JPH0657720B2 - B cell differentiation factor - Google Patents

B cell differentiation factor

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JPH0657720B2
JPH0657720B2 JP60025301A JP2530185A JPH0657720B2 JP H0657720 B2 JPH0657720 B2 JP H0657720B2 JP 60025301 A JP60025301 A JP 60025301A JP 2530185 A JP2530185 A JP 2530185A JP H0657720 B2 JPH0657720 B2 JP H0657720B2
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bcdf
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cell
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、人について活性を有するB細胞分化因子
(以下「BCDF」と記す)蛋白標品に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a B cell differentiation factor (hereinafter referred to as “BCDF”) protein preparation having human activity.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

抗原刺激を受け活性化された成熟B細胞は、T細胞の助
けにより分裂増殖するが、さらにB細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、1種またはそれ以上のT
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。この物質の存在はR.W.Duttonら、Transplant.R
ev.2366(1975),A.SchimplとE.Weckerら、Na
ture N.Biol.237,15(1972),により明らか
にされた。彼らはマウスのリンパ球混合物培養後の培養
上清中または抗原やマイトゲンにより刺激を受けたマウ
スのリンパ球触媒上清中に存在する物質が、マウスのT
細胞を除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来
のリンパ球のヒツジ赤血球(SRBC)に対する1次免
疫応答を増幅させることを見出し、そのような作用を有
する活性物質にTリンパ球代替因子、すなわちTRFと
いう称呼を与えた。それ以来TRFは、抗原非特異的に
主要組織適合遺伝子複合体(以下、MHCと略称す
る。)の一致を必要としない様式でB細胞に作用し、B
細胞の分裂増殖を誘導せず、B細胞の抗体産生細胞への
分化を誘導する液性因子であると定義されている。
Antigen-stimulated and activated mature B cells divide and proliferate with the help of T cells, and in order for B cells to finally differentiate into antibody-producing cells, one or more T cells may be generated.
It is known that a cell-derived differentiation-inducing substance is essential. The existence of this substance is RW Dutton et al., Transplant.R.
ev. 23 66 (1975), A.Schimpl and E.Wecker et al, Na
ture N. Biol. 237 , 15 (1972). They found that the substance present in the culture supernatant of a mouse lymphocyte mixture culture or in the lymphocyte catalytic supernatant of a mouse stimulated by an antigen or mitogen
It was found that the primary immune response to sheep red blood cells (SRBC) of lymphocyte cell populations from which cells have been removed or lymphocytes derived from nude mice is amplified, and an active substance having such an action has a T lymphocyte replacement factor, namely, The name TRF was given. Since then, TRF acts on B cells in a non-antigen-specific manner that does not require concordance of major histocompatibility complex (MHC).
It is defined as a humoral factor that does not induce mitotic proliferation of cells but induces differentiation of B cells into antibody-producing cells.

その後、このようなB細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たB細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をBCDFと
総称するようになった。
Thereafter, evidence showing the existence of such a B cell differentiation factor has been accumulated, and the existence of a differentiation factor similar to that of the mouse has been suggested in humans. At present, the factors for differentiating B cells defined as described above into antibody-producing cells have been generically called BCDF.

このようにBCDFは人の体内でB細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。BCDFの臨床への応用は大
別して3つ考えられる。第1はBCDFによりBCDF
抗体を作り、BCDFと抗BCDF抗体によるBCDF
のイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用
いることが出来る。第2の応用は各種疾患の治療への応
用である。例えば、T細胞のヘルパー機能低下にともな
うB細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にBCD
F単独または他のリンホカインと共に投与することによ
り抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。
As described above, BCDF plays an important role in the antibody producing function of B cells in the human body. There are three major clinical applications of BCDF. First is BCDF by BCDF
Make antibody and BCDF by BCDF and anti-BCDF antibody
Can be used for analysis of immunological pathological conditions. The second application is to treat various diseases. For example, in patients with immunodeficiency due to a decrease in B cell antibody production due to a decrease in T cell helper function, BCD
It is considered that administration of F alone or with other lymphokines restores the antibody production function to normal.

さらにBCDFの応用として次のことが考えられる。B
細胞増殖因子(BCGF)(K.Yoshizakiら、J.of Immu
nol.130,1241(1983))、その他のリンホカインを含むT
細胞因子を培地に加えることにより正常B細胞を長期培
養できることが報告されている(B,Sredniら、J.Exp.Me
d.,154,1500(1981)参照)。これらの培
養正常B細胞あるいはEBウイルスで形質転換したB細
胞に対し、適当な時期にBCDFを作用させることによ
り生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗
体、例えば、病原細菌、病原ウイルス、病原原虫、癌細
胞などの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生する
B細胞をモノクローン化し、クローン化正常B細胞また
はEBウイルスで形質転換した細胞をBCDFとその他
のリンホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナ
ル抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症
や眼の治療および診断に利用できる。
Furthermore, the following are possible applications of BCDF. B
Cell growth factor (BCGF) (K. Yoshizaki et al., J. of Immu
nol. 130, 1241 (1983) ), including the other lymphokines T
It has been reported that normal B cells can be cultured for a long period of time by adding a cell factor to the medium (B, Sredni et al., J. Exp. Me.
d., 154 , 1500 (1981)). Antibodies can be produced in vitro by allowing BCDF to act on these cultured normal B cells or B cells transformed with EB virus at an appropriate time. B cells producing specific antibodies, for example, antibodies that recognize specific antigens on the surface of pathogenic bacteria, pathogenic viruses, pathogenic protozoa, cancer cells, etc. are monocloned and transformed with cloned normal B cells or EB virus. Cells can be cultured in combination with BCDF and other lymphokines to produce useful monoclonal antibodies. These antibodies can be used for treatment and diagnosis of infectious diseases and eyes.

