JPH0687061B2 - 糖転移酵素活性の免疫学的測定方法 - Google Patents
糖転移酵素活性の免疫学的測定方法Info
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- JPH0687061B2 JPH0687061B2 JP8825788A JP8825788A JPH0687061B2 JP H0687061 B2 JPH0687061 B2 JP H0687061B2 JP 8825788 A JP8825788 A JP 8825788A JP 8825788 A JP8825788 A JP 8825788A JP H0687061 B2 JPH0687061 B2 JP H0687061B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycosyltransferase
- measured
- antibody
- activity
- acceptor
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、糖転移酵素活性を免疫学的に測定する方法に
関するものであり、より詳しくは、検体中の糖転移酵素
の働きにより生成される糖鎖を認識するモノクローナル
抗体を用いて、検体中の糖転移酵素活性を測定する方法
に関するものである。
関するものであり、より詳しくは、検体中の糖転移酵素
の働きにより生成される糖鎖を認識するモノクローナル
抗体を用いて、検体中の糖転移酵素活性を測定する方法
に関するものである。
近年、細胞の癌化と該細胞表面上の糖鎖構造の変化との
関係が注目を集めており、さらにその糖鎖構造の変化を
引き起こす糖転移酵素活性の存在も細胞の癌化と関連し
て話題を集めてきている。すなわち、癌患者血中におけ
る糖転移酵素活性を測定し、癌診断に利用しようという
試みは多くなされており、健常人より有意に高い活性を
有するという報告もなされている。しかし、従来の糖転
移酵素活性の測定法は、標識ドナー糖のアクセプター複
合糖質への取り込み量を測定することにより糖転移酵素
の活性測定としているにすぎず、糖転移酵素のひとつの
特徴である糖鎖結合様式に依存した特異的酵素、すなわ
ち、糖転移酵素のアイソザイムを区別してその活性を測
定することはできなかった。また、腫瘍組織に特異的に
発現する糖鎖抗原の存在や、それに対するモノクローナ
ル抗体の作製に関する報告もなされているが、その糖鎖
抗原が血中に遊離しない場合や、自己抗体が存在する場
合などもあり、組織での抗原の増量が必ずしもその抗体
の血清診断に反映されるとは限らない。
関係が注目を集めており、さらにその糖鎖構造の変化を
引き起こす糖転移酵素活性の存在も細胞の癌化と関連し
て話題を集めてきている。すなわち、癌患者血中におけ
る糖転移酵素活性を測定し、癌診断に利用しようという
試みは多くなされており、健常人より有意に高い活性を
有するという報告もなされている。しかし、従来の糖転
移酵素活性の測定法は、標識ドナー糖のアクセプター複
合糖質への取り込み量を測定することにより糖転移酵素
の活性測定としているにすぎず、糖転移酵素のひとつの
特徴である糖鎖結合様式に依存した特異的酵素、すなわ
ち、糖転移酵素のアイソザイムを区別してその活性を測
定することはできなかった。また、腫瘍組織に特異的に
発現する糖鎖抗原の存在や、それに対するモノクローナ
ル抗体の作製に関する報告もなされているが、その糖鎖
抗原が血中に遊離しない場合や、自己抗体が存在する場
合などもあり、組織での抗原の増量が必ずしもその抗体
の血清診断に反映されるとは限らない。
本発明は、血液などの体役を検体として、癌に特異的な
糖転移酵素の活性測定し、癌の診断に用いることを一つ
の目的としているが、その測定対象は癌特異的糖転移酵
素に限定されるものではなく、あらゆる糖転移酵素の測
定に、本発明の原理を利用することができるものであ
る。すなわち、本発明は、アクセプターとなる複合糖質
を不溶性担体に結合させた固相化アクセプター複合糖質
に、血液などの検体液およびドナー糖を反応させ、検体
液中の糖転移酵素の触媒作用により固相化アクセプター
複合糖質にドナー糖を結合させ、次いで生成された糖鎖
構造を認識するモノクローナル抗体を標識剤で標識した
標識抗体を反応させ、不溶性担体に生成糖鎖を介して結
合した標識抗体の標識剤の活性を測定することにより、
検体中の糖転移酵素の活性を測定するものである。
糖転移酵素の活性測定し、癌の診断に用いることを一つ
の目的としているが、その測定対象は癌特異的糖転移酵
素に限定されるものではなく、あらゆる糖転移酵素の測
定に、本発明の原理を利用することができるものであ
る。すなわち、本発明は、アクセプターとなる複合糖質
を不溶性担体に結合させた固相化アクセプター複合糖質
に、血液などの検体液およびドナー糖を反応させ、検体
液中の糖転移酵素の触媒作用により固相化アクセプター
複合糖質にドナー糖を結合させ、次いで生成された糖鎖
