JPH0652254B2 - Electrophoretic medium film - Google Patents
Electrophoretic medium filmInfo
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- JPH0652254B2 JPH0652254B2 JP62177978A JP17797887A JPH0652254B2 JP H0652254 B2 JPH0652254 B2 JP H0652254B2 JP 62177978 A JP62177978 A JP 62177978A JP 17797887 A JP17797887 A JP 17797887A JP H0652254 B2 JPH0652254 B2 JP H0652254B2
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は核酸(DNA,RNA)塩基配列決定のために用いら
れるポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電気泳動用
ゲル媒体に関するものであり,さらに詳しくは,核酸塩
基フラグメントの低分子量部分から高分子量部分まで広
い分子量範囲にわたって良好な分離性能を有するように
予め定められ制御されたゲル媒体の膜厚勾配(膜厚グラ
ジエント)とアクリルアミド化合物と架橋剤の濃度勾配
(ポリアクリルアミドゲル濃度勾配,すなわちゲル濃度
グラジエント)の組合せを有する電気泳動用媒体膜に関
するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial field of use] The present invention relates to a gel medium for electrophoresis comprising a polyacrylamide-based aqueous gel used for determining the base sequence of nucleic acids (DNA, RNA). Is a gel medium thickness gradient (thickness gradient) of the gel medium, which is predetermined and controlled so as to have good separation performance over a wide molecular weight range from the low molecular weight portion to the high molecular weight portion of the nucleobase fragment, and the acrylamide compound and the cross-linking agent. The present invention relates to a medium film for electrophoresis having a combination of concentration gradients (polyacrylamide gel concentration gradient, that is, gel concentration gradient).
[従来の技術] 化学分解法,ジデオキシ法等による核酸(DNA,RNA)の
塩基配列決定法においてはポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動用媒体膜(以下,ポリアクリルアミドゲル膜
又は,単に,ゲル膜ということがある)を用いたスラブ
電気泳動が必須の操作になっている。近年では電気泳動
分析が頻繁に利用されるようになっている。そしてジデ
オキシ法の発達により,核酸フラグメントの高分子量部
分まで精度よく分離できるポリアクリルアミドゲル膜の
要請が高まってきた。[Prior Art] In a nucleic acid (DNA, RNA) base sequencing method such as a chemical decomposition method or a dideoxy method, a polyacrylamide-based aqueous gel electrophoresis medium film (hereinafter, referred to as a polyacrylamide gel film or simply a gel film) is used. Slab electrophoresis is an essential operation. In recent years, electrophoretic analysis has been frequently used. With the development of the dideoxy method, there has been an increasing demand for a polyacrylamide gel membrane capable of accurately separating even high-molecular-weight portions of nucleic acid fragments.
一方、核酸の塩基配列決定のために,核酸塩基フラグメ
ントをその分子量の違いにより電気泳動分離する場合,
通常の厚さ一定のポリアクリルアミドゲル膜では,分離
したフラグメントのバンドの間隔が低分子量部分では広
く,高分子量部分では狭くなる。このため核酸フラグメ
ントの高分子量部分の分離が悪くなる。そこで低分子量
部分から高分子量部分まで広い分子量範囲にわたって均
等に良好な分離性能を得るために,電気泳動方向にポリ
アクリルアミド濃度,緩衝液濃度に勾配をもたせたポリ
アクリルアミドゲル膜(グラジエントゲル膜)が使用さ
れている。例えば特開昭60-235819(EP 0 159 694A)に
はポリアクリルアミド濃度(ゲル濃度又は孔径サイズ)
勾配を有するポリアクリルアミドゲル電気泳動用媒体膜
を,アクリルアミドと架橋剤を含む水溶液の薄層を支持
体の表面で電子ビーム等の電離放射線を用いて架橋重合
させて製造する方法及び装置が記載されている。この方
法に用いられる装置及び濃度勾配をゲル膜中に発現させ
るための電子ビーム等のコントロール法はきわめて複雑
である。一般にグラジエントゲル膜は製造するのに手数
がかかり,濃度勾配の再現性が悪く,製造に失敗するこ
とが多く,再現性のよいグラジエントを有する多数のゲ
ル膜を製造し難いという欠点があった。On the other hand, when a nucleic acid base fragment is electrophoretically separated according to its molecular weight for the purpose of determining the base sequence of a nucleic acid,
In a normal polyacrylamide gel membrane with a constant thickness, the band separation of separated fragments is wide in the low molecular weight part and narrow in the high molecular weight part. Therefore, the separation of the high molecular weight portion of the nucleic acid fragment becomes poor. Therefore, in order to obtain good separation performance evenly over a wide molecular weight range from the low molecular weight portion to the high molecular weight portion, a polyacrylamide gel membrane (gradient gel membrane) with a gradient in the polyacrylamide concentration and the buffer concentration in the electrophoresis direction is used. It is used. For example, in JP-A-60-235819 (EP 0 159 694A), polyacrylamide concentration (gel concentration or pore size)
A method and apparatus for producing a gradient polyacrylamide gel electrophoresis medium film by cross-linking and polymerizing a thin layer of an aqueous solution containing acrylamide and a cross-linking agent on the surface of a support using ionizing radiation such as an electron beam is described. ing. The apparatus used for this method and the control method such as an electron beam for expressing the concentration gradient in the gel film are extremely complicated. Generally, a gradient gel film is troublesome to manufacture, the reproducibility of the concentration gradient is poor, the manufacturing is often unsuccessful, and it is difficult to manufacture a large number of gel films having a gradient with good reproducibility.
一方,通常ゲル膜を作製する場合,2枚の平面ガラスの
間にゲル膜を形成するため,膜厚に望みの漸次的変化の
勾配をもたせることが難しかったので,膜厚勾配ゲル膜
は従来使用されていなかった。On the other hand, when a normal gel film is produced, it is difficult to give a desired gradual change in the film thickness because the gel film is formed between two flat glass sheets. It was never used.
このようにゲル濃度又は膜厚のいずれか一方だけに勾配
を設けるだけでも技術的に困難であるために,濃度勾配
と膜厚勾配の併用については注目されていなかった。ま
た,濃度あるいは膜厚のいずれか一方だけに勾配を有す
る場合には,核酸の高分子量部分まで良好な分離性能を
得ようとすると複雑な勾配曲線を必要とすることが一般
に知られているが,濃度と膜厚の2種類の勾配の併用の
場合にはそれぞれの単純な勾配曲線(又は直線)の組合
わせで大きな効果を得られることが判明した。さらに,
ポリアクリルアミド水性ゲルが濃度の違いによって膨潤
率が異なるので,複雑な濃度勾配曲線を有するグラジエ
ントゲル膜においては,分離した核酸フラグメント像を
有する電気泳動実施後のゲル膜を支持体から剥離する操
作時にゲル膜が変形しやすいという欠点があったが,単
純な濃度勾配曲線(又は濃度勾配直線)のゲル膜におい
ては泳動実施後の剥離操作時のゲル膜の変形が生じ難い
ことが判明した。Thus, since it is technically difficult to provide a gradient only to either the gel concentration or the film thickness, no attention has been paid to the combined use of the concentration gradient and the film thickness gradient. In addition, it is generally known that a complex gradient curve is required in order to obtain good separation performance even in the high molecular weight portion of nucleic acid when there is a gradient only in either concentration or film thickness. It was found that, when two types of gradients of concentration and film thickness are used in combination, a large effect can be obtained by combining the respective simple gradient curves (or straight lines). further,
Since the swelling ratio of the polyacrylamide aqueous gel differs depending on the concentration, in the gradient gel membrane with a complicated concentration gradient curve, the gel membrane after the electrophoresis with the separated nucleic acid fragment image is separated from the support. Although the gel film has a drawback of being easily deformed, it has been found that the gel film having a simple concentration gradient curve (or concentration gradient straight line) is unlikely to be deformed during the peeling operation after the electrophoresis.
