【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、インターロイキン２（以下「IL2」
と記す）レセプター（interleukin2recep−tor，
以下「IL2R」と記す）の発明を誘導する物質
（以下「ADF」と記す）に関する。
〔従来の技術〕
ADFは、IL2RであるとされているTac抗原
（Nature，300，267−269（1982），Pro，N.A.S.
80，6957−6951（1983），Nature，311，635−638
（1984））を誘導する物質としてヒト成人型Ｔ白血
病患者より樹立したＴ白血病細胞株（以下
「ATL細胞」と記す）の培養液上清中に存在する
ことが見い出された（J.Immunol.134，1623−
1630.（1985），J.Mol.Cell.Immunol.２，17−26.
（1985））。従つてADFは、IL2Rの発現を誘導す
ることにより、生体内においてはIL2のＴ細胞分
化増殖作用等の活性を発現せしめ又は生体内IL2
を有効に機能せしめるものであり、このような特
異な生物活性から免疫不全、腫瘍等の治療として
広く応用され得ることが期待できる。
tac抗原を誘導する可溶性物質としては、本発
明者らの研究によればインターロイキン１（inter
−leukin1）があるが、インターロイキン１のア
ミノ酸配列等の化学的性質（Pro.N.A.S.81，
7907−7911，（1984））と本発明のADFのそれと
は全く相違するものである。
また、本発明者らは先に、ATL細胞の培養上
清をゲル濾過クロマトグラフイーに付し、分子量
40から35kdと20から15kdのADF活性を有する画
分を得たが（J.Mol.Cell.Immunol.２，17−26.
（1985））、その後の研究によれば、ここにおいて
得られたADF画分は純粋なものでなく、いくつ
かの蛋白の混合物であることが明らかになつた。
従つて、このADF蛋白画分と精製された本発明
のADF蛋白標品とは別異のものであり、このよ
うに精製されて初めて単一物質がIL2Rの発現誘
導に関与していることが明らかにされたのであ
る。いいかえれば、従来のADF画分は、いくつ
かの蛋白性物質の混合物としてIL2R発現誘導活
性を有していたものである。加えてこのような混
合物を医薬として使用するには、種々の問題があ
ることは充分予想できる。
〔発明が解決しようとする問題点〕
従つて本発明の目的は、活性を有するために必
要な蛋白のみに精製されたADFを得ることにあ
る。
〔問題点を解決するための手段］
叙上の問題点を解決するため、本発明者らは種
種研究の結果、ついに以下の性質を有するADF
を単一物質として単離することに成功した。即ち
(1) 分子量：20から10kd（セフアクリルＳ−200
ゲル濾過法）
(2) 等電点：pI5.5から4.5
(3) アミノ酸配列（Ｎ−末端より）：Val−Lys−
Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−Ala−Phe−
Gln−Glu−Ala−Leu−Asp−Ala−Ala
ATL細胞を得るには、例えば以下の二つの方
法がある。
第１の方法は、ATL患者末梢血より樹立する
ものである。即ち、ATLと診断された患者より
末梢血を採取し、フイコール法を用いて白血球を
得、ヒト末梢血、あるいはヒト脾細胞より調製し
た粗IL−２を添加した10％ウシ胎児血清（FCS）
を含むRPMI−1640培地で培養を開始する。安定
な増殖を示す様になつた後、徐々に粗IL2を培地
から抜き培養開始数ケ月後、10％FCSを含有した
RPMI−1640培地のみ増殖、継代可能な細胞株を
得る。得られた細胞株がATL細胞であることを
確認するため、ＥロゼツトOKTシリーズ，ｓ−
lg，ATLA，Tacなど表面形質を検索する。尚こ
れらの抗原マーカーを説明すれば、いずれも良く
しられたものであり、臨床面で広く用いられてい
る。
Ｅロゼツトはヒツジ赤血球に対するレセプター
の検索であり、主にＴリンパ球に発現されてい
る。OKTシリーズにはOKT−３，４，６，８，
などがあるが、Ｔ−３はＴ細胞抗原リセプター関
連抗原であり、ヒト末梢血Ｔリンパ球の同定に、
又Ｔ−４はヘルパーＴリンパ球サブセツトの同定
に、Ｔ−６はβ−２ミクログロブリン関連抗原
で、コモン胸腺由来Ｔリンパ球の同定に、Ｔ−８
はサプレツサー／キラーＴリンパ球サブセツトの
同定にそれぞれ用いられている。ｓ−Igは細胞表
層免疫グロブリンであり、Ｂリンパ球に特異的に
発現されている。ATLAはヒト成人白血病抗原
であり、ウイルス由来の蛋白質が抗原となつてい
る。又TacはIL2Rであるとされている。これら
の抗原に対するモノクローナル抗体はいずれ市販
されているか、もしくは容易に入手可能であるこ
とからそれぞれのモノクローナル抗体にFITCを
結合させ、検体の細胞と反応させれば容易に細胞
表面抗原の同定ができる。
第２の方法は、ヒト成人Ｔ白血病ウイルス
（ATLV）を用いた末梢血トランスフオーメーシ
ヨン（in vitro）である。（Science，217，737
（1982））。即ちγ線（12000ラド）照射により、増
殖能を完全に停止させたATLV産生ATL細胞例
えばMT−２細胞と健常人由来末梢血をフイコー
ル処理して得られた白血球細胞をともにRPMI−
1640培地（10％FCS含有）中にて培養開始し、３
〜５日毎に1/2培地交換を行う。培養開始２週間
から一ケ月後、継代可能な細胞株が得られるよう
になるが、増殖が不安定な場合は、ヒト末梢血由
来などのIL2を添加する。得られた細胞株がATL
細胞であることを確認するためＥロゼツト，
OKTシリーズ，Ｓ−Ig，ATLA，Tacなどの表
面形質の検索を第一の方法と同様に行なう。
次にATL細胞を用いてADFを産生する方法の
一例を示す。ATL細胞を増殖させるのに好適な
条件例えば、ウイ胎児血清（FCS）を含む培地に
て、ATL細胞を培養し、ATLの細胞数を増やし
