JPH07242697A - 終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそれをコードするdna - Google Patents
終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそれをコードするdnaInfo
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそ
れをコードするDNAを提供する。 【構成】 図2、図3および図4に示されるアミノ酸配
列を有する、ウサギの終脳特異的膜蛋白テレンセファリ
ンをコードする、図2、図3および図4に示される塩基
配列を有するDNAのクローニングに成功した。
れをコードするDNAを提供する。 【構成】 図2、図3および図4に示されるアミノ酸配
列を有する、ウサギの終脳特異的膜蛋白テレンセファリ
ンをコードする、図2、図3および図4に示される塩基
配列を有するDNAのクローニングに成功した。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物由来の新規な
終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよび該蛋白をコー
ドするDNAに関する。
終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよび該蛋白をコー
ドするDNAに関する。
【0002】
【従来の技術】脳神経系の機能は、胎児期および生後発
達期に形成される神経細胞間のネットワークによっても
たらされる。神経細胞間のネットワークの形成には、
(1)神経細胞の軸索突起および樹状突起の伸長、(2)軸索
突起の投射経路のガイダンス、および(3)軸索突起と樹
状突起の間のシナプス形成の過程、が含まれる。これら
の過程は、細胞接着分子と呼ばれる膜蛋白が媒介する神
経細胞間の相互作用および神経細胞と基質との相互作用
によってコントロールされている。脳神経系の細胞接着
分子としては、カドヘリンスーパーファミリーの分子
群、インテグリンファミリーの分子群、およびイムノグ
ロブリンスーパーファミリーの分子群が知られている。
達期に形成される神経細胞間のネットワークによっても
たらされる。神経細胞間のネットワークの形成には、
(1)神経細胞の軸索突起および樹状突起の伸長、(2)軸索
突起の投射経路のガイダンス、および(3)軸索突起と樹
状突起の間のシナプス形成の過程、が含まれる。これら
の過程は、細胞接着分子と呼ばれる膜蛋白が媒介する神
経細胞間の相互作用および神経細胞と基質との相互作用
によってコントロールされている。脳神経系の細胞接着
分子としては、カドヘリンスーパーファミリーの分子
群、インテグリンファミリーの分子群、およびイムノグ
ロブリンスーパーファミリーの分子群が知られている。
【0003】神経細胞の表面膜は、軸索表面膜と細胞体
・樹状突起表面膜に分かれている。軸索表面膜に特異的
に発現している接着分子(軸索接着分子)として、L
1,Ng−CAM,Nr−CAM,TAG−1/アクソニ
ン−1,F3/F11,DM−GRASP/SC1(以
上、イムノグロブリンスーパーファミリー分子群)、E
−カドヘリン,N−カドヘリン,R−カドヘリン(以
上、カドヘリンスーパーファミリー分子群)が見いださ
れており、軸索突起の伸長、軸索束の形成、および軸索
突起のガイダンスに重要な役割をすると考えられてい
る。
・樹状突起表面膜に分かれている。軸索表面膜に特異的
に発現している接着分子(軸索接着分子)として、L
1,Ng−CAM,Nr−CAM,TAG−1/アクソニ
ン−1,F3/F11,DM−GRASP/SC1(以
上、イムノグロブリンスーパーファミリー分子群)、E
−カドヘリン,N−カドヘリン,R−カドヘリン(以
上、カドヘリンスーパーファミリー分子群)が見いださ
れており、軸索突起の伸長、軸索束の形成、および軸索
突起のガイダンスに重要な役割をすると考えられてい
る。
【0004】一方、細胞体・樹状突起に特異的に発現し
ている接着分子(樹状突起接着分子)はこれまで知られ
ていなかった。しかしながら、樹状突起接着分子は、軸
索接着分子と相互作用をして、軸索と樹状突起の間のシ
ナプス形成や樹状突起の伸長に働くと予想されている。
ている接着分子(樹状突起接着分子)はこれまで知られ
ていなかった。しかしながら、樹状突起接着分子は、軸
索接着分子と相互作用をして、軸索と樹状突起の間のシ
ナプス形成や樹状突起の伸長に働くと予想されている。
【0005】本発明者らは、先にウサギの終脳(嗅球、
大脳新皮質、線条体、海馬、嗅皮質、扁桃核および中隔
核)の神経細胞の細胞体・樹状突起膜に特異的に発現し
ている膜蛋白と特異的に結合するモノクローナル抗体2
71A6を作成することに成功した[森ら(Mori et a
l.)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3921-3925,(198
7)]。さらに、このモノクローナル抗体271A6が結
合する膜蛋白を、271A6抗体・アフィニティーカラ
ムを用いて精製したところ、この膜蛋白は分子量130
kdの糖蛋白質だと判明した。また、哺乳類の各種(ウサ
ギ、ラット、マウス、ネコ、サル)において終脳に特異
的に発現していることより、終脳特異的膜蛋白(テレン
セファリン)と名付けた[岡ら(Oka et al.)Neurosc
i. 35, 93-105,(1990)]。このテレンセファリンは、最
初に見つかった樹状突起接着分子ではないかと考えられ
る。
大脳新皮質、線条体、海馬、嗅皮質、扁桃核および中隔
核)の神経細胞の細胞体・樹状突起膜に特異的に発現し
ている膜蛋白と特異的に結合するモノクローナル抗体2
71A6を作成することに成功した[森ら(Mori et a
l.)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3921-3925,(198
7)]。さらに、このモノクローナル抗体271A6が結
合する膜蛋白を、271A6抗体・アフィニティーカラ
ムを用いて精製したところ、この膜蛋白は分子量130
kdの糖蛋白質だと判明した。また、哺乳類の各種(ウサ
ギ、ラット、マウス、ネコ、サル)において終脳に特異
的に発現していることより、終脳特異的膜蛋白(テレン
セファリン)と名付けた[岡ら(Oka et al.)Neurosc
i. 35, 93-105,(1990)]。このテレンセファリンは、最
初に見つかった樹状突起接着分子ではないかと考えられ
る。
【0006】終脳部は、学習、記憶、感覚・知覚、運動
の統合、感情、言語等、最も高次な神経機能を有してお
り、その神経細胞間ネットワークの形成にテレンセファ
リンが関与していると考えられる。また、脳内出血や脳
こうそく等による終脳部の神経細胞ネットワークの損傷
後の、機能回復過程においてもテレンセファリンが関与
していると予想される。さらに、免疫系における細胞接
着分子が、各種のウイルスの受容体(たとえばICAM
がライノウイルス受容体に、CD4がエイズウイルスの
受容体に)なっていることより、テレンセファリンが脳
炎を引き起こす各種ウイルスの受容体になっている可能
性が考えられ、終脳部の疾病との関係も興味深い。
の統合、感情、言語等、最も高次な神経機能を有してお
り、その神経細胞間ネットワークの形成にテレンセファ
リンが関与していると考えられる。また、脳内出血や脳
こうそく等による終脳部の神経細胞ネットワークの損傷
後の、機能回復過程においてもテレンセファリンが関与
していると予想される。さらに、免疫系における細胞接
着分子が、各種のウイルスの受容体(たとえばICAM
がライノウイルス受容体に、CD4がエイズウイルスの
受容体に)なっていることより、テレンセファリンが脳
炎を引き起こす各種ウイルスの受容体になっている可能
性が考えられ、終脳部の疾病との関係も興味深い。
【0007】テレンセファリンの構造および性質を明ら
かにすることは、テレンセファリンが樹状突起接着分子
かどうかを判定するとともに、テレンセファリンの生理
作用の解明およびテレンセファリン関連疾患の治療法の
開発に寄与すると考えられる。
かにすることは、テレンセファリンが樹状突起接着分子
かどうかを判定するとともに、テレンセファリンの生理
作用の解明およびテレンセファリン関連疾患の治療法の
開発に寄与すると考えられる。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、テレン
セファリンの作用機構を理解し、種々の分野で有効に利
用するには、テレンセファリンの構造を決定し、その性
質を明らかにすることが必須である。そのためにはテレ
ンセファリンを単離し、該ポリペプチドのアミノ酸配列
を決定し、それをコードするDNAのヌクレオチド配列
を決定することが必要である。
セファリンの作用機構を理解し、種々の分野で有効に利
用するには、テレンセファリンの構造を決定し、その性
質を明らかにすることが必須である。そのためにはテレ
ンセファリンを単離し、該ポリペプチドのアミノ酸配列
を決定し、それをコードするDNAのヌクレオチド配列
を決定することが必要である。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、モノクロ
ーナル抗体271A6を用いてウサギの終脳からテレン
セファリン蛋白質を精製し、その一部のアミノ酸配列を