[発明の目的] 本発明の目的は核酸(DNA,RNA)の塩基配列決定のため
に用いられるポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用
媒体(以下,ゲル媒体ということがある)において,核
酸フラグメントの低分子量部分から高分子量部分までほ
ぼ同等な良好な高分離性能を持つように厚さグラジエン
トとポリアクリルアミドゲル濃度グラジエントを有する
ゲル媒体膜を提供することである。[Object of the Invention] An object of the present invention is to reduce the content of nucleic acid fragments in a polyacrylamide-based aqueous gel electrophoresis medium (hereinafter sometimes referred to as gel medium) used for determining the nucleotide sequence of nucleic acids (DNA, RNA). It is an object of the present invention to provide a gel medium membrane having a thickness gradient and a polyacrylamide gel concentration gradient so as to have a good high-separation performance that is almost equivalent from the molecular weight portion to the high molecular weight portion.
本発明の他の目的は濃度グラジエントだけを有するゲル
膜に比べて膨潤による変形の排除された,あるいは変形
の少ない厚さグラジエントとポリアクリルアミドゲル濃
度グラジエントを有するゲル媒体膜を提供することであ
る。Another object of the present invention is to provide a gel medium film having a thickness gradient and a polyacrylamide gel concentration gradient in which deformation due to swelling is eliminated or deformation is reduced as compared with a gel film having only a concentration gradient.
[発明の構成] 本発明は,アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル及
び変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基を含む
化合物を含む電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状支
持体と平面状カバーシートとの間に設けてなる電気泳動
用媒体膜において, 前記ゲル媒体層が電気泳動方向に沿う漸次的な厚さの変
化及び電気泳動方向に沿う漸次的なポリアクリルアミド
系水性ゲル濃度の変化を併せて有することを特徴とする
電気泳動用媒体膜である。[Structure of the Invention] The present invention provides a gel for electrophoresis containing a polyacrylamide-based aqueous gel obtained by cross-linking and polymerizing an acrylamide compound and a cross-linking agent in the presence of water, and a compound containing at least one carbamoyl group as a modifier. In an electrophoretic medium film in which a layer made of a medium is provided between a flat support and a flat cover sheet, the gel medium layer has a gradual change in thickness along the electrophoretic direction and an electrophoretic direction. The electrophoretic medium film is characterized in that it also has a gradual change in polyacrylamide-based aqueous gel concentration along with it.
[発明の構成の詳細な説明] ゲル媒体に用いることができるアクリルアミド系化合物
(単量体)の例としては,アクリルアミド,N−メチル
アクリルアミド,N,N−ジメチルアクリルアミド,N−
(ヒドロキシメチル)アクリルアミド,ジアセトンアク
リルアミド等のアクリルアミドホモログがある。これら
の化合物は単独で,または2種以上を組合せて用いるこ
とができる。これらの化合物のうちではアクリルアミド
が好ましく,またアクリルアミドと他のアクリルアミド
系化合物の1種以上との併用も好ましい。[Detailed Description of Configuration of the Invention] Examples of acrylamide compounds (monomers) that can be used in the gel medium include acrylamide, N-methylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, and N-
There are acrylamide homologs such as (hydroxymethyl) acrylamide and diacetone acrylamide. These compounds can be used alone or in combination of two or more. Of these compounds, acrylamide is preferable, and it is also preferable to use acrylamide in combination with one or more other acrylamide compounds.
架橋剤としては「Electrophoresis」2(4),213−219
(1981),同誌2(4),220−228(1981)等に記載の二
官能性架橋剤化合物,特開昭61-2058等に記載の三官能
性以上の架橋剤化合物を用いることができる。二官能性
架橋剤の具体例として,N,N′−メチレンビスアクリル
アミド(BIS);N,N′−プロピレンビスアクリルアミド
(PBA);ジアクリルアミドジメチルエーテル(DAE);
1,2−ジアクリルアミドエチレングリコール(DEG);エ
チレンウレアビスアクリルアミド(EUB);エチレンジ
アクリレート(EDA);N,N′−ジアリルタルタルジアミ
ド(DATD);N,N′−ビスアクリリルシスタミン(BAC)
がある。三官能性架橋剤の具体例として,1,3,5−トリ
アクリロイルヘキサヒドロ−s−トリアジン(TAHT);
トリアリルシアヌレート(TAC);トリアリルイソシア
ヌレート(TAIC)等がある。これらの架橋剤のうちでBI
SとTAHTが好ましい。架橋剤は2種以上を組合わせて用
いることもできる。As a cross-linking agent, "Electrophoresis" 2 (4), 213-219
(1981), ibid. 2 (4), 220-228 (1981) and the like, and bifunctional crosslinking agent compounds described in JP-A-61-2058 and the like can be used. . Specific examples of the bifunctional cross-linking agent include N, N'-methylenebisacrylamide (BIS); N, N'-propylenebisacrylamide (PBA); diacrylamide dimethyl ether (DAE);
1,2-Diacrylamide Ethylene glycol (DEG); Ethylene ureabisacrylamide (EUB); Ethylene diacrylate (EDA); N, N'-diallyl tartardiamide (DATD); N, N'-bisacrylyl cystamine ( BAC)
There is. Specific examples of the trifunctional crosslinking agent include 1,3,5-triacryloylhexahydro-s-triazine (TAHT);
Triallyl cyanurate (TAC); triallyl isocyanurate (TAIC) and the like. BI of these cross-linking agents
S and TAHT are preferred. Two or more kinds of cross-linking agents may be used in combination.
架橋剤の量は,単量体と架橋剤の合計重量に対して約1w
%から約30w%,好ましくは約2w%から約10w%の範囲で
用いられる。The amount of cross-linking agent is about 1w based on the total weight of monomer and cross-linking agent.
% To about 30 w%, preferably about 2 w% to about 10 w%.
ゲル媒体にはアガロースを添加することができる。アガ
ロースとしては,特開昭55-5730,特開昭55-110946,特
表昭57-502098,特開昭59-126236等に記載の低電気浸透
性アガロース,中電気浸透性アガロース,高電気浸透性
アガロースのいずれも用いることができる。アガロース
の添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対し
て約0.2w/v%から約2.0w/v%,好ましくは約0.3w/v%か
ら約1.2w/v%の範囲である。Agarose can be added to the gel medium. Examples of agarose include low electroosmotic agarose, medium electroosmotic agarose, and high electroosmosis described in JP-A-55-5730, JP-A-55-110946, JP-A-57-502098, and JP-A-59-126236. Any of the sex agarose can be used. The amount of agarose added is about 0.2 w / v% to about 2.0 w / v%, preferably about 0.3 w / v% to about 1.2 w / v% relative to the volume of the aqueous gel containing the monomer and the cross-linking agent. It is a range.