た後、細胞を分離洗浄して、ADF産生に最適な
条件例えば、FCSなどの蛋白質を含まぬ完全合成
培地に細胞を移し、さらに培養することにより爽
雑蛋白質の少ないADFを得ることができる。
ATL細胞を培養するのに用いる培地の主成分
は市販の培地でよい。例えばRPMI−1640培地，
改良イーグル培地（MEM），ダルベツコ改良イ
ーグル培地（DMEM），又はクリツク培地でよ
い。これらの培地に対する添加物として）１ml
当たり20〜250単位、理想的には１ml当り約100単
位のペニシリン、）１ml当り1μｇ〜100μｇ，
理想的には１ml当り10μｇのゲンタマイシン、
）１ml当り、20〜250μｇ、理想的には100μｇ
のストレプトマイシン、）１ml当り約100〜
1000μｇ、理想的には１ml当り約300μｇの新鮮Ｌ
−グルタミン、）１〜３ｇ／理想的には２
ｇ／のNaHCO3、）５×10-4〜５×10-6M、
理想的には５×10-5Mの２−メルカプトエタノー
ルなど必要に応じて用いることが出来る。ATL
細胞の細胞数を増やすのに最適な培地として、例
えば上述の培地にさらに１〜30％、好ましくは10
％FCSを添加した培地を用いる。
Ｔ細胞よりリンホカインを生産する場合は、通
常は培地にFCSのような蛋白質を添加したり、マ
イトゲンを添加したりすることが必須であつた
が、これに対して、ATL細胞を使用して、ADF
を生産する場合には、培地にFCSのような血清成
分、あるいは、その他の血清成分を加える必要が
なく、又通常用いられているＴ細胞またはＢ細胞
に対するマイトゲンも加える必要がない。
ATL細胞を用いてADFを生産する上記方法は
種々の環境的条件で行なわれる。即ち、好ましく
はATL細胞培養物は約35゜〜37℃の温度の範囲に
おいて約５％〜10％の炭酸ガスを含む湿度調節空
気中に保持すべきである。培養器としてはフアル
コン・ラブウエア・デイヴイジヨン，ベクトン・
デイツキンソン・エンド・コーポレーシヨン
（Falcon Labware，Div.Becton，Dickinson
and CO.）から市販されているフアルコンNo.3013
又3025のような組織培養フラスコを使用すること
ができる。又、上記フアルコン・ラブウエアから
市販されているボトルNo.3027のようなローラーボ
トル、あるいは、スピンナージヤーフラスコも使
用することが可能である。ATL細胞を培養して
細胞数を増やすための培養開始時の細胞密度は１
×105／mlであることが好ましい。上述の条件で
ATL細胞を培養すると通常４〜５日で４〜６×
105／mlに細胞密度が増加するので再び新しい培
地を加えて、１×105／mlまで細胞密度を下げ、
再び培養を続ける。この様にして目的とする細胞
数になるまでATL細胞の培養を続けた後、細胞
を遠心分離し、細胞を蛋白質を含まぬ完全合成培
地で洗つてから、新しい完全合成培地に接種す
る。この時の細胞の当初密度は、１×10-4〜１×
107であることが好ましく、理想的には５×105／
mlである。ATL細胞を培養することによつて生
産されるADF量は経時的に変化する。例えば、
５×105／mlの初発細胞密度でATL細胞をRPMI
−1640培地（ペニシリン100単位／ml，ストレプ
トマイシン100μｇ／ml及びNaHCO32ｇ／を含
む）で培養すると、ADF活性は３日〜５日後に
最高に達する。この様にRPMI−1640培地中で
ATL細胞よりADFを生産する至適培養時間は約
３日〜５日間である。
このようにして得られたATL細胞の培養液上
清より、ADFは、塩析、真空透析、限外濾過、
ゲル濾過クロマトグラフイー、イオン交換クロマ
トグラフイー、アフイニイテイークロマトグラフ
イー、クロマトフオーカシング、逆相クロマトグ
ラフイー、ゲル電泳動等の種々の方法によつて上
述の培養上清から濃縮して精製できる。例えばセ
フアクリルＳ−200（Pharmacia Fine Chemi−
cals、スウエーデン）カラムクロマトグラフイ
ー、スペローズHR／12カラムクロマトグラフイ
ー（Superose HR／12、Pharmacia Fine
Chemicals）、ハイドロオキシアパタイトクロマ
トグラフイー，オクタドデシルシラン（Octa
Dodesyle Silane（ODS C18）カラムを用いた逆
相高速液体クロマトグラフイー（HPLC）等の組
み合わせによりADFを純化することが可能であ
る。尚、ATL細胞の濃縮液をセフアクリルＳ−
200カラムを用いて分画すると分子量40〜30kd及
び、20−10kdに相当する２つのADF活性のピー
クが認められるが、本発明のADFは低分子，即
ち分子量20−10kdの位置に認められる物質に相
当する。
得られたADFの物理化学的性質は、以下のと
おりである。
(1) 分子量
上述の方法でATL−２より生産されるADFは
以下の性質を有する。
前もつてPBSで平衡化セフアクリルＳ−200カ
ラムに濃縮されたATL−２培養上清を添加し、
PBSで溶出すると、分子量40−30，20−10kdに
対応する位置にADFが溶出する。又、FPLCシス
テム（Pharmacia Fine Chemicals、スウエーデ
ン）を用いたスペローズHR／12カラムクロマト
グラフイーにおいては分子量30−25kdと15−
13kdに対応する位置にADFが溶出された。
(2) 等電点
前述の方法でATL−２より得たADFを含む培
養液を限外濾過により濃縮しセフアクリルＳ−
200ゲル濾過クロマトグラフイーを行ない分画し
た粗ADF、即ち、高分子および低分子ADFを含
んだサンプルをPH６〜４の範囲でフアルマシアモ
ノｐカラムを用いてクロマトフオーカシングを行
なうと、ADFはPH5.5〜4.5の間に溶出されpIが5.5
から4.5の酸性蛋白質であることが明らかとなつ
た。さらにセフアクリルＳ−200ゲルクロマトグ
ラフイー以後数段階の精製工程を終了した低分子
性ADFを含んだ試料を用いて、前述の如く同様
