JPH0690180B2 - 核酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キット - Google Patents
核酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キットInfo
- Publication number
- JPH0690180B2 JPH0690180B2 JP63247480A JP24748088A JPH0690180B2 JP H0690180 B2 JPH0690180 B2 JP H0690180B2 JP 63247480 A JP63247480 A JP 63247480A JP 24748088 A JP24748088 A JP 24748088A JP H0690180 B2 JPH0690180 B2 JP H0690180B2
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- Japan
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- nucleic acid
- sample
- base sequence
- electrophoresis
- nucleotide sequence
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は、けい光標識を用いたゲル電気泳動法による核
酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キットに関
し、更に詳しくはゲル電気泳動装置の試料孔にけい光標
識された核酸断片を含む試料を注入するさい、電気的に
中性もしくはプラスに帯電しており、電気泳動時に試料
中の核酸断片と挙動を異にし、かつ、核酸に対して活性
な官能基を有しない着色用の色素を添加するものであ
る。
酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キットに関
し、更に詳しくはゲル電気泳動装置の試料孔にけい光標
識された核酸断片を含む試料を注入するさい、電気的に
中性もしくはプラスに帯電しており、電気泳動時に試料
中の核酸断片と挙動を異にし、かつ、核酸に対して活性
な官能基を有しない着色用の色素を添加するものであ
る。
（従来の技術） 従来核酸塩基配列決定法としては、デオキシリボ核酸
（DNA）の一端を32Pまたは32Sなどの放射性同位元素で
標識したのち、特定の塩基のところで化学的に分解し、
得られたいろいろの長さの断片をゲル電気泳動にかけ、
オートラジオグラフィーを行うことにより、Ｘ線フィル
ム上のバンドの並び方から塩基配列を読みとるマクサム
−ギルバート（Maxam−Gilbert）法や、１本鎖DNAに短
い相補性DNA鎖を結合させ、これをプライマーとしてDNA
ポリメラーゼなどの酵素を用い、基質となるデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸（dNTP）と合成阻害剤であるジ
デオキシヌクレオシド三リン酸（ddNTP）との競合反応
を利用して３′未満側の鎖長の違うDNAを合成し、ゲル
電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーによっ
て放射性同位元素で標識されたdNTPの位置を検出し、比
較することによって塩基配列を決定するジデオキシ（di
deoxy）法［別称サンガー（Sanger）法］が知られてい
る。これらの方法はいずれもDNA断片をゲル電気泳動さ
せ、その泳動パターンを読みとることで塩基配列を決定
するものであり、読みとる手段として放射性同位元素に
よる標識が行われている。これに対して放射性同位元素
を用いない安全な標識手段としてけい光による標識が提
案されており、特開昭60−242368号公報には、DNA試料
を４分割し、それぞれを異なる励起波長を有するけい光
色素で標識することで、一本のカラムによる電気泳動で
塩基配列を決定する方法が開示されている。
（DNA）の一端を32Pまたは32Sなどの放射性同位元素で
標識したのち、特定の塩基のところで化学的に分解し、
得られたいろいろの長さの断片をゲル電気泳動にかけ、
オートラジオグラフィーを行うことにより、Ｘ線フィル
ム上のバンドの並び方から塩基配列を読みとるマクサム
−ギルバート（Maxam−Gilbert）法や、１本鎖DNAに短
い相補性DNA鎖を結合させ、これをプライマーとしてDNA
ポリメラーゼなどの酵素を用い、基質となるデオキシリ
ボヌクレオシド三リン酸（dNTP）と合成阻害剤であるジ
デオキシヌクレオシド三リン酸（ddNTP）との競合反応
を利用して３′未満側の鎖長の違うDNAを合成し、ゲル
電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーによっ
て放射性同位元素で標識されたdNTPの位置を検出し、比
較することによって塩基配列を決定するジデオキシ（di
deoxy）法［別称サンガー（Sanger）法］が知られてい
る。これらの方法はいずれもDNA断片をゲル電気泳動さ
