JPH069509B2 - 摘出膵臓からランゲルハンス氏島を分離する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 《産業上の利用分野》 本発明は糖尿病の治療や膵癌、慢性膵炎等による膵全摘
出後、その内分泌機能回復のために用いられるランゲル
ハンス氏島を、摘出された膵臓から分離するための方法
に関する。

《従来の技術》 既知の通り、重度の糖尿病患者の根本的治療法として、
膵臓移植に関する研究が盛んに行なわれてきており、実
際の症例も年々増加している。

ところが、免疫抑制方法の問題を始めとして、膵管再建
術後の血栓防止、臓器保存方法等、充分に解決されてい
ない問題が多々ある為に、いまだ成功率は心臓、肝臓等
に比してかなり低く、例えば１９８３年には世界で１３
２例の膵移植が行われたが、同年末での１年グラフト生
着率は２５％に過ぎず、いまだ実験的段階を脱していな
いといえる。

そこで最近、膵臓器移植に代る方法として膵内にある特
異な細胞群であるランゲルハンス氏島細胞を膵本体から
分離して、これだけを移植する手段が注目され、各国各
期間で研究が推進され、その有効性が確かめられてきて
いる。

既知の通り、ランゲルハンス氏島は、外分泌器管である
膵内におけるインシュリン、グルカゴン等の内分泌器管
であって、これらのホルモンによって体内の糖の代謝を
コントロールしているものである。

特にインシュリンの分泌が減少したり、あるいは分泌が
充分であっても、有効に作用し得ない状態になると血中
糖度が上昇して糖尿病に至るのである。

従って少なくとも糖尿病治療の為であれば、前記の如く
決して生着率が高くなく、各種の危険を伴う膵臓移植を
大手術によって行なう必要はなく、ランゲルハンス氏島
細胞だけ移植すれば目的は達せられるのである。

ランゲルハンス氏島は、小さな細胞群に過ぎないので、
移植手段も極めて容易かつ小規模で、手術そのものに伴
なう危険性もなく、免疫学的問題も含めて、術後の問題
点も極めて軽微で安全であるうえ、他の臓器、例えば腎
臓の被膜下等に移植しても機能が発揮される事が分って
おり、従来の膵臓移植に比して極めて魅力的な方法であ
る。

更に糖尿病のみならず、膵癌、慢性膵炎等に、よる膵全
摘出後の内分泌機能回復対策としての自家ランゲルハン
ス氏島の移植も検討されている。

ところが、そのランゲルハンス氏島移植に関して１つの
大きな障害がある。

それは特に人を含む中、大型哺乳動物においては、従来
研究されてきた方法によると、ランゲルハンス氏島細胞
移植を無傷で、しかも高い回収率で分離する事が極めて
困難なことである。

それは、分離が比較的容易なラットやハムスターと異っ
て、中、大型の哺乳動物のランゲルハンス氏島が、複雑
な形状をしている上、ランゲルハンス氏島細胞とその周
辺の外分泌細胞が複雑に入り組んでおり、周囲の血管、
膵管、結合組織が極めて豊富な事等による。

それでも主として人および人と同様にランゲルハンス氏
島細胞の分離が困難な犬の摘出膵臓を用いて、それに損
傷を与えることなく、高い回収率で分離するためのいく
つかの方法が提案されている。

例えば、ラットやハムスター等に対して従来から用いら
れてきた、コラゲナーゼ等の酵素による分離法の適用、
あるいはベルクロに組織を貼り付けて振盪させることで
分離するベルクロ法等である。

しかし乍ら、前述の如く人、犬等のランゲルハンス氏島
からの分離が困難な状態となっている為、例えば前者の
方法によるときは、摘出膵臓そのままの状態では、殆ど
分離しない為これを、あらかじめ１〜２mm程度に細かく
切ってから酵素処理する必要があり、従って当該細切時
の物理的損傷が大きく、加えて酵素を多量に用いる為、
結局肝心のランゲルハンス氏島細胞までが酵素に侵され
勝ちとなって、殆ど有効でなく、又、後者の手段にあっ
ても、前者よりも好結果が得られるとはいえ、いぜん低
回収率である。

《発明が解決しようとする問題点》 本発明は上記の問題点を解消するため、摘出膵臓に対し
て適切な液体注入の前処理を施した上で、これを凍結粉
砕して微細粒となし、これを解答した後に比重分離の手
段によって、ランゲルハンス氏島細胞を回収するように
なし、このように処理することで、ランゲルハンス氏島
を高い回収率で分離可能にしようとするのが、その目的
である。

