JPH0734698B2 - 牛胚の体外発生方法 - Google Patents
牛胚の体外発生方法Info
- Publication number
- JPH0734698B2 JPH0734698B2 JP16546792A JP16546792A JPH0734698B2 JP H0734698 B2 JPH0734698 B2 JP H0734698B2 JP 16546792 A JP16546792 A JP 16546792A JP 16546792 A JP16546792 A JP 16546792A JP H0734698 B2 JPH0734698 B2 JP H0734698B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- serum
- medium
- culture
- bovine
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、牛受精卵の体外胚発生
方法、そのために使用する添加剤、及び該添加剤の製造
方法に関する。
方法、そのために使用する添加剤、及び該添加剤の製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】牛受精卵の体外胚発生は牛の効果的な繁
殖のための有用な手段である。しかしながら、この方法
においては、８細胞期から１６細胞期で発生が停止する
ことが一般的に知られている（ Wright 及びBondioli :
J. Anim. Sci. 53 ; 702-729（1981))。個体において
は受精の起こる場所は卵管であることから、８細胞期か
ら１６細胞期の停止を解除するために種々の動物の卵管
組織を外科的に体外に取り出し、受精卵をそれら卵管内
で培養する方法が開発された。ウシ受精卵をウサギ卵管
組織（Boland : Theriogenology 21 ; 126-137（1984))
やヒツジ卵管組織（Eyestoneら、: Theriogenology, 28
; 1-24 (1987)）と一時的に体外培養することにより桑
実胚や胚盤胞までに発生させることに成功した。しかし
ながらこの方法は、卵管組織を毎回外科的に取り出すた
め、手法が複雑で長時間かかり、そして卵管組織の個体
差により胚発生効率が変動するという欠点を有する。
殖のための有用な手段である。しかしながら、この方法
においては、８細胞期から１６細胞期で発生が停止する
ことが一般的に知られている（ Wright 及びBondioli :
J. Anim. Sci. 53 ; 702-729（1981))。個体において
は受精の起こる場所は卵管であることから、８細胞期か
ら１６細胞期の停止を解除するために種々の動物の卵管
組織を外科的に体外に取り出し、受精卵をそれら卵管内
で培養する方法が開発された。ウシ受精卵をウサギ卵管
組織（Boland : Theriogenology 21 ; 126-137（1984))
やヒツジ卵管組織（Eyestoneら、: Theriogenology, 28
; 1-24 (1987)）と一時的に体外培養することにより桑
実胚や胚盤胞までに発生させることに成功した。しかし
ながらこの方法は、卵管組織を毎回外科的に取り出すた
め、手法が複雑で長時間かかり、そして卵管組織の個体
差により胚発生効率が変動するという欠点を有する。
【０００３】より改善された方法として、種々の培養さ
れた体細胞と受精卵の共培養系が開発されてきた。卵丘
細胞や顆粒膜細胞とウシ受精卵の共培養により、受精卵
の発生促進が報告されている（Kajiharaら: Jpn. J. An
im. Reprod. 33, 173-180 (1987)，Gotoら: J.Reprod.
Fert. 83, 753-758 (1988)., Fukuda ら．: Biol. Repr
od. 42, 114-119 (1990)) 。Heymanら（Theriogenology
: 27, 59-68 (1987)) は、栄養芽細胞小胞（trophobl
astic vesicles）を用いて、またEyestoneら（Therioge
nology : 27, 228 Abstr. (1987))は、卵管細胞との共
培養においてウシ受精卵の桑実胚や胚盤胞への発生を報
告している。しかし、これらの共培養系はすべて血清培
地中で行われている。
れた体細胞と受精卵の共培養系が開発されてきた。卵丘
細胞や顆粒膜細胞とウシ受精卵の共培養により、受精卵
の発生促進が報告されている（Kajiharaら: Jpn. J. An
im. Reprod. 33, 173-180 (1987)，Gotoら: J.Reprod.
Fert. 83, 753-758 (1988)., Fukuda ら．: Biol. Repr
od. 42, 114-119 (1990)) 。Heymanら（Theriogenology
: 27, 59-68 (1987)) は、栄養芽細胞小胞（trophobl
astic vesicles）を用いて、またEyestoneら（Therioge
nology : 27, 228 Abstr. (1987))は、卵管細胞との共
培養においてウシ受精卵の桑実胚や胚盤胞への発生を報
告している。しかし、これらの共培養系はすべて血清培
地中で行われている。
【０００４】さらにEystone 及びFirst （J. Reprod. F
ert : 85, 715-720 (1989)) は、過排卵処理で得られた
５〜８細胞の受精卵を血清添加培地で培養されたウシ卵
管上皮細胞の培養上清中で体外培養を試みた。培養上清
液のみでも卵管上皮細胞との共培養系と同程度の良好な
胚発生が認められた。この結果から卵管上皮細胞は胚発
生に必須の因子を合成しかつ培養液中に分泌しているこ
とが示唆された。
ert : 85, 715-720 (1989)) は、過排卵処理で得られた
５〜８細胞の受精卵を血清添加培地で培養されたウシ卵
管上皮細胞の培養上清中で体外培養を試みた。培養上清
液のみでも卵管上皮細胞との共培養系と同程度の良好な
胚発生が認められた。この結果から卵管上皮細胞は胚発
生に必須の因子を合成しかつ培養液中に分泌しているこ
とが示唆された。
【０００５】しかしながら、上記の家畜胚の体外培養は
いずれも動物の血清や牛血清アルブミンなどの血清画分
を含有する培地中で行われている。しかしながら、血清
や血清アルブミンの化学的組成は不明であるばかりでな
くロットにより、また血清画分の調整により胚発生にお
よぼす生物活性は大きく変動するなどの難点がある（Ka
ne及びHeadon : J. Reprod. Fert. 60, 469-475 (1980)
; Fukui及びOno J. Reprod. Fert. 86, 501-506 (198
9)) 。また血清は非常に高価であること、またしばしば
動物血清の中にはウィルスやマイコプラズマに汚染され
ているものもあり受精卵の発生に悪影響をもたらすこと
もある。
いずれも動物の血清や牛血清アルブミンなどの血清画分
を含有する培地中で行われている。しかしながら、血清
や血清アルブミンの化学的組成は不明であるばかりでな
