JPH0666793A - リウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異な抗体 - Google Patents
リウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異な抗体Info
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- JPH0666793A JPH0666793A JP4334889A JP33488992A JPH0666793A JP H0666793 A JPH0666793 A JP H0666793A JP 4334889 A JP4334889 A JP 4334889A JP 33488992 A JP33488992 A JP 33488992A JP H0666793 A JPH0666793 A JP H0666793A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リウマチ患者血漿中から単離、精製したリウ
マチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異的
な抗体を得て、簡便で、特異性、再現性に優れた高感度
なリウマチ特異蛋白質の免疫学的測定法を確立する。 【構成】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で１
５０，０００〜１７０，０００分子量を示し、蛋白変性
剤を用いない２次元電気泳動における等電点が７．３〜
７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０
として）が０．３０〜０．４５で、かつ特定のアミノ酸
組成を有するリウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白
質に対して特異的な抗体。
マチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異的
な抗体を得て、簡便で、特異性、再現性に優れた高感度
なリウマチ特異蛋白質の免疫学的測定法を確立する。 【構成】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で１
５０，０００〜１７０，０００分子量を示し、蛋白変性
剤を用いない２次元電気泳動における等電点が７．３〜
７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０
として）が０．３０〜０．４５で、かつ特定のアミノ酸
組成を有するリウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白
質に対して特異的な抗体。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、慢性関節リウマチ等の
リウマチ患者血漿中から単離・精製したリウマチ疾患の
みに特異的に発現する蛋白質に対して特異的な抗体に関
するものである。 【０００２】 【従来の技術】現在リウマチの診断は、一般に１１項目
から成るアメリカリウマチ協会の診断基準に基づいて行
われている。しかし、この診断基準は医師の所見や患者
主訴に負うものが多く、そのため、診断は主観的かつ定
性的に行われているのが実情である。したがって、この
アメリカリウマチ協会の診断基準に基づくリウマチ因子
に代わる客観的かつ定量的に測定できるリウマチ診断の
ためのパラメーターが嘱望されている。 【０００３】本発明者らは、多数のリウマチ患者および
他の疾患患者、健常人の血漿について研究した結果、リ
ウマチ患者血漿中に、他の疾患患者や健常人の血漿中に
は認められない新規蛋白質（リウマチ特異蛋白質）が高
率に発現されていることを、蛋白変性剤を用いない２次
元電気泳動法（以下の２次元電気泳動はすべて蛋白変性
剤を用いていない）により発見し、さらに、このリウマ
チ特異蛋白質測定の慢性関節リウマチ診断における有用
性について報告した。（１９８３．５．生化学会） 【０００４】ところで、２次元電気泳動法は、研究的に
は非常に有効な測定方法ではあるが、検体処理能力が低
い、手間がかかる、操作に熟練を要する等、通常の臨床
検査法として広く一般に用いられる方法とはいえない。
この問題点を解決して、臨床検査法として広く一般に用
いられる方法を確立するためには、リウマチ特異蛋白質
に対する特異抗体を作成することが重要である。なぜな
ら、リウマチ特異蛋白質に対する特異抗体を用いること
によって、簡便で、特異性、再現性に優れた高感度なリ
ウマチ特異蛋白質の免疫学的測定法を確立できるからで
ある。 【０００５】一般に抗体は、抗原となる蛋白質等を動物
（例えばウサギ等）に免疫して、その動物の血清より得
ることができる。しかしながら、この時免疫する抗原の
純度が低く、目的とする抗原以外の共雑物が多く含まれ
ていると、その目的とする抗原以外の共雑物に対する抗
体（非特異抗体）もまた同時に作られ、最終的に得られ
る抗体の抗原に対する特異性は低くなってしまう。その
ために、この抗体を用いた抗原の免疫学的測定法もま
た、特異性が低くなる。つまり、特異性に優れた抗原の
免疫学的測定法の確立には、特異性の高い抗体が必要で
あり、特異性の高い抗体を得るためには高純度に精製さ
れた抗原が必要である。したがって、特異性の高いリウ
マチ特異蛋白質の免疫学的測定法の確立のためには、特
異性の高い抗体が必要であり、特異性の高い抗体の作成
には高純度に精製されたリウマチ特異蛋白質（すなわ
ち、精製リウマチ特異蛋白質）が必要である。よって、
リウマチ診断において、精製されたリウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質を得ることは重要である。 【０００６】本発明の抗体の特異的抗体であるリウマチ
疾患のみに特異的に発現する蛋白質は、リウマチ患者血
漿を２次元電気泳動する時、等電点（ｐＩ）７．３〜
７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０
として）０．３０〜０．４５の範囲に単一のスポットと
して認められる、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量が１５０，０００〜１７０，０００の蛋
白質であり、健常人血漿では認められない。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】リウマチ疾患のみに特
異的に発現する蛋白質は、本発明者らの研究によって、
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と類似した性質をもつ
蛋白質であることが解明された。 【０００８】 【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するため鋭意研究の結果、リウマチ疾患
のみに特異的に発現する蛋白質の簡便で優れた精製法の
開発に成功し、高純度に精製したリウマチ疾患のみに特
異的に発現する蛋白質（以下、抗リウマチ特異蛋白質ま
たは精製リウマチ特異蛋白質という）を得ることに成功
し、本発明の抗体を得るに至った。 【０００９】本発明の抗体は次のようにして得ることが
できる。リウマチ患者血漿の２５〜３５％飽和硫酸アン
モニウムで塩析される沈殿について（他の硫酸ナトリウ