《問題点を解決するための手段》 本発明は上記の目的を達成するために、摘出した膵臓の
主膵管からは、生理的食塩水等の無菌凍結性液体を、腹
腔動脈からは、凍害防止剤を、所要温度条件下、夫々注
入する第１工程で前処理工程と、第１工程による膵臓全
体を凍結粉砕して微細粒とする第２工程と、第２工程に
よる微細粒を解凍した後、比重分離手段によりランゲル
ハンス氏島細胞する回収する第３工程とからなることを
特長する摘出膵臓からランゲルハンス氏島を分離する方
法を提供しようとするものである。

《実施例》 本発明に係る方法を第１図の参照のよって説示すれば、
先ず凍結の前処理工程である第１工程として、同図に示
された膵臓１にあって、その腹腔動脈２からはハンクス
液やＭＥＭ等の培養液あるいはグリセリンなどの一種ま
たは混合液にＤＭＳＯ（ジメチルスルオキシド）を加え
た凍害防止材ａを潅流するのであり、これによって上記
動脈２はランゲルハンス氏島３を網目状をなして通って
いるから、凍害防止剤ａは、当該ランゲルハンス氏島３
に極めてよく浸透することとなる。

一方膵臓１の外分泌組織のみに張り巡らされているが、
ランゲルハンス氏島３の細胞には通じていない主膵管４
の出口4aからは、無菌凍結性液体ｂ、すなわち凍結し易
く無菌である、従って凍結防止剤を含まない液体、例え
ば生理的食塩水、無菌純水、Hanks液（培養液）等を、
逆流的に注入するのである。

このような注入処理によってランゲルハンス氏島３と、
その周囲組織との間隙に、生理的食塩水等による無菌凍
結性液体ｂが満たされることとなる。

さて、上記の如き凍結の前処理を行った後に、当該膵臓
１を、液体窒素、液体空気、液体ヘリウム等の低温液化
ガス冷媒とか、冷凍機を用いることで、望ましくは制御
によって、冷却速度を制御しながら冷却して凍結を進
め、所定温度まで降下したならば、極低温を保持するこ
とで、当該膵臓の内部組織まで完全に凍結させる。

次に、この凍結物を粉砕して1.0mmφ以下、望ましくは
0.1〜0.2mmφ程度の微粒に粉砕するのであるが、その前
処理として予めハンマー等を用いて粉砕機に投入できる
程度の大きさに粗粉砕を行うようにするのがよく、この
ような第２工程における機械的な手段によることなく、
超音波粉砕によっても目的は達成可能である。

第２工程で得られたランゲルハンス氏島３の細胞が含ま
れた凍結膵臓砕粒を解凍し、この解凍物についてPercol
lまたはFicoll等による比重分離手段により、ランゲル
ハンス氏島細胞群だけを、他の組織細胞から分離するの
が第３工程であり、これにより施術に供し得る目的物が
得られる。

ここで、もちろん上記目的物を、直ちに使用するとき
は、これを解凍することになるが、後刻の使用であれば
これを保存容器に入れて、そのまま液体窒素等の低温液
化ガス中に保存しておけばよい。

ここで本発明に係る上記の第１工程にあって、生理的食
塩水などによる無菌凍結性液体ｂを注入したのは、ラン
ゲルハンス氏島３とその周囲外分泌組織との間隙を
開、これにより形成された空隙に生理的食塩水等が満た
されることとなり、これが第２工程の凍結処理により凍
結して、ランゲルハンス氏島の周囲に厚めの氷層を形成
するためである。

このような状態で粉砕処理を施せば、当該氷層の部分か
ら割れ易くなって、これよりランゲルハンス氏島とその
周囲組織とを分離し易くなり、この結果回収したランゲ
ルハンス氏島細胞群が付着せず、回収率を高くすること
ができるのである。

しかも、この際前記の如くランゲルハンス氏島３には凍
害防止剤ａが充分浸透しているから、凍結処理に際し、
凍結をおこしてランゲルハンス氏島細胞が損傷を受ける
といった支障もなく、これに加えて前掲従来の酸素処理
法の如く、生の状態で細かく切断するのとは異なり、本
発明では凍結状態で粉砕の外力を加えるので、粉砕操作
時における損傷も極めて軽微なものとなり、またベルク
ロ法に見られるような細胞の逸失もないので、前記のよ
うにランゲルハンス氏島細胞回収率も極めて高いものと
なる。

