JPH072898A - グリコシル化インシュリン及びそれを含む糖尿病治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 凝結に抵抗し血液の糖分のレベルを抑えるに
有効なインシュリン。 【構成】 合成サクシニル及びグリタリル・グルコサミ
ン，ｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グ
ルコー及びマンノピラノサイド，ｐ−（グルタリルアミ
ド）−フェニル−α−Ｄ−グルコー及びマンノピラノサ
イドならびにｐ−（イソチオシアノトフェニル）−α−
Ｄ−グルコー及びマンノピラノサイドをインシュリンと
反応せしめて、インシュリン１分子に対し１ないし３の
グリコシル基を含有する、符号するグリコシル化インシ
ュリンを調製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グリコシル化インシュ
リンの調製に関するものである。更に詳細には、本発明
はグリコシル化インシュリンの調製及びグリコシル化イ
ンシュリンの調製に使用される新規な中間体に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】患者の必要に応答する度合の高いインシ
ュリンを糖尿病患者に投与する各種のシステムが提案さ
れている。

【０００３】生物工学の解決方法はインシュリン注入ポ
ンプの設計に向けられている。多数の糖尿病患者が現在
外部バッテリー作動型ポンプを使用している。ポンプは
静脈内又は皮下組織内に挿入されるカテーテルに取付け
られた針を通じてインシュリンを連続的に注入する。そ
の流量は必要とされるインシュリンの量に変化が生じた
場合、自動的に調整可能である。そのユニットは通常ベ
ルト上に装架されるか又は脚にベルト止めされる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】血中のブドウ糖レベル
を測定する検出器によって正確に測定されるインシュリ
ンの量を送り出すポンプは今でも実験段階にある。この
分野で好結果を生んだ発展がなされてはいるが、これら
のポンプは依然重くて可搬式にはなり得ない。その他の
難点は、そのシステムが血液の連続的なサンプリング用
の装置と、血液中のブドウ糖のレベルを迅速且つ連続的
に決定する分析装置と、その分析結果を分析し最適なイ
ンシュリン服用量を決定するコンピューターと、膵臓の
ベータ細胞による分泌に近似している様式でインシュリ
ンを静脈内に送る注射ポンプを必要とする点である。シ
ステムの寸法を減少し、その検出器の寿命を伸ばす努力
が行なわれている。ブドウ糖検出器、電源、コンピュー
ター、インシュリン溜め及びポンプを含むタバコケース
の寸法になったシステムである『ベスト・ポケット』型
についてエリオット氏がJ. Am. Med. Assoc ２４１，２
２３（１９７９年）で報告している。

【０００５】現時点における他の障害は血液中のブドウ
糖の濃度を検出する正確な埋め込み式電極が欠けている
点である。長期間に亘り患者の血流に皮膚を通じて接続
すると、感染の危険や凝結といった問題が生ずる。又、
凝結したインシュリンはその溶液状態から凝結し又は結
晶化し、かくしてインシュリン溜め内のインシュリンの
生物学的効力を低減化させるところから相当の問題をか
かえている。その上、凝結したインシュリンは注射針内
にとどまり、インシュリンの流れが注入システムから糖
尿病患者へ流れるのを阻止する場合がある。

【０００６】従って、本発明の目的は、生体インシュリ
ン程迅速には凝結せず、そのため貯蔵寿命が長くなった
半合成インシュリンを調製することにある。

【０００７】凝結しない半合成インシュリンの調製に使
用する新規な中間化合物を調製することも本発明の目的
である。

【０００８】本発明の更に別の目的は血液の糖分のレベ
ルを抑える著しい生物学的効力を有するグリコシル化イ
ンシュリンを調製することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】これらの目的及び他の目
的は、次の一般式化３、化４、化５の１つを有する新規
なグリコシル化インシュリンによって達成可能である。

【００１０】

【化３】

【００１１】

【化４】

【００１２】

【化５】

【００１３】式中、ｍは１ないし３の整数であり、Ｘ及
びＺは異なり、−Ｈ及び−ＯＨから成る群より選択さ
れ、−Ｑ−は化６の式を有するジカルボキシル酸スペー
サー基である。化６の式でｎは２ないし６の整数であ
り、好適には２又は３である。

【００１４】

【化６】

【００１５】

【実施例】ブロンリー氏等がサイエンス、２０６．２２
３（１９７９年）に開示している如く、インシュリンは
麦芽糖と組合せ得ることが知られている。然し乍ら、こ
の二糖類とインシュリンの誘導体は血糖値を下げる著し
い生物学的効力は何んら有していないことが判明してい
る。

【００１６】本発明において、インシュリンと結合させ
る調製された中間体は全てスペーサー基に結合されるブ
ドウ糖又はマンノース単糖類から成っている。スペーサ
ー群はジカルボキシル酸、酸無水物又はフェニルアミン
又はこれらの組合せの酸から得られる。中間体は化７の
一般的な構造式を有している。

【００１７】

【化７】

【００１８】式中、ＹはＨ，化８又は化９；から成る基
より選択された一員であり、Ｘは−Ｈ，−ＯＨ又は化１
０；から成る基より選択した一員であり、Ｚは−Ｈ又は
−ＯＨから成る群の一員である。

