JPH07504560A - 糸状微生物の増殖制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糸状微生物の増殖制御 本発明は、培養物中の望ましくない変異株の発生を延期するかまたは防止するよ うに制御される糸状微生物の連続または供給バッチ培養法に関する。特に、本発 明は、タンパク質性生産物または代謝産物の製造法に関する。

糸状微生物の連続培養の際に、特に、長時間の培養後に、極めて分岐状のコロニ ー形成変異株の微生物が現れる傾向がある。時々、これらの変異株はある限られ た程度までしか現れないし、しかも培養物の全体の増殖にはほとんど影響がない 。しかしながら、他の場合において、変異株はますます増加して発生し、そして ついにはそれらを含む培養物の主要な微生物成分となりつる。この傾向は、糸状 微生物を用いる商業的発酵、特に、限られた菌糸分岐のみを有する糸状微生物を 生じることがしばしば望まれるタンパク質性組成物の生産用発酵にとって望まし くない結果をもたらす。

１９６９年以来、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎ ｅａｒｕｍ）（シュワーベ（Ｓ　ｃ　ｈｗａ　ｂ　ｅ）　）の菌株を小麦デンプ ン含有培地中で培養して、ヒトが消費するための高タンパク質食品中に配合する ことができるタンパク質性生産物を製造する方法が開発されてきた。この方法の 生産物は栄養性に優れており、しかも獣肉および鳥肉などの繊維食物であると思 わせられる類似物を製造するすることができる。この方法は、特に、本明細書中 に参考として文書の内容が包含されている、英国特許第１３４６０６１号明細書 ；英国特許第１３４６０６２号明細書；欧州特許第１２３４３４号明細書および 、Ｒ，Ｋ、プーレ（Ｐｏｏｌｅ）らによって監修され且つ５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ 　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙによって公開されたトリンシ（Ｔ ｒｉｎｃｉ）らによる「微生物増殖力学（Ｍｊｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　 Ｄｙｎａｍｉｃｓ）Ｊの２章に記載されている。培養条件は、糸状生産物の分岐 を制限し且つ処理微生物の望ましくないコロニー形成変異株が培養物中で発生す る程度を制限するように制御されるのが望ましい。

本発明者は、ここで、糸状微生物の連続培養を、培養物中の望ましくない変異株 の発生を延期するかまたは防止するように制御することができる手段を開発した 。

本発明により、本発明者は、炭素を含む適当な栄養素源が供給されていて、培養 物の増殖を制限する量で供給され且つそれに対する制限栄養素を構成している栄 養素源である培地中における糸状微生物の連続培養での培養法であって、該糸状 微生物の望ましくない変異株の発生が、第一栄養素源を培養物に対して制限栄養 素として供給した後、培養物に対する該栄養素供給を、第二栄養素源が制限栄養 素源として第一栄養素源に取って代わるような方法で変更することによって制限 されるおよび／または延期される上記方法を提供する。

更に、本発明により、本発明者は、炭素を含む他の適当な栄養素源が供給されて いる培地中における糸状微生物の連続培養での培養によるタンパク質性生産物の 製造法を提供する。培養物の増殖を制限する量で供給され且つそれに対する制限 栄養素を構成する一つの栄養素源および、糸状微生物の望ましくない変異株の発 生が、第一栄養素源を培養物に対して制限栄養素として供給した後、培養物に対 する該栄養素供給を、第二栄養素源が制限栄養素として第一栄養素源に取って代 わるような方法で変更することによって制限されるおよび／または延期される培 養物からの糸状微生物の分離。

更に、本発明により、本発明者は、炭素および他の適当な栄養素源が供給されて いて、該炭素または別の栄養素源が培養物の増殖を制限する量で供給され且つそ れに対する制限栄養素を構成する培地中における糸状微生物の連続または供給バ ッチ培養並びに、生産された該糸状微生物または該培地からの代謝産物の回収に よる代謝産物の製造法であって、該糸状微生物の変異株の発生が、第一栄養素源 を培養物に対して制限栄養素として供給した後、培養物に対する該栄養素供給を 、第二栄養素源が制限栄養素として第一栄養素源に取って代わるような方法で変 更することによって制限されるおよび／または延期される上記方法を提供する。