せ、その泳動パターンを読みとることで塩基配列を決定
するものであり、読みとる手段として放射性同位元素に
よる標識が行われている。これに対して放射性同位元素
を用いない安全な標識手段としてけい光による標識が提
案されており、特開昭60−242368号公報には、DNA試料
を４分割し、それぞれを異なる励起波長を有するけい光
色素で標識することで、一本のカラムによる電気泳動で
塩基配列を決定する方法が開示されている。
（発明が解決しようとする問題点） 放射性同位元素を用いる核酸塩基配列決定法において
は、DNA断片を含む試料を電気泳動ゲルに注入するさい
試料の視認性を高め、かつ泳動状態の観察を目的として
0.1％程度のブロムフェノールブルー、キシレンシアノ
ール等の色素を試料に添加するのが通常行われている。
しかし、けい光法による核酸塩基配列決定法においては
前記の色素は電気泳動時に核酸と同様に挙動し、励起光
を減衰させ発光を吸収して検出を妨害するために、放射
性同位元素を用いる核酸塩基配列決定法で使用する色素
は使用することができず、無色透明の試料を試料孔に注
入している。しかし、マイクロリッター単位の無色透明
の試料をピッペッターもしくはマイクロシリンジ等に採
り、ポリアクリルアミドゲルの試料孔に注入する作業を
数十回繰り返すのは、同じ試料孔に別の試料を重複して
注入するミスの原因になりやすく、試料の一部又は全部
が試料孔の外に漏れても確認できない。また試料孔には
気泡を入れない事が必須であるが無色透明の試料中の気
泡の視認は困難である等の欠点を有している。
は、DNA断片を含む試料を電気泳動ゲルに注入するさい
試料の視認性を高め、かつ泳動状態の観察を目的として
0.1％程度のブロムフェノールブルー、キシレンシアノ
ール等の色素を試料に添加するのが通常行われている。
しかし、けい光法による核酸塩基配列決定法においては
前記の色素は電気泳動時に核酸と同様に挙動し、励起光
を減衰させ発光を吸収して検出を妨害するために、放射
性同位元素を用いる核酸塩基配列決定法で使用する色素
は使用することができず、無色透明の試料を試料孔に注
入している。しかし、マイクロリッター単位の無色透明
の試料をピッペッターもしくはマイクロシリンジ等に採
り、ポリアクリルアミドゲルの試料孔に注入する作業を
数十回繰り返すのは、同じ試料孔に別の試料を重複して
注入するミスの原因になりやすく、試料の一部又は全部
が試料孔の外に漏れても確認できない。また試料孔には
気泡を入れない事が必須であるが無色透明の試料中の気
泡の視認は困難である等の欠点を有している。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、電気泳動の結果に影響を与えることなく
試料の視認性を高めることによって人為的ミスを防止
し、かつ試料の添加状態を目視により確認可能とするこ
とにより、けい光法による核酸塩基配列決定法のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法の精度の向上を目的として
検討を重ねた結果、試料中に以下の要件を満たす色素を
添加することからなる本発明を完成したものである。
試料の視認性を高めることによって人為的ミスを防止
し、かつ試料の添加状態を目視により確認可能とするこ
とにより、けい光法による核酸塩基配列決定法のポリア
クリルアミドゲル電気泳動法の精度の向上を目的として
検討を重ねた結果、試料中に以下の要件を満たす色素を
添加することからなる本発明を完成したものである。
すなわち、けい光法による核酸塩基配列決定のさい、ゲ
ル電気泳動装置の試料孔に注入する無色透明な試料に添
加する色素としては、電気的に中性若しくはプラスに帯
電しており、電気泳動時に試料中の核酸断片と挙動を異
にし、かつ核酸に対して活性な官能基を有しないことを
用件とするもので、この他少量の添加により試料を十分
視認可能とするだけの着色を与え、また水、もしくは水
とホルムアミドの混液に対して十分な溶解度をもつ色素
であれば更に望ましい。すなわち、上記の如き色素を試
料中に添加することにより試料採取量の精度の向上と試
料注入時の人為的ミスを防止するもので、電気泳動時に
はマイナスに帯電した核酸断片のみがゲル中を電気泳動
下槽に向けて移行し、核酸断片のけい光標識を順次けい
光検出器により検出される。一法、着色用色素は電気的
に中性若しくはプラスに帯電しているため、試料孔にそ
のまま残留するか、電気泳動上槽中の緩衝液に移行する
ため、核酸断片のけい光検出を妨害することはない。本
発明において用いられる色素としては、ナイルブルー
Ａ、パラローザニリン、ニュートラルレッド、塩基性フ
クシン、ビクトリアブルー、ビクトリアピュアブルーB
O、メチルバイオレット、チオニン、ブリリアントグリ
ーン、エチルバイオレット、メチレンブルー、エチルレ
ッド、インドフェノールブルー、5-アミノ‐2,3-ジハイ
ドロ‐1,4-フタルアジンジオン（CAS♯521-31-3）、オ
キサジン９、ピナシアノール、1,1′,3,3,3′３′ヘキ
サメチルインドトリカーボシアニンビスマルクブラウン
Ｙ、ビスマルクブラウンＲ、アストラザルブルー3RL、
サフラニンＯ、クリスタルバイオレット、クリソイジ
