HUT68186A - Nucleotide sequences making replication and maintenance of genetic information possible in animal cells - Google Patents

Nucleotide sequences making replication and maintenance of genetic information possible in animal cells Download PDF

Info

Publication number
HUT68186A
HUT68186A HU9402185A HU9402185A HUT68186A HU T68186 A HUT68186 A HU T68186A HU 9402185 A HU9402185 A HU 9402185A HU 9402185 A HU9402185 A HU 9402185A HU T68186 A HUT68186 A HU T68186A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
cells
sequence
cell
dna
Prior art date
Application number
HU9402185A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402185D0 (en
Inventor
Gerard Devauchelle
Martine Cerutti
Cecile Persillon
Original Assignee
Centre Nat Rech Scient
Agronomique Inst Nat Rech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Nat Rech Scient, Agronomique Inst Nat Rech filed Critical Centre Nat Rech Scient
Publication of HU9402185D0 publication Critical patent/HU9402185D0/hu
Publication of HUT68186A publication Critical patent/HUT68186A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/75—Vector systems having a special element relevant for transcription from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány targya genetikai információ replikacióját és fenntartását állati sejtekben. különösen rovarsejtekben lehetővé tevő vektorok.
Az eukarióta sejtek, és különösen az állati sejtek klónozott, idegen eredetű gének expresszálásához való alkalmazása számos kutatás tárgyat képezi. Valójában csak az eukarióta sejtek képesek megvalósítani a poszt-transzlációs módosításokat, amelyek számos esetben szükségesek az aktív protein kialakulásához. Jelenleg — könnyű alkalmazhatóságuk miatt — az élesztők képezik a legszélesebb körben használt eukarióta expressziós rendszereket, miközben az élesztők glikozilálási rendszere, amely némileg eltér az állati sejtekétől, bizonyos proteinek esetében nem teszi lehetővé az aktív forma kialakulását.
Egy gén állati sejtben való expressziójához általában vírus eredetű vektorokat alkalmaznak. Ezek közül megemlíthetők a baculovírusok, melyeket jelenleg is számos laboratóriumban használnak. Ezen vírusok több előnye ismert·, hosszú DNSszegmensek inszercióját teszik lehetővé, s ráadásul számos olyan nagyhatású promoterrel rendelkeznek, amelyek a vírus replikációs ciklusának különböző stádiumaiban aktívak. Ezek a promoterek a szabályozásuk alá került gének nagyon magas szintű expressziójának indukálására képesek. Két kései promotert, a polihedrin és a P10 protein promotert különösen gyakran használják idegen eredetű gének expresszálásához.
• ·»» • 4 · « · · ·
- 3 Ezek a baculovlrus eredetű expressziós vektorok azonban rendelkeznek bizonyos hátrányos tulajdonságokkal, amelyek korlátozzák alkalmazhatóságukat. Elsőként, ezen vektorok valamelyikébe inszertált idegen eredetű gén csak a vírusfertőzés körzetében expresszálódik, a vírusfertőzés pedig a sejtek gyors lízisét eredményezi, ami azt jelenti, hogy a gén sejtekben történő expresszálódása csak tranziens (átmeneti) lehet, s hogy a sejtek által termelt proteinek gyorsan lebomlanak. Ráadásul, ha az idegen eredetű gént kései promoter szabályozása alá helyezzük, az csak a vírus replikációs ciklusának végén expresszálódik, abban a stádiumban, amikor a celluláris funkciók, s különösen a poszt-transzlaciós módosításokat (például a glikozilálást) létrehozó működések már megváltoztak.
Néhány kutatócsoport ezeket a problémákat úgy próbálta megoldani, hogy az expresszálni kívánt idegen eredetű gént nem kései, hanem korai promoter szabályozása alá helyezték. A korai promoterek irányítása alá helyezett gének a vírusfertőzés kezdetétől igen magas szinten expresszálódnak. Ezen promoterek némelyikét, például az AcNPV baculovírus (Aut-ographa californica sejtmag polihedrózis vírus) IE1 (Guarino és Summers, J. Virol., 6.1:7, 2091-2099, 1987), IE0 és IEN génjeinek promotereit — a polihedrin vagy a P10 promoterekkel ellentétben — a sejt RNS polimeráz II enzimje felismeri. Az e promoterek szabályozása alá helyezett gének expressziója ilyenformán nem függ a vírusfertőzéstől, s emiatt javasolták az IE1 és IEN promoterek alkalmazását a • · ·
korai idegen eredetű gének expresszi ójához.
Expressziós vektorok kialakításához javasolták az IE1 proteint kódoló szekvencia másik korai baculovírus gén promoterrel, például a 39K promoterrel (az IE1 gén által kódolt protein egyéb korai baculovírus gének, különösen a 39K gén expressziójának transz-aktiváló faktora), és tetszés szerint enhancer szekvenciákkal (hrl, hr2, hr3, hr4 és hr5) (Guarino és mtsi, J. Virol., 6LQ:1, 224-229, 1986) való együttes alkalmazását (PCT/WO 92/05265 számú szabadalmi bejelentés; bejelentő: The Texas A & M University System; feltalálók: Guarino és dervis).
A kitűzött cél mindkét esetben az volt, hogy olyan vektorokat hozzanak létre, amelyek oly módon integrálhatók a celluláris genomba, hogy baculovírus korai promoter irányítása alatt tartósan expresszáljanak egy idegen eredetű gént. Az ilyen vektorok alkalmazása azonban egyéb problémákat vet fel. Valójában, sem a celluláris genomba történő integrálás helye, sem stabilitása nem kontrollálható, pedig ezen két paraméter nagymértékben meghatározza az integrált gén expresszióját.
Az idegen eredetű gén állati sejtben való expresszálása által felvetett problémák egy másik vonatkozását olyan expressziős vektor de nova kialakításának kísérlete jelenti, amely, egyrészt autonóm replikációra képes, másrészt fenntartható a sejtben, és átjuttatható annak utódába. Ez
azt jelenti. hogy ennek a vektornak legalább egy olyan szekvenciát kell tartalmaznia, amely biztosítja a sejtben aktív replikációs kedöpont működését, továbbá tartalmaznia kell olyan szekvenciákat, amelyek biztosítják fennmaradását a sejtben, illetve a sejtosztódás során a leánysejtekben való szegregálódását.
Az extrakromoszómális kezdőpontként aktív szekvenciák élesztőkben régóta ismertek; ezeket. a DNS darabokban jelenlevő szekvenciákat ARS-eknek (autonóm módon replikálódó szekvenciák·) hívják. Az ARS elemek két konszenzus szekvenciával rendelkeznek: az egyik az ún. mag (core) szekvencia (A dómén), amely szükséges az ARS működéséhez (Kearsey, Cell, 37, 299-307, 1984), de önmagában nem elégséges az autonóm replikáció elősegítéséhez, és további szegélyező szekvenciák jelenlétét igényli; a másik a mag (core) szekvencia T (timin) nukleotidokban gazdag szálának 3' végétől 3' irányban (downstream) elhelyezkedő 3' konszenzus szekvencia (C dómén).
Bár állati sejtekben leírtak az ARS elemek konszenzus szekvenciáihoz hasonló szekvenciákat, ezek az állati sejtekben történő DNS-replikációban mutatott szerepét sosem sikerült megállapítani. Több vizsgálatot végeztek azzal a céllal, hogy állati sejtekben, különösen emlős sejtekben replikációs kezdőpontként (origó) aktív szekvenciákat azonosítsanak (Krysan és mtsi.. Mól. Cell. Bioi., 9, 1026-1033, 1989; Holst és mtsi, Cell, 52, 355-365, 1988;
illetve (Jmek és mtsi, Biochim. and Biophys. Acta, 1QQ2,
1-14, 1989). A legtöbb esetben azonban ezek a vizsgálatok
nem eredményezték az extrakromoszómális genetikai információ
replikációját és fenntartását lehetővé tevő szekvenciák
előállítását.