くロットにより、また血清画分の調整により胚発生にお
よぼす生物活性は大きく変動するなどの難点がある（Ka
ne及びHeadon : J. Reprod. Fert. 60, 469-475 (1980)
; Fukui及びOno J. Reprod. Fert. 86, 501-506 (198
9)) 。また血清は非常に高価であること、またしばしば
動物血清の中にはウィルスやマイコプラズマに汚染され
ているものもあり受精卵の発生に悪影響をもたらすこと
もある。
【０００６】最近、血清を用いない無血清培養系でも牛
胚の発生が進むことがわかってきた。すなわち、Elling
ton ら（Biol. Reprod. 43, 97-104 (1990))は、牛卵管
上皮細胞との共培養系でグルコースを添加せず、高濃度
の牛血清アルブミン（５mg／ml）を添加した無血清培地
（ＣＺＢ培地）で、過排卵処理によって得た牛受精卵の
胚盤胞までの発生が起こることを報告している。
胚の発生が進むことがわかってきた。すなわち、Elling
ton ら（Biol. Reprod. 43, 97-104 (1990))は、牛卵管
上皮細胞との共培養系でグルコースを添加せず、高濃度
の牛血清アルブミン（５mg／ml）を添加した無血清培地
（ＣＺＢ培地）で、過排卵処理によって得た牛受精卵の
胚盤胞までの発生が起こることを報告している。
【０００７】卵管上皮細胞と胚の共培養系で、黄体ホル
モン、卵胞刺激ホルモンそしてエストラジオールを添加
した無血清培地では、受精率、胚の発生率ともに上昇す
ることがわかった（Saeki ら : Biol. Reprod. 44, 25
6-260, (1991))。コラーゲン処理した培養シャーレに上
皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、トランスフェリ
ン添加の無血清培地では、卵丘細胞の著しい増殖が見ら
れ、卵丘細胞と胚の共培養系で胚の発生が有為に上昇す
ることが報告されている（Takagiら : Theriogenology,
35, 1197-1207,(1991)) 。
モン、卵胞刺激ホルモンそしてエストラジオールを添加
した無血清培地では、受精率、胚の発生率ともに上昇す
ることがわかった（Saeki ら : Biol. Reprod. 44, 25
6-260, (1991))。コラーゲン処理した培養シャーレに上
皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、トランスフェリ
ン添加の無血清培地では、卵丘細胞の著しい増殖が見ら
れ、卵丘細胞と胚の共培養系で胚の発生が有為に上昇す
ることが報告されている（Takagiら : Theriogenology,
35, 1197-1207,(1991)) 。
【０００８】Pinyopummintr and Bavister（Biol. Repr
od. 45, 736-742 (1991)) は、体外成熟／体外受精で得
られた牛胚の胚盤胞への発生が血清培地より低率ではあ
るが、成分既知物質よりなる無血清培地でも起こること
を示した。彼らはＴＣＭ１９９培地に１０％仔牛血清を
添加した培地では胚盤胞形成率が２９．７％であるのに
対して、ハムスター胚発生培地として開発した成分既知
無血清培地（HECM; Schini and Bavister, Biol. Repro
d. 39, 1183-1192,(1988)) でも、胚盤胞への発生率が
９．７％と低い胚盤胞形成率であるが発生が起こること
を示した。
od. 45, 736-742 (1991)) は、体外成熟／体外受精で得
られた牛胚の胚盤胞への発生が血清培地より低率ではあ
るが、成分既知物質よりなる無血清培地でも起こること
を示した。彼らはＴＣＭ１９９培地に１０％仔牛血清を
添加した培地では胚盤胞形成率が２９．７％であるのに
対して、ハムスター胚発生培地として開発した成分既知
無血清培地（HECM; Schini and Bavister, Biol. Repro
d. 39, 1183-1192,(1988)) でも、胚盤胞への発生率が
９．７％と低い胚盤胞形成率であるが発生が起こること
を示した。
【０００９】コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナ
ーゼなどいわゆるメタロプロテイナーゼは、細胞外マト
リックスの消化に関係ある酵素で、これらの酵素は結合
織の組織再構成に重要であることが知られている。これ
らメタロプロテイナーゼのインヒビターとして血清中の
主要なメタロプロテイナーゼインヒビターであるα2−
マクログロブリンやそれより分子量の小さい Tissue in
hibitor of metallo proteinase （ＴＩＭＰ）などが知
られている（Travis and Salvesen : Annu. Rev. Bioch
em. 52, 655-709,(1983); De Clerck ら：J. Biol. Che
m. 264, 17445-17453, (1989))。最近ＴＩＭＰが卵胞液
中（Curry ら : Endocrinology, 123, 1611-1618 (198
8)), 顆粒膜細胞（Mannら： Endocrinology, 128, 1825
-1832, (1991)) に存在していることが判明し、排卵時
の卵胞破裂に密接に関与する因子と考えられている。し
かしＴＩＭＰの胚に対する生理的役割についての報告は
ない。
ーゼなどいわゆるメタロプロテイナーゼは、細胞外マト
リックスの消化に関係ある酵素で、これらの酵素は結合
織の組織再構成に重要であることが知られている。これ
らメタロプロテイナーゼのインヒビターとして血清中の
主要なメタロプロテイナーゼインヒビターであるα2−
マクログロブリンやそれより分子量の小さい Tissue in
hibitor of metallo proteinase （ＴＩＭＰ）などが知
られている（Travis and Salvesen : Annu. Rev. Bioch
em. 52, 655-709,(1983); De Clerck ら：J. Biol. Che
m. 264, 17445-17453, (1989))。最近ＴＩＭＰが卵胞液
中（Curry ら : Endocrinology, 123, 1611-1618 (198
8)), 顆粒膜細胞（Mannら： Endocrinology, 128, 1825
-1832, (1991)) に存在していることが判明し、排卵時
の卵胞破裂に密接に関与する因子と考えられている。し
かしＴＩＭＰの胚に対する生理的役割についての報告は
ない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、無血清培地
中で牛受精卵からの胚発生を行う手段を提供しようとす
るものである。
中で牛受精卵からの胚発生を行う手段を提供しようとす
るものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、顆粒膜細胞を無血清培
地中で長期にわたって培養することに成功し、こうして
得られた無血清培地由来の培養上清を含有する無血清培