ン、ニューフフクシン、バサクリルレッド（CAS♯42373
-04-6）等が例示されるが、前記の用件を満たす色素で
あれば、これらに限定されるものではない。
ル電気泳動装置の試料孔に注入する無色透明な試料に添
加する色素としては、電気的に中性若しくはプラスに帯
電しており、電気泳動時に試料中の核酸断片と挙動を異
にし、かつ核酸に対して活性な官能基を有しないことを
用件とするもので、この他少量の添加により試料を十分
視認可能とするだけの着色を与え、また水、もしくは水
とホルムアミドの混液に対して十分な溶解度をもつ色素
であれば更に望ましい。すなわち、上記の如き色素を試
料中に添加することにより試料採取量の精度の向上と試
料注入時の人為的ミスを防止するもので、電気泳動時に
はマイナスに帯電した核酸断片のみがゲル中を電気泳動
下槽に向けて移行し、核酸断片のけい光標識を順次けい
光検出器により検出される。一法、着色用色素は電気的
に中性若しくはプラスに帯電しているため、試料孔にそ
のまま残留するか、電気泳動上槽中の緩衝液に移行する
ため、核酸断片のけい光検出を妨害することはない。本
発明において用いられる色素としては、ナイルブルー
Ａ、パラローザニリン、ニュートラルレッド、塩基性フ
クシン、ビクトリアブルー、ビクトリアピュアブルーB
O、メチルバイオレット、チオニン、ブリリアントグリ
ーン、エチルバイオレット、メチレンブルー、エチルレ
ッド、インドフェノールブルー、5-アミノ‐2,3-ジハイ
ドロ‐1,4-フタルアジンジオン（CAS♯521-31-3）、オ
キサジン９、ピナシアノール、1,1′,3,3,3′３′ヘキ
サメチルインドトリカーボシアニンビスマルクブラウン
Ｙ、ビスマルクブラウンＲ、アストラザルブルー3RL、
サフラニンＯ、クリスタルバイオレット、クリソイジ
ン、ニューフフクシン、バサクリルレッド（CAS♯42373
-04-6）等が例示されるが、前記の用件を満たす色素で
あれば、これらに限定されるものではない。
本発明における色素の添加は、色素の0.05〜0.1％のホ
ルムアミド溶液を泳動用の試料に対し1/3量〜等量加え
る事により目的は達せられる。
ルムアミド溶液を泳動用の試料に対し1/3量〜等量加え
る事により目的は達せられる。
また、本発明の色素は、通常の塩基配列決定用試薬類、
たとえばジデオキシ法における試薬であるプライマー、
Klenow断片で代表される酵素類、４種類のdNTP、ddNTP
またはdNTPとddNTPとの混合物等と組合せて塩基配列決
定用試薬キットとして構成することもできる。このさい
色素は粉状のままでもよく、また反応停止液として用い
るホルムアミドの溶液としてもよい。
たとえばジデオキシ法における試薬であるプライマー、
Klenow断片で代表される酵素類、４種類のdNTP、ddNTP
またはdNTPとddNTPとの混合物等と組合せて塩基配列決
定用試薬キットとして構成することもできる。このさい
色素は粉状のままでもよく、また反応停止液として用い
るホルムアミドの溶液としてもよい。
実施例 以下、実施例により説明する。
実施例１ フルオレッセインにて標識したデオキシリボヌクレオチ
ド21量体溶液10マイクロリッターに対し蒸留水950マイ
クロリッターを加え100倍に希釈し、２個の別容器にそ
れぞれ100マイクロリッターずつ分注した。一方にはメ
チルバイオレットの0.05％のホルムアミド溶液を100マ
イクロリッター、他方にはホルムアミドを100マイクロ
リッター加えよく撹はんして試料とした。ポリアクリル
アミドゲルの試料孔に１マイクロリッターずつ着色試料
と未着色試料とをそれぞれ10か所に添加し1200ボルトに
て泳動し蛍光にて検出しピーク面積を算出、解析した。
その結果未着色試料の標準偏差0.21に対し着色試料の標
準偏差は0.08であり、試料に対する着色は試料添加の再
現性の向上に寄与していた。
ド21量体溶液10マイクロリッターに対し蒸留水950マイ
クロリッターを加え100倍に希釈し、２個の別容器にそ
れぞれ100マイクロリッターずつ分注した。一方にはメ
チルバイオレットの0.05％のホルムアミド溶液を100マ
イクロリッター、他方にはホルムアミドを100マイクロ
リッター加えよく撹はんして試料とした。ポリアクリル
アミドゲルの試料孔に１マイクロリッターずつ着色試料
と未着色試料とをそれぞれ10か所に添加し1200ボルトに
て泳動し蛍光にて検出しピーク面積を算出、解析した。
その結果未着色試料の標準偏差0.21に対し着色試料の標
準偏差は0.08であり、試料に対する着色は試料添加の再
現性の向上に寄与していた。
実施例２ 蛍光標識したプライマーを用いて通常の手法（塩基特異
的相補鎖合成停止反応）に従って調製したDNA断片群５
マイクロリッターに対し塩基性フクシンの0.1％のホル
ムアミド溶液を２マイクロリッター加え95℃１分間の熱
処理の後、自動DNAシケンサーにて分析した結果、通常
の操作による結果と比較して異常なピークは認められず
蛍光強度も十分であった。
的相補鎖合成停止反応）に従って調製したDNA断片群５
マイクロリッターに対し塩基性フクシンの0.1％のホル
ムアミド溶液を２マイクロリッター加え95℃１分間の熱
処理の後、自動DNAシケンサーにて分析した結果、通常