ゲル媒体には水溶性ポリマーを添加することができる。
水溶性ポリマーとしては,特開昭59-126236,特開昭60-
60548等に記載の分子量約1万から約100万の範囲の付加
重合型または縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマー,
特開昭61-18852等に記載のビニルスルホニル基等含有の
架橋性アクリルアミド系コポリマー,特願昭61-214878
(特開昭63-70156)に記載の水溶性セルロース誘導体を
用いることができる。付加重合型の水溶性の非イオン性
ポリマーの例としてポリアクリルアミド,ポリビニルア
ルコール,ポリビニルピロリドンがある。縮重合型の水
溶性の非イオン性ポリマーの例としてポリエチレングリ
コール,ポリプロピレングリコール,ポリ−N−ビニル
ピロリドンがある。架橋性アクリルアミド系コポリマー
の例として,N−[[3−(ビニルスルホニル)プロパンア
ミド]メチル]アクリルアミド−アクリルアミドコポリ
マー;N−[[3−(2−クロロエチルスルホニル)プロパ
ンアミド]メチル]アクリルアミド−アクリルアミド−
N−(1,1−ジメチル−3−オキソブチル)アクリルアミ
ドコポリマーがある。水溶性セルロース誘導体の例とし
てメチルセルロース,エチルセルロース,ヒドロキシエ
チルセルロース,ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス,ヒドロキシブチルメチルセルロース等の水溶性セル
ロースエーテルがある。これらの水溶性ポリマーのうち
ではポリアクリルアミド,ポリエチレングリコール,N
−[[3−(ビニルスルホニル)プロパンアミド]メチ
ル]アクリルアミド−アクリルアミドコポリマーが好ま
しい。水溶性ポリマーの添加量は,付加重合型または縮
重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの場合,単量体と
架橋剤の合計重量に対して約2w%から約100w,好ましく
は約5w%から約50w%の範囲,架橋性アクリルアミド系
コポリマーの場合,アクリルアミド系化合物の重量に対
して約1w%から約50w%,好ましくは約5w%から約40w%
の範囲である。A water-soluble polymer can be added to the gel medium.
Water-soluble polymers include those disclosed in JP-A-59-126236 and JP-A-60-
Addition-polymerization type or polycondensation-type water-soluble nonionic polymers having a molecular weight of about 10,000 to about 1,000,000 described in 60548,
Crosslinkable acrylamide-based copolymers containing vinylsulfonyl groups and the like described in JP-A-61-18852, Japanese Patent Application No. 61-214878
The water-soluble cellulose derivative described in (JP-A-63-70156) can be used. Examples of the addition polymerization type water-soluble nonionic polymer include polyacrylamide, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone. Examples of polycondensation type water-soluble nonionic polymers are polyethylene glycol, polypropylene glycol, and poly-N-vinylpyrrolidone. Examples of the cross-linkable acrylamide copolymer include N-[[3- (vinylsulfonyl) propanamide] methyl] acrylamide-acrylamide copolymer; N-[[3- (2-chloroethylsulfonyl) propanamide] methyl] acrylamide-acrylamide −
There is N- (1,1-dimethyl-3-oxobutyl) acrylamide copolymer. Examples of water-soluble cellulose derivatives include water-soluble cellulose ethers such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxybutyl methyl cellulose and the like. Among these water-soluble polymers, polyacrylamide, polyethylene glycol, N
-[[3- (Vinylsulfonyl) propanamide] methyl] acrylamide-acrylamide copolymer is preferred. In the case of addition-polymerization type or polycondensation-type water-soluble nonionic polymer, the addition amount of the water-soluble polymer is about 2w% to about 100w, preferably about 5w% with respect to the total weight of the monomer and the crosslinking agent To about 50 w%, in the case of crosslinkable acrylamide copolymers, about 1 w% to about 50 w%, preferably about 5 w% to about 40 w%, based on the weight of the acrylamide compound.
Is the range.
ゲル媒体には核酸フラグメントの高分子量部分の泳動像
バンド幅の広がりと分離像の歪の発生防止の目的でグリ
セロールをゲル媒体の容積に対して約0.1w/v%〜約1.0w
/v%の範囲で添加することができる。また湿潤剤として
グリセロール,エチレングリコール等のポリオール化合
物をゲル媒体の容積に対して約1.0w/v%〜約40w/v%の
範囲で添加することができる。In the gel medium, glycerol was added to the gel medium in an amount of about 0.1 w / v% to about 1.0 w for the purpose of broadening the migration image band width of the high molecular weight portion of the nucleic acid fragment and preventing distortion of the separation image.
It can be added in the range of / v%. As a wetting agent, a polyol compound such as glycerol or ethylene glycol can be added in the range of about 1.0 w / v% to about 40 w / v% with respect to the volume of the gel medium.
アガロース及び/又は水溶性ポリマー,あるいはグリセ
ロール,エチレングリコール等のポリオール化合物をゲ
ル媒体に添加する時期は通常単量体と架橋剤を水に溶解
する時からポリアクリルアミド系水性ゲルの形成時まで
の間が好ましい。Agarose and / or a water-soluble polymer or a polyol compound such as glycerol or ethylene glycol is usually added to the gel medium from the time when the monomer and the crosslinking agent are dissolved in water to the time when the polyacrylamide-based aqueous gel is formed. Is preferred.
ゲル媒体にはノニオン性,アニオン性又は両性界面活性
剤を添加することができる。界面活性剤の例として, 等のノニオン性界面活性剤, 等のアニオン性界面活性剤, 等の両性界面活性剤がある。界面活性剤の添加量は,単
量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して,ノニオン
性又はカチオン性界面活性剤の場合,約1×10-4から約
5×10-1w/v%,好ましくは約1×10-3から約1×10-2w
/v%の範囲,アニオン性界面活性剤の場合,約1×10-4
から約5×10-2w/v%,好ましくは約1×10-3から約5
×10-2w/v%の範囲である。Nonionic, anionic or amphoteric surfactants can be added to the gel medium. Examples of surfactants include Nonionic surfactants such as Anionic surfactants such as And other amphoteric surfactants. The amount of the surfactant added is about 1 × 10 -4 to about 5 × 10 -1 w / w in the case of the nonionic or cationic surfactant, relative to the volume of the aqueous gel containing the monomer and the crosslinking agent. v%, preferably about 1 × 10 -3 to about 1 × 10 -2 w
/ v% range, about 1 x 10 -4 for anionic surfactants
To about 5 × 10 -2 w / v%, preferably about 1 × 10 -3 to about 5
It is in the range of × 10 -2 w / v%.