にクロマトフオーカシングを行なうとADFはPH
5.2，4.7，4.4の位置に溶出され低分子性ADFはpI
が5.2，4.7，4.4のミクロヘテロジヤナイテイーを
示す酸性蛋白であることが示された。これは糖鎖
構造の違いを反映しているものと考えられる。
(3) Ｎ末端部分のアミノ酸配列
最終精製工程であるODSカラムを用いた逆相
高速液体クロマトグラフイーで、単一ピークとな
つた低分子性ADFのＮ末端部分のアミノ酸一次
構造をアミノ酸シークエンサーで決定すると以下
のＮ末端構造からなる分子であることが明らかと
なつた。
Val−Lys−Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−
Ala−Phe−Gln−Glu−Ala−Leu−Asp−Ala
−Ala
こうして得られたADFは、免疫不全、癌、自
己免疫感染症などの治療薬として有用であり、
ADF単独もしくはIL2や他のリンホカイン、免疫
活性物質との併用で、治療薬としての広範囲の適
用が可能である。と同時に、本蛋白やそれを構成
するペプチドはそれ自体もしくはそれに対する抗
体と組み合わせて、各種疾病の診断にも用いう
る。又ADFとIL2を併用させることにより、IL2
の作用の増強も可能である。尚本ADFは単に
IL2R発現を増強するのみならず、他にも多くの
免疫活性を示し免疫活性物質として当該分野で良
く知られる有用性も併せもつ。
ADFの活性は以下の方法で測定する。
IL2R（Tac抗原）の発現が調節的であるNK様
腫瘍株であるYT細胞（J.Immunol.134，1623−
1630.（1985））の、Tac抗原発現誘導を指標とし
てADFの活性測定を行なつた。即ち３×105コの
YT細胞をサンプル存在下、24時間５％CO2通気
中培養する。１％FCS及び0.1％NaN3を含むハン
クスバランスド溶液で２回洗浄し螢光物質である
FITC（fluorecein isothiocyanate）を結合した抗
Tac抗体で30分間40℃で反応させ染色する。ネガ
テイブコントロールとしてFITC−ヤギ抗マウス
Ig抗体を用いる。染色された細胞の螢光強度はフ
ローサイトメトリー（Spectrum−Ortho
Pharmaceutical CO.，NJ）で測定し、陽性率を
求める。
実施例 １
(1) ADF生産ATL細胞の樹立
ADF産生ATL細胞としては、例えばATL−２
細胞株がある。ATL−２細胞株は成人Ｔ細胞白
血病（ATL）と診断された61才男子の末梢血よ
り樹立したものである。培養開始時の患者末梢血
は細胞核の異型性から白血病細胞と判定されたも
のであり、白血病細胞の表面形質はＥロゼツト
（＋），OKT−３（＋），４（＋），６（−），８（−
），
Ia（＋）であり血清中のATLA抗体は陽性であつ
た。培地はRPMI−1640培地（10％FCS含有）に
ヒト末梢血、あるいは脾細胞由来の粗IL2を添加
したものを用いた。培養開始３ケ月後から安定な
増殖を示す様になり、３−４日毎の継代培養が可
能になつた。更に培養開始後10ケ月前後からIL2
依存性を漸次脱しIL2を添加しなくとも10％の
FCSを含むRPMI−1640培地のみで増殖継代が可
能となり、現在に至る迄、３年８ケ月にわたり継
代培養が続けられている。ATL−２の細胞の形
質はＥロゼツト（＋），OKT−３（−），４（＋），
８（−），Tac（＋），SIg（−）であり、ATLA
（＋）で、電子顕微鏡によりＣ型レトロウイルス
粒子（ATLV））が多数観察される。
ATL患者からは種々の表面形質を持つATL細
胞が樹立されるが、ADF産生細胞株の多くは
ATL−２細胞と同様OKT−４（＋）即ちヘルパ
ーフエノタイプである。
(2) ATL−２によるADFの製造
２容プラスチツクローラー培養器（フアルコ
ン3027）（以下ローラーと称する）中の１の10
％FCS含有RPMI−1640培地（2mMのグルタミ
ン、100単位／mlペニシリン、100μｇ／mlストレ
プトマイシン、２ｇ／NaHCOを含有）に１
×105／mlの細胞密度にATL−２を接種し、
20rpmで回転させつつ、５日間、37℃で培養し
た。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集め、
RPMI−1640培地で１回細胞を洗つた後、細胞を
２容ローラ中１のRPMI−1640培地に５×
105／ml細胞濃度に懸濁した。ローラーを20rpm
で回転させつつ、37℃で４日間培養した。培養後
培養物を遠心分離して培養上清を得た。
本培養上清のADF活性を検定すると、確かに
ATL−２細胞はYT細胞上のIL2Rの発現を誘導
する物質を産生していることが示された。
(3) ADFの精製
ADFはATL−２の培養上清より以下の様にし
て精製した。
セフアクリルＳ−200ゲル濾過クロマトグラフイ
ー
11のATL−２無血清培養上清（RPMI−
1640）をアミコン社のDC−２ホローフアイバー
システム（HIPIO−８ hollow fiber、
molecular cut at 10kd Amicon Corp.、
Lexington、LA）を用い、10mlまで濃縮した後
PBSで平衡化したセフアクリルＳ−200カラムに
よるゲル濾過クロマトグラフイーを行ない分画し
た。ADF活性は分子量40−30kd及び20−10kdに
相当する画分に溶出された。尚、標準蛋白質とし
てはウシ血清アルブミン（6.6万）、キモトリプシ
ノーゲン（2.4万）、チトクロームＣ（1.3万）を用
いた。分子量10kd〜50kdに相当する画分を集め、
アミコンDiafloYM−５メンブレンフイルターを
用いて濃縮した。（Amicon、molecular cut at
5000）
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイー
次に濃縮ADFサンプルを10mM NaiPO4（PH
6.8）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラ
ム（10×1.5cm）に添加し、20mlの10，40，110，
400，mMのNaiPO4（PH6.8）でそれぞれ順次蛋白
質を溶出した。主に110mMのNaiPO4でADF活
性は溶出された。
FPLCシステムによるスペローズHR10／30カラ
ムクロマトグラフイー
ハイドロキシアパタイトカラムより得たADF
活性画分（110mM NaiPO4溶出液をさらにPBS
で平衡化したスペローズHR10／30 12カラムを
用いたFPLC（Fast Protein Liquid
Chromatography system，Pharmacia、
Uppsala、スウエーデン）システムにかけ、0.5
ml／minの流速で分離精製した。ADFはセフア
クリルＳ−200クロマト同様、分子量30−25kdと
15−13kdに相当する高分子量及び低分子量の２
つの画分に溶出された。
ハイドロキシアパタイトカラムを用いた高速液体
クロマトグラフイー（HPCL）
10mM NaiPO4（PH6.8）で平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラムにスペローズHR10／30
12カラムから溶出した低分子性のADF活性画分
即ち分子量15−13kdに相当する画分を添加し、
HPLCにより分離した。蛋白質の溶出は10mMか
ら400MmのNaiPO4（PH6.8）直線濃度勾配
（10mM／min）で行ない溶出速度は0.5ml／min
とした。ADF活性は２つの活性ピークに分かれ
全体の90％以上の活性を占める高濃度のNaiPO4
で溶出された画分をプールし、次の精製工程に移
行した。
ODSカラム（C18）を用いた逆相高速液体クロマ
トグラフイー
ハイドロキシアパタイトカラムより得られた
ADF活性画分をさらにシンクロパツク
（Synchropak）RP−CIB（Sychrom、InC.、
Linden、Indiana）カラムに添加し、逆相HPCシ
ステムにより分離した。尚カラムは予め0.1％の
TFAで平衡化し、蛋白の溶出は流速1.0ml／min
で0.1％のTFAを含む０〜100％のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配により行なつた。ADF活性は
CH3CN58〜62％で溶出され蛋白の吸収
（OD280）と完全に一致した。
(4) ADF精製蛋白の性質
分子量
上述した如く、セフアクリルＳ−200クロマト
グラフイーではADFは40〜30及び20〜10kdの分
子量を与えて、スペローズHR／12カラムクロマ
トでは30〜20kd及び15〜13kdの分子量を与える。
さらに低分子性のADFはSDS−PAGEでは10〜
13kdの分子量を与える。
等電点
あらかじめ25mM bis−Tris・HCl（PH6.3）で
平衡化したモノｐカラムにADF活性画分を通し
た。蛋白質の溶出はPH６〜4.0の10mMポリバツ
フアー74で行ないカラス操作はFPLCシステムを
用いた。セフアクリルＳ−200溶出ADF画分、即
ち高分子および低分子性のADFの混合物を含ん
だサンプルではPI5.5−4.5を与え、ハイドロキシ
アパタイトカラム（HPLCシステム）溶出画分の
低分子性ADFのみを含んだサンプルではpI5.2，
4.7，4.4を与えた。
アミノ酸配列
低分子性のADF蛋白のアミノ酸配列を決定す
るために精製ADFをプロテイン・シークエンサ
ー（Applied Biosystem CO.）に導入した。ア
ミノ酸配列の決定方法はJ.Biol.Chem.193，265−
275（1951）に記載されている方法により行つた。
低分子性のADFは以下に示すＮ末端構造を示
す分子からなることが判明した。
Val−Lys−Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−
Ala−Phe−Gln−Glu−Ala−Leu−Asp−Ala−
Ala
(5) 精製ADFの免疫活性
HPLCによつて単一に純化されたADFサンプ
ルを用いてYT細胞におけるIL2R、すなわちTac
抗原の発現について確認した。３×105のYT細
胞と純化されたADFサンプルを10％FCSを含む
RPMI培地（100μｇ／mlストレプトマイシン，
100単位／mlのペニシリン，２ｇ／NaHOC3を
含む）で24時間培養した。１％FCSおよび0.1％
NaN3を含むハンクスバランスド溶液で２回洗浄
し、FITC結合抗Tac抗体と４℃、30分間反応さ
せた。反応後細胞を洗浄し細胞に結合したFITC
−抗Tac抗体の量をフローサイトメトリーを用い
て解析した（第１図）。第１図を説明すれば、ａ
が対照実験であり実線はADFサンプル加えない
YT細胞、または破線はネガテイブコントロール
であり、FITC−抗Tac抗体のかわりにヤギ抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を用いた螢光パターン
である。ｂは純化されたADFを加えたYT細胞の
螢光パターンである。横軸はは螢光強度を、縦軸
はそれぞれの螢光強度に対する細胞数を示す。即
ち曲線のカーブが横軸の左にずれるほど、検体の
細胞表面のFITC量が多いことを示す。第１図に
示すとおり、明らかに純化されたADFはYT細胞
のTac抗原の発現を誘導している。
尚、本条件下で単にTac抗原の発現のみならず
純化されたリコンビナントIL2の結合の増巾も確
認された。さらにはADFに加えIL2を共存させる
と、Tac抗原の発現、IL2の結合はADF単独の時
よりも更に増強させることも確認され、ADFと
IL2による併用の有用性が示された。 [Detailed Description of the Invention] [Field of Industrial Application] This invention relates to interleukin 2 (hereinafter referred to as "IL2").