Rovarsejtek esetében az egyetlen azonosított replikációs kezdőpont a Drosophila melanogaster mitokondriális DNS replikációs kezdőpontja (Sugino, Biochem. Biophys. Rés. Commun., Q.1, 1321-1329, 1979). Bár az ARS szekvenciákat a drosophila genomban is lokalizálták (Gragerov és mtsi, Nucl. Acids Rés., 1_6, 1169-1180, 1988), replikációs kezdőpontként való lehetséges működésűket nem mutatták ki. A rovarvírusokkal kapcsolatban, az AcNMPV baculovirus genom legalább két régiójában jelenlevő szekvenciákat írtak le. amelyek az élesztősejtekbe juttatva az ARS elemekhez hasonló módon viselkednek (Hooft van Hiddekinge és mtsi, Arch. Virol., 83, 279-284, 1986). Az utóbbi időben egv másik vírus, a Christoneura fumiferana NPV baculovirus genomjában négy, ARS elemeket tartalmazó, a S. cerevisiae-ben működőképes fragmenst írtak le (Lee és mtsi. Vírus Research, 24, 249-264, 1992). Ezen fragmensek egyikének (amely a legnagyobb ARS-aktivitással rendelkezett) szekvenciaanalízisével egy A+T-ben gazdag régiót mutattak ki, amely kapcsolatban áll egy felcsavarodott DNS-régióval. Annak ellenére, hogy az élesztő ARS elemek konszenzus mag (core) szekvenciájának egy szekvencia sem felel meg pontosan, az említett szekvenciák 13 olyan régióját mutatták ki, amelyek ···
- 7 hasonlóak az ARS elemek régióihoz (11 bázispárból 9 vagy 10 azonos), arra vonatkozóan azonban nincs semmiféle utalás, hogy ezek a szekvenciák az élesztőseiteken kívül más eukarióta sejtekben is működőképesek lennének. E szekvenciákról általában nem feltételezik, hogy részt vennének a vírus replikációjában, annál is inkább, mivel az utóbbi időben kimutatták, hogy az AcNPV baculovírusban a DNS replikációs kezdőpontjai a hr elnevezésű repetitív (ismétlődő) szekvenciákban helyezkednek el, amelyek mindegyike több, egymáshoz nagyon hasonló, hiányos palindrom szekvenciát tartalmaz (Pearson és mtsi, Science, 252, 1382-1384, 1992). Ezek az AcNPV genomban hat régióra szétosztva jelenlevő szekvenciák korábban expressziót fokozó tulajdonságaikról voltak ismertek (vö. Guarino és mtsi, 1986, ld. fentebb). A hr szekvenciák deléciós analízisével lehetőség nyílt annak bizonyítására, hogy egy teljes palindrómát tartalmazó szekvencia lehetővé teszi a replikációt. Más szerzők a detektív (szaporodásra képtelen) vírusok DNS-ében jelenlevő, és a fertőzött sejtekben az AcNPV replikációs kezdőpontjaként szolgáló szekvenciák detektálását és funkcionális analízisét írták le (Kool és mtsi, Virology, 192. 94-101, 1993). A vírus replikációjához kapcsolódó aktivitás lényegében a sokszorosan ismétlődő hr5 DNS-t tartalmazó, 1000 bázispár hosszúságú régión lokalizálható.
Munkánk során a Lepidoptera sejtekben autonóm replikációra képes stabil vektorok előállítása céljából elsőként az
említett sejtekben aktív replikációs kezdőpont keresését kezdtük meg.
Ennek érdekében szabályozása alá az IE1 AcNPV baculovírus gén promoterének helyezett neomicin-rezisztencia riporter gént tartalmazó plazmidot (a továbbiakban PIElNeoR) állítottunk elő, abból a célból, hogy genom DNS könyvtár előállításához és screeneléséhez
Spodoptera frugiperda sejteket (Sf9) használva rovarsejtekben aktív replikációs kezdőpontot tartalmazó celluláris
DNS-szekvenciákat keressünk.
Munkánk során, meglepő módon, azt tapasztaltuk, hogy a PIElNeoR plazmid celluláris eredetű DNS inszertek hiányában képes volt a sejtekben önállóan replikálódni, és ezenfelül, a replikációt a tenyésztés során néhány passzálás végén az eredetileg transzformált sejtek utódaiban a plazmid genetikai anyag gyarapodása és nagy molekulatömegű, extrakromoszomális szerkezetű alakká történő szerveződése kísérte.
Munkánk során kerestük a fenti tulajdonságokért felelős plazmid-régiókat, s azt találtuk, hogy ezek az IE1 gén IE1 protein C-terminálisát kódoló részletét, valamint a 3' szegélyező régiót átfedő DNS-szekvencia jelenlétével állnak kapcsolatban. Ezt a szekvenciát, melyet a következőkben AMÍG szekvencia-ként (Enhancement and Maintenance of Genetic Information; a genetikai információ • · • · · gyarapítása és fenntartása) is említünk, a szekvencialistában az 1. számú szekvenciaként tüntettük fel.
Az AMÍG szekvencia említett tulajdonságokért felelős struktúráinak lokalizálása céljából végzett analízisével számos, az élesztő ARS szekvenciáival rokon szekvenciát azonosítottunk, köztük egy 11 bázispárból álló MCCS szekvenciát, amely homológ az ARS elemek A doménjének konszenzus szekvenciájával. Az élesztő és emlős sejtek konszenzus centromer szekvenciáihoz közel álló szekvenciákat is lokalizáltunk.
A fentieken kívül azonosítottunk egy olyan szekvenciát is, amely az IE1 gén promoterétől 5' irányban (upstream) helyezkedik el, s azt tapasztaltuk, hogy ez a szekvencia működésével biztosítja a nagy molekulatömegű extrakromoszomalis szerkezet stabilitását. Ezt a szekvenciát, amelyet a következőkben STÁB szekvencia-ként, említünk, a szekvencialistában a 2. azonosítási számú szekvenciaként tüntettük fel.
Különböző, az AMÍG és STÁB szekvenciákat különféle promoterekkel együtt tartalmazó plazmidokat állítottunk elő, melyek mindegyike rendelkezik a fentebb említett tulajdonságokkal; nevezetesen: képesek a transzformált sejtekben való replikacióra, s ezenfelül, fenntarthatok a transzformált sejtek utódaiban, s képesek nagyon nagy molakulatömegű episzómák alakjában szerveződni. A •·· ··* ···» ··* talalmanyban az episzóma'- kifejezésen extrakromoszómái is és ön-replikációra képes DNS molekulát értünk.
A találmány tárgya a szekvencialistában 1. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát tartalmazó DNS fragmens alkalmazása állati sejtben önálló replikálócióra képes, és az említett sejt utódaiban episzóma alakjában fenntartható vektor előállításában.
A találmány előnyben részesített megvalósítási módjában az 1. számú szekvencia DNS-fragmensét a szekvencialistában 2. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát tartalmazó DNSfragmenssel együtt alkalmazzuk.
A találmány további tárgya állati sejtben sokszorosítható, s az említett sejt utódaiban fenntartható vektor, amely egységvektor konkatameréből álló episzóma alakjában van jelen, melyben az egységvektor az 1. számú szekvenciát tartalmazza.
A találmány előnyben részesített megvalósítási módjában az említett egységvektor tartalmazza még a 2. számú szekvenciát is.