変性剤としては少なくとも1個のカルバモイル基をもつ
化合物が用いられる。その具体例として尿素,ホルムア
ミド等がある。変性剤の添加量は単量体と架橋剤を含む
水性ゲルの容積に対して約40w/v%から約60w/v%の範囲
である。変性剤として尿素を用いる場合には,単量体と
架橋剤を含む水性ゲル1000mLに対し約6モル(約360g)
から飽和溶解量(約420g)まで,好ましくは約7モルか
ら飽和溶解量までの範囲で用いられる。変性剤は添加量
が多いので,その添加時期は通常単量体と架橋剤を含む
諸成分を水に溶解する時が好ましい。As the modifier, a compound having at least one carbamoyl group is used. Specific examples thereof include urea and formamide. The amount of the modifier added is in the range of about 40 w / v% to about 60 w / v% based on the volume of the aqueous gel containing the monomer and the crosslinking agent. When using urea as a denaturant, about 6 mol (about 360 g) per 1000 mL of aqueous gel containing monomer and crosslinking agent
To a saturated dissolution amount (about 420 g), preferably about 7 mol to a saturated dissolution amount. Since the modifier is added in a large amount, it is usually preferable to add the modifier when the various components including the monomer and the crosslinking agent are dissolved in water.
ゲル媒体には公知のpH緩衝剤を含有させて電気泳動実施
時のpH値を8.0から0.9の範囲に調節することができる。
用いうるpH緩衝剤としては,日本化学会編「化学便覧基
礎編」(東京,丸善(株),1966年発行)1312−1320
頁;R.M.C.Dawson et al編「Data for Biochemical Res
earch」第2版(Oxford at the Clarendon Press,1969
年発行)476−508頁;「Bio−chemistry」5,467−477
頁(1966年);「Analytical Biochemistry」104,300
−310頁(1980年)等に記載のpH緩衝剤系がある。pH緩
衝剤の具体例として,トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン(Tris)を含む緩衝剤;N,N−ビス(2−ヒドロ
キシエチル)グリシン(Bicine);4−(2−ヒドロキシ
エチル)−1−ピペラジンプロパンスルホン酸(HEPP
S),Na塩又はK塩等;β−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロ
キシエチル)−1−ピペラジンプロパンスルホン酸(HEP
PSO),Na塩又はK塩等;3−[[2−ヒドロキシ−1,1−
ビス(ヒドロキシメチル)エチル]アミノ]−1−プロ
パンスルホン酸(TAPS),Na塩又はK塩等;3−(シクロ
ヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(CAPS),N
a塩又はK塩等;及びこれらのいずれかと必要により組合
せられる酸,アルカリ又は塩がある。好ましい緩衝剤の
例としてTris−硼酸−EDTA・2Na塩(pH8.2〜8.3用組成)
がある。A known pH buffer may be contained in the gel medium to adjust the pH value during electrophoresis to a range of 8.0 to 0.9.
As a pH buffering agent that can be used, “Chemical Handbook Basic Edition” edited by The Chemical Society of Japan (Tokyo, Maruzen Co., Ltd., 1966) 1312-1320
Page; RMCDawson et al, “Data for Biochemical Res”
earch "Second Edition (Oxford at the Clarendon Press, 1969
Pp. 476-508; "Bio-chemistry" 5 , 467-477.
Page (1966); "Analytical Biochemistry" 104 , 300
There is a pH buffer system described in page 310 (1980) and the like. Specific examples of the pH buffer include a buffer containing tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris); N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine); 4- (2-hydroxyethyl) -1- Piperazine propane sulfonic acid (HEPP
S), Na salt or K salt; β-hydroxy-4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinepropanesulfonic acid (HEP
PSO), Na salt or K salt; 3-[[2-hydroxy-1,1-
Bis (hydroxymethyl) ethyl] amino] -1-propanesulfonic acid (TAPS), Na salt or K salt, etc .; 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid (CAPS), N
a salt or K salt; and an acid, alkali or salt optionally combined with any of these. As an example of a preferable buffering agent, Tris-boric acid-EDTA.2Na salt (composition for pH 8.2 to 8.3)
There is.
ゲル媒体は予め定められた厚さの膜において実質的に無
色透明であることが泳動像の検出または読取りに一般的
に好ましい。It is generally preferred for the detection or reading of electrophoretic images that the gel medium be substantially colorless and transparent in a film of predetermined thickness.
ゲル媒体は,実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑
な表面のシート状(フィルム状,又は平板状)支持体又
はカバーシートの上に予め定められた,制御された漸次
的な厚さの変化を有する層又は膜として設けられる。実
質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面のシート
状支持体又はカバーシートとして公知のガラス板,有機
ポリマーシート等を用いることができる。有機ポリマー
シートの具体例としてポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールAのポリカルボネート,ポリスチレン,セ
ルロースエステル(例,セルロースジアセテート,セル
ローストリアセテート,セルロースアセテートプロピオ
ネート等)等のポリマーからなる厚さ約50μmから約2m
m,好ましくは約80μmから約500μmの範囲の透明な,
すなわち波長約200nmから約900nmの範囲内の少なくとも
一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる平滑な表面
を有するシート状物又は平板状物がある。有機ポリマー
支持体又はカバーシートを用いる場合にはその表面を親
水化しゲル膜との接着を良好にするために,紫外線照
射,グロー放電処理,コロナ放電処理,火焔処理,電子
線照射,ケミカルエッチング,電解エッチング等の公知
の表面処理方法を適用することができる。有機ポリマー
支持体又はカバーシートの表面には必要に応じて特開昭
59-164950,特開昭59-212753,特開昭60-194349,特開
昭60-239658,特開昭60-244850,特開昭61-14557等に記
載の下塗層または接着層を設けてその上に設けられるゲ
ル媒体層と支持体又はカバーシートとの接着を強固にす
ることができる。また,後述するように,予め定められ
た漸次的な厚さ変化を有する平面状支持体又はカバーシ
ートを用いることもできる。The gel medium consists of a predetermined, controlled, grading on a substantially electrically non-conductive, water-impermeable, smooth surface sheet-like (film or plate) support or cover sheet. It is provided as a layer or film with a varying thickness. A known glass plate, organic polymer sheet or the like can be used as a sheet-like support or cover sheet having a substantially electrically non-conductive, water-impermeable, smooth surface. Specific examples of the organic polymer sheet include polyethylene terephthalate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, cellulose ester (eg, cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose acetate propionate, etc.) and the like, and the thickness is about 50 μm to about 2 m.
m, preferably transparent in the range of about 80 μm to about 500 μm,
That is, there is a sheet or plate having a smooth surface which transmits electromagnetic radiation having a wavelength in at least a part of the range of about 200 nm to about 900 nm. When using an organic polymer support or cover sheet, in order to make the surface hydrophilic and to improve the adhesion with the gel film, ultraviolet irradiation, glow discharge treatment, corona discharge treatment, flame treatment, electron beam irradiation, chemical etching, A known surface treatment method such as electrolytic etching can be applied. If necessary, the surface of the organic polymer support or the cover sheet may be used as a light-emitting device.
59-164950, JP-A-59-212753, JP-A-60-194349, JP-A-60-239658, JP-A-60-244850, JP-A-61-14557, etc. The adhesion between the gel medium layer provided thereon and the support or cover sheet can be strengthened. Further, as will be described later, it is also possible to use a planar support or a cover sheet having a predetermined gradual thickness change.