【００１９】

【化８】

【００２０】

【化９】

【００２１】

【化１０】

【００２２】但し、Ｙが−Ｈである場合、Ｚも−Ｈでな
ければならず、Ｘは化１１でなければならない。Ｘが−
ＯＨである場合にはＺは−Ｈでなければならず、Ｙは化
１２又は化１３でなければならない。

【００２３】

【化１１】

【００２４】

【化１２】

【００２５】

【化１３】

【００２６】Ｚが−ＯＨである場合にはＸは−Ｈでなけ
ればならず、Ｙは化１４または化１５；でなければなら
ない。

【００２７】

【化１４】

【００２８】

【化１５】

【００２９】この化７の式でｎは２ないし６の整数であ
る。ｎは２又は３の整数であり、スペーサーの化１６の
部分はコハク酸又はグルタル無水物から得られる。

【００３０】

【化１６】

【００３１】前掲の構造式で述べた中間体は２つのサブ
・グループに分割可能である。

【００３２】第１のサブ・グループはグルコサミン誘導
体であり、ここでＺは−Ｈであり、Ｙは−Ｈであり、Ｘ
は化１７であり、ここでｎは２ないし６の整数である。

【００３３】

【化１７】

【００３４】第２のサブ・グループはＮ−サクシニル又
はＮ−グルタリル−アミド−フェニル−α−Ｄ−グルコ
ー及びマンノピラノサイド並びにｐ−イソチオシアノト
フェニル−α−Ｄ−グルコー及びマンノピラノサイドで
あり、ここでＸ及びＺは異なり、−Ｈ及び−ＯＨから成
る群より選択され、Ｙは化１８及び化１９から成る群よ
り選択される一員であり、ｎは２ないし６の整数であ
る。

【００３５】

【化１８】

【００３６】

【化１９】

【００３７】糖分にスペーサーグリコール化中間体を加
えたものの調製に使用する開始材料はグルコサミン及び
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコー及びマンノピラ
ノサイドであり、これらは市販されている。

【００３８】グルコサミンは直接酸無水物と反応可能で
ある。好適なスペーサーはサクシニル及びグルタリルの
部分であるので、残りの説明についてはこれらの誘導体
に向けられよう。然し乍ら、適当な合成によってアジピ
ン酸、ピメリン酸及びスベリン酸からの４種類の対応す
る誘導体も利用可能である。

【００３９】ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコー及
びマンノピラノサイドが最初に処理されてニトロ基をア
ミノ基に還元する。これらは次に、対応するＮ−サクシ
ニル−及びＮ−グルタリル誘導体を生成するためコハク
酸無水物及びグルタル酸無水物と反応可能である。

【００４０】ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−グルコー及
びマンノピラノサイドは対応するｐ−イソチオシアノト
フェニル−α−Ｄ−グルコー及びマンノピラノサイドを
形成するようチオホスゲンとも反応出来る。これらの生
成物の合成については以下に続く実施例で詳細に述べ
る。

【００４１】以下に続くグリコシル化中間体はインシュ
リンと結合するため使用出来る新規なピラノサイドの代
表的なものである。

【００４２】

【化２０】

【００４３】ｎ＝２ Ｎ−サクシニル・グルコサミン，
ｍ．ｐ．１７４−１７５℃ ｎ＝３ Ｎ−グルタリル・グルコサミン，ｍ．ｐ．１９
５−１９６℃

【００４４】

【化２１】

【００４５】ｎ＝２ ｐ−（サクシニルアミド）−フ
ェニル−α−Ｄ−グルコピラノサイド，ｍ．ｐ．１７８
−１８０℃ ｎ＝３ ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−
Ｄ−グルコピラノサイド，ｍ．ｐ．１６７−１６８℃

【００４６】

【化２２】

【００４７】ｎ＝２ ｐ−（サクシニルアミド）−フ
ェニル−α−Ｄ−マンノピラノサイド，ｍ．ｐ．６５−
６６℃ ｎ＝３ ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−
Ｄ−マンノピラノサイド，ｍ．ｐ．１３４−１３６℃

【００４８】

【化２３】

【００４９】ｐ−イソチオシアノトフェニル−α−Ｄ−
グルコピラノサイド

【００５０】

【化２４】

【００５１】ｐ−イソチオシアノトフェニル−α−Ｄ−
マンノピラノサイド

【００５２】インシュリン分子の構造は良く知られてい
る。その構造はシステインの二硫化結合により共に結合
された２個のポリペプチド鎖Ａ及びＢから成っている。
Ａ留分のＮ末端基はグリシン（グリＡ−１）であり、Ｂ
留分のＮ末端基はフェニル・アラニン（Ｐｈｅ Ｂ−
１）である。両方のＮ−末端位置には無反応α−アミノ
基が含まれている。Ｂ留分のＣ末端基に隣接して遊離ε
−アミノ基を有するリジンが存在している。これらの遊
離アミノ基はその最終的な沈澱によりインシュリン分子
の凝結問題に関係があると信じられている。