A találmányt illetően a konkatamer kifejezésen olyan DNS molekulát értünk, amely az egységvektor által hordozott genetikai információ legalább két példányából áll. Az egységvektor az 1. számú, és előnyösen a 2. számú
szekvencián kívül tartalmazhat még legalább egy olyan DNS-fragmenst, amelynek jelenléte szükséges a vektor állati sejtben való sokszorosításához, illetve az említett sejt utódaiban való fenntartásához. Ez a DNS-fragmens proteinek termeléséhez szükséges információkat hordozó vagy szelektálható markert képező, és hasonló DNS-fragmens lehet.
A találmány további tárgya eljárás olyan állati sejtvonalak előállítására, amelyek képesek az idegen eredetű extrakromoszomális genetikai információt utódaikba átvinni. Az eljárás során első lépésként az állati sejtet az említett genetikai információt hordozó, s a szekvencialistában 1. azonosítási számmal jelzett szekvenciát tartalmazó legalább egy egységvektorból álló DNS-készítménnyel, vagy legalább egy, az említett egységvektor konkatameréből álló episzómát tartalmazó DNS-készítménnyel transzfektáljuk, majd második lépésként az említett állati sejtet szaporítjuk, s kiválasztjuk az említett sejt azon utódait, amelyek legalább egy, az említett egységvektor konkatamerét tartalmazó episzómát hordoznak.
A találmány szerinti fent említett eljárás előnyben részesített megvalósítási módjában az egységvektor tartalmazza még a szekvencialistában 2. azonosítási számmal jelzett szekvenciát is.
A találmány szerinti episzomális vektorok a fent leírt eljárás után szelektált sejtek DNS-ének kivonásával • · • ff • ••ff
- 12 állíthatók elő.
A találmány szerinti állati sejtvonalak és episzómális vektorok előállítási eljárásának megvalósítását lehetővé tevő egységvektor kialakításához az 1. számú szekvenciát, és előnyösen, a 2. ezámú szekvenciát, továbbá bármely egyéb szekvenciát, amelynek állati sejtben való sokszorosítása és az említett sejtben való fenntartása kívánatos, megfelelő gazdavektorba ligáljuk. Az említett egységvektor előállítását lehetővé tevő eljárások általánosan használt gazdavektorokat (mint amelyeket Sambrook és mtsi, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, második kiadás; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] írtak le) felhasználó, hagyományos génsebészeti eljárások.
A találmány további tárgya idegen eredetű genetikai információ expresszálására képes folyamatos sejtvonalak, amelyek minden egyes sejtje legalább egy, találmány szerinti episzómális vektort tartalmaz.
A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási módjában az említett sejtvonalak rovar-, elsősorban Lepidoptera sejtvonalak.
A találmány lehetővé teszi olyan expressziós rendszer kialakítását, amely állati sejtekben állandó szinten biztosítja az idegen eredetű genetikai információ expresszálását. Ez a rendszer különösen rekombináns • ·
- 1.3 proteinek termeléséhez alkalmazható, mivel folyamatos termelésüket teszi lehetővé, s a szóban forgó protein magas szintű expresszálását biztosítja, anélkül, hogy az azt kódoló gén celluláris genomba integrálódna, s így kiküszöbölhetők az ilyen integrációhoz kapcsolódó bizonytalanságok.
A találmány az alábbi, az AMÍG szekvenciákat tartalmazó vektorok előállítására és alkalmazására vonatkozó példák leírásának segítségével lesz jobban érthető.
Magától értetődik, hogy ezeket a példákat a találmány tárgyának jellemzéseként, és semmiképpen nem korlátozásaként írjuk le.
A példákban a hivatkozásul említett általános molekuláris biológiai technikákat Sambrook és mtsi (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, második kiadás; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) írták le.
1. példa:
AMÍG és
STÁB 8zekvenciáJs.at tartalmazó plazmid előállítása;
ezen plazmid rovarsej tekben történő replikációja és nagyon nagy molekulatömegű episzómák kialakítása
Az IE1 gén és promotere az AcNPV baculovírus
HindiII-G fragmensének
Clal-Xbal szubfragmensében (265Θ bp) helyezkedik el (ld. 1.
ábra). A Clal-Xbal szubfragmenst kivágtuk, majd a pUC18 plazmidba (az Accl-Xbal fragmens helyére) inszertáltuk, így a pIEl plazmidot kaptuk (ld.
2/A ábra; a bázisok számozása az IE1
ATG kodonj ának adeninjén (A) kezdődik).
A neomicih-rezisztencia gént (NeoR) az IE1 proteint kódoló gén promoterétől 3' (downstream) irányban az alábbi módon inszertáltuk a pIEl plazmidba. A pNeo plazmid (Pharmacia)
BglII-Smal fragmensét a pIEl plazmid HincII-AccI fragmensének helyére inszertáltuk. A pIEl plazmid végeit és a NeoR gént hordozó fragmens BglII végét az összekapcsolás előtt
Klenow-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk. Az így kapott plazmidot pIElNeoR-nek nevezzük; az IElNeoR inszertet a 2/B ábrán sematikusan ábrázoljuk (a bázisok számozása a
NeoR ATG tripletének adeninjén (A) kezdődik).
A pIElNeoR plazmidot az E.
coli DHSalfa
F'IQ törzs (Gibco-BRL) transzformálásához használtuk, s ampicillinrezisztenciájuk alapján szelektált rekombináns baktériumokból CsCl gradienssel tisztítottuk.
• ♦ ♦ ·
A
A pIElNeoR plazmidot az alábbi eljárás szerint lipofekcióval Spodoptera frugiperda sejtekbe (Sf9 klón) vittük.
Kétmillió sejtet 25 cm2 alapterületű palackban 10 V/V %-os magzati borjúszérummal kiegészített TC100 tápközegbe (GIBCO) helyeztünk. Szobahőmérsékleten egy óra elteltével a sejtek a palack aljához tapadtak. A tápközeget eltávolítottuk, s az előbbi tápközeg — 40 pl DOTAP-pal (Boehringer) és 10 pg pIElNeoR plazmiddal kiegészített — 3 ml-ével helyettesítettük. 28 “C-on négy órán keresztül végzett inkubálás után a tápközeget az első tápközeg (TC100 + 10 % FCS) 1 mg/ml G418-at (GIBCO-BRL) tartalmazó 4 ml-ével helyettesítettük. Ez utóbbi tápközegben végzett tenyésztés több szakasza után a sejteket 140 mm átmérőjű petricsészékben (csészénként kb. 100 sejt mennyiségben) 3 % metil-cellulóz 3000-5000-et (PROLABO) és 1 mg/ml G418-at tartalmazó fenti tápközegben klónoztuk. A G418-rezisztens telepeket szelektáltuk.
A pIElNeoR genetikai információt hordozó struktúrájának karakterizálása céljából a G418-rezisztens sejtek teljes DNS-ét az alábbiak szerint pulsed-field (pulzáló erőterú) elektroforézissel vizsgáltuk. Kétmillió sejtet összegyűjtöttünk, ezeket PBS-ben kétszer mostuk, s 1 %-os agarózba helyeztük. A 4 °C-on történő polimerizáció után az agaróz darabokat 50 °C-on 16 órán keresztül ötszörös térfogatú lízis pufferben (10 mM Tris-HCl, pH - 8; 100 mM EDTA, 1 % N-lauril-szarkozin; 200 pg/ml proteináz-K) • « • « · · • · · ·· • · · · · áztattuk.
