JPH07203985A - 動物細胞内の遺伝情報の複製および保持の可能なヌクレオチド配列 - Google Patents
動物細胞内の遺伝情報の複製および保持の可能なヌクレオチド配列Info
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- JPH07203985A JPH07203985A JP6174579A JP17457994A JPH07203985A JP H07203985 A JPH07203985 A JP H07203985A JP 6174579 A JP6174579 A JP 6174579A JP 17457994 A JP17457994 A JP 17457994A JP H07203985 A JPH07203985 A JP H07203985A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 動物細胞内の遺伝情報を複製・保持するベク
ターを提供する。 【構成】 ＡｃＮＰＶバキュロウイルスＩＥ１遺伝子の
３’端の配列を含むＤＮＡ断片を，好ましくはＩＥ１遺
伝子の促進因子の上流に位置する配列を含むＤＮＡ断片
と共に用いてベクターを生成する。エピソマーベクター
やそれを含む形質転換細胞の提供も本発明の範囲とす
る。
ターを提供する。 【構成】 ＡｃＮＰＶバキュロウイルスＩＥ１遺伝子の
３’端の配列を含むＤＮＡ断片を，好ましくはＩＥ１遺
伝子の促進因子の上流に位置する配列を含むＤＮＡ断片
と共に用いてベクターを生成する。エピソマーベクター
やそれを含む形質転換細胞の提供も本発明の範囲とす
る。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は，動物，特に昆虫の細胞内の遺伝
情報の複製および保持の可能なベクターに関するもので
ある。
情報の複製および保持の可能なベクターに関するもので
ある。
【０００２】
【背景技術】真核細胞，特に動物細胞を使用して，異種
遺伝子をクローニング発現するための研究が，種々行な
われている。活性蛋白質を得るのに多くの場合に必要で
ある遺伝情報の翻訳後の変異・修飾が可能なのは，真核
細胞のみである。現在，酵母菌が，その使用の簡便性か
ら，真核細胞による遺伝子発現系として広く使われてい
るものの一つとされている。しかしながら，酵母菌は，
その糖鎖形成（グリコシル化）システムは動物のものと
幾らか異なっているため，ある種の蛋白質を活性な形態
で得ることができない。
遺伝子をクローニング発現するための研究が，種々行な
われている。活性蛋白質を得るのに多くの場合に必要で
ある遺伝情報の翻訳後の変異・修飾が可能なのは，真核
細胞のみである。現在，酵母菌が，その使用の簡便性か
ら，真核細胞による遺伝子発現系として広く使われてい
るものの一つとされている。しかしながら，酵母菌は，
その糖鎖形成（グリコシル化）システムは動物のものと
幾らか異なっているため，ある種の蛋白質を活性な形態
で得ることができない。
【０００３】動物細胞内遺伝子の発現を得るため，ウイ
ルス由来のベクターが特に使用されている。これらのベ
クターの中でも，バキュロウイルスが多くの研究所で現
在使用されている。これらのウイルスは以下の利点を有
する。即ち，ＤＮＡの長い断片の挿入が可能であり，更
にウイルスの複製サイクルの種々の段階において活性な
幾つかの強い促進因子を保持している。これらの促進因
子は，それらの管理下で極めて高いレベルの遺伝子発現
を誘発し得るものである。今まで，異種遺伝子の発現
に，二つの後期促進因子，即ち，ポリヘドリン（ｐｏｌ
ｙｈｅｄｒｉｎ）促進因子およびプロテインＰ１０促進
因子が特に使用されてきた。
ルス由来のベクターが特に使用されている。これらのベ
クターの中でも，バキュロウイルスが多くの研究所で現
在使用されている。これらのウイルスは以下の利点を有
する。即ち，ＤＮＡの長い断片の挿入が可能であり，更
にウイルスの複製サイクルの種々の段階において活性な
幾つかの強い促進因子を保持している。これらの促進因
子は，それらの管理下で極めて高いレベルの遺伝子発現
を誘発し得るものである。今まで，異種遺伝子の発現
に，二つの後期促進因子，即ち，ポリヘドリン（ｐｏｌ
ｙｈｅｄｒｉｎ）促進因子およびプロテインＰ１０促進
因子が特に使用されてきた。
【０００４】しかし，これらのバキュロウイルス由来の
発現ベクターは，その利用に限界があるという欠点を有
している。先ず第一に，これらのベクターに挿入された
異種遺伝子は，ウイルス感染の枠内でのみ発現される。
ウイルス感染は細胞の急速な溶解に帰し，細胞内での遺
伝子の発現は一次的なものでしか有り得ず，更に細胞に
より生成された蛋白質が急速に分解してしまうのであ
る。また，異種遺伝子が後期促進因子の管理下に置かれ
ているので，遺伝子はウイルス複製サイクルの終わりに
おいてのみ発現され，その段階では，細胞の機能は既に
変化している。特に，翻訳後修飾（例えば，糖鎖形成）
をもたらす機能は変化している。
発現ベクターは，その利用に限界があるという欠点を有
している。先ず第一に，これらのベクターに挿入された
異種遺伝子は，ウイルス感染の枠内でのみ発現される。
ウイルス感染は細胞の急速な溶解に帰し，細胞内での遺
伝子の発現は一次的なものでしか有り得ず，更に細胞に
より生成された蛋白質が急速に分解してしまうのであ
る。また，異種遺伝子が後期促進因子の管理下に置かれ
ているので，遺伝子はウイルス複製サイクルの終わりに
おいてのみ発現され，その段階では，細胞の機能は既に
変化している。特に，翻訳後修飾（例えば，糖鎖形成）
をもたらす機能は変化している。
【０００５】これらの問題を解決するために，後期促進
因子ではなく初期促進因子の管理下で，発現させたい異
種遺伝子を挿入することを試みた研究者グループがあ
る。初期促進因子の管理下に置かれた遺伝子はウイルス
感染の始めから多く発現する。これらの促進因子のある
ものは，ポリヒドリンやＰ１０促進因子とは違って，細
胞ＲＮＡ重合酵素II型（ポリメラーゼ）により完全に認
識される。それらの促進因子としては，例えは，ＩＥ１
促進因子〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳＵＭＭＥＲＳ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：７，ｐ２０９１−２０９９（１
９８７）〕，ＩＥＯやＡｃＮＰＶバキュロウイルス（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウイルス群）のＩＥＮ遺伝子がある。これらの促進因
子の管理下に置かれた遺伝子の発現はウイルス感染を必
要とするものではない。このように，非常に初期の異種
遺伝子を発現するために，ＩＥ１およびＩＥＮ促進因子
を使用することが提案されている。
因子ではなく初期促進因子の管理下で，発現させたい異
種遺伝子を挿入することを試みた研究者グループがあ
る。初期促進因子の管理下に置かれた遺伝子はウイルス
感染の始めから多く発現する。これらの促進因子のある
ものは，ポリヒドリンやＰ１０促進因子とは違って，細
胞ＲＮＡ重合酵素II型（ポリメラーゼ）により完全に認
識される。それらの促進因子としては，例えは，ＩＥ１
促進因子〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳＵＭＭＥＲＳ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：７，ｐ２０９１−２０９９（１
９８７）〕，ＩＥＯやＡｃＮＰＶバキュロウイルス（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウイルス群）のＩＥＮ遺伝子がある。これらの促進因
子の管理下に置かれた遺伝子の発現はウイルス感染を必
要とするものではない。このように，非常に初期の異種
遺伝子を発現するために，ＩＥ１およびＩＥＮ促進因子
を使用することが提案されている。
【０００６】また，配列符号化プロテインＩＥ１を，別
のバキュロウイルス初期遺伝子の促進因子と共に用いる
ことが提案されている。例えば，３９Ｋ促進因子があ
り，ＩＥ１遺伝子により符号化された蛋白質は，他のバ
キュロウイルス初期遺伝子，とくに３９Ｋ遺伝子の発現
をするための相互活性化因子となる。３９Ｋ促進因子
は，発現ベクターを生成するために，エンハンサー配列
（ｈｒ１，ｈｒ２，ｈｒ３，ｈｒ４，ｈｒ５）〔ＧＵＡ
ＲＩＮＯ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：１，ｐ．２２４−
２２９）１９８６）〕と共に用いられることがある（Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＷＯ９２／０５２６５，出願人：ＴＨ
Ｅ ＴＥＸＡＳ Ａ ＆ Ｍ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
ＳＹＳＴＥＭ，発明者：ＧＵＡＲＩＮＯおよびＪＡＲＶ
ＩＳ）。
のバキュロウイルス初期遺伝子の促進因子と共に用いる
ことが提案されている。例えば，３９Ｋ促進因子があ
り，ＩＥ１遺伝子により符号化された蛋白質は，他のバ
キュロウイルス初期遺伝子，とくに３９Ｋ遺伝子の発現
をするための相互活性化因子となる。３９Ｋ促進因子
は，発現ベクターを生成するために，エンハンサー配列
（ｈｒ１，ｈｒ２，ｈｒ３，ｈｒ４，ｈｒ５）〔ＧＵＡ
ＲＩＮＯ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：１，ｐ．２２４−
２２９）１９８６）〕と共に用いられることがある（Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＷＯ９２／０５２６５，出願人：ＴＨ
Ｅ ＴＥＸＡＳ Ａ ＆ Ｍ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
ＳＹＳＴＥＭ，発明者：ＧＵＡＲＩＮＯおよびＪＡＲＶ
ＩＳ）。
【０００７】いずれの場合も，目的は，バキュロウイル
ス初期促進因子の管理下で異種遺伝子を安定的に発現す
るように，細胞ゲノムに組込み可能なベクターを得るこ
とである。しかし，そのようなベクターの使用は他の問
題点を有している。即ち，細胞ゲノムへの組込み部位お
よび組込みの安定性が組込遺伝子の発現を決定する二つ
の大きなパラメータであるが，これらの二つのパラメー
タのいずれも制御不可能であることである。
ス初期促進因子の管理下で異種遺伝子を安定的に発現す
るように，細胞ゲノムに組込み可能なベクターを得るこ
とである。しかし，そのようなベクターの使用は他の問
題点を有している。即ち，細胞ゲノムへの組込み部位お
よび組込みの安定性が組込遺伝子の発現を決定する二つ
の大きなパラメータであるが，これらの二つのパラメー
タのいずれも制御不可能であることである。
【０００８】動物細胞内に異種蛋白質を発現させる際に
当面する問題点を解決する別のアプローチとして，自己
複製する一方，細胞内に保持されその後代に伝えられる
発現ベクターを新規に生成する試みがある。このベクタ
ーは，細胞内で活性な複製起源の機能を保証する少なく
とも一つの配列と，細胞内でのベクターの保持および細
胞分裂中に娘細胞でのベクターの分離を可能とする複数
の配列を含むことが必要である。
当面する問題点を解決する別のアプローチとして，自己
複製する一方，細胞内に保持されその後代に伝えられる
発現ベクターを新規に生成する試みがある。このベクタ
ーは，細胞内で活性な複製起源の機能を保証する少なく
とも一つの配列と，細胞内でのベクターの保持および細
胞分裂中に娘細胞でのベクターの分離を可能とする複数
の配列を含むことが必要である。
【０００９】以前より，酵母菌に染色体外複製起源とし
て活性な配列が存在することが知られている。これらの
配列は，ＤＡＮ部分に存在するものであるが，ＡＲＳ
（自己複製配列）と呼ばれている。ＡＲＳ因子は，二つ
のコンセンサス配列を所有している。そのうちの一つ
は，コア配列（Ａ領域またはドメイン）であり，これは
ＡＲＳ機能〔ＫＥＡＲＳＥＹ，Ｃｅｌｌ．，３７，２９
９─３０７，（１９８４）〕に必要であるが，それ自体
は自己複製を許容するに充分でなく，追加の側方配列の
存在を必要とする。他の一つは，上記コア配列のＴ残基
の豊富な鎖の３’端の下流に位置する３’コンセンサス
配列（Ｃ領域またはドメイン）である。
て活性な配列が存在することが知られている。これらの
配列は，ＤＡＮ部分に存在するものであるが，ＡＲＳ
（自己複製配列）と呼ばれている。ＡＲＳ因子は，二つ
のコンセンサス配列を所有している。そのうちの一つ
は，コア配列（Ａ領域またはドメイン）であり，これは
ＡＲＳ機能〔ＫＥＡＲＳＥＹ，Ｃｅｌｌ．，３７，２９
９─３０７，（１９８４）〕に必要であるが，それ自体
は自己複製を許容するに充分でなく，追加の側方配列の
存在を必要とする。他の一つは，上記コア配列のＴ残基
の豊富な鎖の３’端の下流に位置する３’コンセンサス
配列（Ｃ領域またはドメイン）である。
【００１０】動物細胞における上記ＡＲＳ因子のコンセ
ンサス配列と同様な配列について記載した文献はある
が，動物細胞内のＤＮＡ複製におけるそれらの配列の役
割は未だ解明されていない。動物，特に哺乳動物の細胞
内において複製起源として高い活性を有する配列を同定
する種々の研究が行われてきた〔ＫＲＹＳＡＮ等，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．１０２６−１０３
３，（１９８９）；ＨＯＬＳＴ等，Ｃｅｌｌ ５２，
ｐ．３５５−３６５，（１９８８）〕；ＵＭＥＫ等，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１
００７，ｐ．１−１４，）１９８９）〕。しかし，これ
らの研究の多くは，染色体外遺伝情報の複製および保持
を可能とする配列の生成には至らなかった。
ンサス配列と同様な配列について記載した文献はある
が，動物細胞内のＤＮＡ複製におけるそれらの配列の役
割は未だ解明されていない。動物，特に哺乳動物の細胞
内において複製起源として高い活性を有する配列を同定
する種々の研究が行われてきた〔ＫＲＹＳＡＮ等，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．１０２６−１０３
３，（１９８９）；ＨＯＬＳＴ等，Ｃｅｌｌ ５２，
ｐ．３５５−３６５，（１９８８）〕；ＵＭＥＫ等，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１
００７，ｐ．１−１４，）１９８９）〕。しかし，これ
らの研究の多くは，染色体外遺伝情報の複製および保持
を可能とする配列の生成には至らなかった。
【００１１】昆虫の細胞の場合，複製起源として唯一同
定されているのはショウジョバエのメラノガスタ・ミト
コンドリアＤＮＡ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ ＤＮ
Ａ）のものである〔ＳＵＧＩＮＯ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９１，ｐ．１３
２１−１３２９，）１９７８）〕。ショウジョバエのゲ
ノムにＡＲＳ配列が存在することも知られているが〔Ｇ
ＲＡＧＥＲＯＶ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
６，ｐ．１１６９−１１８０，（１９８８）〕，複製起
源としてのそれらの活動は示されていない。昆虫のウイ
ルスに関して，ＡｃＮＭＰＶバキュロウイルスゲノムの
少なくとも二つの領域に，酵母菌細胞に導入された時に
ＡＲＳ因子と同様な挙動を示す配列の存在が知られてい
る〔ＨＯＯＦＴ ＶＡＮ ＨＩＤＤＥＫＩＮＧＥ等，Ａ
ｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．８８，ｐ．２７９−２８４，（１
９８６）〕。最近では，別のバキュロウイルスのゲノム
（Ｃｈｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ
ＮＰＶバキュロウイルス）において，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅにおいて機能的なＡＲＳを含む４個の断片が同
定されている〔ＬＥＥ等，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，２４，ｐ．２４９−２６４，（１９９２）〕。これ
らの断片のうちのＡＲＳ活動が最も高いものの配列の分
析をした結果，屈曲ＤＮＡの領域に対合したＡ＋Ｔの豊
富な領域の存在することが判明した。酵母菌のＡＲＳ因
子のコアコンセンサス配列に正確に対応する配列はない
が，これらのＡＲＳ因子（１１の塩基対のうちの９また
は１０対）に近い１３の配列領域が同定されている。し
かしながら，酵母菌細胞以外の真核細胞におけるそれら
配列の機能に関しては知られていない。特に，それらが
ウイルス複製に関与するという推測もない。これは，Ａ
ｃＮＰＶバキュロウイルスにおいて，そのＤＮＡの複製
起源が，ｈｒ配列と呼ばれる複数の反復配列に位置する
ことが最近において判明している〔ＰＥＡＲＳＯＮ等，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，ｐ．１３８２−１３８４，
（１９９２）〕ことからも推定される。それらのｈｒ配
列はそれぞれ，互いに高い相似性を有する幾つかの不完
全パリンドローム（自己相補的配列）を含むものであ
る。上記反ｈｒ列はＡｃＮＰＶゲノムに沿って配置され
た６つの領域に存在するものであるが，そられは発現促
進特性を有することで以前より知られている〔前記ＧＵ
ＡＲＩＮＯ等，（１９８６）〕。上記ｈｒ配列の遺伝子
欠失分析により，単一の完全パリンドロームを含む配列
が複製可能であることが証明された。また，ＫＯＯＬ等
は，欠陥ウイルスのＤＮＡに存在し，感染細胞内におい
てＡｃＮＰＶの複製起源として機能することが可能な配
列の検出および機能分析についての文献を発表している
〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２，ｐ．９４−１０１，（１
９９３）〕。そのウイルス複製に関する活動は主に，反
復性の高いＤＮＡ ｈｒ５を含む１，０００個の塩基対
領域で行われることが判明している。
定されているのはショウジョバエのメラノガスタ・ミト
コンドリアＤＮＡ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏｒｉａｌ ＤＮ
Ａ）のものである〔ＳＵＧＩＮＯ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９１，ｐ．１３
２１−１３２９，）１９７８）〕。ショウジョバエのゲ
ノムにＡＲＳ配列が存在することも知られているが〔Ｇ
ＲＡＧＥＲＯＶ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
６，ｐ．１１６９−１１８０，（１９８８）〕，複製起
源としてのそれらの活動は示されていない。昆虫のウイ
ルスに関して，ＡｃＮＭＰＶバキュロウイルスゲノムの
少なくとも二つの領域に，酵母菌細胞に導入された時に
ＡＲＳ因子と同様な挙動を示す配列の存在が知られてい
る〔ＨＯＯＦＴ ＶＡＮ ＨＩＤＤＥＫＩＮＧＥ等，Ａ
ｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．８８，ｐ．２７９−２８４，（１
９８６）〕。最近では，別のバキュロウイルスのゲノム
（Ｃｈｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ
ＮＰＶバキュロウイルス）において，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅにおいて機能的なＡＲＳを含む４個の断片が同
定されている〔ＬＥＥ等，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，２４，ｐ．２４９−２６４，（１９９２）〕。これ
らの断片のうちのＡＲＳ活動が最も高いものの配列の分
析をした結果，屈曲ＤＮＡの領域に対合したＡ＋Ｔの豊
富な領域の存在することが判明した。酵母菌のＡＲＳ因
子のコアコンセンサス配列に正確に対応する配列はない
が，これらのＡＲＳ因子（１１の塩基対のうちの９また
は１０対）に近い１３の配列領域が同定されている。し
かしながら，酵母菌細胞以外の真核細胞におけるそれら
配列の機能に関しては知られていない。特に，それらが
ウイルス複製に関与するという推測もない。これは，Ａ
ｃＮＰＶバキュロウイルスにおいて，そのＤＮＡの複製
起源が，ｈｒ配列と呼ばれる複数の反復配列に位置する
ことが最近において判明している〔ＰＥＡＲＳＯＮ等，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，ｐ．１３８２−１３８４，
（１９９２）〕ことからも推定される。それらのｈｒ配
列はそれぞれ，互いに高い相似性を有する幾つかの不完
全パリンドローム（自己相補的配列）を含むものであ
る。上記反ｈｒ列はＡｃＮＰＶゲノムに沿って配置され
た６つの領域に存在するものであるが，そられは発現促
進特性を有することで以前より知られている〔前記ＧＵ
ＡＲＩＮＯ等，（１９８６）〕。上記ｈｒ配列の遺伝子
欠失分析により，単一の完全パリンドロームを含む配列
が複製可能であることが証明された。また，ＫＯＯＬ等
は，欠陥ウイルスのＤＮＡに存在し，感染細胞内におい
てＡｃＮＰＶの複製起源として機能することが可能な配
列の検出および機能分析についての文献を発表している
〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２，ｐ．９４−１０１，（１
９９３）〕。そのウイルス複製に関する活動は主に，反
復性の高いＤＮＡ ｈｒ５を含む１，０００個の塩基対
領域で行われることが判明している。
【００１２】
【解決課題】本発明者等は，鱗翅目類細胞において自己
複製可能な安定的ベクターを生成する目的で，先ず第一
段階として，上記鱗翅目類細胞において活性な複製起源
を検索することから始めた。
複製可能な安定的ベクターを生成する目的で，先ず第一
段階として，上記鱗翅目類細胞において活性な複製起源
を検索することから始めた。
【００１３】そのために，本発明者等は，ＡｃＮＰＶバ
キュロウイルスＩＥ１遺伝子の促進因子の管理下におい
てネオマイシンに対する耐性のリポータ遺伝子を挿入し
て，この遺伝子を含む核外遺伝子またはプラスミド（以
後，ｐＩＥ１ＮｅｏＲと呼ぶ）を生成し，ゲノムＤＮＡ
群の生成およびスクリーニングのためにＳｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９）を使用し
て，昆虫細胞内において活性な複製起源を保持する細胞
ＤＮＡ配列を検索した。
キュロウイルスＩＥ１遺伝子の促進因子の管理下におい
てネオマイシンに対する耐性のリポータ遺伝子を挿入し
て，この遺伝子を含む核外遺伝子またはプラスミド（以
後，ｐＩＥ１ＮｅｏＲと呼ぶ）を生成し，ゲノムＤＮＡ
群の生成およびスクリーニングのためにＳｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９）を使用し
て，昆虫細胞内において活性な複製起源を保持する細胞
ＤＮＡ配列を検索した。
【００１４】上記研究において本発明者等は，驚くべき
発見を得た。即ち，上記プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ
は，細胞由来のいかなるＤＮＡ挿入もすることなしに昆
虫細胞内において自己複製が可能なこと，更に，この自
己複製が，最初に形質転換した細胞の後代において高分
子の染色体外構造であるプラスミド遺伝物質を強化する
ことにより，数代の培養の後に達成された事実を確認し
た。
発見を得た。即ち，上記プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ
は，細胞由来のいかなるＤＮＡ挿入もすることなしに昆
虫細胞内において自己複製が可能なこと，更に，この自
己複製が，最初に形質転換した細胞の後代において高分
子の染色体外構造であるプラスミド遺伝物質を強化する
ことにより，数代の培養の後に達成された事実を確認し
た。
【００１５】
【解決手段】本発明者等は，上記特性に貢献するプラス
ミドの領域を検索した結果，それたの領域は，ＩＥ１プ
ロテインのＣＯＯＨ末端を符号化するＩＥ１遺伝子の部
分およびこの遺伝子の側方３’領域にオーバーラップす
るＤＮＡ配列の存在と係わるものであることを発見し
た。この配列を以後「ＡＭＩＧ配列」（遺伝情報の強化
および保持）と呼ぶこととするが，これを添付の配列表
１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示す。
ミドの領域を検索した結果，それたの領域は，ＩＥ１プ
ロテインのＣＯＯＨ末端を符号化するＩＥ１遺伝子の部
分およびこの遺伝子の側方３’領域にオーバーラップす
るＤＮＡ配列の存在と係わるものであることを発見し
た。この配列を以後「ＡＭＩＧ配列」（遺伝情報の強化
および保持）と呼ぶこととするが，これを添付の配列表
１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】上記特性に貢献する構造を見つける目的で
ＡＭＩＧ配列の分析を行った結果，ＡＲＳ因子のＡ領域
のコンセンサス配列と同種の１１ｂｐのＭＣＣＳ配列の
一つを含む，酵母菌ＡＲＳ配列に関係する幾つかの配列
を同定した。また，酵母菌および哺乳類細胞のコンセン
サス動原体配列に近い配列も同定した。
ＡＭＩＧ配列の分析を行った結果，ＡＲＳ因子のＡ領域
のコンセンサス配列と同種の１１ｂｐのＭＣＣＳ配列の
一つを含む，酵母菌ＡＲＳ配列に関係する幾つかの配列
を同定した。また，酵母菌および哺乳類細胞のコンセン
サス動原体配列に近い配列も同定した。
【００１８】更に，本発明者等は，ＩＥ１遺伝子の促進
因子の上流に位置する配列を同定し，この配列が高分子
の染色体外構造の安定性を保証する作用を有することを
確認した。この配列を以後「ＳＴＡＢ配列」と呼ぶこと
とするが，これを添付の配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２として示す。
因子の上流に位置する配列を同定し，この配列が高分子
の染色体外構造の安定性を保証する作用を有することを
確認した。この配列を以後「ＳＴＡＢ配列」と呼ぶこと
とするが，これを添付の配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２として示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】上記ＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列を種
々の促進因子と共に含む種々のプラスミドを生成した。
これらのプラスミドの全てが上記特性，即ち，形質転換
細胞内において複製可能であり，それらの細胞の後代に
おいて保持され，分子量が相当に多いエピソームの形態
で存在するという特性を有している。
々の促進因子と共に含む種々のプラスミドを生成した。
これらのプラスミドの全てが上記特性，即ち，形質転換
細胞内において複製可能であり，それらの細胞の後代に
おいて保持され，分子量が相当に多いエピソームの形態
で存在するという特性を有している。
【００２１】本発明においては，「エピソーム（ｅｐｉ
ｓｏｍｅ）」なる用語は染色体外，自己複製ＤＮＡ分子
を意味するものとして解釈されるものとする。
ｓｏｍｅ）」なる用語は染色体外，自己複製ＤＮＡ分子
を意味するものとして解釈されるものとする。
【００２２】本発明は，添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１として示す配列を含むＤＮＡ断片を使用して，
動物細胞内において自己複製可能で，且つエピソームの
形態において該細胞の後代に保存され得るベクターを生
成する方法を，その要旨とするものである。
ＮＯ：１として示す配列を含むＤＮＡ断片を使用して，
動物細胞内において自己複製可能で，且つエピソームの
形態において該細胞の後代に保存され得るベクターを生
成する方法を，その要旨とするものである。
【００２３】上記方法において，有利には，前記配列Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むＤＮＡ断片を，添付配列表
２にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示す配列を含むＤＮ
Ａ断片と組み合わせて使用される。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むＤＮＡ断片を，添付配列表
２にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示す配列を含むＤＮ
Ａ断片と組み合わせて使用される。
【００２４】また，本発明においては，動物細胞内にお
いて繁殖可能で，該細胞の後代に保存され得るベクター
であって，添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とし
て示す配列を含む単位ベクターのコンカテマーから成る
エピソームの形態として存在するベクターをも，その要
旨とするもである。
いて繁殖可能で，該細胞の後代に保存され得るベクター
であって，添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とし
て示す配列を含む単位ベクターのコンカテマーから成る
エピソームの形態として存在するベクターをも，その要
旨とするもである。
【００２５】本発明に従うベクターにおいては，前記単
位ベクターが更に，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２として示す配列を含むことが望ましい。
位ベクターが更に，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２として示す配列を含むことが望ましい。
【００２６】本発明においては，上記用語「コンカテマ
ー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）」は，単位ベクターにより
保持される少なくとも二群の遺伝情報を有するＤＮＡ分
子を意味するものと解釈されるべきである。この「単位
ベクター」は，上記配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に加え
て，特にそして有利には，配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
を更に含むようにすることができる。この場合，配列Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一つのＤＮＡ断片は
動物細胞内で増殖し，この細胞の後代に保持されるもの
である。例えば，配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は蛋白質
の生成や選択可能なマーカー等の構成に必要な遺伝情報
を持つ複数のＤＮＡ断片を含む。
ー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）」は，単位ベクターにより
保持される少なくとも二群の遺伝情報を有するＤＮＡ分
子を意味するものと解釈されるべきである。この「単位
ベクター」は，上記配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に加え
て，特にそして有利には，配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
を更に含むようにすることができる。この場合，配列Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一つのＤＮＡ断片は
動物細胞内で増殖し，この細胞の後代に保持されるもの
である。例えば，配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は蛋白質
の生成や選択可能なマーカー等の構成に必要な遺伝情報
を持つ複数のＤＮＡ断片を含む。
【００２７】また，本発明にあっては，異種由来の染色
体外遺伝情報を後代に伝え得る動物細胞系の生成方法で
あって，前記遺伝情報を有し且つ添付配列表１にＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１として示す配列を含む少なくとも一つの
単位ベクターを含むＤＮＡ標本，若しくは前記単位ベク
ターのコンカテマーから成る少なくとも一つのエピソー
ムを含むＤＮＡ標本により，動物細胞に形質移入（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する工程と，前記動物細胞を増
殖して，前記単位ベクターのコンカテマーから成る少な
くとも一つのエピソームを持つ前記細胞の後代を選択す
る工程とを含むことを動物細胞系の生成方法をも，その
要旨とするものである。
体外遺伝情報を後代に伝え得る動物細胞系の生成方法で
あって，前記遺伝情報を有し且つ添付配列表１にＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１として示す配列を含む少なくとも一つの
単位ベクターを含むＤＮＡ標本，若しくは前記単位ベク
ターのコンカテマーから成る少なくとも一つのエピソー
ムを含むＤＮＡ標本により，動物細胞に形質移入（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する工程と，前記動物細胞を増
殖して，前記単位ベクターのコンカテマーから成る少な
くとも一つのエピソームを持つ前記細胞の後代を選択す
る工程とを含むことを動物細胞系の生成方法をも，その
要旨とするものである。
【００２８】上記方法にあっては，前記単位ベクターが
更に，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤＮＯ：２として示す
配列を含むことがむことが望ましい。
更に，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤＮＯ：２として示す
配列を含むことがむことが望ましい。
【００２９】本発明に従えば，上記方法により選択され
た細胞からＤＮＡを抽出することによりエピソームベク
ターを取り出す可能である。
た細胞からＤＮＡを抽出することによりエピソームベク
ターを取り出す可能である。
【００３０】本発明に従って動物細胞系およびエピソー
ムベクターを生成するために上記方法の実施を可能とす
る単位ベクターを得るために，添付配列表１にＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１として示す配列，好ましくは更に，添付配
列表２にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示す配列，並び
に動物細胞内での増殖およびその細胞の後代での保持を
望むその他のＤＮＡ配列を，適当な宿主ベクターに導入
する。この単位ベクターの生成方法として，ＳＡＭＢＲ
ＯＯＫ等の〔分子クローニング：ラボラトリー・マニュ
アル，第二版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー出版，（１９８９）〕に記載の宿主ベクターや
その他の一般に使用されている宿主ベクターを用いる従
来の遺伝子工学の方法が採用される。
ムベクターを生成するために上記方法の実施を可能とす
る単位ベクターを得るために，添付配列表１にＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１として示す配列，好ましくは更に，添付配
列表２にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示す配列，並び
に動物細胞内での増殖およびその細胞の後代での保持を
望むその他のＤＮＡ配列を，適当な宿主ベクターに導入
する。この単位ベクターの生成方法として，ＳＡＭＢＲ
ＯＯＫ等の〔分子クローニング：ラボラトリー・マニュ
アル，第二版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー出版，（１９８９）〕に記載の宿主ベクターや
その他の一般に使用されている宿主ベクターを用いる従
来の遺伝子工学の方法が採用される。
【００３１】本発明は更に，異種由来の遺伝情報を発現
し得る安定な細胞系であって，前記細胞系の各細胞が本
発明に従う少なくとも一つのエピソームベクターを含む
細胞系をも，その対象とするものである。
し得る安定な細胞系であって，前記細胞系の各細胞が本
発明に従う少なくとも一つのエピソームベクターを含む
細胞系をも，その対象とするものである。
【００３２】上記細胞系は，昆虫，特に，鱗翅目類であ
ることが好ましい。
ることが好ましい。
【００３３】本発明は，異種由来の遺伝情報を動物細胞
内に安定的に発現することを保証する発現系を提供する
ものである。本発現系は，特に，組換蛋白質の生成に利
用することができる。即ち，本発現系は，蛋白質を符号
化する遺伝子の細胞内への組み入れと独立に，且つこの
組み入れに係わる不明瞭を伴うことなく，対象とする蛋
白質を，連続的に且つ高い発現性を以て得ることを可能
とするものである。
内に安定的に発現することを保証する発現系を提供する
ものである。本発現系は，特に，組換蛋白質の生成に利
用することができる。即ち，本発現系は，蛋白質を符号
化する遺伝子の細胞内への組み入れと独立に，且つこの
組み入れに係わる不明瞭を伴うことなく，対象とする蛋
白質を，連続的に且つ高い発現性を以て得ることを可能
とするものである。
【００３４】
【実施例】以下に，本発明を更に具体的に明らかにする
ために，本発明に従うＡＭＩＧ配列を含むベクターの生
成例および使用例を説明する。
ために，本発明に従うＡＭＩＧ配列を含むベクターの生
成例および使用例を説明する。
【００３５】しかしながら，そのような実施例は本発明
の主題を例示する目的でのみ記載され，本発明がそれら
の実施例に限定的に解釈されるものではない。
の主題を例示する目的でのみ記載され，本発明がそれら
の実施例に限定的に解釈されるものではない。
【００３６】以下の実施例では一般的な分子生物学の技
法が言及されるが，それらの技法は前記ＳＡＭＢＲＯＯ
Ｋ等の〔分子クローニング：ラボラトリー・マニュア
ル，第二版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー出版，（１９８９）〕に記載されている。
法が言及されるが，それらの技法は前記ＳＡＭＢＲＯＯ
Ｋ等の〔分子クローニング：ラボラトリー・マニュア
ル，第二版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー出版，（１９８９）〕に記載されている。
【００３７】実施例１： ＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列を含むプラスミドの生
成；およびプラスミドの動物細胞内複製，並びに非常に
大きい分子量を有するエピソマー構造の形成 ＩＥ１遺伝子およびその促進因子が，図１に示されるＡ
ｃＮＰＶバキュロウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｇ断片の
ＣｌａＩ−ＸｂａＩサブ断片（２６５８ｂｐ）に存在し
ている。このＣｌａＩ−ＸｂａＩサブ断片を切除し，プ
ラスミドｐＵＣ１８に挿入し，そのプラスミドのＡｃｃ
Ｉ−ＸｂａＩ断片と置換した。このようにして，図２Ａ
に示すプラスミドｐＩＥ１がえられる（これらの塩基は
ＩＥ１のＡＴＧコドンのＡから番号が付される）。
成；およびプラスミドの動物細胞内複製，並びに非常に
大きい分子量を有するエピソマー構造の形成 ＩＥ１遺伝子およびその促進因子が，図１に示されるＡ
ｃＮＰＶバキュロウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｇ断片の
ＣｌａＩ−ＸｂａＩサブ断片（２６５８ｂｐ）に存在し
ている。このＣｌａＩ−ＸｂａＩサブ断片を切除し，プ
ラスミドｐＵＣ１８に挿入し，そのプラスミドのＡｃｃ
Ｉ−ＸｂａＩ断片と置換した。このようにして，図２Ａ
に示すプラスミドｐＩＥ１がえられる（これらの塩基は
ＩＥ１のＡＴＧコドンのＡから番号が付される）。
【００３８】ネオマイシン（ＮｅｏＲ）に対する耐性遺
伝子を，ＩＥ１プロテインを符号化する遺伝子の促進因
子の下流のプラスミドｐＩＥ１に，次の方法で挿入し
た。先ず，ｐＮｅｏ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）のＢｇｌＩ
Ｉ−ＳｍａＩ断片をｐＩＥ１のＨｉｎｃＩＩ−ＡｃｃＩ
断片と置換した。プラスミドｐＩＥ１の端と，ＮｅｏＲ
遺伝子を持つ断片のＢｇ１ＩＩ端とを，それらの接合前
に，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼの作用により丸形状に
した。このようにして得られたプラスミドをｐＩＥ１Ｎ
ｅｏＲと呼ぶ。このｐＩＥ１ＮｅｏＲ挿入片を図２Ｂに
概略的に示す（これらの塩基はＮｅｏＲのＡＴＧのＡか
ら番号が付される）。
伝子を，ＩＥ１プロテインを符号化する遺伝子の促進因
子の下流のプラスミドｐＩＥ１に，次の方法で挿入し
た。先ず，ｐＮｅｏ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）のＢｇｌＩ
Ｉ−ＳｍａＩ断片をｐＩＥ１のＨｉｎｃＩＩ−ＡｃｃＩ
断片と置換した。プラスミドｐＩＥ１の端と，ＮｅｏＲ
遺伝子を持つ断片のＢｇ１ＩＩ端とを，それらの接合前
に，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼの作用により丸形状に
した。このようにして得られたプラスミドをｐＩＥ１Ｎ
ｅｏＲと呼ぶ。このｐＩＥ１ＮｅｏＲ挿入片を図２Ｂに
概略的に示す（これらの塩基はＮｅｏＲのＡＴＧのＡか
ら番号が付される）。
【００３９】プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲがＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ５αＦ’ＩＱ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の形質転
換に使用され，ＣｓＣｌ勾配で，アンピシリン（ａｍｐ
ｉｃｉｌｌｉｎ）に対する抵抗性に基づき選択された組
換バクテリアから純粋化された。
ｉ ＤＨ５αＦ’ＩＱ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の形質転
換に使用され，ＣｓＣｌ勾配で，アンピシリン（ａｍｐ
ｉｃｉｌｌｉｎ）に対する抵抗性に基づき選択された組
換バクテリアから純粋化された。
【００４０】プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲをＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（クローンＳｆ
９）に次の方法で導入した。
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（クローンＳｆ
９）に次の方法で導入した。
【００４１】２００万個の細胞を，子牛の血清の１０％
（ｖ／ｖ）を添加したＴＣ１００培地（ＧＩＢＣＯ）を
収容する２５ｃｍ2 フラスコに導入する。室温にて一時
間放置すると，細胞がフラスコの底に付着し始める。上
記培地を取り除き，それに代えて，ＤＯＴＡＰ（ＢＯＥ
ＨＲＩＮＧＥＲ）の４０μｌとプラスミドｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲの１０μｇを添加したＴＣ１００培地を３ｍｌ導入
する。２８°Ｃにて４時間培養の後，培地を再び，Ｇ４
１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１ｍｇ／ｍｌ含む培地
（ＴＣ１００＋１０％ＦＣＳ）４ｍｌと代える。この培
地において数代培養した後，３％のメチルセルロース３
０００─５０００（ＰＲＯＬＡＢＯ）およびＧ４１８の
１ｍｇ／ｍｌを含む培地中の直径１４０ｍｍのペトリ皿
に細胞がクローニング生成される（一皿当たり約１００
個の細胞）。
（ｖ／ｖ）を添加したＴＣ１００培地（ＧＩＢＣＯ）を
収容する２５ｃｍ2 フラスコに導入する。室温にて一時
間放置すると，細胞がフラスコの底に付着し始める。上
記培地を取り除き，それに代えて，ＤＯＴＡＰ（ＢＯＥ
ＨＲＩＮＧＥＲ）の４０μｌとプラスミドｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲの１０μｇを添加したＴＣ１００培地を３ｍｌ導入
する。２８°Ｃにて４時間培養の後，培地を再び，Ｇ４
１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１ｍｇ／ｍｌ含む培地
（ＴＣ１００＋１０％ＦＣＳ）４ｍｌと代える。この培
地において数代培養した後，３％のメチルセルロース３
０００─５０００（ＰＲＯＬＡＢＯ）およびＧ４１８の
１ｍｇ／ｍｌを含む培地中の直径１４０ｍｍのペトリ皿
に細胞がクローニング生成される（一皿当たり約１００
個の細胞）。
【００４２】ｐＩＥ１ＮｅｏＲの遺伝情報を持つ構造の
特徴を決定するため，Ｇ４１８に対する抵抗性を有する
細胞の全ＤＮＡを次の方法によりパルスフィールド電気
泳動法で分析した。２００万個の細胞を取り出し，ＰＢ
Ｓで洗浄した後，１％のアガロースに挿入する。４°Ｃ
にて重合した後，アガロースブロックを５容量部の溶解
緩衝剤（１０ｍＭ トリス─ＨＣｌ，ｐＨ８，１００ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，２００
μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ）に５０°Ｃで１６時間浸漬
する。続いて，アガロースブロックをＴＥ緩衝剤（１０
ｍＭ トリス─ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で２回濯ぎ，ＰＭＳＦ溶液（ＴＥ中０．５ｍＭＰ
ＭＳＦ）中において３７°Ｃで２時間培養した後，再び
ＴＥ緩衝剤で３回濯ぐ。その後，所定の制限酵素緩衝剤
中で，４°Ｃで１６時間平衡化処理し，この酵素の５０
Ｕで一晩切断する。このように処理されたアガロースブ
ロックを１％のアガロースゲル（ＳＥＡＫＥＭ ＧＴ
Ｇ）に直接与えて，０．５ ｘＴＢＥ緩衝剤（４５ｍＭ
トリス─ＨＣｌ，３２ｍＭ ホウ酸，１．２５ｍＭＥ
ＤＴＡ；ｐＨ８．３）を用いて電気泳動法を実施する。
特徴を決定するため，Ｇ４１８に対する抵抗性を有する
細胞の全ＤＮＡを次の方法によりパルスフィールド電気
泳動法で分析した。２００万個の細胞を取り出し，ＰＢ
Ｓで洗浄した後，１％のアガロースに挿入する。４°Ｃ
にて重合した後，アガロースブロックを５容量部の溶解
緩衝剤（１０ｍＭ トリス─ＨＣｌ，ｐＨ８，１００ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，２００
μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ）に５０°Ｃで１６時間浸漬
する。続いて，アガロースブロックをＴＥ緩衝剤（１０
ｍＭ トリス─ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で２回濯ぎ，ＰＭＳＦ溶液（ＴＥ中０．５ｍＭＰ
ＭＳＦ）中において３７°Ｃで２時間培養した後，再び
ＴＥ緩衝剤で３回濯ぐ。その後，所定の制限酵素緩衝剤
中で，４°Ｃで１６時間平衡化処理し，この酵素の５０
Ｕで一晩切断する。このように処理されたアガロースブ
ロックを１％のアガロースゲル（ＳＥＡＫＥＭ ＧＴ
Ｇ）に直接与えて，０．５ ｘＴＢＥ緩衝剤（４５ｍＭ
トリス─ＨＣｌ，３２ｍＭ ホウ酸，１．２５ｍＭＥ
ＤＴＡ；ｐＨ８．３）を用いて電気泳動法を実施する。
【００４３】同様の分析を，形質転換をしていないＳｆ
９対照細胞について実施した。
９対照細胞について実施した。
【００４４】ｐＩＥ１ＮｅｏＲ上でのランダムプライミ
ング（ランダムプライミングによるラベリング用ＢＯＥ
ＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＴＩＭキット）により得
られる32Ｐプローブ（“ｐＩＥ１ＮｅｏＲプローブ”）
によるハイブリダイゼーションの後に，Ｓｆ９ＤＮＡの
パルスフィールド電気泳動ゲルを用いて行ったサザン法
により図３に示す結果が得られた。
ング（ランダムプライミングによるラベリング用ＢＯＥ
ＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＴＩＭキット）により得
られる32Ｐプローブ（“ｐＩＥ１ＮｅｏＲプローブ”）
によるハイブリダイゼーションの後に，Ｓｆ９ＤＮＡの
パルスフィールド電気泳動ゲルを用いて行ったサザン法
により図３に示す結果が得られた。
【００４５】図３Ａは，Ｂｇ１ＩＩによるＤＮＡの切断
（１８時間泳動，５秒パルス，２００Ｖ，０．５ｘ Ｔ
ＢＥ中１％アガロースゲル）を示す。 ＭＷ：分子量マーカー（単位：ｂｐ） レーン１：非形質移入Ｓｆ９細胞（対照細胞） レーン２：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲにより形質移入
されたＳｆ９細胞 図３Ｂは，４時間泳動（５秒パルス，２００Ｖ，ＴＢＥ
中１％アガロースゲル）の場合を示す。 ＭＷ：分子量マーカー レーン１：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ（非切断ＤＮ
Ａ）による形質移入されたＳｆ９細胞 レーン２：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ（ＮｃｏＩによ
り切断されたＤＮＡ）より形質移入されたＳｆ９細胞
（１８時間泳動，５秒パルス，２００Ｖ，０．５ｘ Ｔ
ＢＥ中１％アガロースゲル）を示す。 ＭＷ：分子量マーカー（単位：ｂｐ） レーン１：非形質移入Ｓｆ９細胞（対照細胞） レーン２：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲにより形質移入
されたＳｆ９細胞 図３Ｂは，４時間泳動（５秒パルス，２００Ｖ，ＴＢＥ
中１％アガロースゲル）の場合を示す。 ＭＷ：分子量マーカー レーン１：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ（非切断ＤＮ
Ａ）による形質移入されたＳｆ９細胞 レーン２：プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲ（ＮｃｏＩによ
り切断されたＤＮＡ）より形質移入されたＳｆ９細胞
【００４６】非常に大きい分子量（約３００ｋｂ）が非
切断ＤＮＡにおいて検出される。また，同様な分子量
が，Ｂｇ１ＩＩ等のプラスミドｐＩＥ１ｎｅｏＲに分割
部位を持たないエンドヌクレアーゼにより切断されたＤ
ＮＡにおいても検出される。非切断ＤＮＡの方が，Ｂｇ
１ＩＩで切断されたＤＮＡより分子量が大きい。これ
は，非切断ＤＮＡの場合には，エピソマー構造の泳動が
非常に大きい分子量の染色体ＤＮＡにより阻害されるた
めである。
切断ＤＮＡにおいて検出される。また，同様な分子量
が，Ｂｇ１ＩＩ等のプラスミドｐＩＥ１ｎｅｏＲに分割
部位を持たないエンドヌクレアーゼにより切断されたＤ
ＮＡにおいても検出される。非切断ＤＮＡの方が，Ｂｇ
１ＩＩで切断されたＤＮＡより分子量が大きい。これ
は，非切断ＤＮＡの場合には，エピソマー構造の泳動が
非常に大きい分子量の染色体ＤＮＡにより阻害されるた
めである。
【００４７】ＤＮＡの調製が、Ｎｃｏ１のように、ｐＩ
Ｅ１ＮｅｏＲのプラスミド配列の一ケ所だけ切断サイト
を有する、エンドヌクレアーゼによって行われるとき、
プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲの元の大きさに相当する単
一の断片が観察される。
Ｅ１ＮｅｏＲのプラスミド配列の一ケ所だけ切断サイト
を有する、エンドヌクレアーゼによって行われるとき、
プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲの元の大きさに相当する単
一の断片が観察される。
【００４８】プローブｐＥＩ１ｎｅｏ（ゲルＢレーン
２）によるハイブリダイゼーションを示す帯域を切除し
て，ＤＮＡを抽出し，電子顕微鏡で観察した結果，多く
の円形ＤＮＡ分子が検出された。それらの分子の長さ
は，約１１２μｍと推定され，これは略３３０ｋｂｐに
相当する。
２）によるハイブリダイゼーションを示す帯域を切除し
て，ＤＮＡを抽出し，電子顕微鏡で観察した結果，多く
の円形ＤＮＡ分子が検出された。それらの分子の長さ
は，約１１２μｍと推定され，これは略３３０ｋｂｐに
相当する。
【００４９】上記の結果から，ｐＩＥ１ＮｅｏＲにより
形質転換された細胞には，直列に連なるｐＩＥ１Ｎｅｏ
Ｒのコンカテマーから成る大きなＤＮＡ構造かエピソー
ムの形態で存在することが判った。
形質転換された細胞には，直列に連なるｐＩＥ１Ｎｅｏ
Ｒのコンカテマーから成る大きなＤＮＡ構造かエピソー
ムの形態で存在することが判った。
【００５０】更に，このＤＮＡ構造は細胞からアルカリ
溶解法〔ＣＡＲＲＯＬ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７，１７４０−１７５０，（１９８７）〕により
効率良く抽出することがでる。このことは，構造の大き
さに係わらず，円形の構造に特有のことである。上記抽
出は次の手法で行われる。先ず，５００万個の細胞を５
００μｌの溶解緩衝剤（５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ
ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，ｐＨ１２．４５）に入れて，２
分間渦動させ，３０°Ｃで３０分間培養する。次に，１
Ｍトリス─ＨＣｌ，ｐＨ７の１００μｌ，５Ｍ ＮａＣ
ｌの５５μｌおよび１０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ５
μｌをで加える。こうして得られた混合物を３７°Ｃで
３０分間培養する。冷却後，フェノール─クロロホルム
抽出を行い，エタノールでＤＮＡを沈殿させる。
溶解法〔ＣＡＲＲＯＬ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７，１７４０−１７５０，（１９８７）〕により
効率良く抽出することがでる。このことは，構造の大き
さに係わらず，円形の構造に特有のことである。上記抽
出は次の手法で行われる。先ず，５００万個の細胞を５
００μｌの溶解緩衝剤（５０ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ
ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，ｐＨ１２．４５）に入れて，２
分間渦動させ，３０°Ｃで３０分間培養する。次に，１
Ｍトリス─ＨＣｌ，ｐＨ７の１００μｌ，５Ｍ ＮａＣ
ｌの５５μｌおよび１０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ５
μｌをで加える。こうして得られた混合物を３７°Ｃで
３０分間培養する。冷却後，フェノール─クロロホルム
抽出を行い，エタノールでＤＮＡを沈殿させる。
【００５１】１０μｇのエピソマ形態のｐＥＩ１ｎｅｏ
（アルカリ溶解法により純粋化したもの）でＳｆ９細胞
の形質移入を行うことにより，抗Ｇ４１８細胞が得られ
る。
（アルカリ溶解法により純粋化したもの）でＳｆ９細胞
の形質移入を行うことにより，抗Ｇ４１８細胞が得られ
る。
【００５２】この非常に大きい分子量を持つエピソマー
構造は，ｐＩＥ１ＮｅｏＲを長時間多重合することによ
り細胞に現れる。形質移入の２５日後，ｐＩＥ１Ｎｅｏ
Ｒが，Ｇ４１８耐性細胞から得られた低分子ＤＮＡ中に
おいて，ＨＩＲＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６
５−３６９（１９６７）〕の方法に従って検出される。
この方法によれば，低分子構造が豊富なＤＮＡ標本が得
られる。次に，ｐＩＥ１ＮｅｏＲを１％アガロースゲル
上に分離し，電子顕微鏡で観察すると，平均長さが１．
６μｍのリラックス型・スーパーコイル型ＤＮＡ分子と
して検出される。この長さは，プラスミドｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲの理論長さに相当する。更に，数培養世代（継代）
について観察した結果，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲに
（プローブｐＩＥ１ＮｅｏＲ32Ｐによるハイブリダイゼ
ーション））対応する信号はＨＩＲＴ法で抽出したＤＮ
Ａでは減少していたが，全細胞ＤＮＡでは増加してい
た。また，ＨＩＲＴ法で細胞から抽出したＤＮＡでＥ．
ｃｏｌｉを形質転換することにより得られたクローンの
数は，形質移入後の経過時間と共に大きく減少している
ことが観察された。即ち，形質移入後２５日，４０日お
よび７０日に抽出したＤＮＡから，それぞれ２００個，
２個および０個のクローンが得られた。
構造は，ｐＩＥ１ＮｅｏＲを長時間多重合することによ
り細胞に現れる。形質移入の２５日後，ｐＩＥ１Ｎｅｏ
Ｒが，Ｇ４１８耐性細胞から得られた低分子ＤＮＡ中に
おいて，ＨＩＲＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６
５−３６９（１９６７）〕の方法に従って検出される。
この方法によれば，低分子構造が豊富なＤＮＡ標本が得
られる。次に，ｐＩＥ１ＮｅｏＲを１％アガロースゲル
上に分離し，電子顕微鏡で観察すると，平均長さが１．
６μｍのリラックス型・スーパーコイル型ＤＮＡ分子と
して検出される。この長さは，プラスミドｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲの理論長さに相当する。更に，数培養世代（継代）
について観察した結果，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲに
（プローブｐＩＥ１ＮｅｏＲ32Ｐによるハイブリダイゼ
ーション））対応する信号はＨＩＲＴ法で抽出したＤＮ
Ａでは減少していたが，全細胞ＤＮＡでは増加してい
た。また，ＨＩＲＴ法で細胞から抽出したＤＮＡでＥ．
ｃｏｌｉを形質転換することにより得られたクローンの
数は，形質移入後の経過時間と共に大きく減少している
ことが観察された。即ち，形質移入後２５日，４０日お
よび７０日に抽出したＤＮＡから，それぞれ２００個，
２個および０個のクローンが得られた。
【００５３】実施例２： ｐＩＥ１ＮｅｏＲの特性に貢献するＤＮＡ配列の特徴の
同定およびＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列の位置の特
定検出 ｐＩＥ１ＮｅｏＲから断片を除去することにより一連の
プラスミドが得られた。 ─ ＩＥ１の３’符号化配列の末端に位置するＡｆ１Ｉ
ＩＩサイトとベクターｐＵＣ１８のＡｆ１ＩＩＩサイト
との間の断片を除去することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔ
Ａを得る。 ─ ＩＥ１促進因子の側方５’領域での除去によりｐＩ
Ｅ１ＮｅｏＲΔＮ，ｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢおよびｐＩＥ
１ＮｅｏＲΔＭが得られる。 ＊ ＩＥ１のＮｈｅサイトとｐＵＣ１８のマルチサイト
・リンカーのＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間の断片を除去
することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＮが得られる。 ＊ ＩＥ１のＢｓｍＩサイトとｐＵＣ１８のマルチサイ
ト・リンカーのＰｓｔＩサイトとの間の断片を除去する
ことによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢが得られる。 ＊ ＩＥ１のＭｌｕＩサイトとｐＵＣ１８のマルチサイ
ト・リンカーのＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間の断片を除
去することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＭが得られる。
同定およびＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列の位置の特
定検出 ｐＩＥ１ＮｅｏＲから断片を除去することにより一連の
プラスミドが得られた。 ─ ＩＥ１の３’符号化配列の末端に位置するＡｆ１Ｉ
ＩＩサイトとベクターｐＵＣ１８のＡｆ１ＩＩＩサイト
との間の断片を除去することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔ
Ａを得る。 ─ ＩＥ１促進因子の側方５’領域での除去によりｐＩ
Ｅ１ＮｅｏＲΔＮ，ｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢおよびｐＩＥ
１ＮｅｏＲΔＭが得られる。 ＊ ＩＥ１のＮｈｅサイトとｐＵＣ１８のマルチサイト
・リンカーのＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間の断片を除去
することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＮが得られる。 ＊ ＩＥ１のＢｓｍＩサイトとｐＵＣ１８のマルチサイ
ト・リンカーのＰｓｔＩサイトとの間の断片を除去する
ことによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢが得られる。 ＊ ＩＥ１のＭｌｕＩサイトとｐＵＣ１８のマルチサイ
ト・リンカーのＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間の断片を除
去することによりｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＭが得られる。
【００５４】上記断片の除去によりＩＥ１促進因子の機
能が影響されないことを確認した後，除去したプラスミ
ドを実施例１で記載のＳｆ９細胞の形質移入に使用し
た。
能が影響されないことを確認した後，除去したプラスミ
ドを実施例１で記載のＳｆ９細胞の形質移入に使用し
た。
【００５５】Ｇ４１８耐性クローンを少数のみ生成した
プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲを除く全てのプラスミドが
多数の抵抗性クローンを生成した。
プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲを除く全てのプラスミドが
多数の抵抗性クローンを生成した。
【００５６】形質移入後１００日経過する迄，ＨＩＲＴ
法により抗Ｇ４１８細胞から得られた低分子ＤＮＡ内
に，全てのプラスミドが存在するのが検出された。しか
し，ｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡプラスミドの数は他のプラス
ミドの数よりかなり少なかった。
法により抗Ｇ４１８細胞から得られた低分子ＤＮＡ内
に，全てのプラスミドが存在するのが検出された。しか
し，ｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡプラスミドの数は他のプラス
ミドの数よりかなり少なかった。
【００５７】その後実施（形質移入後３００日後）した
実験では，ＨＩＲＴ法で抽出したＤＮＡにはもはやプラ
スミドは存在しなかった。
実験では，ＨＩＲＴ法で抽出したＤＮＡにはもはやプラ
スミドは存在しなかった。
【００５８】アルカリ溶解法でＧ４１８耐性細胞から抽
出したＤＮＡは，高分子染色体外細胞構造を有するプラ
スミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡ以外の全ての実験プラスミ
ドを含む。
出したＤＮＡは，高分子染色体外細胞構造を有するプラ
スミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡ以外の全ての実験プラスミ
ドを含む。
【００５９】従って，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡ
で形質移入された細胞に観察されたネオマイシン抵抗性
は，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡの細胞ＤＮＡへの
ランダムな組込から生じると思われる。
で形質移入された細胞に観察されたネオマイシン抵抗性
は，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡの細胞ＤＮＡへの
ランダムな組込から生じると思われる。
【００６０】形質移入細胞から準備される全ＤＮＡがＢ
ｇ１ＩＩで切断される際，高分子のエピソマー構造に対
応する主帯域に加えて，強度が低く電気泳動流動性の大
きい別の帯域が，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢ，ｐ
ＩＥ１ＮｅｏＲΔＮおよびｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＭについ
て観察される。このことから，染色体にプラスミドのコ
ンカテマーが組込まれることが判る。上記別の帯域はア
ルカリ溶解法により得られる抽出物では検出されないこ
とから，それらの抽出物は組込形態であると推定され
る。
ｇ１ＩＩで切断される際，高分子のエピソマー構造に対
応する主帯域に加えて，強度が低く電気泳動流動性の大
きい別の帯域が，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢ，ｐ
ＩＥ１ＮｅｏＲΔＮおよびｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＭについ
て観察される。このことから，染色体にプラスミドのコ
ンカテマーが組込まれることが判る。上記別の帯域はア
ルカリ溶解法により得られる抽出物では検出されないこ
とから，それらの抽出物は組込形態であると推定され
る。
【００６１】更に，種々のプラスミドで形質移入した細
胞をサブクローニングで得られたクローンを個別に分析
して，結果が均質細胞挙動によるものか，あるいは複数
の細胞個体群の挙動によるものかを観察した。
胞をサブクローニングで得られたクローンを個別に分析
して，結果が均質細胞挙動によるものか，あるいは複数
の細胞個体群の挙動によるものかを観察した。
【００６２】ｐＩＥ１ＮｅｏＲで形質移入した細胞から
得られたクローンは，全多クローン性細胞個体群と同一
の挙動を示した。
得られたクローンは，全多クローン性細胞個体群と同一
の挙動を示した。
【００６３】ｐＩＥ１ｎｅｏＲΔＡで形質移入した細胞
クローンには標識断片を検出されなかった。これは，プ
ラスミドに保持されている遺伝情報が存在するとすれ
ば，その情報の複製数は非常に少ないことを示唆するも
のである。
クローンには標識断片を検出されなかった。これは，プ
ラスミドに保持されている遺伝情報が存在するとすれ
ば，その情報の複製数は非常に少ないことを示唆するも
のである。
【００６４】ｐＥＩ１ｎｅｏＲΔＮから得られた３つの
クローンは多クローン性個体群と同じ挙動を持つことか
ら，同一細胞内に，組込まれた複製プラスミドと共存す
るエピソマー構造が存在するものと思われる。
クローンは多クローン性個体群と同じ挙動を持つことか
ら，同一細胞内に，組込まれた複製プラスミドと共存す
るエピソマー構造が存在するものと思われる。
【００６５】一方，ｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＢから得られた
４つのクローンの中，２つのクローンがｐＩＥ１Ｎｅｏ
ＲΔＮから得られたクローンと同様な挙動を有し，他の
２つのクローンがｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡから得られたク
ローンと同様な挙動を有している。プラスミドｐＩＥ１
ＮｅｏＲΔＭで形質移入した細胞から得られたクローン
についても同様である。
４つのクローンの中，２つのクローンがｐＩＥ１Ｎｅｏ
ＲΔＮから得られたクローンと同様な挙動を有し，他の
２つのクローンがｐＩＥ１ＮｅｏＲΔＡから得られたク
ローンと同様な挙動を有している。プラスミドｐＩＥ１
ＮｅｏＲΔＭで形質移入した細胞から得られたクローン
についても同様である。
【００６６】上記実験により，プラスミドｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲの特性に貢献する部位の特定をすることができた。
即ち，添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＡＭＩ
Ｇ配列）として示す配列を含むｐＩＥ１ＮｅｏＲのＡｃ
ｃＩ−ＸｂａＩ断片がプラスミド複製に必須の情報を保
持している。また，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２（ＳＴＡＢ配列）として示す配列を含むｐＩＥ１
ＮｅｏＲのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片がプラスミドのエピ
ソーム形態での構成に寄与し，エピソーム構造の安定化
に資する情報を保持している。
ｏＲの特性に貢献する部位の特定をすることができた。
即ち，添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＡＭＩ
Ｇ配列）として示す配列を含むｐＩＥ１ＮｅｏＲのＡｃ
ｃＩ−ＸｂａＩ断片がプラスミド複製に必須の情報を保
持している。また，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２（ＳＴＡＢ配列）として示す配列を含むｐＩＥ１
ＮｅｏＲのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片がプラスミドのエピ
ソーム形態での構成に寄与し，エピソーム構造の安定化
に資する情報を保持している。
【００６７】ＡＭＩＧ断片およびＳＴＡＢ断片の配列Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２を分析した。図４および図５はそれらの配列を表すも
ので，特定の特徴を現す領域が示されている。これらの
図において， ─ 上記断片の境界を成す制限サイトの配列を下線で示
し，それを断片の他の領域の列と括弧で分離している。
断片内の制限サイトの配列を下線で示す。 ─ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ＣＥＮコンセンサス配列
と同様の配列をボールドで示す。 ─ 酵母菌ＡＲＳコンセンサス配列を二重下線で示す。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２を分析した。図４および図５はそれらの配列を表すも
ので，特定の特徴を現す領域が示されている。これらの
図において， ─ 上記断片の境界を成す制限サイトの配列を下線で示
し，それを断片の他の領域の列と括弧で分離している。
断片内の制限サイトの配列を下線で示す。 ─ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ＣＥＮコンセンサス配列
と同様の配列をボールドで示す。 ─ 酵母菌ＡＲＳコンセンサス配列を二重下線で示す。
【００６８】ＡＭＩＧ配列（図４）は，ＡＲＳ要素の１
１塩基対と完全に同質な一つの部位（ＭＣＣＳ）と，１
１の塩基対のうち１０の塩基対がＡＲＳ要素のコア・コ
ンセンサス配列と同質な４つの部位と，１１の塩基対の
うち９の塩基対が，酵母菌ＡＲＳ要素のＡ領域（ドメイ
ン）の下流に位置するＡＲＳ（Ｃ）コンセンサス配列と
同質は一つの部位とを有している。これらの配列の全て
は，Ａ＋Ｔの約７０％を含む４１９の塩基対の部位に含
まれている。更に，ＡＭＩＧ配列は多くのＡＴＴＡまた
はＡＴＴＴＡ単位を有し，また，転写因子ＮＦＩ（核因
子Ｉ）の結合部のコンセンサス配列と非常に似た二つの
配列を持っている。ＡＭＩＧ配列を分析した結果，Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ＣＥＮコンセンサス配列と非常に
似た領域を確認した。これらの配列の一つは位置番号４
１乃至位置番号４７（この塩基番号は配列表上の番号で
ある）に存在し，ＣＤＥＩコンセンサス配列と１００％
同質である。
１塩基対と完全に同質な一つの部位（ＭＣＣＳ）と，１
１の塩基対のうち１０の塩基対がＡＲＳ要素のコア・コ
ンセンサス配列と同質な４つの部位と，１１の塩基対の
うち９の塩基対が，酵母菌ＡＲＳ要素のＡ領域（ドメイ
ン）の下流に位置するＡＲＳ（Ｃ）コンセンサス配列と
同質は一つの部位とを有している。これらの配列の全て
は，Ａ＋Ｔの約７０％を含む４１９の塩基対の部位に含
まれている。更に，ＡＭＩＧ配列は多くのＡＴＴＡまた
はＡＴＴＴＡ単位を有し，また，転写因子ＮＦＩ（核因
子Ｉ）の結合部のコンセンサス配列と非常に似た二つの
配列を持っている。ＡＭＩＧ配列を分析した結果，Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ＣＥＮコンセンサス配列と非常に
似た領域を確認した。これらの配列の一つは位置番号４
１乃至位置番号４７（この塩基番号は配列表上の番号で
ある）に存在し，ＣＤＥＩコンセンサス配列と１００％
同質である。
【００６９】また，位置番号１７７乃至位置番号２６３
および位置番号１５８乃至位置番号１６６に位置する配
列も，酵母菌ＡＲＳ要素のＣＤＥＩＩおよびＣＤＥＩＩ
Ｉコンセンサス配列と非常高い同質性をしめす。しか
し，ＣＤＥＩＩ／ＣＤＥＩＩＩブロックの向きをプラス
ミドｐＥＩ１ｎｅｏおよび酵母菌ＡＲＳ要素のＣＤＥ１
と比較すると，その向きが反対であることが観察され
る。
および位置番号１５８乃至位置番号１６６に位置する配
列も，酵母菌ＡＲＳ要素のＣＤＥＩＩおよびＣＤＥＩＩ
Ｉコンセンサス配列と非常高い同質性をしめす。しか
し，ＣＤＥＩＩ／ＣＤＥＩＩＩブロックの向きをプラス
ミドｐＥＩ１ｎｅｏおよび酵母菌ＡＲＳ要素のＣＤＥ１
と比較すると，その向きが反対であることが観察され
る。
【００７０】ＳＴＡＢ配列（図５）もまた，ＡＴＴまた
はＡＴＴＴＡ単位を有し，転写因子ＮＦＩ（核因子Ｉ）
および転写因子ＮＦＩＩＩの結合部のコンセンサス配列
およびＡＲＳ型配列と非常に似た配列を持っている。
はＡＴＴＴＡ単位を有し，転写因子ＮＦＩ（核因子Ｉ）
および転写因子ＮＦＩＩＩの結合部のコンセンサス配列
およびＡＲＳ型配列と非常に似た配列を持っている。
【００７１】実施例３： ＡＭＩＧ配列を持つプラスミドの生成，およびＩＥＯ促
進因子の管理下でのＮｅｏＲ遺伝子の発現 ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスＩＥＯ促進因子を，Ｋｐ
ｎＩおよびＢｓｓＨＩＩ制限サイトが側方に位置する断
片の形態のＰＣにより増幅した。そのＢｓｓ１ＩＩＩ端
をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後，ｐＵＣ１
９のＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片に置換挿入して，プラスミ
ドｐＩＥＯを得た。
進因子の管理下でのＮｅｏＲ遺伝子の発現 ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスＩＥＯ促進因子を，Ｋｐ
ｎＩおよびＢｓｓＨＩＩ制限サイトが側方に位置する断
片の形態のＰＣにより増幅した。そのＢｓｓ１ＩＩＩ端
をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後，ｐＵＣ１
９のＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片に置換挿入して，プラスミ
ドｐＩＥＯを得た。
【００７２】次に，ＮｅｏＲ遺伝子を含むｐｎｅｏのＢ
ｇ１ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＩＥＯのＢａｍ１ＩＩサ
イトに挿入し，ＩＥＯ促進因子の管理下でＮｅｏＲ遺伝
子を発現させて，プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲを得た。
ｇ１ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＩＥＯのＢａｍ１ＩＩサ
イトに挿入し，ＩＥＯ促進因子の管理下でＮｅｏＲ遺伝
子を発現させて，プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲを得た。
【００７３】ＡＭＩＧ配列を含むｐＩＥ１のＨｉｎｃＩ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をｐＩＥＯＮｅｏＲのＳｍａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片に置換挿入して，プラスミドｐＩＥＯＮｅ
ｏＲＡＭＩＧを得た。この構成を図６に示す。
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をｐＩＥＯＮｅｏＲのＳｍａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片に置換挿入して，プラスミドｐＩＥＯＮｅ
ｏＲＡＭＩＧを得た。この構成を図６に示す。
【００７４】上記プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧ
および実施例１で記載したように１ｍｇ／ｍｌでＧ４１
８にて選択した耐性細胞を用いて，Ｓｆ９細胞を形質転
換した。
および実施例１で記載したように１ｍｇ／ｍｌでＧ４１
８にて選択した耐性細胞を用いて，Ｓｆ９細胞を形質転
換した。
【００７５】１０世代（継代）の後，アルカリ溶解方で
上記Ｓｆ細胞から抽出したＤＮＡを実施例１で記載した
サザン法により分析した。この場合においても，遺伝情
報が，プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧの多くが直
列に複製されたものから成る高分子エピソームの形態で
存在する。
上記Ｓｆ細胞から抽出したＤＮＡを実施例１で記載した
サザン法により分析した。この場合においても，遺伝情
報が，プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧの多くが直
列に複製されたものから成る高分子エピソームの形態で
存在する。
【００７６】実施例４： ＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列を含むベクターにより
保持される遺伝子の，ウイルス促進因子の管理下での，
形質転換細胞の後代での発現 ＡｃＮＰＶからのＩＥＮ促進因子を含むＨｉｎｄＩＩＩ
−ＸｈｏＩ断片を次の方法で得た。 ─ ８ｂｐのＸｈｏＩリンカーをＮｅｏＲ遺伝子のＡＴ
Ｇの─３４において，ｐＮｅｏのＢｇ１ＩＩサイトに挿
入し，プラスミドｐＮｅｏＸｈｏＩを得た。 ─ ＡｃＮＰＶからの２６２０ｂｐの−Ｎ断片（ＩＥＮ
遺伝子およびその促進因子を含む）をｐＵＣ１８のＰｓ
ｔＩサイトに挿入することによりプラスミドｐＵＣ１８
ＩＥＮを生成した。ＩＥＮ促進因子を含むｐＵＣ１８Ｉ
ＥＮのＢｇ１ＩＩ−ＰｓｔＩ断片をプラスミドｐＳｅｌ
ｅｃｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ）にサブクローニングした．一
つの特異なＸｈｏＩサイトが，サイト指定突然変異誘発
により，ＩＥＮのＡＴＧ開始コドンに発生した。
保持される遺伝子の，ウイルス促進因子の管理下での，
形質転換細胞の後代での発現 ＡｃＮＰＶからのＩＥＮ促進因子を含むＨｉｎｄＩＩＩ
−ＸｈｏＩ断片を次の方法で得た。 ─ ８ｂｐのＸｈｏＩリンカーをＮｅｏＲ遺伝子のＡＴ
Ｇの─３４において，ｐＮｅｏのＢｇ１ＩＩサイトに挿
入し，プラスミドｐＮｅｏＸｈｏＩを得た。 ─ ＡｃＮＰＶからの２６２０ｂｐの−Ｎ断片（ＩＥＮ
遺伝子およびその促進因子を含む）をｐＵＣ１８のＰｓ
ｔＩサイトに挿入することによりプラスミドｐＵＣ１８
ＩＥＮを生成した。ＩＥＮ促進因子を含むｐＵＣ１８Ｉ
ＥＮのＢｇ１ＩＩ−ＰｓｔＩ断片をプラスミドｐＳｅｌ
ｅｃｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ）にサブクローニングした．一
つの特異なＸｈｏＩサイトが，サイト指定突然変異誘発
により，ＩＥＮのＡＴＧ開始コドンに発生した。
【００７７】ＩＥＮ促進因子を含むｐＵＣ１８ＩＥＮの
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を，プラスミドｐＢＬＣ
ＡＴ２〔ＬＵＣＫＯＷおよびＳＣＨＵＴＺ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５）１３‘５９４０（１９
８７）〕のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片に置換挿入し
た。このようにして得られたプラスミドをｐＩＥＮＣＡ
Ｔと呼ぶ。
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片を，プラスミドｐＢＬＣ
ＡＴ２〔ＬＵＣＫＯＷおよびＳＣＨＵＴＺ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５）１３‘５９４０（１９
８７）〕のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片に置換挿入し
た。このようにして得られたプラスミドをｐＩＥＮＣＡ
Ｔと呼ぶ。
【００７８】ＩＥＮ促進因子およびＣＡＴ遺伝子を含む
ｐＩＥＮＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片のＨｉ
ｎｄＩＩＩ端を，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復し
た後，その断片をプラスミドｐＩＥＮＮｅｏＲのＳｍａ
ＩとＳｃａＩサイトの間に挿入して，プラスミドｐＩＥ
１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴを得た。このプラスミドの構成
を図７に示す。
ｐＩＥＮＣＡＴのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片のＨｉ
ｎｄＩＩＩ端を，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復し
た後，その断片をプラスミドｐＩＥＮＮｅｏＲのＳｍａ
ＩとＳｃａＩサイトの間に挿入して，プラスミドｐＩＥ
１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴを得た。このプラスミドの構成
を図７に示す。
【００７９】プラスミドＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴお
よび１ｍｇ／ｍｌでＧ４１８にて選択した抵抗細胞を用
いて，Ｓｆ９細胞を形質転換（実施例１で述べたよう
に）した。
よび１ｍｇ／ｍｌでＧ４１８にて選択した抵抗細胞を用
いて，Ｓｆ９細胞を形質転換（実施例１で述べたよう
に）した。
【００８０】１０世代（継代）後，細胞を二つのバッチ
に分離した。これらのバッチの一つは選択圧力下に維持
したものであり，他方はそうでないものである。更に，
１５世代後，それらの二つの細胞バッチをパルス・フィ
ールド電気泳動法で分析した。
に分離した。これらのバッチの一つは選択圧力下に維持
したものであり，他方はそうでないものである。更に，
１５世代後，それらの二つの細胞バッチをパルス・フィ
ールド電気泳動法で分析した。
【００８１】その分析結果を図８に示す。遺伝情報は，
細胞が選択圧力下に維持されるか否かに係わらず，プラ
スミドｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴの多くを直列に複
写したものから成る高分子エピソームの形態で依然存在
する。尚，プラスミドの複製数はいずれのバッチも同じ
である。図８において，ＭＷおよび個々レーンは次の通
りである。 ＭＷ：分子量マーカー（単位：ｂｐ） レーン１：非形質転換Ｓｆ９細胞；Ｂｇ１ＩＩ切断 レーン２：非形質転換Ｓｆ９細胞；ＨｉｎｄＩＩＩ切断 レーン３：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力，Ｂｇ１ＩＩ切断（ｐＩＥ１Ｎ
ｅｏＲＩＥＮＣＡＴ中の単一サイト） レーン４：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力，ＨｉｎｄＩＩＩ切断（ｐＩＥ
１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴ中の単一サイト） レーン５：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力無し，Ｂｇ１ＩＩ切断 レーン６：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力無し，ＨｉｎｄＩＩＩ切断
細胞が選択圧力下に維持されるか否かに係わらず，プラ
スミドｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴの多くを直列に複
写したものから成る高分子エピソームの形態で依然存在
する。尚，プラスミドの複製数はいずれのバッチも同じ
である。図８において，ＭＷおよび個々レーンは次の通
りである。 ＭＷ：分子量マーカー（単位：ｂｐ） レーン１：非形質転換Ｓｆ９細胞；Ｂｇ１ＩＩ切断 レーン２：非形質転換Ｓｆ９細胞；ＨｉｎｄＩＩＩ切断 レーン３：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力，Ｂｇ１ＩＩ切断（ｐＩＥ１Ｎ
ｅｏＲＩＥＮＣＡＴ中の単一サイト） レーン４：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力，ＨｉｎｄＩＩＩ切断（ｐＩＥ
１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴ中の単一サイト） レーン５：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力無し，Ｂｇ１ＩＩ切断 レーン６：ｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴで形質転換し
たＳｆ９細胞；選択圧力無し，ＨｉｎｄＩＩＩ切断
【００８２】更に，細胞により生成されたＣＡＴのＥＬ
ＩＳＡ分析試験の結果は，抗─ＣＡＴ抗体（ＢＯＥＨＲ
ＩＮＧＥＲ）を用いた全細胞に関して，下表３に示すよ
うに，両バッチとも同様なものである。この試験結果か
ら，選択圧力の不存在下でも，エピソマー構造は安定で
あることが判る。
ＩＳＡ分析試験の結果は，抗─ＣＡＴ抗体（ＢＯＥＨＲ
ＩＮＧＥＲ）を用いた全細胞に関して，下表３に示すよ
うに，両バッチとも同様なものである。この試験結果か
ら，選択圧力の不存在下でも，エピソマー構造は安定で
あることが判る。
【００８３】実施例５： ＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列を含むプラスミドベク
ターにより保持される遺伝子の，細胞促進因子の管理下
での，形質転換細胞の後代での発現 プラスミドｐＣａＳｐｃＲ−ｈｓ〔ＴＨＵＭＭＥＬおよ
びＰＩＲＯＴＴＡ，Ｄｒｏｓ．ｉｎｆ．Ｓｅｍ．７１：
１５０）１９９２）〕のＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のＸｈ
ｏＩ端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼにて修復した。こ
の断片は，ショウジョバエ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からのｈｓｐ
７０促進因子およびこの遺伝子の約３００ｂｐの３’配
列を含む。これらの二つの要素は，特にＢｇ１ＩＩサイ
トとＳｔｕＩサイトを含むマルチプル・クローニング・
サイトにより分離される。本断片を，ｐＩＥ１ＮｅｏＲ
のＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片に置換挿入して，プラスミド
ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐを得た。
ターにより保持される遺伝子の，細胞促進因子の管理下
での，形質転換細胞の後代での発現 プラスミドｐＣａＳｐｃＲ−ｈｓ〔ＴＨＵＭＭＥＬおよ
びＰＩＲＯＴＴＡ，Ｄｒｏｓ．ｉｎｆ．Ｓｅｍ．７１：
１５０）１９９２）〕のＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のＸｈ
ｏＩ端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼにて修復した。こ
の断片は，ショウジョバエ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からのｈｓｐ
７０促進因子およびこの遺伝子の約３００ｂｐの３’配
列を含む。これらの二つの要素は，特にＢｇ１ＩＩサイ
トとＳｔｕＩサイトを含むマルチプル・クローニング・
サイトにより分離される。本断片を，ｐＩＥ１ＮｅｏＲ
のＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片に置換挿入して，プラスミド
ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐを得た。
【００８４】ＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドｐＢＬＣＡ
Ｔ２のＢｇ１ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲｈｓｐのＢｇ１ＩＩサイトとＳｔｕＩサイトとの間
に挿入して，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴ
を得た。このプラスミドの構成を図９に示す。
Ｔ２のＢｇ１ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＥ１Ｎｅ
ｏＲｈｓｐのＢｇ１ＩＩサイトとＳｔｕＩサイトとの間
に挿入して，プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴ
を得た。このプラスミドの構成を図９に示す。
【００８５】プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴ
および実施例１で記載したように１ｍｇ／ｍｌの濃度の
Ｇ４１８にて選択した耐性細胞でＳｆ９細胞を形質転換
した。
および実施例１で記載したように１ｍｇ／ｍｌの濃度の
Ｇ４１８にて選択した耐性細胞でＳｆ９細胞を形質転換
した。
【００８６】１０世代後，細胞を二つのバッチに分離し
た。そのうちの一つは抽選圧力下に維持したものであ
り，他方はそうでないものである。更に５世代後，これ
らの二つのバッチから得られたＤＮＡをアルカリ溶解法
により抽出して，実施例１で述べたようにサザン法で分
析した。この場合においても，遺伝情報は，プラスミド
ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴの多くを直列に複写した
ものから成る高分子エピソームの形態で存在する。
た。そのうちの一つは抽選圧力下に維持したものであ
り，他方はそうでないものである。更に５世代後，これ
らの二つのバッチから得られたＤＮＡをアルカリ溶解法
により抽出して，実施例１で述べたようにサザン法で分
析した。この場合においても，遺伝情報は，プラスミド
ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴの多くを直列に複写した
ものから成る高分子エピソームの形態で存在する。
【００８７】ショウジョバエ細胞においては，ｈｓｐ７
０促進因子が熱ショックの効果により誘導可能である。
従って，ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換した
Ｓｆ９細胞を３７°Ｃで０．５時間，１時間および２時
間熱ショックに晒して，生成されたＣＡＴの量を実施例
４で述べたようにＥＬＩＳＡ分析した。分析結果を図１
０に示す。図１０において，□，◆および■は，次のも
のを表す。 □：非形質転換Ｓｆ９細胞 ◆：ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換されたＳ
ｆ９細胞；選択圧力なしで１０世代 ■：ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換されたＳ
ｆ９細胞；選択圧力下で１０世代
０促進因子が熱ショックの効果により誘導可能である。
従って，ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換した
Ｓｆ９細胞を３７°Ｃで０．５時間，１時間および２時
間熱ショックに晒して，生成されたＣＡＴの量を実施例
４で述べたようにＥＬＩＳＡ分析した。分析結果を図１
０に示す。図１０において，□，◆および■は，次のも
のを表す。 □：非形質転換Ｓｆ９細胞 ◆：ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換されたＳ
ｆ９細胞；選択圧力なしで１０世代 ■：ｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴで形質転換されたＳ
ｆ９細胞；選択圧力下で１０世代
【００８８】３７°Ｃでの熱ショック時間をｘ軸に表
し，生成されたＣＡＴの量（ｎｇ／そう蛋白質ｍｇ）を
ｙ軸に表す。分析結果は次の通りである。 ─ 細胞は，選択圧力下に維持されるか否かに係わら
ず，全く同様の挙動を示す。 ─ ｈｓｐ１０促進因子（１．２ｎｇ／総蛋白質μｇ）
の管理下で生成されたＣＡＴの量はＩＥＮ促進因子
（０．２５ｎｇ／総蛋白質ｍｇ；実施例４，表Ｉ，参
照）の管理下で生成されたものより遙に多い。しかし，
熱ショックにより生成は誘導されないばかりか，３対２
の割合で減少する。
し，生成されたＣＡＴの量（ｎｇ／そう蛋白質ｍｇ）を
ｙ軸に表す。分析結果は次の通りである。 ─ 細胞は，選択圧力下に維持されるか否かに係わら
ず，全く同様の挙動を示す。 ─ ｈｓｐ１０促進因子（１．２ｎｇ／総蛋白質μｇ）
の管理下で生成されたＣＡＴの量はＩＥＮ促進因子
（０．２５ｎｇ／総蛋白質ｍｇ；実施例４，表Ｉ，参
照）の管理下で生成されたものより遙に多い。しかし，
熱ショックにより生成は誘導されないばかりか，３対２
の割合で減少する。
【００８９】実施例６： ＡＭＩＧ配列およびＳＴＡＢ配列を含むベクターにより
保持される遺伝子の，ウイルス要素によりトランス活性
化およびシス活性かされたウイルス促進因子の管理下で
の発現 ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスからの３９Ｋ初期促進因
子を，ＩＥＩ遺伝子の生成物〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳ
ＵＭＭＥＲＳ，Ｖｉｒｏｌ．，５７：５６３−５７１）
１９８６）〕であるＩＥＩ蛋白質によりトランス活性化
し，ｈｒ２配列〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳＵＭＭＥＲ
Ｓ，Ｖｉｒｏｌ．６０：２１５−２２３（１９８６９〕
によりシス活性化する。本発明者等は，次の通り，上記
促進因子の管理下でＣＡＴ遺伝子の安定的発現をおこな
った。 ─ ３９Ｋ遺伝子を含むＡｃＭＮＰＶからのＰｓｔＩ−
Ｋ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩのサイトに挿入した。こ
うして得られたプラスミドのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片は３９Ｋ促進因子と遺伝子の符号化配列の始めの部
分を含む。この断片をｐＳｅｌｅｃｔ（ＰＲＯＭＥＧ
Ａ）のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に置換挿入した。
一つの特異なＳｔｙＩサイトが，３９ＫのＡＴＧにサイ
ト指定突然変異誘発により発生し，プラスミドｐＳｅｌ
ｅｃｔ３９Ｋが得られた。この生成の過程を図１１ａに
示す。 ─ 更に，ｈｒ２を含むＡｃＭＮＰＶからのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−Ｌ断片をｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿
入して，プラスミドｐｈｒ２を得た。 ─ ｐｈｒ２のＥａｇＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は全ｈｒ
２配列を含む。その両端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼ
で修復し，同じくＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで両端を
修復したｐＩＥ１のＸｂａＩサイトに挿入した。得られ
たプラスミドをｐＩＥ１ｈｒ２と呼ぶ。この生成の過程
を図１１に示す。 ─ プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２をＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＳｔｙＩで切断して，それらの酵素に対応するサイトを
除去し，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで両端を修復後に
再び閉じた。 ─ 突然変異３９Ｋ促進因子およびＳｔｙＩサイトを含
むｐＳｅｌｅｃｔ３９ＫのＳｎａＢＩ−ＳａｃＩ断片を
プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２のＳｎＢＩ−ＳａｃＩ断片に
置換挿入して，プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１を
得た。 ─ Ｂｇ１ＩＩリンカーをｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１の
ＳｔｙＩサイトに挿入した。 ─ ｐＢＬＣＡＴ２〔ＬＵＣＫＯＷおよびＳＣＨＵＴ
Ｚ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５，）１
３‘５９４０）１９８７）〕のＳｃａｃＩ−ＨｐａＩ断
片は，ＳＶ４０ Ｔ抗原遺伝子のポリアデニレーション
（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を含む。この
断片を，ＢｓｐＥＩ端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで
修復したｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１のＢｓｐＥＩ−Ｓａ
ｃＩ断片に置換挿入した。こうして得られたプラスミド
をｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２と呼ぶ。
保持される遺伝子の，ウイルス要素によりトランス活性
化およびシス活性かされたウイルス促進因子の管理下で
の発現 ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスからの３９Ｋ初期促進因
子を，ＩＥＩ遺伝子の生成物〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳ
ＵＭＭＥＲＳ，Ｖｉｒｏｌ．，５７：５６３−５７１）
１９８６）〕であるＩＥＩ蛋白質によりトランス活性化
し，ｈｒ２配列〔ＧＵＡＲＩＮＯおよびＳＵＭＭＥＲ
Ｓ，Ｖｉｒｏｌ．６０：２１５−２２３（１９８６９〕
によりシス活性化する。本発明者等は，次の通り，上記
促進因子の管理下でＣＡＴ遺伝子の安定的発現をおこな
った。 ─ ３９Ｋ遺伝子を含むＡｃＭＮＰＶからのＰｓｔＩ−
Ｋ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩのサイトに挿入した。こ
うして得られたプラスミドのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片は３９Ｋ促進因子と遺伝子の符号化配列の始めの部
分を含む。この断片をｐＳｅｌｅｃｔ（ＰＲＯＭＥＧ
Ａ）のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に置換挿入した。
一つの特異なＳｔｙＩサイトが，３９ＫのＡＴＧにサイ
ト指定突然変異誘発により発生し，プラスミドｐＳｅｌ
ｅｃｔ３９Ｋが得られた。この生成の過程を図１１ａに
示す。 ─ 更に，ｈｒ２を含むＡｃＭＮＰＶからのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−Ｌ断片をｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿
入して，プラスミドｐｈｒ２を得た。 ─ ｐｈｒ２のＥａｇＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は全ｈｒ
２配列を含む。その両端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼ
で修復し，同じくＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで両端を
修復したｐＩＥ１のＸｂａＩサイトに挿入した。得られ
たプラスミドをｐＩＥ１ｈｒ２と呼ぶ。この生成の過程
を図１１に示す。 ─ プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２をＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＳｔｙＩで切断して，それらの酵素に対応するサイトを
除去し，Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで両端を修復後に
再び閉じた。 ─ 突然変異３９Ｋ促進因子およびＳｔｙＩサイトを含
むｐＳｅｌｅｃｔ３９ＫのＳｎａＢＩ−ＳａｃＩ断片を
プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２のＳｎＢＩ−ＳａｃＩ断片に
置換挿入して，プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１を
得た。 ─ Ｂｇ１ＩＩリンカーをｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１の
ＳｔｙＩサイトに挿入した。 ─ ｐＢＬＣＡＴ２〔ＬＵＣＫＯＷおよびＳＣＨＵＴ
Ｚ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５，）１
３‘５９４０）１９８７）〕のＳｃａｃＩ−ＨｐａＩ断
片は，ＳＶ４０ Ｔ抗原遺伝子のポリアデニレーション
（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）配列を含む。この
断片を，ＢｓｐＥＩ端をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで
修復したｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１のＢｓｐＥＩ−Ｓａ
ｃＩ断片に置換挿入した。こうして得られたプラスミド
をｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２と呼ぶ。
【００９０】ＢａｍＨＩサイトをｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ
−２から除去するために，後者を前者で切断し，両端を
Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後に再閉した。
続いて，１０ｂｐのＢａｍＨＩリンカーをプラスミドｐ
ＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２のＳａｃＩサイトに挿入して，
プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−３を得た。
−２から除去するために，後者を前者で切断し，両端を
Ｋｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後に再閉した。
続いて，１０ｂｐのＢａｍＨＩリンカーをプラスミドｐ
ＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２のＳａｃＩサイトに挿入して，
プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−３を得た。
【００９１】プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１，ｐ
ＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２およびｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−
３の生成過程を図１２に概略的に示す。 ─ プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−３のＰａｃＩ−
ＸｂａＩ断片はＩＥ１のポリアデニレーション配列およ
びＡＭＩＧ配列を含む。Ｂｓｕ３６ＩおよびＰａｃＩ端
をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後，よの断片
を，ＣＭＶウイルスのチミジン・キナーゼ遺伝子を含む
ｐＢＫＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）から得られたＢ
ｓｕ３６１−ＡｖｒＩＩ断片と置換した。得られたプラ
スミドをｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−４と呼ぶ。 ─ ｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ
断片を，ｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−４のＢａｍＨＩ−Ｋｐ
ｎＩ断片に置換挿入して，３９Ｋ促進因子の管理下で外
来遺伝子を特異なＢｇ１ＩＩサイトに挿入可能な発現プ
ラスミドｐＣ２Ｂｇ１ＩＩを得た。ベクターｐｃ２ Ｂ
ｇ１ＩＩの生成過程を図１３に示し，またこのベクター
ｐＣ２Ｂｇ１ＩＩの詳細マップを図１５ａに示す。 ─ ＣＡＴ遺伝子を含むｐＢＬＣＡＴ２のＸｍａＩ−Ｂ
ｇ１ＩＩ断片を，ｐＣ２Ｂｇ１ＩＩのＸｍａＩ−Ｂｇ１
ＩＩ断片に置換挿入して，プラスミドｐＣ２ＣＡＴを得
た。
ＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−２およびｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−
３の生成過程を図１２に概略的に示す。 ─ プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−３のＰａｃＩ−
ＸｂａＩ断片はＩＥ１のポリアデニレーション配列およ
びＡＭＩＧ配列を含む。Ｂｓｕ３６ＩおよびＰａｃＩ端
をＫｌｅｎｏｗのポリメラーゼで修復した後，よの断片
を，ＣＭＶウイルスのチミジン・キナーゼ遺伝子を含む
ｐＢＫＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）から得られたＢ
ｓｕ３６１−ＡｖｒＩＩ断片と置換した。得られたプラ
スミドをｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−４と呼ぶ。 ─ ｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ
断片を，ｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−４のＢａｍＨＩ−Ｋｐ
ｎＩ断片に置換挿入して，３９Ｋ促進因子の管理下で外
来遺伝子を特異なＢｇ１ＩＩサイトに挿入可能な発現プ
ラスミドｐＣ２Ｂｇ１ＩＩを得た。ベクターｐｃ２ Ｂ
ｇ１ＩＩの生成過程を図１３に示し，またこのベクター
ｐＣ２Ｂｇ１ＩＩの詳細マップを図１５ａに示す。 ─ ＣＡＴ遺伝子を含むｐＢＬＣＡＴ２のＸｍａＩ−Ｂ
ｇ１ＩＩ断片を，ｐＣ２Ｂｇ１ＩＩのＸｍａＩ−Ｂｇ１
ＩＩ断片に置換挿入して，プラスミドｐＣ２ＣＡＴを得
た。
【００９２】ｐＣ２ＣＡＴは次の遺伝子の発現を許容す
る。 ─ ＩＥＯ促進因子（ｐｏｌｙＡ配列：ＩＥ１）の管理
下においてＮｅｏＲ− ＩＥＩ促進因子（ｐｏｌｙＡ配
列：ＣＭＶ ＴＫ）の管理下においてＩＥ１ − ＩＥ１によりトランス活性化されｈｒ２（ｐｏｌｙ
Ａ配列：ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ）の管理下においてＣＡＴ
る。 ─ ＩＥＯ促進因子（ｐｏｌｙＡ配列：ＩＥ１）の管理
下においてＮｅｏＲ− ＩＥＩ促進因子（ｐｏｌｙＡ配
列：ＣＭＶ ＴＫ）の管理下においてＩＥ１ − ＩＥ１によりトランス活性化されｈｒ２（ｐｏｌｙ
Ａ配列：ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ）の管理下においてＣＡＴ
【００９３】ＳＴＡＢ配列はＩＥ１の上流に存在し，Ａ
ＭＩＧ配列はＮｅｏＲの下流に存在する。このように，
これらの配列は発現ベクターの符号化配列の側方に位置
する。Ｓｆ９細胞を，プラスミドｐＣ２ＣＡＴおよび実
施例１において述べた１ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８に
て選択した耐性細胞により形質転換した。
ＭＩＧ配列はＮｅｏＲの下流に存在する。このように，
これらの配列は発現ベクターの符号化配列の側方に位置
する。Ｓｆ９細胞を，プラスミドｐＣ２ＣＡＴおよび実
施例１において述べた１ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８に
て選択した耐性細胞により形質転換した。
【００９４】１０世代後，上記細胞のＤＮＡをアルカリ
溶解法により抽出して，サザン法により分析した。この
場合にも，遺伝情報はプラスミドｐＣ２ＣＡＴを多数直
列に複製したものから成る高分子エピソーム形態で存在
する。ＥＬＩＳＡ分析法で測定した，ＣＡＴの生成量
は，１．６ｎｇ／全蛋白質ｍｇである。
溶解法により抽出して，サザン法により分析した。この
場合にも，遺伝情報はプラスミドｐＣ２ＣＡＴを多数直
列に複製したものから成る高分子エピソーム形態で存在
する。ＥＬＩＳＡ分析法で測定した，ＣＡＴの生成量
は，１．６ｎｇ／全蛋白質ｍｇである。
【００９５】ベクターｐＣ２ＣＡＴを図１４に，またそ
の詳細を図１５ｂに示す。
の詳細を図１５ｂに示す。
【図１】ＡｃＮＰＶバキュロウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ
断片のマップを示す図である。
断片のマップを示す図である。
【図２】プラスミドｐＩＥ１（図２Ａ）およびプラスミ
ドｐＩＥ１ ＮｅｏＲの挿入片ＩＥ１ ＮｅｏＲ（図２
Ｂ）を示す図である。
ドｐＩＥ１ ＮｅｏＲの挿入片ＩＥ１ ＮｅｏＲ（図２
Ｂ）を示す図である。
【図３】実施例１におけるＳｆ９細胞の電気泳動分析を
説明する図である。
説明する図である。
【図４】ＡＭＩＧ断片の配列を示す図である。
【図５】ＳＴＡＢ断片の配列を示す図である。
【図６】プラスミドｐＩＥＯＮｅｏＲＡＭＩＧを示す図
である。
である。
【図７】プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲＩＥＮＣＡＴを示
す図である。
す図である。
【図８】実施例４におけるＳｆ９細胞の電気泳動分析を
説明する図である。
説明する図である。
【図９】プラスミドｐＩＥ１ＮｅｏＲｈｓｐＣＡＴを示
す図である。
す図である。
【図１０】実施例５におけるＳｆ９細胞のＥＬＩＳＡ分
析結果を説明する図である。
析結果を説明する図である。
【図１１】プラスミドｐＳｅｌｅｃｔ３９Ｋ（ａ）およ
びプラスミドｐＩＥ１ｈｒ２（ｂ）の生成過程を説明す
る図である。
びプラスミドｐＩＥ１ｈｒ２（ｂ）の生成過程を説明す
る図である。
【図１２】プラスミドｐＩＥ１ｈｒ２３９Ｋ−１，ｐＩ
Ｅ１ｈｒ２３９Ｋ−２およびｐＩＥ１ｈｒ３９Ｋ−３の
生成過程を説明する図である。
Ｅ１ｈｒ２３９Ｋ−２およびｐＩＥ１ｈｒ３９Ｋ−３の
生成過程を説明する図である。
【図１３】プラスミドｐＣ２Ｂｇ１ＩＩの生成過程を説
明する図である。
明する図である。
【図１４】プラスミドｐＣ２ＣＡＴのマップを示す図で
ある。
ある。
【図１５】プラスミドｐＣ２Ｂｇ１ＩＩのマップを示す
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 594131887 サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェ ルシュ・シアンティフィク−シーエヌアー ルエス ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴ ＩＦＩＱＵＥ−ＣＮＲＳ フランス国 75794 パリ・セデックス 16リュ・ミシェル・アンジュ ３ (72)発明者 ジェラール・ドゥヴォシェル フランス国 30380 サン・クリストル− レ−ザレス シュマン・ドゥ・レスペルヴ ェット 137 (72)発明者 マルティーヌ・セリュッティ フランス国 30380 サン・クリストル− レ−ザレス ルート・ドゥ・モンテーズ 2997 (72)発明者 セシル・ペルション フランス国 30100 アレス リュ・ド ゥ・ブレジス 11
Claims (8)
- 【請求項１】 添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
として示す配列を含むＤＮＡ断片を使用して，動物細胞
内において自己複製可能で，且つエピソームの形態にお
いて該細胞の後代に保存され得るベクターを生産する方
法。 - 【請求項２】 前記配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む
ＤＮＡ断片を，添付配列表２にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
として示す配列を含むＤＮＡ断片と組み合わせて使用す
ることを特徴とする請求項１に記載のベクターの生産方
法。 - 【請求項３】 動物細胞内において繁殖可能で，該細胞
の後代に保存され得るベクターであって，添付配列表１
にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示す配列を含む単位ベ
クターのコンカテマーから成るエピソームの形態として
存在することを特徴とするベクター。 - 【請求項４】 前記単位ベクターが，更に，添付配列表
２にＳＥＱ ＩＤＮＯ：２として示す配列を含むことを
特徴とする請求項３に記載のベクター。 - 【請求項５】 異種由来の染色体外遺伝情報を後代に伝
え得る動物細胞系の生産方法であって，前記遺伝情報を
有し且つ添付配列表１にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として
示す配列を含む少なくとも一つの単位ベクターを含むＤ
ＮＡ標本，若しくは前記単位ベクターのコンカテマーか
ら成る少なくとも一つのエピソームを含むＤＮＡ標本に
より，動物細胞に形質移入する工程と，前記動物細胞を
増殖して，前記単位ベクターのコンカテマーから成る少
なくとも一つのエピソームを持つ前記細胞の後代を選択
する工程と，を含むことを特徴とする動物細胞系の生産
方法。 - 【請求項６】 前記単位ベクターが，更に，添付配列表
２にＳＥＱ ＩＤＮＯ：２として示す配列を含むことを
特徴とする請求項５に記載の生産方法。 - 【請求項７】 異種由来の遺伝情報を発現し得る安定な
細胞系であって，該細胞系の各細胞が，請求項３または
４に記載の少なくとも一つのエピソームベクターを含む
ことを特徴とする細胞系。 - 【請求項８】 細胞系が，昆虫，特に鱗翅類の細胞系で
あることを特徴とする請求項７に記載の細胞系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9309156A FR2708284B1 (fr) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | Séquences nucléotidiques permettant la réplication et le maintien d'une information génétique dans les cellules animales. |
| FR9309156 | 1993-07-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203985A true JPH07203985A (ja) | 1995-08-08 |
Family
ID=9449618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6174579A Pending JPH07203985A (ja) | 1993-07-26 | 1994-07-26 | 動物細胞内の遺伝情報の複製および保持の可能なヌクレオチド配列 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5597689A (ja) |
| EP (1) | EP0638647A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07203985A (ja) |
| AU (1) | AU682189B2 (ja) |
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| FR (1) | FR2708284B1 (ja) |
| HU (1) | HUT68186A (ja) |
| IL (1) | IL110451A0 (ja) |
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Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| GB0123098D0 (en) * | 2001-09-26 | 2001-11-14 | Lonza Biologics Plc | Use of aminoglycoside resistance gene |
| BR112015027611A2 (pt) | 2013-01-28 | 2022-03-03 | Univ Kansas State | Molécula de ácido nucleico isolada; célula hospedeira; vetor; proteína ou polipeptídeo isolado; imunorreagente específico de vírus da febre do vale do rift (rvfv); uso de uma composição; uso de uma composição para o diagnóstico de febre do vale do rift (rvf) em um indivíduo; e kit |
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|---|---|---|---|---|
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| DE4133038A1 (de) * | 1991-10-07 | 1993-04-08 | Genentech Inc | Neue recombinante viren, deren verwendung und deren herstellung |
-
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-
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- 1994-07-26 NZ NZ264095A patent/NZ264095A/en unknown
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| US5597689A (en) | 1997-01-28 |
| HU9402185D0 (en) | 1994-09-28 |
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| NZ264095A (en) | 1995-02-24 |
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