JPH07504333A - Ｃ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体及び抗イディオタイプ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称＝Ｃ型肝炎ウィルスに対するモノクローナル抗体及び抗イデイオタイプ抗体 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス抗原と特異的に免疫反応を示すモノクローナル抗体 、該抗体を分泌する細胞系、該抗体を含む免疫診断試薬、並びにＨＣＶ検出のた めの方法及び検査キットに関する。

本発明は更に、抗イデイオタイプ抗体、該抗イデイオタイプ抗体を分泌する細胞 系、該抗イデイオタイプ抗体を含む免疫診断試薬、並びに抗イデイオタイプ抗体 を用いて試料中の抗■Ｃｖ抗体を検出するための検査キットに関する。

Ｃ型肝炎ウィルス（１’１（Ｊ）　ハ、ＮＡＮＢ　（非Ａ非Ｂ）　型肝炎を引き 起こす因子のひとつとして認識された、９．４ｋｂの一本鎖ポリアデニル化ＲＮ ＾ウィルスである。ＨＣＶは急性及び慢性の肝臓疾患を引き起こし、また肝細胞 ガンに関係する。

非Ａ非Ｂ型肝炎は、他の形態のウィルス関連肝臓疾患［例えば、公知の肝炎ウィ ルス、即ちＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＪ）　、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）及びδ 型肝炎ウィルス（ＩＩＤＶ）によって引き起こされる疾患、並びにサイトメガロ ウィルス（ＣＭＶ）又はエプスタイン−パールウィルス（ＥＢＹ）によって誘発 される肝炎］と区別することができる。

疎水性プロット及び配列相同性に基づ（証拠から、ＨＣＶがフラビウイルス（Ｆ ｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーと僅かに関連初めて同定された。ヒトから チンパンジーへの伝搬及びチンパンジーでの連続継代によって、非Ａ非Ｂ型肝炎 が伝搬性感染因子によるものであることが実証された。

疫学的証拠は、非Ａ非Ｂ型肝炎には水系感染（ｗａｔｅｒ−ｂ。

ｒｎｅ）流行性型、血液又は針関連型及び散発発生（集団獲得）型の３つの型が あることを示唆している。ＨＣｖのウィルスゲノムは、広範囲（ｅｘｔｅｎｓｉ ｖｅ）の翻訳後プロセッシングを受ける約３０１０アミノ酸のポリタンパク質を コードする。ウィルス構造領域は非構造領域の上流に位置し、保存性の高い１９ ｋＤａのヌクレオカプシドタンパク質、及び広範囲にグリコジル化された２個の エンベローブボリベブチドｇｐ　３３（Ｅｌ）、ｇｐ７２（Ｅ２／Ｎ５Ｉ）を含 むと推定される。最近の研究では、Ｅ２／ＮＳＩのＮ末端領域に、実質的に全て のＨＣＶ単離物間で実質的な配列不均一性が存在することが指摘されている。こ のことは、ＩＩＣｖエンベロープのこの領域が強い免疫選択下にあり得ることを 示唆している。様々な推定上の非構造タンパク質が、残余の■Ｃｖポリタンパク 質からプロセシングされるが、そのような非構造タンパク質には、膜結合２３ｋ Ｄａタンパク質ＮＳ２、及びウィルスヘリカーゼに相当し、現在ＮＳタンパク質 のプロセシングに関与すると考えられているＮ末端セリンプロテアーゼドメイン を含み得る約６０ｋＤａの可溶性タンパク質ＮＳ３が含まれる。ＮＳ４タンパク 質の機能は現在判明していないが、このタンパク質は免疫優性抗体結合部位を含 む５−１−１断片を含んでいる０：ｕｏ　Ｇ、等、Ｓｅｔ露すると、抗−ｃｌｏ ｏ−３（ＮＳ３のＣ末端及びＮＳ４タンパク質の一部分を包含する組換えタンパ ク質）に血清転換（５ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）する数週間前にウィルス核 タンパク質の保存領域及びＮＳ３に対する抗体が出現し得ることが臨床研究で判 明した。従って、保存性の高いＩＩｃＶヌクレオカプシドタンパク質及びＮＳ３ を包含する血清アッセイは急性■Ｃｖ感染の有用な診断マーカーになる。

ＨＣｖウィルスのＮＳ３タンパク質と特異的に反応し、また臨床検体でのＨＣＶ の存在の有無を検出するための免疫診断検査で特に有用な新規なモノクローナル 抗体を提供することが本発明の目的である。

本発明は、９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔ４ ｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏ ｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエプスタイン−バールウィルス形質転換ヒトＢリンパ 球細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体によって特異的に認識される、 Ｃ型肝炎ウィルスのＮＳ３タンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗 体を提供する。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒ ｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅｓ。

Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエプスタイン−バールウィルス形 質転換ヒトＢリンパ球細胞系によって分泌される。

本発明のモノクローナル抗体によって認識されるＮ５−３エピトープを含むペプ チドは、同時係属中である同−所有権者の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９３１０３４７ ８に記載されている。この明細書の内容は参考として本明細書の一部を構成する ものとする。

前述の細胞系は、１９７７年のブダペスト条約の規定に基づき１９９２年１２月 １６日にＥＣＡＣＣに寄託された。

これらのモノクローナル抗体を分泌し得る細胞系も本発明の一部である。

モノクローナル抗体を産生ずる細胞系は例えば、エプスタイン−バールウィルス による形質転換、ＫＱｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの技術（Ｋ５ｈｅｒ及びＭ ｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する技術を考 案した（Ｇ、ＫＱｈｌｅｒの直接形質転換技術、ヒトＢリンパ球と融合パートナ −（ヒト若しくはマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系）との直接融合、又は ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系と前記骨髄腫細胞系との直接融合によって製造され得る 。

本発明の好ましい細胞系は、Ｃ型肝炎ウィルスのＮＳ３タンパク質上のエピトー プと結合するモノクローナル抗体を分泌し得るエプスタイン−バールウィルス形 質転換ヒトＢリンパ球クローン細胞系である。この細胞系は、９２１２１６０９ の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　 Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されて いる。

エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＹ）は、ヒトＢリンパ球の形質転換及び不 死化を可能とする。エプスタイン−バールウィルスを用いれば、パートナ−たる 骨髄腫細胞を用いずに不死化したヒトＢリンパ球を得ることができる。工プスタ インーバールウイルスは種々の供給源から得ることができる。最もよ（使用され ているＥＢＶ源は、Ｂ９５−８マーモセツト細胞系である。Ｂ９５−８細胞系は 自発的にエプスタイン−バールウィルスを培地中に放出する。

ＥＢＶ形質転換細胞のクローニングのために良好な支持細胞層を提供するため、 様々な細胞型が提案されている。最もよ（使用されているのは、末梢血単核細胞 （ＰＢＭＣ）及び線維芽細胞である。

ＰＢＩＩＣは単球と、Ｔリンパ球と、８９２８球（５〜１０％）とからなる。全 ての８９２８球が的確な特異性を有する抗体を提供するわけではないので、適切 な細胞についてＰＢＭＣを増やすことが有利である。ＥＢＶ形質転換細胞に対す る細胞障害性Ｔ細胞が生成しないように、（例えばＥＢＶ産生可能なり９５−８ 細胞系由来の上清による）　ＥＢＶ感染の前に、細胞を洗浄済ヒツジ赤血球で処 理してＴリンパ球を除去することができる（Ｉｎ：“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｖ ｏｌ、　ｌ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃｌｅ　ａｐｐｒｏａｃｈ”、　Ｅｄｉｔｏｒ ：　Ｃａｔｔｙ　Ｄ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎ ｄ。

１９８ｇ、　Ｃｈ、　４）。

本発明の不死化Ｂ細胞系は、以下の要件に適う場合、モノクローナルであるとみ なした： １）経時的な（〉６力月）抗体分泌の安定性、２）僅か１個のＩｇＧ（ＩＩ及び Ｌ）機能分子の分泌、３）連続して行う少なくとも２回のサブクローニング手順 後の抗体分泌の特異性及び安定性（成長するコロニーの１００％は、親糸と同一 の遺伝子表現型及び特異性を有するＩｇＧを分泌する）。

本発明のモノクローナル抗体は、検査試料中のＢＣｖ又は■Ｃｖ断片を検出する ためのいわゆるイムノアッセイで使用するのに極めて適している。

本発明の抗体を含む免疫診断試薬及び試料中のＨＣｖを検出するための検査キッ トも本発明の一部である。

用いるアッセイシステムによって生起する免疫化学反応は、いわゆるサンドイッ チ反応であってもよく、凝集反応であってもよく、競合反応であってもよく、又 は阻害反応であってもよい。

以下のアッセイシステムは単に例示的であって、本発明を制限するものではない 。

検査試料中のＨＣｖ検出のために例えばサンドイッチ反応を実施する場合、使用 すべき検査キットは、固相担体（例えばマイクロテストウェルの内壁）上にコー ティングされた本発明のモノクローナル抗体、及び結合体としての標識モノクロ ーナル抗体又はその断片を含む。