従来BCDFを得るには、人末梢血などより分離した正
常人T細胞をマイトゲン刺激することによりBCDFを
産生させる方法が採られてきた。この方法では、T細胞
を十分得ることが困難である点、マイトゲンを用いたた
め、BCDFに有害なマイトゲンが混入し、これを除去
するのが困難である点、またT細胞培養にはウシ胎児血
清など血清成分を培地に添加する必要があり、これら添
加タンパク質とBCDFを十分分離することが出来ず、
BCDFを医療に用いるには、純化BCDFが得られぬ
ことが障害となっている点など問題が多く、工業的にB
CDFを産生することは出来なかった。また人T細胞を
人癌細胞を細胞融合して人T融合細胞を得、これにより
BCDFを産生せしめる方法も報告されている(Okada
ら、J.Exp.Mod.,157,583(1983))。しか
し、人融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低下し
てゆくことが多く、実用的BCDF産生人融合細胞は未
だない。
Conventionally, in order to obtain BCDF, a method of producing BCDF by stimulating normal human T cells separated from human peripheral blood or the like with mitogen has been adopted. In this method, it is difficult to obtain T cells sufficiently, and since mitogen is used, harmful mitogen is mixed into BCDF and it is difficult to remove it, and fetal bovine serum is used for T cell culture. It is necessary to add serum components to the medium, and these added proteins and BCDF cannot be separated sufficiently,
There are many problems in using BCDF for medical treatment, such as the fact that purified BCDF cannot be obtained, and it is industrially
It was not possible to produce CDF. In addition, a method has been reported in which human T cells are fused with human cancer cells to obtain human T fused cells and thereby BCDF is produced (Okada).
Et al., J. Exp. Mod., 157 , 583 (1983)). However, human fused cells often lose their lymphokine-producing ability during passage, and there is no practical BCDF-producing human fused cell yet.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problems to be solved by the invention]

従ってこの発明の目的は、BCDFを含有する蛋白標品
を提供することにある。
Therefore, an object of the present invention is to provide a protein preparation containing BCDF.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

本発明者らは、人T細胞白血病ウイルス(以下「HTL
V」と記す)により形質転換された人T細胞が高い効率
でBCDFを生産することを見い出した。即ち、この発
明は、HTLVにより形質転換された人T細胞より生産
され、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフォーカ
シングおよび逆相クロマトグラフィーで精製して得られ
る下記の性質を有するB細胞分化因子である。
The present inventors have found that human T-cell leukemia virus (hereinafter referred to as “HTL
We have found that human T cells transformed with V.) produce BCDF with high efficiency. That is, the present invention is a B cell differentiation factor having the following properties, which is produced from human T cells transformed with HTLV and obtained by purification by gel filtration chromatography, chromatofocusing and reverse phase chromatography.

(1)分子量 3.5±0.5×10ダルトン(ゲル濾過法) 2.2±0.2×10ダルトン(SDS・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法) (2)N−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala 人BCDF産生人T細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・臍帯血などよりフイ
ルコールパックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ
球を分離し、N.Yamamoto,science217,737(19
82)の方法に準じてHTLVを用いて人T細胞を形質
転換(トランスフォーメーション)する。たとえば下記
の方法を用いることができる。ウイルス産生細胞株MT
−2をX線照射(12000〜14000ラド)で不活
化した細胞1×10/mと、上述のようにして得た
人リンパ球1×10/mを20%FCS、100μ
g/mカナマイシン、2μg/m NaHCO3、25mM
N−2−hydroxyethyl-piperazine−N′−2−ethansu
lfonicacid(HEPES)を含むRPMI1640培地
を入れたプラスチックシャーレ(ファルコン♯300
8)に接触し5% CO 存在下37℃で培養する。
1週間に2回、半分の培地を新鮮な培地と交換しつつ2
〜3カ月培養した後、リミティングダイリューション法
により株化する。株化した細胞の培養上清のBCDF活
性を測定し、BCDF活性を有する株を得る。
(1) Molecular weight 3.5 ± 0.5 × 10 4 Dalton (gel filtration method) 2.2 ± 0.2 × 10 4 Dalton (SDS / polyacrylamide gel electrophoresis method) (2) N-terminal amino acid sequence Pro Val Pro Pro Glu Asp Ser The Lys Asp Val Ala Ala human BCDF producing human T cell line can be prepared as follows. Lymphocytes were isolated from human peripheral blood, tonsils, umbilical cord blood, etc. by density gradient centrifugation using a film call pack, etc., and N. Yamamoto, science 217 , 737 (19).
According to the method of 82), human T cells are transformed (transformed) using HTLV. For example, the following method can be used. Virus-producing cell line MT
-2 and cell 1 × 10 7 / m inactivated by X-ray irradiation (12,000 to 14,000 rads) and human lymphocytes 1 × 10 7 / m with 20% FCS obtained as described above, 100 microns
g / m kanamycin, 2 μg / m NaHCO 3 , 25 mM
N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethansu
Plastic petri dish (Falcon # 300 containing RPMI1640 medium containing lfonic acid (HEPES))
Contact with 8) and culture at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
2 times a week, replacing half of the medium with fresh medium
After culturing for 3 months, the strain is established by the limiting dilution method. The BCDF activity of the culture supernatant of the established cells is measured to obtain a strain having BCDF activity.