構造を認識するモノクローナル抗体を標識剤で標識した
標識抗体を反応させ、不溶性担体に生成糖鎖を介して結
合した標識抗体の標識剤の活性を測定することにより、
検体中の糖転移酵素の活性を測定するものである。
従来の糖転移酵素活性の測定法は、標識ドナー糖をアク
セプター複合糖質への取り込み量を測定するものであ
り、糖転移酵素の一つの特徴である糖鎖結合様式に関す
る酵素の特異性の区別、例えば、Galβ1-4GlcNAcとGal
β1-3GlcNAc結合の各々を触媒する酵素の区別ができな
かった。さらに、従来の方法では、固相化したアクセプ
ター複合糖質を用いないため、標識したトナー糖と生成
物の分離が煩雑であり、また、糖脂質と糖蛋白ではその
固有の方法により測定が行われていた等の短所があっ
た。本発明は、糖鎖結合様式に関する酵素の特異性を区
別できること、生成糖鎖がモノクローナル抗体によって
認識されるエピトープであれば、糖脂質も糖蛋白もいず
れもこの方法で測定することができること、操作が非常
に簡便であるなどの利点を有する。さらに、癌化により
過剰に産生されても血中に遊離されない糖鎖、もしくは
血中半減期の短い糖鎖など、糖鎖抗原自体を検出できな
い場合においても、本発明によれば、糖鎖抗原に関与す
る糖転移酵素を測定するため、癌の診断に用いることが
できるという利点を有する。
セプター複合糖質への取り込み量を測定するものであ
り、糖転移酵素の一つの特徴である糖鎖結合様式に関す
る酵素の特異性の区別、例えば、Galβ1-4GlcNAcとGal
β1-3GlcNAc結合の各々を触媒する酵素の区別ができな
かった。さらに、従来の方法では、固相化したアクセプ
ター複合糖質を用いないため、標識したトナー糖と生成
物の分離が煩雑であり、また、糖脂質と糖蛋白ではその
固有の方法により測定が行われていた等の短所があっ
た。本発明は、糖鎖結合様式に関する酵素の特異性を区
別できること、生成糖鎖がモノクローナル抗体によって
認識されるエピトープであれば、糖脂質も糖蛋白もいず
れもこの方法で測定することができること、操作が非常
に簡便であるなどの利点を有する。さらに、癌化により
過剰に産生されても血中に遊離されない糖鎖、もしくは
血中半減期の短い糖鎖など、糖鎖抗原自体を検出できな
い場合においても、本発明によれば、糖鎖抗原に関与す
る糖転移酵素を測定するため、癌の診断に用いることが
できるという利点を有する。
測定される糖転移酵素としては、ガラクトシルトランス
フェラーゼ、シリアルトランスフェアーゼなどを挙げる
ことができる。特にβ１−４ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、α２−６シリアルトランスフェラーゼは、癌の
診断に有用であると考えられる。
フェラーゼ、シリアルトランスフェアーゼなどを挙げる
ことができる。特にβ１−４ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ、α２−６シリアルトランスフェラーゼは、癌の
診断に有用であると考えられる。
不溶性担体としては、固相反応において通常利用される
担体物質を用いることができ、例えば、シリコーン、ポ
リアクリルアミド、ポリスチレン、セファデックス等の
合成高分子物質、セルロース等の天然高分子、セラミッ
クス、ガラス、金属等が挙げられる。これらを公知技術
で表面処理し、アクセプターとなる複合物質を結合させ
る。
担体物質を用いることができ、例えば、シリコーン、ポ
リアクリルアミド、ポリスチレン、セファデックス等の
合成高分子物質、セルロース等の天然高分子、セラミッ
クス、ガラス、金属等が挙げられる。これらを公知技術
で表面処理し、アクセプターとなる複合物質を結合させ
る。
標識剤としては、酵素類、ラジオアイソトープ、螢光物
質などを用いることができる。
質などを用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活
性の測定 １）アミノCTH（Lactotriaosylceramide）のポリスチレ
ンビーズへの固相化 ポリスチレンビーズ（0.6cm径）500個をエタノール処理
した後、アミノCTH溶液（２μg/ビーズ）100mlに加え、
室温で20時間、攪拌しながら反応させた。溶液を除去
し、５％の馬血清を含有するリン酸緩衝液（pH7.5）100
mlを加え、室温で１時間、攪拌しながら反応させた。溶
液を除去後、リン酸緩衝液にて５回洗浄し、アミノCTH
吸着ビーズを作製した。
性の測定 １）アミノCTH（Lactotriaosylceramide）のポリスチレ
ンビーズへの固相化 ポリスチレンビーズ（0.6cm径）500個をエタノール処理
した後、アミノCTH溶液（２μg/ビーズ）100mlに加え、
室温で20時間、攪拌しながら反応させた。溶液を除去
し、５％の馬血清を含有するリン酸緩衝液（pH7.5）100
mlを加え、室温で１時間、攪拌しながら反応させた。溶
液を除去後、リン酸緩衝液にて５回洗浄し、アミノCTH