) receptor (interleukin2recep−tor,
The present invention relates to a substance (hereinafter referred to as "ADF") that induces the invention of IL2R (hereinafter referred to as "IL2R"). [Prior art] ADF is the Tac antigen, which is said to be IL2R (Nature, 300 , 267-269 (1982), Pro, NAS
80, 6957-6951 (1983), Nature, 311 , 635-638
(1984)) was found to exist in the culture supernatant of a T leukemia cell line (hereinafter referred to as ``ATL cells'') established from a human adult T leukemia patient (J. Immunol. 134 , 1623−
1630. (1985), J. Mol. Cell. Immunol. 2 , 17-26.
(1985)). Therefore, by inducing the expression of IL2R, ADF induces the expression of IL2 activities such as T cell differentiation and proliferation in vivo, or induces the expression of IL2 in vivo.
Because of this unique biological activity, it can be expected to be widely applied as a treatment for immunodeficiency, tumors, etc. According to research by the present inventors, interleukin 1 (interleukin 1) is a soluble substance that induces tac antigen.
-leukin1), but the chemical properties such as the amino acid sequence of interleukin 1 (Pro.NAS 81 ,
7907-7911, (1984)) and that of the ADF of the present invention are completely different. In addition, the present inventors previously subjected the culture supernatant of ATL cells to gel filtration chromatography, and determined that the molecular weight
Fractions with ADF activities of 40 to 35 kd and 20 to 15 kd were obtained (J. Mol. Cell. Immunol. 2 , 17-26.
(1985)), and subsequent studies revealed that the ADF fraction obtained here was not pure but a mixture of several proteins.
Therefore, this ADF protein fraction and the purified ADF protein preparation of the present invention are different things, and it is only after such purification that a single substance is involved in the induction of IL2R expression. It has been revealed. In other words, conventional ADF fractions have IL2R expression-inducing activity as a mixture of several proteinaceous substances. In addition, various problems can be expected when using such mixtures as medicines. [Problems to be Solved by the Invention] Therefore, an object of the present invention is to obtain ADF purified to only the proteins necessary for having activity. [Means for Solving the Problems] In order to solve the above problems, the present inventors conducted various researches and finally developed an ADF with the following properties.
were successfully isolated as a single substance. Namely (1) Molecular weight: 20 to 10kd (Cefacryl S-200
(gel filtration method) (2) Isoelectric point: pI5.5 to 4.5 (3) Amino acid sequence (from N-terminus): Val-Lys-
Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−Ala−Phe−
There are, for example, the following two methods to obtain Gln-Glu-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala ATL cells. The first method is to establish it from peripheral blood of ATL patients. That is, peripheral blood was collected from a patient diagnosed with ATL, white blood cells were obtained using the Ficoll method, and 10% fetal calf serum (FCS) was added with crude IL-2 prepared from human peripheral blood or human splenocytes.
Start culturing in RPMI-1640 medium containing After showing stable growth, crude IL2 was gradually removed from the medium and after several months of culturing, it was added to the culture medium containing 10% FCS.
Obtain a cell line that can be grown and passaged only in RPMI-1640 medium. To confirm that the obtained cell line is an ATL cell, E rosette OKT series, s-
Search for surface traits such as lg, ATLA, and Tac. These antigen markers are all well known and widely used in clinical practice. E rosette is a search for receptors for sheep red blood cells, which are mainly expressed on T lymphocytes. OKT series includes OKT-3, 4, 6, 8,
etc., but T-3 is a T cell antigen receptor-related antigen and is used to identify human peripheral blood T lymphocytes.
In addition, T-4 is used to identify helper T lymphocyte subsets, T-6 is a β-2 microglobulin-related antigen, and T-8 is used to identify common thymus-derived T lymphocytes.
have been used to identify suppressor/killer T lymphocyte subsets, respectively. s-Ig is a cell surface immunoglobulin and is specifically expressed in B lymphocytes. ATLA is a human adult leukemia antigen, and the antigen is a protein derived from a virus. Tac is also considered to be an IL2R. Since monoclonal antibodies against these antigens are either commercially available or easily available, cell surface antigens can be easily identified by binding each monoclonal antibody to FITC and reacting with sample cells. The second method is peripheral blood transformation (in vitro) using human adult T leukemia virus (ATLV). (Science, 217 , 737
(1982)). That is, ATLV-producing ATL cells, such as MT-2 cells, whose proliferation ability has been completely stopped by γ-ray (12,000 rad) irradiation, and white blood cells obtained by treating peripheral blood from healthy individuals with Ficoll were combined with RPMI-
Start culturing in 1640 medium (containing 10% FCS),
Replace 1/2 medium every ~5 days. Two weeks to one month after the start of culture, a cell line that can be passaged will be obtained, but if growth is unstable, add IL2 derived from human peripheral blood. The obtained cell line is ATL
E rosette to confirm that it is a cell.
