JPH07502887A - ジスルフィド結合を還元するためのチオールレドックスタンパクの利用 - Google Patents

ジスルフィド結合を還元するためのチオールレドックスタンパクの利用

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JPH07502887A
JPH07502887A JP5507194A JP50719493A JPH07502887A JP H07502887 A JPH07502887 A JP H07502887A JP 5507194 A JP5507194 A JP 5507194A JP 50719493 A JP50719493 A JP 50719493A JP H07502887 A JPH07502887 A JP H07502887A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５６、該チオレドキシンを分泌する請求項５５記載の細胞。
５７、組換えＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼＤＮＡを含むベクターを用 いて形質転換された酵母細胞。
５８、該リダクターゼＤＮＡを発現して該リダクターゼを産生ずる請求項５７記 載の細胞。
５９、該リダクターゼを分泌する請求項５８記載の細胞。
６０、請求項５５記載の溶解及び凍結乾燥細胞。
６１、請求項５８記載の溶解及び凍結乾燥細胞。
６２、ドウの品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現する溶 解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母細胞 をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物及び水又は液体バッファーと混合して混合物 を形成し；（ｂ）該混合液を粉に加えてドウを形成することを含む方法。
６３、ドウの品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現する溶 解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母細胞 をＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ又はＮＡＤＰＨ生成物と混合して混合物を形成し： （ｂ）該混合物をドウ成分に加えてドウを形成することを含む方法。
６４、焼き製品の品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現す る溶解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母 細胞をＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ又はＮＡＤＰＨ生成物及び水又は液体バッファーと混 合して混合物を形成し。
（ｂ）該混合物を粉に加えてドウを形成し：（ｃ）該ドウを焼いてパン製品を製 造することを含む方法。
６５、焼き製品の品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現す る溶解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母 細胞をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物と混合して混合物を形成し。
（ｂ）該混合物を粉に加えてドウを形成し；（ｃ）該ドウを焼いて焼き製品を製 造することを含む方法。
６６．１個以上の分子内シスチンを含む非チオニン、非葉緑体タンパクの分子内 ジスルフィド結合を還元する方法てあって、（ａ）チオールレドックスタンパク を該ンスチン含有タンパクを含む液体又は物質に加え。
（ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（Ｃ）該ンスチン含有タンパク を該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。
６７、チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項６６記載の方 法。
６８、チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼで還元する請求項６Ｇ記載の方法。
６９、チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＩ（生成組成物で還元する請求項 ６６記載の方法。
７０、組成物であって、分子内ノスチン含有非チオニン、非葉緑体、植物タンパ ク、チオレドキシン、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨ又 はＮＡＤＰＨ生成組成物を含む組成物。
７１、分子内ジスルフィド結合を有するタンパクの熱又はプロテアーゼ安定性を 低下させる方法であって、 （ａ）チオールレドックスタンパクを該分子内ジスルフィド結合を有する該タン パクを含む液体又は物質に加え： （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（Ｃ）該分子内ジスルフィド結 合を該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。
７２、チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項７１記載の方 法。
７３、チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼ又はＮΔＤｉ”ＩＩ生成組成物で還元する請求項７１記載の方法。
７４、分子内及び分子間ジスルフィド結合を有する特定のタンパクの分子内ジス ルフィド結合のみを選択的に実質的に還元する方法であって、（ａ）チオールレ ドックスタンパクを該特定のタンパクを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し、これにより 該特定のタンパクの分子内ジスルフィド結合のみを該還元チオールレドックスタ ンパクで実質的に還元することを含む方法。
７５、チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項７４記載の方 法。
７６、分子内ジスルフィド結合を有するタンパクが２８アルブミンタンパクであ る請求項７４記載の方法。
７７、還元チオレドキシンをＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ＨとＮＴＲ又はＤＴＴで還元した 請求項７５記載の方法。
７８、ジスルフィド結合及び８〜＋５ｋＤａの分子量を有する単離プルラナーゼ インヒビター。
７９、請求項７８記載のインヒビタータンパクのプルラナーゼインヒビター活性 を不活性化する方法であって、 （ａ）チオレドキシンを該タンパクを含む液体又は物質に加え；（ｂ）該チオレ ドキシンを還元し； （Ｃ）該インヒビタータンパクを該還元チオレドキシンで還元することを含む方 法。
８０、オオムギ又は小麦内胚乳由来プルラナーゼの活性を高める方法であって、 （ａ）チオレドキシンを該プルラナーゼを含む液体又は物質に加え；（ｂ）該チ オレドキシンを還元し、これにより該プルラナーゼ活性を高める方法。
８１、　Ｗ４理パスタの特性を改良する方法であって、（ａ）チオールレドック スタンパクをバスタドウ成分と混合してドウを形成し、該チオールレドックスタ ンパクが単独又は還元剤もしくは還元系との組合わせであり： （ｂ）工程（ａ）のドウ混合物を成形し。
（ｃ）工程（ｂ）の成形ドウ混合物を加熱して調理パスタを形成する：工程を含 む方法。
８２、ドウ又は焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）ＮＡＤＰ＋−（ 又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ生成組成物をグルテニン又はグリアジンを含むドウ成分 と混合してドウを形成し。
（ｂ）　ドウを焼いて焼き製品を形成する工程を含む方法。
８３、焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）チオールレドックスタン パクをドウ成分と混合してドウを形成し、該チオールレドックスタンパクが単独 又は還元剤もしくは還元系との組合わせてあり。
（ｂ）工程（ａ）のドウ混合物を成形し。
（Ｃ）工程（ｂ）の成形ドウ混合物を加熱して焼き製品を形成する工程を含む方 法。
１’１．１．　トリチカーレ焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）液 体及びチオレドキシンをトリチカーレ粉と混合してドウ混合物を形成し、該チオ レドキシンがＮＴＲ及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　！−（生成系との組合わせてあり：（ ｂ）　ドウを焼いて焼き製品を形成する：工程を含む方法。
８５．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒タンパクを還元する方法で あって、 （ａ）該シスチン含有タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオール レドックス（ＳＨ）剤と接触させ；（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以 上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これにより該 神経毒タンパクを還元することを含む方法。
８６、チオールレドックス（Ｓ　）Ｉ　）剤が還元チオレドキシン、チオレドキ シンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群 より選ばれる請求項８５記載の方法。
８７、ヘビ神経毒タンパクがシナプス前部神経毒である請求項８５記載の方法。
８８、シナプス前部神経毒タンパクがβ−神経毒である請求項８７記載の方法。
８９、β−神経毒がβ−ブンガロトキシンである請求項８８記載の方法。
９０、シナプス前部神経毒が促進神経毒である請求項８９記載の方法。
吐ヘビ神経毒がシナプス後部神経毒である請求項８５記載の方法。
９２、シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒又は長鎖型神経毒である請求項９１記 載の方法。
９３、シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒、エラブトキシンａ又はエラブトキシ ンｂである請求項９２記載の方法。
９４、シナプス後部神経毒が長鎖型神経毒、α−ブンガロトキンジンはα−コブ ラドキノンである請求項９２記載の方法。
９５、請求項８５記載の方法により調製された還元ヘビ神経毒タンパク。
９６、組成物であって、ヘビ神経毒タンパク及びチオールレドックス（Ｓ　Ｈ） 剤を含む組成物。
９７．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒タンパクの還元方法であっ て、（ａ）該タンパクをチオレドキシンリダクターゼ、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ ［Ｉ生成系及び該毒素を還元するのに有効な量のチオレドキシンと接触させ；（ ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元するのに 十分な時間該接触を維持し、これにより該タンパクを還元することを含む方法。
９８、請求項９７記載の方法により調製された還元ヘビ神経毒。
９９．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒の生物活性を変性する方法 であって、 （ａ）該神経毒を含む媒体を該毒素を還元するのに十分な量のチオールレドック ス（ＳＨ）剤と接触さぜ： （ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元するの に十分な時間該接触を維持し、これにより該毒素の該生物活性を変性することを 含む方法。
１００、チオールレドックス（ＳＴ（）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシ ンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項９９記載の方法。
ｌ吐ヘビ神経毒がシナプス前部神経毒である請求項９９記載の方法。
＋０２シナプス前部神経毒がβ−神経毒、β−ブンガロトキシンである請求項＋ ０１記載の方法。
１０３、シナプス前部神経毒が促進神経毒である請求項１０１記載の方法。
１０４、ヘビ神経毒がシナプス後部神経毒である請求項９９記載の方法。
１０５、シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒又は長鎖型神経毒である請求項１０ ４記載のか法。
１０６シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒、エラブトキシンｂ又はエラブトキシ ンａである請求項１０５記載の方法。
１０７、シナプス後部神経毒が長鎖型神経毒、α−ブンガロトキンジンはα−コ ブラドキノンである請求項１０５記載の方法。
１０８、１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒を生体外で不活性化する 方法であって、 チオールレドックス（ＳＦ（）剤を、該薬剤の量が該毒素を還元するのに有効で ある該毒素を含む液体に加えることを含む方法。
＋０９．チオールレドックス（Ｓ　Ｈ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシ ンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項＋０８記載の方法。
１１０、請求項１０８記載の方法により調製された不活性化ヘビ神経毒。
Ｉｌｌ、組成物であって、液体中ヘビ神経毒タンパク及びチオールレドックス（ ＳＨ）剤を含む組成物。
１１２、１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒を生体外で不活性化する 方法であって、 該毒素を還元するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、Ｎ　 Ａ　Ｉ）　Ｐ　Ｈ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンを該毒素を含む液体 に加え、これにより該毒素を不活性化する方法。
１】３．請求項＋１２記載の方法により調製された不活性化ヘビ神経毒。
１１４、組成物であって、不活性化ヘビ神経毒、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダ クターゼ、ＮＡＤＰＨ又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ｆ（生成系及びチオレドキシンを有 する液体を含む組成物。
１１５、個体におけるヘビ毒神経毒性の治療方法であって、該ヘビ毒神経毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をヘビ毒神経毒 性を受けている個体に投与することを含む方法。
１１６、チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項＋１５記載の方法。
＋１７．ヘビ毒神経毒性がα−ブンガロトキシン、エラブトキシンｂ又はβ−ブ ンガロトキンジン素に起因する請求項１１５記載の方法。
＋１８．個体におけるヘビ毒神経毒性の治療方法であって、該ヘビ毒神経毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡ ＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをヘビ毒神経毒性を受けている 個体に投与することを含む方法。
＋１９．ヘビ毒神経毒性がα−ブンガロトキシン、エラブトキシンｂ又はβ−ブ ンガロトキノン毒素に起因する請求項＋１８記載の方法。
！２０凹種以上の分子内シスチンを有するミツバチ毒の毒性タンパクの還元方法 であって、 （ａ）該シスチン含有毒性タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオ ールレドックス（Ｓｌｌ）剤と接触させ：（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの １種以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これに より該毒タンパクを還元することを含む方法。
１２１、チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、Ｉ）ＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項１２０記載の方法。
＋２２．　ミツバチ毒タンパクがホスホリパーゼＡ、である請求項１２０記載の 方法。
＋２３．　ミツバチ毒がアビスメリフエラ由来である請求項１２０記載の方法。
１２４、１種以上の分子内シスチンを有するミツバチ毒の生体外不活性化方法で あって、チオールレドックス（ＳＨ）剤を該薬剤の量が該毒を還元するのに有効 である該毒を含む液体に加えることを含む方法。
１２５、チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、１）ＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項１２４記載の方法。
１２６、個体におけるミツバチ毒の毒性の治療方法であって、該ミツバチ毒の毒 性を還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をミツバチ 毒の毒性を受けている個体に投与することを含む方法。
１２７、チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項＋２６記載の方法。
１２８、１種以」二の分子内シスチンを有するサソリ毒の毒性タンパクの還元方 法であって、 （ａ）該ノスチン含イ１タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオー ルレドックス（ＳＲ）剤と接触させ：（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種 以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これにより 該神経毒タンパクを還元することを含む方法。
１２９、チオールレドックス（Ｓ　Ｈ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシ ンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項１２８記載の方法。
１３０、サソリ毒タンパクが神経毒である請求項１２８記載の方法。
１３１、サソリ毒がアンドロクトヌスアウストラリス由来である請求項１２８記 載の方法。
＋３２．１種以上の分子内シスチンを有するサソリ毒の生体外不活性化方法であ って、チオールレドックス（ＳＨ）剤を該薬剤の量が該毒を還元するのに有効で ある該毒を含む液体に加えることを含む方法。
１３３、チオールレドックス（Ｓｌ−１）剤が還元チオレドキシン、チオレドキ シンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群 より選ばれる請求項１３２記載の方法。
１３４、個体におけるサソリ毒の毒性の治療方法であって、該サソリ毒の毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をサソリ毒の毒 性を受けている個体に投与することを含む方法。
１３５、チオールレドックス（Ｓｌｌ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシ ンの存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群よ り選ばれる請求項１３４記載の方法。
１３６、個体におけるミツバチ毒の毒性の治療方法であって、該ミツバチ毒の毒 性を還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、 ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをミツバチ毒の毒性を受け ている個体に投与することを含む方法。
１３７、個体におけるサソリ毒の毒性の治療方法であって、該サソリ毒の毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡ ＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをサソリ毒の毒性を受けている 個体に投与することを含む方法。
明細書 ジスルフィド結合を還元するためのチオールレドックスタンパクの利用相互川魚 本特許出願は、１９９１年１０月１２日付けで出願された特許出願Ｎｏ、　０７ ／７７６．１０９および１９９２年８月２５日付けで出願された特許出願Ｎｏ、 　０７７９３５．００２の一部継続出願であり、該特許出願Ｎｏ、　０７／９３ ５，００２は１９９１年１０月１２日付けて出願された特許出願Ｎｏ。
０７／７７６、１０９の一部継続出願である。
産業上の利用分野 本発明は種子タンパク、例えば穀類タンパク類、酵素阻害性タンパク類および毒 液毒素タンパク類並びに幾つかの他のタンパク類の分子内ジスルフィド結合を還 元するだめのチオールレドックスタンパク類の使用に関するものである。より詳 しく言えば、本発明はグリアジン、グルテニン（ｇｌｕｔｅｎｉｎｓ）　、アル ブミンおよびグロブリンを還元して、ドウおよび焼き製品の緒特性を改善し、か つ新規なドウを生成し、またシスチン含有タンパク、例えばアミラーゼおよびト リブジン阻害剤を還元して、飼料および穀類製品の性能を改善するための、チオ レドキシンおよびグルタレドキジンの利用を包含する。また、本発明はプルラナ ーゼを阻害する新規タンパクの単離および該新規タンパクのチオールレドックス タンパクによる還元を包含する。本発明は、更に油−貯蔵種子に特徴的な２Ｓア ルブミンタンパクのチオレドキシンによる還元をも包含する。また、本発明は特 にヘビの神経毒素およびある種の昆虫およびサソリの毒液毒素のインビトロでの 不活性化のための、並びに各固体における対応する毒作用を処置するための還元 されたチオールレドックス剤の使用をも包含する。
本発明は、ナ／ヨナルサイエンスファウンデーション（Ｎａ目ａｎａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）により授与された許諾契約Ｎｏｓ、　ＤＣＢ　 ８８２５９８０およびＤＭＢ　８８−１５９８０の下に政府の支援の基になされ た。米国政府が本発明の幾分かの権利を有する。
技術的背景 葉緑体は、フェレドキシン、フエレドキジンーチオレドキンンリダクターゼおよ びチオレドキシンｆおよびｍを含むフェレドキシン／チオレドキシン系を含有し 、これは光を光合成酵素の調節と関連付ける（ブキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ） 、　Ｂ、Ｂ、。
＋９９１．　”酸素型光合成における００２同化の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ＣＯｘ　ａｓｓｉｍｌｌａｔｉｏｎｉｎ　ｏｘｙｇｅｎｉｃ　ｐｈｏｔ ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：フエレドキシン／チオレドキシン系（Ｔｈｅｆｅｒｒ ｅｄｏｘｉｎ／１ｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ）、その発見、現状およ び将来的展望に関する見解（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｏｎ　ｉｔｓ　ｄｉｓｃ ｏｖｅｒｙ、ｐｒｅｓｅｎｔ　５ｔａｔｕｓ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｅｖｅ ｌｏ吹{ｎｅｎｔ）”。
Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９９１．２８８．　ｐ ｐ、　ｌ−９；シエイブ（Ｓｃｈｅｉｂｅ）、　Ｒ，、ｒ葉■ 体酵素のレドックス−変調。個々の制御の共通の原理（Ｒｅｄｏｘ−ｍｏｄｕｌ ａｔｉｏｎ　ｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ａ　ｃａＩｏｎ 　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｆｏｒ　１ｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ）ＪA 　Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　９６．　ｐｐ、　１−３　）。幾つかの研究により、植物 も、動物並びに多くの微生物について確立されたものと同様の系を含み、鎖糸に おいてはチオレドキシン（ｈ−型）が以下の式に従って、ＮＡＤＰＩ＋および酵 素ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ（ＮＴＲ）により還元されることを明 らかにした。
ＴＲ （１）　ＮＡＤＰＨ＋ｔ＋　”＋チオレドキシンｈａｆｆ　−＞　ＮＡＤＰ＋　 チオレドキシンｈ１．６（これに関しては、フロジンチオ（Ｆｌｏｒｃｎｃｉｏ ）、　Ｆ、Ｊ、等、　Ａｒｃｈ、口１ｏｃｈｃａ　［１ｉｏｐｈｙｓ、。
ｐｐ、　２１４−２２１を参照のこと）。現在の証拠はこのＮＡＤＰ／チオレド キシン系が植物組織中に広く分布しており、またミトコンドリア、小胞体および サイドシル中に収容されていることを示唆している（ポンデンシュタインーラン グ（Ｂｏｎｄｅｎｓｔｅｉｎチオレドキシンｈも、炭水化物代謝のサイドシル酵 素、ピロホスフェートフルクトース−６−Ｐ、　Ｉ−ホスホトランスフェラーゼ またはＰＰＰを還元により活性化することが知られている（キス（Ｋｉｓｓ）、 　Ｆｏ等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９９１． ２８７゜ｐｐ、　３３７−３４０）。
種子は、該ＮＡＤＰ／チオレドキシン系が植物において生理的活性をもつとされ る唯一の組織である。また、チオレドキシンｈは、実験室においてチオニン（ｊ ｈｉｏｎｉｎｓ）を還元することが示された（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、 　Ｔ、Ｃ，、等、　Ｉ’１ａｎｔＰｈｙｓｉｏ１．、１９８７．８５．　ｐｐ、 　４４（ｉ−４５１）。チオエン類はシスチンに富む可溶性の穀類種子タンパク である。該ジョンソン等の研究においては、以下の反応式２および３に従って、 ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ（ＦｆｆＲ）およびチオレドキシンｈを 介して、小麦ビューロチオニンをＮＡＤＰ）Ｉにより実験的に還元した。
Ｒ （２）　ＮＡＤＰＩ（＋チオレドキシンｈ　ａｔ　−＞　ＮへＤＰ＋チオレドキ シンｈ、□ （３）ビューロチオニン。ヨ）チオレドキシンｈ、、、−＞ビューロチオニンｒ ｅｄ　＋チオレドキシンｈ□ 小麦、ライムギ、オオムギ、コーン、キビ、モロコシおよびイネ等の穀類の種子 は４種の主な種子タンパク群を含んでいる。これら４種の群はアルブミン類、グ ロブリン類、グリアジン類およびグルテニン類または対応するタンパク類である 。チオエンはアルブミン群に属する。現在、小麦およびライムギはグルテンまた はドウを作成している唯一の２種の穀類である。グルテンはドウに凝集性を与え る、粘着力の強い弾性かつゴム状のタンパク複合体である。グルテンは主として グリアジンおよびグルテニンタンパクから構成される。これはライムギまたは小 麦のドウを水洗した場合に形成される。パン用のドウに弾性に富む特性を与える のがグルテンである。他の主な栽培穀類であるオオムギ、コーン、モロコシ、エ ンバク、キビおよびイネ、並びに大豆植物からの粉は、小麦およびライムギに対 して使用した条件下ではグルテン一様の網状構造を生成しない。
グルテニンおよびグリアジンはシスチン含有種子貯蔵タンパクであり、かつ不溶 性である。貯蔵タンパクは発芽中に分解される種子中のタンパクであり、発芽中 の実生がこのタンパクを利用して成長かつ発育する。プロラミン類は小麦以外の 穀粒中の貯蔵タンパクであり、グリアジンに対応し、一方でグルテリンは小麦以 外の穀粒中の貯蔵タンパクであり、グルテニンに対応する。小麦貯蔵タンパクは 全種子タンパクの８０％までを占める（カサルダ（Ｋａｓａｒｄａ）、　Ｄ、Ｄ 、、等、八ｄｖ、Ｃｅｒ。
の形成において、従ってパンの品位において重要であると考えられている。イン ビトロ実験から、種子貯蔵タンパクの溶解度は還元すると増大することが明らか にされている（シューリ−（Ｓｈｅｗｒｙ）、　Ｐ、Ｒ，、等、　Ａｄｖ、　Ｃ ｅｒ、　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈ、、　１９８５゜７、　ＰＰ、　ｌ−８３）。しか しながら、以前グルテニンおよびグリアジンの還元はドウの品位を改善するとい うよりも寧ろ低下すると考えられていた（ダール（Ｄａｈｌｅ）、　Ｌ、に、９ 等、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅａ、１９６６、４３．　ｐｐ、　６８２−６８８） 。このことは、恐らく化学的還元剤による非−特異的還元が該ドウの脆弱化を生 じたものと考えられる。
「直捏（Ｓけａｉｇｈｔ　Ｄｏｕｇｈ）Ｊおよび「予備−醗酵（Ｐｒｅ−Ｆｅ＋ ｖ＋ｅｎｔ）Ｊ法が、ドウおよび後のイースト膨化パン製品の製造用の主な２つ の公知法である。
該直捏法に関連して、粉、水または他の液体および他のドウ成分、例えばイース ト、穀粒、食塩、ショートニング、砂糖、イースト栄養分、ドウ調質剤および保 存剤（但し、これらに制限されない）の全てをブレンドして、ドウを形成し、部 分的または完全な熟成にまで混合する。この生成したドウを、特定の方法または 所定の最終製品の緒特性に応じて一定時間醗酵させることができる。
この方法の次工程では、焼き、冷却し、かつ裁断した後の所定の正味の重量を達 成するのに十分な重量の適当なサイズの断片にこのドウを機械的にまたは手作業 で分割する。このドウの断片は、次にしばしば丸められ、かつ種々の長さの時間 静置（中間的焙炉）される。これは、ガス抜きおよび整形操作の前に該ドウを［ 柔らか＜　（ｒｅｌａｘ）」する。この時間は、一般的に５〜１５分であるが、 特定の加工要件並びに処方物に応じてかなりの幅で変えることができる。このド ウ断片を、次に機械的または手作業で適当な形状に整形し、更に通常は焼く前に 最終の「焙炉（ｐｒｏｏｆ）］に付される。このドウ断片を次に、種々の時間、 温度、およびスチーム条件下で焼いて、所定の最終製品を得る。
上記予備醗酵法においては、イーストを他の成分と配合し、種々の長さの時間に 渡り醗酵させた後に、パンまたはロールトウの最終的混合を実施する。これら系 に対するパン・菓子製造業者の用語は「ウォーターブルー（Ｗａｔｅｒ　Ｂｒｅ ｗ）Ｊ、［リキッドファーメント（１，１ｑｕｉｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔ）Ｊ、　［ リキッドスポンジ（１，ｉｑｕｉｄＳｐｏｎｇｅ）　Ｊおよび［スポンジ／ドウ （Ｓｐｏｎｇｅ／Ｄｏｕｇｈ）　Ｊなどを包含する。０〜１００％の範囲の割合 の粉を、他の成分、例えば水、イースト、イースト栄養分およびドウ調質剤等（ これらに制限されない）と組み合わせ、所定の時間制御されたまたは周囲条件下 で醗酵させる。典型的な醗酵時間は１〜５時間である。この醗酵生成物はそのま ま使用でき、あるいは冷却し、かつ後の使用のために大容量のタンクまたはこね ばち内に保存できる。残りの成分（粉、特徴付は用成分、付随的添加物、付随的 水、等）を添加し、得られたドウを部分的または完全に熟成するまで混合する。
このドウを、次いで種々の時間醗酵させる。典型的には、幾分かの醗酵が生じた 後に、残りの成分を添加するが、これに必要とされる時間は最小限の時間（即ち 、１０−２０分）である。しかし、装置並びに製品の型に応じて変えることがで きる。該第二の醗酵段階に引き続き、このドウを直捏法と同様に処理する。
ここで使用する用語「ドウ混合物（ｄｏｕｇｈ　ｍ１ｘｔｕｒｅ）Ｊとは、最小 限度の粉またはあら粉と液体、例えばミルクまたは水とを含む混合物を表すのに 使用する。
ここで使用する用語「ドウ（ｄｏｕｇｈ）Ｊとは、最小限度の粉またはあら粉と 液体、例えばミルクまたは水とを含む弾性のある、柔軟なタンパク網状構造をも つ混合物を表すのに使用する。
ここで使用する用語「ドウ成分（ｄｏｕｇｈ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）Ｊとは、 以下の成分、例えば粉、水または他の液体、穀粒、イースト、スポンジ、食塩、 ンヨートニング、砂糖、イースト栄養分、ドウ調質剤および保存剤を包含するが 、これらに限定されない。
ここで使用する用語「焼き製品（ｂａｋｅｄ　ｇｏｏｄ）Ｊとは、あらゆる型の パン、例えばイースト醗酵したおよび化学的に醗酵した並びに白パン、別種のパ ン、ロールパン、マフイン、ケーキおよびクツキー、糖菓被覆製品、クラッカー 、ドーナツツおよび他のスィートペーストリー製品、パイおよびピザ皮、プレ・ ソラニル、ピータ−および他のフラットブレッド、トルテイーヤ、パスタ製品、 および冷凍および冷蔵ドウ製品を包含するが、これらに限定されない。
チオレドキシンは粉中のアルブミンを還元するが、チオールレドックスタジノく りはグルテニンおよびグリアジン並びに池の水不溶性の貯蔵タンＡ９を還元する のに使用されておらず、またドウ並びに焼き製品の性能の改善にも使用されてい ない。チオールレドックスタンパクも、グルテンの性能を改善し、結果としてそ の価値を高めるのにも、また栽培穀類、例えばオオムギ、コーン、モロコシ、エ ンバク、キビおよびコメなどから、あるいは大豆粉からドウを調製するのにも使 用されていない。
多くの穀類種子も異種起源の酵素の阻害剤として機能することが明らかにされて いるタンパクを含有する。これらの酵素阻害剤はある種の有害な微生物に対する 防禦を果たし得ることが示唆されている（ガルシアーオルメト（Ｇａｒｃｉａ− ０１ｍｅｄｏ）。
Ｆｌｌ等、オックスフォードサーベイズオブプラントモレキュラー＆セルバイオ ロジー（Ｏｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、＋９８７．４．　垂吹B ５９３−６２６）。２種のこのような型の酵素阻害剤はアミラーゼ阻害剤および トリプシン阻害剤である。更に、オオムギタンパク阻害剤（本研究においてはテ ストしなかった）が同一の起源を由来とするα−アミラーゼを阻害することを示 す証拠がある（ウェスレーク（Ｗｅｓｅｌａｋｅ）、　Ｒ，Ｊ、、等、　Ｐｌａ ｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１９８３．７２．　ｐｐ。
８０９−８１２）。不幸なことに、この阻害性タンパクは、幾つかの食品製品中 で、しばしば望ましからぬ作用を生ずる。大豆中のトリプシン阻害剤、特にクニ ツツ（Ｋｕｎｉ　ｔｚ）　トリプシン阻害剤（ＫＴＩ）およびボウマン−パーク （Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）　トリプシン阻害剤（ＢＢＴＩ）を、先ず不活性化 した後に初めて、あらゆる大豆製品はヒトまたは家畜による消化が可能となる。
これら２種の阻害性タンパクが、水素化ホウ素ナトリウムにより化学的に還元し た場合に、トリプシン阻害剤として不活性となることは公知である（パーク（Ｂ ｉｒｋ）、　Ｙ、、　ｌ吐Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、。
