JPH0749377B2 - 機能的特異性抗体 - Google Patents

機能的特異性抗体

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JPH0749377B2
JPH0749377B2 JP1046393A JP4639389A JPH0749377B2 JP H0749377 B2 JPH0749377 B2 JP H0749377B2 JP 1046393 A JP1046393 A JP 1046393A JP 4639389 A JP4639389 A JP 4639389A JP H0749377 B2 JPH0749377 B2 JP H0749377B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体内で標的組織に供給される抗体に結合し
た診断または療法剤の量を非標的組織に供給される前記
の薬剤の量に比較して相対的に増加させる方法に関す
る。１種類以上の（腫瘍特異的モノクローン性抗体に結
合した）診断または療法剤の癌部位への特異的な供給を
促進し、他方交差反応性の正常な組織へ結合する投与さ
れた薬剤の比率を低下させる方法を提供する。
〔従来の技術〕
1901年に抗体が魔法の弾丸として記載され、それらの特
異性が、根絶することが望ましい細胞群の直接治療に用
い得ることが示唆された。この見通しが発表されてから
の数十年は、腫瘍細胞のような定義された細胞集団に絶
対的に特異的な抗原に対する抗体を産生させる試みが繰
り返えされてきた。正常組織よりも腫瘍細胞との反応性
が高いモノクローン性抗体が産生されたが、腫瘍細胞に
絶対的に特異的であるものは報告されていない。抗イデ
ィオタイプ抗体がそれに向けられるＢ細胞リンパ腫に関
する抗原の場合は例外とすることができるが、抗体によ
って導かれる療法の標的として好適な腫瘍特異性抗原は
発見されていない。その代わりに、腫瘍上での発現が定
量的に増大しそして／または正常組織での発現が限定さ
れそして／または減少した抗原が、診断および療法用の
抗体を発生させるのに用いられてきた。正常の交差反応
性組織が活発でありまたは複製可能である（例えば、正
常なＴ細胞）ときには、非標的交差反応性組織への診断
または治療剤の供給に関する問題は余り重要ではない。
しかしながら、療法が更に強力になれば、交差反応性が
安全性を一層犠牲にすることになり、投与し得る最大許
容投与量は低下する。正常の交差反応性組織への診断剤
の供給は誤診を生じさせることがある。
〔発明が解決しようとする課題〕
腫瘍のような標的組織に対する特異性が改良され且つ非
標的（例えば、正常な）組織との交差反応性が減少した
抗体が必要とされている。これは、絶対的に腫瘍特異性
の抗原および抗体の同定により、または全体として腫瘍
特異性の抗体を産生させる改良された免疫化技術によっ
て達成されるであろう。しかしながら、このような標的
腫瘍特異性抗原は存在せず、そして所望な程度の特異性
を有する抗体も単離されることはない可能性がある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、哺乳類またはヒト宿主中の標的部位に１種類
以上の診断または治療剤を供給する方法であって、前記
の宿主に２種類以上の異なる抗体種であってそれぞれが
前記の薬剤の１種類と結合しているものを投与し、ここ
で前記の抗体種のそれぞれが標的部位上の異なるエピト
ープと反応性であり且つそれぞれの抗体種に対する交差
反応性のパターンが重複性しない、ことを特徴とする方
法を提供する。抗体種のそれぞれには、診断剤が結合さ
れていてもよい。あるいは、抗体種には、同じまたは異
なる療法剤（例えば、放射性同位体、毒素または薬物）
が結合されていてもよい。本発明の１つの態様では、そ
れぞれの抗体種は癌細胞と反応性のモノクローナル抗体
である。
ヒトまたは哺乳類宿主中の標的組織上への２種類以上の
免疫接合体の累加的蓄積を生じさせ非標的組織上への免
疫接合体の累加的蓄積を最少にする方法であって、 （ａ）第一の抗体種を含んで成る第一の免疫接合体を宿
主に投与し、そして （ｂ）１種類以上の追加の免疫接合体であってそれぞれ
が異なる抗体種を含んで成るものを宿主に投与すること
を含んで成り、ここで抗体種のそれぞれが標的組織上の
異なるエピトープと反応しそして異なる抗体種が交差反
応性の非重複パターンを有する、ことを特徴とする方法
が、本発明によって提供される。
本発明は、ヒトまたは哺乳類宿主に２種類以上の異なる
療法剤を投与して標的細胞を根絶する方法を提供し、こ
の方法においては、それぞれの療法剤をその最大許容投
与量またはその付近の量で宿主に投与し、それぞれの異
なる療法剤は異なる抗体種に結合させることによって非
標的組織に対する毒性を最少限にし、それぞれの抗体種
が標的細胞上の異なるエピトープと反応し、そしてそれ
ぞれの抗体種に対する交差反応性のパターンが重複せ
ず、こうして最大許容投与量またはその付近の量の生成
する免疫接合体のそれぞれが宿主に投与される。
本発明の非重複性交差反応性を有する抗体種を用いるこ
とによって、（診断剤の場合には）誤診の可能性が減少
し、（治療剤の場合には）非標的組織に対する毒性が減
少するという利益も提供される。
本発明は、ヒトまたは哺乳類宿主中の所望の標的部位に
診断剤または療法剤を供給する方法を提供する。これら
の薬剤は、標的部位上の（同じまたは異なる抗原上の）
異なるエピトープと反応するが交差反応性の非重複パタ
ーンを有する２種類以上の異なる抗体種に結合される。
エピトープは抗原決定基であり所与の抗原は２種類以上
のエピトープを有することができる。例えば、異なる抗
体は（それに結合した薬剤と共に）所望の標的部位に累
加的に蓄積し、他方、それぞれの種類の交差反応性の非
標的組織には唯１種類の抗体種が蓄積する。したがっ
て、非標的組織上での免疫接合体の２種類以上の累加的
蓄積は最少にされるかまたはなくなる、それ故、投与さ
れた薬剤の比率は、生体内では非標的組織に較べて標的
部位上に局在する。診断剤の場合には、標的部位を一層
明瞭に検出することができ、または非標的部位での薬剤
の比較的低い「バックグラウンド」に対して映像化する
ことができ、その結果、誤診の可能性を低下させること
ができる。治療剤については、非標的部位に供給される
薬剤の量が比較的低いので、正常組織に対する毒性は減
少する。
上記のように、所望な標的部位に対して100％の特異性
を有する抗体は、この目的に向けられた著しい努力にも
拘らず単離されていない。唯一の例外は抗イディオタイ
プ抗体であるが、この抗体の如何なるものも１個の固体
のみのＢリンパ腫細胞に対して特異的であるので、それ
ぞれの新たな患者に対して別個に発生させ且つ単離しな
ければならない。本発明によれば、増加した標的特異性
を有する単一抗体は単離されなくても、標的部位に特異
的であるが正常組織に対しては非重複性の交差反応性を
有する２種類以上の抗体を用いることによって、非標的
部位に比べて標的部位に局在する抗体に結合する（１又
は複数の）薬剤の相対量を増加させる方法が提供され
る。
本発明によれば、抗体種のそれぞれに対する交差反応性
のパターンが非重複性である（又は、重複しない）とい
う記載は、１個の抗体種が結合する非標的組織のリスト
が第二の抗体種が結合する非標的組織のリストとは実質
的に異なることを意味する。第三の抗体種を同一患者に
投与する場合には、第一および第二の抗体種の両方とも
実質的に異なる交差反応性のパターンを有する抗体が用
いられる。交差反応性のパターンは、本発明の方法の所
望の結果を生じるのに十分異なっているべきであり、す
なわち非標的組織上では薬剤を相対的に少なくして（診