吸着ビーズを作製した。
２）抗パラグロボシドモノクローナル抗体の作製 パラグロボシドド溶液0.1ml（25μｇ含有）にフロイン
ド・コンプリート・アジュバント0.1mlを加え、エマル
ジョンを調製した。このエマルジョン0.2mlをBalb/cマ
ウスの腹腔に２週間おきに４回投与した。10日後に最終
免疫を行い、その３日後に脾臓を摘出した。脾細胞1X10
8個と、Balb/cマウス由来ミエローマ細胞（P3U1株）2X1
07個をポリエチレングリコール50％存在下で細胞融合を
行わせた。特異的モノクローナル抗体産生細胞の選択ク
ローン化は、パラグロボシドを吸着したプレート上でエ
ンザイムイムノアッセイ法により行った。得られたモノ
クローナル抗体産生株1X107個を予めプリスタンを東予
したBalb/cマウスの腹腔に接種し、２週間後に腹水を採
取した。
ド・コンプリート・アジュバント0.1mlを加え、エマル
ジョンを調製した。このエマルジョン0.2mlをBalb/cマ
ウスの腹腔に２週間おきに４回投与した。10日後に最終
免疫を行い、その３日後に脾臓を摘出した。脾細胞1X10
8個と、Balb/cマウス由来ミエローマ細胞（P3U1株）2X1
07個をポリエチレングリコール50％存在下で細胞融合を
行わせた。特異的モノクローナル抗体産生細胞の選択ク
ローン化は、パラグロボシドを吸着したプレート上でエ
ンザイムイムノアッセイ法により行った。得られたモノ
クローナル抗体産生株1X107個を予めプリスタンを東予
したBalb/cマウスの腹腔に接種し、２週間後に腹水を採
取した。
３）抗パラグロボシドモノクローナル抗体の125Iによる
標識 抗パラグロボシドモノクローナル抗体含有腹水に硫酸ア
ンモニウム粉末を40％飽和となるように添加溶解した。
析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩衝液（pH
7.5）に1mg/mlとなるように溶解してγ−グロブリン液
を得た。
標識 抗パラグロボシドモノクローナル抗体含有腹水に硫酸ア
ンモニウム粉末を40％飽和となるように添加溶解した。
析出した沈澱を遠心分離して回収後、リン酸緩衝液（pH
7.5）に1mg/mlとなるように溶解してγ−グロブリン液
を得た。
Na125I約300μCiをリン酸緩衝液（pH7.5）に加え、上記
γ−グロブリン液1mlを加えて攪拌後、クロラミンＴ（1
mg/ml）25μｌを添加、30秒間振盪反応後、メタ重量亜
硫酸ナトリウム（1mg/ml）100μｌ加え反応を停止させ
た。遊離の125IをセファクリルＳ−300カラムを用いて
除去し、125I標識抗パラグロボシドモノクローナル抗体
を回収した。
γ−グロブリン液1mlを加えて攪拌後、クロラミンＴ（1
mg/ml）25μｌを添加、30秒間振盪反応後、メタ重量亜
硫酸ナトリウム（1mg/ml）100μｌ加え反応を停止させ
た。遊離の125IをセファクリルＳ−300カラムを用いて
除去し、125I標識抗パラグロボシドモノクローナル抗体
を回収した。
４）β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の測
定 被検血清10μｌに固相化アミノCTHビーズ１個、UDP-Gal
（ウリジン ジファスフェイト ガラクトース）液100
μｌ及び1mMカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH6.5,MnCl2
（10μmol）,Trit on X-100（0.5％）を含む）90μｌを
加え、37℃で１時間インキュベーションした。生理食塩
水でビーズを２回洗浄後、125I標識抗パラグロボシドモ
ノクローナル抗体液200μｌを加え、室温で振盪しなが
ら４時間インキュベーションした。生理食塩水でビーズ
を３回洗浄後、ビーズの放射能を測定した。
定 被検血清10μｌに固相化アミノCTHビーズ１個、UDP-Gal
（ウリジン ジファスフェイト ガラクトース）液100
μｌ及び1mMカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH6.5,MnCl2
（10μmol）,Trit on X-100（0.5％）を含む）90μｌを
加え、37℃で１時間インキュベーションした。生理食塩
水でビーズを２回洗浄後、125I標識抗パラグロボシドモ
ノクローナル抗体液200μｌを加え、室温で振盪しなが
ら４時間インキュベーションした。生理食塩水でビーズ
を３回洗浄後、ビーズの放射能を測定した。
予め作成した標準曲線より被検血清中の、β１−４ガラ
クトシルトランスフェラーゼ活性を求めた。
クトシルトランスフェラーゼ活性を求めた。
図１は、本発明により血中のβ１−４ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ活性を測定する場合の標準曲線の一例で
ある。 図２は、本発明により測定した健常者および各種疾患患
者の血中β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性
の測定値である。
ンスフェラーゼ活性を測定する場合の標準曲線の一例で
ある。 図２は、本発明により測定した健常者および各種疾患患
者の血中β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性
の測定値である。
Claims (9)
- 【請求項１】不溶性担体にアクセプター複合糖質を結合
させた固相化アクセプター複合糖質に、測定すべき糖転
移酵素を含有すると思われる検体及び該糖転移酵素の基
質となる糖を反応させ、検体中の糖転移酵素の働きによ
り不溶性担体上に該糖転移酵素に特異的な糖鎖を生成さ
せた後、生成された糖鎖構造に対するモノクローナル抗
体を標識剤で標識した標識抗体を反応させ、次いで、不
溶性担体上に結合した標識抗体の標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする検体中の糖転移酵素活性の測定方
法。 - 【請求項２】アクセプター複合糖質が糖蛋白或いは糖脂
質である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】測定すべき糖転移酵素がガラクトシルトラ
ンスフェラーゼである特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項４】測定すべき糖転移酵素がβ１−４ガラクト
シルトランスフェラーゼである特許請求の範囲第３項に
記載の方法。 - 【請求項５】モノクローナル抗体がパラグロボシドを認
識する抗体である特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】測定すべき糖転移酵素がシアリルトランス
フェラーゼである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項７】測定すべき糖転移酵素がα２−６シアリル
トランスフェラーゼである特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項８】モノクローナル抗体がα２−６シアリルパ
ラグロボシドを認識する抗体である特許請求の範囲第７
項に記載の方法。 - 【請求項９】標識剤がラジオアイソトープ、酵素、螢光
物質或いは化学発光物質である特許請求の範囲第１項、
第５項或いは第８項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8825788A JPH0687061B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 糖転移酵素活性の免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8825788A JPH0687061B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 糖転移酵素活性の免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01260364A JPH01260364A (ja) | 1989-10-17 |
| JPH0687061B2 true JPH0687061B2 (ja) | 1994-11-02 |
Family
ID=13937822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8825788A Expired - Fee Related JPH0687061B2 (ja) | 1988-04-12 | 1988-04-12 | 糖転移酵素活性の免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0687061B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0315761A (ja) * | 1989-03-15 | 1991-01-24 | Sumitomo Seika Chem Co Ltd | 糖転移酵素の活性測定方法およびその用途 |
| EP1563840A1 (en) * | 2002-10-22 | 2005-08-17 | Japan Science and Technology Agency | Dengue virus infection inhibitor |
-
1988
- 1988-04-12 JP JP8825788A patent/JPH0687061B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01260364A (ja) | 1989-10-17 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
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