ム等通常塩析に使用される塩を用いることができる。あ
るいは一般に行われているエチルアルコールやアセトン
等の有機溶媒等を用いた溶媒沈澱法によっても可能であ
る。）、例えば、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
（ファルマシア社製、スウェーデン）等のような陰イオ
ン交換ゲルによるイオン交換クロマトグラフィーを行
い、塩化ナトリウム等の塩濃度０．３Ｍ以下の低塩濃度
で溶出される分画を除去した後、塩化ナトリウム等の塩
濃度０．５Ｍで溶出される分画を回収する。次に、例え
ば抗ヒトＩｇＧ抗体、あるいはスタフイロコッカス由来
のヒトＩｇＧとの結合性を有するプロテインＡを、臭化
シアン等のリガンドによってセファロース４Ｂ（ファル
マシア社製、スウェーデン）等のようなゲルに結合させ
る。そのゲル〔抗ヒトＩｇＧ抗体（あるいはスタフイロ
コッカス由来プロテインＡ等）を結合したセファロース
４Ｂ等のゲル〕を詰めたカラム（アフィニティーカラ
ム）に、上記ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０のよう
な陰イオン交換ゲル等によるイオン交換クロマトグラフ
ィーによって粗精製したリウマチ患者の蛋白質を通す。
アフィニティーカラムをよく洗浄の後、グリシン緩衝液
等によってｐＨを変える方法、あるいは尿素等を用いる
穏やかな蛋白変性作用による方法等、通常アフィニティ
ーゲルからの蛋白質溶出法に用いられる方法によって、
アフィニティーカラムからリウマチ疾患に特異的に発現
する蛋白質を分離し、それを回収することによって精製
リウマチ特異蛋白質を得ることができる。 【００１０】かくして得られた精製リウマチ特異蛋白質
は、例えばポリアクリルアミドゲル等の電気泳動支持体
を用いて電気泳動し、その後、コマシー・ブリリアント
・ブルー等の蛋白染色剤によって染色、脱色した支持体
をデンシトメーター（常光社製、日本）等によって測定
する時、純度９０％以上である。 【００１１】また、この精製リウマチ特異蛋白質は、２
次元電気泳動する時、等電点（ＰＩ）７．３〜７．８、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
０．３０〜０．４５の範囲の単一スポットとして検出で
き、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって
測定する時、１５０，０００〜１７０，０００の分子量
を示す。また、この蛋白質を予め２−メルカプトエタノ
ール等の還元剤で還元した後に、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって分子量を測定する時、２
５，０００〜３０，０００および５５，０００〜６０，
０００の２種の分子量を示す。 【００１２】かくして精製リウマチ特異蛋白質に特異な
抗体、すなわち、本発明の抗リウマチ特異蛋白質抗体
は、精製リウマチ特異蛋白質を例えばフロインド（ Fre
und ）の完全アジュバント等と共に免疫可能な動物に免
疫して、その免疫動物から抗血清を採取して精製する抗
体作成の一般的方法によって得ることができる。抗血清
からの抗体の精製は、抗原である精製リウマチ特異蛋白
質を臭化シアン等のリガンドによってセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製、スウェーデン）等のゲルに結合さ
せ、そのゲルを詰めたカラムに抗血清を通し、よく洗浄
の後、グリシン緩衝液等によりカラムから抗体を分離す
る免疫吸着法等によって行うことができる。あるいは通
常のＩｇＧの精製法、すなわち塩析の後、陰イオン交換
クロマトグラフィーによりＩｇＧ分画を回収することに
よっても行うことができる。 【００１３】さらに、上記抗体は、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質のヒトＩｇＧとの共通抗原性部
分に対する抗体をまた含んでいるため、例えば次のよう
にしてヒトＩｇＧとの交差反応性を除去することができ
る。ヒトＩｇＧを臭化シアン等のリガンドによってセフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製、スウェーデン）等の
ゲルに結合させ、そのゲルを詰めたカラムに上記抗体を
通して、ヒトＩｇＧとの反応成分を除去することによっ
て、抗リウマチ特異蛋白質抗体を得ることができる。あ
るいは上記抗体にヒトＩｇＧを加えて一定時間反応させ
た後、ヒトＩｇＧと反応した抗体を除去することによっ
ても得ることができる。このようにして得た抗リウマチ
特異蛋白質抗体は、一般的な特異抗体の確認法、例えば
免疫電気泳動や免疫沈降反応等によって、精製リウマチ
特異蛋白質と特異的に反応することが確認できる。 【００１４】 【発明の効果】精製リウマチ特異蛋白質抗体を用いるこ
とによる血漿中のリウマチ疾患のみに特異的に発現する
蛋白質の測定は、現在一般に行われている特異抗体を用
いた抗原測定の方法、例えば、寒天等のゲルを用いた二
重免疫拡散法や、ラテックスや赤血球等に抗リウマチ特
異蛋白質抗体を固定して行う各種凝集反応、ビーズやマ
イクロプレート等の固相に抗リウマチ特異蛋白質抗体を
吸着させて酵素やラジオアイソトープ等を用いる免疫測
定法等により行うことができる。このような測定方法等
によって、本発明の精製リウマチ特異蛋白質抗体を用い
て精製リウマチ特異蛋白質が簡便に測定でき、したがっ
て、リウマチ診断のための日常検査法として本発明のリ
ウマチ特異蛋白質抗体は重要である。 【００１５】 【実施例】 ＜精製リウマチ特異蛋白質の取得＞慢性関節リウマチ患
者に血漿交換療法を施した結果生じた排血漿（１リット
ル）の、２５％飽和硫酸アンモニウムによって析出した
沈澱を８，０００×ｇ，２０分の遠心分離によって除
き、上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて、３５％飽
和硫酸アンモニウムとし、析出した沈澱を８，０００×
ｇ，２０分の遠心分離により回収した。この沈澱を０．
０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で溶解し、セファロン膜（ビスキングカ
ンパニー社製，米国）により、０．０５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で一晩
透析して硫酸アンモニウムを除去した（回収量：波長２
８０ｎｍにおけるＯＤ９５．２、液量９０ml）。次に、
あらかじめ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平
衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（ＤＥＡＥ
−Sephadex Ａ−５０ ファルマシア社製、スウェーデ
ン）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
濃度０．３Ｍ以下の塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）によって溶出される分画に
は、２次元電気泳動法でリウマチ疾患のみに特異的に発
現する蛋白質が認められず、よって、この分画は除去し
た。濃度０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で十分に溶出した後、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）によって溶出される分画にリウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質が含まれていることを２次元電
気泳動法によって確認し、この分画を回収した（回収
量：波長２８０ｎｍにおけるＯＤ０．３５、液量１００
ml）。 【００１６】別に、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ
（ＣＮＢｒ−activated Sepharose４Ｂ，ファルマシア
社製、スウェーデン）２ｇに、抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ
血清ＩｇＧ分画，マイルス社製，米国，製造元能書によ
れば蛋白量およそ９．６mg，内特異抗体２．９mg）を反
応させて、抗体結合ゲルを作成した。この抗体ゲルをカ
ラムに詰め、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した後、先にイオ
ン交換クロマトグラフィーによって回収したリウマチ疾
患のみに特異的に発現する蛋白質分画を抗体結合ゲルに
吸着させた。０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質を吸着させた抗体結合ゲルを十
分に洗浄した後、ｐＨ２．３のグリシン緩衝液（０．１
７Ｍ）で溶出した。溶出された蛋白質分画を回収し、そ
れに直ちに１／１０量のｐＨ１１．５のグリシン緩衝液
（１Ｍ）を加えて中和した。この時得られた蛋白質分画
を精製リウマチ特異蛋白質とした。得られた精製リウマ
チ特異蛋白質は、マイクロビウレット法によって蛋白量
２．７mgと測定できた。 【００１７】この精製リウマチ特異蛋白質を検体とし
て、以下のように２次元電気泳動を行った。精製リウマ
チ特異蛋白質６０μリットル（蛋白濃度０．４０mg／m
l）を、アンフォライン〔 Ampholine，ファルマシア社
製，６．２５ｗ／ｖ％（ｐＨ３．５−１０：ｐＨ３．５
−５＝４：１）〕を含むポリアクリルアミドゲル上で
０．０１Ｍリン酸液と０．０４Ｎ水酸化ナトリウム液を
用いて、はじめ一定電流（２ｍＡ）で泳動し、電圧が２
２０Ｖに達した後、２２０Ｖの一定電圧で２０時間泳動
した。次に、この泳動ゲルを４％から１７％の濃度勾配
をもつポリアクリルアミド・スラブゲル上に置いて、一
定電流（２７ｍＡ）で２０時間泳動した。泳動液には、
０．０５Ｍトリス−０．３８４Ｍグリシン緩衝液を用い
た。２次元電気泳動した後、ゲルは、０．０２５％コマ
シー・ブリリアント・ブルー（ Coomersie Brilliant B
lue Ｒ−２５０），５０ｖ／ｖ％メタノール，７ｖ／ｖ
％酢酸液で８時間染色し、７ｖ／ｖ％酢酸、１０ｖ／ｖ
％メタノール液で３日間脱色して観察した。（泳動像を
図１に示す。） 【００１８】泳動像は等電点（蛋白の泳動位置に相当す
るｐＨをその蛋白の等電点とした）７．３〜７．８、移
動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
０．３０〜０．４５の範囲内に、単一のスポットとして
得られ、このことよりリウマチ疾患のみに特異的に発現
する蛋白質であることを確認した。この時、２次元電気
泳動ゲル上には、上記範囲外に蛋白のスポットは認めら
れなかった。 【００１９】参考までに、慢性関節リウマチ患者血漿お
よび健常人血漿を同様の方法によって２次元電気泳動し
た場合の泳動像を、それぞれ図２および図３に示す。慢
性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動像には、等電
点７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動
度を１．０として）０．３０〜０．４５の範囲内にリウ
マチ特異蛋白質のスポットがみられる（破線で禍根だ部
分）。しかしながら、健常人血漿の２次元電気泳動像に
は、等電点７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端
部の移動度を１．０として）０．３０〜０．４５の範囲
内に蛋白質のスポットは全く認められない。 【００２０】得られた精製リウマチ特異蛋白質（０．５
mg／ml）１０μリットルを、４〜１７％の濃度勾配をも
つポリアクリルアミド・スラブゲルによって電気泳動し
た。次に、泳動ゲルを０．０２５％コマシー・ブリリア
ント・ブルー（ Coomersie Brilliant Blue Ｒ−２５
０），５０ｖ／ｖ％メタノール，７ｖ／ｖ％酢酸液で８
時間染色し、７ｖ／ｖ％酢酸、１０ｖ／ｖ％メタノール
液で３日間脱色した。その後、泳動ゲルをデンシトメー
ター（ DENSITRON IM 、常光社製，日本）によって測定
した。この時、精製リウマチ特異蛋白質の純度は９２％
と測定できた。 【００２１】また、精製リウマチ特異蛋白質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約１６０，００
０、２−メルカプトエタノールによって還元した後に行
ったＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約
２８，０００および約６０，０００の２サブユニットと
測定できた。 【００２２】さらに、精製リウマチ特異蛋白質を６Ｎ塩
酸で１１０℃で２４時間加水分解後、アミノ酸分析機
（ＫＬＨ−５、日立社製、日本）によってアミノ酸の分
析を行った。この時得た結果は、次のようであった（単
位 mole ％）。 【００２３】 Lysine 6.6 Histidine 1.9 Arginine 4.0 Aspartic acid 7.0 Threonine 8.5 Serine 10.0 Glutamic acid 10.0 Proline 7.9 Glycine 10.4 Alanine 4.7 Cysteine／２ 1.0 Valine 7.5 Methionine 1.6 Isoleucine 2.9 Leucine 8.3 Tyrosine 4.5 Phenylalanine 2.9 Tryptophane 測定せず 【００２４】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体の作成＞精製
リウマチ特異蛋白質１ml（蛋白量０．３０mg）とフロイ
ンド（ Freund ）完全アジュバント１mlを混ぜ合わせ
て、安定な油中水型エマルジョンを作成し、成熟家兎皮
下に注射した。１ケ月後に、精製リウマチ特異蛋白質１
ml（蛋白量０．３０mg）とフロインド（ Freund ）完全
アジュバント１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型エマ
ルジョンを再度作成し、同じ家兎に皮下注射した。さら
に２週間後に、上記と同様にして再度家兎に免役し、そ
の３日後に採血して抗血清を得た。 【００２５】抗血清からの抗体の精製は次のようにして
行った。まず抗血清に硫酸アンモニウムを加えて、３５
％飽和硫酸アンモニウム濃度とし、析出した沈澱を８，
０００×ｇ，２０分の遠心分離により回収した。この沈
澱を０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解し、セロファン膜（ビスキ
ングカンパニー社製，米国）により、０．０５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