Tris-HCl, óráig 37
Az agaróz darabokat kétszer TE pufferben (10 mM pH = 7,5; 1 mM EDTA) öblítettük, majd kétszer két °C-on PMSF oldatban (TE pufferben 0,5 mM PMSF) inkubáltuk, majd háromszor ismételten TE pufferben öblítettük. Az agaróz darabokat ezután 4 °C-on 16 órán keresztül a kiválasztott restrikciós enzim pufferében ekvilibráltuk, majd egy éjszakán keresztül a restrikciós enzim 50 egységével emésztettük. Az így kezelt agaróz darabokat közvetlenül 1 %-os agaróz gélre töltöttük (SEAKEM GTG), s az elektroforézist. 0,5 x TBE futtató pufferben (45 mM Tris, 32 mM bórsav, 1,25 mM EDTA; pH - 8,3) végeztük.
A transzformálatlan kontroll Sf9 sejtekkel is hasonló vizsgálatot végeztünk.
A 3. ábrát az Sf9 DNS pulsed-field elektroforézis géljeinek a pIElNeoR plazmid random priming jelölésével nyert 32Ppróbával (pIElNeoR próba) (a random priming jelöléshez Boehringer Mannheim kit-et alkalmaztunk) végzett hibridizáció után kapott Southern-lenyomatok alapján készítettük.
3/A ábra: a DNS-t BglII enzimmel emésztettük, az elektroforézist 0,5 x TBE pufferben, 1 %-os agaróz gélen, 18 órás futtatással, 5 másodperces pulzálással, 200 V feszültséggel végeztük. M = molekulatömeg marker (bázispárban kifejezve). Az 1. oszlopban a transzfektálatlan Sf9 sejtekkel (kontroll), míg a 2. oszlopban a pIElNeoR plazmiddal transzfektált Sf9 sejtekkel kapott eredmények láthatók 3/B ábra: az elektroforézist TBE pufferben, 1 %-os agaróz gélen 4 órás futtatással, 5 másodperces pulzalással, 200 V feszültséggel végeztük. M = molekulatömeg marker (bázispárban kifejezve). A 1. oszlopban a pIElNeoR plazmiddal transzfektált Sf9 sejtek emésztetlen DNS-e, a 2. oszlopban pedig a pIElNeoR plazmiddal transzfektált Sf9 sejtek Ncol enzimmel emésztett DNS-e látható.
Az emésztetlen DNS-ben, illetve a pIElNeoR plazmidban hasítási hellyel nem rendelkező enzimmel, pl. BglII-vel emésztett DNS-ben egy nagyon nagy molekulatömegű (kb. 300 kb) formát mutattunk ki. Az emésztetlen DNS esetében a molekulatömeg nagyobb, mint a BglII-vel emésztett DNS esetében; ez azzal magyarázható, hogy az episzóma mozgását a gélen gátolja a nagyon nagy molekulatömegű kromoszómális DNS.
Ha a DNS készítményt a pIElNeoR plazmid szekvenciájában egyetlen hasítási hellyel rendelkező enzimmel, például Ncol-gyel emésztjük, a pIElNeoR plazmid eredeti méretének megfelelő egyetlen fragmenst kapunk.
A pEIlneoR próbával hibridizációs jelet mutató sávot (a B gélen a 2. oszlopban; 3. ábra) kivágtuk, a DNS-t kivontuk a gélből, és elektronmikroszkópos vizsgálathoz készítettük • · • · · · · · · · · ···· ···· · • ·*· · · ·· · ♦ · ·
- 18 elő. Szamos cirkuláris DNS molekulát észleltünk, melyek hosszát kb. 112 um-nek becsültük, amely kb. 330 kb-nak felel meg.
Ezek az eredmények a pEUNeoR plazmiddal transzformált sejtekben episzóma formában nagy DNS-struktúra jelenlétét jelzik, amely közvetlen tandem módon összekapcsolódó pEUNeoR konkatamerekből áll.
Ez a struktúra lúgos lízis eljárással (Cárról és mtsi, Mól.
Cell. Bioi., 1, 1740-1750, 1987), amely cirkuláris szerkezetű DNS-re specifikus (méretétől függetlenül), nagy hatékonysággal vonható ki a sejtekből. Ezt a kivonást az alábbi eljárás szerint végezzük. ötmillió sejtet 500 yl lízis pufferbe (50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % SDS, pH - 12,45) helyezünk, az elegyet 2 percig vortexezzük, majd 30 °C-on 30 percig inkubáljuk. Ezután 100 μΐ 1 M Tris-HCl-t (pH =7), 55 jjI 5 M NaCl oldatot és 5 ul proteináz-K-t (10 mg/ml) adunk az elegyhez, s 37 °C-on 30 percig inkubáljuk. Lehűtés után fenol/kloroform extrakciót végzük, s a DNS-t etanollal csapjuk ki.
Az Sf9 sejtek pEIlneoR episzóma formájának (melyet a lúgos lízis módszerrel tisztítottunk) 10 ;;g-jával végzett transzfekciójával G418-rezisztens sejtek alakíthatók ki.
Az említett nagyon nagy molekulatömegű episzómális szerkezet a sejtekben a pIElNeoR sokszorozódásával jelenik meg. A
Λ
transzfekció után 25 nappal a pIElNeoR a G418-rezisztens sejtekből kivont, kis molekulatömegű DNS-ben mutatható ki, amelyet Hirt eljárásával (J, Mól. Bioi., 26. 365-369, 1967) (amely lehetővé teszi az alacsony molekulatömegű struktúrákban gazdag DNS készítmények kinyerését) állítottunk elő, majd 1 %-os agaróz gélen végzett elválasztást követően elektronmikroszkópos vizsgálattal 1,6 um-es átlagos hosszúságú, kinyújtott és felcsavarodott cirkuláris DNS molekulákat figyeltünk meg. Ez a méret megfelel a pIElNeoR plazmid feltételezett méretének. Azt is megfigyeltük, hogy a tenyésztés előrehaladtával a pIElNeoR plazmidnak megfelelő jel (IElNeoR-32P próbával végzett hibridizálás) a Hirt-módszerre1 kivont DNS-ben csökken, míg a teljes celluláris DNS-ben nő. Ezzel párhuzamosan azt tapasztaltuk, hogy a sejtekből a Hirt-módszerrel kivont DNSsel transzformált E. coli-ból nyert kiónok száma a transzfekció után eltelt idővel jelentősen csökkent: a transzfekció után 25, 40, illetve 70 nappal kivont DNS-sel 200, 2, illetve 0 kiónt nyertünk.
2. példa: A pIElNeoR tulajdonságaiért felelős DNSszekvenciák karakterizálása: az AMÍG és STÁB szekvenciák lokalizálása
A pIElNeoR plazmidból fragmensek deléciójával plazmidsorozatot készítettünk.
A pIElNeoRáA plazmidot az IE1 3' kódoló szekvenciájában
I elhelyezkedő AflIII hely. és a pUC18 vektor AflIII helye közötti fragmens deléclójával kaptuk.
A pIElNeoRAN, pIElNeoRóB és pIElNeoIUM plazmidokat az IE1 promoter 5' szegélyező régiójának delécióival hoztuk letre.
A pIElNeoRúN plazmidot az IE1 Nhe helye, és a p(JC18 polilinkerének HindlII helye közötti fragmens deléciójával állítottuk elő.
A pIElNeoRziB plazmidot az IE1 BsmI helye, és a p(JC18 polilinkerének PstI helye közötti fragmens deléciójával állítottuk elő.
A pIElNeoRóM plazmidot az IE1 Miül helye, és a pUC18 polilinkerének HindlII helye közötti fragmens deléciójával állítottuk elő.
Miután ellenőriztük, hogy egyik deléció sem befolyásolja az IE1 promoter működését, a delécióval előállított plazmidokat az Sf9 sejtek 1. példában leírt transzfekciójához alkalmaztuk.
A plElNeoRáA kivételével, amely csak néhány G418-rezisztens klón kialakulását tette lehetővé, valamennyi plazmid nagyszámú rezisztens klón termelését segítette elő.