断剤の場合には）背景を減少させ、そして（療法剤の場
合には）正常組織に対する毒性を減少させるようにすべ
きである。異なる抗体種に対する交差反応性のパターン
が極めて少数の同じ非標的組織を有する幾つかの場合に
も、所望な結果を達成することができる。例えば、２種
類の抗体が共に患者の健康に本質的ではない非標的細胞
の種類（例えば、正常なＴ細胞）と交差反応して、本質
的でない細胞タイプに対するこれらの抗体に結合した療
法剤が累加的に蓄積されるにも拘らず患者に対する毒性
を所望な程度まで減少させるようにすることができる。
しかしながら、同じ非標的組織のいずれとも交差反応し
ない抗体種を選択することが好ましい。
本発明の方法は、一般的には用いられる２種類以上の抗
体の固定から始まる。上記のように、所望の標的部位に
結合するが非標的部位に対する重複性交差反応性は無視
し得るかまたはまったく無い抗体種を選択して使用す
る。
本発明に用いられる抗体種は、完全な抗体種、それらの
フラグメントまたはそれらと機能的に同等なもの、ある
いはそれらの遺伝子工学的変形体であってもよい。抗体
フラグメントの例は、従来の方法によって産生されるＦ
（ab′）2,Fab′,FabおよびFvである。ポリクローナル
抗体を本発明に用いてもよいが、モノクローナル抗体
（MAb）が好ましい。本発明の一つの態様では、MAbはヒ
トの腫瘍に関連した抗原に向けられる。生体内で特異的
な標的部位（例えば、癌細胞）に向けられた多くのモノ
クローナル抗体が開発されている。このようなMAbの例
は抗TACまたは他のインターロイキン−２レセプター抗
体、250キロダルトンのヒト黒色腫に関連したプロテオ
グリカンに対する9.2.27およびNR−ML−05、37〜40キロ
ダルトンのパンカルシノーマ（pancarcinoma）糖タンパ
ク質に対するNR−LU−10およびいまだに同定されていな
い癌関連の抗原に対するOVB3である。
コーラー（Kohler）とミルシュタイン（Milstein）の方
法（Eur.J.Immunol.,６,292（1976））のような既知の
方法を用いて、所望の抗原と反応する他のモノクローン
性抗体を産生することができる。腫瘍関連抗原に対する
モノクローナル抗体は、幾つかの方法によって製造され
ている。一つの方法は米国特許第4,172,124号明細書に
記載されており、もう一つの異なる方法は「腫瘍関連抗
原および糖タンパク質に対するIgGクラスのモノクロー
ン性抗体の誘引を改良する方法」という標題の同時係属
米国特許出願連続番号第773,340号明細書に記載されて
いる。
特定の標的部位に向けられる複数のMAbについて交差反
応性のパターンを分析して、所定の診断または治療目的
に用いることができる非重複性の交差反応性を有する２
種類以上の標的特異性MAbの組を同定する。産生される
抗体は幾つかの方法によってスクリーニングすることが
できる。腫瘍との反応性および正常組織との交差反応性
を決定するのに用いられる試験管内試験法は免疫組織化
学的分析であるのが有利である。免疫組織化学的方法に
よって、問題の抗体が結合する組織（正常および腫瘍組
織の両方）は、この組織を抗体に暴露した後、洗浄によ
り未結合抗体を除去し、抗体の存在を検出することによ
って同定される。固定が特定の抗原を破壊することがあ
り、且つ様々な程度の抗原保存をもたらすことがある固
定の時期の未確定の差異と関連するので、クリオスタッ
ト断片（すなわち、下記の実施例１に記載の方法によっ
て製造した凍結組織断片）が好ましい。しかしながら、
特定の抗原が固定によって保存されることが知られてい
れば、固定した組織を試験管内の試験法に用いることも
できる。
試験管内の免疫組織化学的分析を行う方法が知られてい
る。例えば、セリアニ（Ceriani）らのCancer Researc
h,47,532−540、１月15日、1987年を参照されたい。も
う一つの好適な試験管内分析法は、下記の実施例１に示
される。例えば、所望の標的部位と反応性の抗体の正常
な組織の交差反応性をこれらの方法で評価することがで
き、２種類以上の好適な抗体を選択して機能的特異性抗
体として用いる。
本発明に用いられる「機能的特異性抗体」という用語
は、１つの特定の標的部位上の異なるエピトープと反応
し且つ正常な組織と交差反応性の非重複パターンを有す
る２種類以上の異なる抗体を指す。２種類以上の機能的
特異性抗体を診断または治療法に用いると、唯一の抗体
または上記のように正常な組織に対する交差反応性の同
様なパターンを有する複数の抗体からなる診断剤または
療法剤に比較して標的組織に対する特異性が増加する。
機能的特異性抗体は（１つ又は複数の）同じ腫瘍と反応
するがこれらの腫瘍中の同じ細胞の総てと反応する必要
はない。例えば、２個の抗体が同じ腫瘍中で腫瘍細胞の
別個の群と反応すれば、これらはその腫瘍に累加的に放
射線を送ることができる。しかしながら、機能的特異性
抗体は、腫瘍細胞の重複する集団に結合するのが更に一
般的である。
しかしながら、機能的特異性抗体は同一の正常な組織の
すべてに結合してはならない。正常組織に対する結合の
重複が少なくなれば、抗体対は一層機能的特異性にな
る。重複が幾分かでも欠落すれば単一の抗体のみに比較
して腫瘍特異性が改良されるが、完全に機能的特異性抗
体の対は重複が全く無いかまたは非本質的な期間または
細胞のタイプでのみ重複するのが好ましい。機能的特異
性抗体の例には、NR−LU−10（TFS−２とも表わされ
る）およびNR−LU−11（TFS−４とも表わされる）で代
表されるモノクローナール抗体であって、共に小細胞肺
癌とと反応するが、しかし、下記の実施例１に記載のよ
うに、それぞれ単独で数種類の他の正常組織と反応する
が両方が交差反応するのは甲状腺とのみである。もう一
つの例はNR−ML−05および抗−GD3抗体であって、両方
とも黒色腫と反応するが、しかし、それぞれ単独に数種
類の正常組織と交差反応性を示すが両方とも通常は既知
の正常組織とは交差反応しないものである。
本発明の一つの態様では、同じ診断剤が異なる抗体種の
それぞれに結合する。99mTc,111In,133I,131I,76Brおよ
び18Fのような放射性同位体に限定されず核磁気共鳴像
形成コントロール剤等のような如何なる好適な既知の診
断剤を用いてもよい。放射性核種は、一般的には例えば
キレートのような安定な錯体の形態となる。このような
診断剤の生体内での生物学的分布を、適当な標準的外部
（すなわち非侵襲的）手段によって分析することができ
る。好ましい診断剤は放射性核種金属99mTcである。99m
Tcを標識した抗体を投与した後、放射性核種金属の生物
学的分布を既知の方法を用いてγ−カメラで患者を走査
することによって検出することができる。標的部位にお
ける99mTc診断剤の蓄積はこのようにして容易に映像化
される。
本発明のもう一つの態様では、それぞれの抗体種には、
同じまたは異なる療法剤が結合している。療法上有効な
放射性核種、薬物、毒素および生物学的応答改質剤（bi
ological response modifier）に限定されず、如何なる
好適な既知の療法剤を用いてもよい。薬剤の選択は、処
置される病気の種類（すなわち標的細胞の種類）によっ
て変わる。このような放射性同位体には、特に188Re,
186Re,203Pb,212Pb,212Bi,109Pd,64Cu,67Cu,131I,211A
t,97Ru,105Rh,198Auおよび199Agがある。放射性核種
は、一般的にはキレートのような安定な錯体の形態をし
ており、既知の方法によって調製することができる。
用いられる毒素の例は、リシン、アブリン、ジフテリア
毒素、シュドモナス（Pseudomonas）エキソトキシン