地中で牛受精卵を培養すれば胚発生を行うことができる
という全く新しい知見を得た（特願平３−３４３８
４）。本発明者は、さらに前記培養上清中の胚発生のた
めの有効成分を探求した結果、それがメタロプロテイナ
ーゼインヒビターであることを見出し、本発明を完成し
た。
を解決すべく種々検討した結果、顆粒膜細胞を無血清培
地中で長期にわたって培養することに成功し、こうして
得られた無血清培地由来の培養上清を含有する無血清培
地中で牛受精卵を培養すれば胚発生を行うことができる
という全く新しい知見を得た（特願平３−３４３８
４）。本発明者は、さらに前記培養上清中の胚発生のた
めの有効成分を探求した結果、それがメタロプロテイナ
ーゼインヒビターであることを見出し、本発明を完成し
た。
【００１２】従って本発明は、組成が明らかな無血清培
地中メタロプロテイナーゼインヒビターの存在下で牛受
精卵を体外培養することを特徴とする胚発生方法を提供
する。 本発明はまた、顆粒膜細胞を無血清培地中で培
養し、そして培養上清からメタロプロテイナーゼインヒ
ビターを採取することを特徴とする、メタロプロテイナ
ーゼインヒビターの製造方法を提供する。本発明はさら
に、メタロプロテイナーゼインヒビターを含んで成る、
牛受精卵からの体外胚発生のための培地用添加剤を提供
する。
地中メタロプロテイナーゼインヒビターの存在下で牛受
精卵を体外培養することを特徴とする胚発生方法を提供
する。 本発明はまた、顆粒膜細胞を無血清培地中で培
養し、そして培養上清からメタロプロテイナーゼインヒ
ビターを採取することを特徴とする、メタロプロテイナ
ーゼインヒビターの製造方法を提供する。本発明はさら
に、メタロプロテイナーゼインヒビターを含んで成る、
牛受精卵からの体外胚発生のための培地用添加剤を提供
する。
【００１３】
【具体的な説明】本発明の方法に用いる牛受精卵は任意
の常法に従って得ることができるが、屠殺された成牛卵
巣から未成熟卵を得、これを体外で成熟させた後、体外
で受精を行うのが便利である。
の常法に従って得ることができるが、屠殺された成牛卵
巣から未成熟卵を得、これを体外で成熟させた後、体外
で受精を行うのが便利である。
【００１４】未成熟卵の体外成熟法はすでによく知られ
ており、例えばFukudaら（Biol, Reprod. 42 114-119
(1990))に記載されている。このための培地としては、
ＴＣＭ１９９，１０％胎児牛血清等を使用することがで
き、一般に約３８〜３９℃、好ましくは３８．５℃、５
％炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境中で行われる。具
体的な一例を実施例１に記載する。体外受精の方法もよ
く知られており、例えばFukui (Mol. Reprod. Dev. 26
40-46 (1990))に記載されている。
ており、例えばFukudaら（Biol, Reprod. 42 114-119
(1990))に記載されている。このための培地としては、
ＴＣＭ１９９，１０％胎児牛血清等を使用することがで
き、一般に約３８〜３９℃、好ましくは３８．５℃、５
％炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境中で行われる。具
体的な一例を実施例１に記載する。体外受精の方法もよ
く知られており、例えばFukui (Mol. Reprod. Dev. 26
40-46 (1990))に記載されている。
【００１５】受精卵の培養、すなわち胚発生のための本
発明の好ましい方法においては、受精卵／顆粒膜細胞を
約１日間培養した後受精卵を裸化し、この裸化受精卵を
メタロプロテイナーゼインヒビターを含有する培地中で
培養する。２〜３日毎に培地を置換する。上記の培養は
通常３８℃〜３９℃、好ましくは３８．５℃にて、５％
炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境で行なわれる。通常
７〜８日間の培養の後受精卵は胚盤胞に達する。
発明の好ましい方法においては、受精卵／顆粒膜細胞を
約１日間培養した後受精卵を裸化し、この裸化受精卵を
メタロプロテイナーゼインヒビターを含有する培地中で
培養する。２〜３日毎に培地を置換する。上記の培養は
通常３８℃〜３９℃、好ましくは３８．５℃にて、５％
炭酸ガス／９５％空気中で加湿環境で行なわれる。通常
７〜８日間の培養の後受精卵は胚盤胞に達する。
【００１６】本発明によれば、顆粒膜細胞の培養は無血
清培地、特に組成が明らかな培地中で行われ、好ましく
は基礎培地に成長因子を補充した培地が用いられる。基
礎培地としては市販の組織培養培地ＴＣＭ１９９（日水
製薬）（Morganら、Proc. Soc. Exp. Biol. 73, 1 (195
0)) 等が用いられる。５００ng／mlのアプロチニンを含
有するＴＣＭ１９９をＩＦＰ１１０培地と称し、これが
特に好ましい培地である。培地はさらに、インシュリ
ン、またはヘパリン結合細胞成長因子（ＨＢＧＦ−２）
を含有するのが、効力の高い培養上清を得るために好ま
しい。
清培地、特に組成が明らかな培地中で行われ、好ましく
は基礎培地に成長因子を補充した培地が用いられる。基
礎培地としては市販の組織培養培地ＴＣＭ１９９（日水
製薬）（Morganら、Proc. Soc. Exp. Biol. 73, 1 (195
0)) 等が用いられる。５００ng／mlのアプロチニンを含
有するＴＣＭ１９９をＩＦＰ１１０培地と称し、これが
特に好ましい培地である。培地はさらに、インシュリ
ン、またはヘパリン結合細胞成長因子（ＨＢＧＦ−２）
を含有するのが、効力の高い培養上清を得るために好ま
しい。
【００１７】顆粒膜細胞培養上清を得るための好ましい
培養方法においては、顆粒膜細胞をまず牛胎児血清を含
有する培地、例えば牛胎児血清１０％を含有する市販の
ＤＭＥ：Ｆ１２（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２と略す場合
がある）中で培養して十分増殖させた後、単層状態に増
殖した細胞を前記無血清培地で十分に洗浄し、次に新た
な無血清培地を添加して培養する。例えば４８時間毎に
無血清培地を回収交換することにより培養上清を得るこ
とができる。こうして得られた培養上清から、実施例４
に記載する方法によりメタロプロテイナーゼインヒビタ
ーを回収、精製することができる。
培養方法においては、顆粒膜細胞をまず牛胎児血清を含
有する培地、例えば牛胎児血清１０％を含有する市販の
ＤＭＥ：Ｆ１２（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２と略す場合
がある）中で培養して十分増殖させた後、単層状態に増
殖した細胞を前記無血清培地で十分に洗浄し、次に新た
な無血清培地を添加して培養する。例えば４８時間毎に
無血清培地を回収交換することにより培養上清を得るこ
とができる。こうして得られた培養上清から、実施例４
に記載する方法によりメタロプロテイナーゼインヒビタ
ーを回収、精製することができる。
【００１８】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１．屠場未成熟卵の回収と成熟培養法 屠殺後３時間以内に採取された成牛卵巣を、プラスチッ