ゲル媒体は前述の諸成分とラジカル重合開始剤組成物を
含む水溶液(以下,ゲル形成液ということがある)を平
面状支持体又はカバーシートの上に層状又は膜状に流延
または塗布し,分子状酸素の不存在下で,必要により紫
外線又は可視光の照射及び/又は加熱して,単量体(ア
クリルアミド系化合物)と架橋剤とが架橋重合したポリ
アクリルアミド系水性ゲル媒体層又は膜として製造され
用いられる。The gel medium is obtained by casting or coating an aqueous solution containing the above-mentioned components and a radical polymerization initiator composition (hereinafter sometimes referred to as a gel forming liquid) on a flat support or a cover sheet in a layer or film form, As a polyacrylamide-based aqueous gel medium layer or film in which a monomer (acrylamide compound) and a cross-linking agent are cross-linked and polymerized by irradiation with ultraviolet rays or visible light and / or heating as necessary in the absence of molecular oxygen Manufactured and used.
アクリルアミド系化合物(単量体)と架橋剤は,水溶液
または水分散液として水に溶解または分散させておき,
水中で両者を架橋重合させて,架橋重合した水性ゲル媒
体を形成させる。本明細書においては特にことわらない
かぎり,(水に)溶解と(水に)分散の両者を含めて単
に(水に)溶解といい,水溶液と水分散液の両者を含め
て単に水溶液という。溶媒または分散媒としては,水だ
けでなく,所望により加えられる有機溶媒を含む水−有
機溶媒混合物を包含する。The acrylamide compound (monomer) and the crosslinking agent are dissolved or dispersed in water as an aqueous solution or dispersion.
Both are cross-linked and polymerized in water to form a cross-linked and polymerized aqueous gel medium. Unless otherwise specified, in this specification, both (in water) and (in water) dispersion are simply referred to as (in water) dissolution, and both an aqueous solution and an aqueous dispersion are simply referred to as an aqueous solution. Solvents or dispersion media include water as well as water-organic solvent mixtures containing optionally added organic solvents.
ラジカル重合開始剤組成物としては「Electro−phoresi
s」2(4),213−219(1981),同誌2(4),220−228(1
981),特開昭59-126236,青木,永井編「最新電気泳動
法」(1973年発行)等に記載の低温ラジカル重合開始剤
組成物のうちから適宜に選択して用いることができる。
ラジカル重合開始剤組成物の例として,β−(ジメチル
アミノ)プロピオニトリル(DMDPN)−ペルオクソ二硫
酸アンモニウム混合物;N,N,N′,N′−テトラメチルエ
チレンジアミン(TEMED)−ペルオクソ二硫酸アンモニ
ウム混合物;TEMED−リボフラビン混合物;TEMED−リボ
フラビン−過酸化水素混合物;リボフラビン−ペルオク
ソ二硫酸アンモニウム混合物;リボフラビン−過酸化水
素混合物(リボフラビン等の光増感剤併用の場合には紫
外線又は可視光の照射を併用する)等がある。ラジカル
重合開始剤組成物の添加量は単量体と架橋剤の合計重量
に対して約0.3w%から約5.0w%,好ましくは約0.5w%か
ら約3.0w%の範囲である。The radical polymerization initiator composition is “Electro-phoresi
s ” 2 (4), 213-219 (1981), ibid 2 (4), 220-228 (1
981), JP-A-59-126236, Aoki, Nagai, "Latest Electrophoresis Method" (published in 1973) and the like, and can be appropriately selected and used from low temperature radical polymerization initiator compositions.
Examples of the radical polymerization initiator composition include β- (dimethylamino) propionitrile (DMDPN) -ammonium peroxodisulfate; N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (TEMED) -ammonium peroxodisulfate; TEMED-riboflavin mixture; TEMED-riboflavin-hydrogen peroxide mixture; riboflavin-ammonium peroxodisulfate mixture; riboflavin-hydrogen peroxide mixture (in the case of using a photosensitizer such as riboflavin, UV irradiation or visible light irradiation is also used) Etc. The amount of the radical polymerization initiator composition added is in the range of about 0.3 w% to about 5.0 w%, preferably about 0.5 w% to about 3.0 w%, based on the total weight of the monomer and the crosslinking agent.
ゲル濃度としてS・Hjertrn:「Archives of Biochemistr
y and Biophysics」1(Suppl.),147−151(1962)に
記載の定義に従って表示して,単量体,架橋剤および水
からなるゲル媒体の容積に対して,単量体と架橋剤の合
計量が約3w/v%から約30w/v%の範囲で用いられる。As gel concentration, S · Hjertrn: “Archives of Biochemistr
y and Biophysics ” 1 (Suppl.), 147-151 (1962), the amount of the monomer and the cross-linking agent relative to the volume of the gel medium consisting of the monomer, the cross-linking agent and water is displayed. The total amount used is in the range of about 3 w / v% to about 30 w / v%.
ゲル形成液を平面状支持体(又はカバーシート)の表面
上で架橋重合させる際には,ゲル形成液の流延塗布とそ
の後の架橋重合を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不
存在下で実施するか,あるいは流延塗布したゲル形成液
の表面上に直ちにカバー用フィルム,シートまたは板等
の被覆材料で覆い架橋重合させることが好ましい。この
目的に使用される被覆材料としては前述の平面状支持体
と同様な素材からなるものを用いることができる。カバ
ー用フィルムが有機ポリマーフィルムである場合,その
厚さは約300μm以下であり,実用的な範囲としては約4
μmから約200μm,好ましくは約約4μmから約100μ
mである。被覆材料がガラス板の場合,その厚さは支持
体として用いる平面状ガラス板と同様な厚さのものを用
いることができる。When the gel-forming liquid is cross-linked and polymerized on the surface of the planar support (or cover sheet), the cast-coating of the gel-forming liquid and the subsequent cross-linking polymerization are carried out in the absence of molecular oxygen such as in a nitrogen gas atmosphere. It is preferable to carry out crosslinking polymerization by covering the surface of the gel-forming liquid which has been carried out or is cast and coated immediately with a covering material such as a covering film, sheet or plate. As the coating material used for this purpose, the same material as the above-mentioned planar support can be used. When the cover film is an organic polymer film, its thickness is about 300 μm or less, which is about 4 as a practical range.
μm to about 200 μm, preferably about 4 μm to about 100 μm
m. When the coating material is a glass plate, the same thickness as the flat glass plate used as the support can be used.