使用できる担体は例えば、マイクロテストウェル若しくはキュベツトの内壁、管 若しくは毛細管、膜、フィルター、テストストリップ又は粒子（例えばラテック ス粒子、赤血球、色素ゾル、金属ゾル、若しくはゾル粒子としての金属化合物、 ＢＳＡ若しくはＫＬＨのような担体タンパク質）の表面である。

使用できる標識物質はとりわけ、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、色素ゾル、 金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物若しくは他のゾルである。ＨＣＶの検 出に使用できる他のイムノアッセイの例は、標識試薬としてヒトモノクローナル 抗体を用いる阻害アッセイである。この試薬と固相上の抗原との結合は試験試料 中の抗体と競合し得る。

前述した如く本発明のモノクローナル抗体は診断に非常に適しているが、これら の中和抗体は受動免疫療法で非常に有用である。

本発明のモノクローナル抗体を使用して、抗イデイオタイプ抗体を産生ずること もできる。

抗イデイオタイプ抗体は免疫グロブリンの可変部分に対する抗体である。抗イデ イオタイプ抗体の亜集団（５ｕｂ−ｐ。

ｐｕｌａｔｉｏｎ）は“抗イデイオタイプβ”又は“内部像（ｉｎｔｅｒｎａｌ 　ｉｏ＋ａｇｅｓ）”として知られている。これらの抗イデイオタイプβ抗体は 抗原との間に構造的又は三次元的類似性をデルで感染症に対するワクチンとして 広範に使用されていセイで使用するために、抗イデイオタイプ抗体を多量に作製 することができる。

抗イデイオタイプ抗体を産生ずるための技術は当業界で公知である。以下の実施 例は例示的であって、本発明を制限するものではない。本発明の抗イデイオタイ プ抗体は、標準的な文献の手順に従ってグルタルアルデヒドでＫＬＨに結合し、 フロイント完全アジュバントと混合したモノクローナル抗体でＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　 ／　ｃマウスを免疫感作して得ることができる。これらのマウスの牌臓細胞を不 死化することができ、このようにして得られたハイブリドーマを、抗イデイオタ イプ抗体産生についてスクリーニングすることができる。例えばＨＣｖペプチド を固相（マイクロタイタープレートのウェル）に結合し、成長するハイブリドー マの培養上清及び、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した本発明の モノクローナル抗体と共に固相をインキュベートしてハイブリドーマをスクリー ニングすることができるが、これに限定はされない。固相上にコーティングされ た）ＩＣＶペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合が阻害されれば、培 養上清中に抗イデイオタイプ抗体が存在することになる。

前述した如き本発明のモノクローナル抗体と反応を示す抗イデイオタイプ抗体は 本発明の一部である。

特に内部像を示す抗イデイオタイプ抗体は、診断検査で抗原模倣物質として使用 することができる。抗イデイオタイプ抗体は、診断検査での使用の他に、非Ａ非 Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療、並びにＨＣＶ抗原の重要なエピトープ領域の解 明でも有用である。

本発明の好ましい抗イデイオタイプ抗体は、９３１２２３０７（＋１ＣＶＩＤ、 　０Ｔ２Ａ）、９３１２２３０８（）ＩＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｂ）、９３１２２３ ０９（ＩＴＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｃ）、９３１２２３１０（ＩＩｃＶＩＤ、　０Ｔ ２Ｄ）、９３１２２３１１（ＩＩＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｅ）、９３１２２３１２（ ＩＩｃＶＩＤ、　０Ｔ２Ｉ）、９３１２２３１．３（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｊ） 、９３１２２３１４（ｌｉｃ％’ＩＤ、ＯＴ２輩）、　９３１２２３１５（ＨＣ ＶＩＤ、０Ｔ２Ｐ）、　９３１２２３１６（ＨＣＶＩＤ、０Ｔ２Ｑ）、９３１２ ２３１７（■ＣＶＩＤ、０Ｔ３Ａ）、９３１２２３１８（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ３ Ｄ）、９３１２２３１９（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ３Ｅ）、９３１２２３２０（ＨＣ ＶＩＤ、０Ｔ３Ｂ）、９３１２２３２１（ＩＩＣＶＩＤ、　０Ｔ３Ｌ）及び９３ １２２３２２（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ３０）の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃａ １ｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＥＣＡ ＣＣ）、Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されている細胞系によって分泌 される抗イデイオタイプ抗体である。

本発明の抗イデイオタイプ抗体は好ましくは、本発明のモノクローナル抗体との 結合のためにエピトープと競合し得る抗イデイオタイプ抗体である。このエピト ープは、９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ａｎｉａ＋ａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、　Ｐｏ ｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエプスタイン−バールウィルス形質転 換ヒトＢリンパ球細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体によって認識さ れるエピトープである。