本発明の方法には様々な用途があり、制限栄養素を用いる発酵法を糸状微生物の 培養に対して行なうときは必ず本発明を用いることができる。特に、それを用い て、英国特許第１３４６０６１号明細書；英国特許第１３４６０６２号明細書； 欧州特許第１２３４３４号明細書に記載された発酵法によるタンパク質性生産物 を製造することができる。何等かの適当な糸状微生物を培養してタンパク質性生 産物を製造することができ、例えば、コモンウエルス・マイコロジカル・インス テイテユート（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａ　１　ｔｈ　Ｍｙｃｏ　ｌ　ｏｇｉ　ｃａ　 １Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、キューに、番号ＩＭＩ　１４５４２５およびＣＭＩ　 ＣＣ番号３４６．７６２として寄託されているフザリウム属、例えば、フザリウ ム・グラミネアルム（シュワーベ）の菌株並びにペニシリウム・ノタトゥム・ク リソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏｔａｔｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ ｍ）ＩＭＩ　１３８．２９１がある。本発明は、更に、代謝産物、例えば、スト レプトマイシンでありうる抗生物質を生産するストレプトミセスーコエリカラー （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌ　１ｃｏｌｏｒ）などのストレプトミセ ス属などを用いる発酵法において用いることができる。

本発明の方法において、制限栄養素は、それが実施される発酵および状況によっ て適当に選択される。工程中に制限栄養素の単一の交換を行なうことができるが 、好ましくは、該工程は、操作時間中に間隔をおいて制限栄養素の一連の交換を 伴って実施される。交換は、２種類の栄養素源のみを制限栄養素として必要とす ることができるが、好ましくは、その方法は、２種類またはそれ以上の種々の栄 養素源を制限栄養素として順次に用いながら実施される。好ましくは、該工程は 、制御サイクルにしたがって、一連の２種類またはそれ以上の栄養素源を制限栄 養素として用いながら行なわれる。

一つの栄養素源を制限栄養素としてのもう一つによって交換するタイミングは種 々の方法で選択することができる。培養物の増殖を監視することができ、そして 発生が抑制されるべき変異株が予め決定された程度まで発生した場合に、例えば 、それが、培養物中に存在する微生物細胞の１％程度を形成する場合に、一つの 栄養素源をもう一つによって交換することができる。或いは、特定の微生物の培 養物の増殖を詳細に研究して、抑制されるべき変異株の発生を予測することがで きる。これが納得のいくように行なわれた場合、制限栄養素としての栄養素源の 交換を予め決定された時間間隔で行なうことができる。

制限栄養素として用いるのに適当な栄養素源としては、キシロース、マルトース 、リボース、フルクトース、スクロースまたはグルコースなどの炭素源、マグネ シウム源、リン酸塩源および硫酸塩源、そして特に、窒素不含代謝産物が生産さ れる場合、窒素源がある。好ましくは、何等かの交換サイクルにおいて制限栄養 素として用いられる栄養素源は、タンパク質性生産物の製造法での窒素源のよ　 −うに、該工程の生産物の製造において最も重要な栄養素ではない。増殖制限栄 養素として炭素源の交換を行なう方法は、特に、グルコースおよびフルクトース 間で採用することができる。

本発明によるいずれの方法においても、工程中に規則的な基準で制限栄養素を変 更するのに適当な方法は、該工程に依存し、更に詳しくは、該工程で用いられる 糸状微生物に依存する。

制限栄養素を変更するのに適当な方法としては、主として、フザリウム属菌株の 培養によるタンパク質性生産物の製造法において用いるのに設計された下記があ る。

（ａ）培養物を規則的に監視し、そして培養物中の微生物集団が望ましくない変 異株の形成のために不都合に変化し始めた徴候がある場合に制限栄養素を変更す る方法。この方法において、３種類の異なる栄養素源を、下記のような制限栄養 素として交互に用いることができる。

１、炭素源、例えば、グルコース ２、マグネシウム源 ３、リン酸塩源。

制限栄養素のこのサイクルを工程の実施中に繰返す。微生物としてフザリウム・ グラミネアルム（シュヮーベ）を用いる典型的な場合、制限栄養素交換の間の時 間間隔は、例えば、下記の通りであってよい。

炭素源〜マグネシウム源−２０日後 マグネシウム源〜リン酸塩源−１４日後。

（ｂ）本発明の方法において一般的に用いるのに好ましい方法は、最初に炭素を 制限されたケモスタットを用いて、制限栄養素を規則的に７目間隔で変更するこ とである。サイクルは下記の通りであるのが適当である。

１、炭素源 ２、マグネシウム源 ３、リン酸塩源 ４、硫酸塩源 工程の間中繰返される制限栄養素サイクルは、多くの場合好ましい方法である。

提案された制限栄養素は該工程の生産物の製造にとって重要でないことが好まし い。例えば、抗生物質の製造に関して、その合成において硫酸塩を配列して制限 栄養素として硫酸塩を用いるのは好ましい方法ではないと考えられる。