Search for surface characteristics such as OKT series, S-Ig, ATLA, Tac, etc. is performed in the same manner as in the first method. Next, an example of a method for producing ADF using ATL cells will be shown. Conditions suitable for growing ATL cells For example, culture ATL cells in a medium containing fetal ovienne serum (FCS) to increase the number of ATL cells, and then separate and wash the cells, which is ideal for ADF production. For example, by transferring the cells to a completely synthetic medium that does not contain proteins such as FCS and culturing them further, ADF containing few extraneous proteins can be obtained. The main component of the medium used to culture ATL cells may be a commercially available medium. For example, RPMI-1640 medium,
Modified Eagle's medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), or Krick's medium may be used. (as an additive to these media) 1 ml
20 to 250 units of penicillin per ml, ideally about 100 units per ml,) 1 μg to 100 μg per ml,
Ideally, 10 μg of gentamicin per ml;
)20-250μg per ml, ideally 100μg
Streptomycin, ) approx. 100 to 1 ml
1000μg, ideally about 300μg per ml of fresh L
-Glutamine, )1-3g/ideally 2
g/ NaHCO3 ,)5× 10-4 to 5× 10-6 M,
Ideally, 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol can be used as needed. ATL
As an optimal medium for increasing the number of cells, for example, add 1 to 30%, preferably 10% to the above medium.
Use a medium supplemented with %FCS. When producing lymphokines from T cells, it is usually necessary to add proteins such as FCS or mitogens to the culture medium, but in contrast, using ATL cells, ADF
When producing , it is not necessary to add serum components such as FCS or other serum components to the culture medium, and there is no need to add commonly used mitogens for T cells or B cells. The above method of producing ADF using ATL cells is performed under various environmental conditions. Thus, preferably the ATL cell culture should be maintained in humidified air containing about 5% to 10% carbon dioxide at a temperature range of about 35° to 37°C. As incubators, Falcon Loveware Division, Becton
Dickinson End Corporation (Falcon Labware, Div. Becton, Dickinson
FALCON No. 3013 commercially available from
Also, tissue culture flasks such as the 3025 can be used. It is also possible to use a roller bottle, such as Bottle No. 3027 commercially available from Falcon Labware, or a spinner jar flask. To increase the number of cells by culturing ATL cells, the cell density at the start of culture is 1
It is preferably ×10 5 /ml. under the above conditions
When ATL cells are cultured, usually 4-6x in 4-5 days.
The cell density increases to 10 5 /ml, so add new medium again and lower the cell density to 1 x 10 5 /ml.
Continue culturing again. After culturing ATL cells in this manner until the desired cell number is reached, the cells are centrifuged, washed with protein-free complete synthetic medium, and then inoculated into a new complete synthetic medium. The initial density of cells at this time is 1×10 -4 ~1×
10 7 is preferable, ideally 5×10 5 /
ml. The amount of ADF produced by culturing ATL cells changes over time. for example,
RPMI ATL cells at an initial cell density of 5×10 5 /ml.
When cultured in -1640 medium (containing 100 units/ml of penicillin, 100 μg/ml of streptomycin and 2 g/ml of NaHCO 3 ), ADF activity reaches its maximum after 3 to 5 days. In this way, in RPMI-1640 medium
The optimal culture time for producing ADF from ATL cells is about 3 to 5 days. From the ATL cell culture supernatant obtained in this way, ADF was extracted by salting out, vacuum dialysis, ultrafiltration,
The above-mentioned culture supernatant can be concentrated by various methods such as gel filtration chromatography, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, chromatography, reversed-phase chromatography, and gel electrophoresis. Can be purified. For example, Cefacrylic S-200 (Pharmacia Fine Chemi-
cals, Sweden) column chromatography, Superose HR/12 column chromatography (Superose HR/12, Pharmacia Fine
Chemicals), hydroxyapatite chromatography, octadodecylsilane (Octa
ADF can be purified by a combination of methods such as reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) using a Dodesyle Silane (ODS C18) column. In addition, the concentrated solution of ATL cells was mixed with Cephacryl S-
When fractionated using a 200 column, two ADF activity peaks corresponding to molecular weights of 40 to 30 kd and 20 to 10 kd are observed, but the ADF of the present invention is a substance with a low molecular weight, that is, a substance found at a molecular weight of 20 to 10 kd. corresponds to The physicochemical properties of the obtained ADF are as follows. (1) Molecular weight ADF produced from ATL-2 by the above method has the following properties. Add the concentrated ATL-2 culture supernatant to a Sephacryl S-200 column previously equilibrated with PBS,
When eluted with PBS, ADF is eluted at positions corresponding to molecular weights of 40-30 and 20-10 kd. In addition, in Sperose HR/12 column chromatography using an FPLC system (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden), the molecular weight was 30-25 kd and 15-
ADF was eluted at a position corresponding to 13 kd. (2) Isoelectric point The ADF-containing culture solution obtained from ATL-2 using the method described above was concentrated by ultrafiltration, and then added to Cephacryl S-
200 gel filtration chromatography and fractionated crude ADF, that is, a sample containing high-molecular and low-molecular ADF, is subjected to chromatofocusing using a Pharmacia Monop column in the pH range of 6 to 4, and ADF has a pH of 5. Eluted between .5 and 4.5 with a pI of 5.5
It was revealed that the protein was an acidic protein with a molecular weight of 4.5. Furthermore, when chromatofocusing is performed in the same manner as described above using a sample containing low-molecular-weight ADF that has undergone several purification steps after Sephacryl S-200 gel chromatography, ADF has a pH of
Low-molecular-weight ADF eluted at positions 5.2, 4.7, and 4.4 has a pI
was shown to be an acidic protein with microheterogeneity of 5.2, 4.7, and 4.4. This is thought to reflect the difference in sugar chain structure. (3) Amino acid sequence of the N-terminal portion The primary amino acid structure of the N-terminal portion of low-molecular-weight ADF, which became a single peak in the final purification step of reverse-phase high-performance liquid chromatography using an ODS column, was determined using an amino acid sequencer. Upon determination, it became clear that the molecule consisted of the following N-terminal structure. Val−Lys−Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−
Ala−Phe−Gln−Glu−Ala−Leu−Asp−Ala
-Ala The ADF thus obtained is useful as a therapeutic agent for immunodeficiency, cancer, autoimmune infections, etc.