【００５３】これらの基を前述したグリコシル化中間体
でブロックすることによりインシュリンの生物学的効力
はあまり大きな影響を受けず、凝結が著しく禁止され又
は阻止されうると信じられていた。その他、グリコシル
化インシュリンは外部の又は埋込み式の検出装置の必要
を伴なわずに、血糖値の変化に直接応答する形で糖尿病
患者にインシュリンを与える耐薬品性解放機構に貢献す
る他の諸特性を有し得ると信じられている。

【００５４】先に示した中間体の反応はスペーサーの端
部においてカルボキシル酸をアルキルクロロフォルメー
トとの反応及び混合無水物の生体インシュリンとの反応
を通じて混合無水物に変換することにより行なわれた。
混合された無水物はアミド結合を介してモノ，ジ又はト
リグリコシル化インシュリンを生成すべくインシュリン
上の１つまたはそれ以上のＡ−１，Ｂ−１又はＢ−２９
の遊離アミノ基と反応する。置換の度合は中間体とイン
シュリンのモル比及びｐＨ値を含む反応条件に依存す
る。一般に中間体とインシュリンのモル比は２ないし１
０に変化する。反応の目的上、約８ないし９．５のｐＨ
値範囲が好ましい。

【００５５】反応が複雑であるためグリコシル化インシ
ュリンをモノ，ジ又はトリ置換誘導体として生成するこ
とは稀れであろう。むしろ、混合物が以下の実施例に示
される如く、得られよう。

【００５６】説明の目的上、グリコシル化インシュリン
は３つの部類に分類出来る。

【００５７】最初の部類は化２５のスペーサーを有し、
化２６の一般的な構造式を有するグルコサミンから調製
されるインシュリンである。

【００５８】

【化２５】

【００５９】

【化２６】

【００６０】式中、ｎは２ないし６の整数であり、ｍは
１ないし３の整数であり、グリコシル基はＡ−１グリシ
ン、Ｂ−フェニルアラニンのα−アミノ基又はインシュ
リン分子のＢ−２９リジン部分のε−アミノ基１つまた
はそれ以上を通じてインシュリンに付着されている。

【００６１】代表的なインシュリンは（グルコサミドサ
クシニル−）_m インシュリンおよび（グルコサミドグル
タリル−）_m インシュリンである。

【００６２】第２部類は化２８の一般的構造式を有する
化２７スペーサーと結合されたグルコ−及びマンノピラ
ノサイドを含む。

【００６３】

【化２７】

【００６４】

【化２８】

【００６５】式中、Ｘ及びＺは異なり、−Ｈ及び−ＯＨ
から成る群から選択され、ｎは２ないし６の整数であ
り、ｍは１ないし３の整数であり、各グリコシル基はＡ
−１グリシン、Ｂ−１フェニルアラニンのα−アミノ基
又はインシュリン分子のＢ−２９リジン部分のε−アミ
ノ基１つまたはそれ以上を通じてアミド結合によりイン
シュリンに付着されている。

【００６６】代表的な化合物には〔ｐ−（α−Ｄ−グル
コピラノシロキシ）−フェニル−Ｎ−サクシナミル〕イ
ンシュリン；〔ｐ−（α−Ｄ−グルコピラノシロキシ）
−フェニル−Ｎ−グルタラミル〕_m インシュリン；〔ｐ
−（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）−フェニル−Ｎ−
サクシナミル〕_m インシュリン；〔ｐ−（α−Ｄ−マン
ノピラノシロキシ）−フェニル−Ｎ−グルタラミル〕_m
インシュリンが含まれる。

【００６７】第３部類は化３０の一般的構造式を有する
化２９のスペーサーと結合されるグルコ−及びマンノピ
ラノサイドが含まれる。

【００６８】

【化２９】

【００６９】

【化３０】

【００７０】式中、Ｚ及びＸは異なり、−Ｈ及び−ＯＨ
で構成される群から選択され、ｍは１ないし３の整数で
あり、各グリコシル基はＡ−１グリシンのα−アミノ
基、インシュリン分子のＢ−２９リジン部分のε−アミ
ノ基の１またはそれ以上を通じてチオアミド結合により
インシュリンに付着されている。

【００７１】代表的な化合物には、〔ｐ−（α−Ｄ−グ
ルコピラノシロキシ）−フェニル−チオカルバモイル
−〕_m インシュリン及び〔ｐ−（α−Ｄ−マンノピラノ
シロキシ）−フェニル−チオカルバモイル−〕_m インシ
ュリンが含まれる。

【００７２】本発明に従って調製されたグリコシル化イ
ンシュリンは任意の慣用的な方法即ち皮下、筋肉内又は
腹膜腔内注射で糖尿病患者に投与出来る。投与量はＩＵ
単位（国際単位）では遊離又は生体インシュリンと同量
に出来る。投与量は患者の所要量に応じて広範に変化す
るので投与量の範囲を定める試みはなされないであろ
う。この投与量決定は患者の担当医の判断に任せられよ
う。一般に体重６０ｋｇの人には１日あたり２ｍｇのイ
ンシュリンの投与量が要求される。

