JPH0713632B2 - Circulation of column chromatographic eluent using hydrophobic packing - Google Patents
Circulation of column chromatographic eluent using hydrophobic packingInfo
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- JPH0713632B2 JPH0713632B2 JP60157050A JP15705085A JPH0713632B2 JP H0713632 B2 JPH0713632 B2 JP H0713632B2 JP 60157050 A JP60157050 A JP 60157050A JP 15705085 A JP15705085 A JP 15705085A JP H0713632 B2 JPH0713632 B2 JP H0713632B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイ
ー用カラムを用い、極性溶媒に非極性溶媒を飽和量まで
の範囲の量添加したもので構成される溶離液でカラムク
ロマトグラフイーを行なう場合の溶離液の効果的な循環
使用方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial field of application] The present invention uses a column for chromatography packed with a hydrophobic packing material, in which a polar solvent is added with a nonpolar solvent in an amount up to a saturated amount. The present invention relates to an effective method of circulating and using an eluent when column chromatography is performed with an eluent composed of a substance.
従来、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイー用
カラムを用いて行なうカラムクロマトグラフイーでは、
水、メタノール、エタノール、プロパノール、アセト
ン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン
などの極性溶媒のうちの１種類の溶媒か、または２種類
以上の混合溶媒が溶離液として使用されており、水を含
む溶離液を使用するのが一般的である〔PHARM TECH JAP
AN Vol.1,No.1,25（1985）〕。Conventionally, in column chromatography performed using a column for chromatography filled with a hydrophobic packing material,
One of the polar solvents such as water, methanol, ethanol, propanol, acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran, dioxane, or a mixed solvent of two or more kinds is used as the eluent. Generally used [PHARM TECH JAP
AN Vol.1, No.1,25 (1985)].
〔発明が解決しようとする問題点〕 しかし、疎水性の充填剤を充填したクロマトグラフイー
用カラムを用いてカラムクロマトグラフイーを行なう場
合、上記のような極性の高い溶離液を溶質を得る目的で
蒸留、濃縮するためには、一般的に高い熱量と長時間を
要し、また溶離液が２種類以上の混合溶媒である場合、
蒸留、濃縮して回収した溶離液は、蒸留以前の溶質を含
まない溶離液と比較して組成が変わつてしまう場合が多
く、このため蒸留、濃縮して回収した溶離液を再びこの
溶離液を流出させたカラムの上部に注ぎカラムクロマト
グラフイーの溶離液として使用するためには、回収した
溶離液を構成する溶媒の組成をガスクロマトグラフイー
などによつて分析し、その上で溶離液の組成を回収する
以前の組成と同じにするために、例えば精留してそれぞ
れ単一の溶媒にした後、あらためて混合するか、または
新たに溶媒を添加して混合するなどしなければならなか
つた。かくして、蒸留、濃縮して回収した溶離液を、上
記のような操作を行なわず再び溶離液として使用するこ
とは難しかつた。[Problems to be Solved by the Invention] However, when performing column chromatography using a column for chromatography filled with a hydrophobic packing material, the purpose of obtaining a solute with an eluent having a high polarity as described above Distillation and concentration generally requires a large amount of heat and a long time, and when the eluent is a mixed solvent of two or more kinds,
In many cases, the composition of the eluent recovered by distillation and concentration changes as compared with the eluent containing no solute before distillation. In order to use it as the eluent for column chromatography by pouring it onto the upper part of the column that has flowed out, analyze the composition of the solvent that constitutes the recovered eluent using gas chromatography, etc., and then analyze the composition of the eluent. In order to obtain the same composition as that before the recovery, it was necessary to carry out rectification to obtain a single solvent and then mix them again, or add a new solvent and mix them. Thus, it was difficult to use the eluent recovered by distillation and concentration as the eluent again without performing the above operation.
本発明はこの問題を解決し、疎水性の充填剤を充填した
クロマトグラフイー用カラムを用いてカラムクロマトグ
ラフイーを行なう場合の溶離液の効果的な循環使用方法
を提供するものである。The present invention solves this problem and provides an effective method of recirculating the eluent when column chromatography is performed using a chromatographic column packed with a hydrophobic packing material.
上記の問題点を解決するための本発明は、疎水性の充填
剤を充填したクロマトグラフイー用カラムを用い、１種
類または２種類以上の極性溶媒に非極性溶媒を飽和量ま
での範囲の量添加したものを溶離液として用いるカラム
クロマトグラフイーにおいて、上記カラムの下部から流
出する溶質を含んだ溶離液に、これと二相に分離する状
態となるように非極性溶媒を添加、接触させることによ
り溶離液中の溶質を非極性溶媒に移行、抽出させた後、
この非極性溶媒と溶離液とを分離し、溶質を抽出された
後の溶質を含まない溶離液を再び上記カラムの上部に注
ぎ、このカラム中の溶質を溶離させることを特徴とす
る、疎水性の充填剤を使用するカラムクロマトグラフイ
ーの溶離液の循環使用方法である。The present invention for solving the above problems uses a chromatographic column packed with a hydrophobic packing material, and one or more polar solvents in which the amount of the nonpolar solvent is in the range up to the saturated amount. In column chromatography using the added one as the eluent, add and contact the non-polar solvent with the eluent containing the solute flowing out from the lower part of the column so as to separate it into two phases. After the solute in the eluent was transferred to a non-polar solvent and extracted,
The non-polar solvent and the eluent are separated, and the solute-free eluent after the solute is extracted is poured again into the upper part of the column to elute the solute in the column, which is hydrophobic. It is a method of circulating and using an eluent of column chromatography using the packing material of.