決定した。この一部アミノ酸配列をもとにして、オリゴ
ヌクレオチドのプライマーを作成し、ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション法(PCR)でテレンセファリン
の一部分(84塩基対)に対応するPCR産物を得た。
次いで、ウサギ大脳皮質のcDNAライブラリーを構築
し、該ライブラリーから、上記PCR産物をプローブと
してテレンセファリンをコードするcDNAを単離、ク
ローニングし、そのヌクレオチド配列、並びにテレンセ
ファリンのアミノ酸配列を推定し、構造ならびに特性を
分析した。このDNAのヌクレオチド配列は図2、図3
および図4に示されている。また、図2、図3および図
4には推定アミノ酸配列も併記されている。このDNA
でL929細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培
養すると、得られた形質転換体は、テレンセファリンの
性質を有するポリペプチドを産生した。即ち、本発明の
テレンセファリンをコードするDNAで形質転換された
L929細胞の細胞膜は、モノクローナル抗体271A
6と特異的に結合した。また、このcDNAから推定さ
れたアミノ酸配列には、精製したテレンセファリンより
決定した部分アミノ酸配列のすべてが含まれていた。さ
らに、ノザンブロット法により、このcDNAと結合す
るmRNAは、終脳部位にのみ選択的に発現しているの
が観察された。これらの事実は、本発明のcDNAがウ
サギのテレンセファリンをコードしていることを証明す
るものである。
ーナル抗体271A6を用いてウサギの終脳からテレン
セファリン蛋白質を精製し、その一部のアミノ酸配列を
決定した。この一部アミノ酸配列をもとにして、オリゴ
ヌクレオチドのプライマーを作成し、ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション法(PCR)でテレンセファリン
の一部分(84塩基対)に対応するPCR産物を得た。
次いで、ウサギ大脳皮質のcDNAライブラリーを構築
し、該ライブラリーから、上記PCR産物をプローブと
してテレンセファリンをコードするcDNAを単離、ク
ローニングし、そのヌクレオチド配列、並びにテレンセ
ファリンのアミノ酸配列を推定し、構造ならびに特性を
分析した。このDNAのヌクレオチド配列は図2、図3
および図4に示されている。また、図2、図3および図
4には推定アミノ酸配列も併記されている。このDNA
でL929細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培
養すると、得られた形質転換体は、テレンセファリンの
性質を有するポリペプチドを産生した。即ち、本発明の
テレンセファリンをコードするDNAで形質転換された
L929細胞の細胞膜は、モノクローナル抗体271A
6と特異的に結合した。また、このcDNAから推定さ
れたアミノ酸配列には、精製したテレンセファリンより
決定した部分アミノ酸配列のすべてが含まれていた。さ
らに、ノザンブロット法により、このcDNAと結合す
るmRNAは、終脳部位にのみ選択的に発現しているの
が観察された。これらの事実は、本発明のcDNAがウ
サギのテレンセファリンをコードしていることを証明す
るものである。
【0010】本発明によれば哺乳動物のテレンセファリ
ンのアミノ酸配列は種間で相同性が高く、従って、図
2、図3および図4のDNA配列に基づいてプローブを
作成し、ウサギ以外の哺乳動物の終脳cDNAライブラ
リーをクロス・ハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングすれば、該哺乳動物の終脳特異的膜蛋白テレン
セファリンをコードするcDNAを得ることができ、こ
れを適当な発現ベクターに組み込み、次いで適当な宿主
細胞に該ベクターを導入した後、該宿主細胞を培養すれ
ば、所望の哺乳動物のテレンセファリンを製造すること
ができることが判明した。下記の実施例では、この方法
によるマウスのテレンセファリンの製造例について記載
したが、この方法は勿論ヒトにも適用でき、ヒトのテレ
ンセファリンを取得することもできる。ヒトのテレンセ
ファリンは、それ自体、直接医薬として使用することが
可能であると思われるが、ヒト以外の哺乳動物のテレン
セファリンは、該哺乳動物を実験モデルにすることによ
り、種々の脳疾患の解明に役立つものと期待される。
尚、上記テレンセファリンの製造法で使用する発現ベク
ターおよび宿主細胞は特に限定されるものではなく、以
下の実施例に挙げたものは、望ましい発現ベクターおよ
び宿主細胞の例示に過ぎない。例えばpcDNA3以外
にCDM8(インビトロジェン),pEF−BOS[水
島と長田(Mizushima and Nagata)Nucl.Acid Res.18:532
2]などの発現ベクターがあり、導入細胞としてはL9
29細胞の外に、CDS7細胞、Neuro2A細胞
(いずれもアメリカンタイプカルチャーコレクション)
がある。従って、本発明は、哺乳動物のテレンセファリ
ンを提供するものであり、また図2、図3および図4の
DNA配列を使用した哺乳動物テレンセファリンの製造
方法を提供するものである。さらに、本発明は、ウサギ
由来テレンセファリンをコードするDNAを提供するも
のである。以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
ンのアミノ酸配列は種間で相同性が高く、従って、図
2、図3および図4のDNA配列に基づいてプローブを
作成し、ウサギ以外の哺乳動物の終脳cDNAライブラ
リーをクロス・ハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングすれば、該哺乳動物の終脳特異的膜蛋白テレン
セファリンをコードするcDNAを得ることができ、こ
れを適当な発現ベクターに組み込み、次いで適当な宿主
細胞に該ベクターを導入した後、該宿主細胞を培養すれ
ば、所望の哺乳動物のテレンセファリンを製造すること
ができることが判明した。下記の実施例では、この方法
によるマウスのテレンセファリンの製造例について記載
したが、この方法は勿論ヒトにも適用でき、ヒトのテレ
ンセファリンを取得することもできる。ヒトのテレンセ
ファリンは、それ自体、直接医薬として使用することが
可能であると思われるが、ヒト以外の哺乳動物のテレン
セファリンは、該哺乳動物を実験モデルにすることによ
り、種々の脳疾患の解明に役立つものと期待される。
尚、上記テレンセファリンの製造法で使用する発現ベク
ターおよび宿主細胞は特に限定されるものではなく、以
下の実施例に挙げたものは、望ましい発現ベクターおよ
び宿主細胞の例示に過ぎない。例えばpcDNA3以外
にCDM8(インビトロジェン),pEF−BOS[水
島と長田(Mizushima and Nagata)Nucl.Acid Res.18:532
2]などの発現ベクターがあり、導入細胞としてはL9
29細胞の外に、CDS7細胞、Neuro2A細胞
(いずれもアメリカンタイプカルチャーコレクション)
がある。従って、本発明は、哺乳動物のテレンセファリ
ンを提供するものであり、また図2、図3および図4の
DNA配列を使用した哺乳動物テレンセファリンの製造
方法を提供するものである。さらに、本発明は、ウサギ
由来テレンセファリンをコードするDNAを提供するも
のである。以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
【0011】実施例 1.モノクローナル抗体271A6を用いた免疫組織化
学法に よるテレンセファリンタンパク質発現解析 免疫組織化学法は森ら[Mori et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 84: 3921-3925 (1987)]の方法に準じて行
った。体重約2.5kgの日本白ウサギをペントバルビター
ル(40mg/kg)で深麻酔し、生理的食塩水及び3%パラホ
ルムアルデヒド/リン酸緩衝液(pH7.4)で心臓灌流を
行った。その後、脳を取り出し、3%パラホルムアルデ
ヒド/リン酸緩衝液(pH7.4)中に4℃にて一晩浸漬し、
後固定を行い、その後30%ショ糖/リン酸緩衝液(pH7.
4)中で保存した。脳切片作成装置(freezing microtom
e)を用いて厚さ40μmの脳切片を作成した。切片をモノ
クローナル抗体271A6培養上清中に4℃で一晩浸漬
し、トリス緩衝液で洗浄後、ワサビペルオキシダーゼ結
合抗マウスIgGと反応させた。この脳切片上での27
1A6抗体の結合部位をジアミノベンチジンによる発色
を指標にして顕微鏡下で観察しテレンセファリンタンパ
ク質の発現部位を解析した。
学法に よるテレンセファリンタンパク質発現解析 免疫組織化学法は森ら[Mori et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 84: 3921-3925 (1987)]の方法に準じて行
った。体重約2.5kgの日本白ウサギをペントバルビター
ル(40mg/kg)で深麻酔し、生理的食塩水及び3%パラホ
ルムアルデヒド/リン酸緩衝液(pH7.4)で心臓灌流を
行った。その後、脳を取り出し、3%パラホルムアルデ
ヒド/リン酸緩衝液(pH7.4)中に4℃にて一晩浸漬し、
後固定を行い、その後30%ショ糖/リン酸緩衝液(pH7.