クバッグに入れ、まわりを３０℃−３４℃の温水で暖め
て実験室に運び、実験に供した。卵巣をＴＣＭ１９９液
に２５mM HEPES，ポリビニールアルコール（１００μｇ
／ml）、１．２５mMピルビン酸ナトリウム、ヘパリン
（１５μｇ／ml）及び抗生物質ゲンタマイシン（１０μ
ｇ／ml）を含む培地の入った直径１００mmシャーレの中
に移した。
説明する。実施例１．屠場未成熟卵の回収と成熟培養法 屠殺後３時間以内に採取された成牛卵巣を、プラスチッ
クバッグに入れ、まわりを３０℃−３４℃の温水で暖め
て実験室に運び、実験に供した。卵巣をＴＣＭ１９９液
に２５mM HEPES，ポリビニールアルコール（１００μｇ
／ml）、１．２５mMピルビン酸ナトリウム、ヘパリン
（１５μｇ／ml）及び抗生物質ゲンタマイシン（１０μ
ｇ／ml）を含む培地の入った直径１００mmシャーレの中
に移した。
【００１９】外科用ハサミで２分された卵巣を、多刀の
外科用ナイフで細かく切開し、顆粒膜細胞の付着した卵
子を回収し実験に用いた。採取された卵子／顆粒膜細胞
複合体をＴＣＭ１９９液で２回洗浄し、各々約３０個の
卵子／顆粒膜細胞複合体を３５０μｌの成熟培地（ＴＣ
Ｍ１９９液、重炭酸ナトリウム（２mg／ml）、１０％胎
児牛血清）に入れ、それぞれの成熟培地のドロップをミ
ネラルオイルでカバーした。成熟培養は３８．５℃で５
％炭酸ガス／９５％空気の加湿したインキュベーター内
で２０〜２２時間行なった。
外科用ナイフで細かく切開し、顆粒膜細胞の付着した卵
子を回収し実験に用いた。採取された卵子／顆粒膜細胞
複合体をＴＣＭ１９９液で２回洗浄し、各々約３０個の
卵子／顆粒膜細胞複合体を３５０μｌの成熟培地（ＴＣ
Ｍ１９９液、重炭酸ナトリウム（２mg／ml）、１０％胎
児牛血清）に入れ、それぞれの成熟培地のドロップをミ
ネラルオイルでカバーした。成熟培養は３８．５℃で５
％炭酸ガス／９５％空気の加湿したインキュベーター内
で２０〜２２時間行なった。
【００２０】実施例２．体外受精 市販の黒毛和牛凍結精液（０．５ml）を３５℃の温水中
で融解し、遠心管にこの精液を入れ、５mMカフェイン及
びヘパリン（１５μｇ／ml）を含み牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含まないＢＯ培地（６ml）（Brackett and
Oliphant ; Biol. Reprod. 12 : 260-274 (1975))を加
えて混合した。この混合液を７分間２，２００回転で遠
心分離し、上澄み液を捨てた。この精子洗浄操作をさら
に１回同様に行なった。その後血球計算盤を用いて精子
の濃度を１０7 個／mlに調整した。
で融解し、遠心管にこの精液を入れ、５mMカフェイン及
びヘパリン（１５μｇ／ml）を含み牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含まないＢＯ培地（６ml）（Brackett and
Oliphant ; Biol. Reprod. 12 : 260-274 (1975))を加
えて混合した。この混合液を７分間２，２００回転で遠
心分離し、上澄み液を捨てた。この精子洗浄操作をさら
に１回同様に行なった。その後血球計算盤を用いて精子
の濃度を１０7 個／mlに調整した。
【００２１】この精子液５０μｌを５mMカフェイン及び
脂肪酸フリーのＢＳＡ（１０mg／ml）を含むＢＯ培地５
０μｌ中に加えた。２１〜２３時間成熟培養した卵を、
上記の培地で３回洗浄後、精子浮遊液中に入れ、３８．
５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿インキュベータ
ー内で６時間培養することにより受精させた。受精の時
のＢＯ液中の濃度は、精子５×１０6 個／ml、５mMカフ
ェインン、ヘパリン（７．５μｇ／ml）、ＢＳＡ（５mg
／ml）であった。
脂肪酸フリーのＢＳＡ（１０mg／ml）を含むＢＯ培地５
０μｌ中に加えた。２１〜２３時間成熟培養した卵を、
上記の培地で３回洗浄後、精子浮遊液中に入れ、３８．
５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿インキュベータ
ー内で６時間培養することにより受精させた。受精の時
のＢＯ液中の濃度は、精子５×１０6 個／ml、５mMカフ
ェインン、ヘパリン（７．５μｇ／ml）、ＢＳＡ（５mg
／ml）であった。
【００２２】受精卵はＩＦＰ１１０の発生培地で２回洗
浄した後、３５０μｌの発生培地の各スポットを作り、
受精卵をこの発生培地の中に移した。シャーレは卵丘／
顆粒膜細胞の増殖を促進するためにタイプＩコラーゲン
を最終濃度１５０μｇ／mlになるようにＴＣＭ１９９液
で調整し、室温で１時間インキュベートしてから培養に
用いた。受精卵はそれぞれの発生培地中で２４時間培養
後、毛細管様ピペットを用いて、受精卵の回りに付着し
ている卵丘／顆粒膜細胞を裸化した。得られた裸化受精
卵を、３５０μｌのそれぞれの試験用発生培地に移し、
３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿されたイ
ンキュベーター内で培養した。試験用培地は、体外受精
後３日目に培地交換を行ない、胚の発生状況は、１２日
目まで毎日顕微鏡を用いて観察し調べた。
浄した後、３５０μｌの発生培地の各スポットを作り、
受精卵をこの発生培地の中に移した。シャーレは卵丘／
顆粒膜細胞の増殖を促進するためにタイプＩコラーゲン
を最終濃度１５０μｇ／mlになるようにＴＣＭ１９９液
で調整し、室温で１時間インキュベートしてから培養に
用いた。受精卵はそれぞれの発生培地中で２４時間培養
後、毛細管様ピペットを用いて、受精卵の回りに付着し
ている卵丘／顆粒膜細胞を裸化した。得られた裸化受精
卵を、３５０μｌのそれぞれの試験用発生培地に移し、
３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿されたイ
ンキュベーター内で培養した。試験用培地は、体外受精
後３日目に培地交換を行ない、胚の発生状況は、１２日
目まで毎日顕微鏡を用いて観察し調べた。
【００２３】実施例３．牛顆粒膜細胞の培養と培養上清の回収方法 屠場で採取された成牛卵巣を生理的リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ- ）の中に入れて実験室に持ち帰った。卵巣を３回Ｐ
ＢＳ- 液で洗浄した後、外科用ナイフを用いて卵胞を切
開し、顆粒膜細胞の付着した卵をシャーレに回収した。
パスツールピペットを用いて顕微鏡下で観察しながら顆
粒膜細胞の付着した卵子をよりわけた。遠心管に顆粒膜
細胞の付着した卵子を移し、ＰＢＳ- 液中でピペッティ
ングを行ない顆粒膜細胞浮遊液を調整した。この浮遊液
にＰＢＳ- 液を加えて１，５００回転、５分間の遠心操
作を３回行ない顆粒膜細胞を回収した。ＤＭＥ：Ｆ１２
（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２）の培地に１０％牛胎児血
清（ＦＢＳ）添加した血清培地で細胞浮遊液を作り、２