本発明において、疎水性の充填剤としては、アルキル基
をシリカゲルに化学結合させた充填剤、スチレンとジビ
ニルベンゼンの共重合物を素材とした吸着樹脂、メタク
リル酸エステルやアクリル酸エステルを母体とする吸着
樹脂、またはシリカゲルにシリコンオイルや炭化水素類
を含浸させた充填剤などを使用することができる。そし
てこれらの充填剤のクロマトグラフイー用カラム（以
下、カラムという）への充填は、従来の充填方法である
湿式充填法、乾式充填法などによつて任意に充填するこ
とができる。In the present invention, as the hydrophobic filler, a filler in which an alkyl group is chemically bonded to silica gel, an adsorption resin made of a copolymer of styrene and divinylbenzene, a methacrylic acid ester or an acrylic acid ester as a base material It is possible to use an adsorbent resin or a filler obtained by impregnating silica gel with silicon oil or hydrocarbons. The packing of these packing materials into a column for chromatography (hereinafter referred to as a column) can be carried out arbitrarily by a conventional packing method such as a wet packing method or a dry packing method.
充填剤が充填されたカラムには溶離液を通液し、充填層
中の気泡を取り除くなどして、いわゆるカラムのコンデ
イシヨニングを行なつて分離精製の目的の成分を含む原
料の負荷に備える。The eluent is passed through the column packed with the packing material to remove air bubbles in the packed bed to perform so-called column conditioning to load the raw material containing the target components for separation and purification. Prepare
本発明で使用する溶離液としては、１種類の極性溶媒、
または２種類以上の極性溶媒の混合物、あるいはこれら
に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添加したものが用
いられる。As the eluent used in the present invention, one kind of polar solvent,
Alternatively, a mixture of two or more kinds of polar solvents, or a mixture obtained by adding a non-polar solvent in an amount up to the saturation amount is used.
本発明ではカラムの下部から溶質を含んで流出するこれ
らの溶離液は、これと二相に分離する状態となるように
非極性溶媒を接触させることによつて、溶質を非極性溶
媒で抽出した後、溶離液を溶質を含む非極性溶媒と分離
し、この溶質を含まない溶離液を、クロマトグラフイー
用溶離液として再びカラムの上部にもどして循環して使
用するものであるので、溶離液は、循環使用している間
に組成の変化が少ないことが好ましく、また溶質の抽出
に使用する非極性溶媒と二相に分離するのがよく、両
液、すなわち溶離液と溶質の抽出に使用する非極性溶媒
を等量ずつ分液ロートに入れて分配した場合、溶離液側
の容量が全く変わらないか、または増すものが好まし
い。これは、例えば分配した際、溶離液側の容量が減る
場合には、溶離液を構成している溶媒が溶質の抽出に使
用する非極性溶媒によつて抽出されていることを示して
おり、この溶離液を循環使用すれば溶質の抽出を行なう
ごとに溶離液の組成が変化してしまうためであり、一
方、分配した後に溶離液の容量が増す場合には、抽出に
使用した非極性溶媒が溶離液に飽和した場合であるた
め、さらに循環使用しても溶離液の溶媒組成は変わらな
いからである。In the present invention, these eluents containing the solute flowing out from the lower part of the column were extracted with the nonpolar solvent by bringing the solute into contact with a nonpolar solvent so as to be separated into two phases. After that, the eluent is separated from the non-polar solvent containing solute, and the eluent containing no solute is returned to the upper part of the column for circulation and used as the eluent for chromatography. It is preferable that the composition does not change much during cyclic use, and it is better to separate it into two phases with the non-polar solvent used for solute extraction. When the non-polar solvent to be used is distributed in equal volumes in a separating funnel, it is preferable that the volume on the eluent side does not change at all or increases. This indicates that, for example, when the volume on the side of the eluent decreases upon distribution, the solvent constituting the eluent is extracted by the nonpolar solvent used for extracting the solute, This is because the composition of the eluent changes each time the solute is extracted if this eluent is circulated. On the other hand, if the volume of the eluent increases after distribution, the non-polar solvent used for extraction is used. Is saturated with the eluent, and the solvent composition of the eluent does not change even if the solvent is further circulated.
溶離液として、１種類の極性溶媒または２種類以上の極
性溶媒の混合物に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添
加したものを使用するのは、非極性溶媒を添加すること
によつて、分離する目的の成分の分離効果を高めるため
であるが、溶離液に添加する非極性溶媒と、溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の種類が異なる場合は、溶離液と
溶質の抽出に使用する非極性溶媒とを分配した際に、溶
離液に添加する非極性溶媒が、抽出のための非極性溶媒
によつて抽出される場合があり、このような溶媒系で溶
離液を循環使用した場合には、溶離液から溶質の抽出を
行なうごとに溶離液の組成が変化してしまう恐れがある
ため、溶離液に添加する非極性溶媒としては、溶質の抽
出に使用する非極性溶媒と同じものを使用することが好
ましい。As the eluent, one kind of polar solvent or a mixture of two or more kinds of polar solvents to which a nonpolar solvent is added in an amount in a range up to a saturation amount is used. This is to enhance the separation effect of the target component to be separated, but if the non-polar solvent added to the eluent and the non-polar solvent used to extract the solute are different, use it to extract the eluent and the solute. When partitioning with a non-polar solvent, the non-polar solvent added to the eluent may be extracted by the non-polar solvent for extraction, and when the eluent is circulated and used in such a solvent system. Since the composition of the eluent may change each time the solute is extracted from the eluent, the non-polar solvent added to the eluent is the same as the non-polar solvent used for the solute extraction. Is preferably used.