4)中で保存した。脳切片作成装置(freezing microtom
e)を用いて厚さ40μmの脳切片を作成した。切片をモノ
クローナル抗体271A6培養上清中に4℃で一晩浸漬
し、トリス緩衝液で洗浄後、ワサビペルオキシダーゼ結
合抗マウスIgGと反応させた。この脳切片上での27
1A6抗体の結合部位をジアミノベンチジンによる発色
を指標にして顕微鏡下で観察しテレンセファリンタンパ
ク質の発現部位を解析した。
【0012】2.ウサギ・テレンセファリンタンパク質
の精製とその部 分アミノ酸配列の決定 テレンセファリンタンパク質はウサギ終脳可溶化物から
モノクローナル抗体271A6セファロース免疫親和性
カラムを用いて精製した。精製タンパク質を還元カルボ
キシメチル化し、リジルエンドペプチダーゼで加水分解
した。得られたペプチド断片を逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで分離し、ペプチド・シークエンサーでアミノ
酸配列を決定した。
の精製とその部 分アミノ酸配列の決定 テレンセファリンタンパク質はウサギ終脳可溶化物から
モノクローナル抗体271A6セファロース免疫親和性
カラムを用いて精製した。精製タンパク質を還元カルボ
キシメチル化し、リジルエンドペプチダーゼで加水分解
した。得られたペプチド断片を逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで分離し、ペプチド・シークエンサーでアミノ
酸配列を決定した。
【0013】3.SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びウェス タン・ブロット法 精製テレンセファリンタンパク質をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法[レムリ(Laemmli)Nature 22
7: 680-685 (1970)]によって純度解析し、さらにウェ
スタン・ブロット法[吉原ら(Yoshihara et al.)J. Ce
ll Biol. 115:731-744 (1991)]で免疫活性を解析し
た。
泳動及びウェス タン・ブロット法 精製テレンセファリンタンパク質をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法[レムリ(Laemmli)Nature 22
7: 680-685 (1970)]によって純度解析し、さらにウェ
スタン・ブロット法[吉原ら(Yoshihara et al.)J. Ce
ll Biol. 115:731-744 (1991)]で免疫活性を解析し
た。
【0014】4.ウサギ及びマウスのテレンセファリン
cDNAのクロ ーニング ウサギ・テレンセファリンタンパク質の部分アミノ酸配
列をもとにして二つの混合オリゴヌクレオチド(5'-AA
[AG][AC]GI[CT]TIAA[CT]CCIGA[AG]GTIACI[CT]T-3'と5'-
[CT]TT[AGT]ATICC[CT]TC[CT]TC[CT]TCIGCIGTIGC-3')を
合成した。これらをプライマーとして、またウサギ大脳
皮質cDNAを鋳型としてポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション(PCR)法を行うと、84塩基対のPCR
産物を得ることができ、その塩基配列を決定した。塩基
配列から推定されるアミノ酸配列は、上記2で決定した
テレンセファリンタンパク質部分アミノ酸配列と完全に
一致したことから、このPCR産物はテレンセファリン
cDNAの一部分であることがわかった。
cDNAのクロ ーニング ウサギ・テレンセファリンタンパク質の部分アミノ酸配
列をもとにして二つの混合オリゴヌクレオチド(5'-AA
[AG][AC]GI[CT]TIAA[CT]CCIGA[AG]GTIACI[CT]T-3'と5'-
[CT]TT[AGT]ATICC[CT]TC[CT]TC[CT]TCIGCIGTIGC-3')を
合成した。これらをプライマーとして、またウサギ大脳
皮質cDNAを鋳型としてポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション(PCR)法を行うと、84塩基対のPCR
産物を得ることができ、その塩基配列を決定した。塩基
配列から推定されるアミノ酸配列は、上記2で決定した
テレンセファリンタンパク質部分アミノ酸配列と完全に
一致したことから、このPCR産物はテレンセファリン
cDNAの一部分であることがわかった。
【0015】このPCR産物の中央部47塩基のオリゴ
ヌクレオチド(5'-GTCACCCTCGAGGGGGACGCAATCGTGGCCACC
GCCACCGCCACGGC-3')を合成し、これをプローブとして
ウサギ大脳皮質λgt11cDNAライブラリーをスク
リーニングした。70万の組変え体プラークのスクリー
ニングによって、6個の陽性クローンを得ることができ
た。これらのインサート部分をプラスミドpBluescriptI
I SK(+)(ストラタジーン)のEcoRI部位に組み込んだ。
制限酵素マッピング解析によってこれら6つのクローン
は同じDNAに由来することがわかった。塩基配列の決
定はT-141とT-112の二つのクローンについて両方向から
行った。決定したテレンセファリンのcDNAの塩基配
列およびそれから推定されたアミノ酸配列は、図2、図
3および図4で示したものであった。
ヌクレオチド(5'-GTCACCCTCGAGGGGGACGCAATCGTGGCCACC
GCCACCGCCACGGC-3')を合成し、これをプローブとして
ウサギ大脳皮質λgt11cDNAライブラリーをスク
リーニングした。70万の組変え体プラークのスクリー
ニングによって、6個の陽性クローンを得ることができ
た。これらのインサート部分をプラスミドpBluescriptI
I SK(+)(ストラタジーン)のEcoRI部位に組み込んだ。
制限酵素マッピング解析によってこれら6つのクローン
は同じDNAに由来することがわかった。塩基配列の決
定はT-141とT-112の二つのクローンについて両方向から
行った。決定したテレンセファリンのcDNAの塩基配
列およびそれから推定されたアミノ酸配列は、図2、図
3および図4で示したものであった。
【0016】図2、図3および図4で示したテレンセフ
ァリンcDNAを全長にわたってプラスミドpBluscript
IISK(+)(ストラタジーン)のEcoRI部位に組み込み、形質
転換菌Esherichia Coli K12/pBS-rTLN(JM109)を作成し
た。この様にして得た形質転換菌、Escherichia Coli K
12/pBS-rTLN(JM 109)は工業技術院生命工学技術研究所
に寄託した(受託日;平成6年2月15日、受託番号FER
M P-14148)。次にマウス・テレンセファリンのcDNA
クローンを得るために、ウサギ・テレンセファリンの全
長を含むDNAをプローブとして、マウス終脳λgt1
1cDNAライブラリーをクロス・ハイブリダイゼーシ
ョン法によってスクリーニングした。100万の組変え
体プラークから3個の陽性クローンを得ることができ、
これらの塩基配列を両方向から決定した。
ァリンcDNAを全長にわたってプラスミドpBluscript
IISK(+)(ストラタジーン)のEcoRI部位に組み込み、形質
転換菌Esherichia Coli K12/pBS-rTLN(JM109)を作成し
た。この様にして得た形質転換菌、Escherichia Coli K
12/pBS-rTLN(JM 109)は工業技術院生命工学技術研究所
に寄託した(受託日;平成6年2月15日、受託番号FER
M P-14148)。次にマウス・テレンセファリンのcDNA
クローンを得るために、ウサギ・テレンセファリンの全
長を含むDNAをプローブとして、マウス終脳λgt1
1cDNAライブラリーをクロス・ハイブリダイゼーシ
ョン法によってスクリーニングした。100万の組変え
体プラークから3個の陽性クローンを得ることができ、
これらの塩基配列を両方向から決定した。
【0017】5.ノザン・ブロット法によるウサギ・テ
レンセファリン mRNA発現の解析 ウサギの様々な組織からグアニジンチオシアネート/酸
フェノール法[チョモシジンスキーら(Chomczynski et
al.)Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)]により総
RNAを抽出した。等量(10μg)の各組織総RNAを
6.6%ホルムアルデヒド含有1.5%アガロースゲル中で電
気泳動し、ナイロン膜(Amasham)上に転写した。ウサ
ギ・テレンセファリンcDNA(全長)をランダム・プ
ライマー法で32P標識したものをプローブとして用い
た。ハイブリダイゼーションは0.5M NaH2PO4(pH7.2)、
7% SDS、1 mM EDTA、1% ウシ血清アルブミン中で65
℃、一晩行い[チャーチとギルバート(Church and Gil
bert)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (198
4)]、0.1xSSC、1 mM NaH2PO4、0.5% SDS中、60℃で洗
浄を行った。放射活性はイメージ・アナライザー(Fuj
i)を用いて検出した。
レンセファリン mRNA発現の解析 ウサギの様々な組織からグアニジンチオシアネート/酸
フェノール法[チョモシジンスキーら(Chomczynski et
al.)Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)]により総
RNAを抽出した。等量(10μg)の各組織総RNAを
6.6%ホルムアルデヒド含有1.5%アガロースゲル中で電
気泳動し、ナイロン膜(Amasham)上に転写した。ウサ
ギ・テレンセファリンcDNA(全長)をランダム・プ
ライマー法で32P標識したものをプローブとして用い
た。ハイブリダイゼーションは0.5M NaH2PO4(pH7.2)、
7% SDS、1 mM EDTA、1% ウシ血清アルブミン中で65
℃、一晩行い[チャーチとギルバート(Church and Gil
bert)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (198
4)]、0.1xSSC、1 mM NaH2PO4、0.5% SDS中、60℃で洗
浄を行った。放射活性はイメージ・アナライザー(Fuj
i)を用いて検出した。
【0018】6.in situ ハイ ブリダイゼーション法に
よるマウス・テレンセファリンmRNAの脳における発
現の詳細 な解析 脳におけるテレンセファリンmRNAの発現分布の詳細
な解析を、35Sで標識したアンチセンスRNAを用いて
in situ ハイブリダイゼーション法[サイモンズら(S
immons et al.)、 J.Histotechnol. 12: 169-181 (198
9)]により行った。マウス・テレンセファリンのアンチ
センスRNAプローブは、0.4 kb BalI断片(ヌクレオ
チド889-1301)をpBluescript KS(+)にサブクローニン
グし、RNAトランスクリプション・キット(Stratage
ne)と35S−UTPを用いてインビトロで転写して調製
した。パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドで
固定したマウス脳から脳切片作成装置(sliding microt
ome)を用いて厚さ30μmの脳切片を作成し、ゼラチン処
理を施したスライド・ガラス上に吸着させた。脳切片を
乾燥後、プロテイネースKで処理し(10μg/ml、37℃、
30分)、アセチル化、脱水後、風乾した。プローブ(1x
106 cpm/ml)とのハイブリダイゼーションは、ハイブリ
ダイゼーション緩衝液(50% ホルムアミド、20 mM Tri