本発明の抗イデイオタイプ抗体を含む免疫診断試薬及び、抗イデイオタイプ抗体 を含む免疫診断試薬を用いて試料中の抗＋ｉｃｖ抗体を検出するための検査キッ トも本発明の一部分である。

前述した如き本発明のモノクローナル抗体と反応を示す抗イデイオタイプ抗体を 分泌し得る不死化細胞系は本発明の一部である。

抗イデイオタイプ抗体を産生ずる細胞系は例えば、エプスタイン−バールウィル スによる形質転換、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭＵｓｔｅｉｎの技術（ＫＯｈｅｒ及びＭ ｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する技術を考 案した（　Ｇ、ＫＯｈｌｅ球の直接形質転換技術、ヒトＢリンパ球と融合パート ナ−（ヒト若しくはマウス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系）との直接融合、又 はＥＢＶ形質形質転換権細胞系記骨髄腫細胞系との直接融合によって製造され得 る。

本発明の好ましい細胞系は、９３１２２３０７（ｆｌｃ％’ｒＤ、　０Ｔ２Ａ） 、９３１２２３０８（）ＩｃＶＩＤ、　０Ｔ２Ｂ）、９３１２２３０９（ＩＩｃ ＶＩＤ、　０Ｔ２Ｃ）、９３１２２３１０（＋１ＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｄ）、９３ １２２３１’１（ＩＩＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｅ）、９３１２２３１２（ＨＣＶＩＤ 、　ＯＴ２■）、９３１２２３１３（ＩＩｃＶＩＤ、　０Ｔ２Ｊ）、９３１２２ ３１４（ＩＩＣＶＩＤ、　０７２Ｍ）、９３１２２３１５（ｌｉｃＶＩＤ、　０ Ｔ２Ｐ）、９３１２２３１６（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ２Ｑ）、９３１２２３１７（ ＩＩｃＶＩＤ、Ｏ’ｒ３Ａ）、９３１２２３１８（ＩＩｃＶＩＤ、　０Ｔ３Ｄ） 、９３１２２３１９（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ３Ｅ）、９３１２２３２０（ＩＴＣＶ ＩＤ、　０Ｔ３Ｈ）、９３１２２３２１（ＨＣｖＩＤ、　０Ｔ３Ｌ）及び９３１ ２２３２２（ＨＣＶＩＤ、　０Ｔ３０）の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ｐｏｒ ｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されている。

本発明の抗イデイオタイプ抗体を含む免疫診断試薬及び試料中のＩＩ（ｊ’を検 出するための検査キットも本発明の一部である。

以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。

実施例１は、本発明のモノクローナル抗体を産生ずる細胞系の誘導方法を示す。

実施例２は、本発明のモノクローナル抗体の特異的免疫反応性を更に詳しく説明 する。

実施例３は、抗イデイオタイプ抗体の産生及び、これらの抗イデイオタイプ抗体 の、免疫優性ＭＳ−３エピトープを模倣する特異的能力を説明する。

実施例 実施例１：Ｂ細胞系クローンの調製 組換えタンパク質ｃ２２−３　（ウィルス核タンパク質）と、ＨＣｖゲノムのＮ Ｓ３及びＮＳ４領域によってコードされる組換え非構造タンパク質Ｃ２００とを 含む市販のアッセイ（Ｏｒｔｈｏ　ＨＣＶＥＩＪＳＡ　Ｔｅ５ｔ　Ｓｙｓｔｅｍ 、第２世代）と患者血清との反応性によって示されるように、ｃｌｏｏ−３／Ｎ Ｓ４　（ＩＩＣＶ第１世第１体ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ ｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）ではなく　ＨＣＶのＮＳ３及びヌクレオカプシドタ ンパク質に対する抗体を循環している慢性ＨＣＶに感染したー患者から末梢血単 核細胞（ＰＢｉｌＣ）を得た。

熱不活性化してプールした１０％ヒト血清を含み、１０％ヒト内皮培養上清（Ｈ ＥＣ３）　＋２０１／　ｍｌのｒＩＬ６を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地にＰＲ ＩＣを再度懸濁させ、５％ＣＯ！中にて、２５．１２５及び６２５ｎｇ／勤ｌ濃 度の組換えＮＳ３タンパク質（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）の存在下、２ ５ｃｍ”のフラスコ中、４ｘｌＯＥ６／ｍｌの濃度にて３７℃で６日間培養した 。

洗浄後、Ｃｅｒｉｎｏ＾等がＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４７．　ｐ２６９２ ．１９９１に記載する方法で、５−（２−アミノ−エチル）−イソチオウロニウ ムーブロマイドーヒドロブロマイド処理したヒツジ赤血球と共にＴリンパ球を除 去して細胞中の８９２８球の割合を増加し、ＥＢＶ産生可能なり９５−８細胞系 由来の上清を加えて感染させた。