このことから、本発明で使用する溶離液としては、循環
使用している間の組成の変化が少ないことが好ましいた
め、１種類の極性溶媒または２種類以上の極性溶媒の混
合物に溶質の抽出に使用する非極性溶媒と同じ非極性溶
媒を飽和量までの範囲の量添加したものを用いることが
好ましい。From this, it is preferable that the eluent used in the present invention has a small change in composition during cyclic use, and therefore it is possible to extract a solute in one polar solvent or a mixture of two or more polar solvents. It is preferable to use the same non-polar solvent as the non-polar solvent to be used added in an amount up to the saturation amount.
本発明で溶離液として用いる極性溶媒の具体例として
は、例えば水、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、メチル
エチルケトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒ
ドロフラン、酢酸などの酸の水溶液、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどの塩基の水溶液を挙げることが
でき、これらのうちの１種類の溶媒か２種類以上の混合
溶媒を、分離する目的の物質に応じて適宜選択し、使用
することができる。Specific examples of the polar solvent used as the eluent in the present invention include, for example, water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, methyl ethyl ketone, acetonitrile, dioxane, tetrahydrofuran, an aqueous solution of an acid such as acetic acid, sodium hydroxide, water. An aqueous solution of a base such as potassium oxide can be mentioned, and one of these solvents or a mixed solvent of two or more thereof can be appropriately selected and used according to the substance to be separated.
また、溶離液に添加する非極性溶媒、または溶質の抽出
に使用する非極性溶媒の具体例としては、例えばｎ−ペ
ンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、
イソオクタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、
クロロホルム、ジクロルメタンなどを挙げることができ
る。Further, specific examples of the nonpolar solvent added to the eluent or the nonpolar solvent used for extracting the solute include, for example, n-pentane, n-hexane, n-heptane, n-octane,
Isooctane, cyclohexane, benzene, toluene,
Examples thereof include chloroform and dichloromethane.
極性溶媒に非極性溶媒を添加した溶離液の調製には、例
えば選定した１種類または２種類以上の極性溶媒と、非
極性溶媒を分液ロートに入れ、振とうすることにより溶
離液を得ることができる。その際の液温はカラムクロマ
トグラフイーを行なう際のカラムの充填剤の充填層の温
度と同じてあることが好ましい。For preparing an eluent in which a non-polar solvent is added to a polar solvent, for example, one or more polar solvents selected and a non-polar solvent are put in a separating funnel and shaken to obtain an eluent. You can The liquid temperature at that time is preferably the same as the temperature of the packed bed of the packing material of the column when performing column chromatography.
カラムクロマトグラフイーは次のようにして行なう。即
ち、コンデイシヨニングが終了したカラムに分離精製の
目的の成分を含む原料を負荷し、上記のようにして調製
した溶離液をカラムに通液して溶離を開始する。そして
カラムの下部から流出する溶質を含む溶離液は一定量ず
つ分画し、それぞれ分液ロートを用いて分画した溶離液
量の1/10〜１倍量程度の非極性溶媒を１〜５回分ほどに
分けて添加し溶離液から溶出を行なうか、または連続抽
出装置などを使用してカラムの下部から流出する溶離液
から連続的に溶質を非極性溶媒で抽出する。この場合、
抽出に使用する非極性溶媒の量や、分液ロートを用いる
場合の抽出回数、また連続抽出装置を使用する場合の抽
出用非極性溶媒と溶離液の流量比などは、抽出用非極性
溶媒による溶離液からの溶質の抽出率などによつて決定
し、溶離液からの溶質の抽出は完全に行なわれることが
好ましい。Column chromatography is performed as follows. That is, a raw material containing a target component for separation and purification is loaded on the column after completion of the conditioning, and the eluent prepared as described above is passed through the column to start elution. Then, the eluent containing the solute flowing out from the lower part of the column is fractionated by a fixed amount, and 1 to 5 times the non-polar solvent of 1/10 to 1 times the amount of the eluent fractionated using the separating funnel, respectively. The solute is added in batches to elute from the eluent, or a solute is continuously extracted from the eluent flowing out from the lower part of the column with a nonpolar solvent using a continuous extraction device or the like. in this case,
The amount of non-polar solvent used for extraction, the number of extractions when using a separating funnel, and the flow ratio between the non-polar solvent for extraction and the eluent when using a continuous extraction device depend on the non-polar solvent for extraction. It is preferable to completely extract the solute from the eluent, which is determined by the extraction rate of the solute from the eluent.