s-HCl[pH7.6]、1 mM EDTA、0.3 M NaCl、0.1 mM ジチオ
スレイトール、0.5mg/ml 酵母tRNA、1x Denhardt's溶
液、10%デキストランサルフェート)中、56℃で一晩行
った。その後、脳切片を4x SSCで洗浄、RNaseA処
理(10μg/ml、37℃、30分)、0.1x SSCで洗浄、脱水、
風乾後、Hyperfilim βmax(Amersham)に1日暴露し
た。エマルジョンオートラジオグラフィーには、蒸留水
で1:1希釈したNTB2エマルジョン(Kodak)に浸
け、3週間暴露した。現像後、脳切片をチオニンで染色
した。
よるマウス・テレンセファリンmRNAの脳における発
現の詳細 な解析 脳におけるテレンセファリンmRNAの発現分布の詳細
な解析を、35Sで標識したアンチセンスRNAを用いて
in situ ハイブリダイゼーション法[サイモンズら(S
immons et al.)、 J.Histotechnol. 12: 169-181 (198
9)]により行った。マウス・テレンセファリンのアンチ
センスRNAプローブは、0.4 kb BalI断片(ヌクレオ
チド889-1301)をpBluescript KS(+)にサブクローニン
グし、RNAトランスクリプション・キット(Stratage
ne)と35S−UTPを用いてインビトロで転写して調製
した。パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドで
固定したマウス脳から脳切片作成装置(sliding microt
ome)を用いて厚さ30μmの脳切片を作成し、ゼラチン処
理を施したスライド・ガラス上に吸着させた。脳切片を
乾燥後、プロテイネースKで処理し(10μg/ml、37℃、
30分)、アセチル化、脱水後、風乾した。プローブ(1x
106 cpm/ml)とのハイブリダイゼーションは、ハイブリ
ダイゼーション緩衝液(50% ホルムアミド、20 mM Tri
s-HCl[pH7.6]、1 mM EDTA、0.3 M NaCl、0.1 mM ジチオ
スレイトール、0.5mg/ml 酵母tRNA、1x Denhardt's溶
液、10%デキストランサルフェート)中、56℃で一晩行
った。その後、脳切片を4x SSCで洗浄、RNaseA処
理(10μg/ml、37℃、30分)、0.1x SSCで洗浄、脱水、
風乾後、Hyperfilim βmax(Amersham)に1日暴露し
た。エマルジョンオートラジオグラフィーには、蒸留水
で1:1希釈したNTB2エマルジョン(Kodak)に浸
け、3週間暴露した。現像後、脳切片をチオニンで染色
した。
【0019】7.サザン・ブロット法によるマウス・テ
レンセファリン 染色体DNAの解析 マウス脳から染色体DNAを調製し[ブリンとスタフォ
ード(Blin and Stafford)Nucl. Acids Res. 3: 2303-
2308]、10μgDNAを各種制限酵素で切断し、0.8%ア
ガロースゲル中で電気泳動を行った。ゲル中のDNAを
ナイロン膜(Amersham)に転写後、32Pで標識したマウ
ス・テレンセファリンcDNA(完全長)とハイブリダ
イゼーションを行った。放射活性はイメージ・アナライ
ザー(Fuji)を用いて検出した。
レンセファリン 染色体DNAの解析 マウス脳から染色体DNAを調製し[ブリンとスタフォ
ード(Blin and Stafford)Nucl. Acids Res. 3: 2303-
2308]、10μgDNAを各種制限酵素で切断し、0.8%ア
ガロースゲル中で電気泳動を行った。ゲル中のDNAを
ナイロン膜(Amersham)に転写後、32Pで標識したマウ
ス・テレンセファリンcDNA(完全長)とハイブリダ
イゼーションを行った。放射活性はイメージ・アナライ
ザー(Fuji)を用いて検出した。
【0020】8.L929マウス繊維芽細胞へのウサギ
・テレンセファ リンcDNAの導入 L929マウス繊維芽細胞(理科学研究所・細胞銀行R
CB081)は10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変
イーグル培地で培養した。ウサギ・テレンセファリンc
DNA(完全長)を発現ベクターpcDNA3(インビ
トロジェン)にサブクローニングし、線状化した後、リ
ポフェクチン(BRL/Gibco)を用いてL929細胞に導
入した。抗生物質G418(600μg/ml)存在下での培
養で、安定にテレンセファリンを発現する株をノザン・
ブロット、ウェスタン・ブロット及び細胞染色により選
択した。
・テレンセファ リンcDNAの導入 L929マウス繊維芽細胞(理科学研究所・細胞銀行R
CB081)は10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変
イーグル培地で培養した。ウサギ・テレンセファリンc
DNA(完全長)を発現ベクターpcDNA3(インビ
トロジェン)にサブクローニングし、線状化した後、リ
ポフェクチン(BRL/Gibco)を用いてL929細胞に導
入した。抗生物質G418(600μg/ml)存在下での培
養で、安定にテレンセファリンを発現する株をノザン・
ブロット、ウェスタン・ブロット及び細胞染色により選
択した。
【0021】実験結果 1.ウサギ及びマウス・テレンセファリンcDNAのク
ローニ ング 図1Aはモノクローナル抗体271A6(森ら[Mori e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3921-3925(1987)])
によるウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す。この
図から、テレンセファリン(271A6抗原分子)は最
も吻側の脳セグメントである終脳のみに発現しているこ
とがわかる。免疫活性のある終脳部位には嗅球(図1A
でOBで示した)、大脳新皮質(NC)、嗅皮質(O
C)、海馬(HC)などが含まれる。終脳より尾側の他
の脳セグメント(間脳、中脳、後脳、髄脳、脊髄)には
全く免疫活性が検出されない。このようにテレンセファ
リンの発現は脳セグメント(終脳)特異的である。
ローニ ング 図1Aはモノクローナル抗体271A6(森ら[Mori e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3921-3925(1987)])
によるウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す。この
図から、テレンセファリン(271A6抗原分子)は最
も吻側の脳セグメントである終脳のみに発現しているこ
とがわかる。免疫活性のある終脳部位には嗅球(図1A
でOBで示した)、大脳新皮質(NC)、嗅皮質(O
C)、海馬(HC)などが含まれる。終脳より尾側の他
の脳セグメント(間脳、中脳、後脳、髄脳、脊髄)には
全く免疫活性が検出されない。このようにテレンセファ
リンの発現は脳セグメント(終脳)特異的である。
【0022】ウサギ終脳可溶化物を原料として、テレン
セファリンタンパク質の精製を行った。精製にはモノク
ローナル抗体271A6を固定化した免疫親和性カラム
を用いた。図1Bに示すように、精製サンプルのSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクマシー染色で約
130kdの主要なタンパク質バンドが検出された(レーン
1)。このタンパク質バンドはモノクローナル抗体27
1A6に反応したことから(レーン2)、テレンセファ
リンタンパク質であることが確認された。また、テレン
セファリンタンパク質はモノクローナル抗体HNK−1
(アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC
TIB200)とも反応することがわかった(レーン
3)。モノクローナル抗体HNK−1は神経系に存在す
る多くの細胞認識・接着分子が共通に発現する特殊な糖
鎖と反応する抗体であることが知られている。また、精
製サンプル中には極微量であるが、42kdと36kdのタンパ
ク質が混在していた(レーン1)。これらは部分アミノ
酸配列の結果、アクチン(42kd)とグリセルアルデヒド
3−リン酸脱水素酵素(36kd)であることが判明した。
セファリンタンパク質の精製を行った。精製にはモノク
ローナル抗体271A6を固定化した免疫親和性カラム
を用いた。図1Bに示すように、精製サンプルのSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクマシー染色で約
130kdの主要なタンパク質バンドが検出された(レーン
1)。このタンパク質バンドはモノクローナル抗体27
1A6に反応したことから(レーン2)、テレンセファ
リンタンパク質であることが確認された。また、テレン
セファリンタンパク質はモノクローナル抗体HNK−1
(アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC
TIB200)とも反応することがわかった(レーン
3)。モノクローナル抗体HNK−1は神経系に存在す
る多くの細胞認識・接着分子が共通に発現する特殊な糖
鎖と反応する抗体であることが知られている。また、精
製サンプル中には極微量であるが、42kdと36kdのタンパ
ク質が混在していた(レーン1)。これらは部分アミノ
酸配列の結果、アクチン(42kd)とグリセルアルデヒド
3−リン酸脱水素酵素(36kd)であることが判明した。
【0023】精製ウサギ・テレンセファリンを還元カル
ボキシメチル化後、リジルエンドペプチダーゼでの加水
分解によりペプチド断片とし、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで分離し、ペプチド・シークエンサーで部分ア
ミノ酸配列を決定した。決定した5つのペプチド断片の
アミノ酸配列を図1Cに示す。
ボキシメチル化後、リジルエンドペプチダーゼでの加水
分解によりペプチド断片とし、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで分離し、ペプチド・シークエンサーで部分ア
ミノ酸配列を決定した。決定した5つのペプチド断片の
アミノ酸配列を図1Cに示す。
【0024】図1CのペプチドAのアミノ酸配列を基に
して、2つの混合オリゴヌクレオチド(5'-AA[AG][AC]GI
[CT]TIAA[CT]CCIGA[AG]GTIACI[CT]T-3'と5'-[CT]TT[AG
T]ATICC[CT]TC[CT]TC[CT]TCIGCIGTIGC-3')を合成し、こ
れらをプライマーとして、またウサギ大脳皮質cDNA
を鋳型に用いてのポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン(PCR)を行った。約80塩基対の産物を得ること
ができ、これをpCR1000ベクター(インビトロジェン)
にサブクローニングし、その塩基配列を決定し、この産
物がウサギ・テレンセファリンのcDNA断片であるこ
とを確認した。確認した配列の中央部の47塩基のオリ
ゴヌクレオチド(5'-GTCACCCTCGAGGGGGACGCAATCGTGGCCAC
CGCCACCGCCACGGC-3'、図2の塩基配列中の938−98
4の部分)を合成し、これをプローブとしてウサギ大脳
皮質λgt11cDNAライブラリーをスクリーニング
した。その結果、全長約3kbの6個の陽性クローンを
得ることができ、それらのうち2クローンの塩基配列を
決定した。
して、2つの混合オリゴヌクレオチド(5'-AA[AG][AC]GI
[CT]TIAA[CT]CCIGA[AG]GTIACI[CT]T-3'と5'-[CT]TT[AG
T]ATICC[CT]TC[CT]TC[CT]TCIGCIGTIGC-3')を合成し、こ
れらをプライマーとして、またウサギ大脳皮質cDNA
を鋳型に用いてのポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン(PCR)を行った。約80塩基対の産物を得ること