一般的にゲル媒体膜のアクリルアミド系化合物し架橋剤
の濃度勾配(ポリアクリルアミド系水性ゲル濃度の勾
配)は核酸試料注入口側に低く,試料流出側に高くなる
ように勾配を設け,ゲル媒体膜の厚さ勾配は,核酸試料
注入口側に薄く,試料流出側に厚くなるような勾配を設
けるのが原則であるが,目的により他の勾配配置を採用
することができることはいうまでもない。本発明のゲル
媒体膜の特徴をなすゲル膜の厚さ及び濃度の勾配(曲線
又は直線)は,サンプル注入端部からの距離に対して,
直線,ゆるく折れた直線,指数関数,対数関数,懸垂
線,追跡線,放物線,双曲線,楕円,3次極線等の関数
で表される漸次的変化の曲線の一部分,その他の任意の
漸次的変化の曲線又は曲線と直線の組合せ等で表される
勾配をもたせることができる。変化させる厚さの範囲は
約50μmから約5mm,好ましくは約80μmから約1000μ
mの範囲である。また,変化させるアクリルアミド系化
合物と架橋剤の濃度勾配(ポリアクリルアミド系水性ゲ
ル濃度の勾配)の範囲は約3w%から約30w%,好ましく
は約4w%から約25w%の範囲である。膜厚勾配と濃度勾
配の組合せとしては上記の勾配のいずれの組合せも可能
であるが,電気泳動方向に沿って距離とともに膜厚を漸
次的に単調に増加させかつ濃度を漸次的に単調に減少さ
せる組合せ,膜厚を途中まで実質的に一定にし途中から
増加させかつ濃度を途中まで減少させ途中から実質的に
一定にする組合せ,膜厚を漸次的に単調に減少させ,か
つ濃度を漸次的に単調に増加させる組合せ,膜厚を途中
まで減少させ途中から実質的に一定にしかつ濃度を途中
まで実質的に一定にし途中から増加さる組合せが好まし
い。また,サンプル注入部分の形状は,長方形状,正方
形状,三角形状(シャークスティース状),円形状等公
知の形状から選択して設けることができる。Generally, the concentration gradient of the acrylamide compound and the cross-linking agent in the gel medium membrane (polyacrylamide aqueous gel concentration gradient) is low on the nucleic acid sample injection side and high on the sample outflow side. As a general rule, the thickness gradient of 3 is provided on the inlet side of the nucleic acid sample and thicker on the outflow side of the sample, but it goes without saying that other gradient arrangements can be adopted depending on the purpose. The gel film thickness and concentration gradient (curve or straight line) that characterize the gel medium film of the present invention are as follows with respect to the distance from the sample injection end.
A portion of a curve of gradual change represented by a function such as a straight line, a loosely bent line, an exponential function, a logarithmic function, a catenary, a tracing line, a parabola, a hyperbola, an ellipse, and a cubic pole line, and any other gradual It is possible to have a gradient represented by a curve of change or a combination of a curve and a straight line. The range of thickness to be changed is about 50 μm to about 5 mm, preferably about 80 μm to about 1000 μm.
The range is m. Further, the range of the concentration gradient (gradient of polyacrylamide type aqueous gel concentration) of the acrylamide compound and the cross-linking agent to be changed is in the range of about 3 w% to about 30 w%, preferably about 4 w% to about 25 w%. Although any combination of the above gradients is possible as the combination of the film thickness gradient and the concentration gradient, the film thickness gradually increases monotonically and the concentration gradually decreases monotonically with the distance along the electrophoresis direction. The combination that makes the film thickness substantially constant in the middle and increases from the middle and decreases the concentration in the middle to become substantially constant in the middle, gradually decreases the film thickness monotonically and gradually increases the concentration. A combination of monotonically increasing, a combination of decreasing the film thickness halfway and making it substantially constant from the middle, and making the concentration substantially constant halfway and increasing from the middle is preferable. Further, the shape of the sample injection portion can be selected and provided from known shapes such as a rectangular shape, a square shape, a triangular shape (shark's teeth shape) and a circular shape.
ゲル媒体膜に膜厚勾配を設ける方法としては,平面状支
持体に予め定められた,制御された漸次的な厚さ変化
(層厚勾配又は膜厚勾配)にほぼ相当する厚さ変化を有
するスペーサ板を固定し,スペーサ板にそってカバー用
被覆材料(シート状物)で覆ったモールド内部にゲル形
成液を流し込み架橋重合させる方法,予め定められた漸
次的な厚さ変化に相当する厚さ変化を有する平面状支持
体(又はカバーシート)の表面に一定厚さのスペーサー
板を固定し,スペーサ板にそってカバー用被覆材料(支
持体)で覆ったモールド内部にゲル形成液を流し込み架
橋重合させる方法,予め定められた漸次的な厚さ変化に
相当する厚さ変化を有する平面状支持体(又はカバーシ
ート)の表面にゲル形成液を流延し,窒素ガス雰囲気中
等の分子状酸素の不存在下で架橋重合させる方法,予め
定められた漸次的な厚さ変化に対応するように,単位時
間当りの流量を制御(ゲル膜厚さの薄い領域では流量を
少く,厚さの厚い領域では流量を多くする)しながら,
平面状支持体(又はカバーシート)の表面にゲル形成液
を流延塗布し,窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存
在下で架橋重合させる方法等を適用することができる。
予め定められた漸次的厚さ変化を有する平面状支持体
は,モールドカスティング法,ケミカルエッチング法,
切削法等の公知の技術により調製されたものを用いるこ
とができる。流量を制御しながら支持体(又はカバーシ
ート)に流延塗布する場合には,スペーサー板の厚さ変
化は必ずしもゲル膜の予め定められた漸次的な厚さ変化
に相当していなくともよい。また,ゲル媒体の膜厚勾配
をゲル膜の幅全体に設けずに,サンプルを電気泳動させ
るレーンの領域より僅かに広い幅の領域にだけレーンの
数に対応させて設け,残余の領域は実質的に厚さ一定に
することもできる。この態様は漸次的厚さ変化を有する
平面状支持体又はカバーシートを用いる態様において有
利に実施できる。As a method of providing a film thickness gradient to the gel medium film, there is a thickness change substantially equivalent to a predetermined controlled gradual thickness change (layer thickness gradient or film thickness gradient) on the planar support. A method in which the spacer plate is fixed and the gel forming liquid is poured into the mold covered with the cover coating material (sheet-like material) along the spacer plate to cross-link and polymerize, and a thickness corresponding to a predetermined gradual change in thickness. A spacer plate with a certain thickness is fixed on the surface of a flat support (or cover sheet) with varying thickness, and a gel forming liquid is poured into the mold covered with the cover material (support) along the spacer plate. Method of cross-linking polymerization, casting a gel-forming liquid on the surface of a flat support (or cover sheet) having a thickness change corresponding to a predetermined gradual thickness change, No oxygen Controlling the flow rate per unit time so as to correspond to the method of cross-linking polymerization under existing conditions and the predetermined gradual thickness change (the flow rate is small in the region where the gel film thickness is thin, and the flow rate is in the region where the gel thickness is thick). While increasing)
It is possible to apply a method in which a gel-forming liquid is cast on the surface of a flat support (or a cover sheet) and cross-linked and polymerized in the absence of molecular oxygen such as in a nitrogen gas atmosphere.
A flat support having a predetermined gradual thickness change is formed by a mold casting method, a chemical etching method,
A material prepared by a known technique such as a cutting method can be used. When casting is applied on the support (or cover sheet) while controlling the flow rate, the change in thickness of the spacer plate does not necessarily correspond to the predetermined gradual change in thickness of the gel film. In addition, the thickness gradient of the gel medium is not provided over the entire width of the gel film, but is provided only in a region slightly wider than the region of the lane in which the sample is electrophoresed, corresponding to the number of lanes. It is also possible to keep the thickness constant. This embodiment can be advantageously carried out in an embodiment using a planar support or cover sheet having a gradual thickness change.