非極性溶媒で溶質を抽出した後、分液ロートを用いて抽
出した場合には、それぞれ分画された溶離液からの抽出
分ごとに、非極性溶媒を蒸留、濃縮して各分画分の溶質
を得、また、連続抽出装置などにより溶質を抽出した場
合には、連続抽出装置から溶質を抽出して流出する非極
性溶媒を一定量ずつ分画し、この非極性溶媒を蒸留、濃
縮して溶質を得、分画された溶質は、ガスクロマトグラ
フイー（GLC）、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
などによつて分析することによつて目的の成分を得るこ
とができる。When the solute is extracted with a non-polar solvent and then extracted with a separating funnel, the non-polar solvent is distilled and concentrated for each of the extracted fractions from the fractionated eluent. When a solute is obtained and the solute is extracted by a continuous extractor, etc., the non-polar solvent that is extracted from the continuous extractor and flows out is fractionated by a fixed amount, and this non-polar solvent is distilled and concentrated. To obtain the solute, and the fractionated solute is gas chromatograph (GLC), high performance liquid chromatograph (HPLC)
The target component can be obtained by analyzing with such as.
そして非極性溶媒によつて溶質が抽出された後の溶離液
は、再びカラム中の成分を溶離するべく、カラムの上部
から注ぎ入れ、カラムクロマトグラフイーの溶離液とし
て循環使用する。Then, the eluent after the solute is extracted by the nonpolar solvent is poured from the upper part of the column to elute the components in the column again, and is circulated and used as the eluent of column chromatography.
本発明によれば、疎水性の充填剤を充填したカラムを用
いるカラムクロマトグラフイーで使用する極性の高い溶
離液を直接蒸留、濃縮することなく容易に目的とする成
分を得ることができ、しかも使用する溶離液の組成を変
化させることなく効果的に循環して使用することができ
る。According to the present invention, a target component can be easily obtained without directly distilling and concentrating a highly polar eluent used in column chromatography using a column packed with a hydrophobic packing material, and The eluent used can be effectively circulated and used without changing the composition.
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制
限されるものではない。Examples of the present invention will be shown below, but the present invention is not limited thereto.
実施例 １ スチレンとビニルベンゼンの共重合物を母体とする三菱
化成（株）製の非極性吸着樹脂セパビーズSP−207を、
直径3cm、高さ50cmのガラス製カラムに30cmの高さまで
充填した。Example 1 A non-polar adsorbent resin Sepabeads SP-207 manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd. having a copolymer of styrene and vinylbenzene as a base,
A glass column having a diameter of 3 cm and a height of 50 cm was packed to a height of 30 cm.
メタノールを溶離液として上記非極性吸着樹脂充填層に
流し込み、充填層の気泡を取り除き、充填層最上部がわ
ずかに露出するまで、このカラム下部から溶離液を流し
て止め、目的とするエイコサペンタエン酸エチルを42.6
％含有する脂肪酸エチル混合物2.1gを負荷した。このも
のはガスクロマトグラフイー（以下、GLCという）によ
る分析の結果、エイコサペンタエン酸エチルの他に20種
類ほどの脂肪酸エチルが含まれていた。Pour the non-polar adsorption resin packed bed with methanol as an eluent, remove the bubbles in the packed bed, and stop the eluent from the bottom of this column until the top of the packed bed is slightly exposed, then the desired eicosapentaenoic acid. Ethyl 42.6
% Fatty acid ethyl mixture 2.1 g was loaded. As a result of analysis by gas chromatography (hereinafter referred to as GLC), this product contained about 20 kinds of ethyl fatty acid in addition to ethyl eicosapentaenoate.
カラム下部から溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合物
を完全に樹脂層にしみ込ませて溶離液の流出を止めた。
カラムの充填層上部の空間に溶離液を流し込みながら溶
離液をこのカラム下部から毎分1.8mlの流速で流出さ
せ、初めの50mlを三角フラスコに取り、続けて流出して
くる溶離液を別の三角フラスコに取つた。そして初めの
50mlの溶離液を分液ロートに入れ、溶離液量の約1/3の
量である16mlのｎ−ヘキサンで３回、合計48mlのｎ−ヘ
キサンで溶質の抽出を行ない、この48mlのｎ−ヘキサン
を蒸留、濃縮して第１画分の溶質を得た。一方、溶質が
抽出された後の溶離液は再びカラム上部に流し込み、カ
ラムクロマトグラフイーを続け、このようにして第８画
分までの溶質を得た。これらの画分をGLCによつて分析
した結果、目的とするエイコサペンタエン酸エチルは、
第５画分と第６画分に分画されており、それぞれの含有
率は82.3％および84.2％、また収量は0.23gおよび0.20g
であつた。The eluent was allowed to flow out from the lower part of the column, and the fatty acid ethyl mixture was completely permeated into the resin layer to stop the eluent from flowing out.
While pouring the eluent into the space above the packed bed of the column, let the eluent flow out from the bottom of this column at a flow rate of 1.8 ml / min. Take in an Erlenmeyer flask. And the first
50 ml of the eluent was placed in a separating funnel, and the solute was extracted 3 times with 16 ml of n-hexane, which was about 1/3 of the eluent volume, with a total of 48 ml of n-hexane to extract the solute. Hexane was distilled and concentrated to obtain a solute as a first fraction. On the other hand, the eluate after the solute was extracted was poured into the upper part of the column again, column chromatography was continued, and solutes up to the eighth fraction were thus obtained. As a result of analyzing these fractions by GLC, the target ethyl eicosapentaenoate was
It is divided into 5th and 6th fractions, the contents of which are 82.3% and 84.2%, and the yields are 0.23g and 0.20g.
It was.
なお、上記実施例中のGLCの分析は下記の条件で行な
い、面積百分率で含有率を表示した。The analysis of GLC in the above examples was carried out under the following conditions, and the content rate was expressed as an area percentage.
GLC分析条件 充填剤：液相DEGS−ST〔ガスクロ工業（株）製〕10％ 担体UniportHP〔ガスクロ工業（株）製〕60〜80メツシ
ユ カラム:3mmφ×2mガラスカラム カラム温度:200℃ キヤリアガス：窒素 検出器：水素炎イオン化検出器（F.I.D） 実施例 ２ 直径3cm、高さ50cmのガラス製カラムに30cmの高さまで
スチレンとジビニルベンゼンの共重合物である三菱化成
（株）製の非極性吸着樹脂ダイヤイオンHP−20を充填し
た。GLC analysis conditions Packing agent: Liquid phase DEGS-ST [Gaskuro Industry Co., Ltd.] 10% Carrier Uniport HP [Gaskuro Industry Co., Ltd.] 60-80 Mesh Column: 3 mmφ × 2 m glass column Column temperature: 200 ° C Carrier gas: Nitrogen Detector: Hydrogen flame ionization detector (FID) Example 2 Non-polar adsorption resin manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd., which is a copolymer of styrene and divinylbenzene up to a height of 30 cm in a glass column having a diameter of 3 cm and a height of 50 cm. It was filled with Diaion HP-20.
85％メタノール水1000mlと100mlのｎ−ヘキサンを２
の分液ロートに入れ、振とう、分配したところ、ｎ−ヘ
キサン飽和の85％メタノール水1038mlが得られた。85% methanol water 1000 ml and 100 ml n-hexane 2
The mixture was placed in a separatory funnel, shaken and distributed to obtain 1038 ml of 85% methanol water saturated with n-hexane.
このｎ−ヘキサン飽和の85％メタノール水を溶離液とし
て上記非極性吸着樹脂層に流し込み、充填層の気泡を取
り除き、充填層最上部がわずかに露出するまで上記カラ
ムの下部から溶離液を流して止め、目的とするエイコサ
ペンタエン酸エチルを40％含有する脂肪酸エチル混合物
6.4gを負荷した。このものは、GLCによる分析の結果、
エイコサペンタエン酸エチル40％の他に、20種類ほどの
脂肪酸エチルを合計60％含んでいた。カラムの下部から
溶離液を流出させ、脂肪酸エチル混合物を完全に樹脂層
にしみ込ませて溶離液の流出を止めた。ついでカラムの
充填層上部の空間に溶離液を流し込みながら溶離液をこ
のカラムの下部から毎分18mlの流速で流出させ、初めの
500mlを三角フラスコに取つた。続けて流出してくる溶
離液を別の三角フラスコに取つた。そして、初めの500m
lの溶離液を１の分液ロートに入れ、溶離液量の1/10
の量である50mlのｎ−ヘキサンで３回、合計150mlのｎ
−ヘキサンで溶質の抽出を行ない、この150mlのｎ−ヘ
キサンを蒸留、濃縮して第１画分の溶質を得た。85% methanol water saturated with n-hexane was poured into the non-polar adsorption resin layer as an eluent to remove bubbles in the packed bed, and the eluent was poured from the lower part of the column until the top of the packed bed was slightly exposed. A mixture of fatty acid ethyl containing 40% of the desired ethyl eicosapentaenoate
6.4g was loaded. This is the result of GLC analysis,
In addition to 40% ethyl eicosapentaenoate, it contained 60% in total of about 20 fatty acid ethyl esters. The eluent was allowed to flow out from the lower part of the column, and the fatty acid ethyl mixture was completely permeated into the resin layer to stop the eluent from flowing out. Then, while the eluent was being poured into the space above the packed bed of the column, the eluent was allowed to flow out from the lower part of this column at a flow rate of 18 ml / min.
500 ml was collected in an Erlenmeyer flask. The eluent that continuously flowed out was collected in another Erlenmeyer flask. And the first 500m
Put 1 l of eluent into the separatory funnel of 1 and make it 1/10 of the amount of eluent.
Of 50 ml of n-hexane three times, for a total of 150 ml of n-hexane
The solute was extracted with -hexane, and 150 ml of this n-hexane was distilled and concentrated to obtain a solute as a first fraction.
一方、溶質が抽出された後の溶離液は、再びカラムの上
部に流し込みカラムクロマトグラフイーを続け、上記と
同様にして第12画分までの溶質を得た。このようにして
得られた画分をそれぞれGLCによつて分析した結果、目
的とするエイコサペンタエン酸エチルは、第11と12画分
に分画されており、それぞれの含有率は96.3％および9
8.1％、また収量は1.3gおよび0.8gであつた。On the other hand, the eluent after the solute was extracted was poured again into the upper part of the column to continue column chromatography, and solutes up to the 12th fraction were obtained in the same manner as above. As a result of analyzing each of the thus obtained fractions by GLC, the objective ethyl eicosapentaenoate was fractionated into the 11th and 12th fractions, and the respective content rates were 96.3% and 9%.
The yield was 8.1% and the yields were 1.3 g and 0.8 g.
なお、上記実施例中のGLC分析は実施例１と同じ条件で
行なつた。The GLC analysis in the above examples was conducted under the same conditions as in Example 1.
実施例 ３ アセトニトリル180ml、メタノール90ml、水30mlを分液
ロートに入れ、振とう、混合した後、これにｎ−ペンタ
ン30mlを加えて分配したところ、ｎ−ペンタン飽和のア
セトニトリル、メタノール、水の混合溶媒約310mlが得
られ、これを溶離液とした。Example 3 180 ml of acetonitrile, 90 ml of methanol and 30 ml of water were placed in a separating funnel, shaken and mixed, and then 30 ml of n-pentane was added to the mixture for distribution. Mixing of n-pentane-saturated acetonitrile, methanol and water. About 310 ml of a solvent was obtained and was used as an eluent.
直径2.2cm、高さ50cmの中圧液体クロマトグラフイー用
ガラスカラムにオクタデシル基を化学結合により保持し
たシリカゲル系のカラムクロマトグラフイー用充填剤で
あるMERCK社製のLi Chroprep RP−18（15〜25μｍ）190
mlを上記の溶離液とともに湿式充填した。MERCK's Li Chroprep RP-18 (15 ~, which is a silica gel-based column chromatographic packing material in which a octadecyl group is held by a chemical bond in a glass column for medium pressure liquid chromatography with a diameter of 2.2 cm and a height of 50 cm 25 μm) 190
ml was wet filled with the above eluent.
目的とするエイコサペンタエン酸エチルを44.6％、ドコ
サヘキサエン酸エチルを24.1％含有し、その他に20種類
程度の脂肪酸エチルを合計31％含有することがGLC分析
によつて確認された脂肪酸エチル混合物3.8gを、上記カ
ラムの充填層最上部に負荷し、定量ポンプで3.5Kg/cm2
ほどの定圧で溶離液を送り込みながら、カラムの下部か
ら毎分1.8mlの流速で溶離液を流出させ、これを直径2c
m、高さ150cmの液々向流抽出装置のカラムの上部から下
部に向かつて流し、抽出のための溶媒であるｎ−ペンタ
ンを上記の液々向流抽出装置のカラムの下部から上部に
向かつて毎分0.6mlの流速で流して溶離液から溶質の抽
出を行なつた。It contained 44.6% of the target ethyl eicosapentaenoate, 24.1% of ethyl docosahexaenoate, and a total of 31% of about 20 other fatty acid ethyls, a total of 31%, which was confirmed by GLC analysis. , Loaded on top of packed bed of the above column, 3.5 Kg / cm 2 by metering pump
While the eluent was being sent at a constant pressure, the eluent was discharged from the bottom of the column at a flow rate of 1.8 ml / min.
Flowing from the upper part to the lower part of the column of the liquid-liquid countercurrent extraction device having a height of 150 cm, the solvent for extraction, n-pentane, is directed from the lower part to the upper part of the column of the liquid-liquid countercurrent extraction device. The solute was extracted from the eluent at a flow rate of 0.6 ml / min.
溶質がｎ−ペンタンによつて抽出され液々向流抽出装置
のカラムの下部から流出した溶離液は、再び上記のカラ
ムクロマトグラフイーの溶離液として使用し、溶質を抽
出して液々向流抽出装置のカラムの上部から流出するｎ
−ペンタンは、15mlずつでフラクシヨン１〜10まで分画
し、それぞれ蒸留し、溶媒を留去した後、GLC分析を行
なつた。GLC分析の結果、フラクシヨン７を蒸留、濃縮
して得られた画分は1.07gでエイコサペンタエン酸エチ
ルの含有率93.6％であり、またフラクシヨン９を蒸留、
濃縮して得られた画分は0.48gで、ドコサヘキサエン酸
エチルの含有率は96.2％であつた。The eluent extracted from the solute with n-pentane and flowing out from the lower part of the column of the liquid-current countercurrent extraction device is used again as the eluent of the above-mentioned column chromatography to extract the solute and carry out the liquid-current countercurrent flow. N flowing out from the upper part of the column of the extractor
-Pentane was fractionated into fractions 1 to 10 with 15 ml each, distilled respectively, and the solvent was distilled off, followed by GLC analysis. As a result of GLC analysis, the fraction obtained by distilling and concentrating the fraction 7 was 1.07 g, which had an ethyl eicosapentaenoate content of 93.6%, and the fraction 9 was distilled.
The fraction obtained by concentration was 0.48 g, and the content of ethyl docosahexaenoate was 96.2%.
なお、上記実施例中のGLC分析は実施例１と同じ条件で
行なつた。The GLC analysis in the above examples was conducted under the same conditions as in Example 1.
実施例 ４ 90％エタノール水400mlとシクロヘキサン200mlを分液ロ
ートに入れ、振とう、分配したところ、シクロヘキサン
飽和のエタノール水約512mlが得られ、これを溶離液と
した。Example 4 400 ml of 90% ethanol water and 200 ml of cyclohexane were placed in a separating funnel, shaken and distributed to obtain about 512 ml of cyclohexane saturated ethanol water, which was used as an eluent.
実施例３で使用したものと同じカラムに実施例３で使用
したものと同じカラムクロマトグラフイー用充填剤190m
lを上記溶離液とともに湿式充填して、コンデイシヨニ
ングを行なつた。The same column as that used in Example 3 and the same column as that used in Example 3 190 m packing material for chromatography
1 was wet-filled with the above eluent to perform conditioning.