一晩インキユベートした後、細胞をＵ底９６ウエルマイクロタイタープレートに ３Ｘ　１０’／ウエルの密度で播種した。

２０〜３０日間培養した後、３０００　Ｒ照射した同種異系ＰＢＭＣを支持細胞 層として、固相ＮＳ３タンパク質と反応する抗体を分泌する培養物をＵ底つェル 中、ウェル１個当たり１２〜５０個の細胞で継代培養した。更に特性分析を行う 前に、Ｂ細胞系を少なくとも２回線代培養した。

Ｃｅｒｉｎｏ　Ａ等がＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４７．　ｐ２６９２．１９９ １に記載する方法でＩｇＧの重鎖及び軽鎖（Ｌ）を決定した。端的に言えば、Ｂ 細胞系の上清をＮＳ３をコーティングしたウェル上にて３７℃で１時間インキュ ベートし、洗浄後、ヒトＩｇＧサブクラス特異的マウスａＡｂを１時間で加え、 次いでペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇを更に１時間で加えた。

ＩｇＧのし鎖を決定するために、直接アッセイでペルオキシダーゼ結合ウサギ抗 ヒトＩｇに又はλ鎖を使用した。いずれの場合も、オルトフェニレンジアミン／ 　２１１Ｃ１を基質として用いて反応を生起させた。

結果： ２５ｎｇ／ｍｌ及び１２５ｎｇ／ｍｌのｒＮＳ３でｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激した後 に抗ＮＳ３がかなり産生したが、最大Ａｇ濃度を用いると対照培養に比べて＾ｂ の産生に増加は見られなかった。合計４８０個のウェルに、２５ｎｇ／ｍｌ及び １２５ｎｇ／ｍｌのＮＳ３を含む培養物に由来する細胞を播種した。これらの細 胞系のうち３つがかなりの量（＾４１１＞　１）の抗ＮＳ３を分泌し、更なる特 性分析を行うに十分す時間安定テアツタ。−細胞系ＨＣＶＨＵ、　ＯＴ３　（９ ２１２１６０９）受託番号でＥＣＡＣＣに寄託）は、モノクローン性の基準を満 たした。実際、このような系を２度継代培養して、同量の特異抗体を分泌するク ローンを得た。これを連続培養で６力月以上保持した。更には、クローンＨＣＶ ＨＵ、　ＯＴ３は専らＩｇＧ１（ｋ）を産生じた。

実施例２：Ｂ細胞系の抗ＮＳ３産生に関する検査以下の試薬を用いて、オリゴク ローナル及びモノクローナルＩｇＧを含む上清の特異性を更に検査した：１）大 腸菌で発現される組換え精製ＨＣＶ核タンパク質（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉ ｋａ）。

２）大腸菌で発現される組換え精製ＮＳ３タンパク質（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋ ｎｉｋａ）。

３）大腸菌で発現される組換え精製ＭＳ−５タンパク質。

４）組換えイムノプロットアッセイ（ＲＩＢＡ　ＩＩ世代、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ）　ｏこれは、４個の組換え■ＣＶ抗原ニー　Ｎ５−４タンパ ク質由来のｃｌｏｏ−３−ｃｌｏｏ−３の４２アミノ酸断片である５−１−１、 −ＮＳ３タンパク質由来のｃ３３ｃ −ウィルス核タンパク質由来のｃ２２−３を含むニトロセルロースペースのアッ セイである。

ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）も対照としてニトロセルロースス トリップ上に存在する。

結果： クローンＩＩＣＶＨＵ、　ＯＴ３由来の上演の特異性を前述した方法で分析した 。

図１は、本発明の抗体の特異的結合能力を示す。本発明の抗体（ＨＣＶＨＵ、　 ０Ｔ３）とＨＣｖ由来の種々のタンパク質との結合をそれぞれ、ＨＣｖコア及び ＮＳ４タンパク質に特異的な抗体の結合と比較する。図１で分かるように、本発 明のモノクローナル抗体（ＨＣＶＨＵ、　０Ｔ３）は組換えＮＳ３タンパク質調 製物を認識し、０ｒｔｈｏ　ＩＩ世代アッセイでは明らかな陽性反応を示したが 、組換えＨＣＶコア及びＮ５−５タンパク質との結合を認めることはできなかっ た。ＨＣＶＨＵ、　ＯＴ３上清を組換えイムノプロット（ＲＩＢＡ　ＩＩ世代） で分析すると、ｃ３３ｃポリペプチドとだけ明らかに結合することが判明し、更 には図２で分かるようにｍＡｂの特異性が実証された。図中のレーン２は本発明 の抗体（ｆｌｃＶＨＵ、　０Ｔ３）を示す。