−３×１０5 個の細胞を３５mmシャーレに移し、同じ培
地で培養を行なった。
Ｓ- ）の中に入れて実験室に持ち帰った。卵巣を３回Ｐ
ＢＳ- 液で洗浄した後、外科用ナイフを用いて卵胞を切
開し、顆粒膜細胞の付着した卵をシャーレに回収した。
パスツールピペットを用いて顕微鏡下で観察しながら顆
粒膜細胞の付着した卵子をよりわけた。遠心管に顆粒膜
細胞の付着した卵子を移し、ＰＢＳ- 液中でピペッティ
ングを行ない顆粒膜細胞浮遊液を調整した。この浮遊液
にＰＢＳ- 液を加えて１，５００回転、５分間の遠心操
作を３回行ない顆粒膜細胞を回収した。ＤＭＥ：Ｆ１２
（１：１）（ＤＭＥ／Ｆ１２）の培地に１０％牛胎児血
清（ＦＢＳ）添加した血清培地で細胞浮遊液を作り、２
−３×１０5 個の細胞を３５mmシャーレに移し、同じ培
地で培養を行なった。
【００２４】顆粒膜細胞を単離する別法として、卵巣を
外科用ナイフで切開し、卵胞より卵子／顆粒膜細胞の複
合体を取り出し、この複合体をＴＣＭ１９９液の入った
遠心管内に移し、１，５００rpm 、５分間の遠心操作を
３回繰り返し洗浄した後、ＤＭＥ／Ｆ１２に１０％ＦＣ
Ｓの入った血清培地で細胞浮遊液を調整し、培養底面積
２５cm2 の培養用フラスコに移し培養した。
外科用ナイフで切開し、卵胞より卵子／顆粒膜細胞の複
合体を取り出し、この複合体をＴＣＭ１９９液の入った
遠心管内に移し、１，５００rpm 、５分間の遠心操作を
３回繰り返し洗浄した後、ＤＭＥ／Ｆ１２に１０％ＦＣ
Ｓの入った血清培地で細胞浮遊液を調整し、培養底面積
２５cm2 の培養用フラスコに移し培養した。
【００２５】初代培養された顆粒膜細胞がフラスコ底に
完全に単層状態に細胞増殖した時、トリプシン液（２５
０μｇ／mlトリプシン、２００μｇ／mlＥＤＴＡをＰＢ
Ｓ-液で溶かした溶液）を処理し分散した顆粒膜細胞
は、培養底面積７５cm2 の培養用フラスコに移し完全に
単層状態になるまで培養した。この細胞はトリプシン液
処理後、同じ７５cm2 培養フラスコに３分割（１：３ス
プリット）され継代培養を行なった。
完全に単層状態に細胞増殖した時、トリプシン液（２５
０μｇ／mlトリプシン、２００μｇ／mlＥＤＴＡをＰＢ
Ｓ-液で溶かした溶液）を処理し分散した顆粒膜細胞
は、培養底面積７５cm2 の培養用フラスコに移し完全に
単層状態になるまで培養した。この細胞はトリプシン液
処理後、同じ７５cm2 培養フラスコに３分割（１：３ス
プリット）され継代培養を行なった。
【００２６】培養上清の回収は継代培養を２〜５回繰り
返した顆粒膜細胞を用いた。この継代培養された細胞が
完全に単層状態になった後、血清培地を除き３回ＴＣＭ
１９９液で洗浄した後、成分既知無血清培地（ＩＦＰ１
１０培地にインシュリン５μｇ／mlを添加した培地）で
２４時間培養し、血清の影響を完全に除いた。古い培養
上清を除いた後、それぞれの実験で示された成分既知無
血清培地を添加し、４８時間毎に培地交換を行ない培養
上清を回収した。回収した培養上清液は、３，０００回
転で１５分間遠心操作を行い、沈殿を除き、上清を−８
０℃で保存した。この上清中のタンパク質含量は４２μ
ｇ／mlであった。
返した顆粒膜細胞を用いた。この継代培養された細胞が
完全に単層状態になった後、血清培地を除き３回ＴＣＭ
１９９液で洗浄した後、成分既知無血清培地（ＩＦＰ１
１０培地にインシュリン５μｇ／mlを添加した培地）で
２４時間培養し、血清の影響を完全に除いた。古い培養
上清を除いた後、それぞれの実験で示された成分既知無
血清培地を添加し、４８時間毎に培地交換を行ない培養
上清を回収した。回収した培養上清液は、３，０００回
転で１５分間遠心操作を行い、沈殿を除き、上清を−８
０℃で保存した。この上清中のタンパク質含量は４２μ
ｇ／mlであった。
【００２７】実施例４．胚発生促進因子としてのＴＩＭＰの精製方法 牛顆粒膜細胞の無血清培地で回収された培養上清液１ｌ
を、直径９０mmのＹＭ−１０限界濾過膜（アミコン社
製：分子量カットオフ １０，０００）で約１００倍濃
縮し、全タンパク質の５６％を回収した。この濃縮液は
ＰＢＳ- 液で透析した後遠心して上清を回収し、ゲル濾
過高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ
ＷＸＬ，トーソー製）にかけ、ＰＢＳ- 液で溶出した。
溶出液はＵＶ−２８０nmの吸収でモニターし、各画分の
タンパク質濃度は、Bradford法（Bradford, Anal. Bioc
hem, 72, 248-254 (1976)) により測定した。
を、直径９０mmのＹＭ−１０限界濾過膜（アミコン社
製：分子量カットオフ １０，０００）で約１００倍濃
縮し、全タンパク質の５６％を回収した。この濃縮液は
ＰＢＳ- 液で透析した後遠心して上清を回収し、ゲル濾
過高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ
ＷＸＬ，トーソー製）にかけ、ＰＢＳ- 液で溶出した。
溶出液はＵＶ−２８０nmの吸収でモニターし、各画分の
タンパク質濃度は、Bradford法（Bradford, Anal. Bioc
hem, 72, 248-254 (1976)) により測定した。
【００２８】溶出液を検定用培地により１０〜２０倍に
希釈した後に胚発生促進活性を測定した。溶出の結果を
図１に示す。胚発生促進活性は、おおよそ３万と７．５
万の２つの分子量域にみられた。分子量約３万の胚発生
促進活性をembryogenin-1 (EG-1)、また分子量約７．５
万の胚発生促進活性をembryogenin-2 (EG-2)と名づけ
た。
希釈した後に胚発生促進活性を測定した。溶出の結果を
図１に示す。胚発生促進活性は、おおよそ３万と７．５
万の２つの分子量域にみられた。分子量約３万の胚発生
促進活性をembryogenin-1 (EG-1)、また分子量約７．５
万の胚発生促進活性をembryogenin-2 (EG-2)と名づけ
た。
【００２９】なお、胚発生促進活性は次のようにして測
定した。実施例２に記載したようにして裸化受精卵を
得、これを、被検体を加えた無血清培地（ＴＣＭ１９９
培地成分からTween-80とパラアミノ安息香酸を除き、グ
ルコース濃度を１０００μｇ／mlから２００μｇ／mlに
減量し、５mg／mlの脂肪酸フリー牛血清アルブミンを加
えた培地）中で３８．５℃にて培養しながら１２日間顕
微鏡観察し、胚盤胞形成率を求めた。
定した。実施例２に記載したようにして裸化受精卵を
得、これを、被検体を加えた無血清培地（ＴＣＭ１９９
培地成分からTween-80とパラアミノ安息香酸を除き、グ
ルコース濃度を１０００μｇ／mlから２００μｇ／mlに
減量し、５mg／mlの脂肪酸フリー牛血清アルブミンを加
えた培地）中で３８．５℃にて培養しながら１２日間顕
微鏡観察し、胚盤胞形成率を求めた。
【００３０】次に、胚発生促進活性画分ＥＧ−１を、２
０mMトリス塩酸緩衝液、pH７．５で透析後、同じ緩衝液
で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマト
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社）に