ができ、これをpCR1000ベクター(インビトロジェン)
にサブクローニングし、その塩基配列を決定し、この産
物がウサギ・テレンセファリンのcDNA断片であるこ
とを確認した。確認した配列の中央部の47塩基のオリ
ゴヌクレオチド(5'-GTCACCCTCGAGGGGGACGCAATCGTGGCCAC
CGCCACCGCCACGGC-3'、図2の塩基配列中の938−98
4の部分)を合成し、これをプローブとしてウサギ大脳
皮質λgt11cDNAライブラリーをスクリーニング
した。その結果、全長約3kbの6個の陽性クローンを
得ることができ、それらのうち2クローンの塩基配列を
決定した。
【0025】図2、図3および図4に決定したウサギ・
テレンセファリンcDNA配列とそれから推定されるア
ミノ酸配列を示す。このヌクレオチドは912アミノ酸
から成るタンパク質をコードするオープン・リーディン
グ・フレームを有するが、アミノ末端の29アミノ酸は
シグナル配列であり、成熟テレンセファリンは883ア
ミノ酸から成る。タンパク質の疎水性プロットにより、
テレンセファリンは2箇所の疎水性領域を有することが
わかった。
テレンセファリンcDNA配列とそれから推定されるア
ミノ酸配列を示す。このヌクレオチドは912アミノ酸
から成るタンパク質をコードするオープン・リーディン
グ・フレームを有するが、アミノ末端の29アミノ酸は
シグナル配列であり、成熟テレンセファリンは883ア
ミノ酸から成る。タンパク質の疎水性プロットにより、
テレンセファリンは2箇所の疎水性領域を有することが
わかった。
【0026】一つはアミノ末端の29アミノ酸から成る
シグナル配列であり、もう一つはアミノ酸番号822−
851の30残基でありこの部分が細胞膜貫通領域であ
ると考えられる。故にアミノ酸番号30−821は細胞
外領域、852−912は細胞内領域であり、テレンセ
ファリンはタイプIの細胞膜タンパク質であるといえ
る。細胞外領域には14箇所の糖鎖結合可能部位があ
る。成熟テレンセファリン(883アミノ酸)の理論的
分子量は92、762ドルトンであり、一つの糖鎖が約
0.3kdであると考えると、その分子量は精製テレンセフ
ァリンタンパク質が示した130kdに近い値となる。ま
た、図1Cに示した5つのアミノ酸配列はすべて図2、
図3および図4の推定アミノ酸配列に含まれていること
から(図2、図3および図4、下線部分)、このcDN
A配列及びアミノ酸配列がテレンセファリンのものであ
ることが確認された。また、3’非翻訳領域中にmRN
Aの不安定化に寄与すると考えられているATTTAモ
チーフが2箇所に存在している。
シグナル配列であり、もう一つはアミノ酸番号822−
851の30残基でありこの部分が細胞膜貫通領域であ
ると考えられる。故にアミノ酸番号30−821は細胞
外領域、852−912は細胞内領域であり、テレンセ
ファリンはタイプIの細胞膜タンパク質であるといえ
る。細胞外領域には14箇所の糖鎖結合可能部位があ
る。成熟テレンセファリン(883アミノ酸)の理論的
分子量は92、762ドルトンであり、一つの糖鎖が約
0.3kdであると考えると、その分子量は精製テレンセフ
ァリンタンパク質が示した130kdに近い値となる。ま
た、図1Cに示した5つのアミノ酸配列はすべて図2、
図3および図4の推定アミノ酸配列に含まれていること
から(図2、図3および図4、下線部分)、このcDN
A配列及びアミノ酸配列がテレンセファリンのものであ
ることが確認された。また、3’非翻訳領域中にmRN
Aの不安定化に寄与すると考えられているATTTAモ
チーフが2箇所に存在している。
【0027】ウサギ・テレンセファリンcDNA(完全
長)をプローブとして、マウス終脳λgt11cDNA
ライブラリーをクロス・ハイブリダイゼーションによっ
てスクリーニングした。その結果、全長約3kbから成
る3個の陽性クローンを得ることができ、これらの塩基
配列を決定した。その塩基配列から推定されるアミノ酸
配列をウサギ・テレンセファリンと比較したところ、3
0箇所のシステイン残基はマウス及びウサギですべて保
存されていた。マウス・テレンセファリンとウサギ・テ
レンセファリンの相同性はヌクレオチドレベルで78%、
アミノ酸レベルで82%であった(図9)。
長)をプローブとして、マウス終脳λgt11cDNA
ライブラリーをクロス・ハイブリダイゼーションによっ
てスクリーニングした。その結果、全長約3kbから成
る3個の陽性クローンを得ることができ、これらの塩基
配列を決定した。その塩基配列から推定されるアミノ酸
配列をウサギ・テレンセファリンと比較したところ、3
0箇所のシステイン残基はマウス及びウサギですべて保
存されていた。マウス・テレンセファリンとウサギ・テ
レンセファリンの相同性はヌクレオチドレベルで78%、
アミノ酸レベルで82%であった(図9)。
【0028】2.テレンセファリンはイムノグロブリン
・スーパーファ ミリーの新規メンバーである ウサギ及びマウス・テレンセファリンのアミノ酸配列を
NBRFプロテイン・データベースでホモロジー検索す
ると、イムノグロブリン・スーパーファミリーに属する
多くの分子との相同性が検出された。特にテレンセファ
リンは免疫系で重要な役割を演じるICAMサブグルー
プの3つのメンバーを非常に高い相同性を有しているこ
とがわかった。
・スーパーファ ミリーの新規メンバーである ウサギ及びマウス・テレンセファリンのアミノ酸配列を
NBRFプロテイン・データベースでホモロジー検索す
ると、イムノグロブリン・スーパーファミリーに属する
多くの分子との相同性が検出された。特にテレンセファ
リンは免疫系で重要な役割を演じるICAMサブグルー
プの3つのメンバーを非常に高い相同性を有しているこ
とがわかった。
【0029】テレンセファリンの細胞外領域には9つの
イムノグロブリン様ドメインが存在する(図5)(TL
Nはテレンセファリンの構造の模式図を、またICAM
−1,ICAM−3/R,ICAM−2はそれぞれ、イ
ンターセルラーアドヒージョン分子(ICAM)−1,
−3/R,−2の構造の模式図を示す。最もアミノ酸末
端に近いドメイン(ドメインI)は4つのシステイン残
基を有する珍しいイムノグロブリン様ドメインである。
同様なドメインを有する分子としてはICAM−1、−
2、−3/R、VCAM−1、MAdCAM−1がこれ
までに報告されており、これら5つの分子はすべてイン
テグリン・ファミリーに属する分子と結合して機能する
ことが知られている。テレンセファリンのドメインI
I、III、IVはICAM−1及び−3/Rと非常に
高い相同性を有している(41−66%)。
イムノグロブリン様ドメインが存在する(図5)(TL
Nはテレンセファリンの構造の模式図を、またICAM
−1,ICAM−3/R,ICAM−2はそれぞれ、イ
ンターセルラーアドヒージョン分子(ICAM)−1,
−3/R,−2の構造の模式図を示す。最もアミノ酸末
端に近いドメイン(ドメインI)は4つのシステイン残
基を有する珍しいイムノグロブリン様ドメインである。
同様なドメインを有する分子としてはICAM−1、−
2、−3/R、VCAM−1、MAdCAM−1がこれ
までに報告されており、これら5つの分子はすべてイン
テグリン・ファミリーに属する分子と結合して機能する
ことが知られている。テレンセファリンのドメインI
I、III、IVはICAM−1及び−3/Rと非常に
高い相同性を有している(41−66%)。
【0030】テレンセファリンのドメインV−VIII
は高度に保存された繰り返し構造になっている(ドメイ
ン間で31−49%の相同性)。これらのドメインも4
つのシステイン残基を有するが、ドメインIとはその位
置が異なっている。これらのドメイン(V−VIII)
はICAM−1及び−3/RのドメインVと高い相同性
を有する。
は高度に保存された繰り返し構造になっている(ドメイ
ン間で31−49%の相同性)。これらのドメインも4
つのシステイン残基を有するが、ドメインIとはその位
置が異なっている。これらのドメイン(V−VIII)
はICAM−1及び−3/RのドメインVと高い相同性
を有する。
【0031】テレンセファリンのドメインIXはICA
Mよりもむしろ、N−CAM、L1、TAG−1、F3
などの神経系に発現するイムノグロブリン・スーパーフ
ァミリー分子と高い相同性を示した。
Mよりもむしろ、N−CAM、L1、TAG−1、F3
などの神経系に発現するイムノグロブリン・スーパーフ
ァミリー分子と高い相同性を示した。
【0032】テレンセファリンの細胞内領域はICAM
とは全く相同性を有しておらず、ウサギ心筋のトロポニ
ンT2と非常に高い相同性を示した。また、イムノグロ
ブリン・スーパーファミリー分子群の中ではニワトリN
g−CAMの細胞内領域との相同性が検出された。ま
た、テレンセファリンの細胞内領域には1箇所のチロシ
ンリン酸化可能部位と2箇所のカゼイン・キナーゼによ
るリン酸化可能部位が存在する。
とは全く相同性を有しておらず、ウサギ心筋のトロポニ
ンT2と非常に高い相同性を示した。また、イムノグロ
ブリン・スーパーファミリー分子群の中ではニワトリN
g−CAMの細胞内領域との相同性が検出された。ま
た、テレンセファリンの細胞内領域には1箇所のチロシ
ンリン酸化可能部位と2箇所のカゼイン・キナーゼによ
るリン酸化可能部位が存在する。
【0033】3.ノザン・ブロット法及び in situ ハ
イブリダイゼーション法によるテレンセファリンmRN
A発現の 解析 胎児期、生後発達期、および成体のウサギの脳から得た
全RNAと、テレンセファリンcDNAプローブを用い
たノザン・ブロット法により、3.2kbテレンセファリン
mRNAは、胎児期にはほとんど発現していない(図6
Aのレーン1が胎児期の脳)が、生後10日目くらいに
なると急激に発現量が増加し(図6Aのレーン2)、成
体でも大量に発現している(図6Aのレーン3)ことが
観察された。ウサギの種々の組織で得た全RNAを用い
たノザン・ブロット法では、テレンセファリンmRNA
は脳でのみ発現し、心臓、肺、腎臓、脾臓、腸、および
骨格筋では発現が見られなかった。(図6Bのレーン1
−5は終脳の各部分で、1は嗅球、2は嗅皮質、3は大
脳新皮質、4は海馬、5は線条体、レーン6から10は
終脳以外の部位で、6は間脳、7は中脳、8は後脳、9
は髄脳、10は脊髄を示す。また、11は心臓、12は
肺、13は腎臓、14は脾臓、15は腸、16は骨格筋
を示す)
イブリダイゼーション法によるテレンセファリンmRN
A発現の 解析 胎児期、生後発達期、および成体のウサギの脳から得た
全RNAと、テレンセファリンcDNAプローブを用い
たノザン・ブロット法により、3.2kbテレンセファリン
mRNAは、胎児期にはほとんど発現していない(図6
Aのレーン1が胎児期の脳)が、生後10日目くらいに
なると急激に発現量が増加し(図6Aのレーン2)、成
体でも大量に発現している(図6Aのレーン3)ことが
観察された。ウサギの種々の組織で得た全RNAを用い
たノザン・ブロット法では、テレンセファリンmRNA
は脳でのみ発現し、心臓、肺、腎臓、脾臓、腸、および
骨格筋では発現が見られなかった。(図6Bのレーン1
−5は終脳の各部分で、1は嗅球、2は嗅皮質、3は大
脳新皮質、4は海馬、5は線条体、レーン6から10は
終脳以外の部位で、6は間脳、7は中脳、8は後脳、9
は髄脳、10は脊髄を示す。また、11は心臓、12は
肺、13は腎臓、14は脾臓、15は腸、16は骨格筋
を示す)
【0034】脳でのテレンセファリンの分布を、標識化
アンチセンスRNAを用いる系中(in situ)ハイブリ
ダイゼーションによって調べた(図7)。その結果、テ
レンセファリンのmRNAは、嗅球(図7AでOBで示
した)、嗅皮質(OC)、大脳新皮質(NC)、海馬
(HC)、線条体(CPu)、中隔核等の終脳領域で観
察されたが、間脳、中脳、後脳、延髄、脊髄といった終
脳以外の部位では発現が見られなかった。