実施例３：抗イデイオタイプ抗体の産生９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏ ｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ、　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅｓ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託された細胞系の培養上清から モノクローナルヒトＩｇＧ　（Ｈ（ＪＨＵ、０Ｔ３）を精製しフロインドアジュ バント又はＱｕｉｌ　Ａと混合して４匹のマウス及び４匹のラットに注射した。

表１の方式で免疫感作を行った。２回免疫感作した後に、最も血清力価が高いマ ウ示すアッセイで更に、推定上の抗イデイオタイプ抗体を分泌するクローンを検 出した。このようにして、このアッセイでよく反応する１６個のクローンを得た 。標準的な手法に従って、推定上の抗イデイオタイプ抗体を分泌するクローンを 培養し、１００％のクローン度（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）までサブクロモノクロー ナル抗体のうち１２個はマウス由来であり、６個がラット由来であった。種々の 抗体のアイソタイプを表２に示す。

表２ ＨＣＶ　Ｈｕ、ＯＴ３に対するモノクローナル抗イデイオタイプ抗体のリスト 細胞系をより高い細胞密度に成長させ、血清を含まない培地で５日間培養した。

プロティンＡ−セファロース１カラムを用いて培養上清から抗体を精製した。製 造業者（ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｌｌ［Ｂ）の指示に従りて精製した。

２個のラットモノクローナル抗体からは、純粋な抗イデイオタイプ抗体を得るこ とはできなかった（　ＩＩＣＶＩＩｔｌ、　０Ｔ３１１及びＨＣＶＢＬｌ、０Ｔ ３Ｅ）。

ヒトモノクローナル抗体ＢＣＶＨＵ、　ＯＴ３によって認識されるＮ５−３エピ トープを模倣する抗イデイオタイプ抗体の能力を更に分析した。そのために、Ａ ｃｔｉｚ）ｖｅ−ペルオキシダーゼキット（Ｚｙｍｅｄ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）を用いて精製モノクローナル抗体をＩＩＩ？Ｐに結合した。この結合手段 は製造業者の指示に従った。

ＭＳ−３エピトープを模倣する能力の分析手順を以下で更に詳しく説明する。

標準的な手順（０，０５Ｍ炭酸塩緩衝液中１μｇ／ｍ１ＳｐＨ＝９．６．４℃で 一晩インキュベート）で、（ＨＣＶゲノムのアミノ酸１１９２〜１４５７を含む ）Ｃ３３−β−ガラクトシダーゼを９６ウエルマイクロＥＬＩＳ＾プレート上に 固定させた。抗イデイオタイプ抗体の産生についてスクリーニングすべき細胞の 培養上清又はマウス若しくはラットの血清試料をＢＣＶＩＩＵ、　０Ｔ３−ＨＲ Ｐと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、この混合物をＣ３３ −β−ガラクトシダーゼで十分にコーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ °を加えたＰＢＳで徹底的に洗浄した後にＢＣＶＩＩＵ、　ＯＴ３に対する抗イ デイオタイプ抗体の結合を検出した。

抗イデイオタイプ抗体がｕｃｖｎｕ、　０Ｔ３−ＢＲＰに結合した場合、シグナ ルはバックグラウンド値まで減少した。

この材料を用いて、一方で９６ウエルマイクロＥＬＩＳＡプレートの１個のウェ ルに固定したモノクローナル抗イデイオタイプ抗体の１つと、他方でＨＲＰで標 識した同じモノクローナル抗体の溶液とからなるサンドイッチアッセイを実施し た（図４）。

推定上の抗イデイオタイプ抗体を確認するためのアッセイ手順を以下で更に詳し く説明する。

標準的な手順（ｌｈｇ／■ｌ、　０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐｎ＝　９．６．４ ℃で一晩インキュベート）で、９６ウエルマイクロＥＬＩＳＡプレート上に推定 上の抗イデイオタイプ抗体を固定した。

血清希釈物又は１ｉｃＬＨＵ、ＯＴ３希釈物をウェルに加え、次いで３７℃で１ 時間インキュベートした。

０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０”を加えたＰＢＳで徹底的に洗浄した後に（４回）　 、ＨＲＰ標識した推定上の抗イデイオタイプ抗体を加えた。

その後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで０，０５％Ｔｗｅ ｅｎ２０’を加えたＰＢＳで（４回）洗浄した。