ゲル媒体膜にゲル濃度勾配を設ける方法としては,堀
尾,山下編「蛋白質・酵素の基礎実験法」(南江堂,19
81年発行)304−308頁,特開昭54-43881に記載の方法の
ように,単量体(アクリルアミド),架橋剤,重合開始
剤組成物を相対的に高濃度で含む水溶液の入った容器と
単量体(アクリルアミド),架橋剤,重合開始材組成物
を相対的に低濃度で含む水溶液の入った容器を導管で連
結し(高濃度水溶液容器を低濃度水溶液容器と同じ高さ
又は低濃度水溶液容器より相対的に高い位置に配置す
る),低濃度水溶液容器からポンプを経由して流延塗布
装置に導管で連結した装置を用いる方法がある。この装
置を用いる場合,低濃度水溶液を攪拌しながら低濃度水
溶液容器から溶液を送り出すと同時に重力によって高濃
度水溶液が低濃度水溶液容器に移動し,常に両液の液高
を等しく保持することによって,低濃度水溶液の濃度が
次第に高くなり,流延塗布装置においてアクリルアミド
と架橋剤の濃度勾配が発現し,架橋重合後に所望のゲル
濃度勾配が得られる。As a method of providing a gel concentration gradient in a gel medium film, edited by Horio and Yamashita, “Basic Experimental Methods for Proteins and Enzymes” (Nankodo, 19
(Issued in 1981), pages 304-308, as described in JP-A-54-43881, an aqueous solution containing a monomer (acrylamide), a cross-linking agent, and a polymerization initiator composition in a relatively high concentration was added. A container and a container containing an aqueous solution containing a monomer (acrylamide), a cross-linking agent, and a polymerization initiator composition at a relatively low concentration are connected by a conduit (a high-concentration aqueous solution container is at the same height as the low-concentration aqueous solution container or There is a method of using a device which is arranged at a relatively higher position than the low-concentration aqueous solution container) and which is connected from the low-concentration aqueous solution container via a pump to a casting coating device by a conduit. When this device is used, the high-concentration aqueous solution is moved to the low-concentration aqueous solution container by gravity at the same time as the solution is sent from the low-concentration aqueous solution container while stirring the low-concentration aqueous solution, and the liquid heights of both liquids are always kept equal. The concentration of the low-concentration aqueous solution gradually increases, and the concentration gradient of acrylamide and the cross-linking agent appears in the casting apparatus, and the desired gel concentration gradient is obtained after the cross-linking polymerization.
本発明のゲル媒体膜は公知のポリアクリルアミド系水性
ゲル媒体膜と同様にして調製することができる。また,
本発明のゲル媒体膜は前述の諸文献や特許明細書等に記
載の公知の方法に従って,水平型及び垂直型スラブ電気
泳動法等に用いることができる。The gel medium membrane of the present invention can be prepared in the same manner as a known polyacrylamide-based aqueous gel medium membrane. Also,
The gel medium film of the present invention can be used for horizontal and vertical slab electrophoresis and the like according to known methods described in the above-mentioned documents and patent specifications.
実施例1及び比較例1 表面を紫外線照射処理で親水性にした平滑表面の厚さ18
0μm,サイズ20cm×40cmの長方形の無色透明ポリエチ
レンテレフタレート(PET)シート(支持体)の長辺に
沿った両縁辺部に一定厚さ300μmで幅10mm×長さ40cm
のスペーサー板を接着固定した。この支持体の上に第1
表A,Bに記載の組成の2種類のゲル形成液を発明の詳細
な説明の欄に記載の公知の濃度勾配形成装置で混合しな
がら,ゲル形成液膜の厚さが150μmから300μmになる
ような範囲で流量を制御して支持体上のゲル形成液膜の
厚さを変化させながら窒素ガス雰囲気中で流延塗布し,
各ゲル形成液膜に窒素ガス雰囲気中で500Wキセノン放電
灯を照射して架橋重合させ,ついで形成されたゲル膜の
上に厚さ63μm,サイズ20cm×40cmの長方形の無色透明
PETシートをカバーシートとして密着積層して第1図及び
第2図に示したゲル断面の厚さ変化及びゲル濃度変化を
有するポリアクリルアミド水性ゲル膜2種を調製し
た。Example 1 and Comparative Example 1 A smooth surface having a surface made hydrophilic by ultraviolet irradiation treatment has a thickness of 18
0 μm, rectangular 20 cm x 40 cm rectangular transparent and colorless polyethylene terephthalate (PET) sheet (support) along both long sides with a constant thickness of 300 μm and width of 10 mm x length of 40 cm
The spacer plate of was fixed by adhesion. 1st on this support
The thickness of the gel forming liquid film is changed from 150 μm to 300 μm while mixing the two gel forming liquids having the compositions shown in Tables A and B with the known concentration gradient forming device described in the detailed description of the invention. While controlling the flow rate in such a range to change the thickness of the gel-forming liquid film on the support, cast coating in a nitrogen gas atmosphere,
Each gel-forming liquid film is irradiated with a 500W xenon discharge lamp in a nitrogen gas atmosphere to cross-link and polymerize, and then a rectangular colorless transparent film having a thickness of 63 μm and a size of 20 cm × 40 cm is formed on the formed gel film.
A PET sheet as a cover sheet was adhered and laminated to prepare two polyacrylamide aqueous gel membranes having the gel cross-section thickness change and gel concentration change shown in FIGS. 1 and 2.
一方,ゲル形成液の流量をゲル形成膜の厚さが200μm
になるように一定にしたほかは実施例1と同様にして一
定の厚さ200μmでゲル濃度勾配だけを有するゲル膜
(比較例1-1),及び第1表Cに記載の組成のゲル形成液
を用いゲル形成液膜の厚さが200μmになるように一定
にしたほかは実施例1と同様にして一定の厚さ200μm
で一定のゲル濃度を有するゲル膜(比較例1-2)を調
製した。On the other hand, the flow rate of the gel forming liquid is 200 μm when the thickness of the gel forming film is 200 μm.
A gel film having a constant thickness of 200 μm and having only a gel concentration gradient (Comparative Example 1-1), and gel formation of the composition shown in Table 1C A constant thickness of 200 μm was obtained in the same manner as in Example 1 except that the thickness of the gel forming liquid film was fixed to 200 μm using a liquid.
A gel film (Comparative Example 1-2) having a constant gel concentration was prepared.
ゲル膜(第1図): 厚さ最小(泳動方向始端部)150μmから直線状に増大
して最大(泳動方向終端部)300μm;ゲル濃度最大
(泳動方向始端部)約20%からほぼ円弧の一部状に減小
して最小(泳動方向終端部)約6.0%. ゲル膜(第2図): 厚さ最大(泳動方向始端部)300μmから直線状に減少
して最小(泳動方向終端部)150μm;ゲル濃度最小
(泳動方向始端部)約6.0%からほぼ直線状に増大して
最大(泳動方向終端部)約20%. ゲル膜(第3図): 厚さ200μmで一定;ゲル濃度最小(泳動方向始端部)
約6.0%からほぼ直線状に増加して最大(泳動方向終端
部)約20%. ゲル膜(第4図): 厚さ200μmで一定;ゲル濃度約8.0%で一定. 得られた4種のゲル膜を用いてDNA塩基配列解析の実験
をM13−mp8DNAに対してジデオキシ法により調製されたD
NAフラグメントサンプルを用いて常法に従い実施した。
その結果,本発明の厚さグラジエントとゲル濃度グラジ
エントの組合せを有するゲル膜では読み取り可能な塩基
フラグメントの範囲は次のとおりであった。Gel film (Fig. 1): linearly increasing from minimum thickness (starting part in migration direction) of 150μm to maximum (end part in migration direction) 300μm; maximum gel concentration (starting part in migration direction) from about 20% to almost arc It is partially reduced to the minimum (end of migration direction) of about 6.0%. Gel film (Fig. 2): The maximum thickness (starting part in the migration direction) is reduced from 300 μm to a linear shape and the minimum (end part in the migration direction) is 150 μm; The minimum gel concentration (starting part in the migration direction) is approximately 6.0% and almost linear. Up to about 20%. Gel membrane (Fig. 3): Constant at a thickness of 200 μm; minimum gel concentration (starting portion in migration direction)
Increased almost linearly from about 6.0% to the maximum (end of migration direction) about 20%. Gel film (Fig. 4): constant at a thickness of 200 μm; constant at a gel concentration of about 8.0%. Using the obtained 4 kinds of gel membranes, the DNA sequence analysis experiment was performed on M13-mp8 DNA by D prepared by the dideoxy method.
