から読み取り、対応する希釈係数を乗じる。これにより、４つの異なる 状況が起こる。

試験区及び対照区双方の分析サンプルは、０値の領域に吸光度を示し、サンプル 中に抗体が含まれないことを示す。

試験区の分析サンプルが明瞭な吸光度を示し、対照試験区では０値の領域に吸光 度を示めす。これは分析サンプルが抗体を含むことを意味する。抗ウサギグロブ リン抗体の含量は、対応する標準曲線によって定量分析できる。

分析サンプルは、試験区及び対照区において、はぼ同−の高い吸光度を示めし、 これは吸光度が全く非特異的活性から生じる為に、サンプルが抗体の含量に関し て適さないことを示す。

分析サンプルが試験区及び対照区で吸光度の増加を示し、試験区の吸光度が対照 区の吸光度より、かなり高い。

これはサンプルが、抗体の含量に関して使用可能であり、吸光度の差からウナギ グロブリン抗体の濃度を読み取り、計算することが可能であることを意味する。

しかし、これらサンプルは、同様にある程度の付加的な非特異的活性を示す。

結果は、用いた（ヒツジ）抗ウサギグロブリンの対応する希釈濃度との関係で得 られるか、あるいは滴定段階のいずれかで得られる。

もし、分析サンプルの測定値が、標準曲線によって決定される測定範囲外に入る ならば、二つの試験を分析サンプルのより高濃度の希釈液を用いて繰り返すべき である。

図２は、腎臓移植患者での、ＡＴＧ治療中のＡＴＧ抗体生成の進行状況を示す。

図２８は、ヒト抗ウサギ抗体の濃度を示し、図２ｂはＡＴＧ濃度を示す。二つの 図の比較から、連日投与したＡＴＧが、ヒト抗ウサギ抗体の強力な生成によって 無力化されていることが示される。

図に示された経過は、かなり稀に生じる。

図３は、ヒト抗ウサギ抗体の生成がない患者における、ＡＴＧ治療中のプラズマ 中のＡＴＧ濃度の典型的経過を示す。

試験区と対照区は、実施例１で詳述したものと同一の方法で試験を実施した。標 準的な一連の異なる、正確に定量した（ヒツジ）抗つサギＩｇ抗体の量の代わり に、反応性なし、反応性ややあり、及び明瞭に反応性である対照を、両試験にお いて用いる。やや反応性である対照は、１０ｎＨの（ヒツジ）抗つサギＩｇ抗体 を含有し、又明瞭に反応性である対照は、１１００ｎ／ｌ（ヒツジ）抗つサギＩ ｇ抗体を含有する。

試験区及び対照区の結果の評価を、実施例１に明示したものと類似の方法で実施 する。

（１ｍ１Ｂ　７／）　老Ｍ走４４Ｍ１’１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．試験区の試験前、試験中又は試験後に、試験区の反応と同じ反応であるが、 インキュベーションが過剰の未結合かつ非ラベル化抗原の存在下で実施され、固 相が液相から分離され、ラベル化の程度が測定されまた抗体の定性的検出又は定 量期間中考慮される点で異なる反応を、別個の対照区において実施することを特 徴とする、所望の抗体を対応する抗原とともにインキュベートし、その抗原の一 部は、水不溶性担体へ結合しているか、あるいは結合され、及び抗原の他の部分 はラベルされているか、あるいはラベルされ、次いで固相を液相から分離し、及 び、固相中または液相中のいずれかのラベルの程度が測定される、免疫反応によ って試験区の生体液中の抗体の検出または定量を行う診断方法。
2. ２．検出あるいは測定される前記抗体を、最初から、結合抗原及びラベルされた 抗体と、及び対照区においては、過剰の未結合かつ非ラベル化抗原と、一緒にイ ンキュベートすることを特徴とする請求項１項に記載の方法。
3. ３．検出あるいは測定される抗体の、結合抗原及びラベル化抗原とのインキュベ ーションが、それぞれの場合において、間に洗浄段階が入った二つの別個の段階 において行われ、及び対照区においては、結合抗原及び／又はラベル化抗原との インキュベーション段階が、過剰の未結合かつ非ラベル化抗原の存在化で実施さ れることを特徴とする請求項１項に記載の方法。
4. ４．検出あるいは測定される前記抗体が、ウサギグロブリンに対するヒト抗体で あることを特徴とする請求項１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．前記抗原がウサギグロブリンであることを特徴とする請求項１〜４項のいず れかに記載の方法。
6. ６．抗原をラベルする手段として酵素が用いられることを特徴とする請求項１〜 ５項のいずれかに記載の方法。
7. ７．前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項６項 に記載の方法。
8. ８．検出あるいは定量される抗体がウサギグロブリンに対するヒト抗体であり、 また前記抗原がウサギグロブリンであることを特徴とする、検出あるいは測定さ れる抗体を対応する抗原とともにインキュベートし、その抗原の一部を水不溶性 の担体へ結合させ、及びその抗原の他の部分をラベルし、次いでその固相をその 液相から分離し、ラベルの程度を固相又は液相中のいずれかで測定する、免疫反 応によって生体液中の抗体の検出または定量を行う診断方法。
9. ９．検出あるいは測定される抗体の、結合抗原及びラベル化抗原とのインキュベ ーションが、最初から一緒に行われることを特徴とする請求項８項に記載の方法 。
10. １０．検出あるいは測定される抗体の、結合抗原及びラベル化抗原とのインキュ ベーションが、各場合において、間に洗浄段階が入った二つの別個の段階におい て行われることを特徴とする請求項８項に記載の方法。
11. １１．以上記載の発明。