その後、ＨＲＰ用基質を加えた。

図４に示すアッセイを用いて、モノクローナル抗イデイオタイプ抗体の特異性に ついて更に実証が得られた。抗イデイオタイプ抗体は、ＨＣＶＩＩＵ、　ＯＴ３ と、ＨＣＶＩＩＵ、ＯＴ３と同シアイソタイプに属する無関係のヒトモノクロー ナル抗体とを区別することができた。図５に、この特異性の代表例を示す。

同一アッセイ（図５）で、抗イデイオタイプ抗体がＨＣｖに感染したヒト患者の 血清中の抗体と特異的に結合し得るかどうかを確定した。このため、市販のＲＩ ＢＡアッセイ（ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｅｍａｅｒｙｖｉｌｌ ｅ）による測定によりＨＣＶ　ＭＳ−３抗原に対する抗体を含むことが知られて いるヒト血清パネルを選択した。

図５では、ＨＣＶＨＵ、　ＯＴ３との反応を黒イ棒で示し、ｕｃｖｎｕ、　。

Ｔ３と同じサブクラスに属する無関係のヒトモノクローナル抗体との反応を斜線 の入った棒で示す。他のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体でも、匹敵し得る 結果が得られた。

ヒトモノクローナルＩＩＣＶＨＵ、　ＯＴ３によって規定されるような免疫優性 ＭＳ−３エピトープを模倣する前述の方法で産生じた抗イデイオタイプ抗体の疑 噸、能力を表３に示す。

表３は、■Ｃｖ感染患者及び正常対照由来のヒト血清と抗イデイオタイプ抗体１ １ＣＶＩＤ、０Ｔ２Ａ、　ＨＣＶＩＤ、０Ｔ２Ｉとの反応性を示す。

表３ ＨＣＶ感染患者及び正常人対照由来のヒト血清と抗イデイオタイプ抗体１１ＣＶ ＩＤ、０Ｔ２ＡＳＨＣＶＩＤ、０Ｔ２Ｉとの反応性零〇Ｄ＝４５０ｎｍでの光学 密度 木本Ｎ、　Ｒ，＝規格化応答。カットオフ値で割った血清試料の０Ｄ４５０とし て計算。

カットオフ値は平均正常血清（ｎ−２０）　＋３倍標準偏差である。

図面の簡単な説明 図１は、ＮＳ３タンパク質に対するモノクローナル抗体ＨＣＶＢＵ、　ＯＴ３の 結合特異性を示すグラフである。

図２は、組換えイムノプロットアッセイの写真である。

Ａ−Ｇの文字は以下のタンパク質を示す；Ａ：高Ｉｇ対照 Ｂ　：　５−１−１（５−１−１ （：　ｃｌｏｏ−３（ＭＳ−４） Ｄ　：　ｃ３３ｃ（ＭＳ−３） Ｅ　：　ｃ２２−３（コア） Ｆニスパーオキシドジスムターゼ Ｇ：低Ｉｇ対照。

レーン１は陰性対照血清を示す。

レーン２は抗Ｎ５−３モノクローナル抗体（ＨＣＹＨＵ、　０Ｔ３）を示す。

レーン３は抗コアモノクローナル（ＨＣＶＩＩＵ、　０Ｔ２）を示す。

レーン４は■Ｃｖ感染患者由来のポリクローナル血清を示す。

図３は、血清中及びモノクローナル抗体産生細胞の培養土清中でヒトモノクロー ナル抗体［ＩＣＶＨＵ、　ＯＴ３に対する抗イデイオタイプ抗体を検出するため に使用するスクリーニング手順を示す。

図４は、図３に示すスクリーニング手順で得られた推定上の抗イデイオタイプ抗 体を確認するために用いるアッセイ手順を示す。

図５は、６個の異なる抗イデイオタイプ抗体（２＾、　２Ｂ、　２Ｉ。

２Ｐ、２Ｑ、３Ａ）　（７）ＨＣＶ）１１１，０Ｔ３１．：対ｔル特異性ヲ決定 ｔ６タメ（７）（図４に示すような）サンドイッチアッセイを示す。

ＨＣＶ）ＩＩｌ、　ＯＴ３との反応は黒い棒で示す。ＩＩ（ＪＨＵ、　ＯＴ３と 同じサブクラスに属する無関係のヒトモノクローナル抗体との反応を斜線入りの 棒で示す。他のモノクローナル抗イデイオタイプ抗体でも匹敵し得る結果が得ら れた。