ここで上記発明に係る方法の実施につき、その具体例を
説示するが、先ずそのために用いて、第１工程と第２工
程の凍結処理まで行なうことのできる注入凍結装置につ
いて説示する。

図中５は、設定温度例えば４℃で液体状態である冷媒６
（例えばフロン11）を、断熱容器７に満たして構成した
冷却用の恒温槽である。

これには、図示されていない供給源から液体窒素や液体
空気などによる低温液化ガス８が、先端側のノズルより
上記冷媒６内へ噴出されるよう、冷源供給パイプ９が配
設されており、当該冷媒６の温度を検知する温度センサ
10の検知信号を受けた温度コントローラ11によって、上
記冷源供給パイプ９に介設の開閉弁12が、オンオフ制御
されるようになっている。

上記恒温槽５の冷媒６内には、２個の熱交換器13,13'が
浸漬されていて、これらには夫々薬容器14,14'から10%
ＤＭＳＯ等の凍害防止剤ａ、生理的食塩水などの無菌凍
結性液体ｂが供給されるよう配管してあると共に、同熱
交換器13,13'の他端側は、夫々注入ポンプ15,15'を具備
した配管16,16'によって、冷蔵庫などによる膵臓用恒温
槽17と連通されている。

さらに、当該恒温槽17内に延出された配管16,16'の先端
には、連結チューブ18,18'が連結され、図中19は当該恒
温槽17の天面に設けた覗き窓20は同槽17に内接された膵
臓１に載置連通台を示している。

そこで、上記装置を用いて本法を実施するには、摘出し
た膵臓１を膵臓用恒温槽17に収納して、１〜１０℃程度
望ましくは４℃前後に保持されるようにし、これにより
膵臓１が自己融解することを、低温保持によって防止す
るのである。

また恒温糟５も、その冷媒６が４℃程度に保持され得る
よう運転させ、このことにより薬液容器14,14'から供給
される薬液たるａ，ｂが同熱交換器13,13'で、当該所定
冷媒温度まで冷却され、これを注入ポンプ15,15'の稼動
により配管16,16'を介して膵臓用恒温糟17内の膵臓１に
供給することとなるが、もちろんこの際連結チューブ1
8,18'を夫々腹腔動脈２、主膵管４に連結しておくこと
になる。

かくして、凍害防止剤ａ、無菌凍結性液体ｂ、が夫々腹
腔動脈２、主膵管４から供給されるが、ここで上記のよ
うに膵臓１内に注入される薬液を膵臓１の温度と同等の
４℃に冷却保持するようにしたのは、薬液注入による膵
臓１の温度上昇、温度変化を防ぐためであり、またこの
際凍害防止剤ａには、ハンクス液、ＭＥＭ等の培養液に
望ましくは１０％前後のＤＭＳＯ、あるいはグリセリン
等を加えた溶液を用いるのがよく、また潅流速度は２０
ml/min程度、所要時間は略２０分でよい。

この注入の進行に際しては、膵臓用恒温槽17の覗き窓か
ら、当該膵臓１の膨れ具合を観察して、注入の終了時期
を確認するのがよい。

このようにして薬液注入を終ったならば、膵臓１を当該
恒温槽17から取り出して、第３図に示すフリーザー21に
移して凍結処理を開始する。

ここで第３図中22は液体窒素、液体空気等の低温液化ガ
スを、先端ノズル22'から噴出する冷媒供給パイプ、23
は同パイプ22に介設され温度コントローラ24によりオン
オフ制御される開閉弁、25は攪拌用ファン、26は温度コ
ントローラ24により制御されるヒータ、27は通孔載置板
を示している。

もちろん、このようなフリーザー21ではなく、比較的極
低温を得られる多元式冷凍機を使用することも可能であ
る。

ここで、さらに当該フリーザー21には、冷却速度が設定
できるプログラムフリーザーを用いるのが望ましく、こ
れによって冷却速度を毎分１〜２℃程度とすれば、より
良好な結果を得ることができる。

さらに好ましくは、上記の冷却速度を設定してフリーザ
ー21を起動させ、約５０分間位で、−８０℃まで冷却が
進んだならば、当該膵臓１をフリーザー21より取り出
し、別途用意した液体窒素の低温液化ガス中に浸漬して
極低温まで充分に冷却するのがよい。

次に上記のようにして凍結処理の完了した膵臓１を取り
出して、これを耐衝撃性の図示しない容器に入れ、当該
膵臓１と容器とを低温液化ガス等で充分に冷却しなが
ら、ハンマー等でこの凍結膵を粉砕機に投入できる程度
の大きさをもったブロックＡに粗砕する。

次いで、このブロックＡを例えば第４図(a)のコーヒー
ミル28の如き粉砕機に投入して１mmφ以下望ましくは0.
1〜0.2mmφ程度の微粒Ｂとする。

ここで第４図の29は低温液化ガスを示し、同図(a)の30
はモータを示しており、同図(b)は自動ハンマー31で叩
き潰す粉砕機32で、同図(c)はクラッシャー33で挟み潰
す粉砕機34を示しており、このような機械的手段の外、
前記の超音波粉砕手段を採択してもよいが、何れの粉砕
手段によるとしても、粉砕中に解凍が生じないように粉
砕機を低温液化ガス中に浸したり、同ガスを噴霧したり
して低温条件を保持するよう配慮すべきである。

このようにして得られた細粒Ｂは、これを直ちに移植し
ょうとするのであれば、これを解凍してFicoll等により
比重差による細胞選別を行うことで、ランゲルハンス氏
島を得、これを移植に供することになるが、さもなけれ
ば解凍することなく、そのまま全細粒を保存容器に入れ
て、液体窒素等の低温液化ガス中に浸漬保存しておき、
必要に応じ解凍、細胞選別を行うこととなる。

ここで解凍は、３７℃に温められたHanks液またはＭＥ
Ｍ液中に浸漬することにより行ったが、同液に漬けるこ
とで瞬時の解凍が行なわれた。

尚ここで、第２図の恒温槽５には冷凍機を用いることも
でき、また第２図と第３図のように膵臓用恒温槽17とフ
リーザー21とを、夫々注入用、凍結用として格別に使用
しているが、フリーザー21の方に覗き窓を設けておき、
膵臓用恒温槽17を省略して、当該フリーザー21に両者の
機能を兼用させることも可能であり、もちろんこのよう
な場合には、薬液の注入時に４℃となるよう設定してお
き、その後、次第に温度降下して行くプログラムを設定
しておけばようこととなる。

《発明の効果》 本発明に係る方法は、上記のようにして実施するもので
あるから、摘出された膵臓から容易に、しかも無傷のラ
ンゲルハンス氏島を分離することができると共に、その
回収率も従来法に比し極めて高いものとなり、しかも施
術までの保存性も良好で移植の必要時には、可成り迅速
にランゲルハンス氏島の細粒を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は摘出膵臓の模型的説明図、第２図は本発明に係
る摘出膵臓からランゲルハンス氏島を分離する方法のう
ち、第１工程と第２工程の一部とを実施するのに用い得
る注入凍結装置の構成説明図、第３図は第２工程の後半
を行ない得るフリーザーの縦断正面図、第４図の(a)(b)
(c)は各種の粉砕機例を示した縦断正面説明図である。 １‥‥‥膵臓 ２‥‥‥腹腔動脈 ３‥‥‥ランゲルハンス氏島 ４‥‥‥主膵管 ａ‥‥‥凍害防止剤 ｂ‥‥‥無菌凍結性液体

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】摘出した膵臓の膵管からは、生理的食塩水
   等の無菌凍結性液体を、腹腔動脈からは、凍害防止剤
   を、所要温度条件下、夫々注入する第１工程である前処
   理工程と、第１工程による膵臓全体を凍結粉砕して微細
   粒とする第２工程と、第２工程による微細粒を解凍した
   後、比重分離手段によりランゲルハンス氏島細胞を回収
   する第３工程とからなることを特徴とする摘出膵臓から
   ランゲルハンス氏島を分離する方法。
2. 【請求項２】第２工程による膵臓全体を凍結粉砕して得
   る微粒子の大きさは、直径１mm以下である特許請求の範
   囲第１項記載の摘出膵臓からランゲルハンス氏島を分離
   する方法。
3. 【請求項３】第１工程での所要温度条件が、摘出した膵
   臓を０℃〜１０℃の低温にすると共に、注入される無菌
   凍結性液体、凍害防止剤も、上記膵臓の保持低温とした
   特許請求の範囲第１項記載の摘出膵臓からランゲルハン
   ス氏島を分離する方法。
4. 【請求項４】第２工程の凍結粉砕が、液体窒素などの低
   温液化ガスにより、毎分１℃〜２℃の冷却降温速度にて
   行われる凍結処理後の粉砕によって実施される特許請求
   の範囲第１項記載の摘出膵臓からランゲルハンス氏島を
   分離する方法。