The NA fragment sample was used to carry out according to a conventional method.
As a result, the range of readable base fragments in the gel film having the combination of the thickness gradient and the gel concentration gradient of the present invention was as follows.
ゲル膜60〜250番 ゲル膜60〜240番 かつ各レーンでの塩基フラグメントの泳動像の幅と間隔
は読み取れる範囲内で極端に狭まることはなかった。Gel membrane Nos. 60 to 250 Gel membranes No. 60 to 240 The width and interval of the electrophoretic image of the base fragment in each lane did not become extremely narrow within the readable range.
それに対して従来技術である厚さ一定でゲル濃度勾配だ
けを有するゲル膜と厚さ一定ゲル濃度一定のゲル膜
ではその読み取り可能範囲は次のとおりであった。On the other hand, the readable range of the conventional gel film having a constant thickness and only a gel concentration gradient and the gel film having a constant thickness and a constant gel concentration were as follows.
ゲル膜60〜220番 ゲル膜60〜200番 ゲル膜においては各レーンでの塩基フラグメントの泳
動像の幅と間隔は低分子量部分から高分子量部分に至る
につれて次第に狭まっていた。Gel Membrane No. 60-220 Gel Membrane No. 60-200 In the gel membrane, the width and interval of the electrophoretic image of the base fragment in each lane gradually narrowed from the low molecular weight portion to the high molecular weight portion.
この結果から本発明の厚さグラジエントとゲル濃度グラ
ジエントの組合せを有するポリアクリルアミド水性ゲル
電気泳動用媒体膜は核酸塩基フラグメントの低分子量部
分から高分子量部分まで広い分子量範囲にわたってほぼ
一様にレーンでの間隔が維持されていて良好な分離が得
られ,かつ読み取り可能な塩基フラグメントの数が多
く、精度の高いDNA塩基配列解析を行うことができるこ
とが明らかになった。From this result, the polyacrylamide aqueous gel electrophoresis medium membrane having the combination of the thickness gradient and the gel concentration gradient of the present invention shows that the nucleobase fragment has a uniform lane distribution over a wide molecular weight range from a low molecular weight portion to a high molecular weight portion. It was clarified that the separation was maintained, good separation was obtained, and the number of readable base fragments was large, enabling highly accurate DNA base sequence analysis.
第1図と第2図は実施例1の本発明の厚さグラジエントと
ゲル濃度グラジエントの組合せを有するゲル膜及び
の電気泳動方向に沿う漸次的な厚さ変化(膜厚勾配)及
び漸次的なゲル濃度変化(濃度勾配)を示す断面模式図
である。 第3図は従来技術である比較例1-1の厚さ一定でゲル濃度
グラジエントを有するゲル膜の電気泳動方向に沿う一
定厚さ及び漸次的なゲル濃度変化(濃度勾配)を示す断
面模式図である。 第4図は従来技術である比較例1-2の厚さ一定でゲル濃度
一定のゲル膜の電気泳動方向に沿う一定の厚さ及びゲ
ル濃度を示す断面模式図である。1 and 2 show a gradual thickness change (film thickness gradient) along the electrophoretic direction and a gradual change in thickness of a gel film having a combination of the thickness gradient and the gel concentration gradient of the present invention of Example 1. It is a cross-sectional schematic diagram which shows gel concentration change (concentration gradient). FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing a constant thickness along the electrophoresis direction and a gradual gel concentration change (concentration gradient) of a gel film having a constant thickness and a gel concentration gradient in Comparative Example 1-1, which is a conventional technique. Is. FIG. 4 is a schematic sectional view showing a constant thickness and gel concentration along the electrophoresis direction of a gel film having a constant thickness and a constant gel concentration in Comparative Example 1-2 which is a conventional technique.
Claims (6)
在下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル
及び変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基を含
む化合物を含む電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状
支持体と平面状カバーシートとの間に設けてなる電気泳
動用媒体膜において,前記ゲル媒体層が電気泳動方向に
沿う漸次的な厚さの変化及び電気泳動方向に沿う漸次的
なポリアクリルアミド系水性ゲル濃度の変化を併せて有
することを特徴とする電気泳動用媒体膜。1. A layer comprising an electrophoretic gel medium containing a polyacrylamide aqueous gel obtained by cross-linking and polymerizing an acrylamide compound and a cross-linking agent in the presence of water, and a gel medium for electrophoresis containing a compound containing at least one carbamoyl group as a modifier. In an electrophoretic medium film comprising a flat support and a flat cover sheet, the gel medium layer has a gradual change in thickness along the electrophoresis direction and a gradual change along the electrophoresis direction. An electrophoretic medium film having a polyacrylamide-based aqueous gel concentration change together.
有機ポリマーからなるシート状物である特許請求の範囲
第1項に記載の電気泳動用媒体膜。2. The electrophoretic medium film according to claim 1, wherein both the support and the cover sheet are sheet-like materials made of an organic polymer.
ポリエチレンテレフタレートからなるシート状物である
特許請求の範囲第2項に記載の電気泳動用媒体膜。3. The electrophoretic medium film according to claim 2, wherein both the support and the cover sheet are sheet-like materials made of polyethylene terephthalate.
む化合物が尿素である特許請求の範囲第1項に記載の電
気泳動用媒体膜。4. The electrophoretic medium film according to claim 1, wherein the compound containing at least one carbamoyl group is urea.
る特許請求の範囲第1項に記載の電気泳動用媒体膜。5. The electrophoresis medium film according to claim 1, wherein the gel medium further contains agarose.
まれる特許請求の範囲第1項に記載の電気泳動用媒体
膜。6. The electrophoretic medium film according to claim 1, wherein the gel medium further contains a water-soluble polymer.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62177978A JPH0652254B2 (en) | 1987-07-16 | 1987-07-16 | Electrophoretic medium film |
US07/604,358 US5190629A (en) | 1987-07-16 | 1990-10-26 | Electrophoresis medium membrane |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62177978A JPH0652254B2 (en) | 1987-07-16 | 1987-07-16 | Electrophoretic medium film |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPS6421345A JPS6421345A (en) | 1989-01-24 |
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Family
ID=16040400
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6291848A (en) * | 1985-10-17 | 1987-04-27 | Fuji Photo Film Co Ltd | Supporting medium for electrophoresis for determining base sequence of nucleic acid and supporting substrate thereof |
-
1987
- 1987-07-16 JP JP62177978A patent/JPH0652254B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6421345A (en) | 1989-01-24 |
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