＋９８５．２５．９ｐ、＋１３−１３１およびパーク、　Ｙ、、　Ｍｅｔｈ、　 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　＋９７６、４５．　ｐｐ。
６９５−７３９）。プロテアーゼを阻害する他のタンパクと同様に、これらの阻 害剤は分子内ジスルフィドを含み、また通常は熱およびタンパク分解による不活 性化に対して安定である（パークの上記文献（＋９７６）、ガルシアーオルメト 等の上記文献（１９８７）およびライアン（Ｒｙａｎ）（１９８０））。一般に 、これらの阻害剤により生ずる悪影響を最小化するために、動物並びにヒト食品 製品中のこれらの大豆トリプシン阻害剤および他のトリプシン阻害剤は、該食品 を高温に暴露することにより処理されている。しかし、この熱処理は阻害剤活性 を十分に排除しない。更に、この方法は経費が掛かるばかりが、重要な栄養価値 のある他のタンパクの多くを分解してしまう。例えば、１２０℃での３０分の処 理であっても、大豆粉のＢＢＴＩの完全な不活性化に導き、約２０％の元のＫＴ Ｉ活性が残されるに過ぎない（フリートマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）等、　１９９ １）。阻害剤の完全な不活性化に必要とされるより長いかつより高温の処理はシ スチン、アルギニンおよびリジン等のアミノ酸の分解をもたらす（カニｒ−（Ｃ ｈａｅ）等、　＋９８４．スクレープ＆クログダール（Ｓｋｒｅｄｅ　ａｎｄ　 Ｋｒｏｇｄａｈｌ）。
１９８！５）。
α−アミラーゼ活性を必要とする数種の工業的方法がある。その１例は活性α− アミラーゼを必要とするオオムギからの麦芽製造である。阻害剤、例えばオオム ギのアミラーゼ／ズブチリシン（ａｓｉ）阻害剤および他の穀類中のその等偽物 のチオールレドキジンタンパク還元による不活性化は、現在の方法によるよりも 迅速にα−アミラーゼを十分に活性化でき、結果として麦芽製造または類似の方 法に・たする時間を短縮できる。
１寸”−ルレドックスタンパクも、トリプシンまたはアミラーゼ阻害剤タンパク を不活ヤ１化するのに従来使用されてはいなかった。トリプシン阻害剤、例えば クニックおＪ、びボウマン−パーク阻害剤の還元は、その阻害作用を低下する（ バーク（Ｒｉｒｋ）、　Ｙ、、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｉ’Ｐｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｒｅｓ、、　１９８５．２５．　ｐｐ、　１１３−１３１j。ヒト または家畜が／ｒｌ費するための大豆製品中の該阻害剤のチオールレドックスに 関連１、た還元は鴫を必要としないか、あるいは現在タンパクの変性に必要とさ れるよりも低いＭｌを必要とするにすぎず、結果として変性のコストを下げ、カ リ大豆タンパクの品位を改善する。また、生理的還元剤、即ち所謂クリーンな添 加剤（即ち、［有害な化学薬品］と考えられる成分を含まない添加剤）が強く望 まれている。というのは、食品工業か化学的添加剤の代替品を探しめているから である。更に、生理的な還元剤、例えばチオールレドックスタンパクによる制御 された様式で、粉の品位を改善する主要な小麦および種子貯蔵タンパクを選択的 に還元する能力が製パン・製菓工業において、小麦およびライムギから作成した ドウの特性改善、並びに他の穀粒由来の粉、例えば穀類粉がらまたはキャラサバ もしくは大豆粉からドウを作成するのに有用である。
油−貯蔵性種子、例えばヒマおよびブラジルナツツ（Ｂｒａｚｉｌ　ｎｕｔ）等 に特徴的な２Ｓアルブミンタンパク群（クライス（Ｋｒｅｉｓ）等、　１９８９ ；　ニール＆ファング（Ｙｏｕｌｅａｎｄ　Ｈｕａｎｇ）、　１９８１．）　（ これらは種子胚乳または子葉中のプロティンボディー内に収容されている（アシ ュトン（Ａｓｈｔｏｎ）、等、　１９７６；ウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ）、等、　 １９８０））は、典型的には２個の分子間ジスルフィド結合により結合された異 種のサブユニットからなり、該サブユニットの一方は７〜９　ｋＤａであり、他 方は３〜４　ｋＤａである。この大きなサブユニットは２個の分子内ジスルフィ ド結合を含み、一方で小さなサブユニットはこれを含まない。該２５大サブユニ ツトの分子内ジスルフィドは大豆のボウマン−パーク阻害剤のものとの類似性を 示す（クライス（Ｋｒｅｉｓ）等、　１９８９）が、２Ｓタンパクが生理的条件 下で還元を行う能力に関しては何も知られていない。
これらの２３アルブミンタンパクはメチオニンに富んでいる。最近、ブラジルナ ツツの２３タンパクを生成する、トランスジェニックな大豆が開発された。この ような大豆中の２３タンパクの還元は、メチオニンに富んだ大豆扮装のパン中に 形成されるドウの網状構造への該大豆タンパクの組み込み性を高めることを可能 とした。更に、これらの２８タンパクはしばしばアレルゲンである。この２Ｓタ ンパクの還元はそのアレルギー活性の抑止をもたらすであろう。
プルラナーゼ（「脱分枝酵素（ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｅｎｚｙ＋ｎｅ）Ｊ） は、加水分解を通してα−１，６結合を開裂することにより、穀類種子の胚乳の 澱粉を分解する酵素である。
プルラナーゼは醸成並びにベーキング工業にとっての基本的な酵素である。プル ラナーゼは麦芽製造および砂糖または他の炭水化物の添加なしに実施される幾つ かのベーキング手順において澱粉を分解するのに必要とされる。十分なプルラナ ーゼ活性を得ることが、特に麦芽製造工業における問題である。幾つかの場合に おいて、ジチオスレイトール（ＤＴＴ：チオレドキシン用の化学的還元剤）が穀 類調製物（例えば、オオムギ、エンバクおよびコメ粉）のプルラナーゼを活性化 することが知られている。生理的に許容されるシステムで、プルラナーゼを十分 に活性化するもしくはその活性を高める方法はより迅速な麦芽製造法を与え、か つ高い砂糖の許容性のために、アルコール飲料、例えば高いアルコール含量を有 するビールの製造を可能とする。
ヘビに噛まれることにより生ずる死および永続的な傷害が多くのアフリカ、アジ アおよび南米諸国において重大な問題となっており、また米国の幾つかの南部お よび西部領域でも大きな問題となっている。ヘビの毒液は活性なタンパク成分（ 一般には数種）により特徴付けられ、該成分は分子間（路内）シスチン内におよ び幾つかの場合における分子間（踏量）シスチン内に位置するジスルフィド（Ｓ −Ｓ＞架橋を含む。与えられた毒素群内のシスチンの位置は高度に保存性である 。
毒性に関する分子内Ｓ−８基の重要性は、これら基の還元がマウスにおける毒性 の喪失に導くことを示した報告から明らかである（ヤング（Ｙａｎｇ）、　Ｃ， Ｃ，、Ｂｉｏｃｈｅｔからの神経伝達物質の遊離を変更するタンパクであり、か つシナプス前部またはシナプス後部作用性であり得る。ヘビ毒液神経毒に冒され た個体に見られる共通の症状は長期に渡る壊死および該個体の一般的な衰弱等に 加えて、膨張、浮腫および苦痛、失神または目眩、冒された部分の刺痛または麻 痺、産学、筋肉収縮、腎障害なとを含む。
ノナジス前部神経毒素は２群に分類される。その第一の群、即ちβ−神経毒素は ３種の異なる組のタンパクを含み、その各々は高度の保存性を示すホスホリパー ゼＡ２活性を有する。ホスホリパーゼＡ２活性に応答し得るタンパクは６〜７個 のジスルフィド架橋をもつ。このβ−神経毒素に属するものは単一の鎖（例えば 、コードトキノン（ｃａｕｄｏｔｏｘｉｎ）、ノテキシン（ｎｏｔｅｘｔｎ）お よびマムシ毒素）または多重鎖（例えば、クロトキシン、セルレオトキシン（ｃ ｅｒｕｌｅｏｌｏｘｉｎ）およびクサリヘビ（Ｖｉｐｃｒａ）　）キノン）の何 れかである。２個のサブユニットからなるβ−ブンガロトキンジンβ−ｂｕｎｇ ａｒｏｔｏｘｉｎ）は第三の組を構成する。これらサブユニットの１つは哺乳動 物膵臓由来の該クニソッー型のプロティナーゼ阻害剤と同類である。
多重鎖β−神経毒素はイオン的に結合したタンパク成分を有し、一方でβ−ブン ガロトキシンの２個のサブユニットは分子間ジスルフィド結合により共有結合的 に結合している。これも哺乳動物膵臓由来の該クニノッー型のプロテイナーゼ阻 害剤と同類である、β−ブンガロトキシンのＢ鎖すブユニットは３個のジスルフ ィド結合を有する。
促進性の（ｆａｃｉｌＨａｊｏｒｙ）神経毒素である第二のシナプス前部毒素群 は酵素活性が欠損しており、また２個の亜群をもつ。その第一の亜群、即ちデン ドロトキシン（ｄｅｎｄｒｏｔｏｘｉｎｓ）は、５７〜６０個のアミノ酸をもつ 単一のポリペプチド配列を有し、これは哺乳動物膵臓由来の該クニツッー型のト リプシン阻害剤と同類であり、電圧−感受性のカリウムチャンネルを遮断する。
第二の亜群、例えばファシクリン（ｆａｓｃｉｃｕｌ　１ｎｓ）（ファシクリン １および２）は、ヨリンエステラーゼ阻害剤であり、これ以上は深く研究されて いない。
シナプス後部神経毒素は長いまたは短い神経毒素の何れかに分類される。各型は Ｓ−３基を含有するが、そのペプチドは固有のものであって、ホスホリパーゼＡ 。
またはクニックまたはクニッッー型の阻害性タンパクとは類似しない。この短い 神経毒素（例えば、エラブトキシンａおよびエラブトキシンｂ）は、アミノ酸残 基６０〜６２個に対応する長さをもち、また４個の分子内ジスルフィド結合を有 する。
該長い神経毒素（例えば、α−ブンガロトキシンおよびα−コブラドキシン）は ６５〜７４個のアミノ酸残基と、５個の分子内ジスルフィド結合を有する。もう 一つの型の毒素、即ち細胞毒素はシナプス後部作用性であるが、その毒性作用様 式は明確に定義されていない。これらの細胞毒素は曖昧な薬理作用、例えば溶血 、細胞溶解および筋減極を示す。これらは神経毒素よりも低毒性である。細胞毒 素は。
通常６０個のアミノ酸残基と４個の分子内ジスルフィド結合とを有する。ヘビ毒 液の神経毒素は全て多数の分子内ジスルフィド結合を有する。
各個体における緊急処置後に行われる、有毒のヘビによる咬創の治療に使用され る一般の抗ヘビ毒血清はウマ中で調製された抗毒素の静脈内注射を含む。有毒動 物性中毒症後の如何なる時間にこの抗ヘビ毒血清を投与でき、またこれが有効で あり得るかどうかは未知であるが、その使用は２４時間後までとすることを推奨 する。抗ヘビ毒血清治療後には、一般に血漿、アルブミン、血小板または特定の 凝血因子等の液体の静脈内投与が行われる。更に、維持薬品、例えば抗生物質、 抗ヒスタミン剤、抗テタヌス剤、鎮痛剤および鎮静剤等もしばしば投与される。
幾つかの場合には、ショック、腎障害および呼吸障害を最小化するために一般的 な治療手段が採用される。咬創部近傍へのカル７ウム−１１：ＤＴＡの投与およ び創傷部分の切除以外にも、未知の毒素中和および血流中への毒素の取り込みの 防止をもたらす局所的な治療手段がある。これらの局所治療の意味は疑わしく、 また通常はウマ血清に対する個々の感受性を無効にしてしまう（ラッセル（Ｒｕ ｓｓｅｌ）、　Ｆ、Ｒ，。
ヘビ毒液の毒性（Ｓｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ　Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）、　１９８３ ．　ｔｆｆｆｆレグレートネックコラムインターナンｇナル社（Ｓｃｈｏｌｌｕ ｏ＋　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、））。
用語［個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）Ｊとは、本明細書では動物およびヒトを意 味するものと定義する。
一般に使用されている抗ヘビ毒血清は、ウマ血清に敏感な患者におけるアレルギ ー反応（患者の５％まで）に加えて、有害な副作用を生ずる可能性がある点で問 題がある。非アレルギー性反応は発熱性ショックおよび補体の枯渇を包含する（ チップール（Ｃｈｉｐｐａｕｒ）、　Ｊ、−Ｐ、、等、爬虫類毒液および毒素（ Ｒｅｐｔｉｌｅ　Ｖｅｎｏｍｓａｎｄ　Ｔｏｘｉｎｓ）、　１９９１．　ｐｐ、 　５２９−５５５．　Ａ、Ｔ、チュー（Ｔｕ）編、マルセルデッ力−社（Ｍａｒ ｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、））。
ＮＡＤ円（およびチオレドキジンリダクターゼの存在下においてチオレドキシン はインビトロでバクテリア神経毒素テタヌスおよびボッリヌム（ｂｏＬｕｌ　ｉ ｎｕｍ）Ａを還元する（ンアボ（Ｓｃｈｉａｖｏ）、　Ｇ、等、感染および免疫 （！ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｍｕｎｉｔｙ）。
路間ジスルフィド結合の還元において有効であり、かっこのような還元されたテ タヌス毒素は最早神経毒性ではなかった（シアボ等の」二記文献）。しかし、ボ ッリヌムＡ毒素の路間ジスルフィドのチオレドキシンによる還元はより一層緩慢 であると報告された（キストナー等の上記文献）。本発明において研究されたヘ ビの神経毒素とは対照的に、テタヌスの研究グループ（ノアボ等の上記文献）は 、テタヌス毒素を使用して実施した研究において、還元されたチオレドキシンが 毒素の路内ジスルフィド結合を還元する何の証拠も見出せなかった。また、チオ レドキシンがボツリヌムΔについて実施した研究において、路内ジスルフィドを 還元したという証拠も見られなかった。テタヌスおよびポッリヌムＡ毒素は、後 者が（１）低分子量を有し、（２）分子内ジスルフィド結合に富み、（３）トリ プシンおよび池の動物プロテアーゼに対して抵抗性であり、（４）酵素的な変性 なしに活性であり、（５）多くの場合において、動物タンパク、例えばホスホリ パーゼＡ、およびクニソツー型のプロテアーゼとの類似性を示し、（６）多くの 場合において、分子間ジスルフィド結合が不足し、かつ（７）熱およびプロテア ーゼ等の薬品に対して安定である点でヘビの神経毒素とは有意に異なるタンパク である。
１％β−メルカプトエタノールと共に６時間インキュベートし、８Ｍの尿素およ び３０伽剥のβ−メルカプトエタノールと共にインキュベートすることによる、 インビボでのヘビ毒素の還元による不活性化が文献に報告されている（ハヮード 生理的条件からかなりかけ離れている。毒素タンパクに関連して本発明で定義す る用語［不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）Ｊとは、該毒素がレセプタに結 合できない点で、インビボにて最早生物学的活性をもたないことを意味する。ま た、本発明で使用する用語「解毒（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、該 用語「不活性化Ｊの拡張であり、動物毒性試験による測定に基づいて、該毒素が 個体内で中和されていることを意味する。
ハチ毒液は少なくとも４０種の成分を含む複雑な混合物であり、主成分としてメ リチンおよびホスホリパーゼＡ２（それぞれ該毒液全重量の５０％および１２％ を構成する）を含み、また微量成分として、例えば小さなタンパクおよびペプチ ド、酵素、アミンおよびアミノ酸を含む。
メリチンは２６個のアミノ酸残基を含む、分子量２８４０のポリペプチドである 。これはジスルフィド架橋を含まない。脂質−水の相聞（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ）に対する高いアフィニティーのために、このタンパクは細胞膜のリン脂質二重 層を透過し、そこに組み込まれた構造で分布する。メリチンそれ自体は毒素では ないが、これは膜の構造を変え、結果としてホスホリパーゼＡ２、該毒液中に存 在する主な成分並びに主なアレルゲンの加水分解活性を高める。
ハチ毒液のホスホリパーゼＡ２は１２８個のアミノ酸残基をもつ単一のポリペプ チド鎖であり、４個のジスルフィド架橋により架橋され、かつ炭水化物を含有す る。
このハチ毒液の主な毒性作用はメリチンとの関連で達成されたホスホリパーゼＡ Ｉの強力な加水分解活性によるものである。
ハチ毒液中の他の毒性タンパクは低分子量をもち、かつ構造上重要な役割を演す ると考えられる少なくとも２個のジスルフィド架橋を含む。更に、プロテアーゼ 阻害剤（６３−６５個のアミノ酸）、ＭＣＤまたは４０１−ペプチド（２２個の アミノ酸）およびアパミン（ａｐａｍｉ口）（１８個のアミノ酸）をも包含する 。
ハチの種類は数千あるが、ミツバチ即ちアピスメリフエラ（八ｐｉｓ　ｍｅｌｌ ｉｆｅｒａ）のみがアレルギー反応の重大な原因となる。これに対する応答は、 局所的不快感から全身的反応、例えばショック、低血圧、呼吸困難、意識喪失、 喘鳴および／または胸部狭窄（死に至る可能性がある）にまで及ぶ。これらの症 例において使用されている唯一の治療はエピネフリンの注射である。
ハチ剥削の治療は、アレルギー反応をもつ個体に対してのみ重要である訳ではな い。ミツバチの１変種である［キラー（ｋｉｌｌｅｒ）Ｊまたはアフリカ型のハ チは、欧州型のミツバチより一層攻撃的であり、南部および北部アメリカ両者に おいて危険性のあるものである。該アフリカ型のハチおよび欧州型のハチ由来の 毒液の致死性は同一であると考えられる（シューメイカー（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅ ｒ）、　Ｍ、　ｌ。等。
Ｎａｊｕｒ已　１９８９．３３７．　ｌ）、　４１３）が、群の行動パターンは 完全に異なる。アフリカ型のハチはより迅速に、より多数でコロニーの妨害に対 して応答し、またより一層激しい剥削を与える（コリンズ（Ｃｏｆｆｉｎｓ）、 　Ａ、！ＩＬ　等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８２．２１８．　ｐｐ。
７２−７４）。アフリカ型ハチの集団攻撃は個体に数千の剥削を与え、死をもた らす可能性がある。この「キラー」　ミツバチはアフリカ型ハチ（アビスメリフ エラスクテラータ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｒｅｒａ　５ｃｕｔｅｌｌａｔａ）と 欧州型のハチ（アピスメリフエラメリフエラ（Ａｐｉｓ　＋ｎｅｌｌｉｆｅｒａ 　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）との間の交雑により生したものと考えられる。
アフリカ型のハチは、蜂蜜生産を改良してより熱帯的に適したハチとすべく、１ ９５６年にブラジルに導入された。アフリカ型のハチは南部アメリカから北部ア メリカに移動しつつあり、テキサスおよびフロリダで報告されている。
世界の幾つかの領域、例えばメキンコ、ブラジル、化アフリカおよび中東におい ては、サソリがヒトの生命の危険をもたらしている。しかし、ブチダニ（Ｂｕｌ ｈｉｄａｅ）科（アンドロクトヌス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ）　、ブタス（Ｂ ｕｔｈｕｓ）、セントルロイデス（Ｃｅｎｌｒｕｒｏｉｄｅｓ）、レイウルス（ Ｌｅｉｕｒｕｓ）およびチテユス（Ｔｉｔｙｕｓ）属）のサソリのみがヒトに対 して毒性をもつ。サソリの毒液の化学的組成はヘビまたはハチの毒液程には複雑 ではない。サソリの毒液はムコ多糖類、少量のヒアルロニダーゼおよびホスホリ パーゼ、低分子量分子、プロテアーゼ阻害物質、ヒスタミン遊離物質および神経 毒素、例えばセロトニンを含む。該神経毒素は神経筋接合部における電位−感受 性イオンチャンネルに影響を与える。該神経毒素は３〜４個のジスルフィド架橋 をもつ塩基性ポリペプチドであり、また２つの群に分類できる。その一つは６１ 〜７０個のアミノ酸残基をもつペプチドであって、ナトリウムチャンネルを遮断 する。他方のペプチドは３６〜３９個のアミノ酸残基を含み、カリウムチャンネ ルを遮断する。非生理的還元剤、例えばＤＴｒまたはβ−メルカプトエタノール による、該神経毒素上のジスルフィド架橋の還元（ワット（Ｗａｔｔ）、　Ｄ、 Ｄ。
等、　Ｔｏｘｉｃｏｎ、　＋９７２．１０．　ｐｐ、　＋７３（８１）は、その 毒性の喪失に導く。
有毒のサソリに刺された動物の症状は興奮過多、呼吸困難、産学、麻痺および死 を包含する。現時点においては、サソリによる剥削に対する唯一の解毒剤は抗ヘ ビ毒素である。該毒液の入手性が抗ヘビ毒素の生産における主な問題である。
ヘビの毒液とは異なり、サソリの毒液は収集が極めて困難である。というのは、 検体当たりの毒液の収量が制限されており、かつ幾つかの場合には乾燥した毒液 の保存はその毒性の変化を生じてしまう。抗ヘビ毒素の製造における付随的な問 題は抗原の存在が極めて乏しいことである。
ヘビ、ハチおよびサソリの毒素の生理的条件下での還元による不活性カリウムは これまで報告されておらず、またチオールレドックス試薬、例えば還元されたリ ポ酸、ＤＴｒ、または還元されたヂオレドキノンが、個体内におけるこれら毒液 に対する解毒剤として機能し得ることもこれまでに示唆されていない。
発明の概要 本発明の一つの目的は、非チオニン型シスチン含有タンパクの還元法を提供する ことにある。
本発明の第二の目的は、チオールレドックスタンパクのみを、あるいは還元剤ま たは還元系との組み合わせを使用して、粉または種子中に存在するグルテニンま たはグリアジンを還元する方法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、チオールレドックスタンパクのみを、あるいは還元剤ま たは還元系との組み合わせを使用して、ドウ強度および焼き製品の緒特性、例え ば良好なりラムス品位、該焼き製品の柔軟性および高いパン塊の体積等を改良す る方法を提供することにある。
本発明の目的は、また上記方法を実施するのに有用なチオールレドックスタンパ クを含む処方物を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、コメ、コーン、大豆、オオムギ、エンバク、キャラサ バ、モロコシまたはキビ粉からドウを製造する方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、改良されたグルテンを調製する方法または小麦およびラ イムギ以外の穀粒からグルテン一様の製品を調製する方法を提供することにある 。
本発明は、またジスルフィド結合を有する酵素阻害性タンパクを還元する方法を 提供することも目的とする。
更に、本発明はチオレドキシンを発現または超発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ） するように遺伝子操作された酵母細胞を提供することをも目的とする。
本発明の池の目的は、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現または超発 現するように遺伝子操作された酵母細胞を提供することにある。
また、本発明の目的は上記の遺伝子操作された酵母細胞を使用して、ドウまたは 焼き製品の品位を改良する方法を提供することにある。
更に別の本発明の目的は、１以上の分子内シスチンを含有する非−チオニン、非 葉緑体タンパクの分子内ジスルフィド結合を還元する方法を提供することにあり 、該方法は該シスチン含有タンパクを含む液体または物質にチオールレドックス タンパクを添加し、該チオールレドックスタンパクを還元し、かつ該シスチン含 有タンパクを該チオールレドックスタンパクにより還元する工程を含む。
本発明の他の［コ的は、ジスルフィド結合を有し、かつ８〜１５ｋＤａの分子量 をもつ単離プルラナーゼ阻害性タンパクを提供することにある。
本発明の目的は、更にオオムギまたは小麦の胚乳由来のプルラナーゼの活性を高 める方法を提供することにあり、該方法は該プルラナーゼを含有する液体または 物質にチオレドキシンを添加し、該チオレドキシンを還元し、結果として該プル ラナーゼ活性を高める工程を含む。
更に別の本発明の目的は、１以上の分子内シスチンを含有する動物毒液毒素タン パクを還元する方法を提供することにあり、該方法は該シスチン含有タンパクと 該タンパクを還元するのに有効なチオールレドックス（ＳＨ）試薬の一定量とを 接触せしめ、該１種以上の分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元 するのに十分な時間この接触状態を維持して、該神経毒素タンパクを還元する工 程を含む。該チオールレドックス（Ｓｌ＋）試薬は還元されたチオレドキシン、 チオレドキシンの存在下での還元されたリボ酸、ＤＯＴまたはチオレドキシンの 存在下でのＤＴｒであり得、また該ヘビ神経毒素はシナプス前部またはシナプス 後部神経毒素であり得る。
また、本発明はヘビ神経毒素タンパクとチオールレドックス（ＳＨ）試薬とを含 有する組成物を提供することをも目的とする。
更に別の本発明の目的は、１種以上の分子内シスチンを含有する動物毒液毒素タ ンパクを還元する方法を提供することにあり、該方法は該タンパクと、このタン パクを還元するのに有効な一定量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、Ｎ ＡＤＰＨまたはＮＡＤＰＨ発生系およびチオレドキシンとを接触せしめ、該１種 以上の分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間 この接触状態を維持して、該タンパクを還元する工程を含む。
本発明は、更に１種以上の分子内シスチンをもつヘビ神経毒素を、インビトロで 不活性化する方法を提供することにあり、該方法は該毒素を含む液体にチオール レドックス（ＳＨ）試薬を添加する工程を含み、ここで該試薬の量は該毒素を還 元するのに十分な量である。
本発明は、更に個体内の毒液の毒性を処理する方法を提供することにあり、該方 法は毒物の毒性に冒された個体に、該毒物の毒性を減少もしくは軽減するのに有 効な量のチオールレドックス（ＳＨ）試薬を投与する工程を含む。
本発明の目的に従えば、本発明の方法はドウの緒特性を改良するために提供され 、ドウ成分とチオールレドックスタンパクとを混合して、ドウを形成する工程と 、該ドウを焼く工程とを含む。
同様に、本発明の目的に従えば、本発明の一方法は穀粒食品製品中の酵素阻害性 タンパクを不活性化するために提供され、該方法はチオールレドックスタンパク と種子製品とを混合する工程と、還元剤または還元剤系により該チオールレドッ クスタンパクを還元する工程と、該酵素阻害物質を該還元されたチオールレドッ クスタンパクにより還元する工程とを含み、該酵素阻害物質の還元が該酵素阻害 物質を不活性化する。
本発明で使用する該チオールレドックスタンパクはチオレドキシンおよびゲルタ レトキシンを包含する。該チオレドキシンはＥ、コリ（ｔ！、　ｃｏｌｉ）チオ レドキシン、チオレドキシンｈ、ｆおよびｍ並びに動物由来のチオレドキシンを 包含するがこれらに制限されない。本発明で使用するチオレドキシンの還元剤は リボ酸または還元系、例えばＮＡＤＰチオレドキシンリダクターゼ（ＮＴＲ）と 組み合わせたＮＡＤＰＨを含むことができる。ゲルタレトキシンの還元剤は還元 されたグルタチオンと、該還元系ＮＡＤＰＨおよびグルタチオンリダクターゼと の組み合わせを含むことができる。ＮＡＤＰＨはＮＡＤ円１円虫発生剤はＮＡＤ ＰＩ＋発生組成物、例えばグルコース６−ホスフｚ−トと、ＮＡＤＰと、酵母等 を由来とするグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとを含むものなどで 代用することもできる。該ＮＡＤＰＨ発生剤は、ドウ調製工程の開始時点で、チ オし・ドキ／ンおよびＮＡＤＰチオレドキシンリダクターゼと共に添加できる。
本発明は、またンステイン含有タンパクを使用して実施できることに注意すべき である。ンステインは先ず酸化され、次いでチオールレドックスタンパクを通し で還元される。
発明の詳細な説明 この詳細な説明においては、以下の定義並びに略号を使用する。
ＣＭ：　幾つかのパン小麦のα−アミラーゼ阻害剤ＤＳＧ・　マカロニ小麦から 単離した幾つかのα−アミラーゼ阻害剤ＤＴＮＢ　：　２’　、　５°−ジチオ ビス（２−ニトロ安息香酸）ＮＴＲ：　ＮＡＤＰ−チオレドキジンリダクダーゼ ｍ日叶：　モノブロモビマン（＋ｎｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉ＠ａｎｅ）ＮＡＤＰ− ＭＤＨ：　ＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼＦＢＰａｓｅ　：　フルクトー ス−１，６−ビスホスファターゼＳＯ３・　ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ：　ジチオスレイトール 穀類　キビ、小麦、エンバク、オオムギ、コメ、モロコシまたはライムギＢＢＴ Ｉ　ボウマン−パーク大豆トリブジン阻害剤ＫＴＩ：　クニノツ大豆トリブ／ン 阻害剤ＰＡＧＥ：　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＴＣＡトリクロロ酢酸 酵素阻害性タンパク実験 ＣＶ、モンデュール（Ｍｏｎｄｕｒ））の種子を実験室ストックから得た。
試薬 酵素アッセイおよびドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動用の化学薬品および精薬品は、それぞれシグマ化学社（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）およびバイオラドラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。モノブロモビマン（ｍＢＢｒ；商標 チオライト（Ｔｈｉｏｌｉｔｅ））はカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）か ら入手した。他の化学薬品は市場から入手したものであり、手に入る最高の等級 のものであった。
酵素 Ｅ、コリからのＮＴＲおよびチオレドキシンはアメリカンダイアグノスティック ス社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から入手し、また各タンパ クを超発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）するように形質転換された細胞から単離 した。チオレドキシン分泌株を含有する組み換えプラスミドルＦ円は親切にもＤ ｒ、　、１．−Ｐ、ジャコート（ＪａｃｑｕｏｌＸドウラモッテーゲリ−（ｄｅ 　ｌａ　Ｍｏ１．１ｅ−Ｇｕｅｒｙ）、Ｆ、等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅａ、　１９９１．　１９６．　ｐｐ、　Q８７ ２９４）から提供された。ＮＴＲ株を含有する組み換えプラスミドｐｒ’ＭＲ２ １はＤＲ，マージヨリ−ルーセル（Ｍａｒｉｏｒｉｅ　Ｒｕ５ｓｅｌ）およびＤ Ｒ，ベーターモデル（Ｐｅｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ）（ルーセル（Ｒｕｓｓｅｌ）、 　Ｍ等、　、１．８ｉｏ１．　Ｃｈｅａ、　＋９８８．２６３．　ｐｐ、　９０ １５−９０１９）により提供された。これらタンパクを単離するのに使用した手 順は以下の変更を行って実施したこれらの研究に記載されたように実施した。即 ち、細胞はラビー（Ｒａｂｉ）細胞分画装置を使用して、２５．０００ｐｓ　ｉ にて破壊し、またＮＴＲはフロジンチオ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ）等（フロジンチ オＦ、　Ｊ、等、　Ａｒｃｈ、　ＢｉｏｃｈｅｌＴＬＢｉｏｐｈｙｓ、、　１９ ８８．２６６゜ｐｐ、　４９６−５０７）に記載のように精製したが、レッドア ガロース工程は省略した。サッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（ベーカーズイーストタイブｌ）からのｍ およびチオレドキシンは、以下の変更を行って、ホウレンソウの葉に関連するフ ロジンチオ等の開発した方法によって単離した。即ち、懸濁細胞（１部の細胞＝ ５部のバッファー（冑／Ｖ））を、ラビー細胞分画装置に３回、４０、０００ｐ ｓｉにて通すことにより破壊した。
チオレドキシンｈおよびＮＴＲはホウレンソウの葉について開発された手順（フ ロジンチオＦ、　Ｊ、等、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　 １９８８．２６６、　ｐｐ、　４９６−５０７）に記載されている）に従って小 麦胚から単離した。ＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＭＤＩ） およびフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｇｅ）はコーンの 葉から（ジャコート（Ｊａｃｑｕｏｔ）ねＪ、−Ｐ、等、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、、　１９８１．６８．　ｐｐ、　３００−３０４）およびホウレンソ ウ（クローフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、　Ｎ、ん等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅＩＬＢｉｏｐｈｙｓ、、　１９８９．２７１．　ｐｐ、　２２３−２３９ ）からそれぞれ精製した。Ｅ、コリゲルタレトキシンおよびウシ胸腺チオレドキ シンはプロフェッザーＡ、ホルムグレン（ｌ（ｏｌｉｌｇｒｅｎ）から入手した 。
α−アミラーゼおよびトリプジン阻害剤ＣＭ−１タンパクは前に記載されたよう に（コブレール（にｏｂｒｅｈｅｌ）、　Ｋ、等、　ＣｅｒｅａｌＣｈｅｍ、、 　１９９１．６８．　ｐｐ、　１−６）、パン小麦のアルブミン−グロブリン画 分から単離した。また、マカロニ小麦のグルテニン画分からのＤＳＧタンパク（ ＤＳＧ−Ｉ　ＤＳＧ−２）の単離のためにも、公開された手順（コブレール（Ｋ ｏｂｒｅｈｅｌ）、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｓｃｉ。
Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、、　＋９８９．４８．　ｐｐ、　４４１−４５２）が利 用できた。これらのＣＭ−１，ＤＳＧ−１およびＤＳＧ−２タンパクは５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動において相同であった。トリプシン阻害剤は、 コーン穀粒から得たもの（これはフル力（Ｆｌｕｃａ）から入手）を除き、シグ マケミカル社から入手した。全ての場合において、市販の調製品は、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ　（クーマシーブルー染色）において予想されるように泳動する単一のタ ンパク成分を示したが、幾つかの調製品においては該バンドはシャープではなか った。
他のタンパク パン小麦からのビューロチオニンα、マカロニ小麦からのビューロチオニンα− １およびβは親切にもＤｒ、　Ｄ、Ｄ、カサルダ（Ｋａｓａｒｄａ）および叶、 Ｂ、Ｌ、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）からそれぞれ提供された。ビューロチオニン αサンプルは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた場合に、ビュ ーロチオニン科の２種の成分を含んでいた。ビューロチオニンα−１およびβサ ンプルは両者共にＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において均質であっ た。
ＮＡＤＰ−ＭＤＩＬＦＢｒ’ａｓｅ、　ＮＴＲおよびチオレドキシンｈアッセイ 法は、フロジンチオ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ）　Ｆ、Ｊ、等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９８８．２６６、　ｐｐ、　４９６−５０ Vに記 載の方法を記載されるように幾分か変更して実施した。酵素活性化アッセイにつ いて、予備インキュベーション時間は、特に述べない限り２０分てあった。
ｗ＋ＢＢｒ蛍光標識および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析研究中 のタンパクの直接的な還元は、クローフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、　Ｎ、Ａ 、等。
Ａｒｃｈ、　Ｒｉｏｃｈｅａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９８９．２７＋、　ｐｐ 、　２２３−２３９の方法の改良法により測定した。この反応は、最終体積０． １　ｍｌ中に１１０ｆｆ１のＥＤＴＡと１６％のグリセロールとを含むｐ＋４７ ．　Ｉの１００蘭燐酸カリウムバツフアー中で実施した。上記の如く、０．７部 １ｇ（０，ｌ　ｕ　Ｍ）ｔｖＴＲおよび１１ｚｇ（０，８μＭ）のチオレドキシ ン（何れも型通りにＥ、コリから調製）を、＋１１１ＭのＮＡＤＩ”＋１および １０μｇ（２−１７μＭ）のターゲットタンパクを含む７０ＩＩＩの該パンファ ー溶液に添加した。チオレドキシンをジチオスレイトール（ＤＴｒ；　０．５ｍ １Ｊ）により還元し、ＮＡＤＰＩＩおよびＮＴＲは省略した。還元されたグルタ チオンを使用したアッセイも同様に実施したが、最終濃度は１ｍＭとした。２０ 分間のインキュベートの後、１００　ｎＭのｍ８叶を添加し、該反応を更に１５ 分間継続した。この反応を停止し、かつ過剰のｍＢＢｒの誘導体とするために、 １０μｌの１０％ＳＤＳおよび１０μｍの１００−β−メルカプトエタノールを 添加し、次いてこれらサンプルをゲルに適用した。ゲルタレトキシンによる還元 の場合には、チオレドキシンおよびＮＴＲの代わりに、ｌμｇ（０，８μＭ）の Ｅ、コリ由来のゲルタレトキシン、１．４μｇ（０，１４μＭ）のホウレンソウ の葉から精製したグルタチオンリダクターゼ（フロジンチオ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉ ｏ）　Ｆ、Ｊ、等、　Ａｒｃｈ、　ＢｉｏｃｈｅＩＩＬＢｉｏｐｈｙｓ、、　１ ９８Ｂ、　２６６、　ｐｐ、　４９６−T０７）およ び１．５−のＮＡＤＰｌｌを使用した。
ゲル（１７，５％（ｗ／ｖ）　；厚み１．５ｍｍ）を、ラエムリ（Ｌａｅｎｍｌ 　ｉ）に従って（ラエムリ（Ｌａｅｎｗｎｌｉ）、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　１９７０．２２７．　ｐｐ、　６８０−６８５）調製し、一定電流（９鵬） 下で１６時間展開した。電気泳動に引き続き、ゲルを４０％メタノールと１０％ 酢酸との溶液中に入れ、該溶液を数回交換して、４〜６時間浸漬した。次いで、 ゲルを近紫外光を使用して蛍光バンドを調べ、クローフォード（Ｃｒａｗｒｏｒ ｄ）等（クローフォード、Ｎ、Ａ、等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、、　１９８９．２７１．　ｐｐ、　２２３−２３９）の方法に従って 写真撮影（露光時間２５秒）した。最後に、ゲルをクーマシーブルーで染色し、 前と同様に脱染色した（クローフォード、Ｎ、＾１等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、。
ＮＡＤＰ／チオレドキシン系によるテストタンパクの還元の程度の定量的指標を 得るために、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により観測された蛍光バ ンドの強度を、クローフォード、Ｎ、Ａ、等、　Ａｒｃｈ、　ＢｉｏｃｈｅＷＬ Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９８９．２７Ｌ　ｐｐ。
２２３−２３９の方法の改良法を使用して評価した。ネガ写真をファルマーシア ウルトラスキャン（Ｐｈａｒ潤ｃｉａ　Ｕｌｔｒａｓｃａｎ）レーザー濃度計を 使用して走査し、ピーク下部の面積を、各タンパクについて決定された標準曲線 と比較することにより定量化した。後者の測定において、各タンパク（濃度１〜 ５μｇ）を０．５ｍのＤＴｒの存在下で１００℃にて３分間加熱することにより 還元した。ｍＢＢＲによる標識を上記の如〈実施した。但し、ＳＤＳにより該反 応を停止し、過剰のｍＢＢｒをβ−メルカプトエタノールとの誘導体とした後、 標準を１００℃にて２分間加熱した。蛍光バンドの強度が添加したタンパクの量 に比例するので、還元は使用した条件下では完全であったと考えられた。
実施例１：α−アミラーゼ阻害剤のチオレドキシン−関連還元葉緑体酵素の活性 化における特定のチオレドキシンを交換する可能性は、与えられたタンパクのチ オール基が可逆性レドックス変化を生ずる能力をテストする１方法を与える。ブ ラスチド外（ｅｘｔｒａｐｌａｓＬｉｄｉｃ）タンパクの場合においては生理的 ではないが、このテストは幾つかの研究において有用であることが立証されてい る。その適例はビューロチオニンであり、これはチオレドキシンｈにより還元さ れた場合に、葉緑体のＦＢＰａｇｅを活性化する（ワダ（Ｗａｄａ）、　Ｋ、等 、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、。
ｆである）はチオレドキシンｈにより影響を受けない。この例においては、シス チンに富むタンパクのＦＢＩ’ａｓｅ並びにＮＡＤＰ−ＭＤＨを活性化する能力 を上記の如くテストした。マカロニ小麦（ＤＳＧ−１およびＤＳＧ−２）由来の α−アミラーゼ阻害剤は酵素の活性化において有効であることが分かっているが 、これらはＦＢＰａｓｅではなく寧ろＮＡＤＰ−ＭＤＩに対して特異性を示す点 でビューロチオニンとは区別された（第１表参照）。これらのα−アミラーゼ阻 害剤は還元されたチオレドキシンｈの存在下でのみ活性であり、それ自体はこれ ら条件下でＮＡＤＰ−ＭＤＨを有意に活性化しなかった（第１図）。第１図に示 した如く、ＤＳＧ−１およびＤＳＧ−２は、反応式（ＤＴＴ−＞チオレドキシン −＞　ＤＳＧ−＞ＮＡＤＰ−ＭＤＩＩ）に従って、ＤＴｒて還元されたチオレド キシンｈの存在下てＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼを活性化した。
第１図は、マカロニ小麦由来のＤＳＧ−１またはＤＳＧ−２阻害剤について得ら れた結果を表す。β−ＭＥＴはβ−メルカプトエタノールを表す。該活性化につ いて完全な系は２００　ｕ　ｌ　（７）１００　ｍ！ｆｆｒｉｓ−ｔｌｃｌ（ｐ Ｈ７，９）中に、ｌｏｍＭ（７）ＤＴＴ＋　０．７Ｍｇ　ノコー：／i７） 葉山来のＮＡＤＰ−ＭＤＩＩ、　０．２５μｇの小麦チオレドキシンｈおよびＩ Ｏｌｔｇの［１ＳＧ−１またはＤＳＧ−２を含んでいた。上記の如く、２Ｍのβ −メルカプトエタノール（β−ＭＥＴ）をＤＴｒと置換した。予備インキュベー ションに引き続き、ＮＡＤＰ−Ｍ開を分光光度法によりアッセイした。
この酵素活性化アッセイにおいて、チオレドキシンｈをＤＴＴにより還元した。
予想されるようにこれらの条件下では有意な割合でチオレドキシンを還元しない モノチオール、例えばβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥＴ）　（ジャコート （ＪａｃｑｕｏＬ）。
Ｊ、−Ｐ、等、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１９Ｂ１．６８．　ｐｐ、 　３００−３０４；−：シザワ（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ）。
Ａ、　Ｎ、等のメソッズインクロロプラストモレキュラーバイオロジー（Ｍｅｔ ｈｏｄ　１ｎＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ） 、　）ｔ　１デルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）、　Ｒ，Ｂ、　ハリツク（ｌ（ａｌ　 ｌ　１ｃｋ）およびＮ、−Ｈ，チュア（Ｃｈｕａ）編、　１９８２．　ｐｐ、　 ７０７−７１４．エルセピアバイオメディカルプレス（Ｂｌｓｅｖｉｅｒ　［ｌ ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉ’ｒｃｓｓ）、　ＮＹ；およびクローフォード（Ｃｒａ ｗｆｏｒｄ）、　Ｎ、Ａ、等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、、　１９８９．２７１．　ｐｐ、　２２３−２３X）は ＤＴｒと置換しなかった。
ＮＡＤＰ−ＭＤＨ活性は、一定のチオレドキシンｈａｔにおいて、添加されたＤ ＳＧ−１およびＤＳＧ−２の濃度に比例した（第２図参照）。第２図は、α−ア ミラーゼ濃度の、上記と同様のＤＴＴ式に従ってＤＳＧ−１およびＤＳＧ−２に よるＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼの活性化に及ぼす効果を示す。ＤＳＧ −１またはＤＳＧ−２の濃度を変えたことを除き、条件は前に記載しかつ第１図 に示したものと同一であった。一定のＤＳＧ濃度でテストした場合には、ＮＡＤ Ｐ−ＭＤＩは（体３図に示した如く）チオレドキシンｈ濃度の増加に伴って増大 する活性を示した。チオレドキシン１】濃度を変えたことを除き、条件は上記第 １図について示したものと同一であった。
ＣＭ−１はＤＳＧタンパクと類似するがより低い分子量をもち、また第１表に示 した如（２０μｇのＣＭ−１を使用した場合には、ＦＢＰａｓｅではなく　ＮＡ ＤＰ−ＭＤＩＩを活性化した。
この結果は、チオレドキシンｈが種々のα−アミラーゼ阻害剤を還元し、また順 次式４〜６に従ってＮＡＤＰ−ＭＤＩを活性化することを示している。これらの タンパクは、チオレドキシンの不在下でＤＴＴが添加された場合には酵素の活性 化について無効であった。
（４）　ＤＴｒ　、、、＋チオレドキジンｈ６ｖ−〉チオレドキシンｈ　ｒｏｄ 　＋ｏ’ｒｒ、。
（５）α−アミラーゼ阻害剤。、）チオレドキシンｈ、。、−〉α−アミラーゼ 阻害剤、□＋ヂオレドキシンｈ　ａｔ（６）α−アミラーゼ阻害剤、、、　＋Ｎ ＡＤＰ−ＭＤＨ０，（不活性）−〉α−アミラーゼ阻害剤。、＋ＮＡＤＰ−ＭＤ ＋＋　、、、（活性）第１表二葉緑体ＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼおよ びフルクトースビスホスフＮＡＤＰ−Ｍ開の活性化は第１図と同様に実施した。
但し、ＤＳＧまたは他のテストしたタンパクの量は２０μｇであった。ＦＢＰａ ｓｅの活性化は１ＭｇのＥ、コリ由来のチオレドキシンおよび２０μｇの指定さ れたタンパクとを使用する標準的ＤＴＴアッセイによりテストした。上記の値は 、これらの条件の下で、Ｅ、コリ由来のチオレドキシンについて見られた限定さ れた活性化に対して補正される（第１図参照）。
５ｔＤｓＧ−２１７５２０ ネ５ＤＳＧ−１１４５２０ ＩＣＭ−１１２５１２０ コ一ン穀粒　１２５５　０ 大豆ボウマン−バーク　８　７　３　０他の型のタンパク オボムコイド　２８９２　０ 大豆クニノツ　２０２２　０ オボインヒビター　４９１４１　０ ウソ肺（アプロチニン（Ａｐｒｏｆｉｎｉｎ））　７　３　痕跡　２チオニン ｕビューロチオニンーα、　６４１３９１＃ビュー口チオニン−β　６　４　痕 跡　５；ビューロチオニンーα　６４　０　１４章　これらの（直は、それぞれ チオレドキシンｍ　（ＮＡＤＰ−ＭＤＩＩ）およびチオレドキシンｆを使用して 得られた対応する値４０および５５０と対比される。
本市：マカロニ小麦由来のもの。
工・パン小麦由来のもの。
実施例２：ＤＴＮＢ還元アッセイ チオールレドックス活性に関する第二のテストは、４１２　ｒ＋＋ｎｌこおける 吸光度の増加として測定される、スルフヒドリル試薬、２°、５°−ジチオビス （２−二トロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の還元を触媒する能力に関するものである 。ここでアッセイされるタンパクはＮＴＲとチオレドキシンとを介してＮＡＤ囲 により還元された。このＤＴＮＢアンセイは、マカロニ小麦（ＤＳＧ川および２ ）およびパン小麦（ＣＭ−１）両者からのα−アミラーゼ阻害剤に対して有効で あることを立証した。ＮＡＤＰ／チオレドキシン系（この場合には、Ｅ、コリか らのチオレドキシンおよびＮＴＲを使用した）によって還元した場合、ＤＳＧ− １または２の何れかはＤＴＮＢの還元を著しく増強した（第４図参照）。第４図 における最上部の曲線は、ＤＳＧ−１または２の何れかを使用して得た結果を表 す（ＮＡＤｒ’ｌｌ−＞ＮＴＲ−＞　チオレドキシ：／−＞ＤＳＧ−＞ＤＴＮ［ ｌ）。コノＤＴＮＢ還元アッセイは１０μｇのチオレドキシン、および１０μｇ のＮＴＲおよび２０μｇのＤＳＧ−１または２を使用して実施した。ＣＭ−１も ＤＴＮＢ還元ア還元上イにおいて有効であり、ＮＡＤＩ””Ｍ開の活性化（第１ 表）と同様に、検出感度の点て該ＤＳＧタンノジノよりも活性であった（第５図 参照、条件は第４図と同様であるが、該ＤＳＧタンノジノは省略し、かつ２０μ ｇのビューロチオニンαまたは２０μｇのＣＭ−１を使用した）。かくして、こ れらの結果は実施例１の酵素活性化実験を確証しており、また該α−アミラーゼ 阻害剤が該ＮＡＤＰ／チオレドキシン系により生理的に還元し得ることを示した 。これらの条件の下てＤＴＮＢの還元を促進する際における該α−アミラーゼの 役割を以下の式７〜９にまとめた。
ＴＲ （７）　ＮＡＤＰＩ＋＋チオレドキノン。、−−−＞チオレドキシン、、、　＋ 　ＮＡＤＰ（８）チオレドキシン、６．＋α−アミラーゼ阻害剤。、−−−＞チ オレドキシン。１＋　α−アミラーゼ阻害剤１．６（９）α−アミラーゼ阻害剤 、、、　＋　ＤＴＮＢ、、−−−＞α−アミラーゼ阻害剤。、　＋　ＤＴＮＢ　 、、ａ実施例３：タンパク還元の測定 モノブロモビマン（＋ｎＢＢｒ）の利用性およびその植物系での使用に対する適 合性は植物タンパクのスルフヒドリル基を測定する新たな技術を与えた（クロー フォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、Ｎ、Ａ、等、　八ｒｃｈ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、、１９８９．　２７１．　ｐｐ、２２３−２３９）B ５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と組み合わせた場合に、複雑な混合物 においてさえ、レドックス活性タンパクのスルフヒドリルの状態の変化を定量す るのにｍＢＢｒが利用できる。従って、この技術を阻害性タンパクに適用して、 チオレドキシンによるその還元能を確認した。ここで、テストしたタンパクはチ オレドキシン（それ自体は予めＤＯＴまたはＮＡＤＰＩ＋およびＮＴＲにより還 元されている）により還元された。次いて、該還元されたタンパクの該ｍＢＢｒ 誘導体を調製し、ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により他の成分か ら分離し、その還元状態を蛍光測定により調べた。以下に記載する実験において 、Ｒ，コリ由来のチオレドキシンが該ターゲットタンパクの各々の還元において 有効であることが分かった。平行して実施した実験は、チオレドキシンｈおよび ウシ胸腺チオレドキシンが、それぞれ種子由来のおよび動物由来のタンパクを還 元することを明らかにした。
これらの酵素活性化の確認および色素還元実験において、ＤＳＧ−１はチオレド キシンの存在Ｆで効果的に還元された。インキュベーンジン後に、該タンパク類 はｍＢＢｒとの誘導体とされ、かつ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後 に蛍光により可視化された（第６図）。ＤＴＴのみでは還元の程度は低く、かつ ＧＳＩ＋では有意な還元は生じなかった。チオレドキシンに対する同様な要求が 、ＣＭ−１（第７図）およびＤＳＧ−２（データは図示せず）の還元について見 られた。第６および７図において使用したチオレドキシンはＥ、コリ由来のもの であったが、同様な結果が小麦チオレドキシンｈによっても得られた。チオレド キシンは、同様にＤＴｒをＮＡＤＰＩ＋およびＮＴＲ（データは図示せず）に代 えても必要とされた。
実施例４：シスチンに富む植物トリプシン阻害剤のチオレドキシン関連還元小麦 種子の主要な可溶性のシスチンに富むタンパクは外因性のα−アミラーゼの阻害 剤として機能するが、多くの他の種子のシスチンに富むタンパクはこの活性に乏 しく、また幾つかの場合においては動物起源のトリプシンの特異的阻害剤として 機能する。これらのタンパクは強力な化学的還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリ ウムによって還元できる（パーク（Ｂｉｒｋ）、　Ｙ、、　ｌ吐Ｊ、　Ｐｅｐｔ ｉｄｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、、　１９Ｂ５．２５．　Ｉ）９．１１３−１３ １；バール（Ｂｉｒｌ）、　Ｙ、、　Ｍｅｔｈ、　［！ｎｚｙＷ！Ｔｏ１．．１ ９７U、４５゜ ｐｐ、　６９５−７３９０）が、これらが生理的条件下で還元できるかどうかに ついては、殆ど証拠がない。従って、トリプシン阻害剤のチオレドキシンによる 還元の可能性について該阻害剤をテストすることは興味あることであった。テス トされた代表的なシスチンに富む阻害剤は、大豆ボウマン−パークおよびコーン 穀粒トリプシン阻害剤を包含した。これら両者における結果は正であり、各阻害 剤はＤＴＴ＝還元チオレドキシンの存在下で添加された場合に、ＮＡＤＰ−ＭＤ Ｉ＋により（ＦＢＰａｇｅではない）活性化され（第１表）、かつその各々はＮ ＡＤＰＨ、ＮＴＲおよびチオレドキシンの存在下でＩ）ＴＮＢを還元した（デー タは示さなかった）。
α−アミラーゼ阻害剤について見出されたように、該シスチンに富むトリプシン 阻害剤のチオレドキシン−依存性還元はｍＢＢｒ／ＳＯ３−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動技術により直接監視できた。かくして、ＤＴｒによる有意な還元は 、還元されたチオレドキシンの存在下でのみ、該ボウマン−パーク阻害剤（ＢＢ ＴＩ）　（第６図における、迅速に移動する高い蛍光性のバンド）およびコーン 穀粒トリプシン阻害剤（ＣＫＴＩ）　（第７図の、チオレドキシンの背後で移動 する高い蛍光性のバンド）両者について観測された。
種子起源の７スチンに富むトリプシン阻害剤がチオレドキシンにより特異的に還 元されるという発見のために、他の型のトリプシン阻害性タンパクがこの特性を もつか否かに関連する疑問が生した。本研究中に、数種のかかる阻害剤、即ち大 豆クニソツ、ウシ肺アプロチニン、卵白オポインヒビターおよびオボムコイドト リプシン阻害剤をテストした。テストしたパラメータは上記のシスチンに富むタ ンパク程には広範囲ではなかったが、他のトリプシン阻害剤もチオレドキシンに より特異的に還元され得ることを見出した（酵素活性化およびｍＢＢｒ／ＳＯ３ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動性両者により測定した）。上記のシスチンに 富むタンパクと同様に、この研究中にテストしたトリプシン阻害剤（大豆クニッ ツおよび動物トリプシン阻害剤）はＦＢＰａｓｅではなく、ＮＡＤＰ−ＭＤＩを 活性化した（第１表参照）。ウソ肺アプロチニンは、ＮＡＤＰ−ＭＤＩよりも効 果的にＦＢＰａｇｅを活性化する点で例外であった。アプロチニンは、シスチン の高い含有率（約ｌＯ％）を示す点で、ここで研究した種子タンパクの幾つかと 類似する（カッセル（Ｋａｓｓｅｌ）、　Ｂ、等。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎ５ｕｎ、、　１９６５ ．２０．　ｐｐ、　４６３−４６８）。
これらタンパクの１種、即ち該クニッツ阻害剤のチオレドキシン関連還元に関す る蛍光測定による証拠は、第７図に示されている（高い蛍光性の緩慢に移動する バンド）。その還元型において、該クニッツ阻害剤は蛍光性の迅速に移動するバ ンドをも生じた。この低分子量種の特性は未知である。その位置は、これが該ク ニソツ調製品中の異物として存在するボウマン−パーク阻害剤である可能性が示 唆される（第６図参照）が、このような成分はクーマシーブルーで染色したＳＤ Ｓゲル中には見られなかった。予想された分子量の単一の蛍光バンドを生成する 該動物性阻害剤は還元に対するチオレドキシン要求性をも示した（データは示さ ず）。
初期の結果の確認において、チオレドキシン−還元ビューロチオニンはＦＢＰａ ｇｅを矛盾なしに活性化し、かつ初期にテストされた型のもの、ビューロチオニ ンーαはＮＡＤＰ−Ｍ開を活性化しなかった（第１表）（ワダ（Ｗａｄａ）、　 Ｋ、等、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、。
１９８Ｌ　１２４．　ｐｐ、　２３７−２４０）。しかし、パン小麦由来のビュ ーロチオニンーαとは対照的に、前に検討されなかった２種のビューロチオニン （マカロニ小麦由来のビューロチオニンα−１およびβ）はＮＡＤＰ−ＭＤＨを 検出可能に活性化した（第１表）。
これら２種のマカロニ小麦由来のビューロチオニンも、ＦＢＰａｇｅの活性化能 においては異なっていた。これらのビューロチオニンの活性における差異は、こ れらのアミノ酸配列における高い類似性（ンヨーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、　Ｂ、Ｌ 、、等、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ、。
＋９７７、￥、　ｐｐ、　５１１−５２３）およびそのチオレドキシンによる還 元能のために予想し得ないものであった。チオレドキシンに対する要件の一つは 、５ＯＳ−ＰＡＧＥ蛍光法蛍光石、ビューロチオニン（ここではα−型）の還元 について観測された（第７図参照）。
実施例６：還元の定量化 上記の実施例は、チオレドキシンがα−アミラーゼを含む種々のタンパク、例え ばＣＭおよびＤＳＧ阻害剤並びに種子および動物起源のトリプシン阻害剤を還元 することを立証している。定量的な意味からは明白であるが、上記の結果は還元 の程度に関する定量的指標を何等与えない。従って、クローフォード等のプロト コール（クローフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、　Ｎ、Ａ、等、　Ａｒｃｈ、　 Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９Ｂ９゜２７１、　ｐｐ、　２２３− ２３９）に従って実験を行った。
第１＋表に示した如く、該Ｅ、コリＮＡＤＰ／チオレドキシン系による種子起源 の阻害剤タンパクの還元の程度は時間−依存性であり、タンパクに応じて２時間 後には還元は１５〜４８％に達した。主タンパク成分により発せられる蛍光測定 に基くこの結果は、該α−アミラーゼおよびトリプシン阻害剤の還元においてチ オレドキシンが触媒的に作用していることを示す。２時間後に還元されたタンパ ク対添加されたチオレドキシンの比は最も高く還元されるタンパク（大豆ボウマ ン−パークトリプシン阻害剤）および最も少なく還元されるタンパク（コーン穀 粒トリプシン阻害剤）両者に対してｌより大きく、即ち各比は２時間の還元期間 の経過後には７および２であった。第１１表の値は標準的なアッセイ条件下で得 られたものであり、カリこれら条件を改善して還元を最適化する試みは行わなか ったことに注意すべきである。
以下の濃度（ｎＭ）のタンパクを使用した。チオレドキシン、　０．０８；　Ｎ ＴＲ，０，０１；ピューロチオニンーβ、　１．７．　ＤＳＧ−１，０，７，コ ーン穀粒トリプシン阻害剤、　１．０．ボウマン−パークトリプシン阻害剤、　 １．３．およびクニッットリブシン阻害剤、０．５゜以下に示した時間の違いを 除き、他の条件は第６図の場合と同様であった。
以下の時間後の還元（％） ビューロチオニンーβ　１５３２ ＤＳＧ−１２２３８ コ一ン穀粒トリプシン阻害剤　３　１５ボウマンーパークトリプシン阻害剤　２ ５４８クニツツトリブシン阻害剤　１４２２ 実施例７：還元剤としてのＥ、コリゲルタレトキシンバクテリアおよび動物は、 リボヌクレオチド還元などの反応におけるチオレドキシンと交換できるチオール レドックスタンパク、即ちゲルタレトキシンを含有することが知られている（ホ ルムグレン（Ｈｏｌ＋ｎｇｒｅｎ）、　Ａ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｔ。
１９８５、５４．　ｐｐ、　２３７−２７１）。ゲルタレトキシンは以下の式ｌ Ｏおよび１１に示すように還元される。
グルタチオンリダクターゼ （１０）　ＮＡＤＰＨ＋　Ｇ５５Ｇ　＞　２　ＧＳＨ＋　ＮＡＤＰ（１１）　２ ＧＳＩ＋＋ゲルタレトキシン。、　−＞　Ｇ５５Ｇ＋　ゲルタレトキシンｒｅｄ 今までのところ、ゲルタレトキシンが高級植物由来のタンパクと相互作用すると いう証拠はない。この能力を、Ｅ、コリからのゲルタレトキシンと一般的に研究 されている種子タンパクを使用してテストした。還元活性を濃度計による走査と 組み合わせたｍＢＢｒ／ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ電気泳動 性を監視した。第６および７図に対して発展させた条件下では、ゲルタレトキシ ンは全体ではないが幾つかの場合においてチオレドキシンと効果的に交換できる ことが観測された。かくして、ゲルタレトキシンは以下の還元において活性であ ることが分かった（数値はＥ、コリ由来のチオレドキシンに対する相対的な還元 の割合（％）を示す）・ＤＳＧ−１およびＣＭ−１α−アミラーゼ阻害剤（それ ぞれ１４７および２１０％）：コーン穀粒トリプシン阻害剤（４２４％）　；お よびビューロチオニン（それぞれα、αｌおよびβ型に対して８２．１３３およ び１２０％）。ゲルタレトキシンはＤＳＧ−２α−アミラーゼ阻害剤および大豆 ボウマン−パーク並びにクニソットリブシン阻害剤の還元においては効果がなか った。動物起源のトリプシン阻害剤もゲルタレトキシンに対して複合応答を示し た。卵白オポインヒビターは効果的に還元された（Ｅ、コリチオレドキシンの５ ５％の還元）が、卵白オボムコイド阻害剤およびウシ肺アプロチニンは影響され なかった。重大なことに、既に報告された如く　（ウォロシーク（Ｗｏｌｏｓｉ ｕｋ）、　Ｒ，Ａ、等、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９７７、２６６、　ｐｐ、　５６ ５−５６７）　、ゲルタレトキシンは、葉緑体のチオレドキシン関連酵素、ＦＢ ＰａｓｅおよびＮＡＤＰ−ＭＤｌｌの活性化における迅速な還元剤としてチオレ ドキシンと置換できなかった（データは示さず）。
上記実施例は、テストした幾つかの酵素阻害性タンパクがゲルタレトキシン並び にチオレドキシンにより還元できることを立証している。チオレドキシンに特異 的なものはα−アミラーゼ阻害剤（ＤＳＧ−２）および幾つかのトリプシン阻害 剤（クニツツ、ボウマンーバーク、アプロチニンおよびオボムコイド阻害剤）を 包含する。チオレドキシンまたはゲルタレトキシンの何れかにより還元されるタ ンパクはビューロチオニン、２種のα−アミラーゼ阻害剤（ＤＳＧ−］および０ Ｊ−１）　、植物由来のシスチンに富むトリプシン阻害剤（コーン穀粒阻害剤） および動物由来のトリプシン阻害剤（卵白オポインヒビター）を包含する。これ らの結果は、ゲルタレトキシンが植物中に生ずるか否かの疑問が起こる。ゲルタ レトキシンは緑藻類中に存在する（サンプ（Ｔｓａｎｇ）、　Ｍ、Ｌ、−３，、 Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１９８１．６８．　ｐｐ。
１．０９８−１１０４）が、高等植物には存在しないことが報告されている。
第１表に示されたＮＡＤＰ−）ＪＤＩ＋およびＦＢＰａｓｅターゲット酵素の活 性は、生理的葉緑体タンパク（チオレドキシンｍまたはｆ）により活性化された 後に見られる値と比較して低いが、該表に記載された値は繰り返し見られ、従っ て信憑性あるものと考えられる。生理的には適切ではないが、該阻害剤タンパク により示される酵素特異性は還元の際に達成された特別な構造を反映しているも のと考えられる。
このような還元された構造が種子または動物細胞内の機能に関連しているか否か を考察することが残されている。
このチオレドキシン（またはゲルタレトキシン）関連還元事象の生理的な結果は 、ターゲントタンパクの機能が不明であることから、極めて興味深いことである 。本研究の結果は新たな可能性をもたらす。チオレドキシンが生理的条件下で広 範囲に渡る阻害性タンパクを還元するという発見は、区分されたバリヤーの無い 状態で、還元が細胞内で生し得ることを示唆している。
実施例８・大豆粉中の大豆トリプシン阻害剤の不活化本実施例の目的は大豆のボ ウマン−バークおよびクニッットリブシン阻害剤を不活化することにある。以下 のプロトコールを動物飼料調製品に適用する。大豆粉１０ｇに、０．２μｇのチ オレドキシン、０．１μｇのＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼおよび５０ ０　ｎＭのＮＡＤＰｌｌを、ｐｌ＋７．９のＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩバッファーと 共に添加して、５２５ｍ１の３０ｒｒＭＴｒｉｓ−ｔｌｃＩを得た。上記混合物 を約３０分室温にて放置する。前に記載されたｍＢＢｒ蛍光標識／５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動法（コブレール（Ｋｏｂｒｅｈｅｌ）、　Ｋ、等、 　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｆｆｌ、、　＋９９１．２６６、　ｐｐ、　１６１ ３５−１６１４０）を利pして、 該大豆トリプシン阻害剤の直接還元を測定する。トリプシン活性に関する該処理 された粉の能力の分析はインシュリンおよびＢＡＥＥ（Ｎａ−ベンゾイル−し− アルギニンエチルエーテル）アッセイ（ショールマン（Ｓｃｈｏｅｌ　１ｍａｎ ｎ）、　Ｇ、等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
！９６３．２５２．　ｐ、　１４６８２）の方法の改良法を利用して行う。この 分析から、このようにしてＮＡＤＰ／チオレドキンン系でジンした大豆粉がトリ プシンを阻害しないことが決定される。
実施例９・穀類におけるα−アミラーゼ阻害剤の不活性化オオムギ麦芽１０ｇに 、０．２μｇのチオレドキシン、０．１μｇのＮＡＤＰ−チオレドキシンリダク ターゼおよび５００　ｎＭのＮＡＤＰＨを、ｐｌ（７，９のｌ１ｌｒｒｒｉｓ− １（ＣＩバッファーと共に添加して、５．２５ｍ１の３０＋ｒＭｒｒｉｓ−ＨＣ Ｉを得た。上記混合物を約３０分室温にて放置する。以前に記載されたｍＢＢｒ 蛍光標識／５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（コブレール（Ｋｏｂｒ ｅｈｅｌ）、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　＋９９１．２６６ 、１１１）、　＋６１３５−１６１S０） を利用して、該α−アミラーゼ阻害剤の直接還元を測定する。α−アミラーゼ活 性を澱粉からのマルトースの遊離により追跡する（ベルンフエルド（Ｂｅｒｎｒ ｅｌｄ）。
Ｐ、、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１９５５．１．　ｐ、　１ ４９）。この分析から、このようにしてＮＡＤＰ／チオレドキノン系で処理した オオムギがα−アミラーゼを阻害しないことを決定する。
穀類タンパク製品の還元 マカロニ小麦（トリチカムデュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｄｕｒｕｍ）、　Ｄｅ ｓｆ、　ｃｖ、モンロー（Ｍｏｎｒｏｅ））の種子およびセモリナは、親切にも ＤＲ，Ｋ、カーノ（Ｋａｈｎ）から提供していただいた。
小麦種子の発芽 ２０〜３０粒の種子を、プラスチック製のペトリ皿中の、５ｍｌの脱イオン水で 湿らせた３層のファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃　１濾紙上に配置した。発芽 は、暗室内で室温にて４日月まで実施した。
試薬／′精化学薬品 生化学薬品および凍結乾燥した結合酵素はシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｗ＋１ｃａｌＣｏ、）０［州、セントルイス）から入手した。Ｅ、コリ由来の チオレドキシンおよびＮＴＲはアメリカンダイアグツステイカ社（八ｗｚｒｉｃ ａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ｌｎｃ、ＸｃＴ州、グリーンウィッチ）から購 入した。小麦チオレドキシンｈおよび田は胚から、ホウレンソウの葉について開 発された手順（フロジンチオ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ）、　Ｆ、Ｊ、等。
Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１９８８．２６６、　ｐ ｐ、　４９６−５０７）に従って単離した。Ｅ、コリ由来のゲルタレトキシンは プロフェッサーＡ、ホルムグレン（Ｉｌｏ　１ｍｇｒｅｎ）から親切にも提供さ れた。ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試薬はＣＭ州、す・ソチモ ンドのバイオ−ラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）から購入した。モノブロモビマン（ｍＢＢｒ）またはチオライト（Ｔｈｉｏ ｌ　ｉ　ｔｅ）はＣＭ州、サンジエゴのカルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 　Ｃｏ、　）から購入した。アルミニウムラクテートおよびメチルグリーンはス イス、バッハのフル力ケミカルズ社（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ、 　）の製品であった。
ｍｌで、指定した時間２５℃にて抽出した＋　（１）　５０Ｉｎ１１ｒｒｒｉｓ −ｔ（Ｃ１，ｐ）Ｉ　７．５　（２０分）；（２）７０％エタノール（２時間） ：および（３）Ｏ，ｌ購酸（２時間）。この抽出中、サンプルを電気式攪拌器上 に置き、更に時々渦流ミキサーで攪拌した。各溶媒で抽出した後に、サンプルを エンペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロ遠心機内で（１２，００Ｏｒｐ ｍにて５分間）遠心処理し、上澄画分を分析のために保存した。各抽出操作間に おいて、ペレットを１ｍｌの水で洗浄し、前と同様に遠心処理により回収し、上 澄洗浄画分を捨てた。便宜的に、これらの両分を以下の如く命名した。即ち、（ １）アルブミン／グロブリン、（２）グリアジンおよび（３）グルテニン。
タンパクのインビトロでのｍＢＢｒ標識反応はｐＨ７，９の１００１Ｔ１１Ｉｒ ｒｒｉｓ−１１ｃＩバツフアー中で実施した。上記の如く、０．７μｇのＮＴＲ とｌμｇのチオレドキシン（特に述べない限り、両者共にＥ、コリ由来のらの） とを、７０／ｌｌの該バッファー（１ｍのＮＡＤＰＩ＋およびｌＯμｇのターゲ ットタンパクを含有する）に添加した。ンチオスレイトール（Ｄ’口”）により チオレドキシンを還元する場合、ＮＡＤＰＩ＋およびＮＴＲは省略され、かつＤ ＴＴは０．５ｍＭまで添加された。還元されたグルタチオンを使用したアッセイ も同様に実施したが、最終濃度は１蘭とした。２０分間のインキュベーションの 後、１００　ｎＭのｍＢＢｒを添加し、該反応を更に１５分間継続した。この反 応を停止し、かつ過剰のｍＢＢｒを誘導体化するために、ｌＯμｌのｌＯ％ＳＤ ＳとｌＯμｌのｔｏｏ　ｗβ−メルカプトエタノールとを添加し、次いて該サン プルをゲルに適用した。ゲルタレトキシンによる還元のために、該チオレドキシ ンおよびＮＴＲをｌμｇのＥ、コリ由来のゲルタレトキシン、１．４μｇのグル タチオンリダクターゼ（ホウレンソウの葉から精製した）および１．５ｍＭのＮ ＡＤ閉とて置換した。
タンパクのインビボでのｍＢＢｒｔｌ識指定した時間において、該乾燥種子また は発芽中の実生（同し根の長さとなるように選択した）をベトリ皿から取り出し 、その胚または発芽軸を取り出した。
各ロフトからの５個の胚乳を秤量し、次に乳鉢と乳棒とて液体Ｎ２中で粉砕した 。
最後の痕跡量の液体Ｎ２を添加した時点て、ｐｌ＋７．９のｌｏＯｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩバッファー中に分散させた２、０−のｍＢＢｒを含む液１ｍｌを添加 した。次いで、解凍したこの混合物を更に１分間粉砕し、マイクロ遠心分離管に 移した。この懸濁液の体積を適当なｍＢＢｒまたはバッファー溶液で１ｍｌに調 節した。アルブミン／グロブリン、グリアジンおよびグルテニンのタンパク画分 を、上記のような発芽実生の胚乳から抽出した。この抽出したタンパク画分を使 用するまで一２０℃にて保存した。バッファーコントロールを各時点までインキ ュベートした。
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ｍＢＢｒとの誘導体としたサンプルの ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、ラエムリ（Ｌａｅｗｌ＋ｌｉ）、 　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ、１９７０．２２７．　ｐｐ、　６８０−６８５に 記載のように、１５％のゲル中でｐＨ８，５にて実施した。厚み１．５ｍｗｎの ゲルを、９ｍＡの定電流の下で１６時間展開した。
ネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動種々の型のグリアジンを解像するため に、ブシュク＆ジルマン（Ｂｕｓｈｕｋ　ａｎｄＺｉｌｌｍａｎ）　（ブシュク （Ｂｕｓｈｕｋ）、　Ｗ、等、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、１９ ７８．５８．　ｐｐ、　５０T− ５１５）により記載され、またサビルシュタイン（Ｓａｐｉｒｓｔｅｉｎ）＆ブ シュク（サピルシュタイン、Ｈ，Ｄ、等、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ、、　１９ ８５．６２．　ｐｐ、　３７２−３７７）により垂直スラブゲル用に改良された 方法で、６％ゲル中でネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した（ グリアジンを４種の型に分画するように工夫された手順）。最終体積１００　ｍ ｌのゲル溶液は６０ｇのアクリルアミド、０．３ｇのビスアクリルアミド、０、 ０２４ｇのアスコルビン酸、０．２ｍｇの硫酸第一鉄５水和物および０．２５ｇ のアルミニウムラクテートを含んでいた。乳酸でｐｌ＋を３．１に調節した。こ のゲルを２時間氷上で脱気し、次いて０．５ｍｌの３％過酸化水素水を重合触媒 として添加した。流動バッファーも乳酸でｐｏ　３．１に調節され、Ｉｆ’当た り０．５ｇのアルミニウムラクテートを含んでいた。電気泳動の継続時間は、５ ０ｍＡの定電流条件下で約４時間であった。
メチルグリーン追跡染料で標識された溶媒フロントが該ゲルの端部から約１ｃｍ １こまで移動した時点て電気泳動を終了した。
ｍＢＢｒ除去／蛍光写真法 電気泳動に引き続き、ゲルを１２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸中に入れ、１回 溶液を交換して４〜６時間浸漬して、該タンパクを固定させ、次いで該ゲルを４ ０％メタノール７１０％酢酸溶液中に移して、８〜１０時間維持して、過剰のｍ ＢＢｒを除去した。
遊離およびタンパクに結合したｍＢＢｒの蛍光を、紫外光源（３６５ｒ＋ｍ）を 備えたライトボックスにに配置して肉眼観察できるようにした。過剰の（遊離） 　ｒｎＢＢｒを除去し７た後、ゲルをポラロイドポジティブ／′ネガティブラン ドフィルム（ＰｏｌａｒｏｉｄＰｏｓ山ｖｅ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｌａｎｄｆｉ ｌｍ）タイプ５５を使用して、黄色のランタン（Ｗｒａｔｔｅｎ）ゼラチンフィ ルターＮｏ、　８（カットオフ波長＝４６０　ｎｍ）　（Ｃ４，５での露光時間 ２５〜６０秒）を通して写５ｌｉｔ影した（クローフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ ）、　Ｎ、Ａ、等、八ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
５ＤＳ−ゲルを、１〜２時間、４０％メタノール／１０％酢酸中のクーマシーブ リリアン［・ブルーＲ−２５０て染色（−１、以前に記載されたように（クロー フォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）。
Ｎ、Ａ等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、１９８９．２７ １．　ｐｐ、　２２３−２３９）、−夜脱染色した。
アルミニウムラクテートネイティブゲルを、２４０ｍ１の１２％　＋−リクロロ 酢酸中に０１ｇのクーマノ−ブリリアントブルーＲ−２５０（９５％エタノール ｌ０ｍ１中に溶解したもの）を金白゛する濾過した溶液中で一夜染色した。ゲル を１２％トリクロロ酢酸中で一夜脱染色した（ジン、り（Ｂｕｓｈｕｋ）、　Ｗ 、等、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、　１９７８．５８．１１１１ ゜５０５−５１５：およびサビルノユタイン（Ｓａｐｉｒｓｊｅｉｎ）、　Ｈ， Ｄ、等、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅ＋ＴＬ、１９８５゜Ｃ２，’４．　ｐｐ、　３ ７２−３７７）。
タンパク染色ゲルをポラロイドタイプ５５フイルムで写真撮影し、プリントおよ びネガを得た。プリントはバンドの移動距離および負荷の有効性を決定するのに 使用した。
蛍光ゲルのポラロイドネガおよび湿潤タンパク染色ゲルのプリントをレーザー濃 度計（ファルマーシア−１，にＢウルトロスキャン（１’ｈａｒｍａｃｉａ−Ｌ ＫＢ　Ｕｌけｏｓｃａｎ）　Ｘいて走査した。ゲルスキャン（ＧｅｌＳｃａｎ） 　ＸＬソフトウェアによる積分後にピーク面積を算出することにより定量化した 。
酵素アッセイ 以前に記載された方法で、粗抽出物中の以下の成分の活性を測定した：即ち、ヘ キソキナーゼ（バルダス（Ｂａｌｄｕｓ）、　Ｂ、等、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、 、　１９８１．２０．　ｐＨ，１８１１−１８１４）　、グルコース−６−ホス フェートデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（シュナ ージンベルガ−（Ｓｃｈｎａｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ）、　Ｃ，等、八ｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ−、１９７３，１５４，ｐｐ、　４３８−４ ４８）、グルタチオンリダクターゼ、ＮＴＲおよびチオレドキシンｈ（フロジン チオ（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ）、　Ｆ、Ｊ、等、　Ａｒｃｈ。
タンパクの濃度を、パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）試薬および標準物質として のウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォードの方法（ブラッドフォード を使用して、５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル上で評価した。その第一の組はＢＳＡ（ＧＯ ）　、オボアルブミン（４５）、大豆トリブジン阻害剤（２０，１）、ミオグロ ビン（１７）、チトクロームＣ（１２，４）およびアプロチニン（６，５）を含 有していた。その他の組はパイオーラドブレステインドｏ−３ＤＳ−ＰＡＧＥ（ ＢｉｏＲａｄ　Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　Ｌｏｗ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ）標準であり 、ホスホリラーゼｂ（１１０）、ＢＳＡ（８４）、オボアルブミン（４７）、カ ルボニックアンバイトラーゼ（３３）、大豆トリプシン阻害剤（２４）およびリ ゾチーム（１６）を含んでいた。
実施例ＩＯ＝グリアジンの還元 オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）とその共同研究者の１世紀前の開拓者的寄与の結 果として、種子タンパクが水性および有機溶媒に対するそれらの溶解度に基いて 分画できる（２０）。小麦の場合には、胚乳調製物（粉またはセモリナ）を歴史 的にかつ周期的に粉の溶液を抽出して、以下に示すタンパク画分を生成する・（ ｉ）水、アルブミン、（ｉｉ）塩水、グロブリン、（ｉｉｉ）エタノール／水、 グリアジンおよび（ｉｖ）酢酸／水、グルテニン。一群の証拠は、異なるタンパ クが各対応する画分中で豊富であることを示している。例えば、該アルブミンお よびグロブリン画分は多数の酵素を含み、また該グリアジンおよびグルテニン画 分は発芽に必要とされる貯蔵タンパク中にある。
上記実施例１．４および５では多数の水溶性の種子タンパク（アルブミン／グロ ブリン、例えばα−アミラーゼ阻害剤、シスチンに富むトリプシン阻害剤、他の トリプシン阻害剤およびチオニン）を記載しており、これらは種子自体またはＥ 、コリ由来のＮＡＤＰ／チオレドキシン系により還元される。小麦種子からの不 溶性の貯蔵タンパク（その代表例が該グリアジンおよびグルテニン画分である） を還元する鎖糸の能力を以下に説明する。指定した添加物と共にインキュベート した後、該グリアジンタンパクをＩＩＢＢ「との誘導体とし、５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動後に蛍光を可視化した。第８図におけるレーンは以下の 通りであった：ｌコントロール（添加物なし）、２．　ＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＤＰ Ｈ＋還元されたグルタチオン、グルタチオンリダクターゼ（ホウレンソウの葉由 来のもの）およびＮＡＤＰＩＩ　、３．　ＮＧＳ：ＮＡＤ閉、還元されたグルタ チオン、グルタチオンリダクターゼ（ホウレンソウの葉由来のもの）およびゲル タレトキシン（［！、コリ由来のもの）　、４．ＮＴＳ：　ＮＡＤＰＩＩ、ＮＴ Ｒおよびチオレドキシン（両タンパクともＥ、コリ由来のもの）　、５．ＭＥＴ ／Ｔ（Ｅｃ）：β−メルカプトエタノールおよびチオレドキシン（Ｅ、コリ）、 ６．　ＤＴＴ　、７．　ＤＴｒ／Ｔ（ＥＣ）：　ＤＴｒおよびチオＬ／　トキシ ン（Ｅ、　コＩＪ）　、８．ＤＴｒ／Ｔ（Ｗ）：小麦チオレドキシンｌ〕を含む 以外は７と同し、９．　ＮＧＳ、−グリアジン：該グリアジンタンパク画分を含 まないことを除き３と同し、１０．　ＮＴＳ、−グリアジン・該グリアジンタン パク画分を含まないことを除き４と同し。ｍＢＢｒとの反応性に基いて、該グリ アジン画分をチオレドキシンにより強く還元した（第８図）。還元される主な成 分は２５〜４５ｋＤａの範囲のＭ「を示した。種子α−アミラーゼおよびトリプ シン阻害剤タンパクを使用した実施例Ｉ、４および５に見られたように、グリア ジンは天然型りまたはＥ、コリ型のチオレドキシン（何れも均質）により還元さ れた。ＮＡＤ円１（およびＮＴＲ）またはＤＴＴはチオレドキシンの還元剤とし て機能し得た。より軽度の還元が、グルタチオンおよびゲルタレトキシン（幾つ かのＥ、コリおよび哺乳動物の酵素系におけるチオレドキシンと置換し得るタン パクであるが、高等な植物に存在することは知られていない）について観測され た。
該グリアジン画分は４種の異なる型のタンパク、即ちα、β、γおよびωからな っており、これらは酸性条件下でのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動 により分離可能である（ブシュク（Ｂｕｓｈｕｋ）、　Ｗ、等、　Ｃａｎ、　Ｊ 、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、　１９７８゜従ってチオレドキシンによる還元の可 能性を有する。本研究においては、以下の添加物と共にインキュベートした後に 、タンパクをｍ［ｌＢｒと誘導体化し、酸性条件下でのポリアクリルアミドゲル 電気泳動後に、蛍光を可視化する。第９図のレーンはそれぞれ以下の通りであっ た。即ち、１．コントロール（添加物なし）、２、　ＧＳＨ：還元されたグルタ チオン、３．　ＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＤＰＨ：還元されたグルタチオン、グルタチ オンリダクターゼ（ホウレンソウの葉由来のもの）およびＮへＤＰ）Ｉ　、４． ＮＧＳ：ＮＡＤｒ’ｌ＋、還元されたグルタチオン、グルタチオンリダクターゼ （ホウレンソウの葉山来のもの）およびゲルタレトキシン（Ｅ、　コリ由来のも の）、５．　ＮＧＳ＋ＮＴＳ：　４と６との組み合わせ、６．ＫＴＳ：　ＮＡＤ ＰＩＩ、ＮＴＲおよびチオレドキシン（両タンパクともＥ、コリ由来のもの）　 、７．ＭＥＴ／Ｔ（Ｅｃ）・β−メルカプトエタノールおよびチオレドキシン（ Ｅ、　：ｌ：Ｉす）　、’８．ＤＴＴ／Ｔ（Ｅｃ）：　ＤＴＴおよびチオレドキ シン（Ｅ、　コリ）、９．　ＮＴＳ（−Ｔ）：チオレドキシンを含まない以外６ と同一、１０．　ＮＧＳ＋１ｆｒＳ、−グリアジン・該グリアジン画分を含まな い以外５と同一。
該チオレドキシン還元グリアジン両分をネイティブゲル電気泳動にかけた場合に は、チオレドキシンにより最も特異的に還元されることが分かった該タンパク類 がα画分中に回収された（第９図参照）。該βおよびγグリアジンの活発な還元 が見られたが、第１１１表にまとめた濃度計による測定結果から明らかな如く、 これら群中の還元は非特異的であった。即ち、比較的高い還元がグルタチオンお よびゲルタレトキシンについても達成された。γグリアジンのＤＴｒ−還元チオ レドキシンによる特に高い還元が観測された（第９図参照）。予想されるように 、ωグリアジンの還元は観測されなかった。この結果は、チオレドキシン（天然 りまたはＥ、コリ由来）が該グリアジンの何れか、特にそのα型を特異的に還元 することを示す。
実施例１Ｉ：グルテニンの還元 チオレドキシンに対する応答性についてテストすべき種子タンパクの残りの群（ グルテニン類）は最も水溶性の低いものであるが、恐らく最も興味あるものであ る。グルテニン類は、粉およびセモリナの調理特性における重要性のために、長 年に渡り注目を集めていた（マツフリッチ−（ＭａｃＲｉｔｃｈｉｅ）、　Ｆ、 等、八ｄｖ、　Ｃｅｒ。
バクを還元する能力のテストはこれまでの研究の第一の目的であった。
第１ＩＩ表・種々の型のグリアジンの還元剤特異性ＮＡＤＰ／チオレドキノン系 による還元後のα、β、γおよび凝集体ピーク下部の面積は、それぞれ４．３３ ．８．６０．５．６７および０．７４吸光度単位×ｍてあった。これらを総和し た面積は、チオレドキシンがＤＴｒにより還元された場合に観測される面積の約 ６５％であった。反応条件は第９図に対するものと同一であった。
還元剤　グリアジン、相対的還元率（駕）−−五−−互一　−ニー　凝集体。
なし　２２．４　３０．４　２４．３　２９．２グルタチオン　３６，４　６８ ．１　６０．６　６０．１グルタレドキノン　４３．５　８３．３　７９．７　 ６１．５チオレドキノン　１００．０　＋００．０　＋００．０　１００．０＊ 　ゲル中に入り込まないタンパク。
第１０図（処理は実施例１Ｏと同様、第８図参照）に見られるように、数種のグ ルテニンがチオレドキシンにより特異的に還元された。最も強力な還元は、低分 子量領域（３０−５５ｋＤａ）において観測された。高分子量領域で観測された 還元は余り顕著ではなかったが、依然として明確であり、特に１００ｋＤａ以上 の領域において顕著であった。図示しなかったが、還元は１３０ｋＤａの領域で も生ずる可能性がある。
グリアジンと同様に、グルテニンの幾つかはグルタチオンおよびゲルタレトキシ ンによってかなり還元された。しかしながら、全ての場合において、還元の程度 はチオレドキシンによる場合のほうが大きく、また幾つかの場合においては、チ オレドキシンに対して特異的であった（第１ｖ表、特に３０〜４０および６０〜 １１０　ｋＤａの範囲）。テストした池の小麦タンパクについて観測されたよう に、天然りおよびＥ、コリチオレドキシン両者は活性であり、かつＮＡＤＰＩＩ および対応するＮＴＲまたはＤＯＴにより還元できた。従って、グリアジンにつ いて見出された如く、幾つかのグルテニンはインビトロでチオレドキシンにより 特異的に還元され、一方で他のものもそれ程効果的ではないが、グルタチオンお よびゲルタレトキシンによっても還元された。
反応条件は第３図で使用したものと同一であった。
なし　８　２３　１６ グルタチオン　３１　５１　２９ グルタレドキンン　５０　７２　４０ チオレドキンン°　１００　ｔｏｏ　１００＊　：　ＮＡＤＰ／チオレドキンン 系にジン還元した後の３つの分子量群（高いものから低いもの）の下部の面積は それぞれ、１．５．５．６７および５．０４吸光度単位×ｍであった。
実施例Ｉ２；インビボでの還元実験 上記実施例は、チオレドキシンがインビトロでテストした場合に、特異的に小麦 グリアジンおよびグルテニン画分の成分を還元することを立証している。しかし 、これらの結果は、これらタンパクが発芽中にインビボで還元されるが否かに関 して、即ち我々の知る限りにおいて、これまでには提示されなかった問題に対ｐ ｐ、　＋５５７−１５６６）。
この問題に回答を与えるために、我々は発芽中の種子中のタンパクの還元状態を 追跡するのにｍＢＢｒ／５ＤＳ−ＰＡＧＥ技術を利用した。オズボーン画分中の 成分の還元が時間の経過に伴って徐々に増大し、かつ発芽の２〜３日目にピーク に達することを観測した（第１１図）。還元における観測された増加はグリアジ ンについての２−倍から、アルブミン／グロブリンについて３−倍およびグルテ ニンについての５−倍までの範囲であった。これらの結果は、主な小麦タンパク 群の代表的なものが発芽中に還元されたが、正味のレドックス変化はグルテニン について最も高いことを示唆している。
種子貯蔵タンパクが発芽中に還元されることに関する新たな証拠が与えられたが 、第１ｔ図の結果は還元がグルタチオンまたはチオレドキシンによってどのよう に達成されるかに関する何の指標も与えない。この点に関連する情報を得るため に、主なチオレドキシン関連グリアジン（３０−５０ｋＤａ）およびグルテニン （３０−４０゜４（１−６０ｋＤａ）のインビボでの還元のレベルを、インビト ロ測定から測定された還元と比較した（第８図と第＋Ｖ表）。この目的のために 、発芽中にインビボでおよび適当な酵素反応系を使用してインビトロで観測され る蛍光対クーマン−で染色されたタンパクの比を算出した。第１２図に示された 結果（主なチオレドキジン結合グリアンンは２５〜４５　ｋＤａの範囲の計をも つものであり（第８図参照）およびグルテニンは３０〜６０　ｋＤａの範囲のＭ 「をもつものである（第１０図参照））は、グルタチオンがグリアジン画分のイ ンビボ還元の大部分（９０％まで）を占め得るが、このことは還元にチオレドキ シンを必要とするように思われるグルテニンについては正しくないことを示唆し ている。グルタチオン（またはゲルタレトキシン）に帰せられる還元のレベルは 、発芽中の種子につき測定された還元されたグルテニンのレベルを説明するのに 不十分てあった。
実施例１３；酵素測定 チオレドキシンｈのＮＴＲ関連還元に必要とされるＮＡＤＰＨの起源をも調べた 。セモリナを、他の系内でのＮＡＤＰＩＩの生成において機能する酵素、特に酸 化的ホスフェート経路のデヒドロゲナーゼにつき分析した。第Ｖ表にまとめた結 果は、胚乳の抽出物がこの経路を経てグルコースからＮＡＤＰＨを生成するのに 必要な酵素、即ちヘキソキナーゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナー ゼ、および６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを含んでいるという初期の 証拠を確認するものである（タタム（Ｔａｔｈａ＋ｎ）、　Ａ、Ｓ、等、　Ａｄ ｖ、　Ｃｅｒ、　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈ、、　１９９０．　ｔｏ、　ｐｐ、　１− V８ 参照）。第Ｖ表に示されたグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性が 還元されたチオレドキシンに対しては感受性でなかった（データは示さず）こと は述べるに値する。この点に関連して、該胚乳由来の酵素は葉から得た葉緑体由 来の酵素ではなく、寧ろそのサイドシル由来の酵素に類似している（フィッケン シ２９０−２９７）。
−２２１）から予想されるように、セモリナもチオレドキシンｈおよびＮＴＲを 含んでいた（第Ｖ表）。興味あることに、活性測定に基いて、■は調べた栽培変 種からの調製物中の速度−限定成分であるように思われた。
ヘキソキナーゼ　０．２８ グルコース−６−Ｐデヒドロゲナーゼ　０．４５６−Ｐ−グルコネートデヒドロ ゲナーゼ　０．３９ＮＴＲ０，０６ チオレドキシンｈ　０．３５ これらの結果は、チオレドキシンｈが小麦種子の発芽に関連した代謝過程を増強 するシグナルとして機能することを示唆している。ＮＴＲおよびＮＡＩＩＰＨに よるその還元に引き続き（酸化性ペントースホスフェート経路を介して発生する ）、チオレドキシンｈは酵素の活性化においてのみならず、貯蔵タンパクの移動 においても機能しているものと考えられる。
実施例１４　ドウ品位の改善 ドウ品位を、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系を使用して粉タンパクを還元すること により改良した。還元されたチオレドキシンは、タンパクの異なる部分を架橋し 、かつその折り畳まれた形状を安定化している、硫黄−硫黄結合を特異的に開裂 する。これらの架橋が切断された場合、該タンパクは展開されかつパン中の他の タンパクと結合し、ドウの弾性網状構造を形成する絡の合った格子を生成し得る 。
該ドウは、該網状構造がその醗酵過程中に酵母により生成される二酸化炭素をト ラップするために膨張する。この還元されたチオレドキシンが粉中のグリアジン およびグルテニンを活性化し、該ドウを強化するように再結合させることが提案 されている（第１３図）。還元されたチオレドキシンはドウ調製中に形成される 該タンパクの網状構造を強化した。これらのテスト、即ち第１４（ｃ）図および 第１５（ｄ）図に示されたテスト（フランスのモンペリエ地方の製粉業者から得 た中程度の品位の小麦粉１０ｇ（第１４図）、または同様にフランスのモンペリ エ地方の製粉業者から得た低品位の小麦粉（第１５図）を使用、この低品位の小 麦粉は主としてアポロ栽培変種からなる）に関連して、０．２μｇのＥコリ由来 のチオレドキシン、０．１／１ｇのＥ、コリ由来のＮＡＤＰ−チオレドキシンリ ダクターゼおよび５００　ｎＭのＮＡＤＰＨを、ＩＭのＴｒｉｓ−１１ｃＩ　ｔ ＜　ノフ７−（ｐｔｌ　７．９）と共に添加して、５．２５ｍ１の３０ｍＭＴｒ ｉｓ−４１ＣＩ酵素系混合物をｉｕだ。反応を、該酵素系混合物と］Ｏｇの該小 麦粉とを３０℃にてマイクロッアリノブラフ中で混合することにより実施した。
第１４および１５図に見られるように、得られたファリノグラフ測定は、添加さ れたＮＡＤＰ−チオレドキシン系による該ドウの強化を示した。第１５（ｄ）図 におけるように、低品位の小麦粉を使用した場合、ファリノグラフの読みは、該 還元系の存在下でドウを生成した後生なくとも４分間安定であったが、鎖糸を添 加しなかったコントロールにおけるドウ生成後、該ファリノグラフの読みは即座 に低下した（第１５（ａ）図参照）。
この改良効果は永続的であり、実験中ずっと維持された。別の様式で表現すると 、該マイクロッアリノブラフの読みは、該低品位の小麦粉コントロール（酵素系 の添加なし）を使用してドウを形成した後、７分にて３７５ブラベンダ一単位（ Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ　ｕｎｉｔｓ）であったのに対して、該ＮＡＤＰ／チオレド キシン系の成分（ＮＡＤＰＨ、チオレドキシンおよびＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼ）を使用して処理した同様な低品位の小麦粉については４５０ブラ ベンダ一単位であった。
上記と同様に、ＩＯｇのアボロ粉を使用して、またＮＡＤＰＨの濃度をナノモル の代わりに５００μＭとして、もう一つのファリノグラフ実験を実施した。第１ ６図のファリノグラフ測定に示されたように、この量のＮＡＤＰＨは該ドウの品 位の明らかな改善をもたらした。ドウのファリノグラフ測定値がより高いことは 、改良されたドウの強度および改良された焼き製品の良好な緒特性、例えば良好 なりラムス性能、改良されたキメおよび高いパン塊体積に対応する。また、単離 されたタンパクのインビボでの解析に基づき、天然の小麦種子ＮＡＤＰ／チオレ ドキシン系は、該ドウの強化においても有効であろう。
ベーキングの目的および他の本発明の局面に関連して、約０．１〜３．０μｇの チオレドキシン（好ましくはＥ、コリ由来のものまたはチオレドキシンｈ）、お よび約０．１〜２．Ｏｕ　ｇのリダクターゼおよび３０〜５００ｎＭのＮＡＤＰ Ｉ（を約１０ｇ当たりの粉に添加する。チオレドキシンおよびリダクターゼの最 適レベルは粉の品位に依存する。一般的に、粉の品位が高い程、必要とされるチ オレドキシンおよびリダクターゼの濃度は高い。チオレドキシンは、また該ＮＡ ＤＰＩ（／ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ還元系の代わりにリポ酸によ っても還元できる。次いで、他のドウ成分、例えばミルクまたは水を添加する。
しかしながら、液体は最初に該ＮＴＲ／チオレドキシン系に添加し、次いて生成 する混合物を粉に添加することもできる。該還元されたチオレドキシンが該貯蔵 タンパクを還元する機会をもった後に醗酵の目的で酵母を添加することも好まし い。このドウを、次に通常のドウと同様に、焙炉、整形等およびベーキングする 。
本実施例並びに以下の実施例においては、ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰＩＩ発生剤、例 えば１００μｇのグルコース６−ホスフェート、１００μｇのＮＡＤＰおよび０ ．０５単位（０，２μｇ）のグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（酵 母等の源からの）を含むもので置換できる。このＮＡＤＰＨ発生剤は、ドウ形成 工程の開始時点において、チオレドキシンおよびＮＡＤＰ−チオレドキシンリダ クターゼと共に添加される。
第１７（ｃ）図は、ＩＯｇのアポロ栽培変種（ｃｖ）小麦を２０μＮのＮＡＤＰ （２５ｍＭ）、２０１１１のＧ６Ｐ（２５ｄｌｌ）　、０．２５ＭｇのＧ６ＰＤ ａｓｅ　、０．１　μｇのＮＴＲおよび０．２７１ｇのチオレドキシンｈ　（４ ，２５ｍｌのｌ−１，０および０．９０ｍ１のＴｒｉｓ−１１ｃＩ（３０＋ｎｌ に　ｐｔｌ　７．９）中に含まれる）と反応させた場合に得られる高いファリノ グラフ測定値を示す。第１７（ｂ）図は、高いファリノグラフ測定値が、ＩＯｇ のアポロ小麦粉を第１７（ｃ）図と同一の反応混合物（但し、ＮＴＲまたはチオ レドキシンを含まない）と反応させた場合にも観察されることを示す。
実施例１５・小麦バンベーキン乞９鳩寒コンピュータでモニタしたパナソニック （ＰＡＮＡＳＯＮＩＣ）ベーキング装置を使用してベーキングテストを実施した 。
パンの組成 コントロール 粉　２００ｇ（乾燥重量） 水、７０％ハイドラテーンヨン（ｈｙｄｒａｔａｔ　１ｏｎ）食塩（ＮａＣｌ） ：　５．３　ｇ 酵母：　４．８ｇ（サツ力ロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｉ　ｙ ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サフインスタント（Ｓａｆｌｎｓｌａｎｔ）） （乾燥酵母粉末） ＊　粉ザンプルは、際立ったベーキング性能（低品位乃至良好なベーキング性能 をを有する動物飼料等級および他の等級を包含する）を有する純粋なパン小麦栽 培変種から得た。
アッセイ このアッセイ用のドウは該コントロールの成分の全てと、種々の量のＮＡＤＰ− チオレドキシン系（ＮＴＳ）および／またはＮＡＤＰ発生系発生元でいた。
実験条件 一粉および食塩を秤量し、かつ混合する。
−７０％ハイドラテーンヨンを達成するのに必要とされる体積の水を該ベーキン グパン中に投入した。
一該粉と食塩との混合物を該水に添加し、コンピュータによりモニタしたベーキ ングプログラムを始動した。このプログラムの完了には３時間９分７秒を要する 。
−このアッセイの場合、酵素系の成分は該粉−食塩混合物に添加する前に、該水 に添加する。
一酵母は、２０分３秒間の混合後に自動的に添加した。
該パナソニック装置をモニタするプログラムは以下の通りであった。
セグメント　継続時間　混合条件　加熱混合　００：００：０３　Ｔｌ　停止 混合　００：０５：００　Ｔ２　停止 混合　００：０５：００　Ｔｌ　停止 休止　００：１０：００　Ｔｏ　停止 混合　００：１７：００　Ｔ２　停止 混合　００：０７：００　Ｔｌ　停止 休止　００：３０：００　ＴＯ３２℃に達するまて混合　００：００：０４　Ｔ ｌ　３２℃休止　０１：１５：００　Ｔｏ　３２℃ベーキング　ＯＯ・１４：０ ０　Ｔｏ　１８０℃に達するまでベーキング　００：２６：００　Ｔｏ　１８０ °Ｃ混合条件：　ＴＩ＝混合せず（モータ停止）Ｔ２＝通常の混合 ＴＯ−交互に３秒の混合と３秒の停止 パン塊の体積はベーキング操作の終了後、パン塊が室温に達した時点にて測定し た。
栽培変種テシー（Ｔｈｅｓｅｐ）アッセイフランス小麦栽培変種テン−は良好な パン製造特性をもつものと分類されてしする。以下の第Ｖ＋表はこのアッセイの 結果を示すものである。
第Ｖ１表 ＮＡＤＰＨ−Ｉ　ＮＴＲＴｈ　パン塊体積コントロール　ＯＯＯ１６９０１００ サンプル　６．０　３０　６０　１８１０　１０７６．０　３０　０　１７２５ 　１０２ ６．０　０　６０　１７２０　１０２ ６．０　０　０　１５５０　９２ ｔ　ＮＡＤ四発生系　３０　６０　１６２０　９６ｔ　ＮＡＤＩ’ｌ＋発生系＋ 　３０　６０　１６３０　９６八ＴＰ、グルコース ＮＴＲ＋酵母　６．０　９．４　２０　１７５０　１０４由来のＴｈ ｔ：　ＮへＤＰＩ＋発生系、ＡＴＰおよびグルコースを含む組成物添加した体積 ＮＡＤＰ、　２５　ＩｎＭ７００μｆ（１７，５μＭ）グルコース−６−ホスフ ェート、２５蘭　７００μＮ　（１７，５７１Ｍ）グルコース−６−ホスフェー トデヒドロ　１７５μｉ　（８，７５μｇ）ゲナーゼ（５０μｇ／ｍ１） ＡＴＰ、　２５ｍＭ　７００μ７！（１７，５μＭ）グルコース、　２５　ｍＭ 　７００μｌ　（１７，５７１Ｍ）第Ｖ＋表に示されたように、パン塊体積の増 加は、６．０μＭのＮＡＤＰ）Ｉ　、３０ｔ１ｇのＮＴＲおよび６０μｇのＴｈ を含む完全ＮＴＳを使用して、本例において上記した量および条件下で２００ｇ のテン−（Ｔｈｅｓｅｅ）粉からパン塊をベーキングした場合に観測された。特 に述へない限頃該ＮＴＲチオレドキシン（Ｔｈ）はＥ、コリ由来のものであった 。
該発生系を使用した場合またはＮＴＲまたはＴｈを省略した場合には、同様な増 加は見られなかった。また、鎖糸における成分の量を上記の量の半分またはそれ 以下とした場合にはパン塊体積に及ぼす何意な効果は見られなかった。
栽培変種アポ口のアッセイ このフランスの小麦栽培変種は貧弱なパン製造品位をもつものとして分類される 。このアッセイで使用したＮＴＲおよびチオレドキシンはＥ、コリ由来のもので あった。以下の第Ｖ１１表は２００ｇのアポロ粉を使用したこのアッセイの結果 を示す。
また、特に述べない限り量および条件は本例の初めに記載したものである。
第Ｖ１１表 ＮＡＤＰＩＩ　ＮＴＲＴｈ　パン塊体積（ｇＭ）　（＃ｇ）　（μｇ）　（ｃａ ＋’）　相対的単位コントロール　０　０　０　１４００　１００サンプル　６ ．０　３０　６０　１４７５　１０５章ＮＡＤＰＩ＋発生系＋ＡＴＰ、　３０　 ６０　１５３０　１０９グルコース ｔＮＡＤｐＨ発生系＋ＡＴＰ、　０　０　１４３０　１０２グルコース ｔＮＡＤＰ）Ｉ発生系　６　０　１４３０　１０２ネＮＡＤＰｌ＋発生系　６　 ７　１４４０　１０３ネ：該発生系、ＡＴＰおよびグルコースを含む該組成物は 第ｖ１表のものと同じである。
栽培変種アーボン（＾ＲＢＯＮ）のアッセイこのフランスの小麦栽培変種アーボ ンは飼料として使用され、かつパン製造には適さないものと分類されている。以 下の第Ｖｌｌ＋およびｌｘ表は改良されたパン塊体積が、ＮＴＳまたはＮＡＤＰ ＩＩとＮＴＲとをドウ成分と共に使用して、本例の初めに記載した条件下で、ア ーポンから得ることができることを示す。本ア・ソセイて使用するＮＴＲ、チオ レドキシン、ＮＡＤ円１およびＮＡＤＰＩＩ発生系成分の量は第Ｖｌｌ＋および １ｘ表に示されている。第１ｘ表に示した如き該完全ＮＳＴの使用による、アー ボン製パンの品位改善は第１８〜２２図および第２３（ａ）図として示した写真 から明らかである。
第Ｖｌｌ１表 ＮＡＤＰＩＩ　ＮＴＲＴｈ　／＜：／塊体積（μＭ）　Ａｕｇ）　（μｇ）　（ ｃが）コントロール　ＯＯＯ１３５０ サンプル　０．１−０．６　３−４　３−４　コントロールよりも２０％まで高 い値 ＞２．０　＞２０　＞２０　コントロールよりも小さい 第１ｘ表 処理　パン塊体積 （ｃｗｌ′）　相対的単位 完全ＮＴＳ　１６５０　１２２ −チオレドキシン　＋６９０　１２５ −ＮＴＲ１５２０１１３ −チオレドキシン、ＮＴＲ１５４０１１４−ＮＡＤＰＨ１４４０１０？ −ＮＡＤＰ）ｌ、十零ＮＡＤＰＩ＋発生系　１５６０　１１６−　ＮＴＳ（コン トロール）１３５０　１００ＮＡＤＰＩＩ、　０．６μＭ チオレドキシン、３．５μｇ １１１ＴＲ，３μｇ 零：発生系 ３．５μＭ　ＮＡＤＰ ３．５μＭ　グルコース−６−ホスフェート１．７５μｇ　グルコース−６−ホ スフェートデヒドロゲナーゼ実施例１６ トリヂカーレは小麦／ライムギのハイブリッドであり、一般にニワトリの肥料に 用いられている。これは小麦より栄養になるが、特に先進国では一般にパンの製 造に適切てないと考えられている。従って、トリチカーレ粉から製造したローフ についてＮＴＳ系及びその種々の系の影響を実験した。特にことわらない限り、 製造条件及びドウ成分は実施例１５の小麦粉に記載されているようにした。表Ｘ に示されるように、トリチカーレドウがチオレドキシン、ＮＴＲ及びＮＡＤＰＨ 生成系をその表に示されている量で含有した場合にローフ量が改良する。しかし ながら、ＮＴＳ　（即ち、チオレドキシン、ＮＴＲ及びＮＡＤＰＨ）を用いた場 合には、対応する改良が見られなかった。図２４は、表Ｘに示されるＮＴＲ，Ｔ ｈ及びＮＡＤＰＨ生成系を用いた場合にパンのきめも改良されたことを示してい る。
図２４の右側のローフは対照である。
表Ｘ トリチカーレ粉（ｃｖ、　Ｊｕａｎ）から製造した完全なＮＴＳ　＋２３０　９ ４ ＮＴＳなしく対Ｉ！”、）　１３＋０　ｔｏ。
ＮＡＤＰＩＩなし、ｔ　ＮＡＤ囲ありの生成系　１３９０　１０６＼ＡＤ閉、０ ６μモル チオレドキシン、３．５μｇ ＮＴＲ，３，０７１ｇ 生成系　４５μモルのＮＡＤＰ ４．５μモルのグルコース−６−ホスフェート４５μモルのグルコース−６−ホ スフェートデヒドロゲナーゼ実施例１７ モロコシ、トウモロコシ及びコメの粉についてもＮＡＤＰＨ／チオレドキシンの 影響をめた。製造条件は、実施例１５の小麦粉に記載されているようにした。
チオレドキシン及びＮＴＲは共に大腸菌由来とした。このアッセイの結果を図２ ５及び図２３（ｂ）に示す。これらの図に示されているように、ＮＴＳを含有す るパン、特にトウモロコシ及びモロコシはきめ及び安定性の改良を示した。
実施例１８ トリチカーレ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、コメ、モロコシ、トウモロコ シ及びテフからのエタノール可溶性及びミリステート可溶性貯蔵タンパクの還元 特にことわらない限り、本実施例で用られる材料及び方法は、上記“穀類タンパ クの還元、材料及び方法”と題する項で述べたものに準じる。
トリチカーレ、ライムギ、オオムギ、オートムギ及びテフ反応を３０鯛トリス− ＨＣｌバッファー、ｐＨ７，９中で行った。指示されているように、０．７μｇ のＮＴＲ及び同定されたＡｕｇの大腸菌由来チオレドキシン又は２１１ｇの酵母 由来チオレドキシンをｌＩＩＩＭのＮＡＤＰＨ及び２５〜３０μｇの抽出貯蔵タ ンパクを含有する７０μｍのこのバッファーに加えた。１０ｇの粉に対して５０ ｍ１の７０％エタノールを用いて２時間抽出することにより、エタノール抽出貯 蔵タンパクを得た。テフの場合、２００ｍｇの粉砕した種子を抽出した。
Ｉｇの粉を８ｍｇのミリスチン酸ナトリウムで５ｍｌの蒸留水中で２時間抽出す ることにより、ミリステート抽出タンパクを得た。ＮＡＤＰＨ，ＮＴＲ及びチオ レドキシンの組合わせは、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系（ＮＴＳ）として知られ ている。指示されているように、グルタチオン（ＧＳ）（）、２．５μＭを１． ５ｍＭのＮＡＤＰＨ及び１．４μｇのホウレンソウの葉のグルタチオンリダクタ ーゼの不在下（Ｇ　Ｓ　Ｈ）又は存在下（ＧＲ／ＧＳＨ／ＮＡＤＰＨ）に還元剤 として加えた。
２０分間インキュベートした後、１００ナノモルのｍＢＢｒを加え、反応を更に １５分間続けた。反応を停止しかつ過剰のｍＢＢｒを誘導するために、１０μｍ のｌＯ％ＳＤＳとｌＯμＩの＋　００ｆｌｔＭ２−メルカプトエタノールを加え 、次いで、試料をゲルに加えた。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の手 順はＮ、　Ａ。
Ｃｒａｗｆｏｒｄ等（１９８９八ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　２７１：２２３−２３９）に記載されているようにした。
反応を３０Ｉｌｌｌｌトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７，９中で行った。タン パクをチオレドキシンで還元する場合、次のものを７０μｍのバッファーに加え た：１．２ｍＮＡＤＰＨ，Ｉ　Ｏ〜３０μｇの種子タンパク画分、０．５μｇの 大腸菌ＮＴＲ及び１ｇｇの大腸菌チオレドキシン。グルタチオンで還元する場合 、チオレドキシンとＮＴＲを２，５鯛還元グルタチオンと１℃１ｇのグルタチオ ンリダクターゼ（製パン用酵母、　５１ｇｍ　Ｃｈｅｍｌｃａ１社製）に置き換 えた。ジチオスレイトールで還元する場合、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ、チオレドキシ ン及びＮＴＲを除き、０．５＋ｎｌＪジチオスレイトールを加えた。すべての場 合、インキュベーション時間は２０分とした。次いで、１ｏＩｉｌのｌｏｍｍＢ Ｂｒ溶液を加え、反応を更に１５分間続けた。反応を停止しかつ過剰のｍＢＢｒ を誘導するために、１０μｌのｌＯ％ＳＤＳ及びｌＯμｌのＩ　００ｍ２−メル カプトエタノールを加え、試料をゲルに加えた。各々の場合、抽出タンパクを得 るために、１ｇの粉砕した種子を５ｍｌの蒸留水中８＋ｎｇのミリスチン酸ナト リウムで抽出した。タンパクの初期のレドックス状態の定量以外の試料を２２℃ で２時間抽出し、次いで１６．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心した後、ｍＢＢｒを 加えた。初期のレドックス状態の定量に関しては、ｍＢＢｒをミリステートと共 に窒素雰囲気下で加え、次いで抽出した。
図２６−３０は、オートムギ、トリチカーレ、ライムギ、オオムギ及びテフ粉の ミリステート抽出タンパクの還元実験のゲルの写真を示すものである。また図３ ０には、テフのバッファー及びエタノール抽出タンパクを示す。図２６−３０に 示されている実験においては、すべて粉をまずバッファー、５０ｍＭトリス−Ｈ ＣＩ、ｐＨ７，５で２０分間抽出し、次に７０％エタノールで２時間抽出した。
トウモロコン、モロコシ及びコメのミリステート抽出タンパクのゲルの写真も示 す（図３１及び３２）。トウモロコシ、モロコシ及びコメに関しては、粉砕した 種子をミリステートでのみ抽出した。従って、トウモロコシ、モロコシ及びコメ に関しては、ミリステート抽出物が全タンパクを示すが、オートムギ、トリチカ ーレ、ライムギ、オオムギ及びテフに関しては、これらの粉がバッファー及びエ タノールで予め抽出されていることから、ミリステート抽出物はグルテニン等価 両分のみを示している。図２６−３０のゲルに表されている結果は、オートムギ 、トリチカーレ、ライムギ、オオムギ及びテフのミリステート抽出（グルテニン 等価）クンバクに関して、ＧＳＨ又はＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＤＰＨと比べてＮＴＳ が最も効果的であることを示している。ＮＴＳはコメの全タンパクに関しても最 も効果的である（図３１及び３２）。還元グルタチオンは、トウモロコシ及びモ ロコシの全タンパクに関して効果的である（図３１及び３２）。
図３１及び３２からの結論（トウモロコシ、モロコシ及びコメ）図３１に示され ている処理（１）においては、ｍＢＢｒの存在下ミリステートによる処理は窒素 雰囲気下で行い：処理（２）においては、ミリステート抽出タンパクにｍＢＢｒ をタンパクの前還元なしに添加し；処理（３）においては、ミリステート抽出タ ンパクをＮＡＤＰ／チオレドキシン系（ＮＴＳ）で還元し；処理（４）において は、ミリステート抽出タンパクをＮＡＤＰ、グルタチオン及びグルタチオンリダ クターゼで還元した。図３２に示されている処理（１）は図３１の処理（２）と 同様であり：処理（２）においては、種子を窒素下ｍＢＢｒの存在下にミリステ ートで抽出し；処理（３）においては、種　子をミリステートで抽出し、ＮＴＳ で還元し、次いてｍＢＢｒを加え；処理　（４）においては、タンパクをＤＴＴ で還元した以外は（３）での条件とした。図３１の処理（１）及び図３２の処理 （２）は、穀粒中のタンパクの初期のレドックス状態を示している。３種の穀類 すべてに対して、種子中のタンパクを高度に還元する。空気中で抽出する場合に は、タンパクは特にモロコシ及びコメを酸化する。すべての場合において、酸化 タンパクをＮＴＳで最も強く再還元することができる。コメに関して、還元はチ オレドキシンに相対的に特異的であり；トウモロコシに関して、グルタチオンは チオレドキシンと同じくらい効果があり、モロコシに関して、グルタチオンはチ オレドキシンよりわずかに効果がある。ジチオスレイトールは還元剤として種々 の有効性を示した。これらの実験は、これらの穀類の貯蔵タンｌくりが小麦の場 合より特異的でないことを示し、チオレドキシンがドウの網状構造を作ることを 試みる際には、グルタチオンの存在及び不在の双方を試験しなければならないこ とを示唆している。
図３３及び３４は、酵母ＮＡＤＰ／チオレドキンン系にジン小麦グルテニン及び グリアノンの各還元実験から得られたゲルの写真を示すものである。グルテニン は、ｌｏｇの粉に対して５０ｍ１の０．１Ｍ酢酸を用いカリ２時間抽出すること により得られた。グリアジンは、ｌＯｇの粉に対して５０ｍ１の７０％エタノー ルを用いかつ２時間抽出することにより得られた。実験は、酵母系が主要な２種 類の小麦貯蔵タンパクを還元するに当たり非常に活性であることを示している。
図３５−３８は、トリチカーレ、ライムギ、オートムギ及びオオムギ粉の各エタ ノール抽出タンパクの還元に対するゲルの写真を示すものである。結果は、ＮＴ Ｓがｌ・リチカーレ、ライムギ、オートムギのエタノール抽出タンパクで最も効 果的であることを示している。エタノール抽出オオムギタンパクは対照において 減少し、チオレドキシン又はグルタチオンはほとんと効果がない。
実施例１９ クニノツ及びボーマンーバークダイズトリブジンインヒビタータンパクの活性及 び安定性に関するチオレドキシン結合還元の影響デュラム小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕ ｍ　ｄｕｒｕｍ、　Ｄｅｓ（、ｃｖ、　Ｍｏｎｒｏｅ）はＤｒ、　Ｋ、　Ｋａｈ ｎ、から好意て贈らねたものである。小麦胚芽はＳｉｇ両ＣｈＣ＋ｎ１ｃａ１社 （Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、舶）から人手しｔ二。
化学薬品及び酵素 ドデンル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ ）の試薬をＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｃｈｍｏｎｄ、　 Ｃ＾）から入手し、ＤＴＴはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した。Ｌ−１− １−シルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリ プシン（Ｘｌｌｌ型。
７８６４０）、ズブチリノン（Ｖｌｌｌ型　細菌ズブチリシンＣａｒｂｓｂｅｒ ｇ、　Ｐ５３８０）、ＫＴＩ（Ｔ９００３）、Ｂ　Ｂ　Ｔ　Ｉ　（Ｔ９７７７） 、アゾカゼイン及び他の化学薬品は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（ＳＬ、 　Ｌｏ旧ｓ、　ＭＯ）から購入した。大腸菌チオレドキシン及びＮＴＲを各タジ ノくりを過料発現するために形質転換された細胞から単離した。チオレドキジン 株含有組換えプラスミド、ｐＦＰ＋は叶　Ｊ、−Ｐ、　Ｊａｃｑｕｏｔ（ｄｅ　 Ｌａ　Ｍａｔｔｅ−Ｇｕｅｒｙ等。
＋９９１）により好色で提供された。ＮＴＲ株含有組換えプラスミド、ｐＰＭＲ ２１は、叶ｓ、　Ｍａｒｊｏｒｉｅ　Ｒｕ５ｓｅｌとｌ”ｃｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ （Ｒｕｓｓｅｔ、　Ｍｏｄｅｌ、　ｌ！Ｊ８Ｂ）により好意で提供された。これ らのタンパクに用いられる単離手順は、次のことを変更してそれらの実験に記載 されているようにした：細胞をＲｉｂｉ細胞フラクショネーター。
２５、０００ｐｓｉで破壊し、ＮＴＲを赤色アガロース工程なしてＦｌｏｒｅｎ ｃｉｏ等（＋９８８）により記載されているように精製した。大腸菌チオレドキ シン及びＮＴＲは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりめた場合、 各々純度１００％及び９０％であった。小麦チオレドキシンｈを従来のように精 製した（Ｊｏｈｎｓｏｎ等。
小麦種子を５０％（Ｖ／Ｖ）のジエネリックブリーチに浸けて滅菌し、次に蒸留 水で十分洗浄した。滅菌した種子をプラスチックペトリ皿の中１００μｇ／ｎｌ のクロラムフェニコールをｈ有する蒸留水で湿らせた２層のワ・ントマンろ紙上 に置いた。
発芽は、室温で暗室内５日まで続けた。
小麦プロテアーゼの調製 ５日発芽させた小麦種子から根と茎を切り取って単離した内胚乳（新しい重量ｔ ｏ−１５ｇ）をｌｏｆｆＭβ−メルカプトエタノールを含有する５容景の２０〇 −酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６で４℃において３０分間抽出した。ホモンエネー トを４８．０００ｇ、４℃で２０分間遠心した。沈降物を捨て、上清を３０−７ ０％硫酸アンモニウムで分画した。プロテアーゼ標品を示すこの画分を１０蘭β −メルカプトエタノールを含有する最少量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４， ６に懸濁し、このバッファーに４℃で一晩透析した。基質としてアゾカゼインを 用いてア・ソセイすると、プロテアーゼ標品は最適ｐＨ約４．６を有し、４℃で 少なくとも１週間安定であった。
トリプシンインヒビターの還元及びタンパク分解感受性ことわらない限り、トリ プシンインヒビター（０，４ｍｇ／＋ｎｌ）の還元をＩ（ｌｎｌＪＥＤＴＡを含 有するＯ、１ｍｌの２０蘭リン酸ナトリウムバツフアー、ｐＨ７，！３中で行っ た。チオレドキシン、ＮＴＲ及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの濃度は、各々０．０２４ 　ｍｇ／ｎｌ、０、０２ｍｇ／ｍｌ及び０．２５＋ｎＭてあった。還元剤として ＤＴＴを用い、ＥＤＴＡとＮＡＤＰ／チオレドキシン系の成分を除いた。還元後 、トリプシン阻害活性あるいはタンパク分解感受性をめるために、インヒビター 混合液を分取した。ズブチリシン試験においては、インヒビター混合液（５０μ ｍ）を直接ズブチリシンと混合し、室温で１時間インキュベートした。小麦プロ テアーゼ標品については、インヒビター混合液（５０μｍ）をまず３５μｍの２ ００１１１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６と混合することによりＩ）　Ｈ４，７ に調整し：次に１０μＩの小麦プロテアーゼ標品を加え、３７℃で２時間インキ ュベーションを続けた。ズブチリシンによる消化を停止するために、この消化混 合液に２μｌの１００−フェニルメチルスルホニルフルオリド（１’ＭｓＦ）と ｌ０７１１の１０％ＳＤＳを加えた。植物プロテアーゼ標品については、等量の ＳＤＳ試料バッファーを加えることにより消化を停止した［０．１２５Ｍ　トリ ス−１１ＣＩ、Ｌ　；　ｐＨ６゜８．４％（ｗ／ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓ、２０％（ｖ ／ｖ）グリセロール、１０％（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノール及び０６０２ ％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルー］。タンパク分解産物を１２〜１６％ＳＤ Ｓポリアクリルアミドスラブゲル（Ｌａｅａ＋Ｉ　ｉ、　１９７０）を含む電気 泳動で分析した。乾燥したスラブゲルをレーザーデジントメーター（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ−ＬＫＢ　０１けａｓｃａｎ　Ｘいで走査し、ＰｈａｒｍａｃｉａＧｅ ｌＳｃａｎχしソフトウェアプログラムに組込むことにより、ＫＴＩ又はＢＢＴ Ｉタンパクバンドのピーク領域を得た。
アンセイ チオレドキシン及びＮＴＲをＦｌｏｒｅｎｃｉｏ等（１！’１８８）に記載され ているようにアッセイした。基質としてＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル エステルを用いて２５３ｎｍの吸光度が増大するか又はアゾカゼイン基質のトリ クロロ酢酸（ＴＣＡ）−可溶性画分にアゾ色素が遊離することにより、トリプシ ン活性を５０＋ｍ）リス−１（ＣＩ　、ｐ　Ｈ７，９中で測定した（以下参照） 。トリブジン阻害アッセイの場合、トリプシン（５〜１０μｇ）を適量のＫＴＴ 又はＢＢＴＩと５０１１Ｉｌｌ！トリス−ＨＣｌ。
ｐＨ７，９中室温で５分間前インキュベートし、次いでタンパク分解活性をめた 。
２つの基質より同様のデータか得られたが、結果は１つの基質のみ示されている 。
ｐＩ目７においてアゾカゼイン基質のＴＣＡ溶液にアゾ色素が遊離することによ り、小麦プロテアーゼ活性を測定した。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６及 び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールの溶液中５０μｍの小麦プロテアーゼを５ ０７１１の２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６及び１００７１１の２％アゾ カゼイン（２０−リン酸ナトリウム、ｐＨ７，０中）に加えた。３７℃で１時間 インキユベートシた後、１ｍｌのｌＯ％ＴＣＡを加え、この混合液を室温で１０ 分間放置した。
ミクロフユージ（８０００ｇ）で５分間遠心した後、１ｍｌの上清を取り、１ｍ ｌのＩＮ　ＮａＯＨと混合した。４４０ｎｍの吸光度を読み取った。タンパク濃 麿をＢｉ。
−Ｒａｄ試薬で標準としてウシ血清アルブミンを用いてめた（Ｂｒａｄｆｏｒｄ 、　１９７６）。
２０ｋＤａのクニッツ及び８ｋＤａのボーマンーバークダイズトリブシンインヒ ビターは各々２及び７個のジスルフィド基を含んでいる（Ｂｉｒｋ、　ｔＱ７６ ；　Ｗｉ　１ｓｏｎ、　１９８Ｂ）。
それらの生理作用は確立されていないが、この２種類のインヒビターはマメ科植 物の種子に広く分布しかつ栄養障害、例えば、過栄養及び関連した膵機能不全を 引き起こす可能性があるために広範囲に研究されている。前の実施例で記載され た表１及び１１に示されているように、ＫＴＩ及びＢＢＴＩは大腸菌あるいは植 物のＮＡＤＰ／チオレドキシン系によって特異的に還元されている。グルタチオ ン及びゲルタレトキシンの還元型（ある種動物及び細菌系においてチオレドキシ ンを置き換えることができるチオールタンパクであるが、植物で起こることは知 られていない（ｌｌｏｌｍｇｒｅｎ、　１９８５））は効果がなかった。
チオレドキシンによる還元結果をめるために、ＫＴｌ及びＢＢＴＩの酸化還元型 のトリプシン阻害活性を比べた。表ＸＴに示されるように、ＮＡＤＰ／チオレド キンン系（ジンＳ）と３０℃で２時間前インキュベートすると、トリプシン阻害 活性の実質的ロスがあった（即ち、非阻害対照に相対してトリプシン活性が増大 した）。更に詳細には、ＮＡＤＰ／チオレドキシン系は、ＫＴＩ及：びＢＢＴＩ に対するトリプシン活性が各々３及び６倍増加した。同様の結果がＤＴＴ、チオ レドキシンの非生理学的置換体で得られ、チオレドキシンに関しては、リポ酸、 天然ジチオールで還元された。ＤＴＴ単独でインキュベージジンを延長する（室 温で一晩）と、双方のインヒビターが完全に又はほとんど完全に不活化された（ データは示されていない）。ＤＴＴと異なり、リポ酸はチオレドキシンが存在し ないとＫＴＩ及びＢＢＴＩをほとんど還元（不活性化）しなかった。
表ｘ± ＮＡＤＰ／チオレドキシン系、ＤＴＴ又は還元リボ酸による還元後のダイズトリ °基質としてＮ−ベンゾイル−し−アルギニンエチルエステルを用いた非阻害対 照トリブノンの比活性はＯ，Ｏｌ　８Δ＾＋’！、ｍ／μｇ／分であった。
１大腸閑ＮＴＳ　（ＮＡＤＩ）／チオレドキシン系）による還元は３０℃で２時 間行つｔこ。
’ＤＴＴ（１ｍＭ）による還元は３０℃で１時間行った。
３リポ酸（ＬＡ、　０．４　ｍＭ）及び小麦チオレドキシンｈ（Ｔｒｘｈ）によ る還元は　３０°Ｃて１時間（ｒっだ。リポ酸単独（０，４ｍ）の存在下でのト リプシン　活性はＫＴＩの場合２０．０％及びＴ３ＢＴＩの場＝１２．ｓ％であ った。
Ｆｒ１ｅｄ＋ｎａｎと共同研究者等は、ダイズ粉をイオウ還元剤（亜硫酸ナトリ ウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−７ステイン、還元グルタチオン又はＬ−システィン） の存在下に加熱すると、おそらくジスルフィド基の還元又はダイズ粉中の他のタ ン、＜りとの交換の結果として、トリプシンインヒビターを不活性化した（Ｆｒ ｉｅｄｍａｎ。
Ｇｕｗｌｂｍａｎｎ、　１９Ｒ６：　Ｆｒｉｅｄｍａｎ等、１９１’１２．１９ ８４）。これらの還元剤によりトリプシンインヒビターを不活性化すると、ラッ ト試験において粉の消化率及び栄養価が改良された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、　Ｇｕ ｍｂ＋ｎａｎｎ、　１９８６）。従来の結果とまとめて考えると、本知見（よチ オレドキシンが標的とするＫＴＩ及びＢＢＴＩ双方のジスルフィド結合がトリプ シン阻害活性の維持に重要であることを示している。
熱安定性 プロテアーゼインヒビタータンパクは、典型的には、加熱のような不活性化処理 に安定である。この安定性は、少なくとも一部には、ジスルフィド結合の架橋に よるものである（Ｂｉｒｋ、　１９７６：　Ｒｙａｎ、　１９８１）。ジスルフ ィド結合を還元により切断すると、熱安定性が減少することが知られている（Ｆ ｒｉｅｄｍａｎ等、＋９８２）。問題は、チオレドキシンによる還元が同様の結 果を生じるかである。
表Ｘｌ＋に示される結果は、この問題に肯定的に答えている。８０℃で１５分間 加熱すると、ＫＴＩのチオレドキシン還元型がトリプシンを阻害する能力を完全 に消失したが、その酸化相対物は最初の活性の約半分を保持した（表Ｘｌ＋）。
１００℃で２５分間加熱した後、酸化ＢＢＴＩはより安定であり、そのトリプシ ン阻害活性の大部分を保持した。それにもかかわらず、ＫＴＩのように、ＢＢＴ Ｉの還元型は加熱によって完全に不活性化された（表Ｘ１１）。これらの結果は 、（ｉ）ＫＴＩ及びＩ’３１’３ＴＩが還元時に加熱に対する感受性が増大しか つ（ｉｉ）純粋なりＢＴＴを溶解したものが純粋なＫＴＩを溶解したものより熱 安定性である従来の結果と一致している。粉の場合には逆となる（即ち、ＫＴＩ はＢＢＴＩより鴫安定性である（Ｆｒｉｅｄｍａｎ等、１９８２．１９９１；　 ＤｉＰｉｅけｏ、　Ｌｉｅｎｅｒ、１９８９））。
表Ｘｌ＋ クニッツ及びボーマン−バークトリプシンインヒビターの熱安定性、酸化後の大 ″基質としてアゾカゼインを用いたトリプシンの比活性は０．３１９ΔＡ＋＋ｏ ＋７／ｍｇ／分であった。不活性化に用いた温度は、本発明の条件下ｌ・リブジ ンインヒビターの軌安定性を示すように設計された最初の実験でめた。
１測定せず。
プロテアーゼ感受性 ＫＴＩ及びＢＢＴＩの還元型がトリプジン以外のプロテアーゼに対して安定性が 低下するかを試験するために、ＫＴＩ及びＢＢＴＩの還元及び酸化型の双方を小 麦プロテアーゼ標品又はズブチリノンとインキュベートし、タンパク分解産物を ５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳゲルの無傷タンパクの存在量をレーザーデ ノ／トメ−ターで測定することにより、タンパク分解の程度をめた。５日間発芽 させた小麦種子のプロテアーゼ標品を用いて試験すると、クニソツインヒビター の酸化型は消化に対してほとんど完全に抵抗したが、チオレドキシン還元型はプ ロテアーゼに感受性があった。表Ｘ１１１に示されるように、ＮＡＤＰ／チオレ ドキシン系（ＮＴＳ）の成分すべてに依存する反応において、約８０％のＫＴＩ が分解した。酸化タンパクがＫＴＩに相対してタンパク分解感受性が大きい以外 、ＢＢＴＩは同しパターンを示した。植物プロテアーゼ標品をズブチリシンに置 き換えると、両インヒビターについて同様の作用が見られた（データは示されて いない）。タンパク分解反応の種類は調べなかったが、ペプチド産物がＳＤＳゲ ルに検出されなかったことは留意される。
表Ｘ１１１ 植物プロテアーゼ標品によるタンパク分解に対するクニッツ及びボーマンーバー クトリブノンインヒビターの感受性に関するチオレドキシン結合還元の影響１５ 大腸菌チオレドキシン系により３０℃で２時間還元した後、２００酬酢酸ナトリ ウム、ｐｉ−１４，６を加えることによりｐｉ−１４，７に調整した。次いて小 麦プロテアーゼ標品を加え、３７℃で２時間インキュベートした後、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥで分析した。
２レーザーデンントメーターでめた。
’ＮＴＳ　：　ＮＡＤＰ／チオレドキノン系。
４測定せず。
本実施例は、チオレドキシン又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元すると、 双方のタンパクを不活性化しかつそれらの熱及びプロテアーゼ感受性が増大する ことを示している。これらの結果は、インヒビタータンパクのチオレドキシン結 合還元が工業的処理及び種子発芽の双方に適切であることを示している。
これらの結果は、ＫＴＩ及び１３ＢＴＩのトリプシン阻害活性にジスルフィド結 合が不可欠である結論を確認するものである（Ｂｉｒｋ、　１９８５＋　Ｆｒｉ ｃｄｍａｎ、　Ｇｕｍｂｍａｎｎ。
１９８６；　Ｆｒ１ｅｄ＋ｎａｎ等、　１９８２．１９８４）。これらの実験は 、還元（不活性化）が生理的条件下で行われることも示している（即ち、低温で ＮΔＤＩ”’ＩＩ−還元チオレドキンンをジンる）。低温におけるトリプシンイ ンヒビターの不活性化能は、双方のトリプシンインヒビターの完全な不活性化方 法の可能性を与え、これによりダイズ産物の品質を改良しかつエネルギーを節約 する。ＫＴＩの完全な不活性化方法の要求は、ＢＢＴＩが完全に不活性化する条 件下でその活性の２０％がダイズ粉に−ｔｔして保持されるので重要である（Ｆ ｒｉｅｄｍａｎ等、１９９＋）。
本結果は、ＫＴＩ及びＢＢＴＩのプロテアーゼ感受性について新しい情報も加え るものである。還元によるプロテアーゼ感受性の増大は、ＮΔＤＰ／チオレドキ ノン系が種子発芽中プロテアーゼに曝された場合、インヒビタータンパクが修飾 されついには分解される機序として作用することを示唆している（ＢａＵｍｇａ ｒｔｎｅｒ。
Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、　１９７６；　Ｃｈｒｉｓｐｅｃｌｓ、　Ｂａｕｍｇａ ｒｆｎｅｒ、　１９７８；　Ｏｒｆ等、　１９７７；　Ｗｉ撃唐盾氏B １９８８；　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ等、　＋９７９）。以前に述べたように、ＮＡ ＤＰ−チオレドキシン基が小麦種子の発芽中にタンパクを移動する点で同様の役 割を果たしていることが明らかである。
ヒマ種子の２８を還元するスルフヒドリル剤の下記実験の結果（Ｓｈａｒｉｅｆ 、　Ｌｉ。
Ｈ）８２：　Ｙｏｕｌｅ、　ｌｌｕａｎｇ、１９７８）は、チオレドキシンが大 きな２Ｓサブユニツトの分子内ジスルフィドを有効に還元するか、２つのサブユ ニットをつなく分子間ジスルフィドを還元しｌＳいことを示している。
材料及び方法 ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ｌ、　ｖａｒ　ｌ１ａｌｅ）の種子 をＢｏｔｈｗｅｌｌ　Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｃｗ、　ＴＸ） から入手した。化学薬品は、Ｓｉｇｎｍ　Ｃｈｃｗ＋１ｃａ１社（Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　ｌ［）から入手した。大腸菌チオレドキシン及びＮＴＲを各タンパク を過剰発現するために形質転換された細胞から単離した。組換えプラスミドｐＦ ＰＩを含むチオレドキシン株はＤｒ、　Ｊ、−Ｐ、　Ｊａｃｑｕｏｌ（ｄｅ　ｌ 、ａ　Ｍｏｔｔｅ−Ｇｕｅｒｙ等、　＋９９１）により好意で提供された。組換 えプラスミド、ｐＰＭＲ２１を含む株は、Ｄｒｓ、　Ｍａｒｌｏｒｉｅ　Ｒｕ５ ｓｅｌとＰｅｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ（Ｒｕｓｓｅｌ、　Ｍｏｄｅｌ、　１９８Ｂ） により好意で提供された。チオレドキシン及びＮＴＲは、ｄｅ　Ｌａ　Ｍｏｔｔ ｅ−Ｇｕｃｒｙ等（＋９９１）及びＦｌｏｒｅｎｃｉｏ等（１，９８８）の各手 順により精製した。大腸菌チオレドキシン及びＮＴＲは、５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動の試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒ ｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）から購入した。
モノブロモビマン（ｍＢＢｒ）又はチオライトをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ 　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）から入手した。他の薬品は市販のものであり、品質の最 も高いものを人手した。ＮＡＤＰリンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ及びフルクトース −１，６−ビスホスファターゼをトウモロコノＵａｃｑｕｏｔ等１９８＋）及び ホウレンソウ（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ等１９８２）の葉から各々精製した。ホウレ ンソウタンパクに工夫された手順に従って、チオレドキシンｈを小麦種子から単 離した（Ｆ１ｏｒｅｎｃｉｏ等１９８８）。グルタチオンリダクターゼをホウレ ンソウの葉から調製した（Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ等＋９８８）。
プロティンボディーの単離 プロティンボディーを非水法で単離した（Ｙａｔｓｕ、　Ｊａｃｋｓ、　１９６ ８）。皮のついた乾燥ヒマ種子、１５ｇを４０ｍ１のグリセロールとワーリング ブレンダーで３０秒間混合した。混合液を４層のナイロンクロスでろ過した。粗 抽出液をＪＳ−２０ローターを用いたベックマンＪ２−２１Ｍ遠心機で５分間２ ７２Ｘｇで遠心した。遠心後、上清画分を集め、４１，４００Ｘｇで２０分遠心 した。プロティンボディーを含む沈降物をＩＯ＋ｎｌのグリセロールて懸濁し、 遠心した（４１，４００ｘｇ、２０分）後、沈降物を集めた。この洗浄工程を２ 回繰り返した。沈降物を３ｍｌの］００ｍＭトリス−）ＩＣＩバッファー（ｐＨ ８，５）で抽出することにより、可溶性（“マトリックス”）画分を得た。上記 のように遠心して集めた残りの不溶性（“クリスタロイド”）両分を１００ｍ１ −リス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８，５）中３ｍｌの６Ｍ尿素で抽出しＩこ。
２Ｓタンパク精製手順 Ｔｕｌｌｙ及びＢｅｅｖｅｒｓの方法（１９７６）を変更して、２Ｓタンパクを 調製した。マトリックスタンパク画分を５蘭トリス−ＨＣｌバッファー、ｐｉ（ ８，５（バッファーＡ）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（１）［＋−５２） カラムに加え、バッファーＡ中０〜３００ｍ１ＪＮａＣＩ勾配て溶離した。２Ｓ タンパクを含む画分をプールし、凍結乾燥して濃縮した。濃縮画分を１５０ｍＮ ａｃ１を含むバッファーＡで平衡化したＰｈａｒｎｕｃｉａ　ＦＰＬＣ５ｕｐｃ ｒｏｓｅ−１２（ＨＲＩＯ／３０）カラムに加えた。５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２カ ラムからの２８タンパクを含む両分をバッファーＡで平衡化したＦＰＬＣＭｏｎ ｏ　Ｑ　）ＩＲ５１５カラムに加えた。カラムを３ｍｌのバッファーＡ、バッフ ァーＡ中２０ｍ１の０〜３００ｍＭＮａＣ１の直線勾配、最後に１ＭＮａｃＩを 含むバッファーＡで順次溶離した。本方法で精製した２Ｓタンパクは、クーマシ ーブルーで　染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて混入物を含まなか った（Ｋｏｂｒｅｈｅｌ等、　＋９９１）。
分析法 タンパクの還元をＣｒａｗｆｏｒｄ等（＋９８９）のモノブロモビマン（ｍＢＢ ｒ）／ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法でモニターした。標識したタン パクを前記“穀類タンパクの還元、材料及び方法”項のように定量した。タンパ クをＢｒａｄｆｏｒｄ　（＋９７６）の方法でめた。
酵素アッセイ／還元実験 チオレドキシン及び２Ｓタンパクの存在下にＮＡＤＰマレートデヒドロゲナーゼ 及びフルクトース１．６ビスホスフアターゼをアッセイするために、Ｗａｄａ等 。
１９８１のプロトコールを用いた。添加チオレドキシン量がヒマ２Ｓタンパクを 還元するには十分であるが標的酵素を認めうるほど活性化するには不十分な条件 下でアッセイを行った。アッセイはすべて２５℃とした。特にことわらない限り 、用いられるチオレドキシン及びＮＴＲは大腸菌由来とした。ジチオスレイトー ル及び大腸菌チオレドキシンによる還元後、ｍＢＢｒ／５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動て精製中２８タンパクをモニターした（Ｃｒａｗｆｏｒｄ等、 　１９８９；　Ｋｏｂｒｅｈｅｌ等、＋９９１）。
図３９は、ｍＢＢｒ／ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法でめたヒマ種 子のマトリックスとクリスタロイドタンパクの還元を示すものである。１及び７ 、対照：添加なし；２及び８、Ｇ５Ｔｌ／ＧＲ／ＮＡＤｒ’ｌ（＋還元グルタチ オン、グルタチオンリダクターゼ（ホウレンソウの葉）及びＮＡＤＰＨ，３及び ９、ＮＧＳ　：ＮＡＤＰＨ１還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ（ホ ウレンソウの葉）及び大腸菌由来ゲルタレトキシン、４及び１０、ＮＴＳ　：Ｎ ＡＤＰＨｌＮＴＲ及びチオレドキシン（共に大腸菌由来）；５及び１１、ＮＡＤ ＰＨ，６及び１２、ＮＡＤＰＨ及び大腸菌ＮＴＲ，反応は、＋００嘘トリス−Ｈ Ｃｌバッファー、ＤＨ７，８中で行った。
指示されているように、０．７μｇ　ＮＴＲ及び１８ｇチオレドキシンを１ｍＮ ＡＤ　Ｐ　Ｈ及び標的タンパク：処理１−６の場合８μｇのマトリックスタンパ ク及び処理７−１２の場合ＩＯμｇのクリスタロイドタンパクを含む７０μｌの このバッファーに添加した。グルタチオンによるアッセイも２ｄＬ１．４μｇの グルタチオンリダクターゼ、１７１ｇのゲルタレトキシン及び１．５＋ｎＭのＮ ＡＤＰＨの最終濃度で行った。反応時間は２０分とした。
図４０は、ヒマ種子２Ｓタンパクのジスルフィド結合を還元するチオレドキシン の特異性を示すものである。（１）対照（添加なし）；　（２）対照＋ＮＴＳ　 （図３９と同し条件）；（３）対照（１００℃で３分加熱）＋　（４）対照＋２ 關ＤＴＴ（１００℃で３分加熱）。５μとの２８タンパク及び指示されている添 加物を含む試料を３０１ＴＩＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７，８）中で２０分間イン キュベートした。
次いて、ｍＢＢｒ、８０ナノモルを添加し、この反応を更に１５分間続けた後、 ｍＢＢｒ／ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。
結果 種子の熟成中ツブロチインボディー内に保持されているヒマの貯蔵タンパクをそ の溶解性に基づいて２両分に分けることができる。可溶性の大きいタンパクはプ ロティンボディーの外部（“マトリックス”）及び可溶性の小さいタンパクは内 部（“クリスタロイド”）に人っている。現在の研究においては、マトリックス 及びクリスタロイド成分を単離して細胞チオール、即ち、グルタチオン、ゲルタ レトキシン及びチオレドキシンによる還元を行う能力がめられた。触媒的に活性 なチオール基を有するゲルタレトキシン、１２ｋＤａタンパクは、細菌及び動物 の特定の酵素反応においてチオレドキシンに置き換えることができる（Ｉｌｏ１ ｍｇｒｅｎ等１９８５）が、植物で生しることは知られていない。
図３９は、ヒマ種子の多数の貯蔵タンパクが試験されたチオールによって還元さ れたが、厳密にはマトリックスの２８タンパクの大サブユニットに相当する低分 子量タンパクのみがチオレドキシンに対して特異性を示したことを示すものであ る。クリスタロイド画分の特定の高分子量タンパクは還元したが、その場合ゲル タレトキシンとチオレドキシンとの間にほとんど差がなかった　（図３９）。
即ち、ヒマ種子２３大サブユニツトは、チオレドキシン特異的還元を行うに当た り以前に述べられているノスティン含有タンパクに似ていると思われた。これら の実験は、この特異性を確認しかつ還元タンパクのある特性を明らかにするよう に設計された。予想されたように、ジスルフィド基がないことにより、２ｓ小サ ブユニットは試験された任意の還元剤を有するｍＢＢｒと実質的に反応しながっ ｔこ。
その蛍光バンドをレーザーデジントメトリーでモニターすると、ヒマ種子２５大 サブユニツトの還元がＮＡＤｒ’／チオレドキシン系（ＮＡＤＰＬＩ、ＮＴＲ及 びチオレドキシン）のすべての成分に依存することが判明した（表ＸＩＶ）。他 のチオレドキシン結合タンパク（葉緑体酵素のような）の場合のように、２８大 サブユニツトの還元に活性なチオレドキシンはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を 用いて化学的にあるいはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋−４及びＮＴＲを用いて酵素的に還 元することができた。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋−ｒチオレドキンンジンＤＴＴ単独及 びＤＴＴ＋チオレドキンンにジン還元の程度は、２５℃で２０分後、各々８４％ 、６７％及び９０％であった。
一般には広範囲であるが、同様の還元が上記ジスルフィドタンパクで見られた（ Ｊｏｈｎｓｏｎ等１９８７）等地９８７タンパクのように、未変性小麦チオレド キシンｈ及び大腸菌チオレドキシンは、Ｉ）ＴＴによる２Ｓタンパクの還元にお いて同じ意味で用いることができた（データは示されていない）。
表ＸｌＶ 異種スルフヒドリル還元剤によるヒマ種子２Ｓタンパクの還元の程度。反応条件 は図３９の通り。１００％の還元は、２Ｓタンパクを２％ＳＤＳ及び２．５％β −メルカプトエタノールの存在下に３分間加熱したものに相当する。ＮＴＳ　： ＮＡＤＰＨ，ＮＴＲ及びチオレドキシン（共にタンパクは大腸菌由来）；ＧＳＩ Ｉ／ＧＲ／ＮΔＤＰＨ：還元グルタチオン、グルタチオンリダクターゼ（ホウレ ンソウの葉山来）及びＮＡＤＰＨ：ＮＧＳ　：ＮＡＤＰＨ１還元ゲルタデオン、 グルタチオンリダクターゼ（ホウレンソウの葉山来）及びゲルタレトキシン（大 腸菌由来）。
チオレドキシンのヒマ種子２Ｓタンパクを還元する能力も酵素活性化アッセイで 明らかであった。ここで、葉緑体のチオレドキシン結合酵素、ＮＡＤＰリンゴ酸 塩デヒドロゲナーゼ又はフルクトース１．６−ビスホスファターゼを活性化する ために、チオレドキシンが標的にするタンパク（この場合２Ｓ）を用いる。従来 試験されたたいていのタンパクのように、２ＳタンパクはＮＡＤＰリンゴ酸塩デ ヒドロゲナーゼをより効果的に活性化し、フルクトースビスホスファターゼでは ほとんと活性を示さなかった（２．６に対して０．０ナノモル／分／ｍｇタンパ ク）。
ヒマ種子２Ｓタンパクは、分子間及び分子内ジスルフィドを含んでいる。即ち、 ２Ｓタンパクにより、これら２種類の結合に対するチオレドキシンの特異性をめ る。これを目的として、ヒマ種子２Ｓタンパクを（ｉ）ＮＡＩ）Ｐ／チオレドキ ノン系を用いて室温で酵素的に及びＤＴＴで１００℃で化学的に還元した。
ｍＢＢｒと反応させた後、スルフヒドリル剤を追加せずに行った５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動で還元タンパクを分析した。結果（図４０）は、チオ レドキシンが分子内ジスルフィドを有効に還元したが、分子間ジスルフィドでは ほとんど効果がなかったことを示している。
本結果は、ヒマ種子、油産生植物の２８の還元に対するチオレドキシンの役割を 拡大するものである。チオレドキシンは、２ｓタンパクの大サブユニットの分子 内ジスルフィドを特異的に還元し、大及び小サブユニットをつなぐ分子間ジスル フィドにほとんど活性を示さなかった。ダイズのトリプシンインヒビターに関す る結果に基づき、分子内ジスルフィドのチオレドキシンによる還元がタンパク分 解に対するジスルフィドタンパクの感受性を顕著に増大することは明らかである （Ｊｉａｏ等＋９９２ａ）。しかしながら、小麦の主な貯蔵タンパクの場合と思 われるタンパク分解の分解前に２８タンパクの還元が起こるかを見ることが残っ ている。
この実験で提起された関連の問題は、ヒマ及びブラジルナツトのような他の油産 生植物の２３　（ＡＩ　＋ｅｎｂａｃｈ等、　１９８７：＾ｍｐｅ等、　１９８ ６）が貯蔵タンパクの他に機能を有するかである。
実施例２１ 特定のインヒビタータンパクの不活性化による穀類プルラナーゼのチオレドキシ １、マルトトリオースの標学曲線 ０．１〜０．２ｍｌの水又はバッファー中一連の濃度のマルトトリオース（θ〜 ２　ｍｇ）をミクロフユージ管て作成した。これに０．２ｍｌのジニトロサリチ ル酸（ＤＡ）試薬（ＩｇのＤＡ、３０ｇの酒石酸カリウムナトリウム及び２０ｍ １の２ＮＮａＯＨを水と最終容ｆｉｌｏｏｍｌにミックスする）を加えた。この 試薬を温水浴中で溶解した。この混合液を１００℃で５分間加熱し、水浴中で冷 却した（室温）。各試料を２ｍｌの水を含むガラス管に移した。水に対するＡ１ ８．をよみとった。ΔＡ４．。
［ブランク（マルトトリオースなし）のＡ　＋　ｅ　ｓからマルトトリオースを 含む試料のＡ　Ｉ＋　ｓを引いｔこ］をマルトトリオース濃度に対してプロット した。
２、プルラナーゼ活性アッセイ プルラナーゼ活性を基質プルランから還元糖の遊離として測定する。典型的には 、１０−１００μｌのプルラナーゼ試料（２０ｗｌリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５あ ６イハ５−２　（Ｈｈ酸＋トリ’ｙム、ｐＨ４，６中）　ヲ２５−１００　μ１ （７）２００ＷＭａ酸ナトリウム、ｐＨ５，５（このバッファーはアッセイの最 終ｐＨを５．５にするように作用する）及び１０−２０μｌの２％（胃／Ｖ）プ ルランと混合した。この混合液を３７℃でプルラナーゼの活性によって３０〜１ ２０分間インキュベートした。
２００μｌのＤＡ試薬を加えることにより、反応を停止した。次いで還元糖を上 記のようにめた。
注： １、粗抽出液の透析で得られたプルラナーゼの粗抽出液又は透析した３　０−６ ０％硫酸アンモニウム画分から得られたプルラナーゼをプルラナーゼ源として用 いると、粗抽出液中に還元糖があるのでアッセイの前に十分透析しなければなら ない。言い換えると、透析した粗抽出液又は透析した３０−６０％硫酸アンモニ ウム画分からの粗プルラナーゼ試料のバックグラウンドは非常に高い。この場合 、ブランクは次のように調製する。まず２００μｍのＤＡ試薬を加え、次に酵素 試料、プルラン及びバッファーを加える。
２、最終濃度のＤＴＴ　（又はβ−メルカプトエタノール（ＭＥＴ）又はＧＳＨ ）がアッセイ混合液中２ｆｆ１Ｍより高いと、ＯＤ＋ｓｚ値はＤＴＴなしく耶Ｔ 、　Ｇ５１１）より大きくなる。ＤＤＴ（ＭＥＴ、　ＧＳＩ（）は、アッセイ中 反応の終わりにブランク、ＤＴＴなしの試料に加えなければならない。ＤＴＴの アッセイ混合液中の最終濃度が２−以下であるように注意しなければならない。
プルラナーゼインヒビターの精製 抽出及び硫酸アンモニウム分画 ２００ｇのオオムギ麦芽を電気コーヒーグラインダで微細末に粉砕し、６００ｍ １の５％（ｗ／ｖ）　Ｎ　ａ　ＣＩて３０℃において３時間抽出した。３０，０ ００ｇ、４℃で２５分間遠心した後、上清を固体硫酸アンモニウムで沈降するこ とにより分画した。３０〜６０％飽和硫酸アンモニウムで沈降したタンパクを最 少量の２０−トリスＨＣ１，ｐＨ７，５に溶解し、このバッファーで４℃におい て一晩透析した。
ＤＥ５２クロマトグラフィー 透析しまた試料を遠心して不溶性物質を除去し、上清を２Ｎギ酸でｐＨ４，６に 調整した。酸変性タンパクを沈降した後、上清をＮＨ，ＯＨでｐＨ７，５に再調 整し、２０ＩｌＩＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ７，５で平衡化したＤＥ５２カラム（ ２，５ｘ　２６ｃｍ）に充填した。８０ｍ１の上記バッファーで洗浄した後、カ ラムを直線０−５００−トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５で溶離した。６．７ｍｌの 両分を集めた。プルラナーゼを約３２５蘭ＮａＣ１て溶離し、そのインヒビター は約１００＋ｎＭＮａＣ１で溶離した。更にプルラナーゼをＣＭ３２　（２０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０）及び５ｅｐｈａｃｒｙｌ−２００１ＩＲ（２０ ０ｍＭＮ　ａ　Ｃｌ及びＩｍＭＥＤＴＡを含む３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐｊ１ ７．５）クロマトグラフィーで精製した。プルラナーゼインヒビタータンパクを 」二３このよう１こ精製しｔこ。
ＣＭ３２クロマトグラフィー ＤＥ５２工程のプルラナーゼインヒビター試料（約９０ｍ１）を１５０ｍ１のフ ラスコに入れ、７０℃の水浴で２０分間インキュベートした。遠心後、清澄化し た試料を２Ｎギ酸てｐｌＬｌ、６に調整し、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４， ６で透析した。透析で生した沈澱を遠心して除去し、上清を２０關酢酸ナトリウ ム、ｐＨ，１６で平衡化したＣＭ３２カラム（２，５ｘ　６　ｃｍ）でクロマト グラフィー処理した。
タンパクを２００ｍ１の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６中直線（１−０， ０４ＭＮａＣｌて溶離した。プルラナーゼ阻害活性を含む両分（５，０ｍｌ／画 分）をプールし、透析し、２００ｍ１の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０中 直線０．２−ＬＭＮａＣＩを用いてＣＭ３２カラム（２，５Ｘ　６　ｃｍ）で再 びクロマトグラフィー処理した。
セファデックスＧ−７５ろ過 ＣＭ３２クロマトグラフィー第２工程のプルラナーゼインヒビター画分を固体ス クロースに対する透析バッグで濃縮し、次いて２００ｍＭＮａＣ］及びＩｍＭＥ ＤＴＡを含む３０−トリス−ＨＣｌで平衡化したセファデックスＧ−７５カラム （２，５Ｘ　Ｆｌ　５ｃｍ）で分離した。プルラナーゼ阻害活性を示す両分（３ ，６ｍｌ／画分）をプールし、固体スクロースで透析して濃縮し、次に１０ｍＭ トリス−ＨＣＩ。
ｐｌ−（７，５で透析した。
プルラナーゼインヒビターの同定及び精製発芽で、デンプンはα−１β−アミラ ーゼ及びプルラナーゼ（枝切り酵素、Ｒ−酵素とも言われる）によりグルコース に変換される。アミラーゼの調節に対して多くの研究が行われたが、種子におけ るプルラナーゼの調節についてはほとんど知られていない。Ｙａｍａｄａ　（Ｙ ａ＋ｎａｄａ、　Ｊ、　（１９８１）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　９０：１５R− １５７）は、穀類粉を還元剤（例えばＤＴＴ）又はプロテアーゼ（例えばトリプ シン）とインキュベートすると、プルラナーゼ活性を活性化することを報告して おり、還元又はタンパク分解がプルラナーゼを発芽で活性化する機序であること を示している。コメの粉のように、発芽した小麦種子又はオオムギ麦芽のプルラ ナーゼ抽出液は低活性を示し、ＤＴＴとの２０−３０分間の前インキュベーショ ンで３〜５倍に活性化した。しかしながら、抽出液（３０−６０％硫酸アンモニ ウム画分の透析物）をアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィーで精製した 後、全プルラナーゼ活性はＤＴＴと前インキュベーションなしでアッセイしたカ ラムに加えた試料より２〜３倍増加し、ＤＴＴはプルラナーゼに対して全くある いはほとんど効果がなかった。発芽した小麦種子又はオオムギ麦芽が高プロテア ーゼ活性を示すことから、プルラナーゼが精製過程でタンパク分解により活性化 される１つの可能性があった。その場合には、プロテアーゼインヒビター反応混 液を加えると、精製中プルラナーゼ活性化が防止される。これとは反対に、プロ テアーゼインヒビターを用いた多くの実験は、これを証明しなかった。もう１つ の可能性は、硫酸アンモニウムで沈澱しかつプルラナーゼを阻害するインヒビタ ーがあることであった。ＤＴＴの役割はこのタンパクインヒビターを還元、即ち 不活性化することであり、プルラナーゼを活性化する。この方向で、オオムギ麦 芽の３（１−６０％硫酸アンモニウム画分を２０１１ＩＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ ７，５で平衡化したＤＥ５２カラム（２，５Ｘ　２６　ｃｍ）に加えた（図４１ ）。塩の直線勾配で溶離した後、′脱阻害″（″活性化″）プルラナーゼを約３ ２５＋＋＋１ＪＮａＣＩで溶離するタンパクピークとして同定した（画分番号４ ４〜６０）。５０μ！のピークブルラナ・−ゼ活性画分（画分番号４５）と５０ μＩの他のタンパク画分からなる前インキュベーション混合液中のプルラナーゼ 活性をアッセイすると、プルラナーゼ阻害活性を示したタンパクピークが画分番 号８〜２５の間の約１００ｍ１ｉｌＮａＣＩでＤＥ５２カラムから溶離されたこ とを示した（図４１）。
プルラナーゼインヒビター試料をｐＨ４，６（図４２）及び４．０（図４３）の ＣＭ３２を用いた２逐次カチオン交換クロマトグラフィ一工程及びセファデック スＧ−７５（図４４）を用いたろ過で更に精製した。
プルラナーゼインヒビターの特性 予備的実験は、プルラナーゼインヒビタータンパクが７０’′ｃ１０分間及びｐ Ｈ４，０の処理に耐性があることを示した。セファデックスＧ−７５ゲルろ過及 び５ＤＳ−ＰＡＧＥのプロファイルに基づき、プルラナーゼインヒビターは８〜 １５ｋＤａ±２ｋＤａの分子量を有する。実験は、更にタンパクがチオレドキシ ン還元性（Ｓ−３）結合を含むことを示した。
表Ｘ■に示されるこれらの実験は、偏在性ジチオールタンパク、チオレドキシン がオオムギ及び小麦内胚乳のプルラナーゼを阻害するこれまで未知のジスルフィ ド含有タンパクに特異的な還元剤として作用することが判明した。
表Ｘｖ ＮＡＤＰ／チオレドキシン系による還元後のインヒビターなし　１００ インヒビター 酸化　３０．１ ＤＴＴて還元　４６，１ 大腸菌Ｔｒｘ／ＤＴＴて還元　９５．１大腸菌ＮＴＳテ還元　４０．４ ＧＳＩＩ／ＮＡＤｒ’ｌｌ／ＧＲて還元　３３．６インヒビタータンパクを還元 すると、プルラナーゼ阻害能が取り除かれ、これによりプルラナーゼ酵素を活性 にする。表Ｘ■に示されているこれらの実験は、プルラナーゼ酵素をＮＡＤＰＨ ，ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ（ＮＴＲ）及びチオレドキシンＮＡＤ Ｐ／チオレドキシン系）からなる生理系並びにチオレドキシン（Ｔｒｘ）及びジ チオスレイトールで活性にすることが可能であることを示している。これらの知 見は、また、プルラナーゼの還元的活性化が起こる方法を明らかにするものであ る（即ち、特定（従来未知）のインヒビターを還元し、これにより不活性化され るので酵素が活性になる）。この反応に活性なチオレドキシンは、大腸菌又は種 子内胚乳（チオレドキシンｈ）のような各種原料から入手することができる。イ ンヒビタータンパク（１）を還元的に不活性化しかつプルラナーゼ酵素（Ｅ）を 脱阻害するに当たってチオレドキシンの役割を式ｌ及び２還元チオレドキシン＋ ＮＡＤＰ （２）酸化チオレドキシン＋［非活性Ｅ：酸化１］　−酸化チオレドキシン＋活 性Ｅ十還元■ 手短に述べると、内胚乳粗抽出液をカラムクロマトグラフィー法で分画した。
これらの工程は、プルラナーゼ酵素からタンパクインヒビターを分離させた。次 いで、インヒビタータンパクを数工程で高度に精製した。ｍＢＢｒ／５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ法を用いることにより、新規なタンパクのジスルフィド基がチオレドキシ ンで特異的に還元されかつ還元されたタンパクがそのプルラナーゼ阻害能を消失 することがめられた。種子の他のある種ジスルフィドタンパク（例えば、ダイズ のクニッツ及びボーマン−バークトリプシンインヒビター）のように、プルラナ ーゼインヒビタータンパクは、葉緑体ＮＡＤＰリンゴ酸塩デヒドロゲナーゼを活 性化する能力を示した。これらの実験においては、ジチオスレイトールを用いて チオレドキシンを還元し、次にインヒビターを還元し、これによりデヒドロゲナ ーゼ酵素を活性化した。
実施例２２ チオレドキシン及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを過剰発現させる酵 母細胞の操作 ２種類のサツカロミセスセレビシェチオレドキシン遺伝子（Ｍｕｌｌｅｒ、　［ ！、Ｇ、Ｄ。
（＋９９１）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｌＴＬ２６６：９１９４−９２０２ ）　、ＴＲＸ　ｌ及びＴＲＸ２を高コピー数のエピソームベクター、例えばＹＥ ｐ２４中で強力な構成プロモーター因子、例えばグリセルアルデヒド−３−Ｐデ ヒドロゲナーゼ、エノラーゼ又はホスホグリセレートキナーゼ遺伝子の解糖プロ モーターの調節によってクローン化する。組換え構築物を抗チオレドキシンウサ ギ抗血清を用いたウェスタンブロッティング定量法（Ｍｕｌｌｅｒ、　Ｅ、　Ｇ 、　Ｄ、等（１９８９）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｕ　２６４：４００８− ４０１４）でチオレドキシンの過剰発現を評価してチオレドキシン遺伝子及びプ ロモーター因子の最適組合わせを選択する。最適なチオレドキシン過剰発現系に よる細胞をドウの改良のためにヂオレドキシン源として用いる。
ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ遺伝子をそのアミノ末端配列から推論さ れるオリゴヌクレオチドプローブを調製することによりクローン化する。酵母細 胞からホウレンソウの葉に対して考えられた方法を変更して、酵素を調製する（ Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ、　Ｆ、Ｊ、等（１９８８）、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ ＩＩＬＢｉｏｐｈｙｓ、２６６：４９６−５０７）。純粋■■ ダクダーゼ酵素のアミノ末端をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相タン パクシークエンサーを用いて自動Ｅｘｍａｎ分解によるミクロン−フェンシング でめる。この配列に基づきかつ酵母内のコドンを用いることにより、２４大文字 の同義性２０塩基ＤＮＡプローブを調製する。プローブをサザンプロット法によ りＥｃｏＲＩとＰｓｔｌて切断した単離酵母ＤＮＡに対してハイブリッド形成す る。最も活性な領域をアガロースゲルから抽出し、ｐＵＣｌ　９プラスミドベク ターに導入する（Ｓｚｅｋｅｒｃｓ、　Ｍ等（１９９１）、　、１．　［］ａｃ ｌｅｒｉｏ１．１７３＋１８２１−１８２３）。形質転換した後、標識したオリ ゴヌクレオチドプローブを用いてコロニーハイブリッド形成によりプラスミド含 有大腸菌コロニーをスクリーンする（ｖｏｇｅｌｉ、Ｇ、等（１９８７）、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、　１５２：４０７−４１５）　。上記５ｚｅｋｅ ｒｅｓ等に示されているようにＤＮＡを配列決定することによりＮＡＤＰ−チオ レドキシンリダクターゼの遺伝子をもつクローンを同定する。同定するとすぐに 、上記ＴＲＸ１及びＴＲＸ２酵母チオレドキシン遺伝子の酵母内で、ＮＡＤＰ− チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を過剰発現する。ＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼを過剰発現する酵母細胞をリダクターゼ源として用いるとドウの品 質を改良する。
実施例２３ 遺伝子操作した酵母細胞を用いたドウの品質改良２種の酵母チオレドキシンと実 施例２３て述べた酵母ＮＡＤＰ−チオレドキンンリジンターゼを過剰発現するた めに操作したサツカロミセスセレビシェ細胞を音波処理のような確立された方法 により溶解し、次いで凍結乾燥する。チオレドキシン及びＮＡＤＰ−チオレドキ シンリダクターゼを過剰発現する培養物の乾燥細胞を合わせ、粉を補足するため に用いてそのドウの品質を改良する。０．２ｇの合わせた溶解乾燥細胞を約３０ ０〜約５００ナノモルＮＡＤＰ１１と共にＩＭｈリス−１１ｃＩバッフｙ−、ｐ Ｈ７，９に加えて５．２５ｎｌの３０ｍ）Ｊ）リス−ＨＣｌを得た。反応は、実 施例１４に記載されたように３０℃においてミクロファリノグラフで行われる。
実施例１４て示された改良と同様のドウの品質改良が見られた。
ドウの品質についてＮＡＤＰ／チオレドキシンの陽性効果は、グルテンの調製に おいてこの系を粉に加える選択を示している。目的はグルテンの収量及び特性を 変えることであり、これによりその工学的価値を高める：　（１）強力なグルテ ンを得る（弾性の増加、伸長性の改良）；　（２）ＮＡＤＰ−チオレドキシン系 によって還元された可溶性タンパクをタンパクの網状構造に捕捉し、これにより グルテンの製造で洗い流されないように防止してグルテンの収率を増加する。こ の手順（ｌｏｇの粉を用いる）においては、０．２μｇの大腸菌チオレドキシン 、０、１ｇｇの大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及び３００〜５０ ０ナノモルのＮＡＤＰＨをＩＭＩ−リス−ＨＣＬ　ｐＨ７，９，バッファーと共 に加えて５．２５ｍ１の３０酬トリス−ＭＣＩを得る。グルテンを一般の浸出法 により室温で調製する。グルテンの収量を重量でめ、グルテンの強度を古典的な 手動伸長法でめる。ＮＡＤＰ／チオレドキノン系によるこの処理で得られるグル テン産物を粉又は他の粒の添加物として用いる。
実施例２５ 非小麦又はライムギ粉のドウの製造方法本試験の場合（トウモロコン、コメ又は モロコシのｌｏｇの粉砕した粉を用いる’）　、０．２μｇの大腸菌チオレドキ シン、０．１ｇｇの大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキノンリダクターゼ及び５００ナ ノモルのＮＡＤＰＨをＩＭＩ−リス−ＨＣＩ　。
ｐＨ７，９，バッファーと共に加えて５．２５ｍ１の３０ｆｆ！！ｌ−リス−Ｈ Ｃｌを得る。反応は、１０ｇの粉砕した粉と酵素系とをミクロファリノグラフで ３０℃において混合することにより行われる。ファリノグラフ測定は、ＮＡＤＰ −チオレドキシン系により小麦様のドウ特性を示している。酵素系なしの対照に おいては、混合物がドウを形成しないのでミクロファリノグラフの読み取りは不 可能である。形成されるドウは持続性であり、その粘稠性は実験中維持される。
最終産物は、小麦から得られたドウで生じた網状構造と同じである。
動物毒素の還元 本発明は、ミツバチ、サソリ及びヘビに含まれる毒性の原因となるタンパクを化 学的に還元しカリこれによりチオレドキシン又はＤＴＴの存在下にチオールレド ックス（ＳＨ）剤、即ち還元チオレドキシン、還元リポ酸によって動物毒素、詳 細にはヘビ神経毒の毒性を軽減することにより毒液の生物活性を変える方法を提 供する。チオレドキシンの還元は、好ましくはＮＡＤＰ−チオレドキシン系（Ｎ ＴＳ）を介して生シル。前述のように、ＮＴＳはＮＡＤＰＨ，ＮＡＤＰ−チオレ ドキシンリダクターゼ（ＮＴＲ）及びチオレドキシンを含んでいる。
“チオールレドックス剤”は、非還元状態、また還元又はスルフヒドリル（ＳＨ ）状態の薬剤の双方を示すことが文献でしばしば用いられている。本明細書で定 義される“チオールレドックス（Ｓｌｌ）剤”は、還元チオールレド・ソクスタ ジノくり又は合成的に調製されたＤＴＴのような薬剤を意味する。
神経毒の還元は、血液、リンパ球又はバッファー等の液体である媒体又は細胞も しくは池の生存組織等の固体である媒体中で起こるものである。本明細書で用い られる“液体”という用語それ自体は、個体の中に存在する生体液を意味しない 。
おそらく生体外で毒液を不活性化しカリ個体の毒液を解毒するチオールレド・マ ウス（ＳＨ）剤の技術は、これらの毒性の原因となる毒液成分中で分子内ジスル フィド結合を還元する本発明の薬剤の能力に左右される。
すべてのヘビ神経毒は、シナプス前部及びシナプス後部共に還元され、本発明の チオールレドックス（ＳＨ）剤により生体外で少なくとも部分的に不活性化する ことができる。ヘビ毒抗毒素の調製において抗原として有効である。神経毒は、 好ましくは適切なパンファー中チオールレドックス（Ｓ　）（）剤とインキュベ ートすることにより不活性化される。好ましいバッファーは、トリス−ＨＣｌ／ ＜・ソファ−であるが、リン酸塩バッファーのような他のバッファーを用いても よい。好ましいチオールレドックス（ＳＩＤ剤は、還元チオレドキシンである。
ヘビ神経毒を不活性化するのに有効な量は、１００μｍの容量中ｌＯμｇのヘビ 神経毒に対して約０．１〜５．０μｇ、好ましくは約０．５〜１．０μｇの還元 チオレドキシン；約１．０μｇのチオレドキシンの存在下約１〜２０ナノモル、 好ましくは５〜１５ナノモルの還元リポ酸及び約ｌθ〜２００ナノモル、好まし くは５０〜１００ナノモルの還元ＤＴＴ　（好ましくは約１，０μｇのチオレド キシンの存在下）の範囲である。
ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてヘビ神経毒を不活性化するのに有効 な策は、１００μｍの容量中１０μｇのヘビ神経毒に対して約０．１〜５．０μ ｇ１好ましくは約０．５〜１．θμｇのチオレドキシン；約０．１〜２．０μｇ 、好ましくは０．２〜１．０μｇのＮＴＲ及び約０．０５〜０．５マイクロモル 、好ましくは約０．１〜０．２５マイクロモルのＮＡＤＰＨの範囲である。
不活性化の際、不活性化神経毒及びチオールレドックス（ＳＨ）剤等を含有する パンファーは、ヘビ毒抗毒素を産生ずるウマのような動物に注射されるか又は注 射の前に熱又はホルムアルデヒドで更に処理される。
本発明のチオールレドックス（ＳＨ）剤は、有毒な咬傷による神経毒性の作用を 受けている個体を治療するためにも用いられる。還元チオールレドックス（ＳＨ ）剤を個体に投与する好ましい方法は、ヘビ咬傷の周りに多数回皮下注射するこ とによるものである。
個体において神経毒を解毒するために用いられるチオールレドックス（ＳＨ）剤 の正しい量は、個体が咬傷から実際に受けた毒素量に左右されることは当然であ る。しかしながら、マウスにおけるヘビ神経毒の毒性を解毒又は還元するのに有 効な量は、通常、マウスの体重１ｇに対して約０．０１〜０．３μｇ、好ましく は約０．０２〜０．０５μｇの還元チオレドキシン：約００５μｇのチオレドキ シンの存在下約０．１〜３．０ナノモル、好ましくは０．２〜１．０ナノモルの 還元リポ酸；好ましくは０．Ｏ５ｌ１ｇのチオレドキシンの存在下約１．０〜３ ０ナノモル、好ましくは２．０〜５．０ナノモルのＤＴＴの範囲である。
ＮＡＤＰ−チオレドキシン系の成分を用いてマウスにおいてヘビ神経毒を解毒す るのに有効な量は、マウスの体重１ｇに対して約０．０１〜０．３μｇ、好まし くは約０．０２〜０．０５μｇのチオレドキシン；約０．００５〜０，１２μｇ １好ましくはＯ，Ｏｌ〜０．０２５μｇのＮＴＲ及び約５〜３０ナノモル、好ま しくは約ｌＯ〜１５ナノモルのＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの範囲である。
ＮＴＳを個体に投与する好ましい方法は、多数回皮下注射することによるもので ある。ヒト使用に好ましいチオールレドックス剤は、ＮＡＤＰ−チオレドキシン 系を介して又はリポ酸又はＤＴＴを用いて投与されるヒトチオレドキシンである 。
本発明の方法によって不活性化又は解毒される神経毒を産生ずる有毒なヘビの部 分的な表が、Ｃｈｉｐｐａｕｒ、　Ｊ、−Ｐ、等（１９９＋）　Ｒｅｐｔｉｌｅ 　Ｖｅｎｏｍｓ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｎｓ、八、Ｔ、　ＴｕB ｅｄ、、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｃｒ、　Ｉｎｃ、、の５２９−５５５ページに 出ており、参考として本明細書に引用する。
毒液を不活性化及び解毒することについて、本発明の他の特徴及び利点は下記実 施例から明らかである。
実施例２６ ミツバチ、サソリ及びヘビ毒の還元実験及びｍＢＢｒによる標識化反応は、５０ ＩＪｇの毒液（最終審１１００μｌ）を用いて次のプロテアーゼインヒビター　 フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン及びペプスタ チン（アッセイに用いられた最終濃度・各々１００μＭ、ｌμＭ及びｌμＭ）を 含む３０蘭トリス−ＨＣｌバッファーｐＨ７，９中で行った。還元剤としてＮＡ Ｄ　Ｐ　）（を用いた混合液は、４μｇのチオレドキシン、３．５μｇのＮＴＲ （共に大腸菌由来）及び１２．５ｍＭＮＡＤＰＨも含有した。チオレドキシン（ ４１１ｇ、大腸菌又はヒｌ−）をＤＴＴで還元する際、ＮＡＤＰＨとＮＴＲを除 き、ＤＴＴを０．５−に加えた。Ｇ　Ｓ　Ｈによるアッセイは、最終濃度５＋ｎ Ｍでかつ１．５μｇのグルタチオンリダクターゼ及び＋２．５ｍＭＮＡＤＰＨを 存在させる以外は同様に行った。混合液を室温で２０分間インキュベートし、次 いてｍＢＢｒを１．５ｆｆＩＭに加え、反応液を室温で１５分間続けた。反応を 停止し、１０μｍの１００鯛β−メルカプトエタノール、５μｍの２０％ＳＤＳ 及び１０μｍの５０％グリセロールを加えることにより、過剰のｍＢＢｒを誘導 した。次いて前記のように５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析 した。
ＮＡＤＰ−チオレドキシン系を用いて同様の実験をプロテアーゼインヒビターを 加えずに行った。
上記種々の還元剤によるミツバチ、サソリ及びヘビ毒の程度を、各々図４５．４ ６及び４７に示す。図４５．４６及び４７は、種々の毒液の還元実験の結果を示 すものである（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル／ｍＢＢｒ法）。種々の還元剤 を用いかつプロテアーゼインヒビターの存在下に室温で２０分インキュベートし た後、試料をｍＢＢｒで誘導し、電気泳動で分離し、蛍光をめた。（図４５−ア ピスメリフエラ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）由来のミツバチ毒；図４６： アンドロクトヌスアウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉ ｓ）由来のサソリ毒及び図４７：ブンガルスムルチシンクツス（Ｂｕｎｇａｒｕ ｓ　ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）由来のヘビ毒。これらの場合すべてにおいて、 チオレドキシン（大腸菌又はヒト）が毒液の成分を特異的に還元したことが見ら れる。図４８は、反応がプロテアーゼインヒビターを存在させずに行われた同様 の方法で、チオレドキシンが毒成分を還元することを示すものである。
図４８は、プロテアーゼインヒビターあり又はなしでＮＡＤＰ−チオレドキシン 系によるミツバチ、サソリ及びヘビ毒の還元の結果を示すものである（ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲルｍＢＢｒ法）。任意のプロテアーゼインヒビターの存在 又は不在下にＮＴＳを用いて室温で２０分インキュベートした後、試料をｍＢＢ ｒで誘導し、電気泳動て分離し、図４５−４７のように蛍光をめた。
旦科 毒液　アピスメリフエラ由来のミツバチ毒、アンドロクトヌスアウストラリス由 来のサソリ毒及びブンガルスムルチジンクツス由来のヘビ毒をＳｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａ１社（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から購入した。
プロテアーゼインヒビター・フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ） 、ロイペプチン及びペプスタチンをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｓｔ、　 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から購入しｔこ。
毒液の解毒 マウスに皮下注射することにより、ミツバチ、サソリ及びヘビ毒の解毒をめる。
アッセイは３回の実験で行われる。注射前に、毒液をＬＤｏの２倍までの濃度（ マウス１ｇ当たり）・アビスメリフエラ由来のミツバチ毒、２．８μｇ；アンド ロクトヌスアウストラリス由来のサソリ毒、０．３２μｇ：及びブンガルスムル チシンクツス由来のヘビ毒、０，１６μｇでリン酸塩−食塩水バッファ−（１０ ｍＮａｐ　Ｈｐｏｌ　／ＮａＨｔ　ＰＯｔ　ｐＨ７，２中０．１５Ｍ　ＮａＣ＋ ）に希釈する。注射の５、ｌ０１３０．６０分及び４．１２及び２４時間後に、 抗原投与したマウスの別個のグループに（１）静脈内及び（２）皮下注射する（ 初回の注射部位の周りに多数回局所注射）。チオレドキシンは、（１）０．０８ μｇのチオレドキシン、０゜０７μｇのＮＴＲ及び２５ナノモルのＮＡＤＰＨを 用いた大腸菌ＮＡＤＰ−チオレドキソン系、（２）Ｉ）ＴＴで還元したチオレド キシン又は還元リポ酸（０，０８μｇの大腸菌又はヒトチオレドキシンを１ナノ モルのジチオスレイトール又は１ナノモルの還元リポ酸に加える）で還元される 。濃度は、動物に注射した毒液１μｇに対するものであり、溶液はすべてリン酸 塩−食塩水バッファーで調製する。
解毒に関するチオレドキシンの影響は、（１）チオレドキシンなしの対照グルー プと比較する及び（２）動物に対する壊死、腫脹及び全身の不快感で証明される 局所反応の程度を比較することによりめられる。
ブタ膵臓ボスホリバーゼＡ２、エラブトキノンｂ及びβ−ブンガロトキシンをＳ ｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（ｓｌ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ）から購入した 。ホスホリパーゼＡ２は３．２Ｍ（ＮＯ，）２　ＳＯ，溶液ｐｔ＋５．５で供給 されたので、タンパクをセントリコン３ｋＤａカツトオフ膜を用いて３０關トリ ス−１１ＣＩバツフアー、ｐＨ７，９で透析した。
α−ブンガロトキシン及びα−ブンガロトキシン１２″Ｉは、叶、　５ｈａｌｌ ａ　Ｖｅｒｒａｌｌから好意で贈られたものとした。
試薬及びファインケミカルス ＤＬ−α−リポ酸、ダイズの１．−α−ホスファチジルコリン、ＮＡＤＰＨ及び β−メルカプトエタノールをＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｓｔ、　Ｌｏｕ ｉｓ、　Ｍｏ）から及びモノブロモビマン（ｍＢＢｒ、商品名チオライト）をＣ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃａ、）から購入した。ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の試薬は、Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ）がら購入 した。
載されているように大腸菌から精製した。チオレドキシンｈは小麦胚芽から精製 しくＦｌｏｒｅｎｃｉｏ、　Ｆ、Ｊ、等、　（１９８８）＾ｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈ ｅｗｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２６６：４９６−５０７）　、`オレ ドキシンｒ及びｍはホウレンソウの葉から精製した（上記Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ、 　Ｆ、　Ｊ、等）。
ヒトチオレドキシンはＤｒ、　Ｐｍａｎｕｃｌｌｃ　Ｗｏｌｌｍａｎから好意で 贈られたものとした。
ＮＡＤＰリンゴ酸塩デヒドロゲナーゼはトウモロコシの葉から精製しくＪａｃｑ ｕｏｔ、　Ｊ。
−Ｐ、等（！９８１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　６８：３００−３０４ ）、グルタチオンリダクターゼはホウレンソウの葉から精製した（上記Ｆｌｏｒ ｅｎｃｉｏ、　Ｆｊ、等）。大腸菌ゲルタレトキシンはＡ、　ｌ！ｏ１ｍｇｒｅ ｎ教授から好意で贈られたものとした。
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動は、厚さ１．５ｍ＋の１０−２０％勾配ゲルて行い、４０＋ｎＡの定電流で ３時間展開した。電気泳動後、ゲルを１２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸に２時間 浸漬し、次いで４０％メタノールと１０％酢酸を含有する溶液に１２時間移して 過剰のｍＢＢｒを除去した。ゲルを紫外光源（３６５μｍ）を取り付けたライト ボンクスに入れてタンパク結合ｍＢＢｒの蛍光をめた。
ポラロイド陽画／陰画ランドフィルム、５５型でＷｒａｔｔｅｎ黄色ゼラチンフ ィルターＮｏ、８（カットオフ＝４６０ｎｍ）（露光時間ｆ４．５で４０秒）を とおしてゲルの写真を取った。１０％酢酸及び４０％メタノール中０．１２５％ （Ｗ／Ｖ）クーマン−ブルーＲ−２５０の溶液で１時間ゲルのタンパクに対して 染色した。クーマシーブルーを除くこの同じ溶液でゲルを脱染した。
蛍光ゲルのポラロイド陰画及び染色した乾燥ゲルをレーザーデンシトメーター（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ　Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ　ＸＬ）て走査した。Ｇｅ１ ｓｃａｎ　ＸＬソフトウェアでビークの領域又は高さを評価することにより、バ ンドを定量した。
０゜８μｇのチオレドキシン、０．７μｇのＮＴＲ（共に大腸菌由来）及び２． ５ＩＴｌｌＩｌＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを含む３０ｆｆｌ！ＩＩトリス−ＨＣｌバッ ファー、ｐＨ７，９の最終容量１００μＩ中１０）ｚｇの標的毒素を用いて反応 を行った。チオレドキシンをＤＴＴで還元する際、ＮＡＤＰＨとＮＴＲを除き、 ＤＴＴを０．５μＭに加えた。最終濃度１１１Ｍ以外は同様にしてＧ　Ｓ　Ｈに よるアッセイを行った。ゲルタレトキシンによる還元の場合、チオレドキシン及 びＮＴＲを１μｇの大腸菌ゲルタレトキシン、０．３８７１ｇのグルタチオンリ ダクターゼ（ホウレンソウの葉から部分精製したもの）、ｌ　ｗｍＧ　Ｓ　Ｈ及 び２．５酬ＮＡＤＰＨ（これらの４成分の組合わせをＮＡＤＰ／グルタレドキン ン系とジン）に置き換えた。リポ酸の還元型による還元を２種の濃度、１００μ Ｍ及び２００μＭの１００７７１の容量で共に単独及び０．８μｇのチオレドキ シンを用いて１１つだ。混合液を、エラブトキノンｂ及びα−ブンガロトキシン の場合３７℃で２時間、β−ブンガロトキンジン場合室温で１時間及びホスホリ パーゼＡ、の場合室温で２０分間インキュベートした。インキュベートした後、 ｍ１３Ｂｒを１．５ｍＭに加え、反応を室温で１５分間続けた。反応を停止し、 過剰のｍｎｒ３ｒを１０８ｇの１００ｍＭβ−メルカプトエタノール、５Ｉｔｌ の２０％ＳＤＳ及び１０μｍの５０％グリセロールを加えることにより誘導した 。次いで、試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動て分析した。
試料を２ｍＭＤＴＴ中で３分間煮沸することにより、全毒素還元を達成した。冷 却後、試料をｍＢＢｒで標識化し、全試料を２分間再び煮沸した後、ゲルに充填 した以外は前のように処理した。エラブトキノンｂの上記種々の還元剤による還 元の程度を図４９に示す。２−メルカプトエタノール及びグルタチオンのような モノチオール還元剤に対して、ジチオスレイトール（ＤＴｒ）及びチオレドキシ ンとリポ酸の還元型はノチオール還元剤である。ＤＴＴは合成で調製した化学薬 剤であるが、チオレドキシン及びリポ酸は細胞内に存在する。上記で示した証明 は、リポ酸がジチオスレイトールより特異的な還元剤であることを示すものであ る。
ジチオスレイトールはチオレドキシンなして毒素を部分的に還元する（レーン５ ）が、還元リポ酸は還元しなかった（レーン８）。図５２は、ＮＴＳ又はＤＴＴ とチオレドキシンがα−ブンガロトキンジンびβ−ブンカロトキンジン特異的な 還元剤であることを示している。
実施例２８ ＮＡＤＰリンゴ酸塩デ酸塩デヒドロゲナーゼ活性化ヘビ縁体ＮＡＤＩ）リンゴ酸 塩デヒドロゲナーゼ活性化能を、５μｇの毒素をチオレドキシンの限界濃度（チ オレドキシンによる酵素の活性化を制限する）・大腸菌チオレドキシン、０．２ ５μｇ；ヒト０．９μｇ；小麦、１．　＋　５μｇ；ボウレンソウｆ及びｍ、各 々０．３７５及び０．１２５μｇと前インキュベートすることにより行った。１ ００ｍＭトリス−１−１ｃ　Ｉ、ｐＨ７，９、指示されているチオレドキシン及 びｌ　ＯｍＭＤＴＴ　（最終審ＩＬ０．２＋ｎｌ）を含有する溶液に精製トウモ ロコシＮＡＤＰリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、１．４μｇを加えた。２５分後、１ ６０μｍの前インキュベージｇン混合液を（０，７９ｍｌ中）１ｏｏＩＩＩＭト リスＨＣｌ、ｐＨ７，９と０．２５＋ｎＭＮＡＤ　ＰＨを含有する１ｍｌ容量の １ｃｍキュベツトに注入した。５０μｍの５０ｍＭ才キサロ酢酸を加えることに より、反応を開始した。次いで、ＮＡＤＰＨ酸化を４方向チヤンネル切換器を取 り付けたベックマンスベクトロボトメータを用いて３４０μｍの吸光度の変化を モニターした。本実験の結果を示す図５０は、エラブトキノンｂの種々の還元チ オレドキシンで還元すると、ＮＡＤＰリンゴ酸塩デヒドロゲナーゼを活性化する 毒素の生物学的能力を著しく変えることを示している。結果は、有効性の差異は あるが、試験したすべてのチオレドキシンが毒素の作用を制限する程度まで機能 することを示している。
エラブトキノンｂ、１０ｆ１ｇを３０蘭トリス−１−（Ｃｌバｙ７ｙ　ｐＨ７， ９（全量、１００μｍ）と３７℃で２時間インキュベートした。指示されている ように、バッファーを０．８　μｇ　（７）チｔ　Ｉｉドキンジン０．７７１ｇ （７）ＮＴＲ及び２．５＋ｎ１ＪＮＡＤＰＨで補足した。チオレドキシンをＤＴ Ｔで還元する際、ＮＴＲとＮＡＤＰＨを除き、ＤＴＴを０．５酬に加えた。イン キュベートした後、試料を０．４及び２μｇのトリプシンで３７℃において１０ 分間消化した。ＤＴＴ、４．８μｍの５０＋ｎＭ溶液、５μｍの２０％ＳＤＳ及 びｌ０ｆｌｌの５０％グリセロールを加え、試料を３分間煮沸し、次いで５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルをクーマン−ブルーで染色し 、タンパクバンドを上記のようにデンシトメーター走査で定量した。アッセイの 結果を下記表ＸＶＩに示す。これらの結果は、ヘビ神経毒（エラブトキシンｂ） を還元すると毒素がタンパク分解に対してより感受性になることを示している。
この結論を広げると、還元チオレドキシンを解毒剤として投与すると、毒液のプ ロテアーゼによるタンパク分解不活性化が増大するために毒素を破壊することを 助けるに違いないことが示される。
処理　消化エラブトキシンｂ％ ０．４μｇトリプシン　２μｇトリプシン対照　０．０　３４．１ 還元、ＮＴＳ　２１．１　５７．８ 還元、ＤＴＴ　３．１　４０．６ 還元、ＤＴＴ　＋　Ｔｒｘ　２８．０　７１．８エラブトキシンｂ、１０μｇを 次のように３０鯛トリス−ＨＣｌバッファー。
ｐＨ７，９中３７°Ｃて２時間前インキュベートした：対照、添加なし；大腸菌 ＮＡＤＰ／チオレドキンン系（ジンＳ）、チオレドキシン、ＮＴＲ及びＮＡＤＰ Ｈ。
ＤＴＴて還元、ＤＴＴとチオレドキシンで還元、ＤＴＴは大腸菌チオレドキシン で補足した。前インキュベートした後、０．４μｇ及び２μｇのトリプシンを指 示したものに加え、次いて５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動て分析した 。
β−ブンガロトキンジンホスホリパーゼＡ２成分の酸化還元型の活性をＬｏｂ。
ｄｅ＾ｒａｕｊｏ等（１９８７）　Ｔｏｘｉｃｏｎ　２５：ｌｌ８ｌ−１１８８ に記載されているように酸度の変化を分光光度計でめた。還元実験に対して、ｌ Ｏμｇの毒素を０．８μｇのチオレドキシン、０．７μｇのＮ　Ｔ　Ｒ及び７　 ｍＭＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　１−ｒを含有する３０ｒｎＭトリスーＩＣ＋バッファー、 ｐｔｒ７．９　（最終容量、３５μＩ）中でインキュベートした。
室温で１時間インキュベートした後、２０μｍの反応混合液をｌ　ＯｗｌＭＣａ 　Ｃｌ　ｔ、１００ｍＭＮａｃＩ、４酬胆汁酸ナトリウム、１７５μＭダイズホ スファチジルコリン及び５５μＭフェノールレッドを含む１ｍｌのアッセイ溶液 （ｐＨ７，６に調整）の入ったｌｃｃキュベツトに加えた。次いで、Ｂｅｃｋｏ ｍｎ　Ｄｕモデル２４００分光光度計で５５８μｍの吸光度の変化を測定した。
図５１に示されている本実験の結果は、β−ブンガロトキシンがチオレドキシン で還元されるとその大部分のホスホリパーゼ活性を消失することを示している。
結果は、ヘビ咬傷の後に還元チオレドキシンを投与すると、ホスホリパーゼＡｔ 活性を取り除いて毒素の解毒を助けるという結論と一致している。
培養マウス細胞について、放射能標識した毒素を用いてα−ブンガロトキシン結 合をアッセイした（Ｇｕ、　Ｙ、等（１９８５）　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　 ５：ｌ９０９−１９１６）　、　マウス細胞、ラインＣ３をＧｕ等（上記Ｇｕ、 　Ｙ、等）に記載されているように増殖し、２４ウエルのプラスチック組織培養 プレート（Ｆａｌｃｏｎ）にｌウェル当たり約３０００細胞の密度で入れた。４ ８時間後、更に９６時間後に、増殖培地を融合培地に取り替えた。
更に２日間増殖した後、培養物をアッセイに用いた。
３種類の処理に供した細胞を用いてα−ブンガロトキシン結合をめた：　［Ａ］ １０ｎＭα−ブンガロトキシノ’Ｊ　（２６２Ｃｉ／ミリモル）を４μｇのチオ レドキシン、３．５μｇのＮＴＲ（共に大腸菌由来）及び６．２５＋ｎＭＮＡＤ ＰＨを含む２００μ、ｌのリン酸塩−食塩水バッフｙ　（１０ｍＮａｔ　ＨＰＯ Ｉ／ＮａＨ＋　ＰＯ４ｐＨ７，２中０．　ｌ　５Ｍ　ＮａＣｌ）中３７℃で２時 間前インキュベートした。ある場合には、ＮＴＲとＮＡＤＰＨを１．２５蘭ＤＴ Ｔに置き換えた。２時間インキュベートした後、混合液をマウス細胞を含むウェ ルに移し、リン酸塩−食塩水で２回洗浄し、３７℃で２時間インキュベートした 。［Ｂ］細胞をリン酸塩−食塩水バッファーで２回洗浄した後、１ウエル当たり ｌｏｎＭα−ブンガロトキシン１！１１（２００μｍのリン酸塩−食塩水中）を 加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を再びリン酸塩−食塩水バ ッファーで洗浄して非結合毒素を除去した。指示されているように、０．６８ｍ ＭＣａＣｌ、、０．４９ｍＭＭｇＣ１ｔ、４μｇチオレドキンン、３．５μｇ　 ＮＴＲ及び６．２５ｍＭＮＡＤＰＴ−［て補足した２００μｌの食塩水をウェル に加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＮＴＲ及びＮＡＤＰ Ｈを１．２５＋ｎＭで加えるＤＴＴによる処理から除いた。［Ｃ］細胞をリン酸 塩−食塩水バソフア−で２回洗浄した後、４μｇのチオレドキシン、３．５μｇ のＮＴＲ及び６．２５蘭ＮＡＤＰＨを含む２００μｍの溶液を各ウェルに加えた 。ある場合には、ＮＴＲ及びＮＡＤＰＨを１．２５ｍＭＤＴＴに置き換えた。
プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞をリン酸塩−食塩 水バッファーで２回洗浄して加えた還元剤を除去した。０．６８１１＋１ＪＣａ Ｃ１を及び０、４９ｍＭｇＣｌ　＊を含むリン酸塩−食塩水バッファー、２００ μｌ及びＩＯｎＭα−ブンガロトキシン１０１を各ウェルに加えた。インキュベ ーションを３７℃で２時間続けた。本アッセイの結果を表ＸＶＩＩに示す。本実 験は、チオレドキシンで還元すると、β−ブンガロトキシンがもはやアセチルコ リンレセプターに結合することができないことを示している。全動物に広げると 、チオレドキシン結合還元機序により、毒素のその標的レセプターへの結合を取 り除くことによって解毒がもたらされる。
各α−ブンガロトキノン結合アッセイを３回の実験で行った。１００倍過剰の非 標識α−ブンガロトキシンをインキュベーション混合液に加えることにより、非 特異的結合を測定した。インキ、ベーション後、すべての場合の細胞をリン酸塩 −食塩水で洗浄して非結合毒素を除去した。細胞を０．１ＭＮａＯＨで可溶化し かつ放射能をγカウンターで測定することにより、結合した細胞の量をめた。
表ＸＶＩ＋ マウス細胞のアセチルコリンレセプターに対するα−ブンガロトキシンの結合煤 頃へ　桓命」 毒素＋還元剤−−−−−−−→　細胞　−停止２時間、３７℃　２時間、３７℃ 還元剤なし　１００．０ ＮＴＳ　Ｏ，０ ＤＴＴチオレドキ／ンあり　０，０ ＮＴＳ　ＮＴＲなし　６３．０ ＮＴＳチオレドキンンなし　７８．０ ＮＴＳ　ＮＡＤＰＨなし　１０１．０ 処頃旦 還元剤なし　１００．０ ＮＴＳ　７８．０ ＤＴｒチオレドキシンあり　７６．０ 還元剤なし　１００．０ ＮＴＳ　６８．７ ＤＴＴ　８５．０ ＤＴＴチオレドキシンあり　６８．８ 大腸菌ＮＴＳ　：　チオレドキシン、■及びＮＡＤＰＨヘビ神経毒の解毒をマウ スに皮下注射することによりめる。アッセイは３回の実験で行なわれる。注射の 前に、毒素をＬＤ、。用量の２倍までの濃度にリン酸塩−食塩水バッフ７−（ｌ 　０ｄＪＮａｙ　Ｈｐｏ＋／ＮａＨ＊　ｐｏｔ　ｐＨ７，２中０．１５ＭＮａＣ ］）で希釈する。（ＬＤ、。は一定グループの動物の５０％を死滅させる毒素用 量として定義される。）毒性試験に対して、次の神経毒濃度がＬＤ、。（マウス １ｇに対して）に相当する：ニラブトキシンｂ、０．０５−０．１５μｇ；α− ブンガロトキシン、０．３μｇ；及びβ−ブンガロトキンジン０．０８９μｇ０ 注射の５．１Ｏ１３０，６０分及び４．１２．２４時間後に、別個のグループの 抗原投与マウスを（１）静脈内及び（２）皮下に注射する（初回注射部位の周り に多数回局所注射）。チオレドキシンを（１）０．０８μｇのチオレドキシン、 ０．０７μｇのＮＴＲ及び２５ナノモルのＮＡＤＰＨを用いる大腸菌ＮＡＤＰ− チオレドキンン系ジン　（２）　０．０８　ｔｔｇの大腸菌又は０．２０μｇの ヒトチオレドキシンを用いるチオレドキシンと１−２ナノモルの還元リポ酸及び （３）５ナノモルのジチオスレイトールを含む０．０８μｇの大腸菌又は０．２ ０μｇのヒトチオレドキシンを用いて還元する（濃度は動物に注射した毒素ｌμ ｇに対する；溶液はすべてリン酸塩−食塩水バッファー中で調製する）。
解毒に関するチオレドキシンの影響は、（１）ＬＤ、。をチオレドキシンなしの 対照グループと比較する；　（２）壊死、腫脹及び動物に対する全身の不快感で 明らかにされる局所反応の程度による；　（３）クレアチンキナーゼの血清レベ ル、組織損傷の指標によりめる。筋細胞の切断の結果として血液中に放出される クセイキットを用いてモニターする。
ヘビ咬傷は多くの症状からなり、種々の要因による。結果として、患者によって 異なる。それにもかかわらず、ヒトにおいてチオレドキシン治療が軽減しなけれ ばならない共通の症状がある。詳細には、チオレドキシン治療は神経毒に関連し た症状及びヘビ咬傷に起因する関連の作用を軽減しなければならない。腫脹及び 浮腫、疼痛並びに咬傷を取り囲む水瘤の減少；正常な脈搏数の回復；咬傷面の壊 死の抑制；傷害部分の最少化が含まれる。これらの症状の最少化は、次に患者の 全身健康状態の改善がもたらされなければならない。
おわりに 前述の本発明の詳細な説明及びその適用を具体的に説明する個々の実施例から、 本発明が広範囲にわたる結果を有することがわかる。本発明は、基本的には、新 規ｌｊドウ及びドウ混合物並びに新規なドウの製造方法並びにドウ及びパン製品 の品質を改良する方法並びに穀類生産物中の酵素インヒビターを不活性化する方 法を提供するものである。本発明は、また、動物毒素、即ち、ミツバチ、サソリ 及びヘビ毒素の生物学的活性及び不活性を変える方法を提供するものである。本 発明は、更に、プルラナーゼインヒビターである新規なタンパク及びその不活性 化方法を提供するものである。
本発明はその特定の実施態様に関連して記載してきたが、本発明が関係する当業 者に明らかな種々の変更が次の請求の範囲で定義される本発明の範囲内であるこ とは理解されるべきである。
ｏｔ　２　３　４　ｓｉ　７ 時間（分） １０　４ｊ　Ｕｌ　ｉ！　１４　” 中５Ｃ；ｌ、鰭 ｅｐ　ｓｂ　Ｓｏｂ　１５４）　ａ、ｏ　２３．。
〔チオレドキシン旦〕、ド２ ＦＩＧ、３ −・・ご・・Ｖ　￥ｉ　旺Ｎ工Ｏ ・・・・田■（￥ｉ　証Ｎ工０ ＤＳＧ−Ｉ　Ｂ　ＢＴＪ Ｃ＝コントロール　（還元剤なし） ６：チオレドキシン ｐ＋ｃ、、、ら ＋および一チオレドキシンを表す（旦　刀）Ｃ−コントロール　０！元剤なし） Ｅｒ（、−，１ 蛍光　タンパク ＝ （必／／：６ｊ６某墨　下） ＝ （６さｌど６／￥！　工） ￥ｉ兜ｆ別封 −Ｌ２デー４・でｉｌ−一、デカ１、 コーン ：］：／１−９−ル　チオレドキシン ３ＧＳＨ／ＧＲ／ＮＡＬ）Ｉ’１１ ４Ｎゴ５ ＦＩＧ、２６ ３、　ＧＳｔｌ／にＲ／ＮΔＤｌ’ｌ　＋４、ｈＴＳ ライ麦粉からミリステート抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元３、　Ｇ ＳＴ−（／ＧＲ／ＮＡＤＴ’ｌ　１４Ｖ円 ＦＩＧ、２８ オオムギ粉からミリステート抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元４、Ｎ ＴＳ 、！４０１： ｌ　２　］　２ ＦＩＧ、３４ ライ小麦粉エタノール抽出（７たタンパクのチオレドキシン関連還元 ＦＩＧ、　３５ ＦＩＧ、３６ ＦＩＧ、３７ ＦＩＧ、　３８ １．マトリックス（Ｍ）　７．　クリスタロイド（Ｃ）ＦＩＣ，，３°ｌ 画分数（Ａ、３ｄ／画分］ 画分数（４，３ｄ／画分〉 画分数（３，６ｄ／画分） アピスメリフェラ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）からのハチ毒液種々のチオ レドキシンで還元したエラブトキシンｂによるｉｎ体ＮＡＤＰ−マレートデヒド ロゲナーゼの活性化○　・ 図面の簡単な説明 第１図は、ＤＴＴ−還元子すレドキシンｈの存在下での、ＮＡＤＰ−マレートデ ヒドロゲナーゼの活性に及ぼすα−アミラーゼタンパク阻害剤の効果を示すグラ フである。
第２図は、α−アミラーゼ阻害剤によるＮＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼの 活性化に及ぼす、α−アミラーゼ阻害剤濃度の効果を示すグラフである。
第３図は、ＤＳＧ−１または一２α−アミラーゼ阻害剤によるＮＡＤＰ−マレー トデヒドロゲナーゼの活性化に及ぼすチオレドキシンｈの効果を示すグラフであ る。
第４図は、Ｅ、コリＮＡＤＰ／チオレドキシン系による、ＤＴＮＢ還元に及ぼす α−アミラーゼ阻害剤の効果を示すグラフである。
第５図は、Ｅ、コリＮＡＤＰ／チオレドキシン系による、ＤＴＮＢ還元に及ぼす パン小麦（Ｂｒｅａｄ　Ｗｈｅａｔ）由来のビューロチオニンαおよびＣＭ−１ α−アミラーゼ阻害剤の効果を示すグラフである。
第６図は、長いＵ■波長ライトボックス上に配置されたＳＤＳポリアクリルアミ ド電気泳動ゲルを撮影した写真であり、可溶性の硫黄に富む種子タンパク：マカ ロニ小麦のα−アミラーゼ阻害剤（ＤＳＧ−１）およびポウマン−バーク大豆ト リプシン阻害剤（ＢＢＴＩ）のチオレドキシン−関連還元を示す。
第７図は、長いＵｖ波長ライトボックス上に配置されたＳＤＳポリアクリルアミ ド電気泳動ゲルを撮影した写真であり、種子タンパクのチオレドキシン−関連還 元を示す。
第８図は、蛍光ライトボックス上に配置されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳 動ゲルを撮影した写真であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ／ｗ＋Ｂ叶法により測定された グリアジンのチオレドキシン−関連還元を示す。
第９図は、蛍光ライトボックス上に配置された酸性−ポリアクリルアミド電気泳 動ゲルを撮影した写真であり、酸ＰＡＧＥ／＋ｎＢＢｒ法により測定された種々 の型のグリアジンのチオレドキシン−関連還元を示す。
第１０図は、蛍光ライトボックス上に配置されたＳＯＳポリアクリルアミド電気 泳動ゲルを撮影した写真であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ１０＋ＢＢｒ法により測定さ れた酸可溶性グルテニンのチオレドキシン−関連還元を示す。
第１１図は、発芽中の種子タンパク画分の相対的還元を示すグラフである。
第１２図は、（インビボでの還元と比較した）発芽中の主なチオレドキシン−結 合グリアジンおよびグルテニンの還元を示す棒グラフである。
第１３図は、パンおよびパスタのタンパク網状構造形成におけるチオレドキシン の提案された役割を模式的に示す図である。
第１４図は、処理したおよび未処理の中力粉のファリノグラムであり、第１４（ ａ）図は中力粉のファリノダラムであり、第１４（ｂ）図は還元されたグルタチ オンで処理した後の中力粉のファリノグラムであり、また第１４（ｃ）図はＮＡ ＤＰ／チオレドキシン系で処理した後の該中力粉のファリノグラムである。
第１５図は、処理したおよび未処理の薄力粉のファリノグラムであり、第１５（ ａ）図は薄力粉コントロールのファリノグラムであり、第１５（ｂ）図は還元さ れたグルタチオンで処理した後の薄力粉のファリノグラムであり、第１５（ｃ） 図はＤＴｒで処理した後の薄力粉のファリノグラムであり、また第１５（ｄ）図 はＮＡＤＰ／チオレドキ／ン系で処理した後の該薄力粉のファリノグラムである 。
第１６図は、処理したおよび未処理のアポ口（Ａｐｏｌｌｏ）粉のファリノグラ ムを表し、第１６（ａ）図は未処理の該粉のファリノグラムであり、第１６（ｂ ）図はＮＴＳで処理した後の該粉のファリノグラムである。
第１７図は、処理したおよび未処理のアボロ粉のファリノグラムを表し、第１７ （ａ）図は該アポ口コントロールのファリノグラムであり、第１７（ｂ）図はＮ ＡＤＰＨ発生系で発生口た後の該扮のファリノグラムであり、また第１７（ｃ） 図は該発生系とＮＴＲとチオレドキシンとて処理した後の該アボロ粉のファリノ グラムである。
第１８図は、チオレドキジンー処理したドウから調製したパンのアルポン（Ａｒ ｂｏｎ）パン塊と未処理のコントロールパン塩とを比較して示した平面を示す写 真である。
第１９図は、チオレドキシン−処理したアルボン粉ドウから調製したパン塊と未 処理のコントロールパン塩とを比較して示した側面および部分平面を示す写真で ある。
第２０図は、チオレドキジンー処理したアルボン粉ドウから調製したパン塊と未 処理のコントロールパン塩とを比較して示した側面を示す写真である。
第２１図は、チオレドキジンー処理したアルボン粉ドウから調製したパン塊と未 処理のコントロールパン塩とを比較して示した平面を示す写真である。
第２２図は、チオレドキジンー処理したアルボン扮ドウから調製したパン塊と未 処理のコントロールパン塩とを比較して示した側面および部分平面を示す写真で ある。
第２３図は、チオレドキシン処理したおよび未処理のドウから焼き上げたパンを 比較して示した写真であり、第２３（ａ）図は処理および未処理アルボン粉から 調製したパン塊を比較して示した写真であり、また第２３（ｂ）図は、チオレド キシン処理したおよび未処理のコーン、コメおよびモロコン粉から調製した焼き 製品の比較を示す写真である。
第２４図は、チオレドキシン処理したライ小麦粉ドウから焼き上げたパン塊と未 処理のライ小麦粉ドウから調製したコントロールパン塩とを比較した平面および 部分側面を示す写真である。
第２５図は、チオレドキシン処理したおよび未処理のコーン、コメおよびモロコ シ粉から調製した焼き製品の間の比較を示す写真である。
第２６図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、エンバク 粉がらミリステート−抽出したタンパクのチオレドキシン−関連還元の程度を示 したものである。
第２７図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、ライ小麦 粉からミリステーｉ・−抽出したタンパクのチオレドキシン−関連還元の程度を 示したものである。
第２８図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、ライムギ 粉からミリステート−抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元の程度を示し たものである。
第２９図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、オオムギ 粉からミリステート−抽出したタンパクのチオレドキシン−関連還元の程度を示 したものである。
第３０図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、バッファ ー、エタノールおよびテフ粉からミリステート−抽出したタンパクのチオレドキ シン−関連還元の程度を示したものであり、第３０（ａ）図は蛍光を示し、また 第３０（ｂ）図はタンパク染色を示す。
第３１図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、コーン、 モロコシおよびコメ粉からミリステート−抽出したタンパクの還元状態に及ぼす ＮＴＳ対グルタチオンリダクターゼの効果を示す。
第３２図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、コーン、 モロコノおよびコメ粉からミリステート−抽出したタンパクのインビボ還元状態 およびチオレドキジン関連インビボ還元を示すものである。
第３３図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、酵母ＮＡ ＤＰ／チオレドキンン系にジン小麦グルテニンの相対的還元を示すものである。
第３４図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、酵母ＮＡ ＤＰ／チオレドキンン系にジン小麦グリアジンの相対的還元を示すものである。
第３５図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、ライ小麦 からエタノール抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元の程度を示す。
第３６図は、５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、ライムギ からエタノール抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元の程度を示す。
第３７図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、エンバク からエタノール抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元の程度を示す。
第３８図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、オオムギ からエタノール抽出したタンパクのチオレドキシン関連還元の程度を示す。
第３９図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真てあ頃種々の還元 剤によるヒマ種子マトリックスおよびクリスタロイドタンパクの還元の程度を示 すものである。
第４０図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、２Ｓタン パクの還元特異性を示すものである。
第４１図は、ＤＥ５２クロマトグラフィーによる、オオムギ麦芽のプルラナーゼ からのプルラナーゼ阻害物質の分離を示すグラフである。
第４２図は、ｐＨ４，６におけるＣＭ３２クロマトグラフィーによる、オオムギ 麦芽のプルラナーゼ阻害物質の精製を示すグラフである。
第４３図は、ｐｌ＋４．０におけるＣＭ３２クロマトグラフィーによる、オオム ギ麦芽のプルラナーゼ阻害物質の精製を示すグラフである。
第４４図は、セファデックスＧ−７５クロマトグラフイーによる、オオムギ麦芽 のプルラナーゼ阻害物質の精製を示すグラフである。
第４５図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、種々の還 元剤によるハチ毒液タンパクの還元の程度を示すものである。
第４６図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、種々の還 元剤によるサソリ毒液タンパクの還元の程度を示すものである。
第４７図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、種々の還 元剤によるヘビ毒液タンパクの還元の程度を示すものである。
第４８図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、プロテイ ナーゼ阻害剤の存在下および不在下でのＮＴＳによるハチ、サソリおよびヘビ毒 液タンパクの還元の程度を示すものである。
第４９図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、種々の還 元剤で処理したエラブトキンンｂサンプルの還元の程度を示すものである。
第５０図は、種々のチオレドキシンで還元したエラブトキシンｂによる葉緑体Ｎ ＡＤＰ−マレートデヒドロゲナーゼの活性化を、該デヒドロゲナーゼの毒素に欠 けるコントロールによる活性化と比較して示したグラフである。
第５１図は、β−ブンガロトキンジンチオレドキシン関連還元のβ−ブンガロト キシンホスホリバーゼＡ、活性に及ぼす効果を示すグラフである。
第５２図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真であり、細胞性還 元剤によるβ−ブンガロトキシンおよびα−ブンガロトキシンサンプルの還元の 程度を示すものである。
フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ　２３　Ｌ　１／１８ 　８１１４−４ＢＡ６１Ｋ　３５１５８　７４３１−４Ｃ３５／６４　７４３１ −４Ｃ ３８／４４　Ａ　Ｄ　Ｑ ＣＯ７Ｋ　１／１１３　８３１８−４Ｈ１４／４１５　８３１８−４Ｈ １４／４３５　８３１８−４Ｈ １４／４６　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　９／９６　９１５２−４８ １１１０２　２１２１−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ 、ＳＥ、ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　コブレール　カロリーフランス　エフ−３４０６０モンペリエ ールセデックス　０１　プラース　ヴイアラ２　ラボラドワール　ド　チクノロ シード　セレアーレ（イエヌエールア） （７２）発明者　イー　ポイホン　シーアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４５９８　ウォルナット　クリーク　プリムローズ　レーン　３２１５ （７２）発明者　ウオン　ジョシュア　エイチアメリカ合衆国　カリフォルニア 州 ９４０８０　サウス　サン　フランシスコ　ヴイユーモント　テラス　９ （７２）発明者　ロザーノ　ローザ アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４７０６　アルバニー　１６　ブライトン　アベニュー　１１５５ （７２）発明者　イアオ　イン　アン アメリカ合衆国　フロリダ州　３３１．７５　マトメント　オブ　ホーティカル チャー　パエク　キー　ヨエウプ　（番地なし）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．シスチン含有非チオニンタンパクの還元方法であって、（ａ）チオールレド ックスタンパクを該シスチン含有タンパクを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該シスチン含有タンパク を該還元チォールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ２．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項１記載の方法。 ３．チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリ ダクターゼで還元する請求項２記載の方法。 ４．チオールレドックスタンパクがグルタレドキシンである請求項１記載の方法 。 ５．シスチン含有非チオニンタンパク、チオレドキシン、ＮＡＤＰ−チオレドキ シンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成組成物を含む組成物。 ６．ジスルフィド結合を有するアミラーゼインヒビタータンパクを還元する方法 であって、 （ａ）チオールレドックスタンパクを該アミラーゼインヒビターを含む液体又は 物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該インヒビタータンパク を該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ７．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項６記載の方法。 ８．チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及び ＮＡＤＰＨで還元する請求項７記載の方法。 ９．アミラーゼインヒビタータンパクがＣＭ又はＤＳＧタンパクである請求項６ 記載の方法。 １０．チオールレドックスタンパクがグルタレドキシンである請求項６記載の方 法。 １１．グルタレドキシンを還元グルタチオンで還元する請求項１０記載の方法。 １２．アミラーゼインヒビタータンパクがα−アミラーゼインヒビタ−ＣＭ−１ 、ＤＳＧ−１又はＤＳＧ−２である請求項１０記載の方法。 １３．ジスルフィド結合を有するアミラーゼインヒビタータンパク、チオレドキ シン、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生 成組成物を含む組成物。 １４．ジスルフィド結合を有するプロテアーゼインヒビタータンパクの還元方法 であって、 （ａ）チオールレドックスタンパクを該プロテアーゼインヒビターを含む液体又 は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し；（ｃ）該プ ロテァーゼインヒビターを該還元チオールレドックスタンパクで還元することを 含む方法。 １５．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項１４記載の方 法。 １６．還元剤がリポ酸である請求項１５記載の方法。 １７．還元系がＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨである請 求項１５記載の方法。 １８．プロテアーゼインヒビタータンパクがトリプシンインヒビターである請求 項１５記載の方法。 １９．トリプシンインヒビターがコーンカーネル、酵素インヒビター、オボムコ イド、アプロトニン、ボーマン−バーク及びクニッツトリプシンインヒビターか らなる群より選はれる請求項１８記載の方法。 ２０．チオールレドックスタンパクがグルタレドキシンである請求項１４記載の 方法。 ２１．グルタレドキシンを還元するための還元剤が還元グルタチオンである請求 項２０記載の方法。 ２２．プロテアーゼインヒビタータンパクがコーンカーネル及び酵素インヒビタ ートリプシンインヒビターからなる群より選ばれたトリプシンインヒビタータン パクである請求項２０記載の方法。 ２３．プロテアーゼインヒビタータンパクがズブチリシンインヒビターである請 求項１４記載の方法。 ２４．シスチン基を含むダリアジンの還元方法であって、（ａ）チオールレドッ クスタンパクを該グリアジンを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し；（ｃ）該グ リアジンを該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ２５．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項２４記載の方 法。 ２６．還元系がＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨである請 求項２４記載の方法。 ２７．グリアジンタンパクがα、β及びγタンパク型からなる群より選ばれる請 求項２４記載の方法。 ２８．チオールレドックスタンパクがグルタレドキシンである請求項２４記載の 方法。 ２９．グルタレドキシンを還元するための還元剤が還元グルタチオンである請求 項２８記載の方法。 ３０．グリアジンがα、β又はγグリアジンである請求項２８記載の方法。 ３１．グルテニンの還元方法であって、（ａ）チオールレドックスタンパクを咳 グルテニンを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し；（ｃ）該グ ルテニンを該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ３２．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項３１記載の方 法。 ３３．還元系がＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼである請 求項３１記載の方法。 ３４．グルテニンが約３０〜約１３０ｋＤａの分子量を有する請求項３１記載の 方法。 ３５．チオールレドックスタンパクがグルタレドキシンである請求項３１記載の 方法。 ３６．グルタレドキシンを還元するための還元剤が還元グルタチオンである請求 項３５記載の方法。 ３７．グルテニンが約３０〜約１３０ｋＤａの分子量を有する請求項３５記載の 方法。 ３８．食品中の、シスチン基を含む酵素インヒビタータンパクを不活性化する方 法であって、 （ａ）穀粒産物をチオールレドックスタンパクと混合し、該チオールレドックス タンパクが単独又は還元剤もしくは還元系との組合わせであり；（ｂ）該チオー ルレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該酵素インヒビターを該還元チオールレ ドックスタンパクで還元し、該インヒビターの該還元が該インヒビターを不活性 化させることを含む方法。 ３９．食品がダイズであり、インヒビターがトリプシンインヒビターである請求 項３８記載の方法。 ４０．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項３８記載の方 法。 ４１．該穀粒がオオムギであり、該インヒビターがオオムギアミラーゼ／ズブチ リシン（アシ）インヒビター、ＣＭタンパク又はＤＳＧタンパクである請求項３ ８記載の方法。 ４２．チオレドキシン、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡＤＰＨ又 はＮＡＤＰＨ生成組成物を含む組成物。 ４３．ドウ又は焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）チオールレドッ クスタンパクをグルテニン又はダリアジンを含むドウ成分と混合してドウを形成 し、該チオールレドックスタンパクが単独又は還元剤もしくは還元系との組合わ せであり；（ｂ）ドウを焼いて焼き製品を形成する：工程を含む方法。 ４４．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項４３記載の方 法。 ４５．チオレドキシンが該ドウの約０．０１〜０．３ｐｐｍを含む請求項４３記 載の方法。 ４６．セモリナドウ又は調理パスタの特性を改良する方法であって、（ａ）チオ ールレドックスタンパクをグルテニン又はダリアジンを含むセモリナドウ成分と 混合してドウを形成し、該チオールレドックスタンパクが単独又は還元剤もしく は還元系との組合わせであり；（ｂ）工程（ａ）のドウ混合物を成形し；（ｃ） 工程（ｂ）の成形ドウ混合物を加熱して調理パスタを形成する：工程を含む方法 。 ４７．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項４６記載の方 法。 ４８．コメ、トウモロコシ、ダイズ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、キャッ サバ又はアワ扮からドウを製造する方法であって、（ａ）チオールレドックスタ ンパクを該粉と混合して混合物を形成し、該粉が貯蔵タンパクを含み； （ｂ）該混合物中の該チオールレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該貯蔵タン パクを該還元チオールレドックスタンパクで還元し；（ｄ）該還元貯蔵タンパク を酸化し、該酸化貯蔵タンパクが柔軟なドウとしてタンパク網状複合体を生成す ることを含む方法。 ４９．コメ、トウモロコシ、ダイズ、オオムギ、オートムギ、モロコシ又はアワ 扮からドウを製造する方法であって、 （ａ）還元チオールレドックスタンパクを該扮及び液体と混合して混合液を形成 し、該粉が水不溶性貯蔵タンパクを含み；（ｂ）該貯蔵タンパクを該還元チオー ルレドックスタンパクで還元し；（ｃ）該還元貯蔵タンパクを酸化し、該酸化貯 蔵タンパクが柔軟なドウとしてタンパク網状複合体を生成することを含む方法。 ５０．改良グルテンの製造方法であって、（ａ）小麦又はライムギ粉を液体と混 合して混合液を形成し、該粉がグルテニン、ダリアジン及びシスチン含有可溶性 タンパクを含み；（ｂ）チオールレドックスタンパクを加え；（ｃ）該チオール レドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し；（ｄ）該ダリアジン、グルテ ニン及び可溶性タンパクを該還元チオールレドックスタンパクで還元し、該還元 グルテニン、グリアジン及び可溶性タンパクがグルテンを形成し； （ｅ）該グルテンを該混合物から分離することを含む方法。 ５１．改良グルテンの製造方法であって、（ａ）小麦又はライムギ扮を還元チオ ールレドックスタンパク及び液体と混合し、該粉がグルテニン又はダリアジンを 含み；（ｂ）該グリアジン及びグルテニンを該還元チオールレドックスタンパク で還元し、該還元グルテニン及びグリアジンがグルテンを形成し；（ｃ）該グル テンを該混合物から分離することを含む方法。 ５２．グルテン様製品の製造方法であって、（ａ）オオムギ、トウモロコシ、モ ロコシ、コメ又はアワ粉を液体と混合して混合物を形成し、該粉が水不溶性貯蔵 タンパク及びシスチン含有可溶性タンパクを含み； （ｂ）チオールレドックスタンパクを該混合物に加え；（ｃ）該チオールレドッ クスタンパクを還元剤又は還元系で還元し；（ｄ）該水不溶性貯蔵タンパク及び 可溶性タンパクを該還元チオールレドックスで還元し、該還元タンパクが粘弾性 のグルテン様製品を形成し；（ｅ）該グルテン様製品を該混合物から分離するこ とを含む方法。 ５３．チオールレドックスタンパクを含むドウ混合物であって、該チオールレド ックスタンパクが該混合物の約０．１〜約１．０ｐｐｍであるドウ混合物。 ５４．組換えチオレドキシンＤＮＡを含むベクターで形質転換された酵母細胞。 ５５．該チオレドキシンＤＮＡを発現してチオレドキシンを産生する請求項５４ 記載の細胞。 ５６．該チオレドキシンを分泌する請求項５５記載の細胞。 ５７．組換えＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼＤＮＡを含むベクターを用 いて形質転換された酵母細胞。 ５８．該リダクターゼＤＮＡを発現して該リダクターゼを産生する請求項５７記 載の細胞。 ５９．該リダクターゼを分泌する請求項５８記載の細胞。 ６０．請求項５５記載の溶解及び凍結乾燥細胞。 ６１．請求項５８記載の溶解及び凍結乾燥細胞。 ６２．ドウの品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現する溶 解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母細胞 をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物及び水又は液体バッファーと混合して混合物 を形成し；（ｂ）該混合液を扮に加えてドウを形成することを含む方法。 ６３．ドウの品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現する溶 解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母細胞 をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物と混合して混合物を形成し； （ｂ）該混合物をドウ成分に加えてドウを形成することを含む方法。 ６４．焼き製品の品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現す る溶解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母 細胞をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物及び水又は液体バッファーと混合して混 合物を形成し；（ｂ）該混合物を扮に加えてドウを形成し；（ｃ）該ドウを焼い てパン製品を製造することを含む方法。 ６５．焼き製品の品質を改良する方法であって、（ａ）チオレドキシンを発現す る溶解酵母細胞及びＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼを発現する溶解酵母 細胞をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成物と混合して混合物を形成し； （ｂ）該混合物を扮に加えてドウを形成し；（ｃ）該ドウを焼いて焼き製品を製 造することを含む方法。 ６６．１個以上の分子内シスチンを含む非チオニン、非葉緑体タンパクの分子内 ジスルフィド結合を還元する方法であって、（ａ）チオールレドックスタンパク を該シスチン含有タンパクを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該シスチン含有タンパク を該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ６７．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項６６記載の方 法。 ６８．チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼで還元する請求項６６記載の方法。 ６９．チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ生成組成物で還元する請求項６ ６記載の方法。 ７０．組成物であって、分子内シスチン含有非チオニン、非葉緑体、植物タンパ ク、チオレドキシン、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ及びＮＡＤＰＨ又 はＮＡＤＰＨ生成組成物を含む組成物。 ７１．分子内ジスルフィド結合を有するタンパクの熱又はプロテアーゼ安定性を 低下させる方法であって、 （ａ）チオールレドックスタンパクを該分子内ジスルフィド結合を有する該タン パクを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元し；（ｃ）該分子内ジスルフィド結 合を該還元チオールレドックスタンパクで還元することを含む方法。 ７２．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項７１記載の方 法。 ７３．チオールレドックスタンパクをＮＡＤＰＨ及びＮＡＤＰ−チオレドキシン リダクターゼ又はＮＡＤＰＨ生成組成物で還元する請求項７１記載の方法。 ７４．分子内及び分子間ジスルフィド結合を有する特定のタンパクの分子内ジス ルフィド結合のみを選択的に実質的に還元する方法であって、（ａ）チオールレ ドックスタンパクを該特定のタンパクを含む液体又は物質に加え； （ｂ）該チオールレドックスタンパクを還元剤又は還元系で還元し、これにより 該特定のタンパクの分子内ジスルフィド結合のみを該還元チオールレドックスタ ンパクで実質的に還元することを含む方法。 ７５．チオールレドックスタンパクがチオレドキシンである請求項７４記載の方 法。 ７６．分子内ジスルフィド結合を有するタンパクが２Ｓアルブミンタンパクであ る請求項７４記載の方法。 ７７．還元チオレドキシンをＮＡＤＰＨとＮＴＲ又はＤＴＴで還元した請求項７ ５記載の方法。 ７８．ジスルフィド結合及び８〜１５ｋＤａの分子量を有する単離プルラナーゼ インヒビター。 ７９．請求項７８記載のインヒビタータンパクのプルラナーゼインヒビター活性 を不活性化する方法であって、 （ａ）チオレドキシンを該タンパクを含む液体又は物質に加え；（ｂ）該チオレ ドキシンを還元し； （ｃ）該インヒビタータンパクを該還元チオレドキシンで還元することを含む方 法。 ８０．オオムギ又は小麦内胚乳由来プルラナーゼの活性を高める方法であって、 （ａ）チオレドキシンを該プルラナーゼを含む液体又は物質に加え；（ｂ）該チ オレドキシンを還元し、これにより該プルラナーゼ活性を高める方法。 ８１．調理パスタの特性を改良する方法であって、（ａ）チオールレドックスタ ンパクをパスタドウ成分と混合してドウを形成し、該チオールレドックスタンパ クが単独又は還元剤もしくは還元系との組合わせであり； （ｂ）工程（ａ）のドウ混合物を成形し；（ｃ）工程（ｂ）の成形ドウ混合物を 加熱して調理パスタを形成する；工程を含む方法。 ８２．ドウ又は焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）ＮＡＤＰＨ又は ＮＡＤＰＨ生成組成物をグルテニン又はダリアジンを含むドウ成分と混合してド ウを形成し；（ｂ）ドウを焼いて焼き製品を形成する：工程を含む方法。 ８３．焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）チオールレドックスタン パクをドウ成分と混合してドウを形成し、該チオールレドックスタンパクが単独 又は還元剤もしくは還元系との組合わせであり； （ｂ）工程（ａ）のドウ混合物を成形し；（ｃ）工程（ｂ）の成形ドウ混合物を 加熱して焼き製品を形成する：工程を含む方法。 ８４．トリチカーレ焼き製品の特性を改良する方法であって、（ａ）液体及びチ オレドキシンをトリチカーレ粉と混合してドウ混合物を形成し、該チオレドキシ ンがＮＴＲ及びＮＡＤＰＨ生成系との組合わせであり；（ｂ）ドウを焼いて焼き 製品を形成する：工程を含む方法。 ８５．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒タンパクを還元する方法で あって、 （ａ）該シスチン含有タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオール レドックス（ＳＨ）剤と接触させ；（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以 上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これにより該 神経毒タンパクを還元することを含む方法。 ８６．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシンの 存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より選 ばれる請求項８５記載の方法。 ８７．ヘビ神経毒タンパクがシナプス前部神経毒である請求項８５記載の方法。 ８８．シナプス前部神経毒タンパクがβ−神経毒である請求項８７記載の方法。 ８９．β−神経毒がβ−ブンガロトキシンである請求項８８記載の方法。 ９０．シナプス前部神経毒が促進神経毒である請求項８９記載の方法。 ９１．ヘビ神経毒がシナプス後部神経毒である請求項８５記載の方法。 ９２．シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒又は長鎖型神経毒である請求項９１記 載の方法。 ９３．シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒、エラブトキシンａ又はエラブトキシ ンｂである請求項９２記載の方法。 ９４．シナプス後部神経毒が長鎖型神経毒、α−ブンガロトキシン又はα−コブ ラトキシンである請求項９２記載の方法。 ９５．請求項８５記載の方法により調製された還元ヘビ神経毒タンパク。 ９６．組成物であって、ヘビ神経毒タンパク及びチオールレドックス（ＳＨ）剤 を含む組成物。 ９７．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒タンパクの還元方法であっ て、（ａ）該タンパクをチオレドキシンリダクターゼ、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ Ｈ生成系及び該毒素を還元するのに有効な童のチオレドキシンと接触させ；（ｂ ）１種以上の該分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元するのに十 分な時間該接触を維持し、これにより該タンパクを還元することを含む方法。 ９８．請求項９７記載の方法により調製された還元ヘビ神経毒。 ９９．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒の生物活性を変性する方法 であって、 （ａ）該神経毒を含む媒体を該毒素を還元するのに十分な量のチオールレドック ス（ＳＨ）剤と接触させ； （ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以上のジスルフィド架橋を還元するの に十分な時間該接触を維持し、これにより該毒素の該比物活性を変性することを 含む方法。 １００．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項９９記載の方法。 ｌ０１．ヘビ神経毒がシナプス前部神経毒である請求項９９記載の方法。 ｌ０２．シナプス前部神経毒がβ−神経毒、β−ブンガロトキシンである請求項 １０１記載の方法。 １０３．シナプス前部神経毒が促進神経毒である請求項１０１記載の方法。 １０４．ヘビ神経毒がシナプス後部神経毒である請求項９９記載の方法。 １０５．シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒又は長鎖型神経毒である請求項１０ ４記載の方法。 １０６．シナプス後部神経毒が短鎖型神経毒、エラブトキシンｂ又はエラブトキ シンａである請求項１０５記載の方法。 １０７．シナプス後部神経毒が長鎖型神経毒、α−ブンガロトキシン又はα−コ ブラトキシンである請求項１０５記載の方法。 １０８．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒を生体外で不活性化する 方法であって、 チオールレドックス（ＳＨ）剤を、該薬剤の量が該毒素を還元するのに有効であ る該毒素を含む液体に加えることを含む方法。 １０９．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１０８記載の方法。 １１０．請求項１０８記載の方法により調製された不活性化ヘビ神経毒。 １１１．組成物であって、液体中ヘビ神経毒タンパク及びチオールレドックス（ ＳＨ）剤を含む組成物。 １１２．１種以上の分子内シスチンを有するヘビ神経毒を生体外で不活性化する 方法であって、 該毒素を還元するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡ ＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンを該毒素を含む液体に加え、こ れにより該毒素を不活性化する方法。 １１３．請求項１１２記載の方法により調製された不活性化ヘビ神経毒。 １１４．組成物であって、不活性化ヘビ神経毒、ＮＡＤＰ−チオレドキシンリダ クターゼ、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンを有する液体を 含む組成物。 １１５．個体におけるヘビ毒神経毒性の治療方法であって、該ヘビ毒神経毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をヘビ毒神経毒 性を受けている個体に投与することを含む方法。 １１６．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１１５記載の方法。 １１７．ヘビ毒神経毒性がα−ブンガロトキシン、エラブトキシンｂ又はβ−ブ ンガロトキシン毒素に起因する請求項１１５記載の方法。 １１８．個体におけるヘビ毒神経毒性の治療方法であって、該ヘビ毒神経毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡ ＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをヘビ毒神経毒性を受けている 個体に投与することを含む方法。 １１９．ヘビ毒神経毒性がα−ブンガロトキシン、エラブトキシンｂ又はβ−ブ ンガロトキシン毒素に起因する請求項１１８記載の方法。 １２０．１種以上の分子内シスチンを有するミツバチ毒の毒性タンパクの還元方 法であって、 （ａ）該シスチン含有毒性タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオ ールレドックス（ＳＨ）剤と接触させ；（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１ 種以上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これによ り該毒タンパクを還元することを含む方法。 １２１．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１２０記載の方法。 １２２．ミツバチ毒タンパクがホスホリパーゼＡ２である請求項１２０記載の方 法。 １２３．ミツバチ毒がアピスメリフェラ由来である請求項１２０記載の方法。 １２４．１種以上の分子内シスチンを有するミツバチ毒の生体外不活性化方法で あって、チオールレドックス（ＳＨ）剤を該薬剤の量が該毒を還元するのに有効 である該毒を含む液体に加えることを含む方法。 １２５．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１２４記載の方法。 １２６．個体におけるミツバチ毒の磁性の治療方法であって、該ミツバチ毒の毒 性を還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をミツバチ 毒の毒性を受けている個体に投与することを含む方法。 １２７．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１２６記載の方法。 １２８．１種以上の分子内シスチンを有するサソリ毒の毒性タンパクの還元方法 であって、 （ａ）該シスチン含有タンパクを該タンパクを還元するのに有効な量のチオール レドックス（ＳＨ）剤と接触させ；（ｂ）１種以上の該分子内シスチンの１種以 上のジスルフィド架橋を還元するのに十分な時間該接触を維持し、これにより該 神経毒タンパクを還元することを含む方法。 １２９．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１２８記載の方法。 １３０．サソリ毒タンパクが神経毒である請求項１２８記載の方法。 １３１．サソリ毒がアンドロクトヌスアウストラリス由来である請求項１２８記 載の方法。 １３２．１種以上の分子内シスチンを有するサソリ毒の生体外不活性化方法であ って、チオールレドックス（ＳＨ）剤を該薬剤の量が該毒を還元するのに有効で ある該毒を含む液体に加えることを含む方法。 １３３．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１３２記載の方法。 １３４．個体におけるサソリ毒の毒性の治療方法であって、該サソリ毒の毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のチオールレドックス（ＳＨ）剤をサソリ毒の毒 性を受けている個体に投与することを含む方法。 １３５．チオールレドックス（ＳＨ）剤が還元チオレドキシン、チオレドキシン の存在下還元リポ酸、ＤＴＴ及びチオレドキシンの存在下ＤＴＴからなる群より 選ばれる請求項１３４記載の方法。 １３６．個体におけるミツバチ毒の毒性の治療方法であって、該ミツバチ毒の毒 性を還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、 ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをミツバチ毒の毒性を受け ている個体に投与することを含む方法。 １３７．個体におけるサソリ毒の毒性の治療方法であって、該サソリ毒の毒性を 還元又は軽減するのに有効な量のＮＡＤＰ−チオレドキシンリダクターゼ、ＮＡ ＤＰＨ又はＮＡＤＰＨ生成系及びチオレドキシンをサソリ毒の毒性を受けている 個体に投与することを含む方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000103743A (ja) * 1998-09-29 2000-04-11 Jiyunji Yodoi チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類を含有する食品、化粧品及び医薬
JP2008546670A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
WO2011033994A1 (ja) * 2009-09-15 2011-03-24 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 米粉パン類生地の製パン性向上方法

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5792506A (en) * 1991-10-12 1998-08-11 The Regents Of The University Of California Neutralization of food allergens by thioredoxin
EP0863154A1 (en) * 1991-10-12 1998-09-09 The Regents Of The University Of California Use of thiol redox proteins for reducing protein intramolecular disulfide bonds, for improving the quality of cereal products, dough and baked goods
HUT69780A (en) * 1991-10-12 1995-09-28 Univ California Use of thiol redox proteins for reducing disulfide bonds
FR2723097B1 (fr) * 1994-07-26 1996-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Thioredoxines h de ble tendre et de ble dur et proteines presentant des similitudes, fragments d'adncodant pour ces proteines et procedes d'obtention
CA2331741C (en) * 1998-05-13 2011-12-06 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for using dehydrogenases in baking
AU2003252858B2 (en) * 1998-05-13 2006-08-31 Novozymes A/S Methods for Using Dehydrogenases in Baking
WO2000014239A2 (en) * 1998-09-08 2000-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Thioredoxin h homologs
US6897356B1 (en) 1998-09-08 2005-05-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Thioredoxin H homologs
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
US6784346B1 (en) * 1999-03-29 2004-08-31 The Regents Of The University Of California Value-added traits in grain and seed transformed with thioredoxin
US7179964B2 (en) * 1999-03-29 2007-02-20 The Regents Of The University Of California Transgenic plants with elevated thioredoxin levels
EP1163266A2 (en) * 1999-03-31 2001-12-19 The Regents of the University of California Barley gene for thioredoxin and nadp-thioredoxin reductase
US20030195707A1 (en) * 2000-05-25 2003-10-16 Schork Nicholas J Methods of dna marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20020077775A1 (en) * 2000-05-25 2002-06-20 Schork Nicholas J. Methods of DNA marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20040039167A1 (en) * 2000-09-04 2004-02-26 Jean-Marc Sabatier Maurotoxin, pi1 and hstx1 derivatives
US7009087B1 (en) 2000-12-01 2006-03-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for altering the disulfide status of proteins
CA2447407A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 Xencor Nucleic acids and proteins with thioredoxin reductase activity
US7285631B2 (en) * 2001-08-10 2007-10-23 Serono Genetics Institute S.A. Human cDNAs and proteins and uses thereof
US20050079247A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-14 Slilaty George E. Food composition and method of making same
AR047658A1 (es) 2004-02-03 2006-02-01 Cargill Inc Concentrado de proteinas y corriente acuosa con carbohidratos hidrosolubles
WO2007041631A1 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Scynexis, Inc. ARYIiALKYL AND HETEROARYLALKYL DERIVATIVES OF CYCLOSPORINE A FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF VIRAL INFECTION
WO2009023355A2 (en) * 2007-05-25 2009-02-19 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for reducing the toxicity of certain toxins
JPWO2009110624A1 (ja) 2008-03-04 2011-07-14 味の素株式会社 γ−グルタミルシステイン生産酵母及び酵母エキスの製造法
WO2010021798A1 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved crop stress tolerance, yield and quality via glutaredoxin overexpression
US20170049136A1 (en) * 2014-05-02 2017-02-23 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for determination of bioactivity, removal, or inactivation cereal amylase trypsin inhibitors in cereals, flours and complex foods
EP3367812A4 (en) * 2015-10-30 2019-06-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. METHODS FOR DETERMINING BIOACTIVITY, QUANTITY, ELIMINATION OR INACTIVATION OF GRAY AMYLASE / TRYPSIN INHIBITORS IN CEREALS, FLOURS, PLANTS AND COMPLEX FOODS
EP4169933A4 (en) * 2020-06-23 2023-12-27 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. METHOD AND DEVICE FOR INACTIVATING AN ALLERGEN
EP4169932A4 (en) * 2020-06-23 2024-01-03 Panasonic Ip Man Co Ltd METHOD FOR CLEAVING A DISULFIDE BOND IN A PROTEIN AND DEVICE FOR CLEAVING A DISULFIDE BOND IN A PROTEIN

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3803326A (en) * 1972-02-29 1974-04-09 Patent Technology Bread process and additive composition therefor
NL7302329A (ja) * 1972-02-29 1973-08-31
US4405648A (en) * 1979-08-24 1983-09-20 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Method for producing bread
US4673633A (en) * 1984-06-28 1987-06-16 Cooperbiomedical, Inc. Method of determining cystic fibrosis ciliostatic factor
US5028419A (en) * 1984-11-26 1991-07-02 Repligen Corporation Use of thioredoxin, thioredoxin-derived, or thioredoxin-like dithiol peptides in hair care preparations
US4771036A (en) * 1986-02-10 1988-09-13 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method and ophthalmic composition for the prevention and reversal of cataracts
US5952034A (en) * 1991-10-12 1999-09-14 The Regents Of The University Of California Increasing the digestibility of food proteins by thioredoxin reduction
US5792506A (en) * 1991-10-12 1998-08-11 The Regents Of The University Of California Neutralization of food allergens by thioredoxin
HUT69780A (en) * 1991-10-12 1995-09-28 Univ California Use of thiol redox proteins for reducing disulfide bonds

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000103743A (ja) * 1998-09-29 2000-04-11 Jiyunji Yodoi チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類を含有する食品、化粧品及び医薬
JP2008546670A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
WO2011033994A1 (ja) * 2009-09-15 2011-03-24 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 米粉パン類生地の製パン性向上方法
US9049869B2 (en) 2009-09-15 2015-06-09 Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization Method for improving bread-making properties of rice flour bread dough

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