α−トコフエロルを30.5％、γ−トコフエロールを41.3
％、δ−トコフエロールを28.2％含有することをGLC分
析によつて確認したトコフエロール混合物5.7gを上記カ
ラムの充填層最上部に負荷し、定量ポンプで2.5Kg/cm2
ほどの定圧でカラムへの溶離液を送り込みながら、カラ
ムの下部から毎分1.0mlの流速で溶離液を流出させ50ml
で１分画とした。分画した溶離液は、１分画分ずつ分液
ロートに入れ、5mlずつのシクロヘキサンで３回、溶質
の抽出を行ない、溶質が抽出された後の溶離液は、再び
カラムクロマトグラフイーの溶離液として使用した。溶
質を抽出したシクロヘキサンは、蒸留、濃縮して溶質を
得た。α-tocopherol 30.5%, γ-tocopherol 41.3%
%, Δ-tocopherol containing 28.2% 25.7% was confirmed by GLC analysis tocopherol mixture 5.7g was loaded on the top of the packed bed of the column, 2.5Kg / cm 2 by a metering pump.
While feeding the eluent to the column at a constant pressure of approx. 50 ml, let the eluent flow out from the bottom of the column at a flow rate of 1.0 ml per minute.
1 was fractionated. The fractionated eluent was placed in a separatory funnel with 1 fraction each, and solute was extracted 3 times with 5 ml of cyclohexane. The eluent after the solute was extracted was again eluted by column chromatography. Used as a liquid. The cyclohexane from which the solute was extracted was distilled and concentrated to obtain a solute.
以上のようにして１〜20までの溶質画分、すなわちトコ
フエロール画分を得、それぞれGLC分析を行なつたとこ
ろ、第８画分ではα−トコフエロール含有率93.9％のも
のが1.3g、第11画分ではγ−トコフエロール含有率95.3
％のものが1.9g、第14画分ではδ−トコフエロール含有
率93.4％のものが1.2g得られた。As described above, solute fractions 1 to 20, that is, tocopherol fractions were obtained and subjected to GLC analysis. As a result, in the eighth fraction, 1.3 g of α-tocopherol content 93.9%, The fraction contained γ-tocopherol content of 95.3
% And 1.9 g of the 14th fraction, and 1.2 g of delta-tocopherol content 93.4% were obtained.
上記実施例中のGLC分析は、下記の条件で行ない、面積
百分率で含有率を表示した。The GLC analysis in the above examples was carried out under the following conditions, and the content rate was expressed as an area percentage.
GLC分析条件 充填剤：液相Silicone GE SE−30〔信和化工（株）製〕
1.5％ 担体Shimalite W〔信和化工（株）製〕80〜100メツシユ カラム:3mmφ×2.1mガラスカラム カラム温度:260℃ キヤリアガス：窒素 検出器：水素炎イオン化検出器（F.I.D.） 実施例 ５ 80％ｎ−プロパノール水８とイソオクタン２を分配
したところ、9.2のイソオクタン飽和のｎ−プロパノ
ール水が得られ、これを溶離液とした。GLC analysis conditions Filler: Liquid phase Silicone GE SE-30 [Shinwa Kako Co., Ltd.]
1.5% carrier Shimalite W [manufactured by Shinwa Kako Co., Ltd.] 80-100 mesh column: 3 mmφ x 2.1 m glass column Column temperature: 260 ° C Carrier gas: Nitrogen detector: Hydrogen flame ionization detector (FID) Example 5 80% n When propanol water 8 and isooctane 2 were partitioned, 9.2 isooctane-saturated n-propanol water was obtained, which was used as an eluent.
直径5cm、高さ1mのガラス製カラムに、スチレンとジビ
ニルベンゼンの共重合物を母体とした三菱化成（株）製
の非極性吸着樹脂セパビーズSP−207を55cmの高さまで
充填し、上記の溶離液をこのカラムに流し込み、セパビ
ーズSP−207の充填層を溶離液で満たし、充填層中の気
泡を取り除いた後、充填層の最上部がわずかに露出する
までカラムの下部から溶離液を流出させた。A glass column with a diameter of 5 cm and a height of 1 m was filled up to 55 cm with non-polar adsorbent resin SepaBeads SP-207 manufactured by Mitsubishi Kasei Co., which has a copolymer of styrene and divinylbenzene as a base material, and the above elution was performed. Pour the liquid into this column, fill the packed bed of SepaBeads SP-207 with the eluent, remove the bubbles in the packed bed, and then let the eluent flow out from the bottom of the column until the top of the packed bed is slightly exposed. It was
ブラシカステロール9.2％、カンペステロール28.3％、
スチグマステロール13.2％、β−シトステロール49.3％
を含有することがGLC分析によつて確かめられた植物ス
テロール混合物からβ−シトステロールを分離すること
を目的としてこの植物ステロール混合物9.8gを150mlの
ｎ−プロパノールに溶解し、カラムの内壁を伝わらせな
がらゆるやかに上記充填層上に注ぎ入れた。カラムの下
部から溶離液を毎分10mlの速度で流出させ、上記の植物
ステロール混合物のｎ−プロパノール溶液が、充填層に
完全に浸透したところで、溶離液の流出を止めた。この
充填層上に溶離液を注ぎ入れカラムの下部から毎分50ml
ずつ溶離液を流出させ、１分画分を２として、初めの
２を三角フラスコに取つた。続けて流出してくる溶離
液を別の三角フラスコに取つた。そして初めの２を分
液ロートに入れ、200mlずつのイソオクタンで３回、合
計600mlのイソオクタンで溶質の抽出を行なつた。Brush casterol 9.2%, campesterol 28.3%,
Stigmasterol 13.2%, β-sitosterol 49.3%
Was isolated by GLC analysis for the purpose of separating β-sitosterol from the plant sterol mixture, 9.8 g of this plant sterol mixture was dissolved in 150 ml of n-propanol, while passing through the inner wall of the column. Poured slowly onto the packed bed. The eluent was allowed to flow out from the lower part of the column at a rate of 10 ml / min, and the eluent was stopped when the solution of the plant sterol mixture in n-propanol completely penetrated the packed bed. Pour the eluent over this packed bed and feed 50 ml / min from the bottom of the column.