、　−一　Ａ：　高ＩＧ対照 −Ｂ：　５−１−１　（ＮＳ４） −Ｃ：　Ｃ１００−３（ＮＳ４） −□Ｄ：　Ｃ３３Ｃ（ＮＳ３） □　Ｅ：　Ｃ２２−３（コ　ア） Ｆ：　スーパーオキシドジスムターゼ Ｇ：　低ＩＧ対照 ＬＡＮＥ　ｌ：　陰性対照血清 ＬＡＮＥ　２：　ａＮｓ３　ＭＡＢ　（ＨＣＶＨＵ、０Ｔ３）ＬＡＮＥ　３：　 ａｃＯＲＥ　ＭＡＢ　（ＨＣＶＨＵ、０Ｔ２）ＬＡＮＥ　４：　ＨＣＶ感染患者 血清　（ポリクローナル）αＩＤ−ＡＢ　ＨＲＰ標識ＨＣＶＨＵ、０Ｔ３Ｃ３３ −Ｂ−ＧＡＬ ＨＲＰ標識αＩＤ−ＡＢ　ＨＵ−αＮＳ３　ＡＢＢｉ ２イデイオタイプ抗体の特異性 −ＨＣＶＨＵ、ＯＴ３との反応 ２羽　ＩＲＲ，ＭＡＢとの反応 図５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｑ　Ｖ２Ｏ ９４５３−４８ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ ３３１５７６　Ｚ　９０１５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ ／／Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｓ　９２８４−４Ｃ（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　モンデツリ、マリオ・ウシベルトイタリー国、２０１２２・ミ ラノ、ビア・ピタリ・１ Ｉ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のエピトープに結合するモノクローナ ル抗体であって、前記エビトープが、９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏｐ ｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒ ｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエプスタイ ン−バールウイルス形質転換ヒトＢリンパ球細胞系によって分泌されるモノクロ ーナル抗体によって認識されることを特徴とする、前記モノクローナル抗体。
2. ２．９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏ ｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエプスタイン−パールウイルス形質転換ヒト Ｂリンパ球細胞系によって分泌されることを特徴とする、請求項１に記載のモノ クローナル抗体。
3. ３．請求項１に記載の抗体を分泌し得る不死化細胞系。
4. ４．９２１２１６０９の受託番号でＥＣＡＣＣに寄託された細胞系。
5. ５．試料を請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体と接触させ、モノクロー ナル抗体とＣ型肝炎抗原との間で形成された免疫複合体を検出することからなる 、試料中のＣ型肝炎ウイルスの検出方法。
6. ６．請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を含む免疫診断試薬。
7. ７．請求項６に記載の免疫診断試薬を含んでなる、試料中のＣ型肝炎ウイルス検 出用の検査キット。
8. ８．請求項１に記載の抗体に対し反応性を示す抗イディオタイプ抗体。
9. ９．９３１２２３０７、９３１２２３０８、９３１２２３０９、９３１２２３１ ０、９３１２２３１１、９３１２２３１２、９３１２２３１３、９３１２２３１ ４、９３１２２３１５、９３１２２３１６、９３１２２３１７、９３１２２３１ ８、９３１２２３１９、９３１２２３２０、９３１２２３２１又は９３１２２３ ２２の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（Ｕ Ｋ）に寄託されたハイプリドーマ細胞系によって分泌されることを特徴とする、 請求項８に記載の抗イディオタイプ抗体。
10. １０．請求項１に記載のモノクローナル抗体との結合のためにエビトープと競合 し得る請求項８又は９に記載の抗イディオタイプ抗体であって、前記エピトープ が、９２１２１６０９の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏ ｎ　Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に寄託されたエブスタイン−バールウイルス形質転換ヒト Ｂリンパ球細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体によって認識されるエ ピトープであることを特徴とする、前記抗イディオタイプ抗体。
11. １１．請求項８から１０のいずれか一項に記載の抗イディオタイプ抗体を分泌し 得る不死化細胞系。
12. １２．９３１２２３０７、９３１２２３０８、９３１２２３０９、９３１２２３ １０、９３１２２３１１、９３１２２３１２、９３１２２３１３、９３１２２３ １４、９３１２２３１５、９３１２２３１６、９３１２２３１７、９３１２２３ １８、９３１２２３１９、９３１２２３２０、９３１２２３２１又は９３１２２ ３２２の受託番号でＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｎｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ（Ｕ Ｋ）に寄託された細胞系。
13. １３．試料を請求項８から１０のいずれか一項に記載の抗イディオタイプ抗体と 接触させ、抗イディオタイプ抗体と抗ＨＣＶ抗体との間で形成された免疫複合体 を検出することからなる、試料中の抗ＨＣＶ抗体の検出方法。
14. １４．請求項８から１０のいずれか一項に記載の抗イディオタイプ抗体を含む免 疫診断試薬。
15. １５．請求項１４に記載の免疫診断試薬を含んでなる、試料中の抗ＨＣＶ抗体検 出用の検査キット。