で一晩透析して硫酸アンモニウムを除去した。次に、あ
らかじめ０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０（ＤＥＡＥ−Sephadex Ａ−５０
ファルマシア社製、スウェーデン）を用いてイオン交換
クロマトグラフィーを行い、ＩｇＧ分画を回収した。抗
血清２０mlから蛋白量で２２０mgが回収できた（波長２
８０ｎｍ，Ｅ＝１４．０として）。 【００２６】別に、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ
（ＣＮＢｒ−activated Sepharose４Ｂ，ファルマシア
社製、スウェーデン）１０ｇに、ヒトＩｇＧ７０mgを結
合させて、ヒトＩｇＧ結合ゲルを作成した。このＩｇＧ
結合ゲルをカラムに詰め、０．０５Ｍの塩化ナトリウム
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄し
た後、イオン交換クロマトグラフィーによって回収した
上記ＩｇＧ結合ゲルに通して、ヒトＩｇＧと交差反応す
るＩｇＧを吸着除去した。ヒトＩｇＧ結合ゲルとの非反
応分画を回収して抗リウマチ特異蛋白質抗体とした。最
終的に得られた抗体は、蛋白量で１５０mgであった。 【００２７】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体の確認＞抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体は、免疫電気泳動法によって確認
した。ガラス板（７．５×５．２×０．１５cm）に１％
アガロース〔 agarose, （半井化学社製）１ｇを１００
mlのベロナール緩衝液（ｐＨ８．６，イオン強度０．０
５）に溶解したもの〕を流し、固化したものを泳動ゲル
とした。泳動ゲルの中央付近に直径約３mmの穴をあけ、
検体およそ１０μリットルを加えて泳動した。検体とし
ては、精製リウマチ特異蛋白質（０．３mg／ml）、精製
リウマチ特異蛋白質と２次元電気泳動によってリウマチ
特異蛋白質陰性と判定されたヒト血漿の混液（精製リウ
マチ特異蛋白質の終濃度０．３mg／ml，血漿終濃度２倍
稀釈）を用いた。２５０Ｖ定電圧で９０分間泳動した
後、各泳動位置の横に幅約１mmの溝をカミソリであけ、
抗リウマチ特異蛋白質抗体または抗ヒト全血清抗体（カ
ペル社製、米国）およそ２００μリットルを加えて泳動
蛋白と反応させた。１日室温に静置後、３日間脱蛋白を
行い、その後０．０２５％コマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色、脱色して沈降線を観察した。泳動像を図４
に示す。図中ａ，ｂは、それぞれ精製リウマチ特異蛋白
質、精製リウマチ特異蛋白質と２次元電気泳動によって
リウマチ特異蛋白質陰性と判定されたヒト血漿の混液、
ｃ，ｄはそれぞれ抗リウマチ特異蛋白質抗体および抗ヒ
ト全部血清抗体の添加位置、１，２，３，４は、それぞ
れリウマチ特異蛋白質、ＩｇＧ、トランスフェリン、ア
ルブミンの沈降線である。なお、ｂとｄとの反応による
沈降線は、代表的なもののみを示した。 【００２８】精製リウマチ特異蛋白質と抗リウマチ特異
蛋白質抗体の反応は、β２位からγ位にかけて単一の沈
降線が認められた。精製リウマチ特異蛋白質と２次元電
気泳動によってリウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋
白質が陰性と判定されたヒト血漿の混液と、抗リウマチ
特異蛋白質抗体の反応もまた、β２位からγ位にかけて
の沈降線が認められたのみであった。本結果より、抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体は精製リウマチ特異蛋白質と特異
的に反応してβ２位からγ位にかけて沈降線を形成する
ことがわかる。 【００２９】精製リウマチ特異蛋白質と抗リウマチ特異
蛋白質抗体との反応では、β２位からγ位にかけての沈
降線が同様に観察できた。これは、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質とヒトＩｇＧが免疫学的に一部
共通な構造をもつため、精製リウマチ特異蛋白質が抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体中の抗ヒトＩｇＧ抗体と反応する
ことによってできた沈降線である。 【００３０】対照として、精製リウマチ特異蛋白質と２
次元電気泳動によってリウマチ疾患のみに特異的に発現
する蛋白質が陰性と判定されたヒト血漿の混液と、抗リ
ウマチ全血清抗体との反応も図４に示した。 【００３１】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体による血中リ
ウマチ疾患に特異的に発現する蛋白質の測定＞抗リウマ
チ特異蛋白質抗体による血中リウマチ特異蛋白質の測定
は、二重免疫沈降反応（オクタロニー法）によって行っ
た。まず、直径約５mmの穴をあけた１％アガロースゲル
（ agarose, 半井化学社製）の各穴に、検体または陽性
対照である精製リウマチ特異蛋白質を加えて、別の穴に
加えた抗リウマチ特異蛋白質抗体と反応させた。反応後
３日間脱蛋白を行い、その後０．０２５％コマシー・ブ
リリアント・ブルーで染色、脱色して沈降線を観察し
た。陽性・陰性は沈降線によって判定した。測定結果を
表１に示す。 【００３２】 【表１】 【００３３】この時、リウマチ因子と抗リウマチ特異蛋
白質抗体との反応による偽陽性を防ぐために、次の操作
を試験に先だって行った。各検体に、検体１００μリッ
トル当たり、免疫吸着剤〔旭化成工業（株）製、特開昭
５７−１２２８７５号〕４０μリットルを加え、室温で
１時間反応させた。その後３，０００rpm ×１０分間遠
心して免疫吸着剤を除去することによって、それに結合
したリウマチ因子を除き、その上清を回収して試験に用
いた。 【００３４】慢性関節リウマチ患者１００例のうち６２
例で陽性と判定できた。それに対して健常人４０例、癌
患者（胃癌、肝癌、大腸癌、悪性リンパ腫、メラノー
マ）７６例、肝疾患患者（肝硬変、肝炎）４８例、腎不
全患者１６例ではすべて陰性と判定できた。つまり、慢
性関節リウマチ患者における陽性率が６２％であったの
に対して、健常人、癌患者、肝疾患患者および腎不全患
者では陽性率が０％であり、よって、慢性関節リウマチ
診断における抗リウマチ特異蛋白質抗体の有用性は明ら
かである。
リウマチ患者血漿中から単離・精製したリウマチ疾患の
みに特異的に発現する蛋白質に対して特異的な抗体に関
するものである。 【０００２】 【従来の技術】現在リウマチの診断は、一般に１１項目
から成るアメリカリウマチ協会の診断基準に基づいて行
われている。しかし、この診断基準は医師の所見や患者
主訴に負うものが多く、そのため、診断は主観的かつ定
性的に行われているのが実情である。したがって、この
アメリカリウマチ協会の診断基準に基づくリウマチ因子
に代わる客観的かつ定量的に測定できるリウマチ診断の
ためのパラメーターが嘱望されている。 【０００３】本発明者らは、多数のリウマチ患者および
他の疾患患者、健常人の血漿について研究した結果、リ
ウマチ患者血漿中に、他の疾患患者や健常人の血漿中に
は認められない新規蛋白質（リウマチ特異蛋白質）が高
率に発現されていることを、蛋白変性剤を用いない２次
元電気泳動法（以下の２次元電気泳動はすべて蛋白変性
剤を用いていない）により発見し、さらに、このリウマ
チ特異蛋白質測定の慢性関節リウマチ診断における有用
性について報告した。（１９８３．５．生化学会） 【０００４】ところで、２次元電気泳動法は、研究的に
は非常に有効な測定方法ではあるが、検体処理能力が低
い、手間がかかる、操作に熟練を要する等、通常の臨床
検査法として広く一般に用いられる方法とはいえない。
この問題点を解決して、臨床検査法として広く一般に用
いられる方法を確立するためには、リウマチ特異蛋白質
に対する特異抗体を作成することが重要である。なぜな
ら、リウマチ特異蛋白質に対する特異抗体を用いること
によって、簡便で、特異性、再現性に優れた高感度なリ
ウマチ特異蛋白質の免疫学的測定法を確立できるからで
ある。 【０００５】一般に抗体は、抗原となる蛋白質等を動物
（例えばウサギ等）に免疫して、その動物の血清より得
ることができる。しかしながら、この時免疫する抗原の
純度が低く、目的とする抗原以外の共雑物が多く含まれ
ていると、その目的とする抗原以外の共雑物に対する抗
体（非特異抗体）もまた同時に作られ、最終的に得られ
る抗体の抗原に対する特異性は低くなってしまう。その
ために、この抗体を用いた抗原の免疫学的測定法もま
た、特異性が低くなる。つまり、特異性に優れた抗原の
免疫学的測定法の確立には、特異性の高い抗体が必要で
あり、特異性の高い抗体を得るためには高純度に精製さ
れた抗原が必要である。したがって、特異性の高いリウ
マチ特異蛋白質の免疫学的測定法の確立のためには、特
異性の高い抗体が必要であり、特異性の高い抗体の作成
には高純度に精製されたリウマチ特異蛋白質（すなわ
ち、精製リウマチ特異蛋白質）が必要である。よって、
リウマチ診断において、精製されたリウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質を得ることは重要である。 【０００６】本発明の抗体の特異的抗体であるリウマチ
疾患のみに特異的に発現する蛋白質は、リウマチ患者血
漿を２次元電気泳動する時、等電点（ｐＩ）７．３〜
７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０
として）０．３０〜０．４５の範囲に単一のスポットと
して認められる、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量が１５０，０００〜１７０，０００の蛋
白質であり、健常人血漿では認められない。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】リウマチ疾患のみに特
異的に発現する蛋白質は、本発明者らの研究によって、
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と類似した性質をもつ
蛋白質であることが解明された。 【０００８】 【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するため鋭意研究の結果、リウマチ疾患
のみに特異的に発現する蛋白質の簡便で優れた精製法の
開発に成功し、高純度に精製したリウマチ疾患のみに特
異的に発現する蛋白質（以下、抗リウマチ特異蛋白質ま
たは精製リウマチ特異蛋白質という）を得ることに成功
し、本発明の抗体を得るに至った。 【０００９】本発明の抗体は次のようにして得ることが
できる。リウマチ患者血漿の２５〜３５％飽和硫酸アン
モニウムで塩析される沈殿について（他の硫酸ナトリウ
ム等通常塩析に使用される塩を用いることができる。あ
るいは一般に行われているエチルアルコールやアセトン
等の有機溶媒等を用いた溶媒沈澱法によっても可能であ
る。）、例えば、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
（ファルマシア社製、スウェーデン）等のような陰イオ
ン交換ゲルによるイオン交換クロマトグラフィーを行
い、塩化ナトリウム等の塩濃度０．３Ｍ以下の低塩濃度
で溶出される分画を除去した後、塩化ナトリウム等の塩
濃度０．５Ｍで溶出される分画を回収する。次に、例え
ば抗ヒトＩｇＧ抗体、あるいはスタフイロコッカス由来
のヒトＩｇＧとの結合性を有するプロテインＡを、臭化
シアン等のリガンドによってセファロース４Ｂ（ファル
マシア社製、スウェーデン）等のようなゲルに結合させ
る。そのゲル〔抗ヒトＩｇＧ抗体（あるいはスタフイロ
コッカス由来プロテインＡ等）を結合したセファロース
４Ｂ等のゲル〕を詰めたカラム（アフィニティーカラ
ム）に、上記ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０のよう
な陰イオン交換ゲル等によるイオン交換クロマトグラフ
ィーによって粗精製したリウマチ患者の蛋白質を通す。
アフィニティーカラムをよく洗浄の後、グリシン緩衝液
等によってｐＨを変える方法、あるいは尿素等を用いる
穏やかな蛋白変性作用による方法等、通常アフィニティ
ーゲルからの蛋白質溶出法に用いられる方法によって、
アフィニティーカラムからリウマチ疾患に特異的に発現
する蛋白質を分離し、それを回収することによって精製
リウマチ特異蛋白質を得ることができる。 【００１０】かくして得られた精製リウマチ特異蛋白質
は、例えばポリアクリルアミドゲル等の電気泳動支持体
を用いて電気泳動し、その後、コマシー・ブリリアント
・ブルー等の蛋白染色剤によって染色、脱色した支持体
をデンシトメーター（常光社製、日本）等によって測定
する時、純度９０％以上である。 【００１１】また、この精製リウマチ特異蛋白質は、２
次元電気泳動する時、等電点（ＰＩ）７．３〜７．８、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
０．３０〜０．４５の範囲の単一スポットとして検出で
き、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって
測定する時、１５０，０００〜１７０，０００の分子量
を示す。また、この蛋白質を予め２−メルカプトエタノ
ール等の還元剤で還元した後に、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって分子量を測定する時、２
５，０００〜３０，０００および５５，０００〜６０，
０００の２種の分子量を示す。 【００１２】かくして精製リウマチ特異蛋白質に特異な
抗体、すなわち、本発明の抗リウマチ特異蛋白質抗体
は、精製リウマチ特異蛋白質を例えばフロインド（ Fre
und ）の完全アジュバント等と共に免疫可能な動物に免
疫して、その免疫動物から抗血清を採取して精製する抗
体作成の一般的方法によって得ることができる。抗血清
からの抗体の精製は、抗原である精製リウマチ特異蛋白
質を臭化シアン等のリガンドによってセファロース４Ｂ
（ファルマシア社製、スウェーデン）等のゲルに結合さ
せ、そのゲルを詰めたカラムに抗血清を通し、よく洗浄
の後、グリシン緩衝液等によりカラムから抗体を分離す
る免疫吸着法等によって行うことができる。あるいは通
常のＩｇＧの精製法、すなわち塩析の後、陰イオン交換
クロマトグラフィーによりＩｇＧ分画を回収することに
よっても行うことができる。 【００１３】さらに、上記抗体は、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質のヒトＩｇＧとの共通抗原性部
分に対する抗体をまた含んでいるため、例えば次のよう
にしてヒトＩｇＧとの交差反応性を除去することができ
る。ヒトＩｇＧを臭化シアン等のリガンドによってセフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社製、スウェーデン）等の
ゲルに結合させ、そのゲルを詰めたカラムに上記抗体を
通して、ヒトＩｇＧとの反応成分を除去することによっ
て、抗リウマチ特異蛋白質抗体を得ることができる。あ
るいは上記抗体にヒトＩｇＧを加えて一定時間反応させ
た後、ヒトＩｇＧと反応した抗体を除去することによっ
ても得ることができる。このようにして得た抗リウマチ
特異蛋白質抗体は、一般的な特異抗体の確認法、例えば
免疫電気泳動や免疫沈降反応等によって、精製リウマチ
特異蛋白質と特異的に反応することが確認できる。 【００１４】 【発明の効果】精製リウマチ特異蛋白質抗体を用いるこ
とによる血漿中のリウマチ疾患のみに特異的に発現する
蛋白質の測定は、現在一般に行われている特異抗体を用
いた抗原測定の方法、例えば、寒天等のゲルを用いた二
重免疫拡散法や、ラテックスや赤血球等に抗リウマチ特
異蛋白質抗体を固定して行う各種凝集反応、ビーズやマ
イクロプレート等の固相に抗リウマチ特異蛋白質抗体を
吸着させて酵素やラジオアイソトープ等を用いる免疫測
定法等により行うことができる。このような測定方法等
によって、本発明の精製リウマチ特異蛋白質抗体を用い
て精製リウマチ特異蛋白質が簡便に測定でき、したがっ
て、リウマチ診断のための日常検査法として本発明のリ
ウマチ特異蛋白質抗体は重要である。 【００１５】 【実施例】 ＜精製リウマチ特異蛋白質の取得＞慢性関節リウマチ患
者に血漿交換療法を施した結果生じた排血漿（１リット
ル）の、２５％飽和硫酸アンモニウムによって析出した
沈澱を８，０００×ｇ，２０分の遠心分離によって除
き、上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて、３５％飽
和硫酸アンモニウムとし、析出した沈澱を８，０００×
ｇ，２０分の遠心分離により回収した。この沈澱を０．
０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で溶解し、セファロン膜（ビスキングカ
ンパニー社製，米国）により、０．０５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で一晩
透析して硫酸アンモニウムを除去した（回収量：波長２
８０ｎｍにおけるＯＤ９５．２、液量９０ml）。次に、
あらかじめ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平
衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（ＤＥＡＥ
−Sephadex Ａ−５０ ファルマシア社製、スウェーデ
ン）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
濃度０．３Ｍ以下の塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）によって溶出される分画に
は、２次元電気泳動法でリウマチ疾患のみに特異的に発
現する蛋白質が認められず、よって、この分画は除去し
た。濃度０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で十分に溶出した後、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）によって溶出される分画にリウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質が含まれていることを２次元電
気泳動法によって確認し、この分画を回収した（回収
量：波長２８０ｎｍにおけるＯＤ０．３５、液量１００
ml）。 【００１６】別に、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ
（ＣＮＢｒ−activated Sepharose４Ｂ，ファルマシア
社製、スウェーデン）２ｇに、抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ
血清ＩｇＧ分画，マイルス社製，米国，製造元能書によ
れば蛋白量およそ９．６mg，内特異抗体２．９mg）を反
応させて、抗体結合ゲルを作成した。この抗体ゲルをカ
ラムに詰め、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した後、先にイオ
ン交換クロマトグラフィーによって回収したリウマチ疾
患のみに特異的に発現する蛋白質分画を抗体結合ゲルに
吸着させた。０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質を吸着させた抗体結合ゲルを十
分に洗浄した後、ｐＨ２．３のグリシン緩衝液（０．１
７Ｍ）で溶出した。溶出された蛋白質分画を回収し、そ
れに直ちに１／１０量のｐＨ１１．５のグリシン緩衝液
（１Ｍ）を加えて中和した。この時得られた蛋白質分画
を精製リウマチ特異蛋白質とした。得られた精製リウマ
チ特異蛋白質は、マイクロビウレット法によって蛋白量
２．７mgと測定できた。 【００１７】この精製リウマチ特異蛋白質を検体とし
て、以下のように２次元電気泳動を行った。精製リウマ
チ特異蛋白質６０μリットル（蛋白濃度０．４０mg／m
l）を、アンフォライン〔 Ampholine，ファルマシア社
製，６．２５ｗ／ｖ％（ｐＨ３．５−１０：ｐＨ３．５
−５＝４：１）〕を含むポリアクリルアミドゲル上で
０．０１Ｍリン酸液と０．０４Ｎ水酸化ナトリウム液を
用いて、はじめ一定電流（２ｍＡ）で泳動し、電圧が２
２０Ｖに達した後、２２０Ｖの一定電圧で２０時間泳動
した。次に、この泳動ゲルを４％から１７％の濃度勾配
をもつポリアクリルアミド・スラブゲル上に置いて、一
定電流（２７ｍＡ）で２０時間泳動した。泳動液には、
０．０５Ｍトリス−０．３８４Ｍグリシン緩衝液を用い
た。２次元電気泳動した後、ゲルは、０．０２５％コマ
シー・ブリリアント・ブルー（ Coomersie Brilliant B
lue Ｒ−２５０），５０ｖ／ｖ％メタノール，７ｖ／ｖ
％酢酸液で８時間染色し、７ｖ／ｖ％酢酸、１０ｖ／ｖ
％メタノール液で３日間脱色して観察した。（泳動像を
図１に示す。） 【００１８】泳動像は等電点（蛋白の泳動位置に相当す
るｐＨをその蛋白の等電点とした）７．３〜７．８、移
動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
０．３０〜０．４５の範囲内に、単一のスポットとして
得られ、このことよりリウマチ疾患のみに特異的に発現
する蛋白質であることを確認した。この時、２次元電気
泳動ゲル上には、上記範囲外に蛋白のスポットは認めら
れなかった。 【００１９】参考までに、慢性関節リウマチ患者血漿お
よび健常人血漿を同様の方法によって２次元電気泳動し
た場合の泳動像を、それぞれ図２および図３に示す。慢
性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動像には、等電
点７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端部の移動
度を１．０として）０．３０〜０．４５の範囲内にリウ
マチ特異蛋白質のスポットがみられる（破線で禍根だ部
分）。しかしながら、健常人血漿の２次元電気泳動像に
は、等電点７．３〜７．８、移動度（アルブミン最先端
部の移動度を１．０として）０．３０〜０．４５の範囲
内に蛋白質のスポットは全く認められない。 【００２０】得られた精製リウマチ特異蛋白質（０．５
mg／ml）１０μリットルを、４〜１７％の濃度勾配をも
つポリアクリルアミド・スラブゲルによって電気泳動し
た。次に、泳動ゲルを０．０２５％コマシー・ブリリア
ント・ブルー（ Coomersie Brilliant Blue Ｒ−２５
０），５０ｖ／ｖ％メタノール，７ｖ／ｖ％酢酸液で８
時間染色し、７ｖ／ｖ％酢酸、１０ｖ／ｖ％メタノール
液で３日間脱色した。その後、泳動ゲルをデンシトメー
ター（ DENSITRON IM 、常光社製，日本）によって測定
した。この時、精製リウマチ特異蛋白質の純度は９２％
と測定できた。 【００２１】また、精製リウマチ特異蛋白質はＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約１６０，００
０、２−メルカプトエタノールによって還元した後に行
ったＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約
２８，０００および約６０，０００の２サブユニットと
測定できた。 【００２２】さらに、精製リウマチ特異蛋白質を６Ｎ塩
酸で１１０℃で２４時間加水分解後、アミノ酸分析機
（ＫＬＨ−５、日立社製、日本）によってアミノ酸の分
析を行った。この時得た結果は、次のようであった（単
位 mole ％）。 【００２３】 Lysine 6.6 Histidine 1.9 Arginine 4.0 Aspartic acid 7.0 Threonine 8.5 Serine 10.0 Glutamic acid 10.0 Proline 7.9 Glycine 10.4 Alanine 4.7 Cysteine／２ 1.0 Valine 7.5 Methionine 1.6 Isoleucine 2.9 Leucine 8.3 Tyrosine 4.5 Phenylalanine 2.9 Tryptophane 測定せず 【００２４】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体の作成＞精製
リウマチ特異蛋白質１ml（蛋白量０．３０mg）とフロイ
ンド（ Freund ）完全アジュバント１mlを混ぜ合わせ
て、安定な油中水型エマルジョンを作成し、成熟家兎皮
下に注射した。１ケ月後に、精製リウマチ特異蛋白質１
ml（蛋白量０．３０mg）とフロインド（ Freund ）完全
アジュバント１mlを混ぜ合わせて、安定な油中水型エマ
ルジョンを再度作成し、同じ家兎に皮下注射した。さら
に２週間後に、上記と同様にして再度家兎に免役し、そ
の３日後に採血して抗血清を得た。 【００２５】抗血清からの抗体の精製は次のようにして
行った。まず抗血清に硫酸アンモニウムを加えて、３５
％飽和硫酸アンモニウム濃度とし、析出した沈澱を８，
０００×ｇ，２０分の遠心分離により回収した。この沈
澱を０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解し、セロファン膜（ビスキ
ングカンパニー社製，米国）により、０．０５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
で一晩透析して硫酸アンモニウムを除去した。次に、あ
らかじめ０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０（ＤＥＡＥ−Sephadex Ａ−５０
ファルマシア社製、スウェーデン）を用いてイオン交換
クロマトグラフィーを行い、ＩｇＧ分画を回収した。抗
血清２０mlから蛋白量で２２０mgが回収できた（波長２
８０ｎｍ，Ｅ＝１４．０として）。 【００２６】別に、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ
（ＣＮＢｒ−activated Sepharose４Ｂ，ファルマシア
社製、スウェーデン）１０ｇに、ヒトＩｇＧ７０mgを結
合させて、ヒトＩｇＧ結合ゲルを作成した。このＩｇＧ
結合ゲルをカラムに詰め、０．０５Ｍの塩化ナトリウム
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄し
た後、イオン交換クロマトグラフィーによって回収した
上記ＩｇＧ結合ゲルに通して、ヒトＩｇＧと交差反応す
るＩｇＧを吸着除去した。ヒトＩｇＧ結合ゲルとの非反
応分画を回収して抗リウマチ特異蛋白質抗体とした。最
終的に得られた抗体は、蛋白量で１５０mgであった。 【００２７】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体の確認＞抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体は、免疫電気泳動法によって確認
した。ガラス板（７．５×５．２×０．１５cm）に１％
アガロース〔 agarose, （半井化学社製）１ｇを１００
mlのベロナール緩衝液（ｐＨ８．６，イオン強度０．０
５）に溶解したもの〕を流し、固化したものを泳動ゲル
とした。泳動ゲルの中央付近に直径約３mmの穴をあけ、
検体およそ１０μリットルを加えて泳動した。検体とし
ては、精製リウマチ特異蛋白質（０．３mg／ml）、精製
リウマチ特異蛋白質と２次元電気泳動によってリウマチ
特異蛋白質陰性と判定されたヒト血漿の混液（精製リウ
マチ特異蛋白質の終濃度０．３mg／ml，血漿終濃度２倍
稀釈）を用いた。２５０Ｖ定電圧で９０分間泳動した
後、各泳動位置の横に幅約１mmの溝をカミソリであけ、
抗リウマチ特異蛋白質抗体または抗ヒト全血清抗体（カ
ペル社製、米国）およそ２００μリットルを加えて泳動
蛋白と反応させた。１日室温に静置後、３日間脱蛋白を
行い、その後０．０２５％コマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色、脱色して沈降線を観察した。泳動像を図４
に示す。図中ａ，ｂは、それぞれ精製リウマチ特異蛋白
質、精製リウマチ特異蛋白質と２次元電気泳動によって
リウマチ特異蛋白質陰性と判定されたヒト血漿の混液、
ｃ，ｄはそれぞれ抗リウマチ特異蛋白質抗体および抗ヒ
ト全部血清抗体の添加位置、１，２，３，４は、それぞ
れリウマチ特異蛋白質、ＩｇＧ、トランスフェリン、ア
ルブミンの沈降線である。なお、ｂとｄとの反応による
沈降線は、代表的なもののみを示した。 【００２８】精製リウマチ特異蛋白質と抗リウマチ特異
蛋白質抗体の反応は、β２位からγ位にかけて単一の沈
降線が認められた。精製リウマチ特異蛋白質と２次元電
気泳動によってリウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋
白質が陰性と判定されたヒト血漿の混液と、抗リウマチ
特異蛋白質抗体の反応もまた、β２位からγ位にかけて
の沈降線が認められたのみであった。本結果より、抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体は精製リウマチ特異蛋白質と特異
的に反応してβ２位からγ位にかけて沈降線を形成する
ことがわかる。 【００２９】精製リウマチ特異蛋白質と抗リウマチ特異
蛋白質抗体との反応では、β２位からγ位にかけての沈
降線が同様に観察できた。これは、リウマチ疾患のみに
特異的に発現する蛋白質とヒトＩｇＧが免疫学的に一部
共通な構造をもつため、精製リウマチ特異蛋白質が抗リ
ウマチ特異蛋白質抗体中の抗ヒトＩｇＧ抗体と反応する
ことによってできた沈降線である。 【００３０】対照として、精製リウマチ特異蛋白質と２
次元電気泳動によってリウマチ疾患のみに特異的に発現
する蛋白質が陰性と判定されたヒト血漿の混液と、抗リ
ウマチ全血清抗体との反応も図４に示した。 【００３１】＜抗リウマチ特異蛋白質抗体による血中リ
ウマチ疾患に特異的に発現する蛋白質の測定＞抗リウマ
チ特異蛋白質抗体による血中リウマチ特異蛋白質の測定
は、二重免疫沈降反応（オクタロニー法）によって行っ
た。まず、直径約５mmの穴をあけた１％アガロースゲル
（ agarose, 半井化学社製）の各穴に、検体または陽性
対照である精製リウマチ特異蛋白質を加えて、別の穴に
加えた抗リウマチ特異蛋白質抗体と反応させた。反応後
３日間脱蛋白を行い、その後０．０２５％コマシー・ブ
リリアント・ブルーで染色、脱色して沈降線を観察し
た。陽性・陰性は沈降線によって判定した。測定結果を
表１に示す。 【００３２】 【表１】 【００３３】この時、リウマチ因子と抗リウマチ特異蛋
白質抗体との反応による偽陽性を防ぐために、次の操作
を試験に先だって行った。各検体に、検体１００μリッ
トル当たり、免疫吸着剤〔旭化成工業（株）製、特開昭
５７−１２２８７５号〕４０μリットルを加え、室温で
１時間反応させた。その後３，０００rpm ×１０分間遠
心して免疫吸着剤を除去することによって、それに結合
したリウマチ因子を除き、その上清を回収して試験に用
いた。 【００３４】慢性関節リウマチ患者１００例のうち６２
例で陽性と判定できた。それに対して健常人４０例、癌
患者（胃癌、肝癌、大腸癌、悪性リンパ腫、メラノー
マ）７６例、肝疾患患者（肝硬変、肝炎）４８例、腎不
全患者１６例ではすべて陰性と判定できた。つまり、慢
性関節リウマチ患者における陽性率が６２％であったの
に対して、健常人、癌患者、肝疾患患者および腎不全患
者では陽性率が０％であり、よって、慢性関節リウマチ
診断における抗リウマチ特異蛋白質抗体の有用性は明ら
かである。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製リウマチ特異蛋白質の２次元電気泳動図で
ある。 【図２】慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動図
である。 【図３】健常人血漿の２次元電気泳動図である。 【図４】免疫電気泳動の泳動結果を示す泳動像である。
ある。 【図２】慢性関節リウマチ患者血漿の２次元電気泳動図
である。 【図３】健常人血漿の２次元電気泳動図である。 【図４】免疫電気泳動の泳動結果を示す泳動像である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｂ 9015−2Ｊ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で１５０，００
０〜１７０，０００の分子量を示し、蛋白変性剤を用い
ない２次元電気泳動における等電点が７．３〜７．８、
移動度（アルブミン最先端部の移動度を１．０として）
が０．３０〜０．４５の範囲にあり、かつアミノ酸組成
が以下のとおりであるリウマチ疾患のみに特異的に発現
する蛋白質に対して特異な抗体。 アミノ酸組成：Lysine 6.6; Histidine 1.9; Arginin
e 4.0; Aspartic acid 7.0;Threonine 8.5; Serine 1
0.0; Glutamic acid 10.4; Proline 7.9;Glycine 10.
4; Alanine 4.7; Cysteine/2 1.0; Valine 7.5;Met
hionine 1.6; Isoleucine 2.9; Leucine 8.3; Tyros
ine 4.5;Phenylalanine 2.9; Tryptophan 測定せず
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4334889A JPH0666793A (ja) | 1984-09-14 | 1992-11-24 | リウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異な抗体 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59191754A JPS6170464A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | 精製リウマチ特異蛋白質およびその特異抗体 |
| JP4334889A JPH0666793A (ja) | 1984-09-14 | 1992-11-24 | リウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異な抗体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59191754A Division JPS6170464A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | 精製リウマチ特異蛋白質およびその特異抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0666793A true JPH0666793A (ja) | 1994-03-11 |
Family
ID=26506879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4334889A Pending JPH0666793A (ja) | 1984-09-14 | 1992-11-24 | リウマチ疾患のみに特異的に発現する蛋白質に対して特異な抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0666793A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015519360A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ | 多様な官能基を有する粒子による免疫グロブリンｇ調製物のクロマトグラフィー精製 |
-
1992
- 1992-11-24 JP JP4334889A patent/JPH0666793A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015519360A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ | 多様な官能基を有する粒子による免疫グロブリンｇ調製物のクロマトグラフィー精製 |
| US9890205B2 (en) | 2012-05-31 | 2018-02-13 | Agency For Science, Technology And Research | Chromatographic purification of immunoglobulin G preparations with particles having multimodal functionalities |
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