本発明の方法の操作中に制限栄養素の変更が行なわれる場合、希釈速度は、何等 かの望ましくない変異株を微生物集団から一層効果的に除去するために、例えば 、０．０５〜０．１０時−１の範囲の量まで適当に減少される。

本発明を下記の実施例によって例証する。

長期間の連続培養の際に「フザリウム・グラミネアルムＪ　Ａ３１５　（野生型 ）（ＩＭＩ　１４５４２５、ＣＭＩ　ＣＣ番号３４６，７６２）　に取ッテ代わ る極めて分岐状の変異株（コロニー形成変異株）の発生。

旦煎 コロニー形成変異株が培養物で優勢になるのを防止するかまたは延期する方法を 開発すること。

」 （ａ）目的 連続培養中に野生型菌株に取って代わるコロニー形成変異株の能力に対する種々 の栄養素制限の効果を研究すること。本発明者は、２種類のコロニー形成変異株 を用いた。

（ｉ）ＣＣＩ−１−実験室発酵槽中において炭素制限下で発生した変異株。

（ｉ　１）Ｃ１０６−製造工場の作業中に発生した変異株。

（ｂ）方法 本発明者は、野生型および変異株両方の菌株を発酵槽に接種して集団巾約５〜４ ０％の変異株を与えた後、その混合培養物を多数の栄養素、すなわち、炭素、ア ンモニア、マグネシウムおよびリン酸塩制限下において連続的に増殖させた。

図１は、Ａ３１５のグルコース制限発酵中のＡ３１５連続培養において自然に発 生した約１００世代後に最初に検出されたＣＣｌ−１変異株を示す。更に約１０ ０世代後に、ＣＣＩ−１は全集団の〉９０％を構成した。

図２は、ＣＣｌ−１の淘汰係数（Ｓ）が、マグネシウム制限下において−０゜０ ３９世代−１であることを示す。

図３は、ＣＣｌ−１が、アンモニア制限培養において増殖させた場合にほぼ一定 の状態のままであったことを示す。

図４は、ＣＣｌ−１が、硫酸塩制限ケモスタット培養において増殖させた場合に ほぼ一定の状態のままであったことを示す。

同様に、ＣＣｌ−１優勢は、グルコース制限培地からフルクトース制限培地に切 り換えることによって防止することができた。ＣＣｌ−１は、グルコース制限増 殖の際に、集団の１０．６±１．１％から４２．１±４．５％まで増加した（希 釈速度Ｄ＝０．１６時−１）。グルコース制限培地からフルクトース制限培地に 切り換えた後、集団中のＣＣｌ−１集団は４０．６±２．１％で一定の状態のま まであった。

ＣＣｌ−１はキシロース制限培地中の集団において増加しなかったが（Ｓ＝−０ ，０６世代　）、マルトース（Ｓ＝０．０９世代−１）およびリボース制限（Ｓ ＝０゜０９世代−１）培地中においては増加したことが注目された。

図５は、グルコース制限培養（Ｓ＝０＋０．１４５世代−１）において増殖させ た場合に野生型Ａ３１５に取って代わったＣＣｌ−１を示す。

図６は、ＣＣｌ−１優勢をどのように防止することができるかを示す。最初に、 培養物をグルコース制限下におき、ＣＣｌ−１は野生型に取って代わり始める。

約４０世代後、培養をマグネシウム制限に切り換え、そして０ＣＴ−１の増加は 停止した。点線は、グルコース制限が保持された場合に予想されるＣＣＩ　−１ の増加を示す。

少し且つＡ３１５が増加したことを示す。約４０世代後、培養を硫酸塩制限に切 り換えた。硫酸塩制限増殖中に、Ｃ１０６はほぼ一定水準のままであった（Ｓ＝ ）。

図８は、アンモニア制限下において（Ｓ＝−０，０３世代−１）において０１０ ６が減少し且っＡ３１５が増加したことを示す。約３５世代後、培養をマグネシ ウム制限に切り換えた。マグネシウム制限増殖中に、Ｃ１０６は速やかに野生型 に取って代わった（Ｓ＝０．１５世代−１）。約５５世代後、培養を炭素制限に 切り換えた。切り換え後、０１０６は集団中において減少した（Ｓ＝−０，０２ 世代−１、図７を参照されたい）。この期間中に、新規のコロニー形成変異株が 集団中において検出された涜験の開始から約７５世代およびマグネシウムから炭 素制限への切り換え後２０世代）。これらの突然変異体は、集団中において速や かに増加した。約９５世代後、１種類または複数の新規のコロニー形成変異株が 約４０％の水準に達した時点で培養をアンモニア制限に切り換えた。アンモニア 制限増殖中に、１種類または複数の新規のコロニー形成変異株の増加は停止した 。リン酸塩制限下（Ｓ＝−０，０４世代−１）においてもＣ１０６は減少し且つ Ａ３１５は増加した。