の操作による結果と比較して異常なピークは認められず
蛍光強度も十分であった。
（発明の効果） けい光標識を用いたゲル電気泳動による核酸塩基配列を
決定するさい、試料溶液に本発明の色素を添加すること
により試料の視認性を高め、試料採取量の精度の向上と
試料注入時の人為的ミスを防止し、よってゲル電気泳動
法による核酸塩基配列決定の精度の向上を可能とするも
のである。
決定するさい、試料溶液に本発明の色素を添加すること
により試料の視認性を高め、試料採取量の精度の向上と
試料注入時の人為的ミスを防止し、よってゲル電気泳動
法による核酸塩基配列決定の精度の向上を可能とするも
のである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 森五彦、小林茂三郎「▲ろ▼紙電気泳動 法の実際」（昭和35−５−10）南江堂 Ｐ．176
Claims (2)
- 【請求項１】けい光標識を用いたゲル電気泳動法による
核酸塩基配列決定法において、デオキシリボ核酸試料溶
液に、電気的に中性もしくはプラスに帯電しており、電
気泳動時に試料中の核酸断片と挙動を異にし、かつ核酸
に対して活性な官能基を有しない着色用の色素を添加す
ることを特徴とする核酸塩基配列決定方法。 - 【請求項２】けい光標識を用いたゲル電気泳動法による
核酸塩基配列決定のさいの試薬類に、電気的に中性もし
くはプラスに帯電しており、電気泳動時に試料中の核酸
断片と挙動を異にし、かつ核酸に対して活性な官能基を
有しない着色用の色素を組合せることを特徴とする核酸
塩基配列決定用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63247480A JPH0690180B2 (ja) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | 核酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63247480A JPH0690180B2 (ja) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | 核酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0296653A JPH0296653A (ja) | 1990-04-09 |
| JPH0690180B2 true JPH0690180B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=17164086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63247480A Expired - Fee Related JPH0690180B2 (ja) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | 核酸塩基配列決定方法および配列決定用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690180B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5064519A (en) * | 1990-06-29 | 1991-11-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Neutral and positively charged dyes for electrophoresis sample loading solutions |
| US6168701B1 (en) * | 1999-04-30 | 2001-01-02 | The Perkins-Elmer Corporation | Methods and compositions for improving the loading of analytical instruments |
| CN102994626B (zh) * | 2011-09-15 | 2015-10-07 | 温州安得森生物科技有限公司 | 碱性艳兰bo在dna检测中的应用 |
| CN104120173B (zh) * | 2013-04-24 | 2018-01-12 | 温州大学 | 碱性品红及其衍生物在聚丙烯酰胺凝胶上dna检测中的应用 |
-
1988
- 1988-10-03 JP JP63247480A patent/JPH0690180B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 森五彦、小林茂三郎「▲ろ▼紙電気泳動法の実際」（昭和３５−５−１０）南江堂Ｐ．１７６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0296653A (ja) | 1990-04-09 |
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Legal Events
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