A transzfekció után 100 napig a G418-rezistens sejtekből
Hirt-módszerrel kivont alacsony molekulatömegű DNS-ben valamennyi plazmid kimutatható volt, a pIElNeoRáA-t azonban a többi plazmidnál sokkal kisebb mennyiségben detektáltuk.
A később (a transzfekció után 300 nappal) végrehajtott kísérletekben a Hirt-módszerrel kivont DNS-ben már nem tudtuk kimutatni a plazmidokat.
A G418-rezisztens sejtekből lúgos lízissel kivont DNS — a pIElNeoRáA kivételével — valamennyi tesztelt plazmid esetében nagy inolekulatömegü, extrakromoszomális, cirkuláris struktúrákat tartalmaz.
Ilyenformán, úgy tűnik, a pIElNeoRjA plazmiddal transzfektált sejtek esetében tapasztalt neomicinrezisztencia a pIElNeoR4A plazmid celluláris DNS-be történő random integrálódásának eredménye.
Ha a transzfektált sejtekből származó teljes DNS-t BglII-vel emésztjük, a pIElNeoRAB, pIElNeoRAN, illetve pIElNeoRáM plazmidok esetében a nagy molekulatömegű episzómának megfelelő fő sávon kívül számos további, kisebb intenzitású és nagy elektroforetikus mobilitású sávot észlelünk. Ez azt sugallja, hogy a kromoszómába integrálódott plazmid konkatamerei vannak jelen (az említett kisebb intenzitású sávok nem mutathatók ki a lúgos lízissel készített kivonatokban, ami arra enged következtetni, hogy ezek integrált alakok).
Sőt. a különböző plazmidokkal transzfektalt sejteket szubklónoztuk. s a kapott kiónokat elkülönítve analizáltuk, hogy megtudjuk, vajon a megfigyelt eredmények homogén celluláris működést, vagy a sejt szubpopulációk működésének összegződését tükrözik-e.
A pIElNeoR plazmiddal transzformált sejtekből származó kiónok a teljes poliklonális sejt szubpopulációból származóval azonos működést mutattak.
A pIElNeoRiA-val transzformált sejtek kiónjaiban jelölt fragmenst nem detektáltunk, ami arra enged következtetni, hogy amennyiben a plazmid által szállított genetikai információ jelen van, az nagyon alacsony példányszámban található.
A pIElNeoRAN plazmiddal végzett transzformációból származó három klón azonos a poliklonális populációéval, ami azt sugallja, hogy ugyanazon sejtben az integrált plazmiddal együtt létező episzómáiis struktúra van jelen.
Másrészt, a pIElNeoRáB plazmiddal végzett transzformációból származó négy klón közül kettő a pIElNeoRAN plazmiddal, kettő pedig a plElNeoRáA plazmiddal transzformált sejtekből származó klónnal mutat hasonló működést. Ugyanezek igazak a plElNeoRáM plazmiddal transzformált sejtekből származó kiónokra is.
- 23 A fenti kísérletekkel lehetőség nyílt a pIElNeoR plazmid tulajdonságaiért felelős plazmid részletek lokalizálására: a pIElNeoR-ből származó Accl-Xbal fragmens, .amely a szekvencialistában 1. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát (AMÍG szekvencia) tartalmazza, szállítja a plazmid replikációjához nélkülözhetetlen információt, a pIElNeoR (szekvencialistában 2. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát [STÁB szekvencia] tartalmazó) ClalMlul fragmense pedig a plazmid episzómává szerveződését elősegítő, és az episzómális szerkezetet stabilizáló információt szállítja.
A 4. és 5. ábrán az AMÍG és STÁB fragmensek 1., illetve 2. számú szekvenciája analízisének eredményei láthatók, melyeken feltüntettük a specifikus jellemzőket képviselő régiókat:
— a fragmenseket határoló restrikciós helyek szekvenciáit aláhúztuk, és zárójellel különítettük el a fragmensek fennmaradó szekvenciájától; a fragmenseken belüli restrikciós helyeknek megfelelő szekvenciákat szintén aláhúztuk;
—a S. cerevisiae CEN konszenzus szekvenciáihoz hasonló szekvenciákat vastag betűkkel jelöljük;
— az élesztő ARS konszenzus szekvenciáihoz hasonló szekvenciákat kettős vonallal húztuk alá.
Az AMÍG szekvencia (4. ábra) egyik szegmense (MCCS) az ARS elemek 11 bázispárjával teljes homológiát mutat, négy
- 24 szegmense az ARS konszenzus mag (core) szekvenciája 11 bázispárja közül 10 bázispárral, egy szegmense pedig az élesztő ARS elemeiben lévő A doméntől 5' (upstream) irányban elhelyezkedő ARS(C) konszenzus szekvencia 11 bázispárjából 9 bázispárral mutat homológiát. Ezen szekvenciák mindegyike 419 bázipárból álló szegmensben helyezkedik el, amely körülbelül 70 %-ban A+T-ből áll. Sőt, az AMÍG szekvencia nagyon sok ATTA és ATTTA egységet tartalmaz, továbbá két olyan szekvenciával rendelkezik, amelyek nagyon hasonlítanak az NFI (nuclear factor I) transzkripciós faktor kötési helyének konszenzus szekvenciájához. Az AMÍG szekvencia analízisével a S. cerevisiae CSN konszenzus szekvenciáihoz nagyon hasonló régiókat is találtunk. E szekvenciák egyike, amely a 41. helytől a 47. helyig terjed (a bázisok számozása a szekvencialistában feltüntetett számozásra vonatkozik), a CDEI konszenzus szekvenciával 100 %-os homológiát mutat.
A fentieken kívül, a 177-263., és a 158-166. helyeken elhelyezkedő szekvenciák szintén nagyon hasonlóak az élesztő ARS elemek CDEII és CDEIII konszenzus szekvenciáihoz. Ha azonban a CDEII/CDEIII blokk orientációját a CDEI-re vonatkoztatva összehasonlítjuk a pEIlneoR plazmidban és az élesztő ARS elemekben, azt tapasztaljuk, hogy elentétesek.
A STÁB szekvencia (5. ábra) szintén rendelkezik ATTA és ATTTA egységekkel, valamint olyan szekvenciákkal, amelyek nagyon hasonlítanak az NFI (nuclear factor I) és NFIII transzkripciós faktorok kötési helyeinek konszenzus *
·· · · szekvenciáihoz, illetve egy ARS típusú szekvenciához.
3. példa: Az AMÍG szekvenciát hordozó, és az IEO promoter irányítása alatt a NeoR gént expresszáló plazmid előállítása
Az AcMNPV baculovírus IEO promotert KpnI és BssHII restrikciós helyekkel szegélyezett fragmens formájában PCR-rel amplifikáltuk. A promoter BsslIII végét Klenowpolimerázzal töltöttük fel, majd a pUC19 KpnI-Smal fragmensének helyére inszertáltuk, miáltal a pIEO plazmidot kaptuk.
A pneo NeoR gént tartalmazó BglII-BainHI fragmensét ezután a pIEO BamlII helyére inszertáltuk (oly módon, hogy lehetővé váljon a NeoR gén IEO promoter szabályozása alatti expressziója), miáltal a pIEONeoR plazmidot állítottuk elő.
A pIEl plazmid AMÍG szekvenciát tartalmazó HincII-BamHI fragmensét a pIEONeoR plazmid Snal-BamHI fragmensének helyére inszertáltuk, miáltal a pIEONeoRAMIG plazmidot kaptuk. Ezt a 6. ábrán mutatjuk be.
Az Sf9 sejteket a pIEONeoRAMIG plazmiddal lipofekcióval transzformáltuk, s a rezisztens sejteket az 1. példában leírt módon 1 mg/ml konventrációjú G418-cal szelektáltuk.