ADF alone or in combination with IL2, other lymphokines, and immune active substances can be used in a wide range of applications as a therapeutic agent. At the same time, the present protein and its constituent peptides can be used by themselves or in combination with antibodies against them to diagnose various diseases. Also, by using ADF and IL2 together, IL2
It is also possible to enhance the action of Naomoto ADF is simply
It not only enhances IL2R expression, but also exhibits many other immunoactivities and has usefulness well known in the art as an immunoactive substance. ADF activity is measured by the following method. YT cells, an NK-like tumor line in which IL2R (Tac antigen) expression is regulated (J. Immunol. 134 , 1623-
1630. (1985)), ADF activity was measured using the induction of Tac antigen expression as an indicator. That is, 3×10 5 pieces
YT cells are cultured in the presence of sample for 24 hours under 5% CO 2 aeration. Wash twice with Hank's Balanced Solution containing 1% FCS and 0.1% NaN3 and fluorophore.
Antibody conjugated with FITC (fluorecein isothiocyanate)
Incubate and stain with Tac antibody at 40°C for 30 minutes. FITC-goat anti-mouse as negative control
Use Ig antibody. The fluorescence intensity of stained cells was measured by flow cytometry (Spectrum-Orthometry).
Pharmaceutical CO., NJ) to determine the positive rate. Example 1 (1) Establishment of ADF-producing ATL cells ADF-producing ATL cells include, for example, ATL-2
There are cell lines. The ATL-2 cell line was established from the peripheral blood of a 61-year-old man diagnosed with adult T-cell leukemia (ATL). The patient's peripheral blood at the start of culture was determined to be leukemic cells based on atypical cell nuclei, and the surface characteristics of leukemic cells were E rosette (+), OKT-3 (+), 4 (+), and 6 (-). ), 8(-
),
Ia (+), and the ATLA antibody in the serum was positive. The medium used was RPMI-1640 medium (containing 10% FCS) supplemented with human peripheral blood or splenocyte-derived crude IL2. Three months after the start of culture, stable growth began to be observed, and subculturing every 3-4 days became possible. Furthermore, from around 10 months after the start of culture, IL2
Gradual release of dependence and 10% reduction even without the addition of IL2
Propagation and subculture were made possible using only RPMI-1640 medium containing FCS, and subculture has been continued for 3 years and 8 months to date. The cell characteristics of ATL-2 are E rosette (+), OKT-3 (-), 4 (+),
8 (-), Tac (+), SIg (-), and ATLA
(+), many type C retrovirus particles (ATLV) are observed by electron microscopy. ATL cells with various surface characteristics are established from ATL patients, but many ADF-producing cell lines
Like ATL-2 cells, they are OKT-4(+), that is, a helper phenotype. (2) Production of ADF using ATL-2 1 of 10 in a 2-volume plastic crawler incubator (Falcon 3027) (hereinafter referred to as roller)
1% FCS-containing RPMI-1640 medium (containing 2mM glutamine, 100 units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 2g/NaHCO)
ATL-2 was inoculated at a cell density of ×10 5 /ml,
The cells were cultured at 37° C. for 5 days while rotating at 20 rpm. After culturing, centrifuge the culture to collect the cells,
After washing the cells once with RPMI-1640 medium, the cells were incubated 5x in 1 volume of RPMI-1640 medium in a 2 volume roller.
The cells were suspended at a concentration of 10 5 cells/ml. roller 20rpm
The cells were cultured at 37°C for 4 days with rotation. After culturing, the culture was centrifuged to obtain a culture supernatant. When assaying the ADF activity of the main culture supernatant, it was confirmed that
It was shown that ATL-2 cells produce a substance that induces the expression of IL2R on YT cells. (3) Purification of ADF ADF was purified from the ATL-2 culture supernatant as follows. Sephacryl S-200 gel filtration chromatography 11 ATL-2 serum-free culture supernatant (RPMI-
1640) to Amicon's DC-2 hollow fiber system (HIPIO-8 hollow fiber,
molecular cut at 10kd Amicon Corp.,
Lexington, LA) and concentrated to 10 ml.