のせ、このカラムに結合させた。０〜５００mM塩化ナト
リウムの直線的濃度勾配法により溶出を行った。このカ
ラムによって溶出された成分を、ＰＢＳ- 液で透析後、
胚発生促進活性を検討した。この結果を図２に示す。胚
発生促進活性は塩化ナトリウム濃度１００mM〜１３０mM
にて溶出した。このＭｏｎｏ−Ｑ高速液体クロマトカラ
ムにより精製された活性の画分を、０．１％トリクロロ
フルオロ酢酸液で平衡化された後Ｖｙｄａｃ Ｃ−４逆
相高速液体クロマトグラフィーカラム（The Separation
groups社）にのせ、アセトニトリル（２５％−４５
％）の直線的濃度勾配で溶出された。溶出画分はすぐに
真空乾燥した後、培地に溶かして胚発生促進活性を調べ
た。図３に示すごとく、活性を単一ピークとして得るこ
とができた。
０mMトリス塩酸緩衝液、pH７．５で透析後、同じ緩衝液
で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマト
カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社）に
のせ、このカラムに結合させた。０〜５００mM塩化ナト
リウムの直線的濃度勾配法により溶出を行った。このカ
ラムによって溶出された成分を、ＰＢＳ- 液で透析後、
胚発生促進活性を検討した。この結果を図２に示す。胚
発生促進活性は塩化ナトリウム濃度１００mM〜１３０mM
にて溶出した。このＭｏｎｏ−Ｑ高速液体クロマトカラ
ムにより精製された活性の画分を、０．１％トリクロロ
フルオロ酢酸液で平衡化された後Ｖｙｄａｃ Ｃ−４逆
相高速液体クロマトグラフィーカラム（The Separation
groups社）にのせ、アセトニトリル（２５％−４５
％）の直線的濃度勾配で溶出された。溶出画分はすぐに
真空乾燥した後、培地に溶かして胚発生促進活性を調べ
た。図３に示すごとく、活性を単一ピークとして得るこ
とができた。
【００３１】Ｃ4 −逆相高速液体クロマトグラフィーに
よって精製された５００pMの分子量３．１万のＥＧ−１
画分を自動プロティンシークエンサーにかけ、アミノ酸
配列を調べた。胚発生促進活性は、単鎖ポリペプチド構
造をもつタンパク質により与えられ、該蛋白質のＮ末端
から２９番目までのアミノ酸配列が決定された。この２
９個のアミノ酸配列をEuropean Molecular Biology Lab
oratory (Swiss-PROT)のデータベースより解析したとこ
ろ、未同定の部分のシスティン（用いた自動プロティン
シークエンサーではシスティン残基は解読できない）を
含めて牛由来Tissue inhibitor of metalloproteinase
(TIMP)とアミノ酸配列の順序において、９３％の相同性
が認められた（図４）。
よって精製された５００pMの分子量３．１万のＥＧ−１
画分を自動プロティンシークエンサーにかけ、アミノ酸
配列を調べた。胚発生促進活性は、単鎖ポリペプチド構
造をもつタンパク質により与えられ、該蛋白質のＮ末端
から２９番目までのアミノ酸配列が決定された。この２
９個のアミノ酸配列をEuropean Molecular Biology Lab
oratory (Swiss-PROT)のデータベースより解析したとこ
ろ、未同定の部分のシスティン（用いた自動プロティン
シークエンサーではシスティン残基は解読できない）を
含めて牛由来Tissue inhibitor of metalloproteinase
(TIMP)とアミノ酸配列の順序において、９３％の相同性
が認められた（図４）。
【００３２】図１で示したゲル濾過高速液体クロマトグ
ラフィーによって分画された溶出画分を、還元条件下で
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、抗ＴＩＭ
Ｐモノクローナル抗体で検出した。図５の分画番号は、
図１の保持時間１１分後から分取を開始し、１分ごとに
分画を行った。図５で示すように、分画番号１１（図１
の保持時間２１−２２分）と１２（図１の保持時間２２
−２３分）の分子量３．１万のＥＧ−１だけがこの抗体
と免疫交差反応がおこった。しかし、分子量７．５万の
ＥＧ−２（分画番号７）は、抗ＴＩＭＰモノクローナル
抗体と免疫交差反応はおこらなかった。この結果は、分
子量３．１万のＥＧ−１が免疫学的にＴＩＭＰと同一の
性質をもった物質と考えられる。
ラフィーによって分画された溶出画分を、還元条件下で
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、抗ＴＩＭ
Ｐモノクローナル抗体で検出した。図５の分画番号は、
図１の保持時間１１分後から分取を開始し、１分ごとに
分画を行った。図５で示すように、分画番号１１（図１
の保持時間２１−２２分）と１２（図１の保持時間２２
−２３分）の分子量３．１万のＥＧ−１だけがこの抗体
と免疫交差反応がおこった。しかし、分子量７．５万の
ＥＧ−２（分画番号７）は、抗ＴＩＭＰモノクローナル
抗体と免疫交差反応はおこらなかった。この結果は、分
子量３．１万のＥＧ−１が免疫学的にＴＩＭＰと同一の
性質をもった物質と考えられる。
【００３３】顆粒膜細胞培養上清液中にＴＩＭＰが存在
するのか、その上清液から精製されたＥＧ−１がＴＩＭ
Ｐと免疫学的に同一のものであるかどうか検討した。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験は、ｌａｎ
ｅＭは分子量マーカーを示し、ｌａｎｅ１は濃縮培養上
清液とプロティン−Ｇファーストフローゲルを混合して
得た沈殿分画、ｌａｎｅ２はその上清分画、３は培養上
清液のＴＩＭＰモノクローナル抗体で処理した後プロテ
ィン−Ｇファーストフローゲルを混合して得た沈殿分
画、ｌａｎｅ４はその上清分画、ｌａｎｅ５は精製され
たＥＧ−１を示す。
するのか、その上清液から精製されたＥＧ−１がＴＩＭ
Ｐと免疫学的に同一のものであるかどうか検討した。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験は、ｌａｎ
ｅＭは分子量マーカーを示し、ｌａｎｅ１は濃縮培養上
清液とプロティン−Ｇファーストフローゲルを混合して
得た沈殿分画、ｌａｎｅ２はその上清分画、３は培養上
清液のＴＩＭＰモノクローナル抗体で処理した後プロテ
ィン−Ｇファーストフローゲルを混合して得た沈殿分
画、ｌａｎｅ４はその上清分画、ｌａｎｅ５は精製され
たＥＧ−１を示す。
【００３４】この図より精製されたＥＧ−１は分子量
３．１万であることがわかった。この電気泳動ゲルをニ
トロセルロース膜に転写してイミュノブロット実験を行
った。精製されたＥＧ−１はＴＩＭＰ抗体ときれいに交
差反応をおこした（ｌａｎｅ５）。同じく顆粒膜細胞培
養上清液とＴＩＭＰモノクローナル抗体処理して凝集沈
殿した分画（ｌａｎｅ３）に強い免疫交差反応がみら
れ、残りの上清分画（ｌａｎｅ４）中には反応がみられ
なかった。また培養上清中の交差反応する物質は、ＥＧ
−１と同じ３．１万の物質のみであった。ｌａｎｅ２は
ＴＩＭＰ抗体を処理しないコントロール分画で、イミュ
ノブロット実験により交差反応を示した。
３．１万であることがわかった。この電気泳動ゲルをニ
トロセルロース膜に転写してイミュノブロット実験を行
った。精製されたＥＧ−１はＴＩＭＰ抗体ときれいに交
差反応をおこした（ｌａｎｅ５）。同じく顆粒膜細胞培
養上清液とＴＩＭＰモノクローナル抗体処理して凝集沈
殿した分画（ｌａｎｅ３）に強い免疫交差反応がみら
れ、残りの上清分画（ｌａｎｅ４）中には反応がみられ
なかった。また培養上清中の交差反応する物質は、ＥＧ
−１と同じ３．１万の物質のみであった。ｌａｎｅ２は
ＴＩＭＰ抗体を処理しないコントロール分画で、イミュ
ノブロット実験により交差反応を示した。
【００３５】濃縮顆粒膜細胞培養上清液をＴＩＭＰモノ
クローナル抗体で処理し、ＴＩＭＰの除去された濃縮培
養上清液による胚発生促進活性を調べた（図７）。ＴＩ
ＭＰ抗体処理または無処理の濃縮培養上清液を５％及び
１０％の濃度になるように発生培地に加えたところ、抗
体処理した培養上清液の胚発生促進活性は、無処理培養
上清液にくらべて明らかに低下した。この結果は、培養
上清の胚発生促進活性は、抗ＴＩＭＰ抗体と中和反応を
起こし、生物活性が抑制されることを示している。
クローナル抗体で処理し、ＴＩＭＰの除去された濃縮培
養上清液による胚発生促進活性を調べた（図７）。ＴＩ
ＭＰ抗体処理または無処理の濃縮培養上清液を５％及び
１０％の濃度になるように発生培地に加えたところ、抗
体処理した培養上清液の胚発生促進活性は、無処理培養
上清液にくらべて明らかに低下した。この結果は、培養
上清の胚発生促進活性は、抗ＴＩＭＰ抗体と中和反応を
起こし、生物活性が抑制されることを示している。
【図１】図１は、濃縮牛顆粒膜細胞の培養上清液をゲル
濾過高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶
出の状態を示す。
濾過高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶
出の状態を示す。
【図２】図２は、図１で得られた分子量約３万のＥＧ−
１をＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトグラィー
により精製する場合の溶出の状態を示す。
１をＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトグラィー
により精製する場合の溶出の状態を示す。
【図３】図３は、図２で得られた活性画分をＣ4 −逆相
高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶出の
状態を示す。
高速液体クロマトグラィーにより精製する場合の溶出の
状態を示す。
【図４】図４は、図３において完全精製されたＥＧ−１
とｂｏｖｉｎｅＴＩＭＰのアミノ酸配列の相同性を示
す。
とｂｏｖｉｎｅＴＩＭＰのアミノ酸配列の相同性を示
す。
【図５】図５は、図１で精製されたＥＧ−１と抗ＴＩＭ
Ｐモノクローナル抗体によるイミュノブロット実験によ
る免疫交差性を示す電気泳動図である。
Ｐモノクローナル抗体によるイミュノブロット実験によ
る免疫交差性を示す電気泳動図である。
【図６】図６は、顆粒膜細胞培養上清中にＴＩＭＰの存
在、ＥＧ−１とＴＩＭＰの同一性についてのイミュノブ
ロット実験による確認の結果を示す電気泳動図である。
在、ＥＧ−１とＴＩＭＰの同一性についてのイミュノブ
ロット実験による確認の結果を示す電気泳動図である。
【図７】図７は、濃縮顆粒膜細胞上清液を抗ＴＩＭＰモ
ノクローナル抗体により処理した後の胚発生促進活性の
変化を示すグラフである。
ノクローナル抗体により処理した後の胚発生促進活性の
変化を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 無血清培地中メタロプロテイナーゼイン
ヒビターの存在下で牛受精卵を体外培養することを特徴
とする胚発生方法。 - 【請求項２】 前記受精卵が、未成熟卵を採取後これを
体外成熟させそして体外受精させたものである、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 顆粒膜細胞を無血清培地中で培養し、そ
して培養上清からメタロプロテイナーゼインヒビターを
採取することを特徴とする、メタロプロテイナーゼイン
ヒビターの製造方法。 - 【請求項４】 前記無血清培地に成長因子が添加されて
いる、請求項５に記載の方法。 - 【請求項５】 前記無血清培地がインシュリンもしく
は、ＨＢＧＦ−２（別名：basic FGF ）又はこれらの混
合物を含有する、請求項５に記載の方法。 - 【請求項６】 メタロプロテイナーゼインヒビターを含
んで成る、牛受精卵の胚発生用培地のための添加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16546792A JPH0734698B2 (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | 牛胚の体外発生方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16546792A JPH0734698B2 (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | 牛胚の体外発生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197666A JPH06197666A (ja) | 1994-07-19 |
| JPH0734698B2 true JPH0734698B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=15812971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16546792A Expired - Fee Related JPH0734698B2 (ja) | 1992-06-02 | 1992-06-02 | 牛胚の体外発生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0734698B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160257918A1 (en) * | 2015-03-04 | 2016-09-08 | Berkeley Lights, Inc. | Generation and Selection of Embryos in Vitro |
-
1992
- 1992-06-02 JP JP16546792A patent/JPH0734698B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06197666A (ja) | 1994-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| De Smedt et al. | In vitro maturation and fertilization of goat oocytes | |
| Hyttel et al. | Rapid method to prepare mammalian oocytes and embryos for transmission electron microscopy | |
| Yoshida et al. | Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and developmental capacity in vitro | |
| Totey et al. | In vitro maturation and fertilization of buffalo oocytes (Bubalusbubalis): effects of media, hormones and sera | |
| Khatir et al. | Prepubertal bovine oocyte: a negative model for studying oocyte developmental competence | |
| Buhi et al. | De novo synthesis and release of polypeptides from cyclic and early pregnant porcine oviductal tissue in explant culture | |
| Chauhan et al. | Replacement of serum and hormone additives with follicular fluid in the IVM medium: effects on maturation, fertilization and subsequent development of buffalo oocytes in vitro | |
| Lee et al. | Effect of various growth factors in a defined culture medium on in vitro development of bovine embryos matured and fertilized in vitro | |
| Antinori et al. | Successful fertilization and pregnancy after injection of frozen-thawed round spermatids into human oocytes. | |
| Kątska-Książkiewicz et al. | Effects of oocyte quality, semen donor and embryo co-culture system on the efficiency of blastocyst production in goats | |
| Shaw et al. | An association between chromosomal abnormalities in rapidly frozen 2-cell mouse embryos and the ice-forming properties of the cryoprotective solution | |
| US20070010013A1 (en) | Oocytes derived from ovarian culture initially containing no oocytes | |
| Moore et al. | In vitro maturation of mammalian spermatozoa | |
| Maeda et al. | In vitro development of bovine embryos in conditioned media from bovine granulosa cells and vero cells cultured in exogenous proteinand amino acid-free chemically defined human tubal fluid medium | |
| CA2551266C (en) | Embryonic stem cell line and method for preparing the same | |
| WO2013006948A1 (en) | Methods and compositions for enhancing developmental potential of oocytes and preimplantation embryos | |
| JPH0734698B2 (ja) | 牛胚の体外発生方法 | |
| Freeman et al. | Coculture of mouse embryos with cells isolated from the human ovarian follicle, oviduct, and uterine endometrium | |
| Bhatt et al. | Fertilization, embryonic development and oviductal environment: role of estrogen induced oviductal glycoprotein | |
| SAĞIRKAYA et al. | Replacement of fetal calf serum with synthetic serum substitute in the in vitro maturation medium: effects on maturation, fertilization and subsequent development of cattle oocytes in vitro | |
| Abeydeera et al. | Ability of in vitro maturing bovine oocytes to transform sperm nuclei to metaphase chromosomes | |
| Okolski et al. | In‐vitro maturation of equine oocytes in co‐culture with granulosa and theca interna cells | |
| Zuccotti et al. | Collagenase as an agent for dissolving the zona pellucida of hamster and mouse oocytes | |
| JP2959856B2 (ja) | 牛胚の体外発生方法 | |
| JP2010507373A (ja) | 動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090419 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090419 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100419 Year of fee payment: 15 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |