JPH0672886A - 逆転写酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 強いＲＴ阻害活性を有するＲＴ阻害剤を得
る。 【構成】 次の化１の化学構造式で表わされるペダンキ
ュラギン(pedunculagin)が有効成分として含有されたも
の。尚、式中の−Ｒ¹,−Ｒ² は−Ｈ又は−ＯＨ基であ
る。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は例えばエイズの原因とな
っているＨＩＶ(human immuno deficiency virus) 等の
ＲＮＡをゲノムとしているレトロウィルスが特異的に有
する逆転写酵素(Reverse Transcriptase) を阻害する逆
転写酵素阻害剤（以下、ＲＴ阻害剤と記す）に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】ＨＩＶウィルスを始めとするレトロウィ
ルスは、特定のレセプターをもつ細胞に感染後プロウィ
ルスの形をとるという大きな特徴を持っている。このよ
うなウィルスに対処する最善の方法は、予防ワクチンの
開発であるが、特にＨＩＶのｅｎｖ遺伝子の塩基配列が
株ごとに著しく異なること、感染体内でＨＩＶ遺伝子に
高頻度で突然変異が起こること等の理由から、ワクチン
の開発は理論的にも実際的にも非常に困難と考えられて
いる。

【０００３】即ち、エイズを予防すること、つまりＨＩ
Ｖがプロウィルス化する前の段階で、これを阻止するこ
とは、成功までに未だ多大の時間を要する。一方、細胞
に感染し、プロウィルス化したＨＩＶを、特異的に除去
或は不活性化すること、即ち根本的な治療を行うことは
更に困難である。

【０００４】現在、現実的な方法として唯一臨床的に用
いられているのは、選択的にＨＩＶのＲＴを阻害するＡ
ＺＴ等のヌクレオシドアナログを用い、ＨＩＶの増殖を
抑制する化学療法である。この方法は、根本的な治療方
法とは言い難い。しかし、地球的規模での爆発的なＨＩ
Ｖキャリアー、エイズ患者の増加を考えると、よりすぐ
れた方法が開発されるまでの暫定的な手段として、非常
に重要な意味をもつと言わざるを得ない。

【０００５】ここで問題なのは、ＨＩＶ−ＲＴ阻害剤
は、長期にわたり継続的に投与されねば意味がないこと
である。一次的な集中大量投与で充分な効果を上げ得る
他の疾病への化学療法に比べると、この場合は安全性、
経済性に格段の配慮が要求される。この点で、この種の
化学療法剤には、機能性食品に対するのと類似の要求が
なされるべきである。

【０００６】例えば食用きのこ、酵母の抗ＨＩＶ成分の
主なものは、グルコース、マンノースからなる多糖であ
る。また、海藻の熱水抽出物には強いＲＴ阻害活性があ
るが、褐藻の主要有効成分はフコイダン、紅藻のそれは
カラギーナンである。更に緑藻からは、まだ強い阻害物
質は認められていない（遠藤達弥，河村英昌，中島豊，
古越久美子，加藤順，大石邦夫（未発表））。これらの
多糖の主なＨＩＶ抑制作用は、ＲＴ阻害以外のメカニズ
ムによるものと考えられる。

【０００７】また、甘草(Glycyrrhizin glabra) （マメ
科）の薬効成分であるグリチルリチンは古くからヘルペ
スウィルスや肝炎ウィルスに対する抑制作用が知られて
いたが、イトウらはインビトロでＨＩＶの感染・増殖も
抑制することを見出した（M.Ito, H.Nakajima, M.Baba,
R.Pauwels, E.Declercq, S.Shigeta, and N.yamamoto
:Antibiral Res.,7,127(1987) ）。しかしながら、こ
れはＲＴ阻害以外のメカニズムによるものとされている
（伊藤正彦，中島秀喜，茂田士郎、山本直樹：細胞工
学，７，Suppl.,1,S91(1988)）。

【０００８】更に、甘草を硫酸化すると抗ＨＩＶ活性が
高まり、細胞毒性量／有効量の比がもとのグリチルリチ
ンの約４倍となり、硫酸化によってＲＴ阻害活性が生じ
ることが報告されている（H.Nakajima, T.Matui, O.Yos
hida, Y.Isowa, Y.Kido, Y.Motoki, M.Ito, S.Shigeta,
T.Mori, and N.Yamamoto : Jpn.J.Cancer Res.(Gann),
78,767(1987)）が、この活性が抗ＨＩＶ活性上昇の原因
であるかどうかは明らかではない。

【０００９】ところで、タンニンには、強いＲＴ阻害活
性を示すものがある。カキウチらは、ある種のタンニン
がＡＭＶ(Avian myeloblastosis virus)−ＲＴを阻害す
ることを報告している（N.Kakiuchi, M.Httori, T.Namb
a, M.Nishizawa, T.Yamaguchi, and T.Okuda : J.Nat.P
rod.,48,614(1985) ）。

【００１０】また、ニシザワらはガロイルキナ酸(gallo
ylquinic acids) 、特に、テトラガロイルキナ酸(tetra
galloylquinic acids)が強力なＨＩＶ−ＲＴ阻害剤であ
ることを見出した（M.Nishizawa, T.Yamagishi, G.E.Du
tshman, W.B.Parker, A.J.Bodner, R.E.Kilkuskie ,Y-
C.Cheng, and K.H-Lee : J.Natl.Products,52,762(198
9)）。

【００１１】更に、ノナカらは３種類のガロタンニン(g
allotannin) と６種のエラジタンニン(ellagitannin)の
イン・ビトロでの抗ＨＩＶ活性を調べたところ、一種の
エラジタンニン(sanguiin H-11) を除き、何れも強い抑
制活性を示した（G.Nonaka,I.Nishioka, M.Nishizawa,
T.Yamagishi, Y.Kashiwada, G.E.Dutschman, A.J.Bodne
r, R.E.Kilkuskie, Y.C.Cheng, and K.H.Lee : J.Nat.P
rod.,53,587(1990)）。

【００１２】一方、ＨＩＶ−ＲＴの阻害活性を調べたと
ころ、エラジタンニンであるプニカリン(punicalin) ，
プニカコルテンＣ(punicacortein C) 及び、サングイイ
ンＨ−１１(sanguiin H-11) が強い阻害を示し、それら
のＩＤ₅₀は各々８，５，２０μＭであった。これらのタ
ンニン化合物はＨＩＶ−宿主細胞間相互作用の阻害等の
他の働きも持っているので、ＲＴ阻害作用が抗ＨＩＶ作
用の主因であるか否かは明かでない。

【００１３】更に、ナカネらは茶(Camellia sinensis)
から得たエピカテキシン・ガレイト（(-)-epicatechin
gallate ）とエピガロカテキシン・ガレイト（(-)-epig
allocatechin gallate）とに、ＩＤ₅₀が０．０４５μＭ
という強いＲＴ阻害活性をもつことを報告している（H.
Nakane. and K.Ono : Biochemistry,29,2841(1990)）。

【００１４】これらのタンニン化合物は、その構成成分
にまで水解すると活性を失う。また、その作用は鋳型−
プライマー複合体と拮抗的である。エラジタンニン(ell
agitannin)に抗ＨＩＶ作用があることは、予研エイズ研
究センターの基礎研究でも認められている（牛島廣治，
清水博之，大野田秀喜，運天先和，土江秀明，北村敬：
エイズ・ジャーナル，3(1),4(1990)）。

【００１５】また、オノらは２８種の東洋産ハーブか
ら、４０種類の熱水及びアルコール抽出物を調製したと
ころ、そのうち３５種がネズミレトロウィルスＭ−ＭＬ
Ｖ(Moloney murine leukemia virus) のＲＴを阻害する
ことを見出した（K.Ono, H.Nakane, M.Zeng-Mu, Y.Ose,
Y.Sakai, and M.Mizuno : Chem.Pharm,Bull.,37,1810
(1989) ）。この中で、活性が最も強かったのはマメ科
(Millettea pachycarpa)と、トウダイグサ科(Mallotus
apelta) の熱水抽出物で、そのＩＤ₅₀は０．４−０．５
μｇ／ｍｌであった。有効成分はバイカレイン(baicale
in : 5,6,7-trihydroxy flavone)であり、これは鋳型・
プライマー複合体と拮抗的に作用し、１μｇ／ｍｌの濃
度でＲＴを３０％阻害する。

【００１６】しかしながら、この物質はＤＮＡポリメラ
ーゼにはほとんど阻害を示さないことが確認されている
（K.Onn H.Nakane, M.Fukushima, J.C.Chermann, and
F.Barre-Sinoussi : Biochem.Biophys.Res.Commun.160,
982(1989)）。

【００１７】更に、オノらは多数のフラボノイド化合物
を比較することにより、ＲＴ阻害活性とフラボノイド構
造間の相関関係を調べた（K.Ono, H.Nakane, M.Fukushi
ma,J-C.Chermann, and F.Barre-Sinoussi : Eur.J.Bioc
hem.190,469(1990)）。彼らはバイカレインの他にクエ
ルセチン(quercetin) ，クエルセタジェニン(quercetag
enin) ，ミリセチン(myricetin) 等に強いＲＴ阻害活性
があることを認め、フラボン骨格のＯＨ基の数と位置に
ついて論じている。

【００１８】また、ハタノらは甘草由来のカルコン(cha
lcone)，フラボノール(flavonol)，フラボン(flavone)
，クマリン(coumarin)，ピラノクマリン(pyranocoumar
in)によるＲＴ阻害について、報告している（T.Hatano,
T.Yasuhara, K.Miyamoto, and T.Okuda : Chem.Pharm.
Bull.,36,2286(1988)）。

【００１９】更に、牛島らによると、クロロフィルやチ
トクロームの前駆体であるプロトポルフィリン(protopo
rphyrin)にも抗ＨＩＶ活性が見られる（牛島廣治，清水
博之，大野田秀喜，運天先和，土江秀明，北村敬：エイ
ズ・ジャーナル，3(1),4(1990)）。ただし、ＲＴ阻害作
用はない。

【００２０】また、牛島らはリグニンや松かさ成分にも
抗ＨＩＶ活性を認めている（G.Nonaka, G.E.Dutschman,
A.J.Bodner, R.E.Kilkuskie,Y.C.Cheng, and K.H.Lee
: J.Nat.Prod.,53,587(1990)）。また、後者はＲＴ阻
害も示す。

【００２１】植物に広く存在するベタイン(betaine) と
タングステン酸の混合物は、ＲＴ阻害活性はないがＨＩ
Ｖの感染を抑制するという（牛島廣治，清水博之，大野
田秀喜，運天先和，土江秀明，北村敬：エイズ・ジャー
ナル，3(1),4(1990)）。吉仲らは、レトロウィルスの増
殖過程で、翻訳されたペプチドのプロセッシングに必須
のプロテアーゼの研究から、新しい抗ＨＩＶ剤の開発を
試み、大豆トリプシンインヒビターがそのような酵素を
阻害することを見出している（吉仲由之，足立正一，加
藤伊陽子，井川洋二：細胞工学，7,Suppl.1,S67(1988)
）。

【００２２】また、マメ科の植物(Castanospermum aust
rale) が作る一種のアルカノイドであるカスタノスペル
ミン(castanospermine) はα，β−グルコシダーゼを阻
害し、それによってウイルス粒子の成熟を阻害する。
２．５ｍＭで抗ウイルス作用を示すが、O-acyl誘導体は
２０倍活性が高いという（B.D.Walker, M.Kowalski, W.
C.Rosen, L.R.Rohrsch-neider, W.A.Haseltine, and J.
Sodroski : Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,8120(198
7)）。

【００２３】更に、ウリ科の植物(Trichosanthes kiril
owii) の地下茎から取れるリチン(ricin) に似たタンパ
クであるトリコサンチン(trichosanthin) は、インビト
ロで翻訳を阻害し、抗ＨＩＶ作用を示す。この作用は５
週間という長期に亙り持続するという特徴がある。正常
細胞には、毒性がないといわれる（M.S.McGrath, K.M.H
wang, S.E.Caldwell, I.Gaston, K.C.Luk, P.Wu, V.L.N
g, S.Crowe, J.Daniels, J.Marsh, T.Deinhart, P.V.Le
kas, J.C.Vennari, H.W.Yeung, and J.D.Lifson : Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA,86,2844(1989) ）。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、種々の
抗ＨＩＶ剤及びＲＴ阻害活性を有するものが研究されて
いるが、本発明者らは、食品店・売場でハーブ、スパイ
スとして売られている乾燥植物材料約１２０種を集め、
その熱水抽出液中のＭ−ＭＬＶ−ＲＴ阻害活性を調べ
た。

【００２５】

【表１】

【００２６】表１に示すように、多くの材料に強いＲＴ
阻害活性が見られるが、その中で特に強い活性を示した
のはスパイスのクローブ（丁字 : Eugenia caryephylla
ta）（フトモモ科）とハーブのバラ(Rosa spp.) （バラ
科）であった。クローブの強い阻害活性は主として構造
未定のタンニンによるもので、フラボノイド化合物(que
rciturone)も活性の一部を担っていることが確認され
た。クローブ由来の精油、オレオレジン、精油の主成分
であるユーゲノール(eugenol) などは、弱い活性しか示
さなかった。バラの主要な阻害成分もタンニンと判断さ
れた。

【００２７】上述のＲＴ阻害活性のデータを参考にし
て、東京周辺から新鮮なタンニン植物材料、バラ科植物
材料を集め、そのＲＴ阻害活性を調べたところ、タンニ
ン植物の阻害活性はまちまちであり、単にタンニン総含
量のみに支配されているようには考えられなかった（速
水耕介，小川良二，下郷晶子，加藤 順，大石邦夫：日
大農獣研報，47,5(1992)）。なお、バラ科植物のＲＴ阻
害活性は、その植物のおかれた分類学的位置と密接に関
係する。即ち、バラ科はシモツケ亜科、バラ亜科、サク
ラ亜科、ナシ亜科の４つの亜科に分けられているが、強
いＲＴ阻害活性はバラ亜科にのみ認められた（加藤
順，柴田 卓，山口 博，大石邦夫：平成２年度日本発
酵工学会大会講演要旨集，p.209(1990) ）。

【００２８】本発明は、タンニン植物材料のＲＴ阻害活
性を有する物質を検索し、強いＲＴ阻害活性を有してい
る植物材料中の主要阻害活性成分を同定し、有効なＲＴ
阻害剤を得ることを目的とする。

【００２９】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明
に係るＲＴ阻害剤は、次の化４の化学構造式で表わされ
るペダンキュラギン(pedunculagin)が有効成分として含
有されるものである。（但し、式中の−Ｒ¹,−Ｒ² は−
Ｈ又は−ＯＨ基である。）

【００３０】

【化４】

【００３１】次の化５又は化６の化学構造式で表わされ
るペダンキュラギン(pedunculagin)の加水分解物が有効
成分として含有されるものである。（但し、式中の−Ｒ
¹,−Ｒ² は−Ｈ又は−ＯＨ基である。）

【００３２】

【化５】

【化６】

【００３３】更に具体的には、前記ペダンキュラギン(p
edunculagin)がツバキ(Camellia japonica) から得られ
たものを開示する。

【００３４】

【作用】本発明においては、化４の化学構造式で表わさ
れるペダンキュラギン(pedunculagin)が有効成分として
含有されるものであるため、例えばＭ−ＭＬＶのＲＴに
対するＩＣ₅₀は５μｇ／ｍｌである強いＲＴ阻害活性を
有するＲＴ阻害剤を得ることができる。

【００３５】即ち、本発明者らによってツバキの生葉ア
セトン抽出液中に存在するレトロウイルスＲＴ阻害主要
有効成分がエラジタンニンであることが判明していた
が、本発明によってツバキのＲＴ阻害成分の主要有効成
分は、ＴＬＣ，ＩＲ，ＨＰＬＣ等の分析結果により構造
既知タンニンのペダンキュラギン(pedunculagin)と推定
されたものである。

【００３６】また、ペダンキュラギン(pedunculagin)の
タンナーゼ処理を行った加水分解物にもペダンキュラギ
ンほどではないがＲＴ阻害活性を有していることが確認
された。尚、ペダンキュラギンのＭ−ＭＬＶのＲＴに対
するＩＣ₅₀は５μｇ／ｍｌであった。

【００３７】その阻害様式は、ポリ(A)・(dT)₁₅に対し拮
抗・非拮抗混合型阻害であり、Ｋｉ値は０．２μＭであ
った。また、dTTPに対しては拮抗型阻害でありＫｉ値は
３．４μＭであった。ペダンキュラギンはマングマメ由
来のＤＮａｓｅに対し、５０μｇ／ｍｌまで阻害は示さ
ず、子牛胸腺由来のＤＮａｓｅＩに対しては１００μｇ
／ｍｌまで阻害を示さなかった。

【００３８】

【実施例】１）精製方法 図１はツバキ生葉からＲＴ阻害剤の精製方法を示す工程
図である。ツバキ生葉中の有効成分は、ツバキの生葉
（横浜市内より入手）をアセトンで抽出し、抽出液を減
圧濃縮乾固後メタノール・ヘキサンで３回抽出し、この
メタノール層をアビセルセルロースのカラムクロマトグ
ラフィー（アセトン／メタノール）の濃度勾配法（アセ
トン：メタノール＝１：０→４：１）で精製した後、セ
ファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィー
（エタノール／メタノール）で同じく濃度勾配法（エタ
ノール：メタノール＝１：０→１：１）を用いて試料Ｃ
−１を精製単離した。

【００３９】更に試料Ｃ−１にタンナーゼを加えて、４
０℃１２時間酵素処理を行った。これをセファデックス
ＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィー（エタノール：
メタノール）の濃度勾配法（エタノール：メタノール＝
１：０→４：１）を用いて試料Ｃ−２及び試料Ｃ−３を
精製単離した。

【００４０】２）試料Ｃ−１の理化学的性状 (1) 薄層クロマトグラフィーのＲｆ値 セルロースプレート（Merck 5716）を使用し以下の溶媒
で展開した。 (a) ７％酢酸 Ｒｆ値＝０．５０ (b) ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：５（上層）
Ｒｆ値＝０．２４

【００４１】(2) ペーパークロマトグラフィのＲｆ値 Toyo No.50クロマト用ペーパーを使用し以下の溶媒で展
開した。 (a) ７％酢酸 Ｒｆ値＝０．５０ (b) ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：５（上層）
Ｒｆ値＝０．２４

【００４２】(3) 赤外線吸収スペクトル アナレクト社ＡＱ２０型赤外分光計を使用してＫＢｒ錠
法にて測定した。結果を図２に示す。

【００４３】(4) Ｈ¹ −ＮＭＲ 重アセトンに溶解し、ＪＥＯＬ ＧＳＸ−５００を用い
て測定した（５００ＭＨｚ）。結果を図３に示す。

【００４４】(5) ¹³Ｃ−ＮＭＲ 重アセトンに溶解し、ＪＥＯＬ ＧＳＸ−５００を用い
て測定した（１２５ＭＨｚ）。結果を図４に示す。

【００４５】以上の(1) 〜(5) の結果よりツバキ生葉中
の試料Ｃ−１の逆転写酵素阻害有効成分は、次の化４に
示す構造既知のエラジタンニンであるペダンキュラギン
(pedunculagin)であることが判った。但し、式中の−Ｒ
¹,−Ｒ² は−Ｈ又は−ＯＨ基である。

【００４６】

【化４】

【００４７】また、試料Ｃ−２及び試料Ｃ−３について
も同様の分析結果から試料Ｃ−２は次の化５に示すエラ
グ酸、試料Ｃ−３は次の化６に示す4-6-HHDP-glucoseで
あることが確認された。但し、式中の−Ｒ¹,−Ｒ² は−
Ｈ又は−ＯＨ基である。

【００４８】

【化５】

【化６】

【００４９】３）逆転写酵素阻害活性（１） 得られた各試料Ｃ−１〜Ｃ−３の逆転写酵素阻害活性を
測定した。逆転写酵素（以下、ＲＴと記す）はＭ−ＭＬ
ＶとＡＭＶから得られたものを用いた。具体的な操作は
次の通りである。

【００５０】エッペンドルフチューブに0.5M Tris・HCl
バッファー pH8.0 10μｌ，0.5M KCl 10μｌ，0.05M
Mg(OAc)₂ 10μｌ，0.03M ジチオスレイトール 10μ
ｌ，１％Nonident P-40 10μｌ，10ｍｇ／ｍｌウシ血清
アルブミン２μｌ，５ｍＭ dTTP 10μｌ，50μＣｉ／
ｍｌ[³H]-dTTP ５μｌ， 0.8ｍｇ／ｍｌ ポリ(A)・(dT)
₁₅ 10μｌ，１Ｕ／μｌ逆転写酵素１μｌ，供試サンプ
ル10μｌ，これに水を加えて 100μｌとする。３７℃，
３０分間保温した後、５％ＴＣＡ １ｍｌを加えて反応
を停止させ、ニトロセルロースフィルターで濾過し、赤
外線ランプで充分乾燥させた後、フィルター上の酸不溶
物中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測
定し、ＲＴ阻害活性をポリ(A)・(dT)₁₅を鋳型プライマー
としたdTTPの酸不溶部への取込み量の減少として比較検
討した。

【００５１】図５はＭ−ＭＬＶ由来のＲＴを用いた場合
の各試料の濃度変化による阻害活性の変化を示す線図で
あり、図６はＡＭＶ由来のＲＴを用いた場合の各試料の
濃度変化による阻害活性の変化を示す線図である。図５
に示す通り、Ｍ−ＭＬＶのＲＴに対して、各試料（Ｃ−
１〜Ｃ−３）は０〜１０μｇ／ｍｌの濃度に応じた阻害
活性を有していることが確認された。尚、試料Ｃ−１
（ペダンキュラギン）のＲＴに対するＩＣ₅₀は５μｇ／
ｍｌであった。一方、図４に示す通り、ＡＭＶのＲＴで
は各試料（Ｃ−１〜Ｃ−３）とも０〜１０μｇ／ｍｌの
濃度に応じた阻害活性がないことが確認された。

【００５２】４）逆転写酵素阻害活性（２） 最も阻害活性の高かった試料Ｃ−１（ペダンキュラギ
ン）を用い、Ｍ−ＭＬＶ，ＨＩＶ，ＡＭＶの各ＲＴに対
する高低両濃度域での阻害活性を測定した。図７は３種
のＲＴに対するペダンキュラギンの低濃度域（０〜１０
μｇ／ｍｌ）での阻害活性を示す線図であり、図８はペ
ダンキュラギンの高濃度域（０〜１０００μｇ／ｍｌ）
での阻害活性を示す線図である。

【００５３】図に示す通り、Ｍ−ＭＬＶ，ＨＩＶ，ＡＭ
Ｖとも高濃度域では、濃度に応じた阻害活性が得られて
いることが確認され、特にＭ−ＭＬＶでは、１００μｇ
／ｍｌで阻害率が９０％に達することが判った。

【００５４】５）逆転写酵素の反応機構 前述のように濃度に応じた阻害活性を有しているペダン
キュラギンがＭ−ＭＬＶ由来のＲＴと基質との間の反応
機構をどのような機構で阻害するかを調べた。図９は反
応基質であるポリ(A)・(dT)₁₅の量を変化させた場合のラ
インウィーバー−バーク・プロットを示す線図であり、
図１０は反応基質であるdTTPの量を変化させた場合のラ
インウィーバー−バーク・プロットを示す線図である。

【００５５】図９に示す通り、ペダンキュラギンは、ポ
リ(A)・(dT)₁₅に対し、拮抗・非拮抗混合型阻害を示し、
Ｋｉ値は３．４μＭであった。また、図１０に示す通
り、dTTPに対し、拮抗型阻害を示した。

【００５６】６）他の核酸関連酵素との阻害関係（１） ペダンキュラギンについて、ＲＴ以外の核酸関連酵素と
の関係を調べた。用いた核酸関連酵素は子牛胸腺由来の
ＲＮａｓｅＡ，Ｂである。具体的な操作は次の通りであ
る。

【００５７】エッペンドルフチューブに0.5M Tris・HCl
バッファー pH7.5 １０μｌ，0.1%BSA 10μｌ，１% RN
A(Yeast) 50 μl ，ＲＮａｓｅＡ又はＢ 0.7U/μｌ，0.
67U/μｌに各濃度のペダンキュラギンを加え、３７℃，
６０分間保温した後、冷２％ＰＣＡ 100μl を加えて反
応を停止させ、０℃１５分間静置した後、10,000rpmで
２分間遠心した上清を２０倍希釈し、２６０ｎｍの吸収
で測定した。

【００５８】図１１はＲＮａｓｅＡとＭ−ＭＬＶとに対
するペダンキュラギンの濃度変化による阻害活性を示す
線図であり、図１２はＲＮａｓｅＢとＭ−ＭＬＶとに対
するペダンキュラギンの濃度変化による阻害活性を示す
線図である。図に示す通り、子牛胸腺由来のＲＮａｓｅ
Ａ，ＲＮａｓｅＢ共に１００μｇ／ｍｌでほぼ５０％の
阻害を受けるが、Ｍ−ＭＬＶに対する阻害活性に比べる
と弱く、Ｍ−ＭＬＶのＩＣ₅₀の濃度（５μｇ／ｍｌ）で
は、各々５％以下の阻害しか見られなかった。

【００５９】７）他の核酸関連酵素との阻害関係（２） 他の核酸関連酵素として子牛胸腺由来のＤＮａｓｅＩと
マングマメ由来のＤＮａｓｅを用いてＤＮＡを分解した
場合のペダンキュラギンの阻害活性を測定した。具体的
な操作は次の通りである。

【００６０】子牛胸腺由来のＤＮａｓｅＩでは、０．５
Ｍ酢酸バッファー pH5.0 0.4μｌ，0.1M MgSO₄ 1μl ，
0.1% λ・DNA 2μl ， 0.1U/μl ＤＮａｓｅＩ 0.2μl
，水3μl に此のうどのペダンギュランを加え、３７
℃，３０分間保温後、アガロース電気泳動ゲルを行っ
た。また、マングマメ由来のＤＮａｓｅでは、０．５Ｍ
酢酸バッファー pH5.0 ２μｌ，１Ｍ NaCl ２μｌ，0.
01M ZnSO₄ １μｌ，0.01%M13mp18 一本鎖ＤＮＡ 2μl
， 0.1U/μl ＤＮａｓｅ 2μl ，水 8μｌを加え、こ
れに各濃度のペダンキュラギンを加え、３７℃，３０分
間保温した後、アガロース電気泳動ゲルを行った。

【００６１】図１３は子牛胸腺由来のＤＮａｓｅＩでの
アガロース電気泳動の結果を示す模式図であり、図１４
はマングマメ由来のＤＮａｓｅでのアガロース電気泳動
の結果を示す模式図である。尚、図において、検出され
たバンドのおおよその強度はバンドの太さに対応させ、
明確なバンドを示さない領域は斜線の領域に対応して示
している。

【００６２】図に示す通り、子牛胸腺由来のＤＮａｓｅ
Ｉではベダンキュラギンは１００μｇ／ｍｌまで阻害を
示さなかった。更に、マングマメ由来のＤＮａｓｅでは
５０μｇ／ｍｌまで阻害は検出されなかった。

【００６３】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、化４の化
学構造式で表わされるペダンキュラギン(pedunculagin)
が有効成分として含有されるものであるため、例えばＭ
−ＭＬＶのＲＴに対するＩＣ₅₀は５μｇ／ｍｌである強
いＲＴ阻害活性を有するＲＴ阻害剤を得ることができ
る。尚、ペダンキュラギンのＭ−ＭＬＶのＲＴに対する
ＩＣ₅₀は５μｇ／ｍｌであった。

【００６４】更に、その阻害様式は、ポリ(A)・(dT)₁₅に
対し拮抗・非拮抗混合型阻害であり、Ｋｉ値は０．２μ
Ｍであった。また、dTTPに対しては拮抗型阻害であっ
た。他の核酸関連酵素では、子牛胸腺由来のＲＮａｓｅ
Ａ，Ｂでは阻害が５％以下しか見られなかった。更に、
マングマメ由来のＤＮａｓｅに対し、５０μｇ／ｍｌま
で阻害は検出されず、子牛胸腺由来のＤＮａｓｅＩに対
しては１００μｇ／ｍｌまで阻害を検出されなかった。

【００６５】また、ペダンキュラギン(pedunculagin)ほ
どではないが、タンナーゼ処理により、ＲＴ阻害活性を
有しているペダンキュラギン加水分解物も得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ツバキ生葉からＲＴ阻害剤の精製方法を示す工
程図である。

【図２】試料Ｃ−１の赤外線吸収スペクトルの結果を示
す線図である。

【図３】試料Ｃ−１のＨ¹ −ＮＭＲの結果を示す線図で
ある。

【図４】試料Ｃ−１の¹³Ｃ−ＮＭＲの結果を示す線図で
ある。

【図５】ＲＴとしてＭ−ＭＬＶを用いた場合の各試料の
濃度変化による阻害活性を示す線図である。

【図６】ＲＴとしてＡＭＶを用いた場合の各試料の濃度
変化による阻害活性を示す線図である。

【図７】３種のＲＴに対するペダンキュラギンの濃度変
化（０〜１０μｇ／ｍｌ）による阻害活性を示す線図で
ある。

【図８】ペダンキュラギンの濃度変化（０〜１０００μ
ｇ／ｍｌ）による阻害活性を示す線図である。

【図９】ポリ(A)・(dT)₁₅に対するラインウィーバー−バ
ーク・プロットを示す線図である。

【図１０】dTTPに対するラインウィーバー−バーク・プ
ロットを示す線図である。

【図１１】ＲＮａｓｅＡとＭ−ＭＬＶとに対するペダン
キュラギンの濃度変化による阻害活性を示す線図であ
る。

【図１２】ＲＮａｓｅＢとＭ−ＭＬＶとに対するペダン
キュラギンの濃度変化による阻害活性を示す線図であ
る。

【図１３】アガロース電気泳動により子牛胸腺由来のＤ
ＮａｓｅＩに対するペダンキュラギンの濃度変化による
阻害活性を示す模式図である。

【図１４】アガロース電気泳動によりマングマメ由来の
ＤＮａｓｅに対するペダンキュラギンの濃度変化による
阻害活性を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の化１の化学構造式で表わされるペダ
   ンキュラギン(pedunculagin)が有効成分として含有され
   ることを特徴とする逆転写酵素阻害剤。（但し、式中の
   −Ｒ¹,−Ｒ² は−Ｈ又は−ＯＨ基である。） 【化１】
2. 【請求項２】 次の化２又は化３の化学構造式で表わさ
   れるペダンキュラギン(pedunculagin)の加水分解物が有
   効成分として含有されることを特徴とする逆転写酵素阻
   害剤。（但し、式中の−Ｒ¹,−Ｒ² は−Ｈ又は−ＯＨ基
   である。） 【化２】 【化３】
3. 【請求項３】 前記請求項１又は２に記載の逆転写酵素
   阻害剤において、 前記ペダンキュラギン(pedunculagin)がツバキ(Camelli
   a japonica) から得られたものであることを特徴とする
   逆転写酵素阻害剤。