Fractionation was performed by gel filtration chromatography using a Sephacryl S-200 column equilibrated with PBS. ADF activity was eluted in fractions corresponding to molecular weights of 40-30 kd and 20-10 kd. As standard proteins, bovine serum albumin (66,000), chymotrypsinogen (24,000), and cytochrome C (13,000) were used. Collect fractions corresponding to molecular weights of 10 kd to 50 kd,
It was concentrated using an Amicon DiafloYM-5 membrane filter. (Amicon, molecular cut at
5000) Hydroxyapatite chromatography The concentrated ADF sample was then diluted with 10mM Na i PO 4 (PH
Add to a hydroxyapatite column (10 x 1.5 cm) equilibrated with 6.8) and add 20 ml of 10, 40, 110,
The proteins were sequentially eluted with 400 and mM Na i PO 4 (PH6.8), respectively. ADF activity was eluted mainly at 110 mM Na i PO 4 . Sperose HR10/30 column chromatography using FPLC system ADF obtained from hydroxyapatite column
The active fraction (110mM Na i PO 4 eluate was further added to PBS)
FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography system，Pharmacia，
Uppsala, Sweden) system, 0.5
Separation and purification was performed at a flow rate of ml/min. ADF has a molecular weight of 30-25 kd, similar to Sephacryl S-200 chromatography.
High molecular weight and low molecular weight equivalent to 15-13kd
It was eluted in two fractions. High performance liquid chromatography (HPCL) using a hydroxyapatite column Superose HR10/30 was added to a hydroxyapatite column equilibrated with 10mM Na i PO 4 (PH6.8).
Add the low-molecular ADF active fraction eluted from the 12 column, that is, the fraction corresponding to a molecular weight of 15-13 kd,
Separated by HPLC. Protein elution was performed using a linear concentration gradient (10mM/min) of Na i PO 4 (PH6.8) from 10mM to 400Mm, and the elution rate was 0.5ml/min.
And so. ADF activity is divided into two activity peaks and a high concentration of Na i PO 4 accounts for more than 90% of the total activity.
The eluted fractions were pooled and transferred to the next purification step. Reversed phase high performance liquid chromatography using ODS column (C18) Obtained from hydroxyapatite column
The ADF active fraction was further purified by Synchropak RP-CIB (Sychrom, InC.,
Linden, Indiana) column and separated by a reversed-phase HPC system. The column was pre-filled with 0.1%
Equilibrate with TFA and elute protein at a flow rate of 1.0ml/min.
A linear concentration gradient from 0 to 100% acetonitrile containing 0.1% TFA was performed. ADF activity is
It was eluted at CH 3 CN 58-62% and completely matched the protein absorption (OD280). (4) Characteristics and molecular weight of ADF purified protein As mentioned above, ADF gives a molecular weight of 40 to 30 and 20 to 10 kd in Sephacryl S-200 chromatography, and 30 to 20 kd and 15 to 13 kd in Sperose HR/12 column chromatography. gives the molecular weight of
In addition, low-molecular-weight ADF is 10 ~
Gives a molecular weight of 13kd. Isoelectric Point The ADF active fraction was passed through a monop column equilibrated with 25mM bis-Tris.HCl (PH6.3) in advance. Protein elution was performed with 10 mM polybuffer 74 at pH 6 to 4.0, and an FPLC system was used for the glass operation. The ADF fraction eluted from Sephacryl S-200, i.e., a sample containing a mixture of high-molecular and low-molecular ADF, gave a PI of 5.5-4.5, while the fraction eluted from the hydroxyapatite column (HPLC system), which contained only low-molecular ADF, gave a PI of 5.5-4.5. The sample containing pI5.2,
4.7, 4.4 were given. Amino acid sequence To determine the amino acid sequence of the low molecular weight ADF protein, purified ADF was introduced into a protein sequencer (Applied Biosystem CO.). The method for determining the amino acid sequence is J.Biol.Chem. 193 , 265-
275 (1951). It was found that low-molecular-weight ADF consists of molecules having the N-terminal structure shown below. Val−Lys−Gln−Ile−Glu−Ser−Lys−Thr−
Ala−Phe−Gln−Glu−Ala−Leu−Asp−Ala−
Ala (5) Immunoreactivity of purified ADF IL2R, namely Tac, in YT cells was investigated using a single purified ADF sample by HPLC.
The expression of the antigen was confirmed. 3 x 10 YT cells and purified ADF sample containing 10% FCS
RPMI medium (100 μg/ml streptomycin,
(containing 100 units/ml penicillin, 2 g/NaHOC) for 24 hours. 1%FCS and 0.1%
The cells were washed twice with Hank's balanced solution containing NaN 3 and reacted with FITC-conjugated anti-Tac antibody at 4°C for 30 minutes. After the reaction, wash the cells and FITC bound to the cells.
-The amount of anti-Tac antibody was analyzed using flow cytometry (Figure 1). To explain Figure 1, a
is a control experiment, and the solid line shows no ADF sample added.
YT cells or the dashed line is a negative control and is a fluorescence pattern using goat anti-mouse immunoglobulin antibody instead of FITC-anti-Tac antibody. b is a fluorescence pattern of YT cells to which purified ADF was added. The horizontal axis shows the fluorescence intensity, and the vertical axis shows the number of cells for each fluorescence intensity. That is, the more the curve shifts to the left on the horizontal axis, the greater the amount of FITC on the cell surface of the sample. As shown in Figure 1, purified ADF clearly induces Tac antigen expression in YT cells. Note that under these conditions, not only the expression of Tac antigen but also the enhanced binding of purified recombinant IL2 was confirmed. Furthermore, it was confirmed that when ADF and IL2 coexisted, Tac antigen expression and IL2 binding were further enhanced than when ADF was used alone.
The usefulness of the combination with IL2 was demonstrated.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は、本発明のインターロイキン２レセプ
ター発現誘導物質のTac抗原誘導活性を調べた結
果を示す。
FIG. 1 shows the results of examining the Tac antigen inducing activity of the interleukin 2 receptor expression inducer of the present invention.