図９は、希釈速度りが０．０６時−１でのマグネシウム制限下において、０１０ ６は野生型に取って代わった（Ｄ＝０．１９時　でのＳ＝０．１５世代−１と比 較してＳ＝１．１世代−１）。図１０において、野生型は希釈速度りが０゜０６ 時−１でのグルコース制限においてＣ１０６に取って代わった。約１５世代後、 培養をマグネシウム制限に切り換えた。この期間中に、（図１０を参照されたい ）Ｃ１０６水準は速やかに上昇した（Ｓ＝１．２世代−１）。グルコース制限に 戻る切り換えで、Ｃ１０６水準は再度降下した（約２５世（資）。

用いられた適切なフォーゲルス（Ｖｏｇｅｌｓ）培地の組成を下記の表に示す。

このデータは、炭素制限条件がＣ１０６集団を抑制し且つＣＣｌ−１の不存在に おいて長期間耐えうることを示す。ＣＣｌ−１は制御することができるし、しか も若干の場合において硫酸塩またはマグネシウム制限条件によって減少させ且つ 窒素制限条件下において安定化することができる。これは、存在する変異株を監 視し且つそれらの集団が少ない場合に適当に増殖制限条件を変更することによっ て、望ましくない微生物が望まれる微生物を圧倒したために製造工程を閉鎖する 要求を延期することが可能であることを示す。

＝ 実験方法 装置ニブラウン（Ｂ　ｒ　ｏ　ｕ　ｎ）によって商品名バイオスタット（Ｂｉｏ ｓｔａｔ）Ｍとして販売された空気および栄養素供給設備を備えた商業的に入手 可能な連続発酵装置（２リツトル）培養量：２０００ｍ１ 培地：修飾フォーゲル培地（表を参照されたい）消泡剤：０．２５％（Ｖ／Ｖ） ポリプロピレングリコール（混合分子量）ｐＨ＋５．８±０．１で維持された（ ２Ｍ　ＮａＯＨ溶液の添加による）空気圧＝１．６リツトル分−１ 撹拌速度：１４００ｒｐｍ 温度：２５℃ 希釈速度：０．１９時−１（特に断らない限り）生物量：乾燥重量約２ｇ培地リ ットル−１（全制限に関して）集団組成の評価：集団の組成は、寒天で凝固させ たフォーゲル培地上の生存数を計数することによって評価された。発酵装置から の試料を滅菌蒸留水で希釈し、そして懸濁液０．１ｍｌを１０〜１５個の寒天平 板上に塗抹して２０〜６０コロニー／平板を生じた。コロニー形成単位（菌糸体 フラグメントかまたは胞子由来）を２５℃で７２時間のインキュベーション後に 計数した。コロニー形成突然変異体コロニーは、直径が徐々に増加した密集コロ ニーを形成し、しかもそれらは野生種コロニーとは別個に計数されたので、それ らを野生種コロニーとＩＵＩすることができた。生存計数はほぼ２４時間または ４８時間間隔で行なわれた。

制限栄養素二表１に示したような原液を調製した。これらは１種類の特定の栄養 素で制限された。異なる制限栄養素に切り換える場合、前の設定条件下において 栄養素が過剰であったので、発酵装置容器中で望まれるように特定の栄養素濃度 を減少させるには１〜４８時間の時間間隔が必要とされた。

方法 例えば、図６および図８から、下記の方法が好ましいであろうことが分かる。集 団組成が好ましくなくなった第一の徴候において、下記の制限を用いて栄養素制 限を変更する。

（ａ）２０日間のグルコース制限後、コロニー形成突然変異体が１％集団で現れ る。

（ｂ）１４日間のＭｇ２＋制限に変更し、ここでコロニー形成突然変異集団は１ ゜５％集団に達する。

（ｃ　）　Ｐ　０４−制限に変更する。

この操作はコロニー形成突然変異体集団を臨界的水準未満で長期間保持する。

制限の変更は、希釈速度の一時的減少と一緒になって、混入した突然変異体を一 層効果的に集団から除去することができる。（例えば、図８における一層高い希 釈速度と比較される図９および図１０を参照されたい）。