この方法により株化した細胞としてたとえばVT−1と
標識された人T細胞株を用いることが出来る。VT−1
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件の適宜採用して行なえばよい。また、B
CDFの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。
As the cells established by this method, for example, a human T cell line labeled with VT-1 can be used. VT-1
There is no special condition for growing the strain, and generally used culture conditions may be appropriately adopted. Also, B
Although CDF may be produced by a general method, it should preferably be performed using a protein-free medium.

以下に、VT−1を用いてBCDFを製造する方法の1
例を示す。
The following is one of the methods for producing BCDF using VT-1.
Here is an example:

VT−1を増殖させるのに好適な条件、たとえばウシ胎
児血清(FCS)を含む培地にてVT−1を培養し、V
T−1の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してBC
DF産生に最適な条件、たとえばFCSなどのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾雑タンパク質の少ないBCDFを得ること
ができる。
VT-1 is cultured in a medium suitable for growing VT-1, for example, a medium containing fetal calf serum (FCS), and V
After increasing the number of T-1 cells, the cells were separated and washed and BC
BCDF containing less contaminating proteins can be obtained by transferring the cells to the optimal conditions for DF production, for example, a completely synthetic medium containing no protein such as FCS and further culturing.

VT−1を培養するのに用いる培地の主成分は市販の培
地でよい。例えばRPMI1640培地、改良イーグル
培地(MEM)、ダルベッコ改良イーグル培地(DME
M)またはクリック培地でよい。これらの培地に対する
添加物としてi)1m当り約20〜250単位、理想
的には1m当り約100単位のペニシリン、ii)1m
当り1μg〜100μg、理想的には1m当り10
μgのゲルタマイシン、iii)1m当り20〜250
μg、理想的には100μgのストレプトマイシン、i
v)1m当り約100〜1000μg、理想的には1
m当り約300μgの新鮮L−グルタミン、v)10
〜60mM、理想的には25mMのヘペス緩衝液、vi)
8〜20mM、理想的には16mMのNaHCO3、vii)5
×10−4〜5×10−6M、理想的には5×10−5
Mの2−メルカプトエタノールなどを必要に応じて用い
ることが出来る。
The main component of the medium used for culturing VT-1 may be a commercially available medium. For example, RPMI1640 medium, modified Eagle medium (MEM), Dulbecco modified eagle medium (DME
M) or click medium. As an additive to these media i) about 20-250 units per m, ideally about 100 units penicillin per m, ii) 1 m
1 μg to 100 μg, ideally 10 per 1 m
μg geltamycin, iii) 20-250 per m
μg, ideally 100 μg streptomycin, i
v) About 100 to 1000 μg per 1m, ideally 1
About 300 μg of fresh L-glutamine per m, v) 10
~ 60 mM, ideally 25 mM Hepes buffer, vi)
8-20 mM, ideally 16 mM NaHCO 3 , vii) 5
× 10 −4 to 5 × 10 −6 M, ideally 5 × 10 −5
M 2-mercaptoethanol or the like can be used as necessary.

VT−1の細胞数を増やすのに最適な培地として、たと
えば上述の培地にさらに1〜30%、好ましくは20%
のFCSを添加した培地を用いる。BCDF産生のため
の最適な培地としては、FCSを添加しない上述の培地
でよい。FCSを添加しない完全合成培地中で48時間
培養後もVT−1の生存率は70%以上が保持されてい
る。
The optimal medium for increasing the number of VT-1 cells is, for example, 1% to 30%, preferably 20% in the above-mentioned medium.
The medium to which FCS is added is used. The optimal medium for BCDF production may be the above-mentioned medium without the addition of FCS. The viability of VT-1 is maintained at 70% or more even after culturing for 48 hours in a completely synthetic medium without the addition of FCS.

T細胞よりBCDFを生産する場合、従来は培地にFC
Sのようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった(T.Teranishiら、J.of
Immunol.128,1903(1982),A.Muraguchi
らJ.of Immunol.127,412(1981)参照)。
これに対してVT−1を使用してBCDFを生産する場
合、培地にFCSのような血清、血液中のタンパク質成
分、その他タンパク質成分を加える必要がなく、また通
常用いられているT細胞またはB細胞に対するマイトゲ
ンも加える必要がないことは特筆に値する。そのため高
価なFCSを用いないで安価にBCDFを生産すること
が出来るばかりでなく、人体に有害な異種タンパク質や
マイトゲンを含まない安全なBCDFを容易に得ること
が出来る。
When producing BCDF from T cells, FC was conventionally used in the medium.
It was essential to add proteins such as S and mitogens (T. Teranishi et al., J. of
Immunol. 128 , 1903 (1982), A. Muraguchi
J. of Immunol. 127 , 412 (1981)).
On the other hand, when VT-1 is used to produce BCDF, it is not necessary to add serum such as FCS, protein components in blood, and other protein components to the medium, and the T cells or B It is worth noting that there is no need to add mitogens to the cells either. Therefore, not only can BCDF be produced inexpensively without using expensive FCS, but also a safe BCDF that does not contain a heterologous protein or mitogen harmful to the human body can be easily obtained.

VT−1を用いてBCDFを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはVT−1
培養物は約35〜38℃の温度範囲において約5〜10
%炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきである。
また、理想的には培地のpHは約7.0〜7.4と僅かにアルカ
リ性の条件下に保持すべきである。VT−1は平底ミク
ロプレートなど種々のタイプの培養器上100μ単位
などの種々の容量で接種される。ファルコン・ラブウェ
ア・ディヴィジョン、ベクトン・ディッキンソン・エン
ド・コーポレーション(Falcon Labware,Div.Becton,Dic
kinson and Co.)から市販されているフラスコNO.301
3または3025のような組織培養フラスコも使用でき
る。別法として上記ファルコン・ラブウェアから市販さ
れているボトルNO.3027のような回転びんも培養容
器として使用できる。
The above method of producing BCDF using VT-1 is performed under various environmental conditions. However, preferably VT-1
The culture is about 5-10 in the temperature range of about 35-38 ° C.
It should be kept in humidity-controlled air containing% carbon dioxide.
Also ideally, the pH of the medium should be maintained under slightly alkaline conditions of about 7.0-7.4. VT-1 is inoculated in various volumes such as 100 μ units on various types of incubators such as flat bottom microplates. Falcon Labware, Div.Becton, Dic, Becton Dickinson End Corporation
Flask No. 301 commercially available from Kinson and Co.)
Tissue culture flasks such as 3 or 3025 can also be used. Alternatively, a rotating bottle such as bottle No. 3027 commercially available from Falcon Labware can also be used as the culture container.

VT−1を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地1mあたり1×10細胞
ないし5×10細胞、好ましくは2×10細胞であ
る。上述の条件でVT−1を培養すると、通常2〜7日
で培地1m当り5×10細胞から2×10細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地1m当り1×10〜5×10細胞にまで細
胞密度を下げ、再び賠償を続ける。このようにして目的
とする細胞数にまるまでVT−1の培養を続けた後、細
胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含まぬ完
全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種す
る。この時の細胞の当初密度は培地1mあたり約1×
10細胞ないし1×10細胞であることが好まし
く、理想的には培地1mあたり1×10細胞であ
る。
As an optimum condition for culturing VT-1 to increase the number of cells, the initial density of cells is 1 × 10 4 to 5 × 10 5 cells, preferably 2 × 10 5 cells, per 1 m of the medium. When VT-1 is cultured under the above-mentioned conditions, the cell density usually increases from 5 × 10 5 cells to 2 × 10 6 cells per 1 m of the medium in 2 to 7 days. The cell density is reduced to × 10 4 to 5 × 10 5 cells, and compensation is continued again. In this way, after culturing VT-1 until the target number of cells is reached, the cells are separated by centrifugation, washed with a protein-free complete synthetic medium, and then inoculated into a new complete synthetic medium. To do. The initial density of cells at this time is about 1 × per 1 m of medium.
It is preferably 10 4 to 1 × 10 7 cells, and ideally 1 × 10 6 cells per 1 m of the medium.

VT−1を培養することによって生産されるBCDF量
は経時的に変化する。例えば1m当り1×10初発
細胞密度でVT−1をRPMI1640培地(1m当
りペニシリン100単位、マトレプトマイシン100μ
g、ゲンタマイシン10μgおよびNaHCO316μMを含
む)で培養すると、BCDF活性は48時間後にピーク
レベルに達する。さらに、次の24時間に存在するBC
DF活性は僅かに減少する。このようにRPMI164
0培地中のVT−1でBCDFを生産する至適培養時間
は約24〜78時間である。
The amount of BCDF produced by culturing VT-1 changes with time. For example, VT-1 at an initial cell density of 1 × 10 6 cells per 1 m was added to RPMI1640 medium (100 units of penicillin, 100 μm of matretomycin per 1 m).
g, containing 10 μg of gentamicin and 16 μM of NaHCO 3 ), BCDF activity reaches a peak level after 48 hours. Furthermore, BC existing in the next 24 hours
DF activity is slightly reduced. In this way RPMI164
The optimal culture time for producing BCDF with VT-1 in 0 medium is about 24-78 hours.

BCDFの精製 BCDFは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル
電気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から
濃縮して精製できる(実施例1参照)。
Purification of BCDF BCDF can be purified by various methods such as salting out, vacuum dialysis, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, reverse phase chromatography, focus electrophoresis and gel electrophoresis. It can be concentrated and purified from the above-mentioned culture supernatant (see Example 1).

BCDFの物理化学的性質 上述の方法でVT−1より生産されるBCDFは以下の
性質を有する。
Physicochemical Properties of BCDF BCDF produced from VT-1 by the above method has the following properties.

(1)分子量 前もってPBCで平衡化したAcA 34からム(LKB,B
romma,Swed.)にBCDFを含む、濃縮されたVT−1培
養上清を流し、PBSで溶出すると、分子量3.5±0.5×
10ダルトンに対応する位置にBCDFが溶出する。
上述の方法で精製したBCDFを上述の方法でHPLC
用TSK−2000SEG(東洋ソーダー)を用いてゲ
ル濾過すると、分子量3.5±0.5×10ダルトンに対応
する位置にBCDFが溶出する。又SDS−PAGE
(SDS・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)にて泳動
すると2.2±0.2×10ダルトンに対応する位置にBC
DFが溶出される。
(1) Molecular weight From AcA 34 equilibrated with PBC in advance (LKB, B
(Romma, Swed.), the concentrated VT-1 culture supernatant containing BCDF was run and eluted with PBS to obtain a molecular weight of 3.5 ± 0.5 ×
BCDF is eluted at a position corresponding to 10 4 daltons.
The BCDF purified by the above method was subjected to HPLC by the above method.
When gel filtration is performed using a TSK-2000SEG (Toyo Soda), BCDF is eluted at a position corresponding to a molecular weight of 3.5 ± 0.5 × 10 4 daltons. Also SDS-PAGE
When electrophoresed by (SDS / polyacrylamide gel electrophoresis), BC is located at a position corresponding to 2.2 ± 0.2 × 10 4 daltons.
DF is eluted.

(2)等電点 前述の方法でVT−1より得たBCDFを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、AcA 34カラムにより分離
精製したBCDFをpH7〜4の範囲でファルマシマMo
no Pカラムを用いてクロマトフォーカシングを行な
うと、pH4.9〜5.1の位置にBCDFが溶出する。これよ
りBCDFの等電点はpH4.9〜5.1と推定される。
(2) Isoelectric point The culture medium containing BCDF obtained from VT-1 by the above-mentioned method was concentrated by ultrafiltration, and BCDF separated and purified by an AcA 34 column was added to Pharmashima Mo in the range of pH 7 to 4.
When chromatofocusing is performed using a no P column, BCDF is eluted at the position of pH 4.9 to 5.1. From this, the isoelectric point of BCDF is estimated to be pH 4.9-5.1.

(3)N−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala BCDF活性測定法 人BCDFに反応してIgGを産生する人B細胞株CES
S(K.Yoshizakiら、J.of Immunology,132,294
8(1984))を用いてBCDF活性を測定したBC
DF活性を測定する検液と6×10個のCESSを2
00μの10%FCSを含むRPMI1640培地
(1m当りプニシリン100単位、ストレプトマイシ
ン100μg、ゲンタマイシン10μgおよびNaHCO3
6mMを含む)に入れる。この混合物を96穴マイクロ
プレート中で3日間、5% CO存在下、37℃で培
養し、培養上清の1gG量を酵素免疫測定法により、測
定する。この条件において最大の1gG生産量(最高の
CESSの反応)の50%を示すBCDFの活性を1U
/mとした。
(3) N-terminal amino acid sequence Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala BCDF activity assay method Human B cell line CES that produces IgG in response to human BCDF
S (K. Yoshizaki et al., J. of Immunology, 132 , 294).
BC (8 (1984)) for measuring BCDF activity
Test solution for measuring DF activity and 6 × 10 3 CESS
RPMI 1640 medium containing 00 μ of 10% FCS (100 units of punicillin per 1 m, streptomycin 100 μg, gentamicin 10 μg and NaHCO 3 1).
6 mM). This mixture is cultured in a 96-well microplate for 3 days in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C., and the amount of 1 gG of the culture supernatant is measured by enzyme immunoassay. Under this condition, the activity of BCDF showing 50% of the maximum 1 gG production (the highest CESS reaction) was 1 U.
/ M.

〔作用〕[Action]

一方、本発明におけるHTLVをT細胞に感染させるこ
とにより得た形質転換された人T細胞株は、前述のBC
DF産生方法に比べ、大量のBCDFを培地中に産生す
る点、この細胞株は継代培養が出来、継代中にBCDF
産生能力が低下することがない点、又、この細胞株は、
蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、マイトー
ゲンのような刺激剤をまったく加えることなくBCDF
を産生し、混入蛋白質の少ないBCDFを得、比較的容
易な精製方法で、純化したBCDFを得られる点などの
特徴をもち、本発明によりはじめて人BCDFの工業的
生産が可能となった。
On the other hand, the transformed human T cell line obtained by infecting T cells with HTLV according to the present invention is the above-mentioned BC.
Compared to the DF production method, a large amount of BCDF is produced in the medium, and this cell line can be subcultured and BCDF can be subcultured during passage.
In that the production capacity does not decrease, and this cell line
BCDF in protein-free synthetic medium without any stimulant such as mitogen
The present invention enables the industrial production of human BCDF for the first time by the present invention. It is characterized in that it can obtain BCDF containing a small amount of contaminating proteins and can obtain purified BCDF with a relatively easy purification method.

実施例1 (1)VT−1によるBCDFの製造 2容プラスチックローラー培養器(ファルコン#30
27)(以下ローラーと称する)中の1の20%FC
S含有RPMI1640培地(2mMグルタミン、5×
10−5M 2ME、100単位/mペニシリン、1
00μg/mストレプトマイシン、20μg/mゲ
ンタマイシン、16mM NaHCO2を含有)に2×10
/m細胞数にVT−1を接種し、8rpmで回転させつ
つ3日間、37℃で培養した。培養後、培養物を遠心分
離して細胞を集めRPMI1640培地で2回細胞を洗
った後、細胞を2容ローラー中1のRPMI164
0培地に1×10/m細胞濃度に懸濁した。ローラ
ーを8rpmで回転させつつ2日間、37℃で培養する。
培養後培養物を遠心分離して、培養上清を得た。
Example 1 (1) Production of BCDF by VT-1 2 volume plastic roller incubator (Falcon # 30
27) 1 20% FC in (hereinafter referred to as roller)
RPMI 1640 medium containing S (2 mM glutamine, 5 ×
10 −5 M 2ME, 100 units / m penicillin, 1
2 × 10 5 in 00 μg / m streptomycin, 20 μg / m gentamicin, 16 mM NaHCO 2 )
/ M cells were inoculated with VT-1 and cultured at 37 ° C. for 3 days while rotating at 8 rpm. After culturing, the culture was centrifuged to collect the cells, and the cells were washed twice with RPMI1640 medium, and then the cells were mixed with 1 RPMI164 in a 2-volume roller.
The cells were suspended in 0 medium at a cell concentration of 1 × 10 6 / m. Incubate at 37 ° C. for 2 days with the roller rotating at 8 rpm.
After the culture, the culture was centrifuged to obtain a culture supernatant.

上述のように、VT−1を培養して得たBCDFを含む
培養上清よりBCDFを以下の方法で精製した。無細胞
上清10を限外濾過膜(アミコンYM−10、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、USA)を
装着した限外濾過装置(アミコン大量処理用セル200
0型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッ
ツ、USA)を用いて窒素ガスにより4kg/cm2の圧力を
かけ濾過した。濾過膜上部に残った100mの濃縮液
をさら限外濾過膜(アミコンYM−10)を装着した限
外濾過装置(アミコン、スタンダードセル52型)を用
い窒素ガスにより4kg/cm2の圧力をかけて濾過した。濾
過膜上部に残った5mの濃縮液を採取した。
As described above, BCDF was purified from the culture supernatant containing BCDF obtained by culturing VT-1 by the following method. The cell-free supernatant 10 is equipped with an ultrafiltration membrane (Amicon YM-10, Amicon Corporation, Massachusetts, USA) and equipped with an ultrafiltration device (Amicon mass treatment cell 200).
Type 0, Amicon Corporation, Massachusetts, USA) and filtration with nitrogen gas at a pressure of 4 kg / cm 2 . The concentration of 100 m remaining on the upper part of the filtration membrane was further applied with an ultrafiltration device (Amicon, Standard Cell 52 type) equipped with an ultrafiltration membrane (Amicon, Standard Cell 52 type) to apply a pressure of 4 kg / cm 2 with nitrogen gas. Filtered. The 5 m concentrated liquid remaining on the upper part of the filtration membrane was collected.

上述の濃縮した上清をAcA−34ゲル濾過カラム(LK
B Produker.Sweden、2.6×90cm)で処理した。なお、
ゲル濾過カラムはあらかじめPBC(ホスフェート・バ
ッファーセイライン、0.15M食塩を含む0.01Mホスフェ
ート・バッファー、pH7.0)で平衡化した。濃縮上清を
PBCで溶出し、溶出液を5mずつ分取し、分取液の
BCDF活性を測定した。BCDF活性を有する分画は
分子量(3.5±0.5×10ダルトンに相当するフラクシ
ョンにBCDFが含まれていることがわかった。ゲル濾
過カラムは次の分子量マーカーで検定した。ブルーデキ
ストラン2000(ファルマシア・ファインケミカル
ス、スウェーデン)2×10、フェリチン4.5×10
、アルドラーゼ1.58×10、オブアルブミン4.5×
10、キモトリプシノーゲン2.5×10、チトクロ
ームC1.17×10また、BCDFを含むフラクション
を集め、限外濾過膜(アミコンYM−10)を装置した
限外濾過装置を用いて25mMピペラジン−塩酸緩衝液
(pH6.3)に置換した。
The concentrated supernatant described above was transferred to an AcA-34 gel filtration column (LK
B Produker.Sweden, 2.6 × 90 cm). In addition,
The gel filtration column was previously equilibrated with PBC (phosphate buffer saline, 0.01 M phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 7.0). The concentrated supernatant was eluted with PBC, the eluate was fractionated in 5 m increments, and the BCDF activity of the fractionated fraction was measured. The fraction having BCDF activity was found to contain BCDF in the fraction corresponding to the molecular weight (3.5 ± 0.5 × 10 4 Daltons. The gel filtration column was assayed with the following molecular weight markers: Blue Dextran 2000 (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) 2 × 10 6 , ferritin 4.5 × 10
5 , aldolase 1.58 × 10 5 , ovalbumin 4.5 ×
10 4 , chymotrypsinogen 2.5 × 10 4 , cytochrome C1.17 × 10 4 Fractions containing BCDF were collected, and 25 mM piperazine-hydrochloric acid was prepared using an ultrafiltration device equipped with an ultrafiltration membrane (Amicon YM-10). It was replaced with a buffer solution (pH 6.3).