Tíz passzálás után a sejtekből lúgos lízissel kivont DNS-t az 1. példában leírt Southern lenyomat technikával analizáltuk. A genetikai információ ebben az esetben is nagy
molekulatömegü episzóma formájában volt jelen, amely a pIEONeoRAMIG plazmid számos tandem példányát tartalmazza.
4. példa: Az AMÍG és STÁB szekvenciákat hordozó gén vírus promoter szabályozása alatti expressziója a transzformált sejtek utódaiban
Az AcNPV-ből származó IEN promotert tartalmazó HindlII-XhoI fragmenst az alábbi eljárás szerint állítottuk elő.
A pNeo BglII helyére a NeoR gén ATG tripletétől -34 bp távolságra 8 bp hosszú Xhol linkért inszertáltunk, miáltal a pNeoXhoI plazmidot kaptuk.
Az AcNPV-ből származó 2620 bp hosszúságú, az IEN gént és promoterét tartalmazó Pstl-N fragmenst a pUC18 plazmid PstI helyére inszertálva a PÜC18IEN plazmidot állítottuk elő. A PÜC18IEN plazmid IEN promotert tartalmazó BglII-PstI fragmensét a pSelect plazmidba (PROMEGA) szubklónoztuk. Az IEN ATG kezdő kodonjában helyre irányuló mutagenezissel egy egyedülálló Xhol helyet alakítottunk ki.
A pUC18IEN plazmid IEN promotert tartalmazó HindlII-XhoI fragmensét a pBLCAT2 plazmid (Luckow és Schutz, Nucleic Acid Rés., 15, (13) 5940, 1987) HindiiI-Xhol fragmensének helyére inszertáltuk. Az így előállított plazmidot pIENCAT-nek nevezzük.
A pIENCAT plazmid IEN proinotert és CAT gént tartalmazó
HindiiI-SacI fragmensének HindiII végét Klenow-polimerázzal feltöltöttük, majd a fragmenst a pIElNeoR plazmid Smal és SacI helyei közé inszertáltuk, miáltal a pIElNeoRIENCAT plazmidot kaptuk. Ezt a plazmidot a 7. ábrán mutatjuk be.
Az Sf9 sejteket az 1. példában leírtak szerint lipofekcióval pIElNeoRIENCAT plazmiddal transzformáltuk, s a rezisztens sejteket 1 mg/ml koncentrációjú G418-cal szelektáltuk.
Tíz passzálás után a sejteket két csoportra osztottuk: az egyiket szelekciós nyomás alatt tartottuk, a másikat pedig nem. 15 további passzálás után a két sejtcsoportot pulsedfield (pulzáló erőterű) elektroforézissel analizáltuk.
Az eredményeket a 8. ábrán mutatjuk be; a genetikai információ ebben az esetben is nagy molekulatömegül episzóma formájában van jelen, amely a pIElNeoRIENCAT plazmid számos tandem példányát tartalmazza, függetlenül attól, hogy a sejteket szelekciós nyomás alatt tartjuk-e vagy sem. Sőt. a plazmid példányszáma a két sejtcsoport esetében összehasonlítható volt.
A 8. ábrán a következők láthatók:
M = molekulatömeg inarker (bp-ban megadva);
BglII-vel emésztett DNS;
2.
oszlop: transzformálatlan Sf9 sejtekből származó,
1. oszlop:
transzforrnálatlan
Sf9 sejtekből származó, ♦
····
♦ » · «· «·«· *«
HindlII-mal emésztett DNS;
3. oszlop: pIElNeoRIENCAT plazmiddal transzformált, szelekciós nyomás alatt tartott Sf9 sejtekből származó, BglII-vel emésztett DNS (a pIElNeoRIENCAT plazmidban egyetlen HindiII hely van);
4. oszlop: pIElNeoRIENCAT plazmiddal transzformált, szelekciós nyomás alatt tartott Sf9 sejtekből származó, BglII-vel emésztett DNS (a pIElNeoRIENCAT plazmidban egyetlen HindiII hely van);
5. oszlop: pIElNeoRIENCAT plazmiddal transzformált, szelekciós nyomás nélküli Sf9 sejtekből származó, BglII-vel emésztett DNS;
6. oszlop: pIElNeoRIENCAT plazmiddal transzformált, szelekciós nyomás nélküli Sf9 sejtekből származó, HindlIIrnal emésztett DNS.
A sejtek által termelt CAT teljes sejtkivonat felhasználásával, anti-CAT antitesttel (Boehringer) végzett ELISA vizsgálata a két sejtcsoport esetében azonos eredményt adott (ld. I. táblázat).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az episzomális struktúra szelekciós nyomás nélkül is stabil.
• · ·· ·
I. táblázat
CAT koncentráció (ng/μβ celluláris protein)
25 passzálás (+G418) 0,25
10 passzálás + (+G418)
15 passzálás (-G418) 0,26
5. példa: Az AMÍG és STÁB szekvenciákat tartalmazó plazmid vektor által hordozott gén cellulárie promoter szabályozása alatti expresszáláea a transzformált sejtek utódaiban
A pCaSpcR-hs plazmid (Thummel és Pirotta, Dros. Inf. Sem., 71, 150, 1992) XhoI-SacI fragmensének Xhol végét Klenowpolimerázzal töltöttük fel. Ez a fragmens a Drosophila melanogasterDoól szármázó hsp70 promotert, valamint ezen gén 3' szekvenciájának körülbelül 1000 bázispárját tartalmazza. Ezt a két szakaszt egy poliklónozási hely választja el, amely jellemzően a BglII és Stul helyeket tartalmazza. A szóban forgó fragmenst a pIElNeoR plazmid Sacl-Smal fragmensének helyére inszertáltuk, miáltal a pIElNeoRhsp plazmidot kaptuk.
A pBLCAT2 plazmid CAT gént tartalmazó BglII-HindlII fragmensét a pIElNeoRhsp plazmid BglII és Stul helyei közé ί
·· · ·· inszertaltuk, s így a pIElNeoRhspCAT plazmidot állítottuk elő, amelyet a 9. ábrán mutatunk be. Az Sf9 sejteket lipofekcióval a pIElNeoRhspCAT plazmiddal transzformáltuk, s a rezisztens sejteket az 1. példában leírt módon 1 mg/ml koncentrációjú G418-cal szelektáltuk.
passzálás után a sejteket két csoportra osztottuk; az egyiket szelekciós nyomás alatt, a másikat pedig anélkül tartottuk, öt további passzálás után a két sejtcsoportból származó DNS-t lúgos lízissel vontuk ki, s az 1. példában leírt módon Southern lenyomat-technikával vizsgáltuk. A genetikai információ ebben az esetben is nagy molekulatömegü episzóma formájában volt jelen, amely a pIElNeoRhspCAT plazmid számos tandem példányát tartalmazta.
A Drosophila sejtekben a hsp70 promoter hősokk hatására indukálható, ezért a pIElNeoRhspCAT plazmiddal transzformált Sf9 sejteket 37 ’C-on 0,5, 1, illetve 2 órás hősokkal kezeltük, s a termelt CAT mennyiségét a 4. példában leírtak szerint ELISA módszerrel vizsgáltuk.
Az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be, melyen az üres négyzetek a transzformálatlan Sf9 sejteket, a sötét rombuszok a pIElNeoRhspCAT plazmiddal transzformált Sf9 sejteket (szelekciós nyomás nélkül 10 passzálás), a sötét négyzetek pedig a pIElNeoRhspCAT plazmiddal transzformált Sf9 sejteket (szelekciós nyomással 10 passzálás) jelzik.
Az ábrán az x tengelyen a 37 °C-on végzett hőkezelés időtartamát (órákban), az y tengelyen pedig a termelt CAT mennyiségét (ng/mg összes protein értékben kifejezve) tüntetjük fel.
Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek szelekciós nyomás alatt vagy anélkül tartva teljesen azonosan viselkednek, továbbá a hsplO promoter szabályozása alatt termelődött CAT mennyisége (1,2 ng/pg összes protein) sokkal nagyobb, mint az IEN promoter szabályozása alatt termelődötté (0,25 ng/mg összes protein; vö. I. táblázat, 4. ábra). A termelés azonban hősokkal nem indukálható; éppen ellenkezőleg, a termelés mértéke 2-3 faktorral csökken.
6. példa: Az AMÍG és STÁB szekvenciákat tartalmazó vektor által hordozott gén expressziója vírus eredetű elemekkel transz-aktivált és cisz-akt.ivált vírus promoter szabályozása alatt
Az AcMNPV baculovírusból származó 39K korai promotert az IE1 gén IE1 protein terméke (Guarino és Summers, Virol., 57.
563-571,
1986) tra/jsz-aktiválja, és a hr2 szekvencia (Guarino és Summers,
Virol., 60.
215-223, 1986) ciszaktiválja. A CAT gén állandó expresszióját ezen promoter szabályozása alatti az alábbi plazmid előállításával valósítottuk meg.
Az AcMNPV-ből származó, a 39K gént tartalmazó Pstl-K » · ·· ·
- 33 miáltal a pIElhr239K-l plazmidot kaptuk.
A pIElhr239K-l StyI helyére BglII linkért inszertáltunk.
A pBLCAT2 (Luckow és Schullz, Nucl. Acids Rés., IS, 5490, 19Θ7) Sacl-Hpal fragmensét, amely az SV4O T-antigén gén poliadenilációs szekvenciáit tartalmazza, a pIElhr239K-l BspEI-SacI fragmensének (a BspEI vég Klenow-polimerázzal végzett feltöltése után) helyére inszertáltuk. A kapott plazmidot pIElhr239K-2-nek nevezzük.
A pIElhr239K-2 BamHI helyének eltávolítása érdekében a plazmidot BamHI-gyel emésztettük, majd a végek Klenowpolimerázzal végzett feltöltése után újra összezártuk. Ezután a plazmid SacI helyére 10 bp hosszúságú BamHI linkért inszertáltunk, miáltal a pIElhr239K-3 plazmidot állítottuk elő.
A pIElhr239K-l, pIElhr239K-2 és pIElhr239K-3 kialakításának lépéseit vázlatosan a 12. ábrán mutatjuk be.
A pIElhr239K-3 plazmid Pacl-Xbal fragmense az IE1 poliadenilációs szekvenciáit és az AMÍG szekvenciát tartalmazza. Miután a Bsu36I és Paci végeket Klenowpolimerázzal feltöltöttük, a plazmidot a pBKCMV (Stratagene) Bsu361-AvrII fragmensével helyettesítettük, amely a CMV vírus timidin-kináz gén poliadenilációs szekvenciáit tartalmazza. A kapott plazmid a pIElhr239K-4..
• · • ·» · fragmenst a pUC18 Pstl helyére inszertáltuk. Az így kapott plazmid SacI-HindlII fragmense a 39K promotert és a gén kódoló szekvenciájának kezdetét tartalmazza. Ezt a plazmidot a pSelect (Promega) SacI-HindlII fragmensének helyére inszertáltuk. A 39K ATG szakaszában helyre irányuló mutagenezissel egyedüli StyI helyet alakítottunk ki, miáltal a pSelect39K plazmidot kaptuk. A plazmid kialakítási folyamatát a 11/A ábrán mutatjuk be.
Az AcMNPV-ből származó, a hr2-t tartalmazó HindiII-L fragmenst a pUC18 HindiII helyére inszertáltuk, miáltal a phr2 plazmidot kaptuk.
A phr2 Eagl-HindlII fragmense a teljes hr2 szekvenciát tartalmazza, melynek végeit Klenow-polimerázzal töltöttük fel, s ezt a fragmenst a plEl Xbal helyére inszertáltuk, melynek végeit szintén Klenow-polimerázzal töltöttük fel. A kapott plazmidot plElhr2-nek nevezzük, s kialakítási folyamatát a 11/B ábrán mutatjuk be.
A pIElhr2 plazmidot HindlII-inal és Styl-gyel emésztettük, hogy eltávolitsuk az ezen enzimeknek megfelelő helyeket,
majd a végek Klenow-polimerázzal végzett feltöltése után a
plazmidot újra összezártuk.
A pSelect39K plazmid mutációval módosított 39K promotert
és egy StyI helyet tartalmazó SnaBI-SacI fragmensét a
pEIlhr2 plazmid SnBI-SacI fragmensének helyére inszertáltuk, • · e· ·
- 34 A pIEONeoRAMIG BamHI-ΚρηΙ fragmensét a pIElhr239K-4
BamHI-Kpnl fragmensének helyére inszertáltuk, miáltal a pC2BglII expressziós plazmidot kaptuk, amelybe az egyedüli * BglII helyre a 39K promoter szabályozása alá idegen gén inszertálható. A pc2BglII vektor kialakításának lépéseit a 13. ábrán mutatjuk be. A pc2BglII részletesebb térképe a 15/A ábrán látható.
A pBLCAT2 plazmid CAT gént tartalmazó Xmal-BglII fragmensét a pC2BglII Xmal-BglII fragmensének helyére inszertáltuk, miáltal a pC2CAT plazmidot kaptuk.
A pC2CAT az alábbi gének expresszióját teszi lehetővé:
— az IEO promoter szabályozása alatt a NeoR génét (poliA szekvencia: IE1);
— az IE1 promoter szabályozása alatt az IE1 génét (poliA szekvencia: CliV TE);
— az ΙΕΙ-gyel transz-aktivált, és hr2-vel cisz-aktivált 39K promoter szabályozása alatt a CAT génét (poliA szekvencia: SV4O T-antigén).
A STÁB szekvencia az IE1 géntől 5' irányban (upstream), az AMÍG szekvencia pedig a NeoR géntől 3' irányban (downstream) helyezkedik el. ilyenformán e két szekvencia az expressziós vektor kódoló szekvenciáját szegélyezi.
Az Sf9 sejteket lipofekcióval a pC2CAT plazmiddal transzformáltuk, s a rezisztens sejteket az 1. példában · 4 · ··* • · » 9 i • · • « · · <·>
1eírtak szerint szelektáltuk.
ing/inl koncentrációjú G418-cal passzálás után a sejtek DNS-ét lúgos lízissel vontuk ki, és Southern lenyomat módszerrel vizsgáltuk. A genetikai információ ebben az esetben is nagy molekulatömegú episzóma formájában volt Jelen, amely a pC2CAT plazmid számos tandem példányát tartalmazta. A
CAT ELISA módszerrel mért termelődése az összes protein egy mg-jára vonatkoztatva 1,6 ng (1,6 ng/mg összes protein).
A pC2CAT vektort a 14. ábrán, illetve részletesebben a 15/B ábrán mutatjuk be.
Szekvencia!ista (2) TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 516 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálű (D) ALAK: lineáris· (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom DNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTI-SZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Autographa californica sejtmag polihedrózis vírus (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA
ACGTTAGTCA AGTAATTCAA AAATATAATA GATTTAAGCA TCACATGTTT GTAATCGGTA 60
AAGTGAACCG AAGAGAGAGG ACTACATTGC ACAATAATTT GTTAAAATTG TTAGCTTTAA 120
TA'Li'ACAGG^ -Τ' Γ -Τ' r* r·· -ttt· r* r* TTGTCCGACG CTATAACGTT TGCGGAACAA AAACTAAATT 180
GTAAATATAA AAAATTCGAA CTTTAATTAA TTATACATAT ATTTTGAATT TAATTAATTA 240
TACATATATT TTATATTATT Γρ» T> * y VT* T ATTATCGAGG GGCCGTTGTT GG TG TGwj T 300
< | 1 1 ?—· * rp » z”» « AATAACAATG GG AGTT GG\- G ACGTTGCTGC GCCAACACCA 360
f·· π w ír í TCATGTATCT GTAGATAAAA TAAAATATTA AACCTAAAAA CAAGACCGCG 420
CCTATCAACA AAATGATAGG CATTAACTTG CGTGACGCTG TCACTAACGT TGGACGATTT 480
GCCGACTAAA CCTTCATCGC CCAGTAACCA ATCTAG
516 « a • ··· (2) TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 387 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom DNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM ‘ (iv) ANTI-SZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) ORGANIZMUS: Autographa californica sejtmag polihedrózis vírus

Claims (8)

1. A szekvencialistában 1. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát tartalmazó DNS fragmens alkalmazása állati sejtben autonóm replikációra képes, és az említett sejt utódaiban fenntartható vektor episzóma formájában történő előállításához.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, melynek során az
1. azonosítási számú szekvencia DNS fragmensét a szekvencialistában 2. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát tartalmazó DNS fragmenssel együtt alkalmazzuk.
3. Állati sejtben sokszorozódni képes és az említett sejt utódaiban fenntartható vektor, amely egységvektor konkatameréből álló episzóma formájában van jelen, mely egységvektor a szekvencialistában 1. azonosítási számmal jelzett szekvenciát tartalmazza.
4. A 3. igénypont szerinti vektor, melyben az említett egységvektor a szekvencialistában 2. azonosítási számmal jelzett szekvenciát is tartalmazza.
5. Eljárás idegen eredetű extrakromoszomális genetikai információt utódainak átadni képes állati sejtvonalak előállítására, azzal jellemezve, hogy első lépésként az állati sejtet az említett genetikai információt hordozó, s a szekvencialistában
1.
azonosítási számmal jelzett szekvenciát tartalmazó, legalább egy egységvektorból álló
DNS-készítménnyel, vagy legalább egy, az említett egységvektor konkatameréből álló episzómát tartalmazó DNSkészítménnyel transzfektáljuk, majd második lépésként az említett állati sejtet szaporítjuk, s kiválasztjuk az említett sejt azon utódait, amelyek legalább egy, az említett egységvektor konkatamerét tartalmazó episzómát hordoznak.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állati sejteket olyan egységvektorral transzformáljuk, amely a szekvencialistában 2. azonosítási számmal feltüntetett szekvenciát is tartalmazza.
7. Idegen eredetű genetikai információ expresszálására képes stabil sejtvonal, azzal jellemezve, hogy mindegyik sejt legalább egy, 3. vagy 4. igénypont szerinti episzómális vektort tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti sejtvonal, azzal jellemezve, hogy rovar-, elsősorban Lepidoptera sejtvonai.
HU9402185A 1993-07-26 1994-07-25 Nucleotide sequences making replication and maintenance of genetic information possible in animal cells HUT68186A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9309156A FR2708284B1 (fr) 1993-07-26 1993-07-26 Séquences nucléotidiques permettant la réplication et le maintien d'une information génétique dans les cellules animales.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9402185D0 HU9402185D0 (en) 1994-09-28
HUT68186A true HUT68186A (en) 1995-05-29

Family

ID=9449618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402185A HUT68186A (en) 1993-07-26 1994-07-25 Nucleotide sequences making replication and maintenance of genetic information possible in animal cells

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5597689A (hu)
EP (1) EP0638647A1 (hu)
JP (1) JPH07203985A (hu)
AU (1) AU682189B2 (hu)
CA (1) CA2128653A1 (hu)
FR (1) FR2708284B1 (hu)
HU (1) HUT68186A (hu)
IL (1) IL110451A0 (hu)
NZ (1) NZ264095A (hu)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0123098D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-14 Lonza Biologics Plc Use of aminoglycoside resistance gene
BR112015027611A2 (pt) 2013-01-28 2022-03-03 Univ Kansas State Molécula de ácido nucleico isolada; célula hospedeira; vetor; proteína ou polipeptídeo isolado; imunorreagente específico de vírus da febre do vale do rift (rvfv); uso de uma composição; uso de uma composição para o diagnóstico de febre do vale do rift (rvf) em um indivíduo; e kit

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004687A (en) * 1985-05-21 1991-04-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Insect virus vector with broadened host range
DE4133038A1 (de) * 1991-10-07 1993-04-08 Genentech Inc Neue recombinante viren, deren verwendung und deren herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
FR2708284B1 (fr) 1995-10-20
US5597689A (en) 1997-01-28
HU9402185D0 (en) 1994-09-28
CA2128653A1 (fr) 1995-01-27
AU682189B2 (en) 1997-09-25
EP0638647A1 (fr) 1995-02-15
NZ264095A (en) 1995-02-24
IL110451A0 (en) 1994-10-21
FR2708284A1 (fr) 1995-02-03
AU6867094A (en) 1995-02-02
JPH07203985A (ja) 1995-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Differential requirements for baculovirus late expression factor genes in two cell lines
DK172401B1 (da) Fremgangsmåder til fremstilling af rekombinante baculovirus-vektorer, vektorer fremstillet ved fremgangsmåderne, samt fremgangsmåde til fremstilling af heterologt protein under anvendelse af en baculovirus-vektor
Carson et al. Functional mapping of an AcNPV immediately early gene which augments expression of the IE-1 trans-activated 39K gene
Sandri-Goldin et al. A herpesvirus regulatory protein appears to act post-transcriptionally by affecting mRNA processing.
Possee Cell-surface expression of influenza virus haemagglutinin in insect cells using a baculovirus vector
Angel et al. Oncogene jun encodes a sequence-specific trans-activator similar to AP-1
US4968615A (en) Deoxyribonucleic acid segment from a virus
Lu et al. Identification of three late expression factor genes within the 33.8-to 43.4-map-unit region of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
Sarabia et al. The cell cycle genes cdc22+ and suc22+ of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe encode the large and small subunits of ribonucleotide reductase
Rhode 3rd trans-Activation of parvovirus P38 promoter by the 76K noncapsid protein
EP0935648B1 (en) Improved adenovirus vectors
US5348886A (en) Method of producing recombinant eukaryotic viruses in bacteria
WO1999045130A1 (en) Baculovirus expression system and method for high throughput expression of genetic material
CA2033070A1 (en) Baculovirus expression vectors
Vieira et al. Genes in the HindIII J fragment of the murine cytomegalovirus genome are dispensable for growth in cultured cells: insertion mutagenesis with a lacZ/gpt cassette
Laux et al. Structure and evolution of two related transcription units of Epstein-Barr virus carrying small tandem repeats
Ngan et al. The centromere enhancer mediates centromere activation in Schizosaccharomyces pombe
Harkness et al. Inactivation of the Neurospora crassa gene encoding the mitochondrial protein import receptor MOM19 by the technique of" sheltered RIP".
US5866383A (en) In vitro ligation of foreign DNA into large eukaryotic viruses
Westwood et al. Analyses of alternative poly (A) signals for use in baculovirus expression vectors
Garcia et al. Vectors for the genetic manipulation of African swine fever virus
EP1144666B1 (en) Replication deficient baculovirus expression system
Schaffrath et al. Kluyveromyces lactis killer plasmid pGKL2: molecular analysis of an essential gene, ORF5
McLachlin et al. A baculovirus mutant defective in PKIP, a protein which interacts with a virus-encoded protein kinase
HUT68186A (en) Nucleotide sequences making replication and maintenance of genetic information possible in animal cells

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee