JPH0698775A - ヒトサイトメガロウイルスゲノムの非必須遺伝子の同定及びヒトサイトメガロウイルスの阻害剤のスクリーニングの方法 - Google Patents

ヒトサイトメガロウイルスゲノムの非必須遺伝子の同定及びヒトサイトメガロウイルスの阻害剤のスクリーニングの方法

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JPH0698775A
JPH0698775A JP4201891A JP20189192A JPH0698775A JP H0698775 A JPH0698775 A JP H0698775A JP 4201891 A JP4201891 A JP 4201891A JP 20189192 A JP20189192 A JP 20189192A JP H0698775 A JPH0698775 A JP H0698775A
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Thomas R Jones
トーマス・アール・ジヨーンズ
Viera P Muzithras
ビエラ・ピー・ムジスラス
Yakov Gluzman
ヤコブ・グラズマン
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、β−グルクロニダーゼマーカー遺
伝子を特定のＨＣＭＶ遺伝子中に挿入して、ＨＣＭＶ遺
伝子の生成物が発現しない場合に遺伝子をＨＣＭＶの複
製に非−必須であると同定することによる、ヒトサイト
メガロウィルス（ＨＣＭＶ）ゲノムの非−必須遺伝子の
同定法に関する。本発明は、β−グルクロニダーゼマー
カー遺伝子をＨＣＭＶ遺伝子中に挿入し、酵素マーカー
を発現させ、分析系の複合化学物質を切断させて検出で
きる蛍光生成物又は変色を得ることによる、ＨＣＭＶを
阻害する化合物のスクリーニング法にも関する。本発明
はさらにＨＣＭＶの初期細胞変性効果を担う遺伝子を提
供する。 【効果】 ＨＣＭＶ感染患者の治療薬の合理的設計を可
能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明が関連する技術の現状をより十分に
述べるために、種々の文献を本出願を通じて括弧内のア
ラビア数字により引用する。各参照文献の目録全体を明
細書の最後、特許請求の範囲の前に列挙する。これらの
文献の内容をここに参照として本明細書に挿入する。
【０００２】
【発明の背景】ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）
はベータヘルペスウィルスで、免疫不全成人の重要な日
和見病原体であり、胎内で感染した乳児に神経の異常を
起こすことがある（１）。それらの感染患者は、網膜炎
及び全身性後遺症を含む種々の病気にかかり易い。ＨＭ
ＣＶの２３０キロベース（ｋｂ）ゲノムの構造は、別の
ヒトヘルペスウィルスであるヘルペスシンプレックスウ
ィルス（ＨＳＶ）の構造と類似している（２）。ＨＣＭ
Ｖは、長及び短非反復領域、ＵＬ及びＵＳを持ち、それ
らはそれぞれ逆方向反復により結合している。ＵＬ領域
は、ＴＲＬ（長鎖末端重複）領域及びＩＲＬ（長鎖逆方
向反復）領域により結合している。ＵＳ領域は、ＴＲＳ
（短鎖末端重複）領域及びＩＲＳ（短鎖逆方向反復）に
より結合している。全ＨＣＭＶゲノムの配列決定はすで
に完了した（３）。配列決定により、サイトメガロウィ
ルスゲノムが２００以上の有意な読み取り枠を持つこと
が示されている。今日まで、これらの読み取り枠がコー
ドするタンパク質の機能に関して成されている研究は比
較的少ない。
【０００３】ＨＳＶ系の場合、多くのウィルス遺伝子の
機能の研究においてウィルス変異体の分析が非常に貴重
であることがわかっている。いくつかのＨＳＶの温度−
感受性変異体につき記載がある。ＨＳＶ変異体の他の研
究は、ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子を特定部位の突
然変異誘発のための選択マーカーとして開発した（４−
７）。ミニ−Ｍｕファージ及びトランスポゾンＴｎ５を
用いたＨＳＶの任意突然変異誘発も記載がある（８，
９）。
【０００４】より最近になり、ＨＳＶゲノム中への特定
部位挿入に原核β−ガラクトシダーゼ遺伝子が用いら
れ、発色物質Ｘ−ガルを載せた後に青色プラークとして
ウィルス変異体を同定することが容易になった。必須遺
伝子中に変異がある条件致死変異体と対照的に、後者の
方法は非必須遺伝子中に変異を形成し、同定することが
できるという利点を与える。ＨＳＶ変異体の形成のため
のこのような良い方法は、ＨＣＭＶ系ではあまり用いら
れてこなかった。
【０００５】おそらくＨＣＭＶの複製サイクルが長いた
めに、このウィルスの温度−感受性変異体の形成又は分
析に関する報告はわずかである。組織培養（ヒト二倍体
繊維芽細胞）におけるＨＣＭＶの宿主域が限られている
ため、チミジンキナーゼ遺伝子の開発による突然変異誘
発は、非常に困難であっただろう。
【０００６】今日まで、ＵＬに結合した反復配列領域内
へのｂ−ガラクトシダーゼの挿入が、ＨＣＭＶのゲノム
へのマーカー遺伝子の唯一の成功した特定部位挿入であ
った（１２）。
【０００７】しかしこの組み換え体のゲノムＤＮＡ分析
（１２）により、挿入部位に隣接する５．５−ｋｂのウ
ィルスＤＮＡ配列が予期せぬ欠失を起こしたことが示さ
れた。この欠失を説明するひとつの仮説は、野生型ＤＮ
Ａの大きさが包含ウィルスＤＮＡの最大の大きさと非常
に近いために、他の場所における欠失により補正せずに
野生型ゲノムに大きな挿入を行うことができないという
ものである。
【０００８】現在、ＨＣＭＶ−感染患者に使用すること
が認可されている治療薬は少ない。Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，によりＣｙｔｏｖｅ
ｎｅTMの商品名で販売されているヌクレオシド類似体で
あるＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒが、ＨＣＭＶによって起こ
る網膜炎に対する使用を許可されている。しかしＧａｎ
ｃｉｃｌｏｖｉｒは、好中球減少症及び無精子症などの
副作用を伴う。さらに経口的に使用することが困難なの
で、静脈内投与をしなければならない。
【０００９】従って、副作用が少なく投与形態の改良さ
れたＨＣＭＶに対する別の治療薬が必要である。
【００１０】
【発明の概略】本発明は、特定部位挿入突然変異誘発に
よる、遺伝的に安定なβ−グルクロニダーゼマーカー−
発現ＨＣＭＶ組み換え体の構築を目的とする。ＨＣＭＶ
遺伝子の一部をβ−グルクロニダーゼ遺伝子で置換する
ことによりβ−グルクロニダーゼ遺伝子を挿入する。
又、β−グルクロニダーゼ遺伝子を挿入して２個かそれ
以上のＨＣＭＶ遺伝子の一部を置換する。別の場合、付
加によりβ−グルクロニダーゼ発現カセット遺伝子をＨ
ＣＭＶに挿入し、ウィルスゲノムの一部の欠失なしにそ
のＨＣＭＶ遺伝子（又は遺伝子間領域）を分裂させる。
【００１１】組み換えＨＣＭＶウィルスは、β−グルク
ロニダーゼ遺伝子が挿入された遺伝子の野生型遺伝子生
成物を発現しない。従ってウィルスが複製されると、挿
入部分を含むＨＣＭＶ遺伝子は、ウィルスの増殖に必須
ではない。非必須遺伝子は、それがないとウィルスが複
製されない必須遺伝子と区別される。非必須遺伝子は有
益な遺伝子であることができ、その場合はそのような有
益な遺伝子の置換により、野生型の遺伝子より非常にゆ
っくりと複製されるウィルスが得られる。それは植物及
び線虫系に広い用途を持つことが示されたが（２４）、
哺乳類系におけるマーカー遺伝子としてのβ−グルクロ
ニダーゼの利用は以前に報告されていない。
【００１２】これらのマーカー−発現組み換え体は２通
りの方法で使用され、（１）１個又はそれ以上のＨＣＭ
Ｖ遺伝子が組織培養中の増殖に非−必須であるかどうか
の確認のために；及び（２）ＨＣＭＶの阻害剤のスクリ
ーニングのための分析法において使用される。
【００１３】β−グルクロニダーゼ遺伝子を用いた挿入
による突然変異誘発は、ＵＳ及びＵＬ領域などのＨＣＭ
Ｖゲノムの種々の領域で、ならびにＵＳ及びＵＬに結合
する種々の反復領域で行うことができる。特に、ＨＣＭ
ＶゲノムのＵＳ領域にあり、限られたアミノ酸相同性を
分担して担っており（１４）、ｇｃＩＩなどの糖タンパ
ク質をコードすることができる（１５，１６）６個の読
み取り枠（ＵＳ６からＵＳ１１まで）を含むＵＳ６遺伝
子群内に挿入を行う。
【００１４】従って遺伝的に安定なβ−グルクロニダー
ゼマーカー遺伝子をＨＣＭＶゲノムの１個又はそれ以上
の遺伝子内に挿入することが、本発明の目的である。
【００１５】ＨＣＭＶウィルスゲノムの他の領域に欠失
を起こさずにこの挿入を行うことが、本発明のもうひと
つの目的である。
【００１６】β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を１
個又はそれ以上の特定のＨＣＭＶ遺伝子中に挿入し、そ
のような遺伝子のそれぞれの野生型生成物が発現されず
にウィルス複製が起こり、ＨＣＭＶゲノム中で他のＨＣ
ＭＶ遺伝子生成物が発現したら、そのような遺伝子のそ
れぞれをＨＣＭＶの複製に非−必須であると同定するこ
とにより、ＨＣＭＶの非−必須遺伝子を同定する方法を
示すことが、本発明のさらに別の目的である。
【００１７】β−グルクロニダーゼが哺乳類発現系にお
けるマーカー遺伝子としての使用に適していることを示
すのが、本発明の他の目的である。
【００１８】β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子をＨ
ＣＭＶの遺伝子に挿入して酵素マーカーを発現させ、Ｈ
ＣＭＶを阻害する化合物のスクリーニングに利用するの
は、本発明のもうひとつの目的である。
【００１９】本発明は、ＨＣＭＶのゲノム中へのβ−グ
ルクロニダーゼマーカー遺伝子（発現カセット）の挿入
を含む。この特定部位の突然変異誘発により構築された
組み換え体は安定であり、すなわち組み換えウィルスゲ
ノムが、低い感染の多重度における組織培養の継代に対
して安定である。β−グルクロニダーゼは、野生型ＨＣ
ＭＶ遺伝子の一部の置換により、又は野生型遺伝子への
付加により（野生型遺伝子を分断して）挿入する。置換
又は付加法の両方共、組み換えウィルス中で野生型ＨＣ
ＭＶ遺伝子の野生型生成物が発現するのを妨げる。置換
法は、２個又はそれ以上の遺伝子の部分を置換するため
のβ−グルクロニダーゼの挿入も含む。挿入は、ＵＳ及
びＵＬ領域、ならびにＵＳ及びＵＬに結合する反復領域
などの、ＨＣＭＶゲノム中の種々の領域に行うことがで
きる。
【００２０】挿入β−グルクロニダーゼ遺伝子を含む組
み換え体は、本発明の２つの具体化において利用する：
第１に、挿入物を含む遺伝子の発現及び組み換えウィル
スの複製を監視する。挿入により本来の遺伝子の野生型
生成物の発現が妨げられる。従ってウィルスが複製され
たら、遺伝子はウィルスの生存及び増殖、すなわち複製
に非−必須であると同定される。この方法を繰り返し用
いることにより、ウィルス複製に必須であるＨＣＭＶ遺
伝子の範囲を狭めることができる。そのような必須遺伝
子の同定は、ＨＣＭＶに対して活性な化合物の合理的薬
剤設計を容易にする。上記に従い、本発明は遺伝子が野
生型ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）複製に非−
必須であるかどうかを決定する方法を提供する。この方
法は、β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を野生型Ｈ
ＣＭＶゲノム中に挿入して遺伝子の発現を妨げ、それに
より組み換えＨＣＭＶゲノムを形成し、組み換えＨＣＭ
Ｖゲノムを適した宿主細胞に導入し、適した条件下で宿
主細胞を増殖してＨＣＭＶウィルス複製を起こし、子孫
ウィルスの存在に関して宿主細胞をスクリーニングする
段階から成る。子孫ウィルスの存在は、遺伝子が野生型
ＨＣＭＶゲノム又は複製に関して非−必須であることを
示す。核酸配列中へのマーカー遺伝子の“挿入”の方法
は、同業者に周知であり、種々の分子クローニング法を
含む。本文で使用する“導入”という言葉は、外からの
核酸分子を細胞中に挿入するどんな方法も含み、形質転
換、トランスフェクション、微量注射法及び宿主細胞の
ウィルス感染を含むがこれらに限られるものではない。
【００２１】この方法は、ＨＣＭＶビリオン膜糖タンパ
ク質の複合体であるＨＣＭＶの２種類かそれ以上の遺伝
子生成物の複合体の同定を助けるであろう。そして今度
は、複合体の成分についての情報が、ＨＣＭＶに対する
ワクチンの開発を容易にするであろう。
【００２２】ひとつの具体化において、内在プロモータ
ー又は（発現の量を増すための）異種プロモーターによ
り発現が調節されるβ−グルクロニダーゼマーカー遺伝
子を含む直線状プラスミドを持つゲノムＨＣＭＶ ＤＮ
Ａの導入により、組み換え構築物を形成する。（転写を
終結するための）ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）ポリ
アデニル化シグナルを含むことも有用である。
【００２３】ＨＣＭＶへのＤＮＡ挿入の正確性は、ウィ
ルスＤＮＡのサザン法ハイブリッド形成により分析す
る。ノザン法は、組み換えＨＣＭＶ株で感染させたヒト
包皮の繊維芽細胞からのＲＮＡを用いて行い、リボプロ
ーブとハイブリッド形成したＲＮＡの位置を決定する。
組み換えウィルス−感染繊維芽細胞溶菌物からのＨＣＭ
Ｖ遺伝子生成物の発現の分析は、多クローン性抗血清を
用いた免疫沈降により行う。組み換えウィルス−感染繊
維芽細胞の全タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、β−グルクロニダーゼの量へのプロモーターの影響
を決定する。組み換えウィルスの増殖曲線の研究によ
り、非−必須ＨＣＭＶ遺伝子がヒト繊維芽細胞における
ウィルスの増殖に有益であるかどうかがわかる。遺伝子
が有益であることが決定されたら、ＨＣＭＶに対する化
合物の合理的薬剤設計を容易にすることに利用できる。
【００２４】本発明の第２の具体化では、ＨＣＭＶの阻
害剤のスクリーニングのための分析法において、マーカ
ー−発現ＨＣＭＶ組み換え体を利用する。第２の具体化
は、ＨＣＭＶ遺伝子が置換されたり分断したりせず、Ｈ
ＣＭＶ遺伝子すべてが発現するようにβ−グルクロニダ
ーゼ遺伝子発現カセットを２個のＨＣＭＶ遺伝子間の遺
伝子間領域に挿入した組み換え体も利用する。従ってこ
の具体化は、ＨＣＭＶ複製を阻害する化合物の同定法で
ある。この方法は：野生型ＨＣＭＶ遺伝子の一部を置換
し、マーカー遺伝子の挿入により野生型遺伝子の生成物
の発現が妨げられる；野生型ＨＣＭＶ遺伝子に付加して
野生型を分断し、マーカー遺伝子の挿入により野生型遺
伝子の生成物の発現が妨げられる；２個又はそれ以上の
野生型ＨＣＭＶ遺伝子の部分を置換し、β−グルクロニ
ダーゼマーカー遺伝子の挿入により野生型遺伝子の生成
物の発現が妨げられる；及びβ−グルクロニダーゼマー
カー遺伝子を２個のＨＣＭＶ遺伝子の間に挿入し、ＨＣ
ＭＶ遺伝子の置換又は分断を起こさず、ＨＣＭＶ遺伝子
すべてを発現させる方法から成る群よりえらんだ方法
で、β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子をＨＣＭＶゲ
ノムに挿入し、ＨＣＭＶ組み換え体を構築する段階を含
む。その後組み換えＨＣＭＶを適した宿主細胞に挿入
し、宿主細胞をＨＣＭＶ複製に好ましい適した条件下で
成長させ、生成されるβ−グルクロニダーゼの量を測定
する。これらの段階を、試験化合物の存在下で繰り返
し、結果を比較し、試験化合物の存在下において生成さ
れるβ−グルクロニダーゼの量の減少又は生成の阻害に
より、ＨＣＭＶ複製を阻害する試験化合物を示す。
【００２５】本発明の第２の具体化の特徴のひとつとし
て、ＨＣＭＶ組み換え体は、複合化学物質を切断して蛍
光生成物を放出することができるβ−グルクロニダーゼ
を発現する。スクリーニングした試験化合物が必須の又
は有益なＨＣＭＶの機能を阻害すると、β−グルクロニ
ダーゼ発現の量が減少する。β−グルクロニダーゼの量
の減少により、複合物質の切断が減少する。切断が減少
すると蛍光生成物の量が減少し、それは試験化合物がＨ
ＣＭＶの阻害剤であることを示す。
【００２６】本発明の第２の具体化の別の特徴として、
ＨＣＭＶ組み換え体により発現したβ−グルクロニダー
ゼは、複合化学物質を切断して、切断されると変色を起
こす発色生成物を放出する。試験化合物が阻害剤の場合
は、複合化合物の切断が減少し、変色の程度が低下す
る。変色を視覚により、又は分光光度測定により監視す
る。
【００２７】上記の通り、今日までに報告された（１
２）唯一のマーカー−発現ＨＣＭＶ組み換えウィルス
は、ＵＬに結合している反復（すなわち二倍体）配列領
域内にβ−ガラクトシダーゼを含む。特定部位挿入／置
換突然変異誘発という遺伝的方法によりＨＣＭＶ遺伝子
の機能を研究するために、小さいマーカー遺伝子である
β−グルクロニダーゼに関してＨＣＭＶにおけるその有
用性を調べた。β−グルクロニダーゼは、植物、線虫及
び昆虫（バクロウィルス）系におけるマーカーとして利
用するのに適していることが報告されている（１３，１
９，２０）。哺乳類又は動物ウィルス系におけるマーカ
ー遺伝子としてのβ−グルクロニダーゼの利用は、報告
されていない。哺乳類細胞中の内在細胞β−グルクロニ
ダーゼ（２１）が、この遺伝子のマーカーとしての有用
性を無くしていると思われる。
【００２８】対照的に、β−ガラクトシダーゼは、（Ｈ
ＳＶを含む）多くの系で用いられてきた。しかしβ−ガ
ラクトシダーゼを利用したひとつの報告で、このＨＣＭ
Ｖ組み換え体（ＲＶ２５６）がβ−ガラクトシダーゼ挿
入の部位に隣接して欠失を含むことが報告された（２
３）。著者が提案したひとつの仮説は、β−ガラクトシ
ダーゼ挿入物の大きなサイズとＨＣＭＶウィルスキャプ
シドのＤＮＡサイズ包含限度が組み合わさって欠失が起
こるという説である。β−ガラクトシダーゼ−発現ＨＣ
ＭＶ組み換えＲＣ２５６のもうひとつの特徴は、非常に
不安定なことである（１２）。
【００２９】ＨＣＭＶは、組織培養の場合（ヒト包皮繊
維芽細胞（ＨＦＦ）を含んで）非常に少ない種類の細胞
にしか許容されず、このウィルスによる感染は、ある細
胞遺伝子の発現を賦活する。非感染の、及び野生型ＨＣ
ＭＶに感染したＨＦＦ細胞の両方共、非常に少量の内在
細胞β−グルクロニダーゼを発現することがわかってい
る。
【００３０】ＨＣＭＶ系における非−必須遺伝子に関す
る報告は発表されていないので、β−グルクロニダーゼ
がこの系におけるマーカーとなるかどうかを調べる方法
は、β−グルクロニダーゼ組み換えをＵＳ１０−ＵＳ９
遺伝子間領域に向けるプラスミドを設計することであ
る。ＨＣＭＶ ＵＳ６遺伝子群から発現された転写物
は、マッピングされている（１７）。わずかな量のリー
ドスルーＲＮＡが、ＵＳ１０及びＵＳ９間の遺伝子間領
域から転写される。
【００３１】本発明に従い、組み換えＨＣＭＶの同定の
ための、原核β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子の有
用性を示す。β−グルクロニダーゼは、比較的サイズが
小さいので、ＨＣＭＶ系におけるマーカー遺伝子として
β−ガラクトシダーゼより好ましい（３．１−ｋｂに対
して１．９−ｋｂ）。β−ガラクトシダーゼと同様に、
機能的β−グルクロニダーゼは、同一の６８−ｋｄサブ
ユニットモノマーから成る四量体となる傾向があり、非
常に安定である（１９）。β−ガラクトシダーゼの場合
に得られるすべての種類の発色基質（酵素切断により溶
解性、不溶解性又は蛍光生成物を生ずる）は、β−グル
クロニダーゼの場合も得られる。出願人等は、原核β−
グルクロニダーゼ遺伝子を含み発現する組み換えＨＣＭ
Ｖを（特定部位の方法で）構築し、単離し、多重度を特
性化した。単離したすべてのβ−グルクロニダーゼ−発
現ＨＣＭＶ組み換え体は、遺伝的に安定に見える。
【００３２】本発明の方法を用いて、ＨＣＭＶのＩＲＳ
１遺伝子を、ＨＣＭＶ−感染細胞の早期細胞変性効果
（“ＣＰＥ”）に必要な遺伝子として特別に同定する。
許容細胞のＨＣＭＶ感染後初期に、細胞が円形表現型を
示す形態上の変化が起こり、それが早期ＣＰＥと名付け
られた（３３，３７）。円形化は、感染後（“ｐ．
ｉ．”）約６時間で始まり、感染後約１２−２４時間で
最も顕著である。この時点で感染細胞は、典型的繊維芽
細胞の形態ではなく、非常に収縮して見える。感染後２
４時間で、細胞の弛緩が始まり、感染後４８−７２時間
までに、感染細胞は拡大した巨細胞性繊維芽細胞の形態
を示す。
【００３３】変異体ＲＶ６７０の表現型を調べることに
より、ＩＲＳ１遺伝子の機能を同定する。試験によりＲ
Ｖ６７０が、予想以上に広いウィルス遺伝子のクラスタ
ーの欠失を持つ構築物であることが明らかになる。これ
は、９個の主な読み取り枠（ＩＲＳ１，ＵＳ１−ＵＳ
３，ＵＳ６−ＵＳ９及びＵＳ１１と呼ばれる）が欠失し
ている。対照的に、Ｕ６群のみ（すなわちＵＳ６−ＵＳ
１１のみ）が欠失した変異体であるＲＶ３５（本文にて
より詳細に記載）は、依然として形態上の変化を引き起
こす。残る４個の遺伝子のどれが形態上の変化に必要か
を決定するために、これらの遺伝子を欠いた変異体を形
成する。読み取り枠ＵＳ１−ＵＳ３が欠失した変異体
は、表現型を引き起こす能力を保持しており、ＩＲＳ１
が欠失した変異体は、この能力を失っている。
【００３４】ＲＮＡブロット分析の結果は、ＩＲＳ１が
収縮表現型が現れるのと同時に転写されるので、それが
早期ＣＰＥを担っているという結論を支持している。Ｉ
ＲＳ１遺伝子から２個のｍＲＮＡが転写され、その中の
３．６−ｋｂメッセージは感染後初期及び後期に存在
し、１．３−ｋｂ転写物は初期に最も多く検出され、従
って初期円形化を担う遺伝子生成物であると思われる。
【００３５】従って、ＨＣＭＶ細胞における初期円形化
を引き起こすタンパク質生成物をコードする核酸配列
も、本発明により提供する。この核酸配列は、ＩＲＳ１
と称するＤＮＡ配列である。さらに本発明の目的の場
合、核酸分子はＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡであること
ができる。しかし本発明の好ましい具体化のほとんど
で、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００３６】本発明は、核酸分子を発現するために、す
なわち原核及び真核発現系で転写し（分子がＤＮＡの場
合）、ポリペプチドに翻訳するためにベクターに挿入さ
れた、上記のそれぞれの核酸分子を含む。本発明の実行
に有用な適した発現ベクターには、ｐＥＴ３ａ（４
６）、ｐＭａｌ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）、ｐＶＬ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹ
ＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＮＡ１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）及びｐＣＥＰ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含
まれる。しかし本発明の好ましい具体化の場合、ベクタ
ーｐＣＤＮＡ１が、真核細胞の発現のための発現ベクタ
ーである。同業者に周知の通り、本発明の核酸分子は、
ＲＮＡ転写のプロモーター、ならびに他の調節配列に作
動的に結合することができる。本文で使用する“作動的
結合”という言葉は、プロモーターがＲＮＡの転写を核
酸分子の外に向けるような位置を意味する。プロモータ
ーの例は、ＨＣＭＶの主要な即時−初期プロモーターで
ある。本発明のベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ
ｖｉｖｏに核酸の転写及び／又は翻訳が可能であるこ
とが好ましい。本発明の核酸分子の発現により生成され
る組み換えポリペプチドも提供する。
【００３７】後文で述べる組み換えポリペプチドの生成
及び本発明の核酸分子の発現のための宿主ベクター系を
提供する。宿主ベクター系は、前記で適した宿主の中に
記載したベクターのひとつを含む。本発明の目的の場
合、適した宿主には真核細胞、例えば哺乳類細胞、酵母
細胞又はバクロウィルス発現のための昆虫細胞が含まれ
るがこれらに限られるわけではない。適した哺乳類細胞
にはＣＯＳ細胞が含まれるがこれらに限られるわけでは
ない。適した原核細胞は、バクテリア細胞、ＨＢ１０１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ＬＹ
ｓＳを含むことができるが、これらに限られるわけでは
ない（４３）。従って本発明はさらに、これらのベクタ
ー系のいずれかを含む原核又は真核細胞を提供する。
【００３８】同業者には周知の通り、組み換えＤＮＡ法
には、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡ媒介物（ベクター）に
挿入し、宿主細胞中で複製することができる組み換えＤ
ＮＡ分子を形成する段階が含まれる。一般に挿入された
ＤＮＡ配列は、受け入れＤＮＡ媒介物にとって異種であ
り、すなわち挿入ＤＮＡ配列及びＤＮＡベクターは遺伝
情報の交換を自然には行わない生物から誘導するか、又
は挿入ＤＮＡ配列が、完全に又は部分的に人工であるこ
とができる情報を含むが、必ずそうではない。組み換え
ＤＮＡ分子を構築することができるいくつかの一般的方
法が開発されている。例えばＣｏｈｅｎ ａｎｄ １Ｂ
ｏｙｅｒによるＵ．Ｓ．特許４，２３７，２２４は、制
限酵素を用いたＤＮＡの切断及び周知の連結法によるＤ
ＮＡ片の結合を用いた組み換えプラスミドの生成につき
記載している。
【００３９】その後これらの組み換えプラスミドを形質
転換又はトランスフェクションを用いて原核生物及び真
核生物を含む単細胞培養ならびに組織培養で増殖した真
核細胞に導入し、その中で複製する。そこに記載の方法
は、汎用であるので、Ｕ．Ｓ．特許４，２３７，２２４
をここで本明細書に参照として挿入する。組み換えＤＮ
Ａ分子を単細胞生物に導入する他の方法が、Ｕ．Ｓ．特
許４，３０４，８６３にＣＯｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｈｏ
ｈｎにより記載されており、これもここに参照として挿
入する。この方法は、バクテリオファージベクター（コ
スミド）を用いた普遍形質導入を使用した。
【００４０】核酸配列は、ワクシニアウィルス又はバク
ロウィルスなどのウィルス中にも挿入することができ
る。そのような組み換えウィルスは、例えばウィルスに
感染した細胞中へのプラスミドのトランスフェクション
により生成することができる、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ
等、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３
４０２−３４０９。
【００４１】さらに、適した複製、転写及び翻訳信号の
すべてを組み換えＤＮＡ分子上に正しく配置すると、形
質転換又はトランスフェクション宿主細胞中に異種遺伝
子が正しく発現する。
【００４２】種々の遺伝信号及びプロセシング現象が、
種々の段階で遺伝子の発現を調節する。例えばＤＮＡ転
写はある段階であり、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）翻訳は他の段階である。ＤＮＡの転写はプロモータ
ーの存在に依存しており、それはＲＮＡポリメラーゼの
結合を指示してＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であ
る。真核プロモーターのＤＮＡ配列は、原核プロモータ
ーのＤＮＡ配列と異なる。さらに真核プロモーター及び
それに伴う遺伝信号は、原核系で認識されることも、機
能することもできない。
【００４３】クローニングした遺伝子の発現に成功する
には、有効なＤＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻訳、及びある
場合にはタンパク質の翻訳後修正が必要である。クロー
ニングした遺伝子からのタンパク質合成を増すための発
現ベクターが開発された。発現ベクターでは、多くの場
合クローニングした遺伝子が強力なプロモーターの隣に
位置し、プロモーターは、必要な場合に転写を開始する
よう調節することができる。細胞を高濃度に増殖し、そ
の後プロモーターを誘導して転写物の数を増すことがで
きる。これらは、有効に翻訳されれば、ポリペプチドを
高収率で与える。異種タンパク質が宿主細胞に有害な場
合、これは特に有用な系である。
【００４４】上記の組み換えポリペプチドの生成法も提
供する。この方法は、本発明の核酸及び／又は本発明の
宿主ベクター系を含む宿主細胞を、適した条件下で増殖
し、ポリペプチドを生成させ、得られた生成組み換えポ
リペプチドを回収する段階を含む。
【００４５】早期ＣＰＥ−関与タンパク質をコードする
核酸の存在を試料中で検出する方法を、さらに本発明に
より提供する。この方法は、感染細胞のＤＮＡ又はＲＮ
Ａを単離し、単離した核酸を適したハイブリッド形成条
件下で標識ＩＲＳ１ ｃＤＮＡと接触させ、標識ＩＲＳ
１ ＤＮＡとＤＮＡ−ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ−ＲＮＡ複
合体を形成させ、そのようにして形成した複合体の存在
を検出する段階を含み、複合体の存在は、細胞がこの遺
伝子を持つ又は発現していることを肯定的に示してい
る。同業者は、この方法がサザン法又はノザン法ハイブ
リッド形成であることがわかるであろう（５３参照）。
【００４６】本発明の２つの具体化で用いるβ−グルク
ロニダーゼマーカー−発現組み換えＨＣＭＶは、以下の
要領で構築する：本来のゲノム（野生型）ＤＮＡを含む
ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ５３８）から入手し、制限エンドヌクレアーゼ消化を
施してＤＮＡフラグメントを得る。所望のＨＣＭＶ遺伝
子のためのＤＮＡ（すなわち目的とする挿入の部位をフ
ランキングするＤＮＡ）、所望の遺伝子のプロモーター
又は他のＨＣＭＶプロモーター（例えば２．７Ｅプロモ
ーター）、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子、
及び任意にＨＳＶ−１ ｔｋ ポリアデニル化シグナル
フラグメントを含むプラスミドを構築する。
【００４７】多数のプラスミドの構築の詳細を、実施例
１及び８に示す。他のプラスミドは、本文に記載の方法
を用いて構築する。
【００４８】各プラスミドを非反復制限部位で直線化
し、感染ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡと共にＨＦＦ細胞中にコ
−トランスフェクションする。ＨＦＦ細胞などの細胞上
にプレート化することにより、β−グルクロニダーゼ−
発現組み換えＨＣＭＶ変異体に関するスクリーニングを
行う。感染細胞に、β−グルクロニダーゼの発色基質を
含む培地を載せる。酵素切断基質の色である青色を呈す
るプラークは、組み換えマーカー−発現ウィルスを含
む。プラーク精製を行って組み換えウィルスを得る。
【００４９】前記の方法を用いて、１個又はそれ以上の
ＨＣＭＶ遺伝子の一部がβ−グルクロニダーゼ遺伝子で
置換された、又はβ−グルクロニダーゼ遺伝子が挿入さ
れ、ＨＣＭＶ遺伝子が分断した組み換えウィルスを構築
する。両方の種類の構築物は、そのような置換又は分断
遺伝子の野生型遺伝子生成物を発現することはできな
い。両方の種類の構築物を非−必須ＨＣＭＶ遺伝子のス
クリーニングに用い、又ＨＣＭＶの阻害剤のスクリーニ
ングに使用することができる。１個の遺伝子が置換され
た組み換えＨＣＭＶの例（実施例１に記載）には、ＲＶ
６９９、ＲＶ１３１、ＲＶ１４５、ＲＶ７２５、ＲＶ６
９及びＲＶ９２が含まれる。２個又はそれ以上の遺伝子
が置換された組み換えＨＣＭＶの例には、ＲＶ６７、Ｒ
Ｖ８０、ＲＶ１０１及びＲＶ６７０が含まれる。遺伝子
が分断した組み換えＨＣＭＶの例には、ＲＶ１０２、Ｒ
Ｖ８８及びＲＶ９１が含まれる。
【００５０】さらにβ−グルクロニダーゼは、２個のＨ
ＣＭＶ遺伝子の間に挿入し、これらの２個の遺伝子生成
物の発現を妨げないこともできる。そのような構築物
は、ＨＣＭＶの阻害剤のスクリーニングに使用するのに
適している。遺伝子間挿入を含む組み換えＨＣＭＶの例
は、ＲＶ１３４である。
【００５１】表１は、前記で挙げたＨＣＭＶ組み換えウ
ィルスのまとめである：
【００５２】
【表１】 表１ ウィルス ＯＲＦ 置換／分裂 備考 ＲＶ１３４ なし Ａ ＲＶ６９９ ＵＳ１１ Ｂ ＲＶ１３１，ＲＶ１４５ ＵＳ１０ Ｂ ＲＶ６７ ＵＳ１１及びＵＳ１０ Ｂ ＲＶ８０ ＵＳ９及びＵＳ８ Ｂ ＲＶ７２５ ＵＳ７ Ｂ ＲＶ６９ ＵＳ６ Ｂ ＲＶ１０２ ＵＳ１３ Ｃ ＲＶ８８ ＵＳ１２ Ｃ ＲＶ９１ ＵＳ２７ Ｄ ＲＶ９２ ＵＳ２８ Ｄ ＲＶ１０１ ＵＳ２７及びＵＳ２８ Ｄ ＲＶ６７０ ＵＳ１１，ＵＳ９−ＵＳ１及びＩＲＳ１ Ｂ，Ｅ ＲＶ３５ ─────────────────────────────────── Ａ：ＲＶ１３４は、ＵＳ１０及びＵＳ９間の遺伝子間領
域内への挿入を含む。
【００５３】Ｂ：ＨＣＭＶ ＯＲＦのＵＳ６からＵＳ１
１までは、有力な膜タンパク質遺伝子のＵＳ６群に含ま
れる（２５，２７，３８）。
【００５４】Ｃ：ＨＣＭＶ ＯＲＦのＵＳ１２及びＵＳ
１３は、膜に存在する、多重膜スパンドメインを持つタ
ンパク質をコードする（２５）。
【００５５】Ｄ：ＨＣＭＶ ＯＲＦのＵＳ２７及びＵＳ
２８は、周知のＧ−タンパク質カップリンングレセプタ
ーと相同の７個の推定膜スパンドメインを持つタンパク
質をコードする（３）。
【００５６】Ｅ：ＨＣＭＶ ＯＲＦのＩＲＳ１は、ＲＶ
６７０において欠失のないＴＲＳ１と部分的に相同であ
り（３）；ＯＲＦのＩＲＳ１は、ＯＲＦのＵＳ２２，Ｕ
Ｓ２３，ＵＳ２４及びＵＳ２５と関連しており（３）：
ＯＲＦのＵＳは、ＹＳ３１及びＵＳ３２と関連しており
（２５）；ＯＲＦのＵＳ２及びＵＳ３は、膜糖タンパク
質をコードすることができる（３）。
【００５７】ＲＶ１４５の試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
１３２０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に預託し、
ＡＴＣＣ受け入れ番号ＶＲ２３２９と定めた。ＲＶ１４
５は、ＲＶ１３１と同一の遺伝子置換を含むが、ＲＶ１
４５中では異種２．７Ｅプロモーターにより与えられる
β−グルクロニダーゼ発現の程度が高いので、ＨＣＭＶ
阻害剤のスクリーニングに使用するのが好ましい。実施
例１により得られる情報を用いて、同業者は実施例１の
他の組み換えＨＣＭＶを構築することができる。
【００５８】サザン法ＤＮＡ分析（図１６〜１８）によ
り、ＲＶ１３４、ＲＶ１３１、ＲＶ６９９及びＲＶ６７
に関して挿入の正確性を評価する。第１にＲＶ１３４の
組み換えゲノムは、ゲノム中の予想した位置にβ−グル
クロニダーゼ発現カセットを挿入して持つ（図２及び１
６）。図１７に示す通り、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘプローブ
からの２．９５−ｋｂＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメン
トプローブを、それぞれ野生型及びＲＶ１３４消化物中
の５．０２−ｋｂ及び７．８５−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ
ＤＮＡフラグメントにハイブリッド形成させる。ＨＣＭ
Ｖ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ ＤＮＡフラグメントの大きさ
は、β−グルクロニダーゼ発現カセットの挿入により
２．８３−ｋｂ増加する（図２）。ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘ
ｈｏＩ二重消化物の場合、予想された１．０６−ｋｂの
野生型フラグメントのみがＲＶ１３４中で変化による移
動性（３．９−ｋｂに）を示す（図１７）。ＲＶ１３４
からの７．８５−ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ及び３．９−ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメントの
みがβ−グルクロニダーゼプローブとハイブリッド形成
をし、野生型ＤＮＡフラグメントは、ハイブリッド形成
しない。
【００５９】他のサザン法ハイブリッド形成により、β
−グルクロニダーゼ発現カセット挿入の回りの領域は、
野生型と比較してＲＶ１３４が変化していないことがわ
かる。例えば隣接するＨｉｎｄＩＩＩ−Ｑフラグメント
からの２．８３−ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラ
グメントプローブは、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物中の予想さ
れた結合及び末端（不均一ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｑ）フラグ
メントに、及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ二重消化物中
の単一２．８３−ｋｂフラグメントにハイブリッド形成
する（図１８）。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ及びその隣接Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−ＶＤＮＡフラグメントの両方にハイブリッ
ド形成する１．８−ｋｂＸｂａＩ／ＰｓｔＩプローブを
用いて、β−グルクロニダーゼ挿入物を含む前者のＤＮ
Ａ制限フラグメントのみが、野生型ＨＣＭＶ ＤＮＡの
対応する部分と比較してＲＶ１３４ ＤＮＡ中で電気泳
動の移動性を示すことが示される（図１８）。全ＨＣＭ
ＶゲノムＤＮＡプローブ及び非反復長鎖領域からのプロ
ーブを用いて、ＲＶ１３４ゲノムに予想された変化は明
らかにならない。データは、ＲＶ１３４ゲノム中へのβ
−グルクロニダーゼ発現カセットの組み換えが期待通り
に起こったことを示す。
【００６０】２．９５−ｋｂＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラ
グメント及びβ−グルクロニダーゼプローブは、それぞ
れＲＶ６９９及びＲＶ１３１の消化物中の６．７−及び
６．５−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントとハ
イブリッド形成する（図１７）。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ
ＤＮＡフラグメントの大きさの増加（野生型では５．０
２−ｋｂ）は、挿入により予想されるゲノムの大きさの
正味の増加（ＲＶ６９９で１．６８−ｋｂ及びＲＶ１３
１で１．４９−ｋｂ）を反映している（図３及び４）。
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ領域内のβ−グルクロニダーゼ挿入
の正しい位置を、これらのプローブをウィルスＤＮＡの
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化物にハイブリッド形成す
ることにより確認する。２．９５−ｋｂＸｂａＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘから）フラグメントは、野
生型ＤＮＡからの１．１７−、１．０６−及び２．７８
−ｋｂフラグメントにハイブリッド形成する。
【００６１】ＲＶ６９９の場合、１．１７−ｋｂフラグ
メントのみが変化し、大きさが２．８５−ｋｂに増加す
る（そしてこのブロットに使用したゲル中を２．７８−
ｋｂフラグメントと共に移動し；ＳｓｔＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化物により確認される）。ＲＶ１３
１の場合、β−グルクロニダーゼ遺伝子挿入により、
１．１７及び１．０６−ｋｂフラグメントの結合部にあ
るＸＨＯＩ制限部位が消失する（図１６）。得られるフ
ラグメントは、３．７３−ｋｂであり；２．７８−ｋｂ
フラグメントは不変のままである（図１７）。ＲＶ６９
９からの２．８５−ｋｂフラグメント及びＲＶ１３１か
らの３．７３−ｋｂフラグメントは、両方とも２．９５
−ｋｂＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント及びβ−グル
クロニダーゼ遺伝子プローブとハイブリッド形成する
（図１７）。
【００６２】上記のＲＶ１３４に関する記載と同一の方
法の場合、ＲＶ６９９及びＲＶ１３１中のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−Ｘフラグメントに隣接する領域（ＨｉｎｄＩＩＩ−
Ｑ及びＨｉｎｄＩＩＩ−Ｖフラグメント）は、検出でき
るような変化を含まない（図１８）。全ＨＣＭＶゲノム
プローブ及び非反復長鎖領域からのプローブを用いて、
組み換えウィルスゲノムに予想される変化は、明らかに
ならない。
【００６３】ＵＳ１１コード領域全体及びＵＳ１０コー
ド領域のほとんどを含む１．１２−ｋｂ領域を、ＵＳ１
１プロモーター（図５）の調節下でβ−グルクロニダー
ゼで置換したＲＶ６７を構築し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘフ
ラグメントの大きさが正味で０．７８−ｋｂ増加する。
前記の組み換えウィルスに関する記載と類似方法でサザ
ン法を行い、ＨＣＭＶゲノムに予想された変化のみが起
こることが明らかになる。２．９５−ｋｂＸｂａＩ／Ｅ
ｃｏＲＩフラグメント及びβ−グルクロニダーゼプロー
ブ（それぞれ図１６及び１７）は、５．８−ｋｂＨｉｎ
ｄＩＩＩ及び３．０−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフ
ラグメントとハイブリッド形成する。後者は、融合（Ｘ
ｈｏＩ部位は、除去配列の一部なので）野生型１．０６
−ｋｂＸｈｏＩ及び１．１７−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘ
ｈｏＩフラグメント内への挿入を示す（図１６）。前記
と同様に、隣接ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｑ又は−Ｖ領域（図１
８）において、又はＲＶ６７ゲノム中の他の領域におい
て変化は検出されない。
【００６４】ＲＶ１３４の速度論的分類による転写物の
ＲＮＡブロットは、予想される２．２−ｋｂメッセージ
が、β−グルクロニダーゼプローブを用いて決定して感
染後初期及び後期に非常に多量に存在することを示し、
これは強力な２．７Ｅプロモーターの調節下における転
写物から予想されることである（図１９）。４．１−ｋ
ｂのリードスルー転写物も検出される。β−グルクロニ
ダーゼリボプローブは、野生型感染細胞からのＲＮＡと
ハイブリッド形成しない。
【００６５】ＲＶ１３４のＵＳ１０／９遺伝子間領域へ
の、このβ−グルクロニダーゼ発現カセットの挿入は、
隣接上流又は下流転写単位、それぞれＵＳ１１−ＵＳ１
０（１．５−及び０．９−ｋｂＲＮＡ；図１９）又はＵ
Ｓ９−ＵＳ８（１．７−ｋｂ；図２０）からのＲＮＡ発
現の速度論又は定常状態のレベルに、野生型と比較して
影響を与えない。
【００６６】野生型ウィルスからの転写物の以前の微細
マッピングに基づき（２８）、速度論的分類のＲＮＡの
ブロット分析により、それぞれＲＶ６９９及びＲＶ１３
１においてＵＳ１１及びＵＳ１０転写単位内にβ−グル
クロニダーゼ遺伝子が正しく挿入されたことが確認され
る（図２２及び２５）。要するに野生型ウィルスの場
合、１．５−ｋｂの初期転写物はＵＳ１１の上流から始
まり、ＵＳ１０の下流のポリアデニル化部位で終わる。
又、０．９−ｋｂの転写物は、ＵＳ１０の上流から始ま
り、１．５−ｋｂ ＲＮＡと３’共通末端となる（従っ
てＵＳ１０リボプローブは、両方の転写物とハイブリッ
ド形成する；図１９）。
【００６７】ＲＶ６９９へのβ−グルクロニダーゼ遺伝
子挿入のために、野生型の１．５−ｋｂ ＵＳ１１−Ｕ
Ｓ１０転写物の大きさは、約３．２−ｋｂに増加し（図
２３）、β−グルクロニダーゼ（図２２）、ＵＳ１０
（図２２）及びＵＳ１１（図２２）リボプローブとハイ
ブリッド形成する。０．９−ｋｂ ＵＳ１０メッセージ
は、ＲＶ６９９中で変化せず、ＵＳ１０リボプローブの
みとハイブリッド形成する（図２２）。
【００６８】ＲＶ１３１へのβ−グルクロニダーゼ遺伝
子挿入のために、１．５−ｋｂ ＵＳ１０及び０．９−
ｋｂ ＵＳ１０ ＲＮＡの大きさはそれぞれ３．０−及
び２．４−ｋｂに増加する（図２５）。これらの転写物
の両方共β−グルクロニダーゼ（図２４）及びＵＳ１０
リボプローブ（図２４）とハイブリッド形成するが、前
者のみがＵＳ１１リボプローブとハイブリッド形成する
（図２４）。図２２及び２５のノザン法は、β−グルク
ロニダーゼ遺伝子の下流とハイブリッド形成するプロー
ブを用いて、後期ＲＮＡに最も豊富な別の転写物を明ら
かにする。例えばＵＳ１１及びＵＳ１０プローブは、約
２．４−ｋｂ移動するＲＶ６９９からの後期転写物とハ
イブリッド形成する（図２２）。又ＵＳ１０プローブ
は、ＲＶ１３１からの２個の小さい後期ＲＮＡ（約１．
３−及び１．５−ｋｂ）とハイブリッド形成する（図２
４）。これらの転写物はＵＳ９リボプローブとハイブリ
ッド形成しないので、それはＵＳ１０の下流のポリアデ
ニル化シグナルを利用するものと思われる。従ってどち
らの場合も、スプライシングのない場合、転写物の５’
末端はβ−グルクロニダーゼ遺伝子内の、そのＮ末端か
ら１．１−から０．９−ｋｂ下流にある。これらのＲＮ
Ａは、その遺伝子のＮ末端からわずか０．６−ｋｂしか
含んでいないので、β−グルクロニダーゼプローブによ
り検出されない。β−グルクロニダーゼ遺伝子内にかく
れたプロモーターがあり、それはＨＣＭＶによる感染後
後期に活性化されることが結論される。
【００６９】ＲＶ６７のノザン法分析によると、β−グ
ルクロニダーゼ（図２６）又はＵＳ１０（図２６）リボ
プローブのどちらかとハイブリッド形成するがＵＳ１１
リボプローブとハイブリッド形成しない（これらの配列
が完全に欠失しているため）２．３−ｋｂ転写物がＲＶ
６７のこの領域から発現する。４．１−ｋｂのリードス
ルー転写物も検出される。ＲＶ１３１のβ−グルクロニ
ダーゼ遺伝子内のかくれたプロモーターから生ずる少量
の後期転写物も、ＵＳ１０プローブを用いてＲＶ６７−
感染細胞ＲＮＡ中に検出される。
【００７０】ＤＮＡ及びＲＮＡブロット分析からの結果
を累積すると（図１６−２６）、このβ−グルクロニダ
ーゼ発現カセットの挿入は、隣接転写単位からの発現を
変化させず、ＨＣＭＶ組み換え変異体を予定通り構築
し、同定することが可能になることを示す。
【００７１】ＨＳＶ−１後期糖タンパク質Ｈプロモータ
ー配列が、上流ｔｋ遺伝子のポリアデニル化シグナルと
密接に共働することが以前に報告された。この後期プロ
モーター領域は、ＨＣＭＶのＲＶ１３４変異体で使用す
るβ−グルクロニダーゼ発現カセットにおける転写を終
結するために用いるｔｋポリアデニル化シグナルフラグ
メント内にある。このＨＳＶ−１後期プロモーターは
又、ＲＶ１３４感染ＨＦＦ内で感染後後期に活性化さ
れ、それはＵＳ８−ＵＳ９プローブとハイブリッド形成
する２．１−ｋｂ後期転写物により証明される（図２
０）。２．１−ｋｂ転写物は、ウィルスＤＮＡ合成阻害
剤であるＰＦＡが不在の場合に感染合成後期にのみ最も
豊富に検出され、ＰＦＡが存在すると検出されないので
（ＵＳ９−ＵＳ１０遺伝子間領域プローブを用いて；図
２３）、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｈプロモーターは、
（ＲＶ１３４の）ＨＣＭＶゲノム中に挿入されると真の
後期プロモーターとして調節される。
【００７２】ＲＶ１３４及びＲＶ６９９により合成され
るタンパク質を、全感染細胞溶菌物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析する。ＲＶ１３４−感染細胞の場合、β−グ
ルクロニダーゼモノマーサブユニットの大きさである
（１９）６８−ｋＤのタンパク質を、ＲＶ１３４に感染
した細胞の溶解物中に容易に検出する。ＲＶ１３４−感
染細胞中の非常に多量のβ−グルクロニダーゼＲＮＡに
対応して（図１９）、このタンパク質が感染後後期まで
に合成される（図２７）又は累積する（図２７）最も豊
富なタンパク質である。６８−ｋＤのタンパク質は、非
感染細胞の溶解物、又は野生型ウィルス感染細胞からの
溶解物中では検出されない。ウィルスβ−グルクロニダ
ーゼが強力な２．７Ｅプロモーターの調節下にあるの
で、このタンパク質はＲＶ１３４−感染細胞中に豊富で
ある。２．７Ｅプロモーターは、以前にＨＣＭＶ組み換
えＲＣ２５６中のｂ−ガラクトシダーゼ生産を駆動する
のに用いられた（１２）。β−グルクロニダーゼタンパ
ク質は、ＲＣ２５６に感染した細胞中で、同様の高いレ
ベルまで累積する。
【００７３】ＲＶ６９９−感染細胞中では、有意なβ−
グルクロニダーゼの累積は検出されない（図２７）。こ
れは、ＲＶ６９９中のβ−グルクロニダーゼ発現を調節
するＵＳ１１プロモーターが比較的弱いためであり（１
７）、それはＲＶ１３４−感染細胞中の２．２−ｋｂメ
ッセージ（図１９）と比較して低い定常状態のレベルの
３．２−ｋｂβ−グルクロニダーゼ−コードＲＮＡ（図
２２）と対応する。
【００７４】ＲＶ１３４、ＲＶ６９９、ＲＶ１３１、Ｒ
Ｖ６７又は野生型株ＡＤ１６９に感染したＨＦＦ細胞の
溶解物からのＵＳ１０及びＵＳ１１の免疫沈降を、標準
的案に従って行う（２３）。要するに、免疫前血清及び
殺した黄色ぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて放射標識抽出
物をプレクリアする。免疫血清と結合したタンパク質
を、タンパク質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いてペレット化する。洗浄した免疫沈降物を２−メ
ルカプトエタノールの存在下で煮沸し、変性ポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動を行う。ゲルを固定し、１Ｍ
のサリチル酸に浸してから乾燥し、オートラジオグラフ
ィーにかける（２３）。
【００７５】ＵＳ１１融合タンパク質を受けたうさぎか
らの免疫抗血清は、感染後初期に野生型ＨＣＭＶ−感染
細胞の溶解物から３１−ｋＤタンパク質を免疫沈降する
（図２８Ａ）。このタンパク質は、免疫前血清（同一の
動物からの）を用いた場合、あるいは非感染細胞溶解物
からは、沈降しない。同様の実験で、ＵＳ１０融合タン
パク質を受けたうさぎからの抗血清を用いて、感染後初
期に野生型ＨＣＭＶ−感染細胞の溶解物から２２−ｋＤ
の初期タンパク質が特異的に免疫沈降する（図２８
Ｂ）。非改質ＵＳ１０及びＵＳ１１タンパク質の予想分
子量は、それぞれ２０．８−ｋＤ及び２５．３−ｋＤで
ある（３）。ＵＳ１１抗血清により認識される３１−ｋ
Ｄタンパク質は、グリコシル化された形態のＵＳ１１遺
伝子生成物である。予想通り３１−ｋＤ遺伝子生成物
は、その抗血清を用いてＲＶ１３４−及びＲＶ１３１−
感染細胞の溶解物から免疫沈降し、ＲＶ６９９−及びＲ
Ｖ６７−感染細胞の溶解物からは沈降しない（図２８
Ａ）。同一の多重度で感染させるが、野生型−又はＲＶ
１３４−感染細胞の溶解物からと比較してＲＶ１３１−
感染細胞の溶解物からのＵＳ１１タンパク質の免疫沈降
は少ない。これは、ＲＶ１３１中でＵＳ１１をコードす
る３．０−ｋｂ ＲＮＡの量（図２４）が、野生型又は
ＲＶ１３４中の対応する１．５−ｋｂ転写物（図１９）
と比較して少し少ないためであるが、又キメラ転写物の
翻訳性が低いためでもある。
【００７６】ＵＳ１０抗血清を用いると、野生型−、Ｒ
Ｖ１３４−及びＲＶ６９９−感染細胞の免疫沈降中に２
２−ｋＤタンパク質が存在するが、ＲＶ１３１−及びＲ
Ｖ６７−感染細胞溶解物からは免疫沈降しない（図２８
Ｂ）。このデータは、ＵＳ１０又はＵＳ１１タンパク質
がそれぞれＲＶ１３１、ＲＶ６７及びＲＶ６９９から発
現しないことを証明している。
【００７７】ＲＶ１３１及びＲＶ６９９中におけるβ−
グルクロニダーゼ遺伝子の挿入は、それぞれＵＳ１０又
はＵＳ１１の部分の置換を起こす。これらの読み取り枠
の両方は、ＲＶ６７で同時に置換される。しかしＲＶ１
３４における挿入は、有意な読み取り枠内ではないが、
向かい合ったＤＮＡストランドからこの領域内のＵＳ６
群遺伝子として転写される３．０−ｋｂ又は１．０−ｋ
ｂ ＲＮＡと抵触する傾向がある。これらの挿入の影響
を評価するために、ＨＦＦ細胞中でこれらのウィルスを
用いた一段増殖曲線研究を行う。使用する方法を実施例
６に記載し、結果を図２９に示す。
【００７８】４種類の組み換えウィルスそれぞれの暗黒
期は、２−３日である。それぞれの組み換え体による感
染性ウィルス生産の速度と共にこれは野生型ウィルスの
場合と類似している（図２９）。これらの結果は、ＨＣ
ＭＶの野生型株に関して以前に発表された結果と一致し
ている（２４，２５）。データは、ＵＳ６群（ＲＶ１３
４）としての向かい合ったストランドからの転写単位の
妨害、ならびにＵＳ１０及び／又はＵＳ１１タンパク質
の発現がないことが、ウィルス増殖の速度論に検出でき
る程の影響を与えないことを示している。低い多重度の
感染の場合、組み換えウィルスプラークの大きさ及び外
観は、野生型プラークと類似している。本発明の一部と
して、ＨＣＭＶ遺伝子が分裂又は置換されてこれらの読
み取り枠からのタンパク質発現が消失しても、組み換え
ＨＣＭＶが組織培養系で複製する能力を重大に傷付けら
れていないことは、これらのＨＣＭＶ遺伝子が必須でな
いことを示していることを示す。これらの遺伝子生成物
は、途中で宿主からそのまま供給されることはない。表
１に示した遺伝子のタンパク質生成物は、ＨＣＭＶ複製
及びヒト繊維芽細胞中の増殖に非−必須であることが結
論される。この結果に対する２つの考えられる理由を示
すがそれらに縛られるものではない。第１に、ある群の
タンパク質生成物内の機能が保持されていると、現れる
影響なしにその群のメンバーの多くを欠失することがで
きる。別の理由は、ＨＳＶ ＵＳのようにＨＣＭＶ Ｕ
Ｓ内に遺伝子を省略できる組織培養のクラスターがある
というものである（７，９）。
【００７９】ＤＮＡ配列データから推定した、タンパク
質の細胞変形分析に主に基づき、ＵＳ１０及びＵＳ１１
遺伝子生成物が膜糖タンパク質であることが提案されて
いる（１４）。この仮定は、ＨＣＭＶビリオン糖タンパ
ク質複合体ＩＩ（ｇｃＩＩ）と反応する単クローン性抗
体が試験管内で合成したＵＳ１０及びＵＳ１１遺伝子生
成物をも免疫沈降することを示したＧｒｅｔｃｈ等のデ
ータ（１６）により支持された。又、糖タンパク質阻害
剤であるツニカマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いた実験に
よる本発明者等の結果は、ＵＳ１１遺伝子生成物がグリ
コシル化されていることを示している。ＨＳＶ系におけ
るウィルス組み換え体の使用により、ビリオンエンベロ
ープ糖タンパク質遺伝子のいくつかが、組織培養におけ
るウィルス増殖に非−必須であることが示された（６，
７，２６−２８）。これらにはｇＣ，ｇＥ，ｇＧ及びｇ
Ｉが含まれる。ｇＣを除いてこれらの省略できる糖タン
パク質は、ＨＣＭＶのＵＳ領域のちょうどＵＳ１０及び
ＵＳ１１の位置と同様に、ＨＳＶのＵＳ領域にある。Ｈ
ＳＶ ＵＳ内の唯一の必須遺伝子は、ビリオン糖タンパ
ク質ｇＤをコードする（２９）。今日まで、ビリオンエ
ンベロープのＨＣＭＶ−感染細胞膜に存在することがで
きるＵＳ１０及びＵＳ１１遺伝子の生成物の量は、不明
確なままである。
【００８０】ＨＣＭＶ組み換え体におけるβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子−含有ＲＮＡ発現の分析により、いくつ
かの興味深い結果が明らかになる。感染後後期に発現す
る転写物は、多くの場合最初に出会うポリアデニル化シ
グナルで有効に終結せず、リードスルーＲＮＡと呼ぶこ
とができる。ＲＶ１３４におけるβ−グルクロニダーゼ
遺伝子発現は２．７Ｅプロモーターの調節下にあり、こ
れは感染後初期及び後期の両方で非常に活性である。初
期及び後期転写物を比較すると、４．１−ｋｂリードス
ルー転写物の量が後期に約３倍増加する（図１９）。Ｒ
Ｖ６７からの内在ＵＳ１０近位ポリアデニル化シグナル
で終結するべきβ−グルクロニダーゼ遺伝子−含有ＲＮ
Ａにおけるリードスルーの増加が後期に観察されるの
で、ＲＶ１３４で観察されるβ−グルクロニダーゼ遺伝
子−含有ＲＮＡのリードスルーは、単に異種ＨＳＶ ｔ
ｋ ポリアデニル化シグナルがＨＣＭＶポリアデニル化
シグナルほど有効に認識されないということで説明でき
ない（図２６）。感染後後期における、このリードスル
ーＲＮＡの増加の傾向は、完全内在ＨＣＭＶＵＳ６及び
ＵＳ７後期メッセージの場合も観察される（１７）。
【００８１】他の観察結果は、キメラβ−グルクロニダ
ーゼ遺伝子−含有ＲＮＡが、野生型の場合と同一の速度
論を示さないことである。例えば、ＲＶ６９９感染細胞
からの３．２−ｋｂメッセージ（図２２）、ＲＶ１３１
感染細胞からの３．０−ｋｂ転写物（図２４）及びＲＶ
６７感染細胞からの２．３ｋｂ ＲＮＡ（図２６）の定
常状態の細胞質量は、感染後初期と比較して後期にほん
のわずかしか減少しない。野生型感染細胞からの１．５
−ｋｂ ＵＳ１１−ＵＳ１０転写物と同様に、これらの
キメラメッセージは、ＵＳ１１プロモーターの調節下で
転写される。野生型ウィルス−感染細胞の場合、この
１．５−ｋｂメッセージは、感染後初期と比較して後期
に非常に減少する（図１９；（１７））。この矛盾が起
こる可能性は少なくとも２つある。第１は、転写物上に
β−グルクロニダーゼ遺伝子配列があると転写物が安定
化し、野生型ＲＮＡより細胞質半減期が長いということ
である。第２は、転写単位内へのβ−グルクロニダーゼ
遺伝子の挿入の結果、負の遺伝子間（シス）転写調節配
列が阻害されるこいうことである。
【００８２】第３の観察結果は、ＨＳＶ−１の真性後期
ｇＨプロモーターもＲＶ１３４のゲノム中に挿入される
とＨＣＭＶ後期プロモーターと同様に調節されるという
ことである（図２０）。これは、これらの関連ウィルス
後期発現を類似の機構が調節していることを暗示してい
る。以前に、異種ウィルスシグナルの認識がＨＳＶ及び
ＨＣＭＶの間で報告された：ＨＳＶ−１は、ＨＣＭＶの
“ａ”ＤＮＡパッケージ及び切断配列を認識し、ＨＣＭ
Ｖの機能が、ＨＳＶ ＩＣＰＯ変異体を補うことができ
る。
【００８３】本発明の第２の具体化は、ＨＣＭＶの阻害
剤のスクリーニングのための分析を含む。分析は、上記
の通り挿入マーカー遺伝子を持つ組み換えＨＣＭＶ（β
−グルクロニダーゼ遺伝子がＨＣＭＶ遺伝子を置換又は
分断している場合）、ならびに挿入が遺伝子間である場
合、すなわちβ−グルクロニダーゼが２個のＨＣＭＶ遺
伝子の間に挿入されてこれらの遺伝子を置換又は分断し
ていない場合の組み換えＨＣＭＶの利用を含む。
【００８４】スクリーニング法は、β−グルクロニダー
ゼの、複合化学物質を切断して蛍光生成物又は発色生成
物を放出することができる能力を利用する。蛍光発生部
分を含む複合体の場合、微量蛍光計で蛍光の量を測定す
る。スクリーニングした試験化合物がＨＣＭＶを阻害す
る場合、ウィルスからの発現が減少し、従ってβ−グル
クロニダーゼの量が減少する。酵素の量の減少は、蛍光
生成物を与える切断の減少を意味する。蛍光生成物の量
の減少により、微量蛍光計の読み取り値が下がり、試験
化合物によるＨＣＭＶの阻害を示す。
【００８５】複合化学物質は、糖と複合すると蛍光を発
生しない蛍光部分を含む。特に好ましい複合体は、Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌによりムグルクロニドの商品
名で販売されているメチルウンベリフェリルグルクロニ
ドである。この複合体は、蛍光部分、メチルウンベリフ
ェリン及びグルクロン酸の誘導体である糖を含む。
【００８６】発色団を含む複合体の場合は、視覚又は分
光光度測定により変色の程度を測定する。スリーニング
した試験化合物がＨＣＭＶを阻害すると、ウィルスから
の発現が減少し、β−グルクロニダーゼの量が減少す
る。酵素の量の減少は、発色団を与える切断の減少を意
味する。発色団の量が減少し、発色団が放出される時に
通常観察される変色の程度が減少し、試験化合物による
ＨＣＭＶの阻害を示す。複合化学物質は、糖に複合した
発色団を含む。そのような発色性複合体の例のひとつ
は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）であり、これは切
断されると淡黄色から濃黄色に変わる。この分析系にお
いてＨＣＭＶの阻害剤は、この複合体の切断を阻害し、
色を濃黄色ではなく淡黄色に保つ傾向がある。
【００８７】発色性複合体の他の例は、５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．）であり、これは切断される
と透明から青緑色に変わる。この分析系においてＨＣＭ
Ｖの阻害剤は、この複合体の切断を阻害し、色を青緑色
ではなく透明に保つ傾向がある。
【００８８】ＨＣＭＶの阻害剤の分析を行う場合は、組
み換えＨＣＭＶ ＲＶ１４５の使用が好ましい。
【００８９】本発明の分析は、ＨＣＭＶの阻害剤のスク
リーニングの簡便な方法となる。β−グルクロニダーゼ
分析により測定する場合、ウィルス増殖は、より苦労の
多い他の方法で必要な７−８日ではなく、５日のインキ
ュベーション期間の後に検出する。
【００９０】本発明をより良く理解するために以下の実
施例を示す。実施例は、説明のみを目的としており、発
明の範囲を制限するものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１マーカー発現組み換えＨＣＭＶの構築 Ａ．予備段階 野生型ゲノムＤＮＡを含むＨＣＭＶ株ＡＤ１６９を、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＶＲ５３８）から入手し、標
準的案に従って増殖する。そのＨＣＭＶ ＤＮＡの塩基
配列の数字による指定は、以前に記載されている（１
４）。
【００９２】ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９ゲノムＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−Ｘ及び−Ｇ ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐ
ＡＴ１５３（３０）中にクローニングし、Ｏｒａｍ等に
よりそれぞれｐＨｉｎｄ−Ｘ及びｐＨｉｎｄ−Ｇと指定
された（３１）プラスミドを得る。ＨＣＭＶ株ＡＤ１６
９ＸｂａＩ−Ｐ及びＢａｍＨＩ−Ｓ ＤＮＡフラグメン
トをビリオン ＤＮＡからプラスミドｐＡＣＹＣ１８４
のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングし、それ
ぞれｐＸｂａＩ−Ｐ及びｐＢａｍ−Ｓを得る。プラスミ
ドｐＢａｍ−Ｕは、ｐＨｉｎｄ−ＧからｐＡＣＹＣ１８
４にサブクローニングされたＨＣＭＶ ＢａｍＨＩ−Ｕ
フラグメントを含む。使用した融合タンパク質ベクター
（ｐＴ７ｐｒｏｔＡ）は、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）から、そのプロモーター及び終結シグナルをバ
クテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーター及び終結
シグナルと置換することにより構築する。プラスミドＤ
ＮＡ操作はすべて標準的案に従って行う（２３）。ＨＣ
ＭＶゲノム中への組み換えのためのプラスミドは、ｐＹ
７−１（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）骨格中に構築
する。
【００９３】出発ブラスミドはｐＢｇｌｕｃであり、こ
れはｐＴ７−１ポリリンカー内のＳｍａＩ部位に挿入さ
れた１．９ｋｂの原核β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含む。
β−グルクロニダーゼに対するｐＢｇｌｕｃのポリリン
カー内の制限部位の順序は：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｐｓｔ
Ｉ，ＳａｌＩ，ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩ，５’−β−グル
クロニダーゼ−３’，ＳｓｔＩ及びＥｃｏＲＩである。
ウィルスゲノム中への均一な組み換えを容易にするため
に、適したウィルス配列をｐＢｇｌｕｃのβ−グルクロ
ニダーゼの５’及び３’にクローニングする。
【００９４】これらの予備操作の生成物を、下記のβ−
グルクロニダーゼマーカー−発現組み換えＨＣＭＶの構
築に使用する。その後マーカー遺伝子を含むプラスミド
を野生型ＨＣＭＶ ＤＮＡと共にコ−トランスフェクシ
ョンする。ソルビトールクッション密度勾配遠心法の後
（２）、部分的精製ヌクレオキャプシドから感染性ＨＣ
ＭＶ ＤＮＡを単離する。ヌクレオキャプシドを５０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）／１ｎＭＭｇＣｌ2中に再懸
濁する。ヌクレオキャプシド懸濁液を作り（０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／０．１Ｍ ＥＤＴＡ／０．１
Ｍ ＮａＣｌ）、最終濃度０．５％までサルコシルを加
えることにより溶菌する。１００μｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫを用いて消化した後（５０℃の場合３時間）、
フェノール−クロロホルム抽出を行い、得られる核酸を
エタノールを用いて沈澱させる。掬い上げたＤＮＡを短
時間乾燥し、１Ｘ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に終夜再懸濁する。
【００９５】ヒト包皮繊維芽（ＨＦＦ）細胞中でコ−ト
ランスフェクションを行う。ＨＦＦ細胞を単離し、ウィ
ルス複製を確実にするために継代２０以下で使用する。
１０％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び２５ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−
２−エタンスルホン酸）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修正
Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で
細胞を増殖する。
【００９６】コ−トランスフェクションの前に、マーカ
ー発現プラスミドを、ウィルス配列の末端の非反復部位
で直線化する。トランスフェクションの日に７０−８０
％の集密度であるように、ＨＦＦ細胞を分割する。細胞
をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／２５ｍ
ＭＨＥＰＥＳ中に１ｍｌ当たり５．６ｘ１０6細胞まで
懸濁する。修正リン酸カルシウム共沈澱法を用いてＤＮ
Ａをトランスフェクションする。要するに、１．５μｇ
の感染性ＨＣＭＶ ＤＮＡ、２μｇの直線状プラスミド
ＤＮＡ及び２μｇの音波処理をした鮭の精子を、塩化カ
ルシウム溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．０／２５
０ｍＭ塩化カルシウムを含む３００μｌ）中で混合し、
氷上で冷却する。ＤＮＡを氷から除去し、ゆっくり混合
しながら３００μｌの２Ｘ ＨｅＢＳ ｐＨ６．９５
（室温で）を滴下して共−沈澱を開始させる（１ｘＨｅ
ＢＳは、１９．２ｍＭＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０５、０．１％デキストロースである）。少量の
沈澱が見え始めたらすぐに沈澱を氷上に置く（さらに沈
澱が形成するのを防ぐために）。沈澱を３ｘ１０6個の
細胞と混合し、８２ｍｍの組織培養プレート中に置く。
３７℃にて６時間後、培地を除去し、１Ｘ ＨｅＢＳ中
２０％のジメチルスルホキシドを用いて２分間細胞に衝
撃を与える。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、増殖培地を加
える。４−７日毎に培地を変える。細胞変性効果が強く
なったら（トランスフェクション後１４−２１日）、標
準的案に従ってウィルスを収穫する（２４）。得られた
ウィルスストックを順に希釈し、ＨＦＦ細胞上でプレー
ト化する。１０−１２後、１００μｇ／ｍｌのＸ−ｇｌ
ｕ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−１−グ
ルクロニド；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）を含むＤＭＥ
Ｍ中の０．５％のアガロースを感染細胞に載せる。
【００９７】マーカー−発現組み換えウィルスは、以下
の要領で単離する：上に載せた後（β−グルクロニダー
ゼ発現を調節するプロモーターの強さに依存して）３時
間から数日、青い（組み換えウィルス−含有）プラーク
をつつく。例えば、ＲＶ１３４（下記）を含む青いプラ
ークは、５％の頻度で得られる。ある場合には、最初の
青いプラークの同定のために本来のトランスフェクショ
ンプレートを上に載せる。組み換えウィルスを４回プラ
ーク精製する（プレート上のすべてのプラークが青くな
ってから１回プラーク精製）。
【００９８】ここで本実施例１の残りに、図１〜１５に
示す特定のβ−グルクロニダーゼマーカー−発現組み換
えＨＣＭＶにつき記載する。
【００９９】Ｂ．ＲＶ１３４ ＵＳ１０／ＵＳ９遺伝子間領域にβ−グルクロニダーゼ
を挿入するために、ｐ２．７ＥＢｇｐＡＵＳ１０／９を
構築する（図２）。このプラスミドは、順にＡｐａＩ／
ＡｐａＩフラグメント（塩基１４８３４から１３５２
７、ＵＳ１１及びＵＳ１０配列を含む；ｐＨｉｎｄ−Ｘ
から）；ｐＢａｍ−Ｕからの７６８−ｂＳｓｐＩ／Ｓｍ
ａＩＩＩ（−７１３から＋５５）プロモーターフラグメ
ント（４２）；β−グルクロニダーゼ（すべての構築の
場合、ｐＢｇｌｕｃから）；１８０ｂ ＳｍａＩ／Ｈａ
ｅＩＩＩ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリアデニル化シグナル
フラグメント（ＨＳＶ−１マクロプラーク株から得、ポ
リアデニル化シグナルを含む（３２））；及び２．０−
ｋｂ ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（塩基１３５
２７から１１５４８、ＵＳ９及びＵＳ８配列を含む；ｐ
Ｈｉｎｄ−Ｘから）を含む。プラスミドｐ２．５ＥＢｇ
ｐＡＵＳ１０／９は、ウィルス配列フランキングβ−グ
ルクロニダーゼの片端の非反復制限部位（ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ）で直線化する。その後直線状プラスミドをＨＣＭＶ
野生型ＤＮＡと共にコ−トランスフェクションし（上記
の通り）、組み換えウィルスＲＶ１３４を単離する。
【０１００】Ｃ．ＲＶ６９９ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ１１を置換するために、ｐＢｇ
ｄＵＳ１１を構築する（図３）。このプラスミドは、順
に１．８−ｋｂ ＰｓｔＩ／ＸｂａＩフラグメント（塩
基１６７１３から１４８９７、ＵＳ１３、ＵＳ１２及び
ＵＳ１１プロモーター配列を含む；ｐＸｂａＩ−Ｐか
ら）；β−グルクロニダーゼ；及び１．５−ｋｂ Ｓａ
ｌＩ／ＳｓｔＩＩフラグメント（塩基１４６７７から１
３２１５、Ｃ−末端ＵＳ１１配列及びＵＳ１０配列を含
む；ｐＨｉｎｄ−Ｘから）を含む。内在ＵＳ１１初期プ
ロモーターは、この構築物のβ−グルクロニダーゼ遺伝
子発現を調節する。その後プラスミドｐＢｇｄＵＳ１１
をその非反復ＰｓｔＩ部位で直線化し、ＨＣＭＶ野生型
ＤＮＡと共にコ−トランスフェクションし（上記の通
り）、組み換えウィルスＲＶ６９９を単離する。
【０１０１】Ｄ．ＲＶ１３１ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ１０を置換するために、ｐＢｇ
ｄＵＳ１０を構築する（図４）。このプラスミドは順
に、１．２−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメン
ト（塩基１５３６２から１４１８９、ＵＳ１１コード配
列及びＵＳ１０プロモーター配列を含む；ｐＨｉｎｄ−
Ｘから）；β−グルクロニダーゼ；及び１．８−ｋｂＳ
ｍａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（塩基１３７８２から
１１９４９、Ｃ−末端ＵＳ１０配列、ＵＳ９及びＮ−末
端ＵＳ８配列を含む；ｐＨｉｎｄ−Ｘから）を含む。内
在する弱いＵＳ１０プロモーターがこのプラスミド中の
β−グルクロニダーゼ発現を調節する。その後プラスミ
ドｐＢｇｄＵＳ１０を、その非反復ＥｃｏＲＩ部位で直
線化し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−ト
ランスフェクションし、組み換えウィルスＲＶ１３１を
単離する。
【０１０２】Ｅ．ＲＶ６７ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ１０及びＵＳ１１を同時に置換
するために、ｐＢｇｄＵＳ１１／１０を構築する（図
５）。このプラスミドは、１．２−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ
／ＸｈｏＩフラグメントの代わりにβ−グルクロニダー
ゼの上流に挿入された１．８−ｋｂＰｓｔＩ／ＸｂａＩ
フラグメント（塩基１６７１３から１４８９７、ＵＳ１
３，ＵＳ１２及びＵＳ１１プロモーター配列を含む；ｐ
ＸｂａＩ−Ｐから）を持つ以外はｐＢｇｄＵＳ１０と類
似している。その後プラスミドｐＢｇｄＵＳ１１／１０
を、その非反復ＥｃｏＲＩ部位で直線化し、（上記の通
り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トランスフェクション
し、組み換えウィルスＲＶ６７を単離する。
【０１０３】Ｆ．ＲＶ１４５ （ＲＶ１３１の場合と同様に）ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ
１０を置換するが、β−グルクロニダーゼ遺伝子を強い
２．７Ｅプロモーターの調節下に置くために、ｐ２．７
ＥＢｇｄＵＳ１０を構築する（図６）。このプラスミド
は順に１．２−ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメ
ント（塩基１５３６２から１４１８９、ＵＳ１１コード
配列及びＵＳ１０プロモーター配列を含む；ｐＨｉｎｄ
−Ｘから）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ／ＸｍａＩＩＩ（−
７１３から＋５５）２．７Ｅプロモーターフラグメン
ト；β−グルクロニダーゼ；及び１．８−ｋｂＳｍａＩ
／ＥｃｏＲＩフラグメント（塩基１３７８２から１１９
４９、Ｃ−末端ＵＳ１０配列、ＵＳ９及びＮ−末端ＵＳ
８配列を含む；ｐＨｉｎｄ−Ｘから）を含む。その後プ
ラスミドｐ２．７ＥＢｇｄＵＳ１０を、その非反復Ｅｃ
ｏＲＩ部位で直線化し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型
ＤＮＡとコ−トランスフェクションし、組み換えウィル
スＲＶ１４５（ＡＴＣＣ ＶＲ２３２９）を単離する。
【０１０４】Ｇ．ＲＶ８０ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ８及び９を同時に置換するため
に、ｐＢｇｄＵＳ９／８を構築する（図７）。このプラ
スミドは順に、１．５−ｋｂＳａｌＩ／ＳｓｔＩＩフラ
グメント（塩基１４６７７から１３２１５、ＵＳ１１の
一部，ＵＳ１０及びＵＳ９プロモーター配列を含む；ｐ
Ｈｉｎｄ−Ｘから）；β−グルクロニダーゼ；１８０−
ｂ ＳｍａＩ／ＨａｅＩＩＩ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリ
アデニル化シグナルフラグメント；及び１．６−ｋｂ
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（塩基１１９
４９から１０３４３、Ｃ−末端ＵＳ８配列、ＵＳ７及び
Ｎ−末端ＵＳ６配列を含む；ｐＨｉｎｄ−Ｘから）を含
む。内在ＵＳ９プロモーターがこのプラスミドにおける
β−グルクロニダーゼの発現を調節する。その後プラス
ミドｐＢｇｄＵＳ９／８をその非反復ＳａｌＩ部位で直
線化し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−ト
ランスフェクションし、組み換えウィルスＲＶ８０を単
離する。
【０１０５】Ｈ．ＲＶ７２５ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ７を置換するためにｐ２．７Ｅ
ＢｇｄＵＳ７を構築する（図８）。このプラスミドは順
に、１．７−ｋｂ ＳｓｔＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメン
ト（塩基１３２１５から１１５４８、ＵＳ９及びＵＳ８
を含む；ｐＨｉｎｄ−Ｘから）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ
／ＸｍａＩＩＩ（−７１３から＋５５）２．７Ｅプロモ
ーターフラグメント；β−グルクロニダーゼ；及び１．
７−ｋｂＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメント（塩基１０９
５３から９２４７、Ｃ−末端ＵＳ７配列及びＵＳ６を含
む；ｐＨｉｎｄ−Ｘ及びｐＨｉｎｄ−Ｇから）を含む。
２．７Ｅプロモーターがこのプラスミドにおけるβ−グ
ルクロニダーゼの発現を調節する。その後プラスミドｐ
２．７ＥＢｇｄＵＳ７をその非反復ＸｈｏＩ部位で直線
化し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トラ
ンスフェクションし、組み換えウィルスＲＶ７２５を単
離する。
【０１０６】Ｉ．ＲＶ６９ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ６を置換するために、ｐＢｇｄ
ＵＳ６を構築する（図９）。このプラスミドは順に、
１．５−ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメント
（塩基１１９４９から１０４７１、ＵＳ８のＣ−末端配
列、ＵＳ７及びＵＳ６プロモーター配列を含む；ｐＨｉ
ｎｄ−Ｘから）；β−グルクロニダーゼ；及び１．５−
ｋｂ ＨｐａＩ／ＳｓｔＩＩフラグメント（塩基１００
９５から８５６８、ＵＳ６のＣ−末端配列及びＵＳ３を
含む；ｐＨｉｎｄ−Ｇから）を含む。内在ＵＳ６プロモ
ーター配列がこのプラスミドにおけるβ−グルクロニダ
ーゼ発現を調節する。その後プラスミドｐＢｇｄＵＳ６
をその非反復ＨｉｎｄＩＩＩ部位で直線化し、（上記の
通り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トランスフェクショ
ンし、組み換えウィルスＲＶ６９を単離する。
【０１０７】Ｊ．ＲＶ１０２ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ１３を分断するために、ｐ２．
７ＥＢｇｉＵＳ１３を構築する（図１０）。このプラス
ミドは順に、２．０−ｋｂＳａｌＩ／ＮｃｏＩフラグメ
ント（塩基１８４８９から１６４６５、ＵＳ１５のＣ−
末端配列、ＵＳ１４及びＵＳ１３のＮ−末端配列を含
む；ｐＸｂａ−Ｐから）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ／Ｘｍ
ａＩＩＩ（−７１３から＋５５）２．７Ｅプロモーター
フラグメント；β−グルクロニダーゼ；１８０−ｂ Ｓ
ｍａＩ／ＨａｅＩＩＩ ＨＳＶ−１ｔｋ ポリアデニル
化シグナルフラグメント；及び１．６−ｋｂ ＮｃｏＲ
Ｉ／ＸｂａＩフラグメント（塩基１６４６５から１４８
９７、ＵＳ１３のＣ−末端配列、及びＵＳ１２を含む；
ｐＸｂａ−Ｐから）を含む。本実施例の次の４つのプラ
スミド（ＫからＮ）と同様にこのプラスミドにおけるβ
−グルクロニダーゼの発現は、２．７Ｅプロモーターが
調節する。その後プラスミドｐ２．７ＥＢｇｉＵＳ１３
をその非反復ＸｂａＩ部位で直線化し、（上記の通り）
ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トランスフェクションし、
組み換えウィルスＲＶ１０２を単離する。
【０１０８】Ｋ．ＲＶ８８ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ１２を分断するために、ｐ２．
７ＥＢｇｉＵＳ１２を構築する（図１１）。このプラス
ミドは順に、１．２−ｋｂＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＶフラグ
メント（塩基１６７１３から１５５１４、ＵＳ１３のＣ
−末端配列及びＵＳ１２のＮ−末端配列を含む；Ｘｂａ
−Ｐから）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ／ＸｍａＩＩＩ（−
７１３から＋５５）２．７Ｅプロモーターフラグメン
ト；β−グルクロニダーゼ；１８０−ｂ ＳｍａＩ／Ｈ
ａｅＩＩＩ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリアデニル化シグナ
ルフラグメント；及び２．３−ｋｂＥｃｏＲＩ／Ｓｓｔ
ＩＩフラグメント（塩基１５５１４から１３２１５；Ｕ
Ｓ１２のＣ−末端配列、ＵＳ１１及びＵＳ１０を含む；
ｐＸｂａＩ−Ｐ及びｐＨｉｎｄ−Ｘから）を含む。その
後プラスミドｐ２．７ＥＢｇｉＵＳ１２をその非反復Ｐ
ｓｔＩ部位で直線化し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型
ＤＮＡとコ−トランスフェクションし、組み換えウィル
スＲＶ８８を単離する。
【０１０９】Ｌ．ＲＶ９１ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ２７を分断するために、ｐ２．
７ＥＢｇｉＵＳ２７を構築する（図１３）。このプラス
ミドは順に、１．６−ｋｂ ＳａｌＩ／ＮａｅＩフラグ
メント（塩基３１１６０−３２７５７、Ｎ−末端ＵＳ２
６及びＮ−末端ＵＳ２７配列を含む；ｐＢａｍ−Ｓか
ら）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ／ＸｍａＩＩＩ（−７１３
から＋５５）２．７Ｅプロモーターフラグメント；β−
グルクロニダーゼ；１８０−ｂ ＳｍａＩ／ＨａｅＩＩ
Ｉ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリアデニル化シグナルフラグ
メント；及び１．９−ｋｂＮａｅＩ／ＳｓｔＩフラグメ
ント（塩基３２７５７から３４６９５、ＵＳ２７のＣ−
末端アミノ酸及びＵＳ２８を含む；ｐＢａｍ−Ｓから）
を含む。その後プラスミドｐ２．７ＥＢｇｉＵＳ２７を
その非反復ＳａｌＩ部位で直線化し、（上記の通り）Ｈ
ＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トランスフェクションし、組
み換えウィルスＲＶ９１を単離する。
【０１１０】Ｍ．ＲＶ９２ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ２８を置換するために、ｐ２．
７ＥＢｇｄＵＳ２８を構築する（図１４）。このプラス
ミドは順に、１．９−ｋｂ ＳｓｔＩＩ／ＮｏｔＩフラ
グメント（塩基３２０５２から３３９３２、ＵＳ２７及
びＵＳ２８のＮ−末端配列を含む；ｐＢａｍ−Ｓか
ら）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ／ＸｍａＩＩＩ（−７１３
から＋５５）２．７Ｅプロモーターフラグメント；β−
グルクロニダーゼ；１８０−ｂ ＳｍａＩ／ＨａｅＩＩ
Ｉ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリアデニル化シグナルフラグ
メント；及び１．６−ｋｂ ＳｔｕＩ／ＮｃｏＩフラグ
メント（塩基３４１３５から３５７６４、ＵＳ２８のＣ
−末端配列及びＵＳ２９のＮ−末端配列を含む；ｐＢａ
ｍ−Ｓから）を含む。その後プラスミドｐ２．７ＥＢｇ
ｄＵＳ２８をその非反復ＨｉｎｄＩＩＩ部位で直線化
し、（上記の通り）ＨＣＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トラン
スフェクションし、組み換えウィルスＲＶ９２を単離す
る。
【０１１１】Ｎ．ＲＶ１０１ ＨＣＭＶ読み取り枠ＵＳ２７及びＵＳ２８を同時に置換
するために、ｐ２．７ＥＢｇｄＵＳ２７／２８を構築す
る（図１５）。このプラスミドは順に、１．６−ｋｂ
ＳａｌＩ／ＮａｅＩフラグメント（塩基３１１６０から
３２７５７、Ｎ−末端ＵＳ２６及びＮ−末端ＵＳ２７配
列を含む；ｐＢａｍ−Ｓから）；７６８−ｂ ＳｓｐＩ
／ＸｍａＩＩＩ（−７１３から＋５５）２．７Ｅプロモ
ーターフラグメント；β−グルクロニダーゼ；１８０−
ｂ ＳｍａＩ／ＨａｅＩＩＩ ＨＳＶ−１ ｔｋ ポリ
アデニル化シグナルフラグメント；及び１．６−ｋｂ
ＳｔｕＩ／ＮｃｏＩフラグメント（塩基３４１３５から
３５７６４、ＵＳ２８のＣ−末端配列及びＵＳ２９のＮ
−末端配列を含む；ｐＢａｍ−Ｓから）を含む。その後
プラスミドｐ２．７ＥＢｇｄＵＳ２７／２８をその非反
復ＨｉｎｄＩＩＩ部位で直線化し、（上記の通り）ＨＣ
ＭＶ野生型ＤＮＡとコ−トランスフェクションし、組み
換えウィルスＲＶ１０１を単離する。
【０１１２】Ｏ．ＲＶ６７０ ある例で、ＵＳ１１を置換してＲＶ６９９を形成する代
わりに（上記参照）、ｐＢｇｄＵＳ１１をＨＣＭＶ Ｄ
ＮＡとコ−トランスフェクションすると、予期しない欠
失を含む組み換えウィルスＲＶ６７０が単離される。
（下記の実施例２の方法を用いた）ＤＮＡブロットハイ
ブリッド形成分析により、ＵＳ１１上流フランキング配
列内の同種組み換え、及び下流原核プラスミド配列とＨ
ＣＭＶ結合領域配列の異種組み換えの結果、ＲＶ６７０
が形成されたことが明らかになる。欠失は広く、ＵＳ領
域及びＩＲＳ領域の両方の一部を含む。特に以下の読み
取り枠が欠失している：ＵＳ１１，ＵＳ９，ＵＳ８，Ｕ
Ｓ７，ＵＳ６，ＵＳ５，ＵＳ４，ＵＳ３，ＵＳ２，ＵＳ
１及びＩＲＳ１。
【０１１３】実施例２サザン法 感染細胞の細胞質から、（サザン法のための）組み換え
ウィルスＤＮＡを単離する。使用する方法は、修正２Ｘ
ＰＫ緩衝液（２％のＳＤＳの代わりに１％のサルコシ
ルを含む）を使用し、プロテイナーゼＫ処理の前にＲＮ
ＡアーゼＡ（３７℃にて２５μｇ／ｍｌ）を用いて２０
分処理する他は、全細胞質ＲＮＡの単離に使用する方法
（下記）と同様である。
【０１１４】制限エンドヌクレアーゼ消化ウィルスＤＮ
Ａにつき、０．６％アガロースゲルを通して電気泳動を
行う。ＤＮＡをＮｙｔｒａｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）にブ
ロットし、紫外光を交差させ、４２℃にて５０％のホル
ムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、
５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１％のグリ
シン、１００μｇ／ｍｌの変性音波処理鮭精子ＤＮＡ及
び０．１％のＳＤＳ中で４−１６時間予備ハイブリッド
形成する。ランダムプライムキット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いることにより特異的活性
の高いＤＮＡプローブを形成し、４２℃にて５０％のホ
ルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１ｍＭ
のＥＤＴＡ、１ｍｌ当たり１００μｇの変性音波処理鮭
精子ＤＮＡ及び０．１％のＳＤＳ中で１８時間ハイブリ
ッド形成する。ブロットを室温にて２Ｘ ＳＳＣ／０．
１％ＳＤＳ中で５分間、２回洗浄する。０．１Ｘ ＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳ中、５０℃にてそれぞれ２０分づつ
３回の高緊縮洗浄を行う。洗浄したブロットを、−７０
℃にてＤｕｐｏｎｔ Ｃｒｏｎｅｘ補力スクリーンを用
いてＸＡＲ５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光する。表１
に挙げ、実施例１に記載したすべての組み換えウィルス
につきサザン法を行う。野生型ウィルスＡＤ１６９と比
較したＲＶ１３４、ＲＶ１３１、ＲＶ６９９及びＲＶ６
７についての分析の結果の説明を上記に記載し、図１６
〜１８に示す。
【０１１５】実施例３ノザン法 以前に記載のあるＮＰ４０溶菌法（２３）により、全細
胞質ＲＮＡを単離する。感染の多重度（ｍｏｉ）＝５に
てＨＦＦ細胞を感染させた後、ＨＣＭＶ速度論的分類Ｒ
ＮＡを単離する。感染の１時間前から収穫まで２５μＭ
のアニソマイシン又は１ｍｌ当たり１００μｇのシクロ
ヘキシミドを存在させ、感染後８時間で直後ＲＮＡを細
胞から単離する。１ｍｌ当たり１００μｇのホスホノホ
ルメート（ＰＦＡ）の存在下で初期ＲＮＡを、感染後２
４時間で細胞から単離する。後期ＲＮＡを感染後７２時
間で細胞から単離する。
【０１１６】１５μｇの全細胞質ＲＮＡを、標準的案に
従い（２３）、１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲ
ルを通して電気泳動を行う。ＤＮＡをＮｙｔｒａｎ（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅ
ｎｅ，Ｎ．Ｈ．）にブロットし、紫外光を交差させ、４
２℃にて５０％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５ＸＤ
ｅｎｈａｒｄｔｓ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ
６．５、１％のグリシン、１００μｇ／ｍｌの変性音波
処理鮭精子ＤＮＡ及び０．１％のＳＤＳ中で４−１６時
間予備ハイブリッド形成する。特異的活性の高いリボプ
ローブを用い（２３）、ブロットを６０℃にて５０％の
ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ
ｓ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１ｍＭ
のＥＤＴＡ、１ｍｌ当たり１００μｇの変性音波処理鮭
精子ＤＮＡ、１ｍｌ当たり５０μｇの酵母ｔＲＮＡ及び
０．１％のＳＤＳ中で１８時間ハイブリッド形成する。
リボプローブブロットを室温にて２Ｘ ＳＳＣ中で５分
間、２回洗浄し、その後２ｘ ＳＳＣ中１ｍｌ当たり１
μｇのＲＮＡアーゼＡで１５分間処理する。その後０．
０５Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５５℃にてそれぞ
れ２０分づつ３回の高緊縮洗浄を行う。洗浄したブロッ
トを、−７０℃にてＤｕｐｏｎｔ Ｃｒｏｎｅｘ補力ス
クリーンを用いてＸＡＲ５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露
光する。特異的活性の高いリボプローブは、標準的案に
従って形成する。ＲＶ１３４、ＲＶ６９９、ＲＶ１３１
及びＲＶ６７についてノザン法を行う。結果を上記に記
載し、図１９−２６に示す。
【０１１７】実施例４組み換えＨＣＭＶのタンパク質分析 感染の多重度＝５でＲＶ１３４、ＲＶ６９９又は野生型
株ＡＤ１６９に感染したＨＦＦ細胞につき、非感染細胞
を参照標準として用いて全タンパク質分析を行う。非感
染又は感染細胞タンパク質（感染後６８−７２時間）
を、下記の要領で35Ｓ−メチオニン／システインを用い
て代謝的に標識する。
【０１１８】標識の前に、メチオニン及びシステインを
含まない無血清ＤＭＥＭ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄ
ｉａ，Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，ＮＪ）中でインキュベート
することにより、４５分間細胞からこれらのアミノ酸を
欠乏させる。35Ｓ−メチオニン及びシステイン（１１０
０Ｃｉ／ミリモル；ＥｘｐｒｅＳＳ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を、同一であるが透析した牛
胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を最終的濃度１％で含む培地中
で最終的濃度が２００μＣｉ／ｍｌとなるまで加えるこ
とにより、タンパク質の代謝による放射標識を行う。標
識後、三重界面活性剤溶菌緩衝液中に溶解することによ
り、溶菌生成物を調製する（２３）。（透明な溶菌生成
物−−１５０００ｘｇ及び４℃にて５分間遠心した後の
上澄み−−も実施例５の免疫沈降分析用に保つ）。１０
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で溶菌細胞を電気泳動し、タンパ
ク質もクーマシーブルーで染色して累積タンパク質を明
らかにする。ゲルをＸ−フィルムに露光し、写真を撮
る。結果は、上記及び図２７に示す通りである。
【０１１９】実施例５免疫沈降 免疫沈降法を用いてＲＶ６９９、ＲＶ１３１及びＲＶ６
７における挿入により分断された遺伝子が発現するかど
うかを決定する。ＲＶ１３４の遺伝子間挿入は読み取り
枠を分断しないので、それを参照標準として使用する。
ＵＳ１０又はＵＳ１１融合タンパク質を、タンパク質Ａ
コード領域の非変性ｐＲＩＴ２Ｔポリリンカー３’を含
むタンパク質Ａ融合ベクターｐＴ７ｐｒｏｔＡから、
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１中で発現させる。
【０１２０】ＵＳ１０又はＵＳ１１融合の場合、それぞ
れ塩基１４１１９から１３１２７又は塩基１４８３４か
ら１４１８９をポリリンカー中に枠として挿入する。従
ってＵＳ１０融合は、ＵＳ１０読み取り枠のＮ−末端８
アミノ酸以外のすべてを含み、ＵＳ１１融合は、ＵＳ１
１読み取り枠のＮ−末端１１アミノ酸以外のすべてを含
む。ＩＰＴＧを用いて誘導したバクテリアの封入体から
融合タンパク質を溶解し、精製する。
【０１２１】融合タンパク質を用いて免疫感作した後、
うさぎから単一特異性多クローン性抗血清を得る。ニュ
ージーランド白うさぎを、フロインド完全アジュバンド
（一次免疫感作）又はフロインド不完全アジュバンド
（二次免疫感作）を用いた皮下注射により、６週間の間
隔でこれらの融合タンパク質抗原で免疫感作する。５回
目の追加免疫の後血清を得る。実施例４からの放射標識
溶菌細胞を再度使用する。結果は、上記及び図２８に示
す通りである。
【０１２２】実施例６一段増殖曲線 ３５ｍｍプレート中のＨＦＦ細胞の集密的細胞単層を、
野生型又は組み換えＨＣＭＶで、感染の多重度＝２で感
染させる。３７℃で２時間吸収させた後、接種材料を除
去し、新しい培地を各プレートに加える。プレートを、
指示した感染後日数まで３７℃でインキュベートする。
プレートを−７０℃で凍結し、３７℃で解凍し、感染細
胞を培地中に集める。培地／感染細胞懸濁液を１分間音
波処理する。０．５％アガロース上載せを用いたプラー
ク分析により、合計感染性ウィルスを定量する。結果
は、上記及び図２９に示す通りである。
【０１２３】実施例７ＨＣＭＶの阻害剤のスクリーニング スクリーニング分析では最少必須培地（Ｓｅｌｌｇｒｏ
ｗ製造、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより販
売）、繊維芽細胞の増殖に適した高グルコース培地を含
み、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を補った培地を用い
る。培地中で１：２５及び１：２５００に希釈した試験
化合物の希釈液を調製する。
【０１２４】２％ＦＢＳウィルス維持培地（高グルコー
ス）中で１：４０００に希釈することにより、β−グル
クロニダーゼのための遺伝子を含むＨＣＭＶを分析用に
調製する。
【０１２５】Ｂｉｏｍｅｋ１０００ワークステーション
上の９６−ウェル組織培養プレート中で分析を行う。各
ウェルは、分析開始の前日に接種した３−５ｘ１０4の
ヒト包皮繊維芽細胞を含む。分析の開始のために、各ウ
ェル中の細胞上の培地を、下文で述べる新しい培地で置
換する。各プレート上の第１列の８ウェルのそれぞれに
含まれる細胞は感染させず、１００μｌの培地を含み、
負の参照標準とする。第２列の８ウェルは、感染の多重
度が約０．０１となるように希釈ＲＶ１４５５０μｌと
共に細胞を含み、各ウェルの最終体積は１００μｌであ
る。第２列のウェルは試験化合物を含まず、これらが正
の参照標準となる。
【０１２６】８ウェルから成る残りの１０列は、試験化
合物の希釈液（上記）を含む５０μｌの培地と共に細胞
を含む。細胞は、５０μｌの希釈ＲＶ１４５（上記と同
様）で感染させ、各ウェルの最終体積は１００μｌであ
る。必要なら、それぞれ異なる試験化合物を含む別々の
培地を調製し、ひとつのプレートを多くの試験化合物の
分析に使用することができる。
【０１２７】プレートの適したウェルを感染させた後、
ＣＯ2インキュベーター中３７℃で５日間プレートをイ
ンキュベートする。その後プレートを吸引し、１００μ
ｌの混合試薬を加える。混合試薬は、ｌａｃ ｚ緩衝液
（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4；０．０４Ｍ ＮａＨ2Ｐ
Ｏ4；０．０１Ｍ ＫＣｌ；０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4）
中に０．１％のＮＰ−４０、非イオン性界面活性剤、
０．１％のサルコシル、イオン性界面活性剤及び０．１
ｍｇ／ｍｌのムグルクロニド（メチルウンベリフェリル
グルクロニド、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含
む。
【０１２８】界面活性剤は細胞を破壊し、β−グルクロ
ニダーゼを溶解する。これにより酵素の量を下記の蛍光
測定で分析することができる。
【０１２９】ムグルクロニドは、メチルウンベリフェリ
ンと糖の複合体である。この複合体の状態では、蛍光は
発光されない。しかしβ−グルクロニダーゼが複合体を
切断し、蛍光化合物であるメチルウンベリフェリンを遊
離させる。
【０１３０】プレートを３７℃で２０−３０分間インキ
ュベートする。その後微量蛍光計で蛍光の量を測定す
る。負の参照標準（第１列）は、繊維芽細胞が感染して
いないので、ベースラインの値を与える。第２列は試験
化合物を含まず、繊維芽細胞がβ−グルクロニダーゼを
発現する遺伝子を含むＨＣＭＶに感染しており、発現す
ると複合体を切断し、蛍光化合物を測定することができ
るので、正の参照標準となる。
【０１３１】残りの列は、試験化合物の希釈液と共に感
染繊維芽細胞を含む。試験化合物がＨＣＭＶを阻害する
場合、ウィルスは正の参照標準と同程度にβ−グルクロ
ニダーゼを発現し、蛍光の値が同程度となるであろう。
試験化合物がＨＣＭＶを阻害する場合、β−グルクロニ
ダーゼの発現が減少し、複合体の切断が減少し、蛍光の
値が下がる。
【０１３２】試験化合物間の比較のために、ＨＣＭＶが
５０％阻害される蛍光の値（ＩＣ50）を求めるのが有用
である。上記の分析法を用いると、周知のＨＣＭＶ阻害
剤（ＦｏｓｃａｖｉｒTMＦｏｓｃａｒｎｅｔ、Ａｓｔｒ
ａ）のＩＣ50は、３０−４０μＭである。
【０１３３】実施例８ 変異体ＲＶ６７０は、初期ＣＰＥを起こさない。
【０１３４】挿入突然変異誘発法を用いたＨＣＭＶ遺伝
子機能の研究において、Ｓ成分の左端から（原型配置）
９−ｋｂの領域が欠失したウィルス組み換え変異体、Ｒ
Ｖ６７０を単離した（４１）。このゲノムから、ＩＲＳ
１、ＵＳ１−ＵＳ３、ＵＳ６−ＵＳ９及びＵＳ１１を含
む９個の主要読み取り枠が欠失している。そのような多
数の遺伝子が欠失しても、ＲＶ６７０は、組織培養ＨＦ
Ｆ細胞中で野生型株と同様に有効に増殖し、温度感受性
でも低温感受性でもない（４１）。しかし野生型株と異
なり、ＲＶ６７０による感染は、感染後初期に典型的に
観察されるＨＦＦ細胞の収縮−類似円形化、初期ＣＰＥ
を起こさない（３６，３７及び４７）。感染の多重度が
２で野生型株に感染したＨＦＦ細胞は、円形表現型を示
す：そのような円形化は、感染後６時間までに始まり、
１６−２４時間で最高に達する（図３０Ａ；３３）。し
かし同一の多重度で感染したＲＶ６７０感染細胞は、感
染後２４時間で典型的繊維芽細胞の形態を保っている
（図３０Ｂ）。もっと高い感染の多重度（すなわち５又
は１０）でＲＶ６７０に感染したＨＦＦ細胞、又は感染
後の異なる時間で調べた細胞も、初期ＣＰＥを示さな
い。ＲＶ６７０から失われた遺伝子はクラスターである
が、以前に研究されたこの群の読み取り枠からの細胞質
ＲＮＡの速度論は異なる。ＵＳ３−誘導転写物は、感染
後直後、初期及び後期に検出され；ＵＳ６−、ＵＳ８
−、ＵＳ９−及びＵＳ１１−誘導メッセージは、感染後
初期に現れ、ＵＳ７−誘導ｍＲＮＡは、感染後後期に検
出される（３８，４５，５１，１７）。ＩＲＳ１、ＵＳ
１及びＵＳ２からの発現は報告されていない。円形表現
型にはウィルスの初期遺伝子機能が必要であると予想さ
れるが、ＲＳ６７０ゲノムから欠失したどの遺伝子が必
要なのかを、ＲＮＡ発現データのみから予想するのは不
可能である。
【０１３５】ＩＲＳ１からの発現が初期ＣＰＥに必要で
ある。
【０１３６】ＲＶ６７０ゲノムから欠失し、初期ＣＰＥ
に必要な遺伝子を同定するために、上記に記載したβ−
グルクロニダーゼ置換突然変異誘発法を用いて別のウィ
ルス組み換え変異体を形成する。特定の遺伝子が欠失し
たいくつかの新しい変異体を構築する：ＲＶ３５，ＵＳ
６からＵＳ１１が欠失；ＲＶ４７、ＵＳ２及びＵＳ３が
欠失；ＲＶ５１２２、ＵＳ１が欠失；及びＲＶ４６、Ｉ
ＲＳ１が欠失。各変異体の置換の程度、ならびに関連制
限フラグメントの大きさを図１１に模式的に示す。これ
らの変異体につき示したゲノム構成を、ＤＮＡブロット
法により確認する（図３３）。β−グルクロニダーゼ
（図３３Ａ）、ＸＸ−３．６（図３３Ｂ）及びＸＰ（図
３３Ｃ）プローブを用い、すべての予想される制限フラ
グメントを各ウィルス組み換え体に関してハイブリッド
形成させる。
【０１３７】ＨｉｎｄＩＩＩ消化の列における多数のハ
イブリッド形成フラグメントは、ＤＮＡの結合及び末端
領域へのハイブリッド形成を示す。さらにウィルスゲノ
ムの、Ｌ成分を含む他の領域からのいくつかのプローブ
を用いた場合、予想された欠失及び転位は検出されな
い。ＲＮＡブロット分析も、各場合に正しい組み換えが
起こるという結論と一致する。
【０１３８】組み換えウィルスを用いて、初期ＣＰＥを
起こす能力を評価する。ＨＦＦ細胞を、感染の多重度
２，５又は１０で感染させ、毎日２回監視する。感染の
多重度が２の場合、感染後２４時間でＲＶ５１２２、Ｒ
Ｖ４７及びＲＶ３５は、それぞれ初期円形化を起こす能
力を保っている（それぞれ図３４Ａ−Ｄ）。感染の多重
度が５又は１０の場合のＲＶ４６による感染、又は感染
後の異なる時間における観察により基本的に同一の結果
を得る。終始一貫して現れるひとつの差は、感染の多重
度の高い場合に、ＲＶ４６−感染細胞（図３４Ｅ）の細
胞融合が他の変異体又は野生型株（図３４Ｆ）に感染し
た細胞と比較して非常に強いことである。さらに、ＲＶ
４６と同様にＩＲＳ１遺伝子領域が置換されたウィルス
組み換え体の、他の別々の単離物はすべて初期ＣＰＥを
起こすことができない。
【０１３９】ＩＲＳ１からのＲＮＡ発現 組み換えウィルス研究からのデータは、初期円形化表現
型の誘導にＩＲＳ１領域からの発現が必要であることを
示す。ＩＲＳ１読み取り枠は、部分的に反復（ＩＲS）
及び非反復（ＵS）配列内にあり、８４６アミノ酸タン
パク質をコードしており、そのＮ−末端５２９アミノ酸
はＳ−成分の他端で類似位置を占有するＴＲＳ１読み取
り枠の推定生成物と同一である（３，１４）。ＩＲＳ１
からのＲＮＡ発現の速度論決定のために、ＩＲＳ１のＣ
−末端領域を含み、非反復領域配列と相補的で反復領域
配列と相補的でないリボプローブを用いてＲＮＡブロッ
ト分析を行う（図３５Ａ）。このプローブは２片の細胞
質ＲＮＡとハイブリッド形成する：初期及び後期条件下
で検出されるが初期条件下でより豊富な３．６−ｋｂ転
写物；及び初期条件下で非常に豊富で後期条件下でほと
んど検出されない０．３−ｋｂメッセージ。これらのメ
ッセージのひとつの発現と円形表現型の発生を関連づけ
るために、薬剤の不在下で感染後種々の時間にＨＣＭＶ
野生型株−感染ＨＦＦ細胞から細胞質ＲＮＡを単離す
る。図３５Ｄに示す通り、１．３−ｋｂメッセージの発
現は、１６−２４時間の範囲でピークとなり、その後量
が急激に減少する。３．６−ｋｂ転写物の定常状態細胞
質量は、８時間までが最も豊富で、感染のその後を通じ
てゆっくり減少する。このメッセージの量は、感染後８
又は２４時間と比較して１６時間で実質的に少ないこと
に気付く（図３５Ｄ）。感染後８時間から１６時間への
そのような減少は、再現性がある（図３５Ｅ）。別のＲ
ＮＡブロット実験により、両転写物が細胞質に現れるの
は、感染後３時間までであることが示される（図３５
Ｅ）。従ってＩＲＳ１により発現する２つのメッセージ
は感染後初期に現れ、初期ＣＰＥの発生と関連してい
る。
【０１４０】ＤＮＡ配列データから、Ｗｅｓｔｏｎ及び
Ｂａｒｒｅｌｌ（１４）は、ＴＡＴＡボックスプロモー
ターモチーフがＩＲＳ１の推定翻訳開始コドンの約１０
０塩基上流、塩基４１４７の近辺にあり、そのストラン
ドのための最初の下流ポリアデニル化シグナルがＵＳ１
の末端、塩基７５４６の近辺にある（すなわちＩＲＳ１
転写物は、ＵＳ１遺伝子領域から誘導された配列を含
む）ことを報告した。ポリＡの２００塩基を考慮し、
３．６−ｋｂ転写物は、これらの位置で始まり終結する
ＲＮＡと矛盾しない。ＩＲＳ１−誘導転写物がＵＳ１の
末端のポリアデニル化シグナルを使用するという予想を
調べるために、ＲＮＡブロット及びＳ１ヌクレアーゼ分
析を行う。図３５Ｂに示す通り、（ＵＳ１誘導ｍＲＮＡ
とハイブリッド形成せず、ＩＲＳ１−コードメッセージ
などの他のストランドからのＲＮＡとのみハイブリッド
形成するように）ＵＳ１認識配列を含むリボプローブを
用いると、ハイブリッド形成プロフィールは、ＩＲＳ１
非反復領域リボプローブを用いた場合と同一である（図
３５Ａ）。これは、これらの２つのＩＲＳ１−誘導メッ
セージがＵＳ１−遺伝子領域により転写され、実際にＵ
Ｓ１に隣接するＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを
使用することを示唆している。図３５Ａ及び３５Ｂのブ
ロットの場合、両リボプローブは、２．４−及び４．５
−ｋｂの他の２個のあまり豊富でないメッセージともハ
イブリッド形成している。これらの後者のＲＮＡが、単
にリードスルー転写物であり、２番目に出会うＡＡＴＡ
ＡＡポリアデニル化シグナル（ＵＳ２及びＵＳ３の間の
塩基８４０６の近辺に位置する）を用いているのかどう
かを決定するために、（ＵＳ２−誘導ＲＮＡとハイブリ
ッド形成せず、提案されたＩＲＳ１−誘導リードスルー
転写物などの他のストランドからのＲＮＡとのみハイブ
リッド形成するように）ＵＳ２認識配列を含むリボプロ
ーブを用いた（図３５Ｃ）。このリボプローブは、豊富
でない２．４−ｋｂ及び４．５−ｋｂメッセージとのみ
ハイブリッド形成し、これらがリードスルー転写物であ
ることが確認された。ＨＣＭＶ ＵS領域の隣接領域か
らの類似リードスルーｍＲＮＡが以前に記載されている
（１７）。
【０１４１】主要初期群ＩＲＳ１−誘導ｍＲＮＡ（０．
３及び３．６−ｋｂ）の構造を、Ｓ１ヌクレアーゼ保護
及びプライマーエクステンション分析により決定する。
これらの研究により、両メッセージがスプライシングさ
れず、ＵＳ１の末端の部位でポリアデニル化されること
が確認される。１．３−ｋｂ転写物の５’末端は、ＩＲ
ＳのＵＳ領域内にあり、幾分不均一である：主な開始部
位は塩基６３２５であり、主でない開始部位は６３２３
である。これは６２９６のＴＡＴＡボックスプロモータ
ーモチーフから下流３０−ｂの中にある。Ｓ１ヌクレア
ーゼ保護分析により、３．６−ｋｂｍＲＮＡの５’末端
を、以前に記載されたＴＡＴボックスプロモーターモチ
ーフ（５１）の３０−ｂ内にある、塩基４１７９の近辺
の、ＩＲＳ１の推定開始コドンの約０．１−ｋｂ５’に
置く。従って３．６−ｋｂ ｍＲＮＡは、ＩＲＳ１のち
ょうど上流で始まり、そこからＵＳ１に隣接するポリア
デニル化付加部位まで続く。
【０１４２】ＩＲＳ１領域の変化した発現の影響 ＩＲＳ１−誘導ｍＲＮＡは両方共、ポリアデニル化シグ
ナルに達する前にＵＳ１読み取り枠により転写されるの
で、線量依存方式で初期ＣＰＥをＩＲＳ１領域の発現と
関連づける機会を与える。ＵＳ１中でＲＶ１２２と同一
領域を欠失しているが、β−グルクロニダーゼ発現カセ
ットが反対方向に挿入されている、ＨＣＭＶ組み換えＲ
Ｖ５１を構築する（図３９Ｂ）。この変化により、その
３’末端の近辺に別の２．３３−ｋｂのβ４−グルクロ
ニダーゼ発現カセットを含むＩＲＳ１−誘導転写物が得
られる。しかしＩＲＳ１配列を含む５’末端は、変化し
ていない。（β−グルクロニダーゼ遺伝子を同様の方法
で変異体ＲＶ１３１のＵＳ１１タンパク質コード転写単
位の３’末端の近辺に挿入すると、ＵＳ１１タンパク質
（そのメッセージの５’読み取り枠からコードされる）
が、おそらく転写及び／又は転写後機構の有効性の減少
のために非常に少量合成される（１７）。）ＩＲＳ１
ｍＲＮＡの３’末端へのβ−グルクロニダーゼ発現カセ
ットの挿入は、それぞれのＩＲＳ１遺伝子−誘導タンパ
ク質生成物の発現に同様の効果を持つことが望ましい。
実際、２個の新しいＩＲＳ１配列−含有転写物、３．６
−及び５．９−ｋｂの定常状態の細胞質量は、対応する
野生型のそれぞれ１．３−及び３．６−ｋｂメッセージ
と比較して減少している（図４０）。ＩＲＳ１遺伝子発
現におけるこの変化の影響を調べるために、ＨＦＦ細胞
を、多重度２又は１０で感染させる。感染後２４時間
で、多重度２で感染させた細胞は初期円形化表現型を示
さない（図４１Ａ）。しかし多重度１０の場合、ＲＶ５
１（図４１Ｂ）は、野生型株（図４１Ｃ）で感染させた
細胞と同様の表現型を引き起こすことができる。対照的
に、その多重度でＩＲＳ１変異体ＲＶ４６に感染させた
細胞は、強い融合を示すが円形化は示さない（図４１
Ｄ）。これらのデータは、ＨＣＭＶ−誘導初期細胞円形
化が、ＩＲＳ１遺伝子領域の発現を線量依存的に必要と
することを示唆している。
【０１４３】ＩＲＳ１ １．３−ｋｂ ｍＲＮＡは初期
ＣＰＥに必要な機能をコードする ＩＲＳ１組み換え変異体ＲＶ４６のゲノムから欠失した
ＩＲＳ１配列は、その読み取り枠の始めからｍＲＮＡ転
写開始部位の１．３−ｋｂ下流である塩基６３３６のＮ
ａｒＩ部位までのびている。従って２個のＩＲＳ１−誘
導初期群メッセージのいずれも、１．３−ｋｂ転写物の
ためのプロモーター及び５’非翻訳配列の１１−ｂと同
様に３．６−ｋｂ ｍＲＮＡ内に含まれるＩＲＳ１コー
ド領域のほとんどが欠失しているＲＶ４６−感染細胞中
で合成されない。３．６ｋｂ ＲＮＡ転写単位生成物が
初期ＣＰＥに必要かどうかを決定するために、組み換え
ウィルス変異体ＲＶ５１５１を構築する（図３７Ｂ）。
前記の通り、ＤＮＡブロット分析により、正しいゲノム
構造が確認される。このウィルスでは、β−グルクロニ
ダーゼマーカー遺伝子は、ＩＲＳ１ Ｎ−末端配列から
塩基５９３４のＮｒｕＩ部位まで置換し、３．６−ｋｂ
ｍＲＮＡ転写単位のほとんどが欠失している。１．３
−ｋｂ ｍＲＮＡ転写単位は、その転写物の開始部位の
０．３９−ｋｂ上流の配列及び転写された領域のすべて
がそのまま残るので、影響を受けていないと思われる。
感染の多重度２でＲＶ５１５１に感染させたＨＦＦ細胞
を調べ、この変異体が初期ＣＰＥを起こす能力を保持し
ていること（図３８）、従って初期ＣＰＥに必要な１．
３−ｋｂ転写単位タンパク質生成物を含むことが示され
る。
【０１４４】初期ＣＰＥに必要なＩＲＳ１遺伝子生成物
の利用 ＨＣＭＶは、人間の宿主において、アテローム動脈硬化
症及び脳炎を含む多くの病気を伴う。ヒト臍静脈内皮細
胞、ならびにヒト脳毛細管内皮細胞の両方は、ＨＣＭＶ
に感染すると形態上の変化を起こす。特に後者の細胞が
感染した場合、感染後初期に細胞変性が起こる。これら
の内皮細胞の形態の変化は、血液脳関門の破裂を起こ
し、他のウィルス又はそこに見られない他の化合物が脳
に近付けるようになり、脳炎又はアテローム動脈硬化を
起こす。ＨＣＭＶ−感染繊維芽細胞の場合のように、そ
のような細胞の形態上の変化にはＩＲＳ１遺伝子生成物
が必要である。従って１．３−ｋｂ ＩＲＳ１−誘導転
写単位のタンパク質生成物の阻害剤のスクリーニング
が、これらの状態の重度を軽減するのに有用である。
【０１４５】ヒトサイトメガロウィルスからのプロモー
ター及びＩＲＳ１遺伝子１．３−ｋｂ転写単位の読み取
り枠を含むプラスミド（ｐＩＲＳ１ＵＳ１−ＮＳと指
定）の試料を、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆ
ｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ
Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの準備の基に、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ
ｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５
２，Ｕ．Ｓ．Ａ．に預託した。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
【表４】
【０１４９】本発明の主たる特徴及び態様は、以下の通
りである。
【０１５０】１．ＨＣＭＶの初期円形表現型に必要なタ
ンパク質をコードするＨＣＭＶ核酸配列。
【０１５１】２．第１項に記載の核酸において、核酸を
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡから成る群より選ぶことを
特徴とする核酸。
【０１５２】３．第１項に記載の核酸分子を含む発現ベ
クター。
【０１５３】４．第３項に記載の発現ベクターを用いて
安定に形質転換した宿主細胞。
【０１５４】５．第１項に記載の核酸によりコードされ
る、単離タンパク質。
【０１５５】６．遺伝子が、野生型ヒトサイトメガロウ
ィルス（ＨＣＭＶ）の複製に関して非−必須であるかど
うかを決定する方法において： ａ．β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を野生型ＨＣ
ＭＶゲノムに挿入して遺伝子の発現を妨げ、それにより
組み換えＨＣＭＶゲノムを形成し； ｂ．組み換えＨＣＭＶゲノムをを適した宿主細胞に導入
し； ｃ．適した条件下で宿主細胞を増殖し、ＨＣＭＶウィル
スの複製を起こし； ｄ．子孫ウィルスの存在に関して宿主細胞をスクリーニ
ングし； ｅ．子孫ウィルスの存在により、遺伝子が野生型ＨＣＭ
Ｖの複製に非−必須であることを示す段階を含むことを
特徴とする方法。
【０１５６】７．第６項に記載の方法において、β−グ
ルクロニダーゼマーカー遺伝子の挿入が、野生型ＨＣＭ
Ｖゲノムへの付加を含み、野生型遺伝子が分断されるこ
とを特徴とする方法。
【０１５７】８．第６項に記載の方法において、β−グ
ルクロニダーゼマーカー遺伝子の挿入が、２個又はそれ
以上の野生型ＨＣＭＶ遺伝子の一部を置換することを特
徴とする方法。
【０１５８】９．ＨＣＭＶ複製を阻害する化合物の同定
法において： ａ．β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を、以下から
成る群より選んだ方法でＨＣＭＶゲノム中に挿入し、Ｈ
ＣＭＶ組み換え体を構築し： （ｉ）野生型ＨＣＭＶ遺伝子の一部を置換してマーカー
遺伝子の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げ
る； （ｉｉ）野生型ＨＣＭＶ遺伝子に付加してマーカー遺伝
子の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げる； （ｉｉｉ）２個又はそれ以上の野生型ＨＣＭＶ遺伝子の
一部を置換して、β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子
の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げる； （ｉｖ）β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を２個の
ＨＣＭＶ遺伝子の間に挿入し、ＨＣＭＶ遺伝子の置換又
は分断を起こさず、ＨＣＭＶ遺伝子生成物をすべて発現
させる； ｂ．適した宿主細胞に組み換えＨＣＭＶを挿入し； ｃ．ＨＣＭＶ複製に好ましい適した条件下で宿主細胞を
増殖させ； ｄ．生成されたβ−グルクロニダーゼの量を測定し、 ｅ．試験化合物の存在下で段階（ａ）−（ｄ）を繰り返
し、 ｆ．（ｄ）及び（ｅ）の結果を比較し、試験化合物の存
在下で生成されるβ−グルクロニダーゼの量の減少又は
その阻害により試験化合物がＨＣＭＶを阻害することを
示す段階を含むことを特徴とする方法。
【０１５９】１０．第９項に記載の方法において、生成
されたβ−グルクロニダーゼの検出及び測定法が、蛍光
生成物を放出し、測定するような条件下で複合化学物質
とβ−グルクロニダーゼを接触させる段階を含むことを
特徴とする方法。
【０１６０】１１．第１０項に記載の方法において、複
合化学物質がメチルウンベリフェリルグルクロニドであ
り、蛍光生成物がメチルウンベリフェリンであることを
特徴とする方法。
【０１６１】１２．第１０項に記載の方法において、蛍
光の量を微量蛍光計で測定し、微量蛍光計における読み
取り値が低い試験化合物をＨＣＭＶの阻害剤と同定する
ことを特徴とする方法。
【０１６２】１３．第９項に記載の方法において、生成
したβ−グルクロニダーゼの検出及び測定法が、基質か
ら切断されると変色を起こす発色生成物を放出する条件
下でβ−グルクロニダーゼと複合化学物質を接触させる
段階を含むことを特徴とする方法。
【０１６３】１４．第１３項に記載の方法において、複
合化学物質がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニ
ド又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニドであることを特徴とする方法。
【０１６４】１５．第９項に記載の方法において、変色
を視覚により、又は分光光度計により測定することを特
徴とする方法。
【０１６５】１６．ＨＣＭＶゲノムに挿入したβ−グル
クロニダーゼマーカー遺伝子を含む、遺伝的に安定なＨ
ＣＭＶ組み換え構築物。
【０１６６】１７．第１６項に記載の遺伝的に安定なＨ
ＣＭＶ組み換え構築物において、構築物をＲＶ１３４，
ＲＶ６９９，ＲＶ１３１，ＲＶ１４５，ＲＶ６７，ＲＶ
８０，ＲＶ７２５，ＲＶ６９，ＲＶ１０２，ＲＶ８８，
ＲＶ９１，ＲＶ９２，ＲＶ１０１及びＲＶ６７０と指定
された構築物から成る群より選ぶことを特徴とする構築
物。
【図面の簡単な説明】
【図１】組み換えウィルス（ＲＶ）ゲノムの構成を示
す。第１の線は、ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９野生型（ＷＴ）
ゲノム中の５．２キロベースのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ Ｄ
ＮＡフラグメントを含むＵＳ６群の位置を示す。隣接す
るＨｉｎｄＩＩＩ−Ｖ ＤＮＡフラグメントも示す。陰
をつけた四角は、ＵＬに結合する逆方向反復であり、陰
をつけていない四角はＵＳと結合する逆方向反復であ
る。その下はこの領域の拡大であり、遺伝子のＵＳ６群
及び隣接遺伝子の構成を示す。以前にマッピングされた
（１７）この領域からの主な転写物のいくつかが、その
速度論的分類と共に（初期Ｅ；後期Ｌ）示され、その大
きさがキロベース（ｋｂ）で与えられている。転写の方
向は右から左である。転写開始部位はＴであり、ポリア
デニル化部位はＡｎである。
【図２】ＲＶ１３４のゲノム構成を示す。この組み換え
体は、示す通りＵＳ１０−ＵＳ９遺伝子間領域に挿入さ
れた２．８３ｋｂのβ−グルクロニダーゼ発現カセット
を含む。この挿入によるＨＣＭＶゲノム配列の欠失はな
い。矢印の頭（＞）は、読み取り枠のアミノ末端からカ
ルボキシル末端の方向を示す。第２の線（このパネルな
らびにパネルＣからＫ及びＭからＯにおいて）は、組み
換えウィルスの形成のために構築された直線状プラスミ
ドの関連領域の構成を示す。この領域から予想される転
写物を示し、その大きさをｋｂで示す。黒塗りの四角は
２．７Ｅプロモーター、ｐｒであり；β−グルクロニダ
ーゼ遺伝子に隣接するｔｋポリアデニル化シグナルをＡ
ｎとして示す。
【図３】ＲＶ６９９のゲノム構成を示す。β−グルクロ
ニダーゼ遺伝子がＵＳ１１転写開始部位に挿入され、Ｕ
Ｓ１１のＮ−末端６２アミノ酸（２１５から）をコード
する配列を含んでそこから２２０塩基（ｂ）下流を置換
している。この置換によりゲノムの大きさが１．６８ｋ
ｂ増加する。欠失した領域を第１の線の直下の陰をつけ
た四角により示す。内在ＵＳ１１プロモーターは、この
構築物中のβ−グルクロニダーゼの転写を調節する。こ
のパネル及び他のパネルにおいて、ＵＳ読み取り枠の部
分を、その番号をつけたＮ（アミノ末端の場合）又はＣ
（カルボキシル末端の場合）により略図で示す。例えば
β−グルクロニダーゼのすぐ下流は、ＵＳ１１読み取り
枠のＣ−末端１５３アミノ酸をコードする配列である
（Ｃ１１と標識）。３．２−及び０．９−ｋｂ転写物の
両方は、ＵＳ１０の下流の内在ポリアデニル化部位を用
いる。
【図４】ＲＶ１３１のゲノム構成を示す。β−グルクロ
ニダーゼ遺伝子は、ＵＳ１０転写開始部位に挿入され、
ＵＳ１１のＮ−末端１２０アミノ酸（１８５から）をコ
ードする配列を含んでそこから４０７−ｋｂ下流を置換
している。この置換によりゲノムの大きさが１．４９−
ｋｂ増加する。欠失した領域を陰をつけた四角で示す。
Ｃ−末端６５アミノ酸をコードする配列のみが残る（Ｃ
１０と標識）。β−グルクロニダーゼ遺伝子発現は、内
在ＵＳ１０プロモーターにより調節される。３．０−及
び２．４−ｋｂ転写物は、ＵＳ１０の下流のポリアデニ
ル化部位における３’共通−末端である。
【図５】ＲＶ６７のゲノム構成を示す。β−グルクロニ
ダーゼ遺伝子は、ＵＳ１１転写開始部位に挿入され、Ｕ
Ｓ１１コード領域全体及びＵＳ１０のＣ−末端６５アミ
ノ酸をコードする配列（Ｃ１０と標識）以外のすべてを
含んでそこから１．１２−ｋｂ下流を置換している。欠
失した領域を陰をつけた四角で示す。この置換によりゲ
ノムの大きさが０．７８−ｋｂ増加する。β−グルクロ
ニダーゼ遺伝子発現は、ＵＳ１１プロモーターにより調
節される。２．３−ｋｂ転写物のみを予示する。
【図６】ＲＶ１４５のゲノム構成を示す。２．７Ｅプロ
モーター誘起β−グルクロニダーゼ遺伝子をＵＳ１０転
写開始部位に挿入し、ＵＳ１０のアミノ末端１２０（合
計１８５から）アミノ酸をコードする配列を含んでそこ
から４０７−ｂ下流を置換している。この置換によりゲ
ノムの大きさが２．２６−ｋｂ増加する。欠失した領域
を陰をつけた四角で示す。ＵＳ１０のカルボキシル末端
６５アミノ酸をコードする配列のみが残る（Ｃ１０と標
識）。ＲＶ１４５は、２．７Ｅプロモーター調節β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子発現という点でのみＲＶ１３１と
異なる。
【図７】ＲＶ８０のゲノム構成を示す。β−グルクロニ
ダーゼ挿入により、５’非翻訳配列、ＵＳ９コード配列
全体及びほとんどのＵＳ８コード配列（２３５アミノ酸
中１７２をコード）を置換している。ＵＳ８のカルボキ
シ末端６３アミノ酸をコードする配列のみが残る（Ｃ８
と標識）。この置換により、ゲノムの大きさが０．８１
−ｋｂ増加する。欠失した領域を第１の線の直下の陰を
つけた四角により示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子発
現は、内在ＵＳ９プロモーターにより調節される。
【図８】ＲＶ７２５のゲノム構成を示す。２．７Ｅプロ
モーター誘起β−グルクロニダーゼ遺伝子をＵＳ７読み
取り枠の最初に挿入し、そのコード配列のほとんど（２
２５アミノ酸中１９９をコード）を置換している。３個
のアミノ末端アミノ酸をコードする配列の他に、２３個
のカルボキシ末端アミノ酸をコードする配列のみが残る
（Ｃ７と標識）。この置換によりゲノムの大きさが２．
０７−ｋｂ増加する。欠失した領域を第１の線の直下の
陰をつけた四角により示す。
【図９】ＲＶ６９のゲノム構成を示す。β−グルクロニ
ダーゼ挿入により、５’非翻訳配列及びＵＳ６読み取り
枠のコード配列のほとんど（１８３アミノ酸中１２０を
コード）を置換している。ＵＳ６のカルボキシ末端６３
アミノ酸をコードする配列のみが残る（Ｃ６と標識）。
この置換によりゲノムの大きさが１．５２−ｋｂ増加す
る。欠失した領域を第１の線の直下の陰をつけた四角に
より示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子発現は、内在Ｕ
Ｓ６プロモーターにより調節される。
【図１０】ＲＶ１０２のゲノム構成を示す。２．８３−
ｋｂのβ−グルクロニダーゼ発現カセット（ＲＶ１３４
中に示す；図２）の挿入により、ＵＳ１３読み取り枠を
分断してある。これは、カルボキシ末端１６３アミノ酸
をコードする配列からアミノ末端９８アミノ酸をコード
する配列を分離する。
【図１１】ＲＶ８８のゲノム構成を示す。２．８３−ｋ
ｂのβ−グルクロニダーゼ発現カセット（ＲＶ１３４中
に示す；図２）の挿入により、ＵＳ１２読み取り枠を分
断してある。これは、カルボキシ末端１５４アミノ酸を
コードする配列からアミノ末端１２７アミノ酸をコード
する配列を分離する。
【図１２】ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９野生型（ＷＴ）ゲノム
のＵＳ領域内のＢａｍＨＩ−ＳＤＮＡフラグメントの位
置を示す。第２線はこの領域の拡大であり、読み取り枠
ＵＳ２６からＵＳ３０の構成を示す。ＵＳ２７及びＵＳ
２８読み取り枠から生ずる転写物の大体の位置を示して
ある（２９）。
【図１３】ＲＶ９１のゲノム構成を示す。２．８３−ｋ
ｂのβ−グルクロニダーゼ発現カセット（ＲＶ１３４中
に示す；図２）の挿入により、ＵＳ２７読み取り枠を分
断してある。これは、カルボキシ末端２４６アミノ酸を
コードする配列からアミノ末端１１６アミノ酸をコード
する配列を分離する。
【図１４】ＲＶ９２のゲノム構成を示す。β−グルクロ
ニダーゼ発現カセット（ＲＶ１３４に示す；図２）を挿
入し、ＵＳ２８のアミノ酸７７−１４３（合計３２３ア
ミノ酸から）をコードする配列を置換している。残りの
アミノ末端７６アミノ酸及びカルボキシ末端１８０アミ
ノ酸をそれぞれＮ２８及びＣ２８と標識する。この置換
によりゲノムの大きさが２．６４−ｋｂ増加する。欠失
した領域を第１の線の直下の陰をつけた四角で示す。
【図１５】ＲＶ１０１のゲノム構成を示す。β−グルク
ロニダーゼ発現カセット（ＲＶ１３４に示す；図２）を
挿入し、ＵＳ２７のカルボキシ末端２４６アミノ酸（合
計３６２アミノ酸から）をコードする配列、ＵＳ２７及
びＵＳ２８の遺伝子間配列及びＵＳ２８の１４３アミノ
末端アミノ酸（合計３２３アミノ酸から）をコードする
配列を置換している。これらの読み取り枠中、ＵＳ２７
の１１６アミノ末端アミノ酸（Ｎ２７と標識）及びＵＳ
２８のカルボキシ末端１８０アミノ酸（Ｃ２８と標識）
のみが残る。この置換によりゲノムの大きさが１．４６
−ｋｂ増加する。欠失した領域を第１の線の直下の陰を
つけた四角で示す。
【図１６】組み換えＨＣＭＶ ＤＮＡのサザン法分析を
示し、原型指向中のＨＣＭＶゲノムの略図であり
（２）、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｑ、−Ｘ及び−Ｖ ＤＮＡ領
域を拡大してある。中抜きの四角は、ＵＳ６群読み取り
枠ＵＳ６からＵＳ１１までである（３）。ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（Ｈ）及びＸｈｏＩ（Ｘ）制限エンドヌクレアーゼ部
位の位置を示してある。示した各制限エンドヌクレアー
ゼ部位の間のｋｂを示す。ＨＣＭＶ−誘導プローブの位
置を示す。ＲＶ１３４へのβ−グルクロニダーゼ発現カ
セット挿入の位置を（ａ）で示す。β−グルクロニダー
ゼ遺伝子挿入位置及びＲＶ１３１、ＲＶ６９９及びＲＶ
６７中で欠失した野生型配列の量を、それぞれ角括弧し
た領域（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）により示す。ウィルス
ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ（列１，３，５，７及び９）
又はＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ（列２，４，６，８及び
１０）を用いて消化し、０．６％アガロースゲル中で電
気泳動を行った。
【図１７】図１６と同じ組み換えＨＣＭＶ ＤＮＡのサ
ザン法分析を示す。但し上記ウイルスＤＮＡをナイロン
膜に移した後、ＤＮＡをＨＣＭＶ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ
フラグメント誘導ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ（ＸＥ）プロー
ブ（パネルＢ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子プローブ
（パネルＣ）を用いてハイブリッド形成したことを示
す。ＤＮＡは、ＲＶ１３４（列１及び２）、ＲＶ６９９
（列３及び４）、ＲＶ１３１（列５及び６）、野生型株
ＡＤ１６９（列７及び８）、及びＲＶ６７（列９及び１
０）からのＤＮＡである。列Ｍは、末端標識ｇＨｉｎｄ
ＩＩＩ ＤＮＡマーカーを含み、その大きさを各パネル
の右にｋｂで示す。野生型からのハイブリッドＤＮＡフ
ラグメントの位置を、各パネルの左に大きさ（ｋｂで）
により、又は従来の文字指定により示す。すべての列
は、同一のゲルからのものであるが、異なる（最適の）
オートラジオグラフ露出を用いて像を作る。
【図１８】図１６と同じ組み換えＩＩＣＭＯ ＤＮＡの
サザン法分析を示す。但し上記ウイルスＤＮＡをナイロ
ン膜に移した後Ｈｉｎｄ−Ｑフラグメント誘導Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／ＸｈｏＩ（ＨＸ）プローブ（パネルＤ）、又は
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘ及び−Ｖ配列をいくらか含むＸｂａ
Ｉ／ＰｓｔＩフラグメントプローブ（ＸＰ）（パネル
Ｅ）を用いてハイブリッド形成したことを示す。ＤＮＡ
は、ＲＶ１３４（列１及び２）、ＲＶ６９９（列３及び
４）、ＲＶ１３１（列５及び６）、野生型株ＡＤ１６９
（列７及び８）、及びＲＶ６７（列９及び１０）からの
ＤＮＡである。列Ｍは、末端標識ｇＨｉｎｄＩＩＩ Ｄ
ＮＡマーカーを含み、その大きさを各パネルの右にｋｂ
で示す。野生型からのハイブリッドＤＮＡフラグメント
の位置を、各パネルの左に大きさ（ｋｂで）により、又
は従来の文字指定により示す。すべての列は、同一のゲ
ルからのものであるが、異なる（最適の）オートラジオ
グラフ露出を用いて像を作る。
【図１９】ＲＶ１３４−感染細胞のＲＮＡのノザン法分
析を示す。非感染ＨＦＦ細胞（列Ｕ）、感染後（“ｐ．
ｉ．”）直後の細胞（列ＩＥ）、ｐ．ｉ．初期の細胞
（列Ｅ）及びｐ．ｉ．後期の細胞（列Ｌ）からのＲＮＡ
を、β−グルクロニダーゼ遺伝子リボプローブ（パネル
Ａ）またはＵＳ１０リボプローブＡＢ（パネルＢ）とハ
イブリッド形成させる。細胞は、指示通り野生型（Ｗ
Ｔ）ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９又はＲＶ１３４のいずれかを
用いて感染させる。２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡの位置
を示す。ハイブリッド形成ＲＮＡの大きさをｋｂで示
す。β−グルクロニダーゼ遺伝子−含有リードスルー転
写物（ＲＴ）を示す。
【図２０】図１９と同様にＲＶ１３４−感染細胞のＲＮ
Ａのノザン法分析を示す。非感染ＨＦＦ細胞（列Ｕ）、
感染後（“ｐ．ｉ．”）直後の細胞（列ＩＥ）、ｐ．
ｉ．初期の細胞（列Ｅ）及びｐ．ｉ．後期の細胞（列
Ｌ）からのＲＮＡをＵＳ８−ＵＳ９リボプローブＰＰ
（パネルＣ）又はＵＳ９−ＵＳ１０遺伝子間リボプロー
ブＳＡ（パネルＤ）とハイブリッド形成させる。パネル
Ｄの列Ｌ＊は、感染し、１００μｇ／ｍｌのＰＦＡ（ホ
スホノホルメート三ナトリウム、Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ、
ＦｏｓｃａｖｉｒTM、Ａｓｔｒａ）の存在下でｐ．ｉ．
後期まで保持した細胞からのＲＮＡを含む。細胞は、指
示通り野生型（ＷＴ）ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９又はＲＶ１
３４のいずれかを用いて感染させる。２８Ｓ及び１８Ｓ
ｒＲＮＡの位置を示す。ハイブリッド形成ＲＮＡの大
きさをｋｂで示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子−含有
リードスルー転写物（ＲＴ）を示す。
【図２１】図２１はＨＣＭＶの野生型株ＡＤ１６９から
のＵＳ８−ＵＳ１１領域の図である。ＵＳ１０−ＵＳ１
１配列を含む、以前にマッピングされた野生型転写物を
略図の上部に示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子発現カ
セットの挿入位置を、（＃）により示す。ＨＣＭＶ遺伝
子−誘導リボプローブの位置を示す。制限エンドヌクレ
アーゼ部位は、ＡｐａＩ（Ａ）、ＢｓｍＩ（Ｂ）、Ｐｓ
ｔＩ（ＰＳ）、ＰｖｕＩＩ（Ｐｖ）、ＸｂａＩ（Ｘｂ）
及びＸｈｏＩ（Ｘｈ）であり、そのいくつかをリボプロ
ーブのためのフラグメントのクローニングに使用する。
【図２２】ＲＶ６９９−感染細胞ＲＮＡのノザン法分析
を示す。非感染ＨＦＦ細胞（列Ｕ）、感染後（“ｐ．
ｉ．”）直後の細胞（列ＩＥ）、ｐ．ｉ．初期の細胞
（列Ｅ）及びｐ．ｉ．後期の細胞（列Ｌ）からのＲＮＡ
を、β−グルクロニダーゼ遺伝子リボプローブ（パネル
Ａ）、ＵＳ１０リボプローブＡＢ（パネルＢ）、又はＵ
Ｓ１１リボプローブＸＸ（パネルＣ）とハイブリッド形
成させる。２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡの位置を示す。
ハイブリッド形成ＲＮＡの大きさをｋｂで示す。β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子内のかくれたプロモーターから生
じた転写物を星印（＊）で示す。
【図２３】ＨＣＭＶの野生型株ＡＤ１６９からのＵＳ８
−ＵＳ１１領域の略図を示す。リボプローブのためのフ
ラグメントのクローニングに用いる制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す：ＡｐａＩ（Ａ）、ＢｓｍＩ（Ｂ）、Ｘ
ｂａＩ（Ｘｂ）及びＸｈｏＩ（Ｘｈ）。ＵＳ１０−ＵＳ
１１配列を含む、以前にマッピングされた野生型転写物
を略図の上部に示す。ＲＶ６９９を与える組み換えの結
果として予想されるＲＮＡを略図の下部に示す。陰をつ
けた四角は、ＲＶ６９９−感染細胞ＲＮＡ中で欠失し、
β−グルクロニダーゼ遺伝子（スケールに合わせて書い
ていない）により置換された配列の位置及び量を示す。
ＨＣＭＶ遺伝子−誘導リボプローブの位置を示す。
【図２４】ＲＶ１３１−感染細胞ＲＮＡのノザン法分析
を示す。非感染ＨＦＦ細胞（列Ｕ）、感染後（“ｐ．
ｉ．”）直後の細胞（列ＩＥ）、ｐ．ｉ．初期の細胞
（列Ｅ）及びｐ．ｉ．後期の細胞（列Ｌ）からのＲＮＡ
を、β−グルクロニダーゼ遺伝子リボプローブ（パネル
Ａ）、ＵＳ１０リボプローブＡＢ（パネルＢ）、又はＵ
Ｓ１１リボプローブＸＸ（パネルＣ）とハイブリッド形
成させる。２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡの位置を示す。
ハイブリッド形成ＲＮＡの大きさをｋｂで示す。β−グ
ルクロニダーゼ遺伝子内のかくれたプロモーターから生
じた転写物を星印（＊）で示す。
【図２５】ＨＣＭＶの野生型株ＡＤ１６９からのＵＳ８
−ＵＳ１１領域の略図を示す。リボプローブのためのフ
ラグメントのクローニングに用いる制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す：ＡｐａＩ（Ａ）、ＢｓｍＩ（Ｂ）、Ｘ
ｂａＩ（Ｘｂ）及びＸｈｏＩ（Ｘｈ）。ＵＳ１０−ＵＳ
１１配列を含む、以前にマッピングされた野生型転写物
を略図の上部に示す。ＲＶ１３１を与える組み換えの結
果として予想されるＲＮＡを略図の下部に示す。陰をつ
けた四角は、ＲＶ１３１−感染細胞ＲＮＡ中で欠失し、
β−グルクロニダーゼ遺伝子（スケールに合わせて書い
ていない）により置換された配列の位置及び量を示す。
ＨＣＭＶ遺伝子−誘導リボプローブの位置を示す。
【図２６】ＲＶ６７−感染細胞ＲＮＡのノザン法分析を
示す。非感染ＨＦＦ細胞（列Ｕ）、感染後（“ｐ．
ｉ．”）直後の細胞（列ＩＥ）、ｐ．ｉ．初期の細胞
（列Ｅ）及びｐ．ｉ．後期の細胞（列Ｌ）からのＲＮＡ
を、β−グルクロニダーゼ遺伝子リボプローブ（パネル
Ａ）、又はＵＳ１０リボプローブＡＢ（パネルＢ）とハ
イブリッド形成させる。２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡの
位置を示す。ハイブリッド形成ＲＮＡの大きさをｋｂで
示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子−含有リードスルー
転写物（ＲＴ）を示す。β−グルクロニダーゼ遺伝子内
のかくれたプロモーターから生じた転写物を星印（＊）
で示す。パネルＣは、ＨＣＭＶの野生型株ＡＤ１６９か
らのＵＳ８−ＵＳ１１領域の略図を示す。リボプローブ
のためのフラグメントのクローニングに用いる制限エン
ドヌクレアーゼ部位を示す：ＡｐａＩ（Ａ）、ＢｓｍＩ
（Ｂ）、ＸｂａＩ（Ｘｂ）及びＸｈｏＩ（Ｘｈ）。ＵＳ
１０−ＵＳ１１配列を含む、以前にマッピングされた野
生型転写物を略図の上部に示す。ＲＶ６７を与える組み
換えの結果として予想されるメッセージを略図の下部に
示す。陰をつけた四角は、ＲＶ６７−感染細胞ＲＮＡ中
で欠失し、β−グルクロニダーゼ遺伝子（スケールに合
わせて書いていない）により置換された配列の位置及び
量を示す。ＨＣＭＶ遺伝子−誘導リボプローブの位置を
示す。
【図２７】ウィルス感染細胞の全タンパク質分析を示
す。ＨＦＦ細胞は、非感染（列Ｕ）であるか、又は野生
型株ＡＤ１６９（列ＷＴ）、ＲＶ１３４（列ＲＶ１３
４）あるいはＲＶ６９９（列ＲＶ６９９）を用いて感染
の多重度＝５で感染させてある。感染後（又は疑似感
染）６８−７２時間で、下記の通り35Ｓ−メチオニン／
システインを用いてタンパク質を代謝により標識する。
溶菌細胞を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にか
け、タンパク質をクーマシーブルーで染色する。ゲルを
Ｘ−線フィルム（Ａ）に露光し、写真を撮る（Ｂ）。６
８ｋＤ β０グルクロニダーゼタンパク質の位置を示
す。
【図２８】組み換えウィルス−感染溶菌細胞からのＵＳ
１０及びＵＳ１１タンパク質の免疫沈降を示す。ＨＦＦ
細胞は、非感染（列Ｕ）であるか、又は野生型株ＡＤ１
６９（ＷＴ）、ＲＶ１３４、ＲＶ６９９、ＲＶ１３１又
はＲＶ６７を用いて感染の多重度＝５で感染させてあ
る。感染後（又は疑似感染）８−１２時間で、35Ｓ−メ
チオニン／システインを用いてタンパク質を代謝により
標識する。パネルＡは、ＵＳ１１免疫抗血清を用いた免
疫沈降溶菌細胞を示す（列２−８）。同うさぎからの免
疫前血清を列１に用いる。列１−２及び３−８は、異な
る１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる。パネルＢは、Ｕ
Ｓ１０免疫抗血清を用いた溶菌細胞の免疫沈降を示す。
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いる。Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ 14Ｃタンパク質分子量マーカーの位置を、各パネル
の左に示す。ＵＳ１１又はＵＳ１０免疫沈降タンパク質
の位置も示す。
【図２９】組み換えウィルスの一段増殖曲線を示す。
【図３０】野生型ＡＤ１６９株を用いた（パネルＡ）円
形表現型を示す感染後２４時間（感染の多重度２にて）
のＨＦＦ細胞、又はＲＶ６７０を用いた（パネルＢ）繊
維芽細胞の形態を示す感染後２４時間のＨＦＦ細胞を示
す。比較のために非感染ＨＦＦ細胞も示す（パネル
Ｃ）。
【図３１】組み換えウィルスゲノムの構成を図１〜１５
と類似の方法で示す。パネルＡにおいて、第１の線は、
ＨＣＭＶ野生型ゲノムの構成全体の略図であり、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−Ｑ、−Ｘ及び−Ｖ領域の位置を示している。
第２の線は、これらの領域の拡大であり、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（Ｈ）及びＸｈｏＩ（Ｘ）制限酵素部位の位置と大き
さを示す。ＤＮＡブロット分析に用いたいくつかのハイ
ブリッド形成プローブの位置を示す。パネルＢからＣに
おいて、それぞれＲＶ３５、ＲＶ４７、のゲノム構成を
示す。各組み換え体の鍵制限酵素部位及びフラグメント
サイズを示す。括弧内の制限酵素部位は、組み換えによ
り変異ウィルスを生じた結果、欠失した。野生型ゲノム
（第１の線）中、組み換えによる変異体の形成により欠
失した領域は、長方形により示す。これらのパネルの第
２の線は、組み換えウィルスの形成のために構築された
直線状プラスミドの関連領域の構成を示す。
【図３２】組み換えウィルスゲノムの構成を図１と類似
の方法で示す。パネルＡにおいて、第１の線は、ＨＣＭ
Ｖ野生型ゲノムの構成全体の略図であり、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−Ｑ、−Ｘ及び−Ｖ領域の位置を示している。第２の
線は、これらの領域の拡大であり、ＨｉｎｄＩＩＩ
（Ｈ）及びＸｈｏＩ（Ｘ）制限酵素部位の位置と大きさ
を示す。ＤＮＡブロット分析に用いたいくつかのハイブ
リッド形成プローブの位置を示す。パネルＤからＥにお
いて、それぞれＲＶ５１２２及びＲＶ４６のゲノム構成
を示す。各組み換え体の鍵制限酵素部位及びフラグメン
トサイズを示す。括弧内の制限酵素部位は、組み換えに
より変異ウィルスを生じた結果、欠失した。野生型ゲノ
ム（第１の線）中、組み換えによる変異体の形成により
欠失した領域は、長方形により示す。これらのパネルの
第２の線は、組み換えウィルスの形成のために構築され
た直線状プラスミドの関連領域の構成を示す。
【図３３】ＨＣＭＶ組み換え変異体ゲノムＤＮＡのブロ
ット分析を示す。ＨＣＭＶ野生型株ＡＤ１６９又は指示
する組み換えウィルス（ＲＶ）ＤＮＡのいずれかを、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ（列Ｈ）又はＸｈｏＩ（列Ｘ）を用いて消
化し、電気泳動にかけ、ブロットし、β−グルクロニダ
ーゼプローブ（パネルＡ）、ＸＸ−３．６プローブ（パ
ネルＢ）又はＸＰプローブ（パネルＣ）とハイブリッド
形成させる。結合（Ｊ）又は末端（Ｔ）領域フラグメン
トの位置、又はＨｉｎｄＩＩＩ消化物とハイブリッド形
成したフラグメントの大きさを、各パネルの左に示す；
ＸｈｏＩ消化物中でハイブリッド形成するフラグメント
の大きさは、右に示す。β−グルクロニダーゼ及びＸＸ
−３．６プローブとハイブリッド形成したフラグメント
と同一の、ＲＶ３５の末端及び結合領域ＤＮＡフラグメ
ントへのＸＰプローブのハイブリッド形成は、パネルＣ
のオートラジオグラムをより長期に暴露することにより
明確に検出することができる。
【図３４】ＲＶ５１２２（パネルＡ）、ＲＶ４７（パネ
ルＢ）、ＲＶ３５（パネルＣ）ＲＶ４６（パネルＤ及び
Ｅ）及び野生型株ＡＤ１６９（パネルＦ）に感染したＨ
ＦＦ細胞を示す。感染の多重度は２（パネルＡ−Ｄ）又
は１０（パネルＥ及びＦ）である。感染後２４時間で写
真を撮った。
【図３５】野生型ＨＣＭＶ−感染細胞からの細胞質ＲＮ
Ａのブロット分析である。パネルＡではＩＲＳ１の非反
復領域配列に特異的なリボプローブを用い；パネルＢで
はＵＳ１配列に特異的なリボプローブを用い；パネルＣ
ではＵＳ２に特異的なリボプローブを用いる。非感染細
胞（Ｕ）、直後の状態の細胞（ＩＥ）、初期の状態の細
胞（Ｅ）及び後期の状態の細胞（Ｌ）からの全細胞質Ｒ
ＮＡをパネルＡ−Ｃにおいて使用する。
【図３６】野生型ＨＣＭＶ−感染細胞からの細胞質ＲＮ
Ａのブロット分析である。パネルＤ及びＥではＩＲＳ１
の非反復領域配列に特異的なリボプローブを用い；パネ
ルＢではＵＳ１配列に特異的なリボプローブを用い；パ
ネルＣではＵＳ２に特異的なリボプローブを用いる。非
感染細胞（Ｕ）、直後の状態の細胞（ＩＥ）、初期の状
態の細胞（Ｅ）及び後期の状態の細胞（Ｌ）からの全細
胞質ＲＮＡをパネルＡ−Ｃにおいて使用する。パネルＤ
及びＥでは、非感染細胞、又は感染後示した時間経過し
た細胞からの全細胞質ＲＮＡを用いる。ハイブリッド形
成ＲＮＡの大体の大きさをｋｂで示す。２８Ｓ及び１８
Ｓ ｒＲＮＡの位置も示す。
【図３７】組み換え変異体ＲＶ５１５１ゲノムの構成を
示す。パネルＡ及びパネルＢは、図３１に記載のものと
類似である。
【図３８】感染の多重度２においてＲＶ５１５１に感染
させたＨＦＦ細胞を示す。感染後２４時間で写真を撮っ
た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/70 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｒ 1:92） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 (72)発明者 ビエラ・ピー・ムジスラス アメリカ合衆国ニユーヨーク州10950モン ロー・サンセツトハイツ（番地なし) (72)発明者 ヤコブ・グラズマン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07458 アツパーサドルリバー・ピーチツリープレ イス24

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＣＭＶの初期円形表現型に必要なタン
    パク質をコードするＨＣＭＶ核酸配列。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベ
    クター。
  3. 【請求項３】 請求項３に記載の発現ベクターを用いて
    安定に形質転換した宿主細胞。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の核酸によりコードされ
    る単離タンパク質。
  5. 【請求項５】 遺伝子が、野生型ヒトサイトメガロウィ
    ルス（ＨＣＭＶ）の複製に関して非−必須であるかどう
    かを決定する方法において： ａ．β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を野生型ＨＣ
    ＭＶゲノムに挿入して遺伝子の発現を妨げ、それにより
    組み換えＨＣＭＶゲノムを形成し； ｂ．組み換えＨＣＭＶゲノムをを適した宿主細胞に導入
    し； ｃ．適した条件下で宿主細胞を増殖し、ＨＣＭＶウィル
    スの複製を起こし； ｄ．子孫ウィルスの存在に関して宿主細胞をスクリーニ
    ングし； ｅ．子孫ウィルスの存在により、遺伝子が野生型ＨＣＭ
    Ｖの複製に非−必須であることを示す段階を含むことを
    特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 ＨＣＭＶ複製を阻害する化合物の同定法
    において： ａ．β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を、以下から
    成る群より選んだ方法でＨＣＭＶゲノム中に挿入し、Ｈ
    ＣＭＶ組み換え体を構築し： （ｉ）野生型ＨＣＭＶ遺伝子の一部を置換してマーカー
    遺伝子の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げ
    る； （ｉｉ）野生型ＨＣＭＶ遺伝子に付加してマーカー遺伝
    子の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げる； （ｉｉｉ）２個又はそれ以上の野生型ＨＣＭＶ遺伝子の
    一部を置換して、β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子
    の挿入により野生型遺伝子の生成物の発現を妨げる； （ｉｖ）β−グルクロニダーゼマーカー遺伝子を２個の
    ＨＣＭＶ遺伝子の間に挿入し、ＨＣＭＶ遺伝子の置換又
    は分断を起こさず、ＨＣＭＶ遺伝子生成物をすべて発現
    させる； ｂ．適した宿主細胞に組み換えＨＣＭＶを挿入し； ｃ．ＨＣＭＶ複製に好ましい適した条件下で宿主細胞を
    増殖させ； ｄ．生成されたβ−グルクロニダーゼの量を測定し、 ｅ．試験化合物の存在下で段階（ａ）−（ｄ）を繰り返
    し、 ｆ．（ｄ）及び（ｅ）の結果を比較し、試験化合物の存
    在下で生成されるβ−グルクロニダーゼの量の減少又は
    その阻害により試験化合物がＨＣＭＶを阻害することを
    示す段階を含むことを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 ＨＣＭＶゲノムに挿入したβ−グルクロ
    ニダーゼマーカー遺伝子を含む、遺伝的に安定なＨＣＭ
    Ｖ組み換え構築物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU650085B2 (en) * 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
US5846806A (en) * 1994-07-29 1998-12-08 American Cyanamid Company Identification of a human cytomegalovirus gene region involved in down-regulation of MHC class I heavy chain expression
US5945276A (en) * 1996-04-10 1999-08-31 Signal Pharmaceuticals, Inc. Reporter cell line system for detecting cytomegalovirus and identifying modulators of viral gene expression
US5910411A (en) * 1996-09-30 1999-06-08 Signal Pharmaceuticals, Inc. Method for identifying agents that modulate transcription of human cytomegalovirus polymerase
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LT2691530T (lt) * 2011-06-10 2018-08-10 Oregon Health & Science University Cmv glikoproteinai ir rekombinantiniai vektoriai
WO2014138209A1 (en) 2013-03-05 2014-09-12 Oregon Health & Science University Cytomegalovirus vectors enabling control of t cell targeting
AU2015289560B2 (en) 2014-07-16 2018-09-27 Oregon Health & Science University Human cytomegalovirus comprising exogenous antigens
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0074808A3 (en) * 1981-09-16 1984-07-04 University Patents, Inc. Recombinant method and materials
JPH0335784A (ja) * 1989-06-30 1991-02-15 Meiji Milk Prod Co Ltd 置き換え型発現ベクター

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