クロマトフォーカシング AcA−34カラムクロマトグラフィーで分画されたB
CDF画分をあらかじめ25mMピペラジン−塩酸緩衝
液(pH6.3)で平衡化したMonoPカラム(ファルマシア
・ファインケミカルス、スエェーデン)に通した。この
カラムを25mMピペラジン−塩酸緩液で洗った後、塩
酸でpH4.5に調整した40mの1/10希釈ポリバッ
ファ−74(ファルマシア・ファインケミカルス、スウ
ェーデン)で溶出した。カラム操作はファースト・プロ
テイン・リキッド・クロマトグラフィー、FPLC(フ
ァルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン)を用
い、流速は毎分0.5mで行なった。溶出液を1mず
つ分取し、BCDF活性とpHを測定した。BCDF活性
はpH4.9〜5.1の位置に溶出された。
Chromatofocusing B fractionated by AcA-34 column chromatography
The CDF fraction was passed through a MonoP column (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) which had been equilibrated with 25 mM piperazine-hydrochloric acid buffer (pH 6.3) in advance. The column was washed with 25 mM piperazine-hydrochloric acid buffer solution and then eluted with 40 m of 1/10 diluted polybuffer-74 (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) adjusted to pH 4.5 with hydrochloric acid. The column operation was performed using Fast Protein Liquid Chromatography and FPLC (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) at a flow rate of 0.5 m / min. The eluate was collected by 1 m and the BCDF activity and pH were measured. BCDF activity was eluted at pH 4.9-5.1.

Mono Pカラムより得たBCDF活性画分を0.1% T
FA(トリフルオロ酢酸水溶液)で緩衝化した逆相クロ
マトグラフィー用カラムP ro RPCHR 5/10
(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ)にかけ、溶出
液、0.1% TFA中のアセトニトリル濃度を0から6
0%まで直線的に増加させBCDFを溶出した。アセト
ニトリル50〜55%で溶出される。O.D.280
ピークは他のO.D.280のピークとは完全に分離し
ており、このピークに対応してBCDF活性が検出され
た。このピークを凍結乾燥して精製BCDFを得た。
The BCDF active fraction obtained from the Mono P column was added to 0.1% T
Reversed-phase chromatography column P ro RPCHR 5/10 buffered with FA (trifluoroacetic acid aqueous solution)
(Pharmacia Fine Chemicals), eluate, 0.1% TFA in acetonitrile concentration 0 to 6
The BCDF was eluted with a linear increase to 0%. Elute with 50-55% acetonitrile. O. D. The peak at 280 is different from that of other O.I. D. It was completely separated from the 280 peak, and BCDF activity was detected corresponding to this peak. This peak was freeze-dried to obtain purified BCDF.

VT−1のFCS無添加培養上清1.8から精製したB
CFは、表1に示すごとく活性の回収率18%で蛋白量
当りの活性は約1,000倍に上がった。
B purified from culture supernatant 1.8 of FCS-free VT-1
As shown in Table 1, the recovery rate of activity of CF was 18%, and the activity per protein amount increased about 1,000 times.

(2)BCDF精製蛋白の性質 (i)分子量 前もってPBCで平衡化したAcA 34カラム(LKB
Bromma,Swed.)にBCDFを含む、濃縮されたVT−1
培養上清を流し、PBCで溶出したところ、分子量3.5
±0.5×10ダルトンに対応する位置にBCDFが溶
出した。上述の方法で精製したBCDFを上述の方法で
HPLC用TSK−2000SWG(東洋ソーダー)を
用いてゲル濾過したところ、分子量3.5±0.5×10
ルトンに対応する位置にBCDFが溶出した。又SDS
−PAGE(SDS・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法)にて泳動したところ、分子量2.2±0.2×10ダル
トンに対応する位置にBCDFが溶出された。
(2) Properties of BCDF purified protein (i) Molecular weight AcA 34 column (LKB previously equilibrated with PBC)
Concentrated VT-1 containing BCDF in Bromma, Swed.)
When the culture supernatant was poured and eluted with PBC, the molecular weight was 3.5
BCDF was eluted at a position corresponding to ± 0.5 × 10 4 daltons. When the BCDF purified by the above method was subjected to gel filtration using the TSK-2000SWG for HPLC (Toyo Soda) by the above method, BCDF was eluted at a position corresponding to a molecular weight of 3.5 ± 0.5 × 10 4 daltons. Also SDS
When it was electrophoresed by PAGE (SDS / polyacrylamide gel electrophoresis), BCDF was eluted at the position corresponding to a molecular weight of 2.2 ± 0.2 × 10 4 daltons.

(ii)等電点 前述の方法でVT−1より得たBCDFを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、AcA34カラムにより分離精
製したBCDFをpH7〜4の範囲でファルマシアMono
Pカラムを用いてクロマトフォーカシングを行なったと
ころ、pH4.9〜5.1の位置にBCDFが溶出した。これよ
りBCDFの等電点はpH4.9〜5.1と推定される。
(Ii) Isoelectric point The culture medium containing BCDF obtained from VT-1 by the method described above was concentrated by ultrafiltration, and BCDF separated and purified by an AcA34 column was used to obtain Pharmacia Mono in a pH range of 7 to 4.
When chromatofocusing was performed using the P column, BCDF was eluted at the position of pH 4.9 to 5.1. From this, the isoelectric point of BCDF is estimated to be pH 4.9-5.1.

(iii)アミノ酸配列 BCDF蛋白のアミノ酸配列を決定するために6μgの
精製BCDFをプロテイン・セクエンサー(Applied Bio
system Co.,Calf,Model 470A)に導入した。アミノ酸配
列の決定方法はJ.Biol.Chem.,193,265〜275(1951)に記
載されている方法により行なった。
(Iii) Amino acid sequence To determine the amino acid sequence of the BCDF protein, 6 μg of purified BCDF was added to a protein sequencer (Applied Bio
system Co., Calf, Model 470A). The amino acid sequence was determined by the method described in J. Biol. Chem., 193 , 265-275 (1951).

N−末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。The amino acid sequence from the N-terminus was as follows.

Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala (3)BCDFの免疫学的性質 (i)人末梢血よりB細胞を調製し、これによりブラス
ト化B細胞を分離した(K.Yoshizakiら、J.of Immunolo
gy 132,2948(1984)参照)。すなわち、人B細胞をパー
コールのグラージェント(50%〜70%)中で遠心分
離(4℃、400G、15分)し、パーコールPBS溶
液50%〜55%に存在する細胞層を分取し、プラスト
化した低比重B細胞を集めた。
(3) Immunological properties of BCDF (i) B cells were prepared from human peripheral blood, and blasted B cells were isolated by this (K. Yoshizaki et al., J. of Immunolo
gy 132 , 2948 (1984)). That is, human B cells were centrifuged (4 ° C, 400G, 15 minutes) in a Percoll gradient (50% to 70%) to separate the cell layer existing in Percoll PBS solution 50% to 55%, Plastified low density B cells were collected.

低比重B細胞を1mあたり2×10細胞に96穴プ
ラスチックマイクロプレート中の200μのRPMI
1640培地に懸濁した。培地には1単位/mのBC
DFを含むVT−1培養上清、10%FCS、0.0025%
SAC、1mあたり100単位のペニシリン、1m
あたり100μgのストレプトマイシン、1mあたり10
μgのゲンタイマシン、16mMのNaHCOを含有
させた。
Low specific gravity B cells were added to 2 × 10 5 cells / m in 200 μ RPMI in a 96-well plastic microplate.
Suspended in 1640 medium. 1 unit / m BC of medium
VT-1 culture supernatant containing DF, 10% FCS, 0.0025%
SAC, 100 units of penicillin per 1m, 1m
100 μg / streptomycin, 10 / m
μg Gentai Machine, 16 mM NaHCO 3 was included.

培養物を空気中5%炭酸ガス含有の湿度調節環境下37
℃に保ち、5日後B細胞を集めた。この細胞の抗体産生
能力をBCDF活性検定の項に記述した通り検定した。
表2に示すように、BCDFの添加量に対応した抗体産
生B細胞によるプラークを検出した。
Culture in a humidity controlled environment containing 5% carbon dioxide in the air 37
The temperature was kept at 0 ° C, and after 5 days, B cells were collected. The antibody-producing ability of the cells was assayed as described in the BCDF activity assay section.
As shown in Table 2, plaques due to antibody-producing B cells corresponding to the added amount of BCDF were detected.

(ii)人末梢血よりB細胞を調製し、SAC0.0025%を
含む培地(10%FCS,0.0025%SAC,1mあた
り100単位のペニシリン,1mあたり100μgの
ストレプトマイシン,1mあたり10μgのゲンタマ
イシン,16mMのNaHCOを含有するRPMI1
640培地)にて3日間培養後、(1)と同様のパーコー
ルグラージェント処理をしてブラスト化B細胞を分離し
た。
(Ii) B cells were prepared from human peripheral blood, and a medium containing SAC 0.0025% (10% FCS, 0.0025% SAC, 100 units penicillin per m, 100 μg streptomycin per m, 10 μg gentamicin per m, 16 mM) RPMI 1 containing NaHCO 3
After culturing in 640 medium) for 3 days, blasted B cells were separated by the same Percoll gradient treatment as in (1).

以下(i)と同じ方法により、B細胞の抗体産生能力を
検定した。結果を表3に示す。
The antibody production ability of B cells was assayed by the same method as in (i) below. The results are shown in Table 3.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/08 8214−4B (C12P 21/02 C12R 1:91) 特許法第30条第1項適用申請有り 日本癌学会第43回総 合記事(昭和59年8月25日)日本癌学会発行第24,104 ページに発表 特許法第30条第1項適用申請有り 昭和59年10月4,5 日福岡市において開催された第43回日本癌学会総会にお いて発表─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12P 21/08 8214-4B (C12P 21/02 C12R 1:91) Patent Act Article 30 Paragraph 1 Application for application 43rd General Report of the Japanese Cancer Society (August 25, 1984) Published on pages 24 and 104 of the Japanese Cancer Society Application for application of Article 30, Paragraph 1 of the Patent Act October 4, 1984 Presentation at the 43rd Annual Meeting of the Japanese Cancer Society held in Fukuoka City on the 5th

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】人T細胞白血病ウイルスにより形質転換さ
れた人T細胞により生産され、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、クロマトフォーカシングおよび逆相クロマトグラ
フィーで精製して得られる下記の性質を有するB細胞分
化因子。 (1)分子量 3.5±0.5×10ダルトン(ゲル濾過法) 2.2±0.2×10ダルトン(SDS・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法) (2)N−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a
1. A B cell differentiation factor having the following properties, which is produced by human T cells transformed with human T cell leukemia virus and obtained by purification by gel filtration chromatography, chromatofocusing and reverse phase chromatography. (1) Molecular weight 3.5 ± 0.5 × 10 4 Dalton (gel filtration method) 2.2 ± 0.2 × 10 4 Dalton (SDS / polyacrylamide gel electrophoresis method) (2) N-terminal amino acid sequence Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a
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