アンチセンスRNAを用いる系中(in situ)ハイブリ
ダイゼーションによって調べた(図7)。その結果、テ
レンセファリンのmRNAは、嗅球(図7AでOBで示
した)、嗅皮質(OC)、大脳新皮質(NC)、海馬
(HC)、線条体(CPu)、中隔核等の終脳領域で観
察されたが、間脳、中脳、後脳、延髄、脊髄といった終
脳以外の部位では発現が見られなかった。
【0035】標識化センスRNAを用いた実験では、上
記のシグナルが観察されないことから(図7B)、その
特異性が示された。さらに、終脳のエマルジョン浸漬切
片を用いた顕微鏡観察により、テレンセファリンmRN
Aは海馬錐体細胞、歯状回顆粒細胞、嗅球顆粒細胞、大
脳新皮質II、III層およびV、VI層の細胞等、終
脳の特定のタイプの神経細胞に局在することが明らかに
なった。
記のシグナルが観察されないことから(図7B)、その
特異性が示された。さらに、終脳のエマルジョン浸漬切
片を用いた顕微鏡観察により、テレンセファリンmRN
Aは海馬錐体細胞、歯状回顆粒細胞、嗅球顆粒細胞、大
脳新皮質II、III層およびV、VI層の細胞等、終
脳の特定のタイプの神経細胞に局在することが明らかに
なった。
【0036】4.サザン・ブロット法によるマウス・テ
レンセファリン 染色体DNAの解析 マウス脳から調製した染色体DNAを8個の異なる制限
酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動後、ナイロン膜
に転写し、32Pで標識したマウス・テレンセファリンc
DNA(完全長)とハイブリダイゼーションを行った。
図8に示すように、EcoRV、HindIII、SpeI、XbaIでの切
断では1本のバンドが、BamHI、BglIIでは2本のバンド
が、EcoRIでは3本のバンドが、PstIでは5本のバンド
が検出された。マウス・テレンセファリンcDNA中に
は1箇所のBamHI切断部位、1箇所のEcoRI切断部位、5
箇所のPstI切断部位が存在することを考慮すると、マウ
ス・テレンセファリンは1コピーの遺伝子であると考え
られた。
レンセファリン 染色体DNAの解析 マウス脳から調製した染色体DNAを8個の異なる制限
酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動後、ナイロン膜
に転写し、32Pで標識したマウス・テレンセファリンc
DNA(完全長)とハイブリダイゼーションを行った。
図8に示すように、EcoRV、HindIII、SpeI、XbaIでの切
断では1本のバンドが、BamHI、BglIIでは2本のバンド
が、EcoRIでは3本のバンドが、PstIでは5本のバンド
が検出された。マウス・テレンセファリンcDNA中に
は1箇所のBamHI切断部位、1箇所のEcoRI切断部位、5
箇所のPstI切断部位が存在することを考慮すると、マウ
ス・テレンセファリンは1コピーの遺伝子であると考え
られた。
【0037】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:3013 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名:日本白色種ウサギ 配列: ATCCCCGAGC GCAACTCTGC CTCCCCCACA CTGCGCCCGC CGCGCCGCGT CGGCCCGCGC 60 CCGTCCTCTG GCTCAACTCG CCACTCGGGC TCCCCTCGCC TTCTGCGCTT CCCCCGCGGC 120 GGCG ATG CCA GGG CCT TCG CCA GGG CTG CGG GCG CTA CTC GGC TTC 166 Met Pro Gly Pro Ser Pro Gly Leu Arg Ala Leu Leu Gly Phe -25 -20 TGG GTA GCC TTG GGC CTG GGG ATC CTC CGC CTG TCA GCG GTC GCG CAG 214 Trp Val Ala Leu Gly Leu Gly Ile Leu Arg Leu Ser Ala Val Ala Gln -15 -10 -5 1 GAG CCC TTC TGG GCG GAC CTG CAG CCC CGC GTG GCG CTT GTG GAG CGC 262 Glu Pro Phe Trp Ala Asp Leu Gln Pro Arg Val Ala Leu Val Glu Arg 5 10 15 GGG GGC TCG CTG TGG CTG AAT TGC AGT ACC AAC TGC CCT CGG CCG GAG 310 Gly Gly Ser Leu Trp Leu Asn Cys Ser Thr Asn Cys Pro Arg Pro Glu 20 25 30 CGC GGC GGC CTG GAG ACC TCG CTG CGC CGG AAC GGA CCA GAG GGG CTG 358 Arg Gly Gly Leu Glu Thr Ser Leu Arg Arg Asn Gly Pro Glu Gly Leu 35 40 45 CGC TGG CGT GCG CGG CAG CTG GTG GAC ATC CGC GAG CCG GAG ACC CAG 406 Arg Trp Arg Ala Arg Gln Leu Val Asp Ile Arg Glu Pro Glu Thr Gln 50 55 60 65 CCC GTC TGC TTC TTC CGC TGC GCG GCG ACG CTA CAG GCG CGT GGG CTC 454 Pro Val Cys Phe Phe Arg Cys Ala Ala Thr Leu Gln Ala Arg Gly Leu 70 75 80 ATT CGC ACT TTC CAG CGG CCG GAT CGC GTA GAG CTG GTG CCG CTG CCT 502 Ile Arg Thr Phe Gln Arg Pro Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu Pro 85 90 95 CCC TGG CAG CCG GTG GGC GAG AAC TTC ACC CTG AGC TGT AGG GTC CCG 550 Pro Trp Gln Pro Val Gly Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val Pro 100 105 110 GGC GCC GGG CCC CGT GGG AGC CTC ACA TTG ACC CTG CTT CGG GGC GCC 598 Gly Ala Gly Pro Arg Gly Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Arg Gly Ala 115 120 125 CAG GAG CTG ATC CGC CGC AGT TTT GCG GGA GAA CCG GCC CGA GCG CGG 646 Gln Glu Leu Ile Arg Arg Ser Phe Ala Gly Glu Pro Ala Arg Ala Arg 130 135 140 145 GGC GCG GTG CTC ACG GCC ACG GTG CTG GCG CGG AGG GAA GAC CAT GGA 694 Gly Ala Val Leu Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His Gly 150 155 160 GCC AAT TTC TCC TGC CGC GCC GAG CTG GAC CTG CGG CCG CAG GGC CTG 742 Ala Asn Phe Ser Cys Arg Ala Glu Leu Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu 165 170 175 GCG CTG TTT GAA AAC AGC TCG GCT CCT AGA CAG CTC TGG ACG TAC GCC 790 Ala Leu Phe Glu Asn Ser Ser Ala Pro Arg Gln Leu Trp Thr Tyr Ala 180 185 190 CTG CCC CTG GAC TCG CCG CGT CTC CTG GCT CCC CGG GTC CTG GAA GTG 838 Leu Pro Leu Asp Ser Pro Arg Leu Leu Ala Pro Arg Val Leu Glu Val 195 200 205 GAC TCG CAA AGC CTC GTG AGC TGC ACC CTG GAC GGA CTA TTC CCG GCC 886 Asp Ser Gln Ser Leu Val Ser Cys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro Ala 210 215 220 225 TCG GAG GCT GGG GTC CAC CTC GCG CTG GGC GAC AAG AGG CTG AAT CCA 934 Ser Glu Ala Gly Val His Leu Ala Leu Gly Asp Lys Arg Leu Asn Pro 230 235 240 GAG GTC ACC CTC GAG GGG GAC GCA ATC GTG GCC ACC GCC ACC GCC ACG 982 Glu Val Thr Leu Glu Gly Asp Ala Ile Val Ala Thr Ala Thr Ala Thr 245 250 255 GCA GAG GAA GAG GGC ATC AAG CAG TTG GTC TGC GCT GTG ACC CTG GGG 1030 Ala Glu Glu Glu Gly Ile Lys Gln Leu Val Cys Ala Val Thr Leu Gly 260 265 270 GGC GAG CGG CGG GAA AGC CGC GAG AAC GTG ACC GTC TAT AGT TTC CCG 1078 Gly Glu Arg Arg Glu Ser Arg Glu Asn Val Thr Val Tyr Ser Phe Pro 275 280 285 GCG CCC CTC TTG ACC CTG AGC GAA CCC AGC GCC CCC GAG GGG AAG TTG 1126 Ala Pro Leu Leu Thr Leu Ser Glu Pro Ser Ala Pro Glu Gly Lys Val 290 295 300 305 GTG ACA GTA ACC TGC ACA GCC GGG GCC CGA GCC CTG GTC ACC TTA GAG 1174 Val Thr Val Thr Cys Thr Ala Gly Ala Arg Ala Leu Val Thr Leu Glu 310 315 320 GGA GTT CCC GCT GCA GCC CCG GGG CAG CCC GCC CAG CTC CAG TTT AAT 1222 Gly Val Pro Ala Ala Ala Pro Gly Gln Pro Ala Gln Leu Gln Phe Asn 325 330 335 GCT TCC GAG AGC GAC GAC GGA CGC AGC TTT TTT TGC GAC GCC ACT CTG 1270 Ala Ser Glu Ser Asp Asp Gly Arg Ser Phe Phe Cys Asp Ala Thr Leu 340 345 350 GAG TTG GAC GGG GAG ACC CTG AGC AAG AAC GGG AGC GCA GAG CTT CGT 1318 Glu Leu Asp Gly Glu Thr Leu Ser Lys Asn Gly Ser Ala Glu Leu Arg 355 360 365 GTC TTA TAC GCC CCC CGG CTG GAC GAT GCG GAC TGT CCC AGG AGC TGG 1366 Val Leu Tyr Ala Pro Arg Leu Asp Asp Ala Asp Cys Pro Arg Ser Trp 370 375 380 385 ACG TGG CCA GAG GGC CCA GAG CAG ACG CTG CGC TGC GAG GCT CGC GGA 1414 Thr Trp Pro Glu Gly Pro Glu Gln Thr Leu Arg Cys Glu Ala Arg Gly 390 395 400 AAC CCA ACG CCC GCG GTG CAC TGC GCG CGG TCC GAC GGC GGT GCG GTG 1462 Asn Pro Thr Pro Ala Val His Cys Ala Arg Ser Asp Gly Gly Ala Val 405 410 415 CTG GCG CTG GGC CTG CTG GGC CCG GTC ACT CGC GCG CTC GCC GGC ACT 1510 Leu Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Val Thr Arg Ala Leu Ala Gly Thr 420 425 430 TAC CGC TGC ACC GCG GCC AAC GTC CAG GGC GAA GCG GTC AAG GAC GTG 1558 Tyr Arg Cys Thr Ala Ala Asn Val Gln Gly Glu Ala Val Lys Asp Val 435 440 445 ACG CTG ACC GTA GAG TAC GCA CCG GCG CTG GAC AGC GTG GGC TGC CCG 1606 Thr Leu Thr Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Asp Ser Val Gly Cys Pro 450 455 460 465 GAA CGC GTG ACG TGG CTG GAA GGA ACA GAA GCG TCG CTG AGT TGT GTG 1654 Glu Arg Val Thr Trp Leu Glu Gly Thr Gle Ala Ser Leu Ser Cys Val 470 475 480 GCA CAC GGG GTC CCG CCG CCC AGC GTG AGC TGC GTG CGC TTC CGG CAA 1702 Ala His Gly Val Pro Pro Pro Ser Val Ser Cys Val Arg Phe Arg Gln 485 490 495 GCC GAC GTC ATC GAG GGG CTG CTG CTG GTG GCC CGG GAG CAC GCG GGC 1750 Ala Asp Val Ile Glu Gly Leu Leu Leu Val Ala Arg Glu His Ala Gly 500 505 510 ACT TAC CGC TGC GAG GCC ATC AAT GCT CGG GCT CTG GCC AAA AAC GTG 1798 Thr Tyr Arg Cys Glu Ala Ile Asn Ala Arg Ala Leu Ala Lys Asn Val 515 520 525 GCC GTC ACG GTG GAG TAT GGT CCC AGT TTT GAG GAG CGG AGC TGC CCC 1846 Ala Val Thr Val Glu Thr Gly Pro Ser Phe Glu Glu Arg Ser Cys Pro 530 535 540 545 AGC AAC TGG ACG TGG GTG GAA GGA TCG GAA CAG CTG TTT TCC TGC GAG 1894 Ser Asn Trp Thr Trp Val Glu Gly Ser Glu Gln Leu Phe Ser Cys Glu 550 555 560 GTG GAA GGG AAG CCG CAG CCA AGC GTG CAG TGC GTG GGC TCC GAG GGC 1942 Val Glu Gly Lys Pro Gln Pro Ser Val Gln Cys Val Gly Ser Glu Gly 565 570 575 GCC AGC GAG GGG CTG CTG CTG CCG CTG GCG CCC CTA AAC CCT AGT CCC 1990 Ala Ser Glu Gly Leu Leu Leu Pro Leu Ala Pro Leu Asn Pro Ser Pro 580 585 590 AGC GAC CCC AGC GTC CCT AGA GAC CTG GCA CCC GGG ATC TAC GTC TGC 2038 Ser Asp Pro Ser Val Pro Arg Asp Leu Ala Pro Gly Ile Tyr Val Cys 595 600 605 AAC GCC ACC AAC CCG CTC GGC TCG GCG GTC AAA ACA GTC GTC GTG AGC 2086 Asn Ala Thr Asn Pro Leu Gly Ser Ala Val Lys Thr Val Val Val Ser 610 615 620 625 GCG GAG TCG CCG CCG CAG ATG GAC GAC TCC ACG TGT CCG AGC GAC CAG 2134 Ala Glu Ser Pro Pro Gln Met Asp Asp Ser Thr Cys Pro Ser Asp Gln 630 635 640 ACG TGG CTG GAA GGG GCC GAA GCT GCC GGC CCT GCC TGC GCC CGG GGC 2182 Thr Trp Leu Glu Gly Ala Gle Ala Ala Gly Pro Ala Cys Ala Arg Gly 645 650 655 CGG CCC TCG CCA CGA GTG CGC TGC TCC CGG GAG GGC GCG CCC CGA CCT 2230 Arg Pro Ser Pro Arg Val Arg Cys Ser Arg Glu Gly Ala Pro Arg Pro 660 665 670 GCG CGA CCG CGC GTG TCG CGG GAG GAT GCG GGC ACT TAT CTC TGT GTG 2278 Ala Arg Pro Arg Val Ser Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Val 675 680 685 GCC ACC AAC GCG CAC GGC TCG GAC TCC CGG ACC GTC ACT GTG GGT GTG 2326 Ala Thr Asn Ala His Gly Ser Asp Ser Arg Thr Val Thr Val Gly Val 690 695 700 705 GAA TAC CGG CCC GTA GTG GCC GAG CTG GCG GCC TCA CCC TCG GGA GGC 2374 Glu Tyr Arg Pro Val Val Ala Glu Leu Ala Ala Ser Pro Ser Gly Gly 710 715 720 GTG CGC CCG GGC GGG AAC TTC ACG CTG ACT TGC CGC GCG GAG GCA TGG 2422 Val Arg Pro Gly Gly Asn Phe Thr Leu Thr Cys Arg Ala Glu Ala Trp 725 730 735 CCC CCA GCT CAG ATC AGC TGG CGC GCG CCC CCC GGG GCC CCC AAC ATC 2470 Pro Pro Ala Gln Ile Ser Trp Arg Ala Pro Pro Gly Ala Pro Asn Ile 740 745 750 GGC CTG TCG AGC AAC AAC AGC ACG CTC AGC GTG CCC GGC GCC ATG GGC 2518 Gly Leu Ser Ser Asn Asn Ser Thr Leu Ser Val Pro Gly Ala Met Gly 755 760 765 AGC CAC GGC GGC GAG TAC GAG TGC GAG GCC ACC AAC GCG CAC GGC CAC 2566 Ser His Gly Gly Glu Tyr Glu Cys Glu Ala Thr Asn Ala His Gly His 770 775 780 785 GCG CGG CGC ATC ACG GTG CGC GTG GCA GGT CCG TGG CTG TGG ATC GCC 2614 Ala Arg Arg Ile Thr Val Arg Val Ala Gly Pro Trp Leu Trp Ile Ala 790 795 800 GTG GGC GGT GCT GTG GGG GGC GCA GTG CTG CTG GCC GCG GGC GCC GGC 2662 Val Gly Gly Ala Val Gly Gly Ala Val Leu Leu Ala Ala Gly Ala Gly 805 810 815 CTG GCC TTC TAC GTG CAA TCG ACG GCG TGC AAG AAG GGC GAA TAC AAC 2710 Leu Ala Phe Tyr Val Gln Ser Thr Ala Cys Lys Lys Gly Glu Tyr Asn 820 825 830 GTG CAG GAA GCC GAG AGC TCG GGC GAG GCC GTG TGT CTC AAC GGC GCG 2758 Val Gln Glu Ala Glu Ser Ser Gly Glu Ala Val Cys Leu Asn Gly Ala 835 840 845 GGC GGC GGC GCC GGC TCG GGC GCG GAG GGC GGC CCG GAG GCG GAG GAC 2806 Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Gly Pro Glu Ala Glu Asp 850 855 860 865 TCT GCC GAG TCG CCC GCG GGG GGC GAG GTC TTC GCC ATC CAG CTG ACG 2854 Ser Ala Glu Ser Pro Ala Gly Gly Glu Val Phe Ala Ile Gln Leu Thr 870 875 880 TCA GCC TGAGCCTGCT CCCCTCTCCC CGCGGGCCGG GGGTCGCCCC CCAGATGCAC 2910 Ser Ala ACGAGGGGGG CTTCTTTGCC GTTCTATTTA TTATTTATTC AGCTCAAGGG CGCCACCCCC 2970 ATTTTCTACC CACTTTCCCC AGTAAAGTTT ATAAAAAACG AGA 3013
【0038】配列番号:2 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:1 トポロジー:直鎖 配列の種類:合成DNA 配列: 5'-AARMGIYTIAAYCCIGARGTIACIYT-3' 配列の特徴: 3-R:A又はG 4-M:A又はC 6-I:イノシン 7-Y:C又はT 9-I:イノシン 12-Y:C又はT 15-I:イノシン 18-R:A又はG 21-I:イノシン 24-I:イノシン 25-Y:C又はT
【0039】配列番号:3 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1 トポロジー:直鎖 配列の種類:合成DNA 配列: 5'-YTTDATICCYTCYTCYTCIGCIGTIGC-3' 配列の特徴: 1-Y:C又はT 4-D:A又はG又はT 7-I:イノシン 10-Y:C又はT 13-Y:C又はT 16-Y:C又はT 19-I:イノシン 22-I:イノシン 25-I:イノシン
【0040】配列番号:4 配列の長さ:47 配列の型:核酸 鎖の数:1 トポロジー:直鎖 配列の種類:合成DNA 配列: 5’−GTCACCCTCGAGGGGGACGCAA
TCGTGGCCACCGCCACCGCCACGGC
−3’
TCGTGGCCACCGCCACCGCCACGGC
−3’
【図1】 図1Aはモノクローナル抗体271A6によ
るウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す写真の模写
図である(黒く発色した部位が免疫活性部位)。図1B
精製したはテレンセファリンのSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す模式図である(レーン1は
クマシーブルーで染めたもの、レーン2は271A6抗
体との結合、レーン3はHNK−1抗体との結合を示
す)。図1Cはテレンセファリンの5つのペプチド断片
のアミノ酸配列を示す模式図である。
るウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す写真の模写
図である(黒く発色した部位が免疫活性部位)。図1B
精製したはテレンセファリンのSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す模式図である(レーン1は
クマシーブルーで染めたもの、レーン2は271A6抗
体との結合、レーン3はHNK−1抗体との結合を示
す)。図1Cはテレンセファリンの5つのペプチド断片
のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図2】 テレンセファリンをコードするDNAの塩基
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
【図3】 テレンセファリンをコードするDNAの塩基
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
【図4】 テレンセファリンをコードするDNAの塩基
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
配列、およびそれから推定されるテレンセファリンのア
ミノ酸配列を示す模式図である。
【図5】 テレンセファリン(TLN)の9つのイムノ
グロブリン様ドメインを示す模式図である。比較のため
にICAM−1,ICAM−3/R,ICAM−2のイ
ムノグロブリン様ドメインおよびテレンセファリンとの
相同性を%で示した。
グロブリン様ドメインを示す模式図である。比較のため
にICAM−1,ICAM−3/R,ICAM−2のイ
ムノグロブリン様ドメインおよびテレンセファリンとの
相同性を%で示した。
【図6】 ウサギの脳およびその他の組織から得たRN
AとテレンセファリンのcDNAプローブとのノザン・
ブロットの結果を示す写真の模式図である。Aは胎児
期、生後発達期、および成体の脳、Bは脳およびその他
の組織を示す。
AとテレンセファリンのcDNAプローブとのノザン・
ブロットの結果を示す写真の模式図である。Aは胎児
期、生後発達期、および成体の脳、Bは脳およびその他
の組織を示す。
【図7】 テレンセファリンmRNAの脳内分布を示す
系中ハイブリダイゼーションの写真の模写図である。A
はテレンセファリンのアンチセンスRNAプローブを使
ったもの、BはセンスRNAプローブを使ったコントロ
ールを示す。
系中ハイブリダイゼーションの写真の模写図である。A
はテレンセファリンのアンチセンスRNAプローブを使
ったもの、BはセンスRNAプローブを使ったコントロ
ールを示す。
【図8】 サザンブロット法によるマウス・テレンセフ
ァリン染色体DNAの解析結果を示す写真の模写図であ
る。
ァリン染色体DNAの解析結果を示す写真の模写図であ
る。
【図9】 ウサギおよびマウスのテレンセファリンのア
ミノ酸配列の相同性を示す模式図である。四角でかこっ
たアミノ酸配列がウサギとマウスで共通である。
ミノ酸配列の相同性を示す模式図である。四角でかこっ
たアミノ酸配列がウサギとマウスで共通である。
【手続補正書】
【提出日】平成6年7月26日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図1
【補正方法】変更
【補正内容】
【図1】 図1Aはモノクローナル抗体271A6によ
るウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す生物の形態
写真の模写図である(黒く発色した部位が免疫活性部
位)。図1Bは精製したテレンセファリンのSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動写真の模写図である(レー
ン1はクマシーブルーで染めたもの、レーン2は271
A6抗体との結合、レーン3はHNK−1抗体との結合
を示す)。図1Cはテレンセファリンの5つのペプチド
断片のアミノ酸配列を示す模式図である。
るウサギ脳の免疫組織化学染色の結果を示す生物の形態
写真の模写図である(黒く発色した部位が免疫活性部
位)。図1Bは精製したテレンセファリンのSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動写真の模写図である(レー
ン1はクマシーブルーで染めたもの、レーン2は271
A6抗体との結合、レーン3はHNK−1抗体との結合
を示す)。図1Cはテレンセファリンの5つのペプチド
断片のアミノ酸配列を示す模式図である。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図6
【補正方法】変更
【補正内容】
【図6】 ウサギの脳およびその他の組織から得たRN
AとテレンセファリンのcDNAプローブとのノザン・
ブロットの結果を示す電気泳動写真の模写図である。A
は胎児期、生後発達期、および成体の脳、Bは脳および
その他の組織を示す。
AとテレンセファリンのcDNAプローブとのノザン・
ブロットの結果を示す電気泳動写真の模写図である。A
は胎児期、生後発達期、および成体の脳、Bは脳および
その他の組織を示す。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図7
【補正方法】変更
【補正内容】
【図7】 テレンセファリンmRNAの脳内分布を示す
系中ハイブリダイゼーションの結果を示す生物の形態写
真の模写図である。Aはテレンセファリンのアンチセン
スRNAプローブを使ったもの、BはセンスRNAプロ
ーブを使ったコントロールを示す。
系中ハイブリダイゼーションの結果を示す生物の形態写
真の模写図である。Aはテレンセファリンのアンチセン
スRNAプローブを使ったもの、BはセンスRNAプロ
ーブを使ったコントロールを示す。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図8
【補正方法】変更
【補正内容】
【図8】 サザンブロット法によるマウス・テレンセフ
ァリン染色体DNAの解析結果を示す電気泳動写真の模
写図である。
ァリン染色体DNAの解析結果を示す電気泳動写真の模
写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12N 5/10 (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12N 5/00 B C12R 1:91)
Claims (8)
- 【請求項1】 哺乳動物由来の終脳特異的膜蛋白テレン
セファリン。 - 【請求項2】 哺乳動物がウサギである請求項1に記載
のテレンセファリン。 - 【請求項3】 図2、図3および図4に記載のアミノ酸
配列で示される請求項2に記載のテレンセファリン。 - 【請求項4】 哺乳動物由来の終脳特異的膜蛋白テレン
セファリンをコードするDNA。 - 【請求項5】 哺乳動物がウサギである請求項4に記載
のDNA。 - 【請求項6】 図2、図3および図4に記載のアミノ酸
配列で示されるウサギの終脳特異的膜蛋白テレンセファ
リンをコードする請求項5に記載のDNA。 - 【請求項7】 図2、図3および図4に記載のヌクレオ
チド配列で示される請求項6に記載のDNA。 - 【請求項8】 図2、図3および図4に記載のヌクレオ
チド配列に基づいてプローブを作成し、ウサギを除く哺
乳動物の終脳cDNAライブラリーをクロス・ハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングし、得られた該
哺乳動物の終脳特異的膜蛋白テレンセファリンをコード
するcDNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクター
で形質転換した宿主細胞を培養することからなる、哺乳
動物の終脳特異的膜蛋白テレンセファリンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6032328A JPH07242697A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそれをコードするdna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6032328A JPH07242697A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそれをコードするdna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07242697A true JPH07242697A (ja) | 1995-09-19 |
Family
ID=12355882
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6032328A Pending JPH07242697A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 終脳特異的膜蛋白テレンセファリンおよびそれをコードするdna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07242697A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9772335B2 (en) | 2011-02-24 | 2017-09-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomarkers for seizures |
-
1994
- 1994-03-02 JP JP6032328A patent/JPH07242697A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9772335B2 (en) | 2011-02-24 | 2017-09-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomarkers for seizures |
US9983219B2 (en) | 2011-02-24 | 2018-05-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomarkers for seizures |
US11035866B2 (en) | 2011-02-24 | 2021-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biomarkers for seizures |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040831 |