【００７３】以下の実施例は中間体化合物の調製、グリ
コシル化インシュリンの調製、凝結の禁止又は阻止を行
なう当該インシュリンの生物学的効力と能力を示す。

【００７４】実施例Ｉ： Ｎ−サクシニルグルコサミンの調製。グルコサミン塩酸
塩（０．０５ｍ，１０．７８ｇ）を複蒸留水１５ｍｌお
よび０．０５ｍトリエチルアミン（６．９５ｍｌ）に溶
解させた。この溶液に攪拌によりアセトン３７．５ｍｌ
中のコハク酸無水物（０．０５ｍ，５．７０５ｇ）を加
えた。その結果得られた混合物を二層に分離し、充分な
量の水を加えてその両方の層を１つの溶液にした。その
溶液を室温で４時間放置し、反応を完了させ、その後、
溶液を真空室内に入れ、粘性の高い黄色を帯びた濃縮溶
液が得られる迄蒸発させた。その濃縮物を測定し、３倍
量の氷酢酸で稀釈し、その結果Ｎ−サクシニルグルコサ
ミンの白色沈澱物が生成された。その生成物を濾過によ
って酢酸溶液から分離し、エタノールで洗浄し、次に石
油エーテルで洗浄した。その結果得られた生成物の収率
は３９％であった。その生成物の融点は１７４−１７５
℃で、分子量は２７９．２６の計算モル重量の２．５％
内であった。その構造と分子量はＩＲ，ＮＭＲ及びＭＳ
／ＧＣスペクトルで確認された。

【００７５】実施例II： Ｎ−グルタリル グルコサミンの調製。グルタル酸無水
物を使って実施例Ｉの方法を追試した。生成物の収率は
４１％であった。融点は１９５−１９６℃であった。計
算したモル重量は２９３．２７であった。ＩＲ及びＮＭ
Ｒスペクトルを使って構造の確認を行なった。

【００７６】実施例III ： ｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノサイドの調製。第１段階において、３５０ｍｌの
メタノール中のｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピ
ラノサイド（１４ｍモル，４．２１４ｇ）をギ酸アンモ
ニウム（５６ｍモル，３．５４ｇ）及び炭素粒子上のパ
ラジウムを２５℃で混合することにより還元した。系全
体を窒素で４時間洗浄し、しかる後濾過し、濾液を減圧
下で蒸発させた。粗ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−グル
コピラノサイドをエタノール−水（５０：１）混合物内
で再結晶させることにより精製した。収率は７１％であ
った。融点は１６９−１７０℃であった。構造と分子量
をＩＲ及びＭＳ／ＧＣスペクトルによって確認した。実
測した分子量は、２７１．２７の計算モル重量の２．７
％以内にあった。

【００７７】実施例Ｉの方法に従ってｐ−アミノフェニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノサイドをサクシニル酸無水物
と反応させて収率５３％のｐ−（サクシニルアミド）−
フェニル−α−Ｄ−グルコピラノサイドを生成した。生
成物の融点は１７８−１８０℃であった。構造と分子量
をＩＲ，ＮＭＲ及びＭＳ／ＧＣスペクトルによって確認
した。実測した分子量は３７１．３４の計算モル重量の
２％以内にあった。

【００７８】実施例IV： ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノサイドの調製。サクシニル酸無水物の代わりにグ
ルタル酸無水物を使って実施例III の方法を追試した。
ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノサイドを収率６３％で生成し、その融点は１６７
−１６８℃であった。構造をＩＲスペクトルで確認し
た。計算モル重量は３８５．３７であった。

【００７９】実施例Ｖ： ｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノ
ピラノサイドの調製。最初に、実施例III で概説した方
法を使ってｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノ
サイドをｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノサ
イドに還元した。生成物の収率は９１％で、生成物は１
５０−１５３℃で溶融した。構造はＩＲスペクトルで確
認した。

【００８０】こうして得られたｐ−アミノフェニル−α
−Ｄ−マンノピラノサイドを実施例III で説明した方法
でサクシニル酸無水物と反応させて収率６７％の融点６
５−６６℃のｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α
−Ｄ−マンノピラノサイドを生成した。構造と分子量を
ＩＲ，ＭＮＲ，ＭＳ／ＧＣスペクトルを使って確認し
た。実測した分子量は３７１．３４の計算分子量の２％
以内であった。

【００８１】実施例VI： ｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノ
ピラノサイドの調製。実施例Ｖで概説した方法に従いグ
ルタル酸無水物をサクシニル酸無水物と置換した。その
結果得られたｐ−（グルタリルアミド）−フェニル−α
−Ｄ−マンノピラノサイドが溶融点１３４−１３６℃で
収率７５％で生成された。計算による分子量は３８５．
３７であった。構造をＩＲスペクトルで確認した。

【００８２】実施例VII ： ｐ−イソチオシアノトフェニル−α−Ｄ−グルコピラノ
サイドの調製。８０％水性エタノール中のｐ−（アミノ
フェニル）−α−Ｄ−グルコピラノサイドの溶液にチオ
ホスゲン（ＣＳＣＩ₂ ）の過剰モルが追加された。室温
で反応が実施され、数分間で完了した。結晶性生成物が
得られた。計算による分子量は３１３．３であった。

【００８３】実施例VIII： ｐ−イソチオシアノトフェニル−α−Ｄ−マンノピラノ
サイドの調製。ｐ−イソチオシアノトフェニル−α−Ｄ
−マンノピラノサイドを生成するためｐ−（アミノフェ
ニル）−α−Ｄ−マンノピラノサイドを対応するグルコ
ピラノサイドと置換するよう実施例VII の方法を適用出
来る。