別の方法は、図８から分かるように、栄養素制限を規則的に７目間隔で変更する ことである。

配列順は、７日目までグルコース制限、１４日目までＭｇ２＋制限、 ３５日目までグルコース制限 Ｍｇ２＋制限等、または ７日目までグルコース制限、 １４日目までＭｇ２＋制限、 グルコース制限等であってよい。

（ａ）は好ましい方法であるが、その方法がいくつかの種類の制限を妨げる場合 （例えば、合成において硫酸塩を必要とする抗生物質の生産において硫酸塩を制 限しないように、タンパク質を生産する方法において窒素源を制限しない）、（ ｂ）に示唆した方法の種類を行なうのが不可欠であることがある。

Ｍ閏（？代） Ｂ？　ｒａ’ｌ　（世　イ→こ） ０眸ヒ　外ＰＩ　ｃｉ　イ文） ｌｉｔ　／’／ｌ　（ｔ！！代） げずト　已（１（せイ八ミ〕 時間（１！！ｍ代） 妓 吟　聞Ｃ世代ノ 、　Ｎｓ　ＰＣＴ／ＧＢ　９１１０２２３４フロントページの続き （７２）発明者　ロブソン、ジェフリー・デーヴイッドイギリス国マンチェスタ ー　エム１６・８オーダプリユー、ワリー・レインジ、アソル・ロード　２７ （７２）発明者　ライ−ぺ、マリリン・ゲイルイギリス国チェシャー　ニスケイ ４・４エヌエックス、ストックボート、ヒートン・ムーア、ヒートン・ムーア・ ロード　３８（７２）発明者　ネイラー、トーマス・ウィリアムイギリス国ダラ ム　ディーエル５・６アールエイ、ニュートン・アイクリフェ、ハイイントン・ ヴイレッジ、ウェスト・グリーン　６．ダフネ・ハウス

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．炭素および他の適当な栄養素源が供給されていて、該炭素または別の栄養素 源が培養物の増殖を制限する量で供給され且つそれに対する制限栄養素を構成す る培地中における糸状微生物の連続培養での培養法であって、該糸状微生物の変 異株の発生が、第一栄養素源を培養物に対して制限栄養素として供給した後、培 養物に対する該栄養素供給を、第二栄養素源が制限栄養素として第一栄養素源に 取って代わるような方法で変更することによって制限されるおよび／または延期 される上記方法。
2. ２．炭素および他の適当な栄養素源が供給されていて、該炭素または別の栄養素 源が培養物の増殖を制限する量で供給され且つそれに対する制限栄養素を構成す る培地中における糸状微生物の連続培養での培養並びに該培養物からの該糸状微 生物の分離によるタンパク質性生産物の製造法であって、該糸状微生物の変異株 の発生が、第一栄養素源を培養物に対して制限栄養素として供給した後、培養物 に対する該栄養素供給を、第二栄養素源が制限栄養素として第一栄養素源に取っ て代わるような方法で変更することによって制限されるおよび／または延期され る上記方法。
3. ３．炭素および他の適当な栄養素源が供給されていて、該炭素または別の栄養素 源が培養物の増殖を制限する量で供給され且つそれに対する制限栄養素を構成す る培地中における糸状微生物の連続培養での培養並びに生産された該糸状微生物 からまたは該培地からの代謝産物の回収による代謝産物の製造法であって、該糸 状微生物の変異株の発生が、第一栄養素源を培養物に対して制限栄養素として供 給した後、培養物に対する該栄養素供給を、第二栄養素源が制限栄養素として第 一栄養素源に取って代わるような方法で変更することによって制限されるおよび ／または延期される上記方法。
4. ４．糸状微生物がフザリウム属の菌株である請求項１〜３のいずれかに記載の方 法。
5. ５．３種類またはそれ以上の種々の栄養素源を制限栄養素として順次に用いる請 求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．栄養素源を規則的なサイクルにしたがって制限栄養素として用いる請求項５ に記載の方法。
7. ７．制限栄養素としての栄養素源の交換を予め決定された時間間隔で行なう請求 項６に記載の方法。
8. ８．制限栄養素として用いられる栄養素源を、炭素、マグネシウム、リン酸塩、 硫酸塩および窒素から選択する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. ９．制限栄養素の変更を行なう場合に希釈速度を減少させる請求項１〜８のいず れかに記載の方法。