The eluent was flown out of each, and the first fraction was set to 2, and the first 2 was placed in an Erlenmeyer flask. The eluent that continuously flowed out was collected in another Erlenmeyer flask. Then, the first 2 was placed in a separating funnel, and solute was extracted three times with 200 ml of isooctane each and with a total of 600 ml of isooctane.
溶質の抽出が終了した溶離液は、再びカラムの上部に注
ぎ入れ、カラムの溶離液として使用し、このようにして
第１〜23番目までの分画を行なつた。これらは蒸留、濃
縮してイソオクタンを留去した後、それぞれGLC分析を
行なつた。GLC分析の結果、第20番目の画分はβ−シト
ステロール含有率が92.7％であることがわかつた。この
ものの収量は2.8gであつた。The eluent after completion of solute extraction was poured again into the upper part of the column and used as an eluent for the column, and fractions 1 to 23 were thus obtained. These were distilled and concentrated to remove isooctane and then subjected to GLC analysis. As a result of GLC analysis, it was found that the 20th fraction had a β-sitosterol content of 92.7%. The yield of this product was 2.8 g.
上記実施例中のGLC分析は、下記の条件で行ない、面積
百分率で含有率を表示した。The GLC analysis in the above examples was carried out under the following conditions, and the content rate was expressed as an area percentage.
GLC分析条件 充填剤：液相Silicone OV−17〔西尾工業（株）製〕２
％ 担体Chromosorb W−HP〔西尾工業（株）製〕100〜120メ
ツシユ カラム:3mmφ×2.1mガラスカラム カラム温度:270℃ キヤリアガス：窒素 検出器：水素炎イオン検出器（F.I.D.）GLC analysis conditions Filler: Liquid phase Silicone OV-17 [Nishio Industry Co., Ltd.] 2
% Carrier Chromosorb W-HP [manufactured by Nishio Industry Co., Ltd.] 100-120 mesh Column: 3 mm φ x 2.1 m glass column Column temperature: 270 ° C Carrier gas: Nitrogen Detector: Hydrogen flame ion detector (FID)
Claims (1)
ィー用カラムを用い、１種類または２種類以上の極性溶
媒に非極性溶媒を飽和量までの範囲の量添加したものを
溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーにおい
て、上記カラムの下部から流出する溶質を含んだ溶離液
に、これと二相に分離する状態となるように非極性溶媒
を添加、接触させることにより溶離液中の溶質を非極性
溶媒に移行、抽出させた後、この非極性溶媒と溶離液と
を分離し、溶質を抽出させた後の溶質を含まない溶離液
を再び上記カラムの上部に注ぎ、このカラム中の溶質を
溶離させることを特徴とする、疎水性の充填剤を使用す
るカラムクロマトグラフィーの溶離液の循環使用方法。1. A column using a chromatography column packed with a hydrophobic packing material and using as an eluent a non-polar solvent added to one or more polar solvents in an amount up to a saturated amount. In chromatography, a non-polar solvent is added to the eluent containing the solute flowing out from the lower part of the column so that the solute and the solute are separated into two phases. After elution and extraction, the non-polar solvent and the eluent are separated, and the solute-free eluent after extracting the solute is poured again into the upper part of the column to elute the solute in this column. A method of recirculating the eluent of column chromatography using a hydrophobic packing material, which comprises:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60157050A JPH0713632B2 (en) | 1985-07-18 | 1985-07-18 | Circulation of column chromatographic eluent using hydrophobic packing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60157050A JPH0713632B2 (en) | 1985-07-18 | 1985-07-18 | Circulation of column chromatographic eluent using hydrophobic packing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6219759A JPS6219759A (en) | 1987-01-28 |
| JPH0713632B2 true JPH0713632B2 (en) | 1995-02-15 |
Family
ID=15641097
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60157050A Expired - Lifetime JPH0713632B2 (en) | 1985-07-18 | 1985-07-18 | Circulation of column chromatographic eluent using hydrophobic packing |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| JP (1) | JPH0713632B2 (en) |
Families Citing this family (5)
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| JPH07113831B2 (en) * | 1990-03-20 | 1995-12-06 | ヤマハ株式会社 | Electronic musical instrument |
| JP3025590B2 (en) * | 1992-10-14 | 2000-03-27 | エーザイ株式会社 | Crude purification method |
| JP2933210B2 (en) * | 1996-11-29 | 1999-08-09 | ヤマハ株式会社 | Electronic musical instrument |
| JP2004346031A (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | Bios Ikagaku Kenkyusho:Kk | Vegetable trichogenous active ingredient and method for extracting and separating the same trichogenous active ingredient |
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-
1985
- 1985-07-18 JP JP60157050A patent/JPH0713632B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JPS6219759A (en) | 1987-01-28 |
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