【００８４】グルコサミンまたはｐ−アミノフェニル−
α−Ｄ−グルコー及びマンノピラノサイドとサクシニル
酸及びグルタル酸無水物の前述した組合せを合成したも
のを確認するため以下の試験を利用した。赤外線分光光
度計（ベックマン・ミクロラボ６２０ＭＸコンピューテ
ィング赤外分光光度計）がアミド結合の存在を検出する
ことによりアミノ基と無水物の間の反応を決定するため
使用された。０．５％（ｗ／ｗ）ＫＢｒペレットとして
試料が準備された。反応前のアミノ基の存在は１６５０
−１５８０ｃｍ^-1におけるＮ−Ｈ伸張帯域により検出さ
れた。対応するｐ−ニトロフェニル誘導体の還元により
調製されたｐ−アミノフェニル誘導体は還元反応が完了
したことを示す１５８０ｃｍ^-1及び１３３０ｃｍ^-1でＮ
−Ｏ伸張帯域を示さなかった。アミド結合の生成は１６
６０ｃｍ^-1におけるＣ＝Ｏ伸張帯域と１６００ｃｍ^-1に
おけるＮ−Ｈ曲げモードの存在により示された。通常の
二量体カルボキシルＣ＝Ｏ伸張帯域も約１７２５ｃｍ^-1
附近で見られた。これらのデータはアミノとジカルボキ
シル酸無水物反応体との間の結合反応の完了を示す明確
なアミド帯域を確認する。

【００８５】ＤＥＣ ＰＤＰ １１／３４コンピュータ
ーと、インターフェース状態にあるＬＫＢ ９０００Ｓ
ＭＳ／ＧＣ分光光度計を使って分子量がＭＳ−ＧＣス
ペクトルで形成された。炭水化物誘導体の揮発性はヒド
ロキシル及びカルボキシル酸基のトリメチルシリル誘導
体を使って高められた。全ての実施例においてトリメチ
ルシリル誘導体の観測された分子量は計算された理論値
の２．５±０．５以内であった。

【００８６】

【化３１】

【００８７】化３１の部分の存在はＪＯＥＬ ＪＮＭ−
ＦＸ２７０フーリア トランスフォームＮＭＲ分光光度
計を使用してプロトンＭＮＲスペクトルにより確認され
た。試料はＤ₂ Ｏ内に溶解され、ナトリウム２，２−ジ
メチル−２−シラペンタン−５−スルホン酸塩（ＤＳ
Ｓ）が内部基準成分として使用された。例えばｐ−（サ
クシニルアミド−α−Ｄ−グルコピラノサイド）におい
てはサクシニル部分内のメチレン基のプロトン信号が三
重項としてδ＝２．７１にて観測された。ピーク・エリ
アはサクシニル部分のメチレン プロトン４個を表わし
ているプロトンの個数に比例していた。溶融点は毛管溶
融点法によって測定された。

【００８８】ジカルボリル酸無水物を利用する前述のグ
ルコース及びマンノース誘導体の収率は約３９ないし９
１％の間で変動した。収率の変動は再結晶化のための限
定された溶媒（エタノール−水混合物）の使用に起因す
ると思われる。収率は再結晶化方法に対して適当な溶媒
を選択することにより増加させねばならない。

【００８９】前述したグリコシルアミドカルボキシル酸
の誘導体とインシュリンとの再結合作用は混合された無
水物が反応混合物から分離されないような混合無水物法
を通じて実行される。グリコシルアミドカルボキシル酸
はイソブチルクロロギ酸塩との反応により混合無水物に
変換され、その結果生じる混合無水物はアミド結合を形
成するためインシュリン分子からの遊離アミノ基と反応
する。この方法については、一般に、アーランガー氏等
のJ. Biol. Chem. ２２８，７１３（１９５７年）及び
アレカツ氏等のJ. Immunal., ９７，８５８（１９６
６）に説明されている。

【００９０】グリコシルアミドカルボキシル酸誘導体と
インシュリンとの反応に対しインシュリン分子上で利用
可能な１次サイトは３つあり、インシュリンはこれらの
誘導体の１つ、２つ又は３つにより結合可能である。こ
れらの利用可能なサイトにはグリシン（Ｇｌｙ Ａ−
１）のα−アミノ基、フェニルアラニン（Ｐｈｅ Ｂ−
１）及びインシュリン分子のリジン（Ｌｙｓ Ｂ−２
９）のε−アミノ基が含まれる。これらの基のｐＫａｐ
ｐ値はＧｌｙ Ａ−１に対し８．０、Ｐｈｅ Ｂ−１に
対し６．７及びＬｙｓ Ｂ−２９に対し１１．２であ
る。

【００９１】インシュリンはｐＨ値が高過ぎると変性す
るのでＬｙｓ Ｂ−２９部分のε−アミノ基を反応性の
低いプロトン化状態に維持するためグリコシル−アミド
−カルボキシル酸とインシュリンとの間の結合反応のｐ
Ｈ値は７．５と１０との間、好適には９．５が選択され
た。従って、Ｇｌｙ Ａ−１及びＰｈｅ Ｂ−１位置の
α−アミノ基は１次反応サイトとして考えられる。然し
乍ら、三置換グリコシル化インシュリンはイソブチルク
ロロギ酸塩による無水物の生成中に生成されたＨＣｌを
錯化するため添加された求核性の高いトリ−Ｎ−ブチル
アミンを使用することによりＬｙｓ Ｂ−２９部分から
の遊離ε−アミノ基が脱プロトン化により生成可能であ
るところから前掲の方法によっても生成出来る。また、
ヘンダーソン−ハッセルバッハ式に基づきｐＨ値９．５
で、Ｌｙｓ Ｂ−２９のε−アミノ基の約２％が遊離又
は脱プロトン化の形態で平衡状態に在る。従ってかなり
な量の三置換グリコシル化インシュリンを調製出来る。
然し乍ら、選択されたｐＨ値、即ち９．５及びそのｐＨ
値でＧｌｙ Ａ−１及びＰｈｅ Ｂ−１の反応性の高い
遊離アミノ基のためグリコシル化インシュリンは主とし
て二置換及び三置換誘導体の混合物となろう。若干の一
置換体も存在し得る。

【００９２】以下の実施例においては、反応しなかった
インシュリンがＣｏｎ−Ａ（コンカナバリン−Ａ）と結
合されたセハローズ小球体を有するカラムを使って親和
クロマトグラフィーによってグリコシル化インシュリン
から除去される。

【００９３】Ｃｏｎ−Ａは糖類に対し結合親和力を有し
ていることが知られている。それ故インシュリンに結合
されるグリコシル部分が多くなればなる程、グリコシル
化インシュリンがクロマトグラフィー カラム内のＣｏ
ｎ−Ａに対し結合される量が多くなる。従って、反応を
惹さなかったインシュリンはモノ−，ジ−及びトリ−グ
リコシル化インシュリンがこの順序で続くカラムを介し
て最初に溶離されることになろう。

【００９４】これは一般に正しい。然し乍ら、一部のグ
リコシル化誘導体は未反応インシュリンと共にカラムか
ら溶離されることがある。

【００９５】以下の実施例はＣｏｎ−Ａとの親和クロマ
トグラフィーで未反応インシュリンをグリコシル化イン
シュリンから分離する方法の典型的なものである。

【００９６】実施例IX： Ｎ−サクシニルグルコサミンの調製。 結合インシュリン（グルコサミノサクシニル インシュ
リン）。牛型インシュリン（８７．７７マイクロ モル
５００ｍｇ）を蒸留水と、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）の等容積混合物の２００ｍｌ中で溶解し、０．１Ｎ
水酸化ナトリウムでｐＨ値９．５に調整し、次に氷の槽
内で冷却した。Ｎ−サクシニルグルコースアミン、（８
００マイクロ モル）を各ゝトリ−Ｎ−ブチルアミン及
びイソブチルクロロギ酸塩の８００マイクロ モルを含
有するＤＭＦの溶液内で溶解し、０℃に２０分間保持し
た。トリ−Ｎ−ブチルアミン１．６ｍモルをこの溶液に
付加し、次に攪拌により混合してインシュリン溶液とし
た。こうして精製された反応混合物は０．１Ｎ水酸化ナ
トリウムで９．５のｐＨ値に調整され、０℃に１時間保
持された。次に混合物は室温で一昼夜保たれ、次に、未
反応Ｎ−サクシニルグルコサミンを除去するため蒸留水
に対し２日間、半透性膜を通じて透析された。蒸留水は
４℃に保持され、４時間毎に交換された。

【００９７】透析膜の内側に残留するグリコシル化イン
シュリンは親液化され、以下に説明するトリス−バッフ
ァー溶液中で溶解された。その結果生じた溶液は中に存
在するバクテリアの除去のため濾過により滅菌された。

【００９８】その滅菌された生成物をセファローズ４Ｂ
（ミズーリー州セントルイスのシグマ ケミカル社）に
結合された市販のＣｏｎ Ａ（コンカナバリン−Ａ）の
小球体を含有する２．５×６０ｃｍのカラム上に設置し
た。未反応インシュリンは１ｍｍ ＭｎＣｌ₂ 、１ｍｍ
ＣａＣｌ₂ 及び０．５ｍ ＮａＣｌも含有する０．０
２ｍトリス−バッファー溶離液を使用してカラムから除
去された。溶離液はｐＨ値が７．４であり、４℃に維持
された。流量は７２ｍｌ／時に維持され、７．０ｍｌの
留分が集められ、インシュリンの存在に対しＵＶスペク
トルによりＡ２７６ｎｍで分析された。フェノール−硫
酸検査を利用した４８０ｎｍにおける糖分の比色計によ
る測定も一部のＮ−サクシニルグルコサミン結合インシ
ュリンの存在を示した。

【００９９】図１に示す如く、約１０５分後に未反応イ
ンシュリン（成分１）すべてが２７６ｎｍにおいてＵＶ
スペクトルにより監視されて集められていた。その時点
で、０．１ｍ α−メチル−Ｄ−マンノピラノサイドが
溶離液としてトリス−バッファー溶液に加えられ、その
流量が７２ｍｌ／時に保持された。約２００分後にＮ−
サクシニルグルコサミン結合インシュリンから成る成分
２のすべてが図１にも示される如く集められた。

【０１００】Ｃｏｎ−Ａに対するグルコサミン部分の固
有の低結合力は遊離インシュリンと成分１内のグリコシ
ル化インシュリンの混合溶離液のためであると考えられ
ていた。４８０ｎｍにおける成分２内のグリコシル化イ
ンシュリンの低い吸着性が原因で置換度合は測定出来な
かった。

【０１０１】成分２内のグリコシル化インシュリンは血
糖値を下げる能力を測定するため凍結乾燥された。対応
するＮ−グルタリル グルコサミン結合インシュリン
（グルコサミノ・グルタリル・インシュリン）が同様の
様式で調製された。

【０１０２】実施例Ｘ： ｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノサイド結合インシュリンの調製。 〔ｐ−（α−Ｄ−グルコピラノシロキシ）−フェニル−
Ｎ−サクシナミル インシュリン〕。

【０１０３】実施例IXの方法が実施例III からのｐ−
（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノサイドを牛型インシュリンと反応させるため追試され
た。その結果を図２に示す。図２の成分１は４８０ｎｍ
におけるフェノール−硫酸法により実証された遊離イン
シュリンと一部のグリコシル化インシュリンで構成され
た。成分２及び３は集められ、インシュリンに対する２
７６ｎｍと同様、グリコシル基の存在に対しフェノール
硫酸法により検査された。成分３を分離するのに必要な
溶離液の量が多いため、成分３はインシュリン上のグリ
コシル基が成分２より多く含有していたことが予測出来
る。成分２及び３の曲線の下側の領域は、各ゝ５８．９
％及び４１．１％であった。成分２は主としてジグリコ
シル置換インシュリンであり、成分３は主としてトリグ
リコシル置換誘導体であった。従って結合された成分２
及び３内に含有されているインシュリン上のグリコシル
誘導体の平均個数である０．５８９×２＋０．４１１×
３＝２．４１１が得られた。この置換度合はインシュリ
ン分子あたり２．３のグリコシル基を示すフェノール硫
酸検査に固有のものであった。フェノール硫酸試験の詳
細についてはジュポア氏等のアナリティカル・ケミスト
リー２８，３５０（１９５６年）に説明してある。

【０１０４】集合成分２および３が組合されて溶離液除
去のため透析された後、精製生成物であるα−メチル−
Ｄ−マンノピラノサイドは生物学的試験のため凍結乾燥
された。

【０１０５】同じ方法により対応するｐ−（グルタリル
アミド）−フェニル−α−Ｄ−グルコピラノサイド結合
インシュリン〔ｐ−α−Ｄ−グルコピラノシロキシ）−
フェニル−Ｎ−グルタルアミル インシュリン〕が調製
された。

【０１０６】実施例XI： ｐ−（サクシニルアミド）−フェニル−α−Ｄ−マンノ
ピラノサイド結合インシュリンの調製。 〔ｐ−（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）−フェニル−
Ｎ−サクシナミル インシュリン〕。実施例Ｘに概説し
た方法を行ない、その溶離体の形状を図３に示す。成分
１はフェノール−硫酸検査が陰性であったため、未反応
遊離インシュリンであった。成分２及び３の組合せのた
めインシュリンに付着したグリコシル基の平均度合はフ
ェノール硫酸検査により２．５であった。成分２及び３
に対する曲線の下側の領域は各ゝ３４％及び６６％で前
述の試験結果と密に比較される２．６６の平均置換度を
示している。

【０１０７】精製した凍結乾燥生成物を血糖降下試験の
ため保持した。

【０１０８】対応するｐ−（グルタリルアミド）−フェ
ニル−α−Ｄ−マンノピラノサイド結合インシュリン〕
ｐ−（α−Ｄ−マンノピラノシロキシ）−フェニル−Ｎ
−グルタルアミル インシュリン〕が調製され、前述の
方法により精製された。

【０１０９】実施例XII ： ｐ−（α−Ｄ−グルコピラノシロキシ）−フェニル−チ
オカルバモイル インシュリンの調製。 実施例VII から得られたｐ−（イソチオシアノトフェニ
ル）−α−Ｄ−グルコピラノサイド（３５５．０８マイ
クロ モル）をピリジン３部と水１部の５℃の溶液内で
溶解し、そのｐＨ値を０．１ＮａＯＨで８．０に調整し
た。牛型インシュリン（１７７．５４マイクロ モル，
１ｇｍ）をピリジン−水の溶媒を使って調整しグルコピ
ラノサイド溶液と組合せた。その組合された溶液を５℃
でｐＨ値８．０に１時間保持し、次に室温で一昼夜放置
した。次に、ｐ−（α−Ｄ−グルコピラノシロキシ）−
フェニル−チオカルバモイル インシュリンから成る反
応生成物を実施例IXと同様凍結乾燥して未反応ｐ−（イ
ソチオシアノトフェニル）−α−Ｄ−グルコピラノサイ
ドを除去し、残りの生成物を凍結乾燥し、トリス・バッ
ファー内にて溶解し、実施例IXの場合と同様、Ｃｏｎ−
Ａセホラーゼ４Ｂカラム上の親和クロマトグラフィーに
提供した。流量は、４℃において２６ｍｌ／時であり、
５．０ｍｌの留分が集められた。溶離液の性状を図４に
示す。成分１は遊離インシュリンとグリコシル化インシ
ュリンの両方を含有し、成分２はインシュリン分子あた
り１．５グリコシル基の平均値を有するｐ−（α−Ｄ−
グルコピラノシロキシ）−フェニル−チオカルバモイル
インシュリンで構成されていた。

【０１１０】成分２からの生成物はα−メチル−Ｄ−マ
ンノピラノサイド溶離液を除去するため透析され、次に
生物学的試験のため凍結乾燥された。

【０１１１】実施例XIII：凝結試験 遊離インシュリン又は生体インシュリンに関連ある諸問
題の１つはインシュリンが凝結し最終的には溶液状態か
ら結晶化し、こうしてその生物学的効力を失なう傾向が
ある点である。グリコシル化インシュリンの場合、この
傾向はインシュリン内のＧｌｙ Ａ−１、Ｐｈｅ Ｂ−
１及びＬｙｓ Ｂ−２９の活性アミノサイトの部分がグ
リコシル基の結合反応によってブロックされるので著し
く減少される。

【０１１２】グリコシル化インシュリンとの比較による
遊離インシュリンを使った塊状凝結に関する検討が２つ
の方法により行なわれた。塊状凝結に関する検討では各
種水溶液とインシュリンの０．１ｍｇ／ｍｌを含有する
グリコシル化インシュリン溶液が凝結が目視される迄又
は２週間迄１５５５ｒｐｍで攪拌された。別の試験にお
いては、同じインシュリン濃度を含有する溶液をポリウ
レタン（バイオマー）上に析出させ、顕微鏡で凝結の観
察を行なった。その結果は表１の通りである。

【０１１３】

【表１】

【０１１４】グリコシル化インシュリンは凝結に対して
は遊離インシュリンより安定性が高く、従って貯蔵寿命
が良くなることが前述の結果から明らかである。

【０１１５】実施例XIV ： グリコシル化インシュリンの生物学的活性。本明細書で
説明したグリコシル化インシュリンの生物学的活性が血
糖降下試験により測定され、市販のインシュリン製剤及
び対照液と比較された。この試験において、普通の実験
用ラットをモデルにして２０時間絶食させた。基準とな
る血糖値を測定した後、遊離又はグリコシル化インシュ
リンのいずれか一方の１ｍｇ／ｋｇを腹膜腔内のルート
を通じて注入した。各ラット内の血糖値を注入後２０分
経って比色計により測定した。その結果について表２に
掲げる。

【０１１６】

【表２】

【０１１７】本明細書で説明した如く、調製済みの７種
類のグリコシル化インシュリンは全て血糖値を降下させ
る生物学的に著しい効力を有していることが前掲の内容
から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例IXに報告され述べてあるクロマトグラフ
ィー試験による溶離性状の線図である。

【図２】実施例Ｘに報告され述べてあるクロマトグラフ
ィー試験による溶離性状の線図である。

【図３】実施例XIに報告され述べてあるクロマトグラフ
ィー試験による溶離性状の線図である。

【図４】実施例XII に報告され述べてあるクロマトグラ
フィー試験による溶離性状の線図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 【化１】 化１の構造式を有するグリコシル化インシュリン。〔式
   中Ｚ及びＸが異なり、−Ｈ及び−ＯＨから成る群から選
   択され、ｍが１ないし３の整数であり、各グリコシル基
   がＡ−１グリシン、Ｂ−１フエニル・アラニンのα−ア
   ミノ基１種類以上又はインシュリン分子のＢ−29リジン
   部分のε−アミノ基を通じてチオアミド結合によりイン
   シュリンに付着している。〕
2. 【請求項２】 Ｚが−Ｈであり、Ｘが−ＯＨであるよう
   にした請求項１に記載のグリコシル化インシュリン。
3. 【請求項３】 Ｚが−ＯＨであり、Ｘが−Ｈであるよう
   にした請求項１に記載のグリコシル化インシュリン。
4. 【請求項４】 【化２】 製剤的に許容できるキャリア内で化２の構造式を有する
   グリコシル化インシュリンの有効量を含む糖尿病治療
   剤。〔式中Ｚ及びＸが異なり、−Ｈ及び−ＯＨから成る
   群より選択され、ｍが１ないし３の整数であり、各グリ
   コシル基がＡ−１グリシン、Ｂ−１フエニルアラニンの
   α−アミノ基１種類以上又はインシュリン分子のＢ−29
   リジン部分のε−アミノ基を通じてチオアミド結合によ
   りインシュリンに付着している。〕
5. 【請求項５】 グリコシル化インシュリンの有効量が患
   者の必要量を基に決定されている請求項４に記載の糖尿
   病治療剤。
6. 【請求項６】 Ｚが−Ｈであり、Ｘが−ＯＨであるよう
   にした請求項５に記載の糖尿病治療剤。
7. 【請求項７】 Ｚが−ＯＨであり、Ｘが−Ｈであるよう
   にした請求項５に記載の糖尿病治療剤。