Ａ、リボソーム不活性化タンパク質（ribosomal inacti
vating protein）およびマイコトキシン、例えばトリコ
テセンである。トリコテセンは不完全菌類（fungi impe
rfecti）の土壌菌によって産生されるかまたはバカルス
・メガポタミカ（Baccharus megapotamica）〔バンブル
ク・ジェイ・アール（Bamburg,J.R.）、Proc.Molec.Sub
cell Bio.,８,41−110,1983、ジャービス（Jarvis）と
マゾーラ（Mazzola）、Acc.Chem.Res.15,338−395,198
2〕から単離されるマイコトキシンの１種類である。遺
伝子工学またはタンパク質工学技法によって産生される
ような療法上有効な改質された毒素またはそれらのフラ
グメントを用いてもよい。
患者の病気の性状によって如何なる好適な療法薬を用い
てもよい。各種の形態の癌を治療するのに用いられてき
た多くの療法薬の中には、Ｌ−フェニルアラニンナイト
ロジェンマスタードおよびシクロホスファミドのような
ナイトロジェンマスタード、シスジアミノジクロロ白金
のような挿入剤（intercalating agent）、５−フルオ
ロウラシルのような代謝拮抗剤、ビンクリスチンのよう
なビンカアルカロイド、およびアドリアマイシンおよび
ブレオマイシンのような抗生物質がある。
ある種の抗癌剤や放射性治療剤の細胞毒作用を増強する
ことが知られている薬物を用いることもできる。このよ
うな薬物は、一般的には増感剤（sensitizer）と呼ばれ
ている。増感性薬物は、例えば一つの抗体種に結合して
いてもよく、そして他の抗体種に結合した放射性核種ま
たは適当な抗癌剤に結合してもよい。
放射線の治療効果を増すことが知られている増感剤に
は、メトロニダゾール、ミソニダゾール、ある種の２−
スルファミル−６−ニトロ安息香酸誘導体、３−ニトロ
ピラジンの2,6−二置換誘導体およびある種のイソイン
ドレジオン化合物がある（米国特許第4,647,588号、第
4,654,369号、第4,690,659号および第4,494,547号明細
書を参照されたい）。各種の療法薬（例えば、抗癌剤）
の活性を増強する増感剤の例は、ブチオニンスルホキシ
イミン、ベラパミルのようなカルシウム・チャンネル・
ブロッカー（calcium channel blocker）およびジルチ
アゼムである〔米国特許第4,628,047号明細書および
「腫瘍学の重要な進歩、1986年（Important Advances i
n Oncology 1986）」リッピンコット・カンパニー（J.
B.Lippincott Co.）、フィラデルフィア、146〜157頁、
1986年を参照されたい〕。当業者は、増感剤と療法剤と
の適当な組み合わせを特定することができるであろう。
生物学的応答改質剤の例には、インターフェロン（アル
ファ、ベーターおよびガンマー）、腫瘍壊死因子、リン
フォトキシンおよびインターロイキン（IL−1,−2,−3,
−4,−５および−６）がある。
薬剤を抗体に結合させる方法は、薬剤の化学的構造によ
って異なる。抗体は各種の官能基、例えばカルボン酸
（COOH）または遊離アミン（−NH2）基を含むタンパク
質であって、これらの官能基は薬剤分子上の好適な官能
基と反応させて薬剤を抗体に結合させるのに用いられ
る。また、抗体および／または薬剤を誘導体にして追加
の反応性官能基に暴露するかまたは結合させてもよい。
誘導体形成は、ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce
Chemical Company）、ロックフォード、イリノイから
発売されているような多数のリンカー分子のいずれかを
結合させることによってもよい（ピアス1986−87ジェネ
ラル・カタログ（Pierce 1986−87 General Catalog、3
13〜354頁を参照されたい〕。特定の薬剤上の基と反応
する１個の官能基と抗体と反応するもう一つの基を有す
る二官能性リンカーを用いて、所望の免疫接合体を形成
させてもよい。また、誘導体形成は抗体の化学的処理、
例えば糖タンパク質抗体の糖残基を過ヨウ素酸によって
グリコール開裂して遊離のアルデヒド基を生成させるこ
とによってもよい。抗体上の遊離のアルデヒド基は、薬
剤上の遊離アミンまたはヒドラジン基と反応して、薬剤
を抗体に結合させることができる（米国特許第4,671,95
8号明細書を参照されたい）。抗体または抗体フラグメ
ント上に遊離のスルフヒドリル基を生成させる方法も知
られている（米国特許第4,659,839号明細書を参照され
たい）。放射性核種金属キレート、毒素および薬物のよ
うな各種の化合物を抗体のようなタンパク質に結合する
ための多くの手法およびリンカー分子が知られている。
例えば、欧州特許出願公開第188,256号明細書、米国特
許第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第
4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号および第
4,590,071号明細書、およびボーリングハウス（Borling
haus）ら、Cancer Research,47,4071−4075、1987年８
月１日を参照されたい。
ある種の療法化合物を抗体に結合する幾つかの方法に関
連する問題点は、化合物（例えば、薬剤、毒素等）が抗
体に結合すると化合物の生物活性が減少することがある
ことである。療法剤が安定な共有結合によって抗体に接
合されると、例えば、標的部位において薬物がその遊離
で最大活性の形態で放出されることは期待されなくな
る。それ故、薬物が抗体から放出されなければ薬物の所
望な活性が減少するような場合には、標的部位の付近で
開裂可能な結合を有する免疫接合体を用いることができ
る。結合を開裂して抗体から薬物を放出することは、免
疫接合体を標的細胞内部または標的部位の付近において
酵素活性または条件に暴露することによって促進するこ
とができる。標的部位が腫瘍であるときには、腫瘍部位
に存在する条件下で（例えば、腫瘍に関連する酵素また
は酸性pHに暴露するとき）開裂可能なリンカーを用いる
ことができる。
多数の様々な開裂可能なリンカーは既に報告されてい
る。例えば、米国特許第4,618,492号、第4,542,225号お
よび第4,625,014号明細書を参照されたい。これらのリ
ンカー基から薬剤を放出する機構としては、光に不安定
な結合の放射性照射および酸触媒加水分解によるものが
ある。1987年12月２日出願の米国特許出願連続番号第__
__号明細書（代理人事件整理番号6922.476）であって、
「本来の形態における薬剤の供給と放出のための開裂可
能な免疫接合体」という標題のものには、特定の化学構
造のリンカーであって結合が生体内で開裂して化合物
（放射性療法剤、薬物、毒素等）をその本来の形態で放
出するものからなる免疫接合体が記載されている。この
リンカーは中程度の酸性pHで開裂され易く、標的細胞の
細胞質への輸送中に開裂されることによって標的細胞内
部に生物学的に活性な化合物を放出するものと思われ
る。米国特許第4,671,958号明細書には、患者の補体系
のタンパク質分解酵素によって生体内で標的部位におい
て開裂されるリンカーを含む免疫接合体が記載されてい
る。多数の放射性診断化合物、放射性療法化合物、薬
物、毒素および他の薬剤の抗体への結合について報告さ
れた多数の方法の観点では、当業者は所定の薬剤を抗体
に結合する好適な方法を決定することができるであろ
う。
前述の方法で調製した抗体−薬剤接合体は、診断上また
は治療上有効な量でヒトまたは哺乳類宿主に投与され
る。抗体は標的細胞上のレセプターの数およびレセプタ
ーに対する親和性に関して多様であるから、この量は用
いられる抗体のような因子によって変化する。例えば、
毒素および薬物はそれらの強さに関連して変動するの
で、投与量は用いられる薬剤によって変化する。特定の
免疫接合体についての最適有効投与量を決定する方法
は、当業者には明らかであろう。例えば、細胞毒性剤の
ような療法剤の最大許容投与量を決定する方法も知られ
ている。勿論、生体内で薬剤を運搬するには２種類以上
の異なる抗体種が用いられるので、総投与量は患者に投
与される総ての異なる抗体種に就いての薬剤の和であ
る。
現在用いられている多くの治療法について、正常組織へ
の療法剤の作用によって引き起こされる毒性は投与量限
定因子となっている。例えば、標的細胞（例えば、癌細
胞）の根絶に更に有効と考えられる投与量であっても、
この毒性によって引き起こされる副作用のために安全に
投与することは出来なかった。本発明の方法の利点の一
つは、非重複交差反応性のために、（複数の）治療剤
が、交差反応性の性状組織上に累加的に蓄積されること
なく、標的細胞上に累加的に蓄積されることである。し
たがって、総投与量を増加して、望ましくない副作用を
増加することなく治療効果を改良することができる。し
たがって、本発明は、単一の抗体または重複交差反応性
を有する抗体の混合物を用いる他の方法と比較して、癌
のような病気を治療するための改良法を提供する。
診断的方法においては、投与量を従来の投与量よりも多
く増加せずに良好な結果を得ることができる。例えば、
診断剤は非標的部位に非累加的に結合するため標的およ
び非標的組織のコントラストが一層大きくなるので、標
的部位を一層正確且つ効果的にイメージングすることが
できる。第二に、幾つかの転移は、別の抗原とは異る抗
原を発現することがある。これによって、異るの転移を
優先的に標的とすることができる。診断用造影剤を連続
して投与することにより、蓄積の部位を真の陽性として
確かめることができる。
治療的方法においては、それぞれの正常組織は免疫接合
体の１個のみを結合し、異なる治療剤の両方の累加的作
用に暴露されることはないので、２種類以上の抗体種で
あってそれぞれが別の治療剤を結合しているものを最大
許容投与量で患者に投与することができる。
本発明のもう一つの態様では、抗体が共有結合によって
結合してもよい。一つの方法は、一つの抗体種のFab′
フラグメントをFabまたは他のFab′に結合することであ
る。ハイブリッドＦ（ab′）２は標的部位には二価の結
合を有するが、任意の交差反応性抗原には一価の結合し
か持たない。診断用または療法用物質に接合したハイブ
リッド抗体を投与した後、未接合の本来の二価の抗体
を、一価の結合力しか有しておらずそれ故親和性が低い
正常組織からのハイブリッド抗体の除去のために用いる
ことができるであろう。
本発明は、２種類以上の抗体種を含んで成る診断または
治療用のキットであって、抗体種のそれぞれが標的部位
上の異なるエピトープと反応し且つ前記抗体種のそれぞ
れについての交差反応性のパターンが非重複性であるも
のも提供する。例えば、特定のキットは、特定の癌部位
のような所望の標的部位と反応する機能的特異性抗体を
含む。キット中の抗体種は所望の標的部位にしたがって
異り、例えば、標的細胞が黒色腫細胞、SCLC細胞等であ
ることによって異る。抗体の意図する用途に依存して、
診断または療法剤を上記の様に抗体に結合させることが
できる。キット中の抗体は、既に薬剤を結合させている
ものであってもよい。また、使用者（例えば、医療に携
わる者）が、使用の前に所望な薬剤を抗体に結合させて
もよい。
本発明の一つの態様では、キット中のそれぞれの抗体種
には、キレート化合物が結合される。キレート化合物
は、診断上または治療上有効な放射性核種金属をキレー
ト化することができる。本発明の一つのキットは、NR−
LU−10およびNR−LU−11と命名された２種類のモノクロ
ーン性抗体またはそれらのフラグメントであって、癌細
胞に結合するものを含んで成。
下記の実施例は、例示のためのものであり、制限のため
のものではない。
実施例１ 小細胞肺癌に対する２個の抗体 小細胞肺癌と反応する３種類の抗体（KS 1/4,TFS−２、
およびTFS−４）が、近年報告された。バルキ・エヌ・
エム（Varki,N.M.）、ライズフェルド・アール・エイ
（Reisfeld,R.A.）およびウォーカー・エル・イー（Wal
ker,L.E.）、「モノクローン性抗体によって画定される
ヒト肺腺癌に関する抗原」、Cancer Res.44,681−87（1
984）、オカベ・ティー（Okabe T.）、カイズ・ティー
（Kaizu T.）、フジサワ・エム（Fujisawa M.）ら、
「肺の小細胞癌の表面抗原に対するモノクローン性抗
体」、Cancer Res.44,5273−78（1984）を参照された
い。免疫組織化学による正常組織について広汎に評価を
行ったところ、TFS−２及びKS 1/4は正常な甲状腺、膵
臓、肝管および上皮組織に対して交差反応を示すが、TF
S−４は正常な神経組織、副腎、循環性リンパ球および
甲状腺の副集団に結合する。両方共、小細胞肺癌細胞ラ
インに強力且つ累加的に結合する。試験管内試験法は次
の通りである。
要約すれば、分析法は、ネズミのモノクローナル抗体を
異なる細胞型の表面に発現した抗原と反応させることを
含んで成る。西洋ワサビペルオキシダーゼと接合したウ
サギ−抗マウス抗体を次にネズミ抗体と反応せしめる。
ペルオキシダーゼ酵素は、3,3′−ジアミノベンジジン
（DAB）の存在下で過酸化水素を還元して水とし、陽性
反応生成物は組織上に褐色斑として示される。ワサビダ
イコンペルオキシダーゼに接合した適当な第二の抗体が
用いられる場合には、ネズミ由来のものではないモノク
ローナル抗体を試験法に用いてもよい。
注目すべき一つの事実は、組織によっては内因性ペルオ
キシダーゼ斑点を示すことがあることである。一つの組
織スライドを、DABで染色して内因性斑の対照としての
み用いるべきである。ヘマトキシリン／エオシン（H/
E）染色切片は、異なる細胞型の同定を助ける。適当な
陰性対照タンパク質を、抗体について試験した一連の切
片のそれぞれの組について試験する。
スライドを、全染色法の間中、一定の水準に保つ。試薬
は全組織切片を被覆するようにし、スライドのいずれの
未満にもたまらないようにすべきである。一定の水準に
ないスライド及び染色の際に組織の一部分に溜まる試薬
は不正確な結果を生じさせる。染色法のそれぞれの段階
に特定の時間が割り当てられる。それぞれの染色段階の
時期に注意すべきである。染色の際に組織を擦り落とし
てしまわないように注意すべきである。凍結切片は脆い
ことがあるので、丁寧且つ注意して取り扱うべきであ
る。
試薬3,3′−ジアミノベンジジン（DAB）を前もって調製
しておいてもよい。DABは5.0gの量で利用可能である。D
AB製剤は薄膜状の流動フードの下で使い捨ての医療用手
袋を着用して行うべきである。5.0gのDABに20.0mlのHPL
C級の水を加え、DABを溶解する。DAB溶液の200μをそ
れぞれのガラスボトルに移して総ての溶液を使用し切る
ようにし、ボトルを冷凍ボックスに入れる。蓋をとった
ボトルを数層のワイパーで被覆する。DAB溶液を２日間
ボトル中で凍結乾燥する。次いで、ボトルを凍結乾燥機
から取り出して、蓋をして、使用するまで−70℃で凍結
する。
凍結乾燥したDABは、−70℃の冷凍機からDABの１瓶を取
り出して、ベンチトップで室温まで暖めることによって
再構成する。次に、それぞれモノクローナル抗体の分析
は次のようにして行う。
フード中で：カルシウム／マグネシウムを含有しない5.
0mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）（pH7.0）を注射針と注
射筒を用いて瓶に加える。注射筒を介して溶液を上下さ
せて、DABを溶解する。0.45ミクロンフィルターを用い
て全DAB溶液を濾過して、95mlのPBSに入れる。DABは免
疫ペルオキシダーゼ試験毎に新たに作成して、使用の30
分間以上前に再構成すべきではない。0.03％過酸化水素
はDABを活性化する。
115mlの0.45ミクロンフィルターを通して、約15mlのニ
ワトリの血清を濾過する。ニワトリ血清は、凍結切片の
染色に用いるために毎日濾過しなければならない。PBS
中ニワトリ血清の５％溶液（PBS−CS）を作成する。試
験抗体を適当に希釈する（５μg/mlがほとんどの試験お
よびコントロール抗体の適当な希釈物である）。PBS−C
Sおよび４％ヒト血清型AB中でウサギおよび抗マウス（R
aM）接合体1/50も調製する。超遠心機で溶液を４℃、10
0,000xgで１時間回転させる。RaM接合体は毎回自転させ
なければならないことに留意されたい。1/50作業希釈液
を作成するのに用いられない接合体は廃棄すべきであ
る。節約してはならない。一次試験抗体を回転させるこ
とが常に必要であるとは限らない（例えば、上澄液はそ
のまま使用してもよい）。試験抗体を、前もってガラス
スライド上に固定しておいた各種の正常なヒト組織の試
料と接触させる。スライドに結合した新たな凍結組織標
本の調製法は、各種温度の冷凍チャンバーとミクロトー
ム〔クリオスタット（Cryostat）から得られる〕を用い
て、次の通りである。
1. 凍結組織/OCT鋳型を−20℃で素早く凍結する液状OC
Tで切断チャックに固定する。
2. チャックをクリオーミクロトームチャックホルダー
に取り付ける。
3. チャックを一定方向に配置して適正な切片が作成さ
れるようにする。
4. 組織を４〜６ミクロンに切断する。
5. 切片を乾燥ガラスミクロスライド（予め水性の５％
ゼラチン溶液を下塗しておいたもの）に固定する。
6. 組織切片を有するガラスミクロスライドを、次に冷
アセトン（予め−20℃に冷却したもの）中で10分間固定
する。
7. 固定した組織スライドを次に37℃インキュベーター
中に移して、アセトンを完全に蒸発させる。
直ちに使用しないときには、組織担持スライドを調製し
て次のようにして保管してもよい。
1. （乾燥）アセトン固定スライドをプラスチックミク
ロスライドホルダーに入れて、蓋を取り替える。
2. 箱をアルミニウム箔で包む。
3. アルミニウム箔で包んでボックスを２〜３個の乾燥
剤の束を有するプラスチック製のジッパーでロックした
バッグに入れて、密閉して空気スペースを最少限にす
る。
4. −70℃のフリーザーで保存する。
5. 使用の前に、アセトンで固定したスライドを室温に
する。スライドは完全に乾燥すべきである。スライドを
PBSで10分間再水和する。
6. 試験抗体を、次のようにして組織担持スライドと接
触させる。
４％のプールした正常ウサギ血清を含む５％ニワトリ血
清（PBS−CS）を有する100μのPSBと共に、スライド
を20分間インキュベーションして、非特異的結合をブロ
ックする。500ml噴出ボトルを用いてPBSでスライドを洗
浄する。100μの試験抗体（未希釈物または適当に希
釈したもの）と共に切片をインキュベーションして、抗
原の発現を評価し、または100μのPBS−CSで内因性の
ネズミ免疫グロブリンの顕在化のみを行う。スライドを
PBSで洗浄する。大きなビーカー中で、２個の新鮮なPBS
洗浄液中でそれぞれ５および10分間攪拌する。それぞれ
のスライドを、PBS−CSと４％ヒト血清中で1/50に希釈
した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ram−HRPO）に接合
した100μのウサギ−抗マウス免疫グロブリンと共に3
0分間インキュベーションする。切片をPBSで洗浄して、
新鮮な５分PBS洗浄中で３回攪拌する。
スライドを、0.03％過酸化水素を含有するDAB0.5mg/ml
中で纏めて10分間インキュベーションする。PBS槽中で
洗浄する。スライドをマイヤ・ヘマトキシリンで１〜1.
5分間対比染色する。漂白に用いられる飽和炭酸リチウ
ムの水性溶液にスライドを浸漬する。切片を、それぞれ
30％、60％、75％の200゜エタノール、200゜エタノー
ル、およびキシレン中で５分間インキュベーションして
脱水する。切片に少量のペルマウント（Permount）と１
号ミクロカバーグラスを載せる。スライドを保存して顕
微鏡下で観察することができ、または更に検索のために
保存してもよい。
上記の様に、陽性反応は褐色反応生成物によって示され
る。陰性反応スライドは青く見える。スライド染色した
細胞の比率、染色強度および染色の均一性について採点
する。特定の抗体と反応する組織のタイプを、これによ
って確認する。
このようにして、３種類の抗体に対する交差反応性の上
記のパターンを決定した。異なる方法を用いてSHITE−
１と表わされる小細胞肺癌（SCLC）細胞ラインに対する
これらの抗体の反応性を試験した。TSF−４およびKS−1
4は異なる抗原と反応する。それぞれは、小細胞肺癌と
反応する。
抗体を、細胞と共に４℃で１時間インキュベーションし
て、洗浄し、次いでヤギ抗マウスFITCを試験混合物に加
えた。結果を第１図に示す。陰影部分は所定の螢光強度
（Ｘ軸）に対する細胞の数（Ｙ軸）を表わし、フローサ
イトミトリー法によって決定したものである。KS−14と
TSF−２は同一の輪郭を示したもので、KS−14を「累
加」実験に用いた。TSF−４は独特な輪郭を示したが、K
S−14に加えたときには、最高螢光チャンネルに蓄積す
る多数の細胞によって示されるように明瞭な累加結合が
あった。SCLCと反応しない対照抗体であるP3を加える
と、このような「相乗作用」は起きなかった。
上記の試験管内試験法が示すところによれば、抗体TSF
−４は、TSF−２またはKS−1/4のいずれとも本発明によ
る機能的特異性抗体として用いられる。
実施例2. ２種類の抗体からの免疫接合体 ２種類の抗体種TFS−２およびTFS−４を、それぞれ適当
なリンカー分子を介して抗癌剤ドキソルビシンに共有結
合によって結合せしめる。米国特許第4,680,388号明細
書に記載のリンカー分子および方法を用いることができ
る。生成する免疫接合体を、ヒトに対する最大許容投与
量（MTD）について別々に試験する。これは、一回また
は複数回の一定投与量を患者の群（通常は３〜５名）に
投与して、毒性を観察し、限定的な毒性が得られる水準
より低い投与水準としてMTDを決定することによって行
われる。ドキソルビシン自体は、通常は550mg/m2を超過
する累積投与では、可逆性骨髄低下、脱毛症、粘膜表面
炎および不可逆性心筋症を起こす。これが抗体に結合し
て腫瘍およびおそらく正常交差反応性組織に供給される
ときには、その毒性は異なり且つ交差反応性に依存する
ことが期待される。例えば、TFS−４はドキソルビシン
に結合すると、ある投与量で神経毒性を生じることがあ
り、TFS−２ドキソルビシンは甲状腺または膵臓毒性を
生じることがある。したがって、投与量は変わるであろ
う。
これらの免疫接合体は両方とも、SCLCに罹っている患者
に、それらのMTD付近の投与量で投与される。これらの
免疫接合体は腫瘍細胞に累加的に蓄積し、本質的な正常
組織に対しては毒性が重複しないと予想される。
実施例３ 小細胞肺癌に対して２種類の抗体の免疫接合
体を用いる細胞毒性の強化 ブチオニンスルホキシイミン（BSO）はγ−グルタミル
システイン合成酵素を阻害し且つ細胞のグルタチオン
（GHS）を著しく減少させる合成アミノ酸である。BSO
は、ある種の抗癌剤の効力を増強することが報告されて
いる。BSOは合成され、またはケミカル・ダイナミック
ス・コーポレーション（Chemical Dynamics Corporatio
n）、サウス・プレインフィールド、ニュージャージー
から得られる。BSOはモノクローン性抗体TFS−４に結合
する。
BSOを抗体に抱合する合成経路は、次の通りである。
N,N′−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）ブチオニンス
ルホキシイミン〔３〕の調製 THF−H2O（1:1、25ml）中ブチオニンスルホキシイミン
（1.6g、５ミリモル）の攪拌溶液に、トリエチルアミン
（750μ、1.1当量）を加えた後、ジ−ｔ−ブチルピロ
カーボネート（4.5g、4.1当量）を加えた。透明な二層
性混合物を15時間攪拌した。攪拌が終了したなら、テト
ラヒドロフランを真空で留去し、メタノール（15ml）お
よびトリエチルアミン（750μ）を加え、均一溶液に
ジ−ｔ−ブチルピロカーボネート（15.25g、14当量、最
初の96時間に２当量/48時間、次いで後の96時間に５当
量/48時間）を数回に分けて８日間を要して加えた。逆
相TLC、MeOH−H2O（7:3）で、ニンヒドリンを噴霧して
加熱したところ、主要な２個のスポット（RF＝0.7およ
び0.4）が示された。反応物混合物に酢酸（1ml）を加え
て、揮発成分を真空で留去し、残渣を真空でトルエンと
共に再蒸発させた。生成するオイルをメタノールに溶解
し、水を加えたところ若干濁りを生じた。次に、メタノ
ール−水（3:7）で平衡にしたC18カラムに充填して、メ
タノール−水（3:7、500ml）、メタノール−水（2:3、2
50ml）、メタノール−水（1:1、200ml）、メタノール−
水（3:1、300ml）および最後にメタノール（300ml）で
溶出して、75mlサイズの分画を集めた。Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニルブチオニンスルホキシイミン〔２〕を含む
分画をまとめて、真空で留去すると、粉末として1.05g
を得た。1H NMR 1H（CDCl3）δ8.1（2H,D2Oと交換可
能、幅広いｓ）、5.8（1H,D2Oと交換可能、幅広い
ｓ）、4.3（1H,m）、3.2（4H,m）、2.3（2H,m）、2.0〜
0.8（16H,m）。N,N′−−ビス（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）ブチオニンスルホキシイミン〔３〕を含む分画をま
とめて、真空で蒸発させると、フォームとして450mgを
得た。1H NMR（CDCl3）δ6.0−5.5（2H,D2Oと交換可
能、幅広いｓ）、4.40（1H,m）、3.4（4H,m）、2.5−2.
2（2H,m）、1.8（2H,m）、1.48,1.45（18H,2xs）、0.97
（3H,t,J＝7Hz）。13C NMR（CDCl3）δ176.3,158.9,15
6.4,80.8,80.3,51.5,51.3,48.1,48.0,28.3,28.1,27.9,2
5.5,24.3,24.1,21.5,13.5。
N,N′−−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スルホキシ
イミン（マレイミド）メチルエステル〔５〕の調製３ （290mg、0.7ミリモル）をジクロロメタン（3ml）に
溶解したものをアルゴン下で０℃に冷却し、トリエチル
アミン（100μ）を加えた。10分後に、注射器からイ
ソブチルクロロホルメート（120μ）を滴下して加え
た。溶液をアルゴン下で０℃で１時間保存した。Ｎ−ヒ
ドロキシメチルマレイミド〔４〕（89mg、0.7ミリモ
ル）をジクロロメタン（2ml）に溶解したものを滴下し
て加え、琥珀色の懸濁液を０℃で30分間攪拌し、TLC、
シリカゲル、メタノール−ジクロロメタン（1:19）を行
ったところ、反応は完了していた。反応物混合物をジク
ロロメタン（15ml）で希釈して、水（10ml）とジクロロ
メタンとの間で分配した。有機層を乾燥し（硫酸ナトリ
ウム）、濾過し、真空で蒸発させた。残渣（370mg）
を、１×15cmシリカゲルカラム上でメタノール−ジクロ
ロメタン（1:19）を用いてフラッシュクロマトグラフィ
を行った。N,N′−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）ブ
チオニンスルホキシイミン（マレイミド）メチルエステ
ル〔５〕を含む分画をまとめて、真空で蒸発し、胆黄色
油状物（230mg、62％）を得た。1NMR（CDCl3）δ6.8（2
H,s）5.6（24,m）、5.2（1H,m）、4.3（1H,m）,3.5−3.
1（4H,m）、1.5−2.1（2H,m）、1.8（2H,m）、1.48,1.4
5（18H,2xs）、0.95（3H,t,J＝7.0Hz）。
スルホキシイミン（マレイミド）メチルエステル〔６〕
の調製 〔５〕（71mg）をジクロロメタン（350μ）に溶解し
たものをTFA無水物（50μ）で処理した。胆黄色溶液
を周囲温度で一晩保存した。TLC、シリカゲル、メタノ
ール−ジクロロメタン（1:9）およびｎ−ブタノール−
酢酸−水（3:2:1）を行ったところ、反応は完了してい
た。揮発性成分を蒸発させた。粗生成物をジエチルエー
テル（２×5ml）で粉砕し、洗浄液を棄てた。残渣の1NM
R（D2O）は、次の通りとなった。δ6.8（2H,s）、5.6
（2H,m）、4.6（1H,m、一部分H2Oピークの下に埋設）、
3.6−3.2（4H,m）、2.4−2.2（2H,m）、1.8−1.5（2H,
m）、1.4−1.2（2H,m）、0.8（3H,t,J＝7.0Hz）。この
結果は、提案した構造と一致している。
BSO誘導体〔６〕を、モノクローン性抗体TFS−４（上
記）に接合させる。BSO誘導体のマレイミド基を抗体上
の遊離スルフヒドリルと反応させて、イミノ抱合体を形
成させる。反応法は、一般的に米国特許第4,659,839号
明細書に記載の通りである。反応法は、抗体からFab′
フラグメントを単離することから始めるのが好ましい。
これは、従来の方法、例えば、最初に抗体をパパインで
処理してＦ（ab′）２フラグメントを生成させることに
よって行うことができる（パルハム（Parham）ら、J.Im
munol.Methods,53,133−173（1982）を参照された
い）。Ｆ（ab′）２フラグメントをジチオスレイトー
ル、２−メルカプトエタノールまたはシステインのよう
な還元剤を用いて温和な還元条件下で処理して、重鎖と
軽鎖との間のジスルフィド結合を開裂することなく２個
の重鎖の単一のジスルフィド結合を優先的に開裂させ
る。２個の生成するFab′フラグメントは、それぞれ１
個の遊離のスルフヒドリル基を有する。これらのFab′
フラグメントを、抗体フラグメントを損傷しないような
条件下で適当に緩衝した溶液中で、誘導体を形成したBS
O化合物と反応させる。好適な緩衝液には、リン酸ナト
リウム緩衝液、リン酸緩衝食塩水および重炭酸ナトリウ
ム緩衝液のような毒性のない緩衝液があり、約1.0Mの濃
度および約7.0付近のpHであることが有利である。生成
する免疫抱合体は、下記の式（但し、ABは抗体フラグメ
ントを表わす）によって表わされる。
ドキソルビシンを、実施例２に記載したようにTFS−２
に共有結合によって結合する。TFS−4/BSOは、TFS−2/
ドキソルビシンと同様に、その最大許容投与量でSCLC患
者に投与される。BSOはアドリアマイシンの毒性を強化
することができ、腫瘍細胞と甲状腺のみがBSOとドキソ
ルビシンとの両方を受容するので、TFS−２抗体が交差
反応する甲状腺を除き、正常組織のいずれよりもドキソ
ルビシンに一層感受性が高くなるようにすべきである。
甲状腺が損傷すればT4,T3およびTSH水準によって容易に
観察することができ、交替ホルモンが甲状腺機能低下に
関連した問題点を完全に改良する。
実施例４ 放射性治療化合物を含んで成る免疫接合体 治療上有効な放射性核種金属188Reを有し、下記の構造
式 を有するキレートを調製する。
このキレートの調製は、欧州特許出願公開第EP188,256
号明細書または同時係属米国特許出願連続番号第065,01
1号明細書に記載されている通りである。ナトリウムペ
ルレネート（3ml、15mCi、Ｗ−188/Re−188リサーチ・
スケール・ジェネレーター（research scale generato
r）から製造）を、クエン酸75mg、塩化第一スズ0.75m
g、ゲンチシン酸0.25mgおよびラクトース100mgからなる
凍結乾燥混合物を含む瓶に加えた。瓶を緩やかに攪拌し
て内容物を混合し、次に室温で10分間インキュベーショ
ンして188Re−クエン酸塩交換錯体を形成した。次に、
0.50mlのイソプロピルアルコキシルを、エトキシエチル
硫黄保護基と2,3,5,6−テトラフルオロフェニルエステ
ル基とからなるキレート化合物であり、式 を有する2,3,5,6−テトラフルオロフェニル−4,5−ビス
〔Ｓ−（１−エトキシエチル）チオアセタミド〕ペンタ
ノエート0.50mgを含む別の瓶に加えた。この瓶を２分間
攪拌して、キレート化合物を完全に溶解した。次に、こ
の溶液0.30mlを、上記のようにして調製した188Re−ク
エン酸塩錯体を含む瓶に移した。緩やかに混合した後、
瓶を75℃±２℃の水浴中で15分間インキュベーションし
た後、直ちに０℃の氷浴に２分間移した。逆相C18HPLC
分析によって測定した188Re標識キレートの収率は75％
〜90％の間であった。
C18逆相低圧材料（ベイカーC18カートリッジ）を含むカ
ラムを用いて、188Re標識キレートを精製した。カート
リッジをエタノールと水とでコンディショニングした
後、試料を加えて、2mlの水で３回および2mlの20％エタ
ノール/0.01Mリン酸緩衝液で３回洗浄した。次に、カラ
ムを真空で乾燥し、1.0mlのアセトニトリルで２回溶出
した。約75％の188Re−放射能が回収され、エステルキ
レート化合物としての純度は95％よりも大きかった。次
に、不活性ガスを流しながら、有機溶媒を蒸発させた。
次に、キレートを、別々の反応混合物中のモノクローン
性抗体TFS−２のFabフラグメントおよびTFS−４のFabフ
ラグメントに接合する。Fabフラグメントは、従来の方
法によりパパイン処理によって生成される。
抗体フラグメント（5mg/ml、0.5ml）の緩衝溶液を精製
した188Re標識キレートに加え、次いで0.5mlの0.5Mカー
ボネート／ビカーボネート緩衝液、pH9.50を加えた。反
応混合物を室温で15分間保持し、次に25mgのＬ−リシ
ン、0.1mlを加え、反応混合物を室温で更に15分間追跡
する。
セファデックスＧ−25材料を含むカラムを用いて、それ
ぞれの188Re標識免疫接合体を精製する。反応混合物を
カラムの最上端に載せて、PBS緩衝液を用いて反応瓶を
洗浄して、1.2mlずつの量を集め、188Re標識免疫接合体
は第三および第四の分画に溶出する。
次に、この免疫接合体を更にPBSで希釈して、両免疫接
合体をSCLC患者に注射する前に放射能を測定する。２種
類の免疫接合体は、患者のSCLCおよび甲状腺組織にのみ
付加的に蓄積されるべきであり、これらの免疫抱合体の
付加的治療投与物は標的組織に選択的に向かう。
現状のデーターは、抗体に結合したＢ−放射性の放射能
核種の投与は、骨髄へのそれらの影響によって制限され
ることを示唆している。この問題店を解決する一つの方
法は、治療前に骨髄を回収して保存することである。毒
性の第二の標的器官は、次に抗体と用いられる分子種
（全抗体、Ｆ（ab′）2,FabまたはFv）の交差反応性に
関係することになる。全抗体に対する400mCi131Iまでの
投与量では、骨髄を回収し保存した後再度注入するとき
に完全に投与された。
ミソニダゾールおよびBSO（実施例３を参照されたい）
のような放射性増感剤を用いて、それらが薬物として作
用する腫瘍における放射性核種の細胞毒性を強化するこ
とができる。好適な強化が起これば、投与される放射線
量を減少させ、骨髄を節約することができる。放射性核
種は一つの抗体に結合して、増感剤は対になった他の抗
体に結合する。
実施例５ 放射性診断化合物を含んで成る免疫接合体 実施例４に示されたキレート化合物を、欧州特許第188,
256号明細書またはUSSN第065,011号明細書に記載されて
いるように、金属核種99mTc、すなわち診断剤で放射能
標識することができる。
注射用殺菌水1mlを、グルコン酸第一スズ錯体〔50mgグ
ルコン酸ナトリウムと1.2mg塩化第一スズ二水和物、メ
ルク・フロスト（Merck Frosst）（カナダ）製、乾燥固
形状〕を含む無菌瓶に加え、瓶を緩やかに攪拌して内容
物を溶解した。無菌インシュリン注射器を用いて、生成
するグルコン酸第一スズ溶液0.1mlを空の無菌瓶に注入
した。ナトリウムペルテクネタート〔0.75ml、75〜100m
Ci、デュポン、メディフィジクス（Mediphysics）、マ
リンクロッド（Mallinckrodt）またはイー・アール・ス
クイブ（E.R.Squibb）から購入した99Mc/99Tc発生機か
ら溶出〕を加えて、瓶を緩やかに攪拌して内容物を混合
した後、室温で10分間インキュベーションして99mTc−
グルコネート錯体を形成させた。
0.3mgのキレート剤を乾燥固形状で含む別の瓶を、アセ
トニトリル中0.3mgキレート剤の溶液を瓶に加え、次に
溶媒を窒素ガス下で除去することによって調製した。次
に、この瓶に0.87mlの100％イソプロピルアルコールを
加え、瓶を約２分間緩やかに振盪して、2,3,5,6−テト
ラフルオロフェニル4,5−ビス〔ｓ−（１−エトキシエ
チル）チオアセタミド〕−ペンタノエートであるキレー
ト剤を完全に溶解した。次に、このキレート剤の溶液の
0.58mlを0.16ml氷酢酸/0.2N塩酸（2:14）を含む瓶に移
して、瓶を緩やかに攪拌した。この酸性化した溶液の0.
5mlを、上記のようにして調製した99mTc−グルコネート
錯体を含む瓶に移した。瓶を緩やかに攪拌して混合した
後、瓶を75℃±２℃の水浴中で15分間インキュベーショ
ンした後、直ちに０℃の氷浴に移して２分間放置した。
0.5mlのリン酸緩衝食塩水中にモノクローン性抗体（実
施例４に記載のTSF−２またはTSF−４）のFabフラグメ
ント10mgを含む別の瓶に、0.37mlの1.0M重炭酸ナトリウ
ム緩衝液、pH10.0を加えた。瓶を緩やかに攪拌した。99m Tc標識したキレート（上記を参照されたい）の酸性
にした溶液を含む瓶を氷浴から取り出し、重炭酸ナトリ
ウム緩衝液0.1mlを加えて、瓶を攪拌して混合した。直
ちに、緩衝した抗体溶液（上記）を加え、緩やかに攪拌
して混合し、室温で20分間インキュベーションして、放
射能標識したキレートを抗体に接合させた。
DEAE−セファデックスまたはQAE−セファデックスのい
ずれかであるアニオン交換体を含むカラムを用いて、２
種類の免疫接合体のそれぞれを精製する。カラムを、下
記のような無菌条件下で調製する。５個の1ml QAE−セ
ファデックスカラムを接続して単一カラムを形成させ
る。あるいは、単一の5ml QAE−セファデックスカラム
を用いてもよい。カラムを、37mMリン酸ナトリウム緩衝
液、pH6.8の5mlで洗浄する。1.2ミクロンフィルター
（ミリポア（Millipore）製）をカラムに取り付け、0.2
ミクロンフィルターを1.2ミクロンフィルターに取り付
ける。22ゲージの無菌のパイロジェンを有しない注射針
を0.2ミクロンのフィルターに取り付ける。
反応混合物を3mlまたは5ml注射器に抜き取り、溶液から
いかなる気泡も取り除く。針を取り外した後、注射器を
フィルターの反対側の末端のQAE−セファデックスカラ
ムに接続する。針キャップをカラムのフィルター末端に
取り付けた22ゲージ針から取り外して、針先端を無菌の
パイロジェンを有しない試験管に挿入する。ゆっくり
と、２分間をかけて反応混合物をカラムに注入する。試
験管に集めた溶出液を棄てる。カラムの最上端の空にな
った注射器を、（気泡を除去した）75mM（0.45％）の塩
化ナトリウム溶液5mlを含む5ml注射器と取り替える。カ
ラムの他端の針を、無菌のパイロジェンを有しない10ml
血清瓶に無菌的に挿入する。緩やかに、２分間をかけて
食塩溶液をカラムに注入して、溶出液を血清瓶に集め
る。
血清瓶の総放射能を、線量較正装置を用いて測定する。
両方の血清瓶の内容物をまとめて、無菌の発熱性物質不
含の30cc注射器に抜き取り、無菌の0.9％食塩水で総容
積が30mlになるまで希釈して、それぞれの免疫接合体を
ヒトSCLS患者に連続して数日間注射する。２種類の放射
性診断剤を担持する抗体は、標的癌組織上および甲状腺
組織上に累加的に蓄積する。
単一の抗体と比較して、２種類の放射性診断剤を用いる
ことの一つの主要な利点は、抗体を蓄積するのに十分に
豊富に抗原の一つのみを発現する転移を検出することで
ある。正常組織には重複交差反応性が無視し得る程度で
あっても、２種類の抗体は正常組織蓄積（１回の試験で
のみ陽性）から腫瘍の真の焦点（両方の試験が共に陽
性）を識別することもできる。高度に血管化された部
分、またはFabフラグメントを用いるときには腎臓中へ
のトレーサーの既知の吸収では、この評価において考慮
する必要がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、フローサイトメトリー法によって決定される
小細胞肺癌と３種類のモノクローン性抗体との結合を表
わしている。

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】２種類以上の異なる抗体種であってそれぞ
    れに診断または療法剤が結合しているものを含んで成る
    組成物であって、該抗体種のそれぞれが標的部位上の異
    なるエピトープと反応性でありそしてそれぞれの抗体種
    の交差反応性のパターンが非重複性であり、哺乳類また
    はヒト宿主中の標的部位に１種類以上の診断または療法
    剤を供給する方法において使用するための組成物。
  2. 【請求項２】同一の診断または療法剤が抗体種のそれぞ
    れに結合している、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記診断剤が診断上有効な放射性核種であ
    る、請求項２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記診断剤が99mTc,131I,111In,123I,76Br
    および18Fからなる群から選択される、請求項３に記載
    の組成物。
  5. 【請求項５】前記診断剤がキレートの形態の99mTcであ
    る、請求項３に記載の組成物。
  6. 【請求項６】前記療法剤がキレートの形態の188Reであ
    る、請求項１に記載の組成物。
  7. 【請求項７】異なる療法剤が抗体種のそれぞれに結合し
    ている、請求項１に記載の組成物。
  8. 【請求項８】それぞれの療法剤が療法上有効な放射性核
    種、薬物、毒素、増感剤および生物学的応答改質剤から
    なる群から選択される、請求項1,2または７に記載の組
    成物。
  9. 【請求項９】前記放射性核種が188Re,186Re,203Pb,212P
    b,212Bi,109Pd,64Cu,67Cu,131I,211At,97Ru,105Rh,198A
    uおよび199Agからなる群から選択される、請求項８に記
    載の組成物。
  10. 【請求項１０】前記毒素がリシン、アブリン、ジフテリ
    ア毒素、シュドモナス（Pseudomonas）エキソトキシン
    Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、マイコトキシン、
    トリコテセンおよび療法上有効なそれらのフラグメント
    からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】前記標的部位が癌部位であり、そして前
    記薬物が抗癌剤である、請求項８に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】前記薬物が抗癌性抗生物質である、請求
    項11に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】前記標的部位が癌部位であり、増感性薬
    物が一つの抗体種に結合しており、そして療法上有効な
    放射性核種が第二の抗体種に結合している、請求項７に
    記載の組成物。
  14. 【請求項１４】前記標的部位が癌部位であり、増感性薬
    物が一つの抗体種に結合しており、そして抗癌剤が第二
    の抗体種に結合している、請求項７に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】前記標的部位が癌部位である、請求項１
    に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】前記抗体種のそれぞれがモノクローナル
    抗体またはそれらのフラグメントである、請求項１に記
    載の組成物。
  17. 【請求項１７】抗体種のそれぞれが癌細胞に結合するモ
    ノクローナル抗体またはそれらのフラグメントである請
    求項16に記載の組成物。
  18. 【請求項１８】一つの抗体種がモノクローン性抗体NR−
    LU−10またはそのフラグメントであり、そして第二の抗
    体種がNR−LU−11またはそのフラグメントである、請求
    項1,2,5,6,7または17に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】２種類以上の抗体種を含んで成る診断用
    または療法用キットであって、該抗体種のそれぞれが標
    的部位上の異なるエピトープと反応性であり、そして該
    抗体種のそれぞれに対する交差反応性のパターンが重複
    しない、ことを特徴とするキット。
  20. 【請求項２０】２種類の別個の組成物を含んで成る診断
    用または療法用キットであって、それぞれの組成物が診
    断または療法剤と結合している少なくとも１種類の抗体
    種を含んで成り、該抗体種のそれぞれが標的部位上の異
    なるエピトープと反応性であり、そしてそれぞれの抗体
    種に対する交差反応性のパターンが実質的に非重複性で
    あり、単一の哺乳類またはヒト宿主に投与するためのキ
    ット。
  21. 【請求項２１】診断または療法剤を結合している２種類
    以上の抗体種の使用し、ここで該抗体種のそれぞれが標
    的部位上の異なるエピトープと反応性であり且つそれぞ
    れの抗体種に対する交差反応性のパターンが実質的に重
    複しないものである、哺乳類またはヒト宿主中標的部位
    に１種類以上の診断または治療剤を供給する組成物の製
    造方法。
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