JPH06506204A - 神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、または回復させるためのデプレニールの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、または回復させるためのデプレニールの 使用 本出願は、１９９１年４月４日付は出願の米国特許出願０７／６７８．８７３号 の一部継続出願である１９９１年８月２６日付は出願の米国特許出願０７／７５ １．１８６号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、動物において神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／または 回復させるためのデプレニールまたはダブリニールの誘導体もしくは類似体の。

使用：かかる使用に適したデプレニールを含有する医薬組成物：および、神経細 胞機能を維持し、喪失を防止し、または回復させることによる神経系の障害の治 療方法に関する。また、本発明は、動物において神経細胞機能の維持、喪失の防 止および／または回復において、薬物の活性につき該薬物をテストする方法に関 する。

発明の背景 ダブリニールは、最初、選択的モノアミンオキシダーゼ−Ｂ　（ＭＡＯ−Ｂ）阻 害剤として、脳ドーパミンのレベルを上昇させ、Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）か う形成されるドーパミンの薬理学的作用を増強させるが、非選択的ＭＡＯ阻害剤 で観察されるチアミン昇圧剤効果を妨げることに基づき、１０年前から、欧州に おいて、パーキンソン病（ＰＤ）の通常の薬物療法（Ｌ−ンヒドロキシフェニル アラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）十末梢デカルボキシラーゼ阻害剤）に対する付加薬剤 として使用されてきた。組み合わせた薬物療法は、Ｌ−ＤＯＰＡの抗−無動原体 効果を遅延さ也その結果、ＰＤ患者において、オン−オフ効果の消失、機能的不 能の減少、および寿命の増大を生じると報告された（ベルンハイマー・エイチ（ Ｂｅｒｎｈｅｉｍｅｒ、　Ｅｌ、　）ら、ジャーナル・オフ・ニューロロジカル ・サイエンス０、Ｎｅｕｒｏｌｏｇ、　Ｓｃｉ、）、１９７３．２０：４１５− ４５５頁、パークマイヤー・ダブリュー（Ｂｉｒｋｍａｙｅｒ、　ｆ、　）ら、 ジャーナル・オフ・ニューラル・トランズム（Ｊ。

Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｍ、　）、１９７５　３６：３０３−３３６頁、パー クマイヤー・ダブリュー　（Ｂｉｒｋｍａｙｅｒ、　１．　）ら、モト・プロブ ・メチルマコサイキアトル（Ｍｏｄ、　Ｐｒｏｂ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ、　）、１９８３　１９：１７０−１７７ 頁、パークマイヤー・ダブリューおよびビイ・リーデレル（Ｂｉｒｋｍａｙｅｒ 、ｆ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｒｉｅｄｅｒｅｒ）、ハスラー・アール・シイおよびシ エイ・エフ・クリスト（Ｈａｓｓｌｅｒ、Ｒ，Ｇ、　ａｎｄ　Ｊ、ＦＣｈｒｉｓ ｔ）編、アドバーンノズ・イン・二、−ｏｏン−（＾ｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｎ ｅｕｒｏｌｏｇｙ）、１９８４　４０　（Ｙ）：Ｑ〜８９００４頁、およびパー クマイヤー・ダブリュー（Ｂｉｒｋｍａｙｅｒ、　Ｗ、　）、ジャーナル・オフ ・ニューラル・トランズム（Ｊ、　ＮｅｕｒａｌＴｒａｎｓｍ、　）、１９８５ ．６４　（２）：１１３〜１２８頁）。

通常のＬ−ＤＯＰＡ療法に対する付加薬物としてのダブリニールの研究は、通常 １年またはそれ未満までに喪失した短期間の利点を報告している。すべての者で はないが、一部の者は、レボドパ用量は、ダブリニールと組み合わせて摂取した 場合に、減少させることができることを報告している（エリザン・ティ・ニス（ Ｅｌｉｚａｎ、　Ｔ、　Ｓ、　）ら、アーキ・ニューロル（Ａｒｃｈ　Ｎｅｕｒ ｏｌ）　、１９８９　４６　（１２）１２８０−１２８３頁、ピッンヤー・ビイ ・エイおよびエイチ・パース（Ｆｉｓｃｈｅｒ、　Ｐ＾、　ａｎｄ　Ｈ，Ｂａａ ｓ）、ジャーナル・オフ・ニューラル・トランズム（Ｊ。

Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｍ、　）　（補稿）、１９８７　２５：１３７−１４ ７頁、ゴルベ・エル・アイ（Ｇｏｌｂｅ、　Ｌ、　１．　）、二、−ｏロノー（ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、１９８９　３９：１１０９１１１１頁、リーバ−マン・ エイ・エフ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、＾Ｎ、）ら、ニューヨーク・ステイト・ジャ ーナル・オフ・メト（Ｎ、　Ｙ、　５ｔａｔｅ　Ｊ、　１ｌｅｄ、　）、１９８ ７　８７：６４６−６４９頁、ポウエ・ダブリュー、エフ・ゲルステルンブラン ド、およびシイ・ランツマイヤー（Ｐｏｅｖｅ、　ｆ、　、　Ｆ、　Ｇｅｒｓｔ ｅｎｂｒａｎｄ、　ａｎｄ　Ｇ、　Ｒａｎｓｏｍａｙｅｒ）、ジャーナル・オフ ・ニューラル・トランズム（Ｊ、　Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｍ、　）　（補稿 ）、１９８７２５　：１３７−１４７頁、セダルバウム・ジエイ・エム、エム・ ヘイ、およびエフーエイチ・マクドウエル（Ｃｅｄａｒｂａｕｍ、Ｊ、　Ｍ、　 、　Ｍ、　Ｈｏｅｙ、　ａｎｄ　Ｆ、　Ｈ，ＭｃＤｏｖｅｌｌ）、ジャーナル・ オフ・ニューロサージエリ−・サイキフトリー（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｌ　Ｎｅｕｒ ｏｓｕｒｇＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ）、１９８９　５２　（２）：２０７−２１２ 頁、およびゴルベ・エル・アイ、ンエイ・ダブリュー・ラングストン、およびア イ・ンヨルラン（Ｇｏｌｂｅ、　Ｌ。

１、ｊ、Ｗ、Ｌａｎｇｓｔｏｎ、ａｎｄ　１．５ｈｏｕｌｓｏｎ）、ドラッグズ （Ｄｒｕｇｓ）、１９９０　３９（５）６４６−６５１頁）。

デプレニールはパーキンソン病の進行を遅延させるという報告（パーキンソン・ ニス゛シイ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、　Ｓ、　Ｇ、　）、アーキ’：−ユ　Ｏル（ Ａｒｃｈ　Ｎｅｕｒｏｌ）　４６．１゜５２−１０６０　（１９８９）およびニ ー　−ニス−エイ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、ビイ・ニス・シイ　ニュー・イング ランド・ジャーナル・オフ・メディンン（Ｐ、Ｓ、Ｇ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　）、３２１．１３６４−１３７１　（１９８９））により、同 病気の患者に徐々に投与されているが、その作用を説明する満足すべきメカニズ ムは提案されていない。

デプレニールをパーキンソン病（ＰＤ）で使用することの支持は、ダタトツブ（ ＤＡＴＡＴＯＰ）プロジェクト（パーキンソン・ニス・シイ（Ｐａｒｋｉｎｓｏ ｎ、　Ｓ、　Ｇ、　）、アーキ＋：、−Ｃｌル（Ａｒｃｈ　Ｎｅｕｒａｌ）　４ ６．１０５２−１０６０　（１９８９）およびニー・ニス・エイ（Ｌｌ、　Ｓ、 　Ａ、　）、ビイ・ニス・シイ　ニュー・イングランド・ジャーナル・オフ・メ ディシン（Ｐ、Ｓ、Ｇ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、Ｍｅｄ、）、３２１．１３６ ４−１３７１　（１９８９）　）の知見に大いに基づくものである。この多中心 的研究は、デプレニールは、能力障害症候群の開始を遅らせ、はぼ１年までのさ らなる薬理学的治療を必要とすることを報告しており：これらの知見は少数の研 究を除き独立して再度生まれている（テトルド・ジエイ・ダブリューおよびラン グストン・ジエイ・ダブリュー　（Ｔｅｔｒｕｄ、　Ｊ、　？、　＆　Ｌａｎｇ ｓｔｏｎ　Ｊ、　１．　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４５．５１９− ５２２　（１９８９））。不幸にも、ダタトツブ（ＤＡＴＡＴＯＰ）研究のデザ インおよびその結論は、強烈な批判の対象となった（ランダウ・ダブりニー・エ ム（Ｌａｎｄａｕ、　ｆ、　Ｍ、　）、二、　−ｏ　ロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇ ｙ）　４０．１３３７−１３３９　（１９９０））。さらに、これらのプロジェ クトの著者らは、その結果は、ダブリニールがＰＤの進行を遅らせるという仮説 （パーキンソン・ニス・シイ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ。

Ｓ、　Ｇ、　）、アーキ・ニューロル（Ａｒｃｈ　Ｎｅｕｒｏｌ）　４６．１０ ５２−１０６０　（１９８９）、ニー・ニス・エイ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、ビ イ・ニス・シイ　ニュー・イングランド・ジャーナル・オフ・メディノン（Ｐ、 Ｓ、Ｇ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、Ｍｅｄ、）、３２１．１３６４−１３７１　 （１９８９）およびテトルド・ジェイ・ダブリューおよびラングストン・ジエイ ・ダブリュー　（Ｔｅｔｒｕｄ、　Ｊ、　？、　＆　Ｌａｎｇｓｔｏｎ、　Ｊ、 　Ｗ、　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２＝４９．３０３−３０４　（１９ ９０）　）と一致するが、「彼らは決して証明していない」と述べている（テト ルド・ジェイ・ダブリューおよびラングストン（Ｔｅｔｒｕｄ、　Ｊ、　Ｗ、　 ＆　Ｌａｎｇｓｔｏｎ、　Ｊ、　Ｗ、　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２ ４９．３０３−３０４　（１９９０）　）。

デプレニールは霊長類においてＭＰＴＰ−誘発神経毒をブロックするという観察 （ラングストン・ノエイーダブリュー、フォルノ・エル・ニス、ロバート・シイ ーエスおよびイルウィン・アイ（Ｌａｎｇｓｔｏｎ、　Ｊ　、　Ｗ、　、　Ｆｏ ｒｎｏ、　Ｌ、　Ｓ、　、　Ｒｏｂｅｒｔ、　Ｃ，Ｓ、　■ Ｉｒｖｉｎ、　１．　）、プレイン・リサーチズ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）２ ９２．３９０−３９４　（１９８４））およびＭＰＴＰのそれと類似の作用メカ ニズムを伴う他の環境毒素はＰＤの病因と関連し得る（タソナー・シイ・エム（ Ｔａｎｎｅｒ、　Ｃ，Ｍ、　）、ティ・アイ・エフ・ニス（ＴＩＮＳ）　１２． ４９−５４　（ｉ９８９））という仮説に基づき、生存しているドーパミン作動 性黒画線状体（ＤＮＳ）ニューロンのフリーラジカル誘発死滅を最小化すること によって、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤であるダブリニールは、ＰＤの進行を遅延し得ると 提案されている（ラングストン・シエイ・ダブリュー（Ｌａｎｇｓｔｏｎ、　Ｊ 、　Ｌ　）、パーキンラング・ディンーズ・アンド・ムーブメント・ディスオー ダーズ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’　ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｍｏｖｅｍｅｎ ｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）　（ヤニコヒック・ンエイ・アンド・トロサ・イー（ Ｊａｎｋｏｖｉｃ、Ｊ、　＆丁ｏ１ｏｓａ、　Ｅ、編）７５−８５　（アーバン およびンユバ）Ｖ７ｓ：’ベルブ（Ｕｒｂａｎ　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂ ｅｒｇ）、バルチモアーミューニノヒ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ−Ｍｕｎｉｃｈ）　 １９８８　）　ｏしかしながら、ＭＡＯ−Ｂはドーパミン作動性ニューロンには 存在しないため（ビンセント・ニス・アール（Ｖｉｎｃｅｎｔ。

Ｓ、　Ｒ）、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）　２８．１８９ −１９９　（１９８９）、ビンタリ・ノエイ・イー（Ｐｉｎｔａｒｉ、　Ｊ、　 Ｅ、　）ら、プレイン・リサーチズ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ。

）２７６．１２７−１４０　（１９８３）　、ウェストランド・ケイ・エフ、デ エイ・アール−，１ム（ｆｅｓｔｌｕｎｄ、　Ｋ、　Ｎ、　、Ｄｅｎｎｅｙ、　 Ｒ，Ｍ、）　、コヘルスペルゲル・エル・エム（Ｋｏｃｈｅｒｓｐｅｒｇｅｒ　 Ｌ、　Ｍ。）、ローズ・アール・エムおよびアベル・シイ・ダブリュー　（Ｒｏ ｓｅ、Ｒ，Ｍ、　＆＾ｂｅ１１．ｃ、？、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　 （ワシントン・ディーシー（ｌａｓｈ、　Ｄ、　Ｃ，））　２３０．１８１−１ ８３　（１９８５）およびウェストランド・ケイ・エフ、デエイ・アール・エム 、ローズ・アール・エムおよびアベル・シイ・ダブリュー、ニューロサイエンス （Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）　２５．４３９−４５６　（１９８８）、ＭＰＴ Ｐのそれと同様の方法で、ＤＮＳニューロンを損傷し得るドーパミン非作動性ニ ューロンで他の高毒性化合物が形成されるのでないならば、その阻害はどのよう にしてＤＮＳニューロンを保護するのかは不明確である。驚くべくことに、いず れの研究も、ＭＰＴＰが中枢神経系からクリアランスされた後に測定した場合、 デプレニールがニューロンの生き残りに影響するか否かを決定するための、ＤＮ Ｓニューロン数の測定を含んでいない。

発明の概要 広く、本発明は、動物において神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／ または回復させるための、デプレニールまたはデプレニールの誘導体もしくは類 似体の使用に関する。

また、本発明は、有効成分としてのデプレニールオたはダブリニールの誘導体も しくは類似体よりなる神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、または回復させる ことによる神経系の障害の治療に用いる医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、デプレニールまたはダブリニールの誘導体もしくは類似体の 有効量を患者に投与することを特徴とする神経細胞機能を維持し、喪失を防止し 、または回復させることによる神経系の障害を治療する方法に関する。

また、本発明は、患者において神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／ または回復させることにおいて活性につき薬物をテストする方法に関する。

本発明の１具体例において、神経毒活性を有する薬剤をテスト動物に投与し：薬 物を該テスト動物に投与し、該薬剤の投与の完了の２０日間以内に該テスト動物 を犠牲にし、黒画緻密体を通じて脳の連続区画を採取し：該黒画緻密体を通じて 脳の別の連続区画におけるチロ／ンヒドロキシラーセ陽性細胞体数を測定し５、 および介在する連続区画におけるニソスル小体染色陽性黒画緻密体数を測定し。

次いて、測定したチロシンヒトロキ／ラーゼ陽性細胞体およびニノスル小鉢染色 細胞体の数を、該薬物を投与されていない対照動物の黒画緻密体を通じての脳の 連続区画におけるチロ７ンヒドロキシラーゼ陽性細胞体およびニラスル小体細胞 体の数と比較することを特徴とする患者において神経細胞機能を維持し、喪失を 防止し、および／′または回復させることにおいて活性につき該薬物をテストす る方法が提供される。

本発明のもう１つの朝様において、テスト動物に対して軸索切断を施し、テスト 動物に薬物を投与し、軸索切断の部位からの組織学的区画についてコリンアセチ ルトランスフェラーゼ陽性細胞体の数を測定し、測定したコリンアセチルトラン スフェラーゼ陽性細胞体の数を、該薬物を投与１−でいない対照動物における軸 索切断の部位からの連続区画におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ陽性細 胞体の数と比較することを特徴とする患者において神経細胞機能を維持し、喪失 を防止し、および／または回復させることにおいて活性につき該薬物をテストす る方法が提供される。

図面の簡単な説明 添付図面を参照し、後記する実施例の助けを借りて、本発明の詳細な説明する。

かかる図面において、図１は、Ｍ　Ｐ　Ｔ　Ｐの投与後における黒画緻密体（Ｓ Ｎｃ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性（ＴＨ十）ニューロンの数を 示すグラフである。

図２は、セーラインのみでの処理した（ＡＩ、Ａ２、Ａ３）　、ＭＰＴＰ−セー ラインで処理した（Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３）およびＭＰＴＰ−デプレニールで処理し た動物（ＣＩ、Ｃ２、Ｃ３）について、直ぐに隣接する区画の対応する領域から のＴＨ＋およびニラスル小体染色ＳＮｃ細胞体のカウントのジヨイント・プロッ トであり、データは、ＭＰＴＰ処理の２０日後において各群における３匹の動物 からプールしたものである。

図３は、核全体を通じての別の１０ミクロン連続区画から採取した個々の代表的 なＳＮｃ核についての、ＴＨ＋　ＳＮＣニューロンの累積カウント一対−区画数 を示すグラフである。

図４は、ＭＰＴＰ、ＭＰＴＰ−セーラインおよびＭＰＴＰ−ダブリニール処理マ ウスについての平均値およびＳＥＭ値を示すグラフである。

図５は、ＭＰＴＰを注射したマウスについての運動活性のスペクトル分析を示す 。

図６は、セーライン注射マウスからのＬＤおよびＤＤプレ注射対照期間について の高分解用カスベクトルを示す。

図７は、対照およびＭＰＴＰマウスについての高分解出カスベクトルを示す。

図８は、正規化した合計％ピーク出カ一対−メジアン日を示すグラフである。

第９Ａおよび９Ｂは、ＭＰＴＰまたはセーラインで処理した動物からの接着した 脳についてのＳＮｃ区画を示す。

図１０Ａ、ＢＳＣ，およびＤは、対応するセーライン注射動物についての平均カ ウントのパーセントとして表した核全体から採取したＭＰＴＰ処理後のＴＨ＋Ｓ ＮｃおよびＶＴＡニューロン細胞体のカウント（Ａ）；線条体ＤＡの濃度（Ｂ） ；セーラインおよびＭＰＴＰ注射マウスについての、線条体ＤＯＰＡＣの濃度、 およびＤＯＰＡＣ／ＤＡ比（Ｄ）を示すグラフである。

図１１は、セーラインバックグラウンドについての平均ＯＤ／平均０．　Ｄ、一 対−ＭＰＴＰ注射後日数を示すグラフである。

図１２は、顔面神経の横断と同側の顔面核を通じての隣接ＣｈＡＴ免疫反応させ た（ＡＩおよびＢｌ）およびニラスル小体染色した（Ａ２およびＢ２）区画の顕 微鏡写真を示す。

図１３は、異なる損傷および処理群に対する顔面核についてのＣｈＡＴ十細胞体 のカウントの棒グラフである（棒−平均、誤差棒−標準偏差）。

図１４は、非損傷群（図１４Ａ）、同側損傷−セーライン動物（図１４Ｂ）、損 傷−ダブリニール動物（図１４Ｂ）、および対側損傷動物（図１４ｃ）について の隣接区画のジエイント・ニノスル／ＣｈＡＴ十カウントを示すグラフである。

図１５は、デプレニールの最初の投与（０，２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１ｍｇ ／ｋｇ）の２４時間後（ｄ４）および１８日後（ｄ　２２）におけるＭＡＯ−Ａ およびＭＡＯ−Ｂ測定を示すグラフである。

発明の詳細な記載 本発明者らは、神経毒素１−メチル−４−フェニル−１，２，５，６−チトラヒ ドロビリジン（ＭＰＴＰ）によって誘発されたニューロン死滅の時間的進行を研 究した。モノアミンオキシダーゼ−Ｂ　（ＭＡＯ−Ｂ）の作用下、ジヒドロピリ ジニウム中間体（ＭＰＤｐ＋）を介して、ＭＰＴＰをその毒性代謝産物１−メチ ル−４−フェニル−ピリジニウムイオン（ＭＰＰ＋）まで酸化した。ＭＰＴＰは ドーパミン非作動性細胞においてＭＰＰ＋に変換され、放出され、ドーパミン作 動性細胞に摂取され、そこで、その神経毒効果を発揮すると信じられている（ビ ンセント・ニス・アール（Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ｓ、　Ｒ，）、ニューロサイエンス （Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９．２８．１８９−１９９頁、ピンタリ ・ンエイ・イー（Ｐｉｎｔａｒｉ、　Ｊ、　Ｅ、　）ら、プレイン・リサーチズ （Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）、１９８３．２７６　（１）　、１２７−１４０頁 、ウェストランド・ケイ・エフ（ｆｅｓｔｌｕｎｄ、　Ｋ、　Ｎ、　）ら、ニュ ーロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８８．２５　（２）　、４ ３９−４５６頁、ヤビッチ・ジェイーエイ（Ｊａｖｉｔｃｈ）ら、ビイ・エフー エイーエス（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、）ＵＳＡ１９８５．８２　（７）　、２１７３− ２１７７頁、メイヤー（Ｍａｙｏｒ）、１９８６＃１７６３、およびランサッラ ・ビイ・ケイ（Ｓｏｎｓａｌｌａ、　Ｐ、　Ｋ、　）ら、神経科学についての第 １７回年余、ニューオリンズ、ルイジアナ州、米国、１９８７年１１月、１９８ ７．１３　（２））。

ＭＰＴＰはマウスにおいて急速に代謝され、クリアランスされる（ジオナネセン ・ンエイーエフ（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ、　Ｊ、　Ｎ、　）、ライフ・サイエ ンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　）、１９８５．３６　：　２１９−２２４頁、マー ケイ−ニス・ビイ（Ｍａｒｋｅｙ、　Ｓ、　Ｐ、　）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔ ｕｒｅ）、１９８４．３１１．４６５−４６７頁、ラオ・ワイ・ニス（Ｌａｕ、 　Ｙ、　Ｓ、　）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）、１９ ８８．４３（１８）＋１４５９−１４６４頁）。急速な代謝およびＭＰＴＰの分 泌とは対照的に、本発明者らは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失は、ＭＰＴ Ｐ投与の停止後２０日間にわたって進行することを証明した。ＭＰＴＰ　（３０ ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を連続５日間マウスに腹腔的投与して（合計累積用量１５０ｍ ｇ／ｋｇ）　、黒画緻密体（ＳＮｃ）および腹側被蓋領域（ＶＴＡ）におけるＴ Ｈ−免疫陽性（ＴＨ十）ニューロンのほぼ５０％の喪失を生じることを示した（ ＭＰＴＰ用量およびカテコールアミン作動性ニューロンの喪失の間の関係につい ては、ここに参照して一体化させるセニウーク・エフ・エイ、ダブリュー・シイ ・タラトン、およびシイ・イー・グリーンウッド（Ｓｅｎｉｕｋ、　Ｎ、　Ａ、 　、　ｆ、　Ｇ、　Ｔａｔｔｏｎ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｅ、　Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ） 、プレC ン・リサーチズ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）、１９９０．５２７：７〜２０頁参 照）。また、本発明者らは、ＴＨ＋ＳＮｃニューロンの死滅には同様の時間的進 行が続くことを見いだした。ＴＨ＋細胞体の２０−３０％は、ＭＰＴＰの投与完 了後５日までに喪失し；ＴＨ−ニューロンの喪失は次の１０〜１５日にわたり継 続し、しかる後は検出可能な喪失はなかった。前記した分泌データに基づ（と、 ＴＨ−ニューロンのこの継続的な喪失は、ＭＰＰ＋の存在によっては説明できな い。また、ＴＨ＋およびニソスル小体染色ＳＮｃ細胞体のカウントのジヨイント ・プロットにより、ＴＨ十細胞体の喪失は、ＴＨ免疫反応性の喪失よりむしろＳ Ｎｃニューロンの死滅を表すことが確認された。

ＴＨ十ＳＮｃ細胞体の喪失と平行して、また、本発明者らは、ＳＮｃおよび腹側 被蓋領域（ＶＴＡ）におけるＴＨタンパクの免疫密度における変化も見い出した 。セーライン処理対照と比較して、５日におけるＭＰＴＰ−処理動物につき、残 りのＴＨ＋ＤＮＳニューロンの細胞体では、細胞質ＴＨ免疫密度は４０％低かっ た。平均細胞体ＴＨ−免疫密度は、時間と共に増大し、ＭＰＴＰに続く２０日後 までには対照レベルに到達した。線条体ＤＡ濃度および運動のごときドーパミン 依存性挙動における変動は、ＴＨ−免疫化学における変化と平行することが判明 した。さらに、本発明者らは、ＤＯＰＡＣ／ＤＡ比によって評価した線条体ＤＡ 含量およびＤＡ合成における増加もまた挙動の回復に平行するらしく、ＭＰＴＰ 暴露で生き残るＶＴＡおよびＳＮｃニューロンにおけるＤＡの含量および合成の 増大を示した。

かくして、本発明者らは、重要なことには、以下のＭＰＴＰ−誘発ニューロン損 傷においては、ＴＨ＋ＳＮｃニューロンが効果的な修復および回復を受けるが、 あるいはそうでなければそれらが死滅するという臨界的な２０日の期間があるこ とを見い出した。

ダブリニールについてのほとんどの研究は、ＭＡＯ−Ｂ活性の阻害はｉｎ　ｖｉ ｖ。

にてＭＰＴＰからＭＰＰ＋への変換およびＭＰＴＰの神経毒性をブロックするこ とを示すのを企画してきた。その結果、デプレニールは、通常、ＭＰＴＰ暴露の 間にＭＡＯ−Ｂ活性が阻害されることを保証するために、ＭＰＴＰ投与の先立つ 数時間または数日間、および次いでその間を通じて投与された（例えば、コー工 ン・シイ（Ｃｏｈｅｎ、　Ｇ、　）ら、ニーロビーアン・ジャーナル・オフ・メ チルマコロジ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　）、１９８４．１０ ６　：　２０９−２１０頁、ヘイキッラ・アール・イー（Ｈｅｉｋｋｉｌａ、　 Ｒ，Ｅ、　）ら、ニーロビーアン・ジャーナル・オフ・メチルマコロノー（Ｅｕ ｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　）　、１９８５．１１６　（３）：３１３ −３１８頁、ヘイキッラ・アール・イー（Ｈｅｉｋｋｉｌａ、　Ｒ，Ｅ、　）ら 、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８４．３１．１：４６７−４６９頁およ びラングストン・ジエイ・ダブリュー（Ｌａｎｇｓｔｏｎ、　Ｊ、　Ｗ、　）ら 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　（ワシントン−ディー・シイ）、１９８４． ２２５　（４６６９）：　１４８０−１４８２頁参照）。匹敵する結果が、ＡＧ Ｎ−１１３３、ＡＧＮ−１１３５およびＭＤ２４０９２８のごとき他の選択的Ｍ ＡＯ−Ｈの阻害剤を用いて得られており（ヘイキッラ・アール・イー（Ｂｅｉｋ ｋｉｌａ、　Ｒ，Ｅ、　）ら、ニーロビーアン・ジャーナル・オフ・メチルマコ ロジ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　）　、１９８５．１１．６　（ ３）：３１３−３１８頁およびフラー・アール・ダブリューおよびエル・ニス・ ケイ・ヘムリック（Ｆｕｌｌｅｒ、　Ｒ，ｆ、　ａｎｄＬ、ＳＪ：、　Ｈｅ＋＊ ｒｉｃｋ）、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　）、１９８５．３７（ １２）：１０８９−１０９６頁）、ダブリニールの作用メカニズムはＭＡＯ−Ｂ をブロックし、それにより、当該毒素がその活性形に変換されるのを防ぐその能 力によって媒介されることを示唆する。

前記研究とは対照的に、本発明者らは、ＭＰＴＰのＭＰＰ＋への変換をブロック するその能力とは独立しているＤＳＮニューロンに対してデプレニールが影響し 得るか否かを決定することに興味を持った。ＭＰＴＰ−処理マウス（１５０ｍｇ ／ｋｇの累積用量）には、ＭＰＴＰ投与後３日ないし２０日にダブリニールを摂 取させた（０．０１．０２５．１０ｍｇ／　ｋ　ｇ　ｉ、ｐ、　；　１週間当た り３回）。ダブリニール投与は３日まで差し控えて、すべてのマウスがＭＰＰ＋ のがなりのレベルに暴露され、すべてのＭＰＴＰおよびその代謝産物が中枢神経 系から除去されてしまうのを確実とした。ＭＡＯ−Ｂ阻害剤であるクロルギリン もまた該ＭＰＴＰ−処理マウスに投与した。

本発明者らは、セーライン処理マウスにおいては、約３８％のドーパミン作動性 点質緻密体（Ｄ　Ｓ　Ｎ）ニューロンが２０日間にわたって徐々に死滅すること を見いだした。ＤＳＮニューロンの数はＭＰＴＰ−セーラインおよびＭＰＴＰ− タロルギリン処理マウスにおいて実質的に同一であることが判明した。しかしな がら、ダブリニールはＭＰＴＰ−誘発損傷で生き残るＤＳＮニューロン数を増加 させ（１６％喪失−０，０１ｍｇ／ｋｇ、１６％喪失−０，２５ｍｇ／ｋｇ、お よび１４％喪失−１０ｍｇ／ｋｇ）　、すべての用量は同等の能力である。かく して、本発明者らは、ダブリニールは死滅するニューロンを助け、効果的な修復 を受けるその確率を増大させ、ドーパミン合成に必要なチロノンヒドロキシラー ゼのごとき酵素のそれらの合成を再確立し得ることを示した。これは、さもなけ れば死滅してしまうニューロンにおいて損傷から死滅までを逆行させる、末梢ま たは経口投与処理の最初の報告であると信じる。

また、本発明者らは、ダブリニール（０，２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１ｍｇ／ ｋｇ）投与後２４時間、および１８日後（すなわち、動物を２０日において免疫 化学につき犠牲した直後である２１日に対応）にＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂを 測定して、処理期間の最初および最後におけるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ活性 の測定を得た。驚くべきことに、０．０１ｍｇ／ｋｇ用量は、２つの期間におい て、いずれの有意なＭＡＣ）−ＡまたはＭＡＯ−Ｂ阻害も生じないことを見いだ した。かくして、０．０１ｍｇ／ｋｇデブレニールでのＤＳＮニューロンの顕著 な救済はＭ　Ｓ　Ｏ−Ｂ阻害に帰されるのではないよってある。

前記のような発明者の研究により、ダブレニールが、毒性代謝物ＭＰＰ＋へのＭ ＰＴＰ変換を阻害することによって、その復活効果を媒介している可能性が排除 された。その結果は、デプレニールがこれまで同定されていない作用機序を有す ることを示唆している。ドーパミン作動性ニュートロン自体におけるデプレニー ルの直接的効果を、これら細胞中にＭＡＯ−Ｂが存在しないことにより調和させ ることは困難であり（ゲインセント。ニス・アール（Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｓ、Ｒ， ）ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）　２８．１８９−１９ ９　（１９８９）　；ビンターリ、シェイ・イー（Ｐｊｎｔａｒｉ、Ｊ、Ｅ、） ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　２７６、　１２７−１４０ 　（１９８３）　；ウエストルンド、ケイ・エフ（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ、Ｋ、　Ｎ 、　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）（ワノントン、Ｄ、Ｃ，）　２３０． １８１−１８３　（１９８ｇ）およびウエストルンド、ケイーエフ（Ｗｅｓｔｌ ｕｎｄ、Ｋ、　Ｎ、　）ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ） ２５、４３９−４５６　（１９８ｇ））、これらの結果がドーパミン作動性ニュ ーロンそれ自体中のデプレニールによるＭ　Ａ　Ｏ−Ｂ阻害に基づいて説明する ことができる見込みはない。さらに、０．０１ｍｇ／ｋｇのダブレニールを投与 したＭＰＴＰマウス中におけるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの測定によると、ダ ブレニールがその復活効果をＭＡＯ−Ｂの阻害によって媒介することは、非常に 疑わしくなった。デプレニールの復活効果は、神経系の細胞のいずれかによって 媒介され得るのであり、その機序には、おそらく、ＭＡＯ−Ｂをブロフクする構 造に関連していない構造により、それら細胞上のレセプター（例えば、ニューロ ン親和性因子に対するレセプター）の活性化が関係している。このことは、ダブ レニールが、ちょうどドーパミン作動性ニューロンのみに影響を与えるのではな く、ダリア栄養因子に応答する脳内におけるすべてのニューロンの死を防ぐのを 助けることができることを意味するのであろう。従って、パーキンソン病に対し て治療上効果的であるだけでなく、他の神経変性病や神経筋病、ならびに低酸素 症、虚血、卒中または外傷による脳の損傷に効果的であり、脳の加齢化に関連す るニューロンの進行性減少さえ遅延させ得る（コールマン、ピー・ディー（Ｃｏ ｌｅｍａｎ、Ｐ、　Ｄ、　）およヒフラット、ディー・ジー（Ｆ　１ｏｏｄ　Ｄ 、　Ｇ、　）、ニューロバイオロジー・オフ・エイジング（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ 、　Ａｇｉｎｇ）　８．５２１−８４５　（１９８７）　；　７　ックギー乙　 ピー・エル（ＭａＧｅｅｒ、Ｐ、　Ｌ、　）ら、パーキンソニズム・アンド−エ イジング（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ）中、（ディー・ピ ー・カルネ（Ｄ、　Ｂ、　Ｃａ１ｎｅ）、ディー、シー、−ジー・コーミ（Ｄ、 　Ｃ，−Ｇ、　Ｃｏｍ１）およびアール・ホロウスキー（Ｒ，Ｈｏｒｏｗｓｋｉ ）編）　２５−３４　（プレナム（Ｐ　ｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク、　１９８ ９）。また、それは、外傷性および非外傷性の末梢神経損傷における筋肉の再支 配を刺激するのに有用であり得る。

１４日齢で軸索切断した後のラットの顔面運動ニューロンの生存率を調べたとこ ろ、ダブレニールは軸索切断してから２１日後に生存している運動ニューロンの 数を２．２倍に増大させることがわかった（本願の実施例３を参照）。従って、 デプレニールは軸索切断によって惹起される栄養供給の減少を部分的に補償する ことができることが示され、筋萎縮性側索硬化症における運動ニューロンの死の 治療に、ダブレニールがある役割を果たすことを示唆している。

上で考察したように、本発明は、動物における神経細胞機能を維持し、その喪失 を防止し、および／または回復させるための、ダブレニールまたはデプレニール の誘導体もしくは類似体の使用：かかる用途に適したダブレニールを含有する医 薬組成物、および神経細胞機能を維持し、その喪失を防止し、または回復させる ことによる神経系疾患の治療方法に関する。

本発明で使用し得るのは、ダブレニール、好ましくはＬ−ダブレニール（ザ・メ ルク・インデックス（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉ　ｎｄｅｘ）、第１１版、２８９ ３を参照）：ダブレニールの誘導体、好ましくはデプレニールの医薬上許容され る塩およびエステル：あるいは、デプレニールの類似体、好ましくはデプレニー ルの構造類似体、またはパルギリン、ＡＧＮ−１１３３、ＡＧＮ−１１３５およ びＭＤ２４０９２８などのデプレニールの機能類似体、あるいは、イミブラミン 、クロロプロマシン、アミ］・リブチリン、（−）２．３−シクロローα−メチ ルベンジルアミン、Ｎ−シクロプロピル−置換アリールアルキルアミン類などの 、必要に応じてＭＡＯ−Ｂを阻害する他の薬剤である。

デブし・ニー／ｌまたはデブし・７ハールの誘導体もしくは類似体の投与は、動 物の神経細胞機能を維持しその喪失をｐ防１．、および／または回復させ得るの で、神絆変性麹や神経筋病の治療に、な１：１びに低酸素症、低血糖症、虚血発 作または外傷による脳の損傷に使用し、−４ｆ：、、脳の加齢化に関連するニュ ーロンの進行性減６ｊ＞さえ遅延させるために使用し得る。さらに詳し５（は、 ダブレニールは、パーキンソン病、へＬＳ、頭部外傷またはを髄損傷や、虚血発 作、呼吸不全による低酸素症、溺水、持続性痙彎、心臓停市、−酸化炭素への曝 露、毒素への曝露、王たＩＪウィルス感染の直後の患者の治療に使用し得る。ま た、デプレニールまたはデブｌノニールの誘導体もしべは類似体は、外傷性およ び非外傷性の末梢神経損傷における筋肉の再支配を刺激するｔ−めにも使用し、 得る。

本発明の医薬組成物は、デジ１ノニールまｔ二はダブレニールの誘導体もしくは 類似体を、弔独で含有するか、あるいは他の活性物質と共に含有する。かかる医 薬組成物の使用は、経口的、局所的、直腸内、非経口的、局部的、吸入的または 大１１ｉζ内とすることができる３、従、−７で、ｆれらは、固形または゛を固 形、例えば、丸剤、錠剤、ニアリーム剤、セラチンカプセＩｌ剤、カプセル剤、 坐剤、軟質ゼラチンカプセル剤、ケル剤、メンブレン剤、チューブ剤である。非 経口的な用途および大脳内での用途の場合には、筋肉内または皮下投与の形態を 使用することができるか、あるいは、注入用または静脈内もし７くは大脳内注射 用の形態を使用することができ、従って、活性化合物の溶液として、あるいは、 前記の用途に適すると共に生理学的液体に適合するモル浸透圧濃度を有する１種 またはそれ以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と混合すべき活性化合物 の粉末として、調製することができる。局部的な用途の場合には、局部用のクリ ーム剤や軟膏剤の形態またはスプレー剤の形態の製剤を考える必要があり、吸入 用途の場合には、スプレー剤、例えば鼻スプレー剤の形態の製剤を考える必要が ある。

本発明の製剤は、ヒトまたは動物への投与用とすることができる。それらは、液 剤、スプレー剤、軟膏剤およびクリーム剤の場合には、好ましくは約１〜４ｍｇ の活性成分を含有し、固形製剤の場合には、約０．１％〜５％、好ましくは約０ １％〜１０％の活性成分を含有する。投与すべき用量は、個々の必要性、所望の 効果および選択された投与経路に依存するが、皮下、筋肉内または大脳内の注射 によるヒトへの毎日投与量は、一般的には、０１〜１０ｍｇ／日の活性物質、好 ましくは１〜］、Ｏｍｇ／日、最も好ましくは５〜］、Ｏｍｇ／日の範囲内で変 化する。

前記の医薬組成物は、也者に投与することができる医薬」二許容される組成物を 調製するためのそれ自体公知の方法によって、有効量の活性物質を医薬上許容さ れる賦形剤との混合物に組み合わせるように、調製することができる。適当な賦 形剤は、例えば、レミントンの医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）［レミントンの医薬品科学（Ｒｅｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、マノ ク・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）、イーストン、ペンンルベニア州、Ｕ　Ｓ　Ａ　ｌ９８５１゜　前記の 医薬品組成物は、１種またはそれ以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と 共に、適当なｐＨと生理学的液体に対する等浸透圧性とを有する緩衝溶液中に含 まれるデプレニールまたはダブレニールの誘導体もしくは類似体の溶液を包含す るが、それに限定されるわけではない。

前記のように、本発明はまた、患者の神経細胞機能を維持し、その喪失を防止し 、および／または回復する活性について薬物を試験する方法に関する。

本発明のある具体例に従って、叡者の神経細胞機能を維持し、その喪失を防止し 、および／または回復する活性について薬物を試験する方法であって、神経毒性 活性を有する薬剤を試験動物に投与し、試験動物に前記薬物を投与し、前記薬剤 の投与終了後２０日以内に該動物を殺害し、点質緻密層を通る脳の連続切片を取 り：悪質緻密層を通る脳の１つ置きの連続切片におけるチロシンヒドロキシラー ゼ陽性の細胞体の数を測定し、かつ、介在する切片におけるニラスル（Ｎｉｓｓ ｌ）染色陽性の黒画緻密層の数を測定し：そして、チロシンヒドロキシラーゼ陽 性の細胞体およびニラスル染色陽性の細胞体の数を、前記薬剤を投与していない 対照動物の黒画緻密層を通る脳の連続切片におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽 性の細胞体およびニラスル染色陽性の細胞体の数と比較することからなる方法が 提供される。

ある好ましい具体例では、神経毒性活性を有する薬剤は、ＭＰＴＰであり、最も 好ましくは、３０ｍｇ／ｋｇ／日の量のＭＰＴＰであり、８週齢のマウス、好ま しくはＣ５７ＢＬマウスに、５日間続けて（第一５〜０日；合計の好ましい累積 的用量は１５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔的投与する。ＭＰＴＰ投与を中止（第０日）し てから３日後に、セーライン（対照動物）または適当な用量の薬物（試験動物） を用いて処理を開始する。好ましくは、薬物の投与を第３日目まで差し控えて、 すべてのマウスが同等レベルのＭＰＰ＋に曝露されることと、すべてのＭＰＴＰ およびその代謝物が中枢神経系から除去されていることを確実にする。マウスは 、最後のＭＰＴＰ注射を行ってから２０日後に、麻酔剤（ベンドパルビタール） を過剰投与した後で、バラホルムアルデヒドを潅流することによって殺害する。

脳は、中心線に沿って縦に２つに切断し、半分の脳を、表面の標認点が縦方向に 完全に一致するように、ティッシュ−チック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）を用いて 貼り合わせる。貼り合わせた脳を一７０℃のメチルブタン中で冷凍し、１０μｍ の連続切片を、各ＳＮｃの縦方向の全長を通って切断する。

黒画緻密層を通る脳の連続切片中のチロシンヒドロキシラーゼ陽性の細胞体の数 は、一般的には、セニウク、エフ・エイ（Ｓｅｎｉｕｋ、　Ｎ、、Ａ、）ら、プ レイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　５２７．７−２０　（１９９０） およびクツトン。ダブリュー・ジー（Ｔａｔｔｏｎ、Ｗ、Ｇ、）ら、プレイン・ リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　５２７．２１−３２　（１９９０）しこれ らは、出典を示すことにより明細書の一部とする］に記載され、以下のように変 形された方法により、好ましくはポリクローナルＴＨ抗体を一次抗体として用い 、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との標準的なアビジン−ビオチン反応を可視化 用の色原体として用いて測定し得る。スライドに載せた切片を、０．２％トリト ン（Ｔｒｉｔｏｎ）／　０．１　Ｍリン酸緩衝液中における非標識の一次ＴＨ抗 血清と共に、４℃で一晩インキユベートする。組織をリン酸緩衝液で洗浄し、次 いでビオチニル化ヤギ抗つサギＩｇＧ二次抗体と共に、１時間インキュベートし た後、アビジン−ＨＲＰインキュベーションに供する。０．０１％過酸化水素中 におけるＤＡＢの０．０５％溶液を用いて、免疫反応した細胞体を可視化する。

介在する切片は、セニウク（Ｓ　ｅｎｉｕｋ）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａ ｉｎ　Ｒｅｓ、）５２７：７、１９９０およびタラトン（ＴＢｔｔｏｎ）ら、プ レイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）５２７・２１．１９９０　［これら は、出典を示すことにより明細書の一部とする］に記載されている手法に従って 、ニラスル染色することにより、核の輪郭を明確にし得る。

本発明の別の具体例に従って、患者の神経細胞機能を維持し、その喪失を防止し 、および／または回復する活性について薬物を試験する方法であって、試験動物 の軸索切断を行い：該試験動物に薬物を投与し：軸素切断部位由来の組織学的切 片について、コリンアセチルトランスフェラーゼ陽性の細胞体の数を測定し：そ して、測定されたコリンアセチルトランスフェラーゼ陽性の細胞体の数を、前記 薬物を投与していない対照動物の軸索切断部位由来の連続切片におけるコリンア セチルトランスフェラーゼ陽性の細胞体の数と比較するからなる方法が提供され る。

好ましくは、試験動物、好ましくはラットに対して、片側の顔面神経の横断面切 断を行い、対をなした損傷グループおよび無損傷グループを、セーライン（対照 動物）または適当な用量の薬物（試験動物）で処理する。軸索切断の２１日後に ラットを殺害し、クツトン。ダブリュー（Ｔａｔｔｏｎ、　Ｗ、Ｇ、）ら、プレ イン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）　５２７　：　２１．１９９０　［ これは、出典を示すことにより明細書の一部とする］の手法を用いて、脳幹の連 続冠状縫合の組織学的切片を、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ） 免疫細胞化学的に調べる。

以下の非限定的な実施例は、本発明を例示するものである：本実施例は、ＭＰＴ Ｐを投与してからデプレニールによって救済した黒画緻密層（ＳＮｃ）由来のチ ロシンヒドロキシラーゼ陽性陽性（ＴＨ＋）ニューロンの減少を示す。　この研 究の第１の部分では、ＭＰＴＰに誘発されたニューロンの死の時間経過が、以下 のように確立された。ＭＰＴＰ　（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を、８週齢の同系Ｃ５ ７ＢＬマウス（シャクラン・ラホラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）のナショナル・インスティテユーツ・オフ・エイジング・コロニー（ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ａｇｉｎｇ　ｃｏｌｏｎｙ ）、ＵＳＡ　（Ｃ５７ＢＬ／ＮＮ１ａ））に、５日間続けて（ｎ＝６／時間間隔 で）腹腔的投与した（合計の累積的用量は１５Ｑｍｇ／ｋｇ）。マウスを麻酔剤 （ベンドパルビタール）を過剰投与した後で、最後にＭＰＴＰを注射してから５ ．１０．１５．２０．３７および６０日後に、等強性セーライン（５％レオマク ロデックシスｒｈｅｏｍａｃｒｏｄｅｘ）およびｏ、ｏｏｓ％キシロカイン（ｘ ｙｌｏｃａｎｅ）を含有）および４％パラホルムアルデヒドを潅流することによ って殺害した。２つに切断された脳を領１ｍリン酸緩衝液中における４％バラホ ルムアルデヒドに一晩浸漬し、２０％スクロース中に入れた。

この研究の第２の部分では、ＭＰＴＰに誘発されたＴＨ＋ＳＮｃニューロン減少 のダブリニールによる救済が以下のように示された。ＭＰＴＰ　（３０ｍｇ／ｋ ｇ／日）を、８週齢のＣ５７ＢＬマウスに、５日間続けて（ｎ＝６〜８／処理グ ループで）腹腔的投与した（第一５〜Ｏ日３合計の累積的用量は１５０ｍｇ／ｋ ｇ）。ＭＰＴＰ投与を中止（第０日）してから３日後に、マウスをセーライン、 ダブリニール（デプレニール・カナダ（Ｄｅｐｒｅｎｙｌ　ＣａｎａｄａＸｏ、 　０１．０２５またはｌＱｍｇ／ｋｇ腹腔内）またはクロロキリン（シグマ・ケ ミカル・カンパニー（Ｓｈｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｕ ＳＡ）　（２ｍｇ／ｋｇ）で、１週間に３回処理した。ダブリニール投与を第３ 日目まで差し控えて、すべてのマウスが同等レベルのＭＰＰ十に曝露されること と、すべてのＭＰＴＰおよびその代謝物が中枢神経系から除去されていることを 確実にした。デプレニールの用量は、ダブリニールがラットの寿命を延長し、Ｍ ＡＯ−Ｂ活性を約７５％だけ阻害するが、ＭＡＯ−Ｂ活性には全（効果を有しな いか（０，２５ｍｇ／ｋｇ）　、あるいはＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの両方の 阻害を惹起することができる（１０ｍｇ／ｋｇ）ことを示す研究に使用される用 量を反映するように選択した（ノール（Ｋｎｏｌｌ）、ノエイ・マウント・シナ イ・ジェイ・メッド（Ｊ、　Ｍｔ、５ｉｎａｉ　Ｊ、　Ｍｅｄ、）　５５゜６７ −７４　（１９８８）およびノール（Ｋｎｏｌｌ）、ジェイ・ノック・エイジン グ・ダブ（Ｊ。

Ｍｅｃｈ、Ａｇｅｉｎｇ、Ｄｅｖ、）　４６．２３７−２６２　（１９８８）、 デマレスト、ケイ・ティ（Ｄｅｍａｒｅｓｔ、　Ｋ、Ｔ、）およびアザルグ、エ イ・ジエイ（Ａｚｚａｒｇ　Ａ、　Ｊ　、　）　：モノアミン・オキシダーゼ： 構造、機能および別機能（Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ　０ｘｉｄａｓｅ　：　５ｔｒｕ ｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｅｒｅｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ）（ティ・ピー・シンガー（Ｔ、Ｐ、　Ｓ　ｉｎｇｅｔ）、アール・ダブリュー ・フォン・コルフ（Ｒ，Ｗ、　Ｖｏｎ　Ｋｏｒｆｆ）、ディー・エル・マーフィ ー　（Ｄ、　Ｌ、　Ｍｕｒｐｈｙ）（編））中、アカデミツク・プレス（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７９）　４２３−４３０頁）。

１０１ｍｇ／ｋｇのデプレニール用量も選択された。この用量では、脳の組織に 達するのは１０−７Ｍ未満である。マウスは、最後のＭＰＴＰ注射を行ってから ２０日後に、麻酔剤（ベンドパルビタール）を過剰投与した後で、バラホルムア ルデヒドを潅流することによって殺害した。

この研究の両方の部分に関して、脳は、中心線に沿って縦に２つに切断し、半分 の脳を、表面の標認点が縦方向に完全に一致するように、ティッシュ−チック（ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）を用いて貼り合わせた。貼り合わせた脳を一７０℃のメ チルブタン中で冷凍し、１０μｍの連続切片を、各ＳＮｃの縦方向の全長を通っ て切断した。

１つ置きの切片を、一般的には、セニウク、エフ・エイ（Ｓｅｎｉｕｋ、　Ｎ、 Ａ、）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）　５２７．７−２０ 　（１９９０）およびクツトン。ダブリュー・ジー（Ｔａｔｔｏｎ、　Ｗ、Ｇ、 ）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　５２７゜２１−３２　（ １９９０）［これらは、出典を示すことにより明細書の一部とするコに記載され 、以下のように変形された方法により、ポリクローナルＴＨ抗体を一次抗体とし て用い、ノアミノベンジジン（ＤＡＢ）との標準的なアビジン−ビオチン反応（ エイ・ビー・シ町キット（ＡＢＣＫｉｔ）、ベクタ町うボズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌ ａｂｓ））を可視化用の色原体として用いたＴＨＨ疫細胞化学的に調べた。スラ イドに載せた切片を、０２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）／　０．１　Ｍリン酸緩 衝液中における非標識の一次ＴＨ抗血清（オイゲン・チック（Ｅｕｇｅｎｅ　Ｔ ｅｃｈ））と共に、４℃で一部インキユベートした。組織をリン酸緩衝液で洗浄 し、次いでビオチニル化ヤギ抗つサギＩｇＧ二次抗体と共に、１時間インキュベ ー１化た後、アビジン−ＨＲＰインキュベーションに供した。０．０１％過酸化 水素中におけるＤＡＢの０．０５％溶液を用いて、免疫反応した細胞体を可視化 した。累積的な光学密度を測定するために、対照およびＭＰＴＰ処理した脳由来 の切片を、同じスライド上に載せることにより、この分析手法の可変性を変化さ せるスライドの効果を減少さ也免疫細胞化学的に調べた。

ＴＩ＋ＳＮｃニューロンの数は、各々核全体を通る番号付けられた１つ置きの連 続切片のカウントによって得られた。切片は、多重盲検による観察者によって再 びカウントされ、観察者による偏りを調べた。得られた結果は、切片の厚さによ って補正した（ケーニヒスマーク、ビー・ダブリュー（Ｋｏｎｉｇｓ■ａｒｋ、 Ｂ、Ｗ、）・ナウタ、ダブリュー・エイチ（Ｎａｕｔａ、　Ｗ、Ｈ，）、エベソ ラン・ニス・オー・イー（Ｅｂｅｓｓｏｎ　Ｓ、０．　Ｅ、）編、コンテンポラ リー・リサーチ・メソッズ・イン・二、−ロアナトミー（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａ ｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）、 ニューヨー人スブリンガー・フェアラーク（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ ）、３１５−３８０頁、１９７０）。平均値上標準誤差を、セーラインを注射し た対照マウスについて計算した。次いで、次のデータを、図１に示すように、こ の平均値の百分率として表した。

介在する切片は、ニラスル染色（セニウク（Ｓｅｎｉｕｋ）ら、プレイン・リサ ーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）　５２７：７、１９９０　；タラトン（Ｔａｔ ｔｏｎ）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）　５２７・２１． １９９０にれらは、出典を示すことにより明細書の一部とする］を参照）するこ とにより、核の輪郭を明確にした。貼り合わせた半分の脳について対をなす半分 の切片は、実験グループおよび対照グループにおけるニューロン数の差が、浸透 の違いや抗体または試薬に対する曝露の違いによるものではないことを保証した 。

各動物の各校の長さ方向を通る２０個の無作為に選択された半分の切片について 、ＴＨ十細胞体を含む領域を、顕微鏡にカメラ鮮明化（ｌｕｃｉｄａ）アタッチ メントを用いてトレースし、次いでその輪郭を、標認点の局所的な組織学的特徴 を用いて、すぐ隣のニラスル切片に置き換えた（各校には、通常、約９０対の切 片が含まれていた）。輪郭内に核仁を含むニラスル細胞体の数を、ラットＳＮｃ の評価基準（ポイリール（Ｐｏｉｒｉｅｒ）ら、１９１１１３．プレイン・リサ ーチ・ビュリティン（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、Ｂｕｌｌ、）　１１　：３７１）に 類似した評価基準を用いて、ダリアのプロファイル（４０〜１００μｍ２）を除 く３つのサイズグループ（小−１４０〜２８０μｍ２、中−３００〜５４０μｍ ２および大−５４０〜８４０μｍ２）に従って、カウントした。ＴＨ十細胞体の 数を、２０個のすぐ隣の切片の対応する領域におけるニラスル細胞体の数に対し てプロットした。合わせたニッスル／ＴＨ＋カウントは、ＴＨ＋ＳＮｃ細胞体の 数の減少が、ニューロンの破壊または生存ニューロンによるＴＨＨ疫反応性の喪 失によるものがどうかを決定する手段を与える（この手法の原理に関する詳細に ついては、セニウク（Ｓｅｎｉｕｋ）ら、１９９０１前出を参照）。図１では、 ＭＰＴＰ後の０日目から２００日目では、ＳＮｃ由来のＴＨ十細胞体は減少を示 すが、それ以後は減少を示さない。注射の予定（５日目）が終了した後、５日間 で、２０％〜３０％のＴＨ十細胞体が減少した：ＴＨ−ニューロンの減少は、次 の１０〜１５日間にわたって続いたが、それ以後は、さらに消滅しなかった。こ のようなＴＨ−ニューロンの連続的減少は、ＭＰＴＰやその毒性代謝物ＭＰＰ＋ が体内から急速に排除されるので、それらの存在によるものであると説明するこ とはできなかった（ヨハネッセン、ジエイ・エフ（Ｊ　ｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ、 　Ｔ、Ｎ、）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　５ｃｉ）、　３６．２１９− ２２４　（１９８５）　：マーキー、ニス・ピー（Ｍａｒｋｅｙ、Ｓ、　Ｐ、　 ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　３１１．４６５−４６７　（１９８４ ）　；およびラウ（Ｌａｕ）ら、ライフ・サイエンス　（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ ｃｅ）。

４３、１４５９−１４６４　（１９８８））。いくつかのニューロンは、ニュー ロンを発達させて軸素または神経突起を延ばすことによって利用されるもの（バ ロン、ケイ・ヴイ（Ｂａｒｒｏｎ、　Ｋ、Ｖ、）、ナーブ・オーカン・アンド・ ティランユ・リジェネレーション（Ｎｅｒｖｅ、　Ｏｒｇａｎ　ａｎｄ　Ｔｉ５ ｓｕｅ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）　リサーチ・パースペクテイブズ（Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ）（セイル、エフ・／エイ（Ｓｅｉｌ、 Ｆ、Ｊ、）編）中、３−３８　（アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８６）を参照）に類似したＤＮＡ転写「プログ ラム」を再活性化することによって、ＭＰＴＰを用いた場合に見られるような、 軸索の損傷後の修復を開始させる能力を有する。ＴＮ十ＳＮｃニューロンの場合 には、これらのニューロンが、ＭＰＴＰに誘発された損傷の後で効果的な修復を 受けて回復するか、あるいはそれらが死ぬ臨界的な２０日間が存在するようであ る。

セーラインのみで処理したマウスのすぐ隣の切片の対応する領域に由来するＴＩ （＋およびニラスル染色ＳＮｃ細胞体のカウントを合わせたプロット（３匹の動 物の値は図２のＡｌ−Ａ３にまとめられている）は、ＴＨ十細胞体の数がニラス ル細胞体の数と直線的に関係し、中位のサイズのＳＮｃ細胞体（図２のＡ２）お よび大きいサイズのＳＮｃ細胞体（図２のＡ３）に関する（図２の対角線によっ て示される）ｎ等値対角線の付近に接近して分散していることを示している。図 ２の各プロットでは、半分の切片あたりの細胞体のニソスルカウントおよびＴＨ 十カウントの平均上標準偏差は、各Ｙ軸の上端および各Ｘ軸の右端に、それぞれ 示されている。中位および大きい細胞体については、ニラスル細胞体の平均数は 、対応するＴＨ十細胞体の平均数を、５〜１０％超過していたが、これはＴＨ十 ではない黒画線状体ニューロンの割合（ヴアン・デル・コーイ（Ｖａｎ　ｄｅｒ Ｋｏｏｙ）ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）　２８　：　 １８９．１９８１）に対応しているようである。

生理食塩処理した動物における小サイズのＳＮｃ細胞体の組み合わせ総数は、小 さなニューロンのごく少数部分のみがＴＨＨ疫反応性であり、それゆえ、ドーパ ミン作用的であることを示す（図２　Ａ１）。これらの結果は、大および中サイ ズの細胞体がドーパミン作用的ニューロンの細胞体である一方で、より小さな細 胞体の大部分が局部的に分枝している内部ニューロンの細胞体であるということ を示す先のげっ歯頚における知見を支持している（ファン・デル・コディ（Ｖａ ｎ　ｄｅｒ　Ｋｏｄｙ）ら、１９８１年、スプラ（ｓｕｐｒａ）　；ポイリアー （ｐｏｉｒｉｅｒ）ら、プレイン・レス・ビュル（Ｂｒａｉｎ、　Ｒｅｓ、　Ｂ ｕｌｌ、）、　１１　：　３７１．　１９８３年）。ＭＰＴＰのみまたはＭＰＴ Ｐに続いてセーライン処理した動物（ＭＰＴＰ−セーライン処理動物についての 値を図２Ｂ１．２Ｂ２および２Ｂ３に示す）における組み合わせニツスル／ＴＨ 総数は、ＭＰＴＰ処理の完了後２０日までには、ＴＨ＋細胞体の喪失が、生存ニ ューロンにおけるＴＨＨ疫反応性の喪失よりもむしろＳＮｃニューロンの死を表 すということを確認するものであった。図２８２および２Ｂ３は、ミノスルおよ びＴＨ十細胞体の総数が、各切片につき２１．６＋／−１５，５および２０．６ ＋／−１５，５から中サイズおよび大サイズの細胞体それぞれにつき１２．４＋ ／−８，０および１１．４＋／−７，２にまで減少しても（値は＋／−１，０標 準偏差を表す）、総数間の殆ど同じ値の関係が維持されたことを示す。ＳＮｃニ ューロンがＴＨＨ疫反応性を失うが死なない場合、組み合わせプロットのばらつ きが等価対角線上の上方に位置することが期待される（セニウク（Ｓｅｎｉｕｋ ）ら、プレイン・レス（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　５２７　：　７．　１９９０ 年）。さらに、図２Ｂ１は、多くの小サイズのニラスル染色細胞体が、小サイズ のＳＮｃ細胞体のＴＨ十酸成分減少（各切片につき４．１＋／−２，８から２． ３　＋／−１６）に伴い僅かに減少（各切片につき２６．２＋／−１８，３から ２２．４　＋／−１２，５）したことを示す。中および大サイズの細胞体の幾分 かの喪失が萎縮により生じ、その結果、ＭＰＴＰ処理に対応してそれらの断面積 がもはや中および大サイズの範囲内でなくなる場合には、小サイズのニラスル染 色細胞体数が増加すると期待される。

図３は、それぞれの核の吻側尾状体全長にわたる交互の１０ミクロンシリーズの 各切片のＳＮＣ核についてのＴＨ＋ＳＮｃ細胞体を表し、積算頻度分散として表 される。各処理の代表的な軌跡を図３に示す。セーラインのみ、ＭＰＴＰ　（１ ５０ｍｇ／ｋｇ）およびセーライン、ならびにＭＰＴＰおよびダブレニール（０ ゜２５ｍｇ／ｋｇ、１週間に３回）処理したマウスのニューロン総数値は、図４ のヒストグラム法で表される値と共通である。図４に示したように、すべてのＳ ＮＣ核に関する積算分散頻度曲線（ｎ＝４／処理群）は、同様のパタ一二／を有 し、該毒素に相対的に耐性であるニューロンを含む核の吻側部分（切片１０〜４ ０）においてそれが最大となると思われるのであるが、ＭＰＴＰによるＴＨ十細 胞体の喪失およびダブレニールによるそれらの回復が核の全部分において起こっ たことを示す。図４はまた、３群の動物間の個々の頻度分散曲線に重なりがない ことを示す。

図４に示すデータは、すべての試験の平均数（ｎ＝６〜８マウス／処理群、すな わち１２〜１６個のＳＮＣ核）±ＴＨ十細胞体／ＳＮｃ核の標準偏差を表す。

これらの値を得るために、コニヒスマルタ。ビー・ダブリュ（Ｋｏｎｉｇｓｍａ ｒｋ、Ｂ、　Ｗ）　。

コンテンポラリー・リサーチ・メソッズ・イン・ニューロアナトミー（Ｃｏｎｔ ｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏａｎ ａｔｏｍｙ）（ナウタ、ダブリュ８エイチ（Ｎａｕｔａ、　Ｗ、　Ｈｏ）および エベラン、ニス・オー・イー（Ｅｂｅｓｓｏｎ　５ＯＥ）編’）３１５−３８０ 頁（スブリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、ニュー ヨーク、１９７０年）記載のごとく相関係数２．１５を用いて、ＴＨ＋の粗総数 をニューロン数に変換した。

図４は、ダブレニール処理マウスにおける、ＭＰＴＰのみを与えられた動物に対 するＴ　Ｈ十Ｓ　Ｎ　ｃ細胞体の増加数を示す。デプレニールの少量および多量 投与双方は、ＴＨ＋　ＳＮｃニューロン喪失防止においては等価であった。

特別に図４は、セーラインのみで処理された動物について観察されたＴＨ十細胞 体の修正数の平均値（３０１４＋／−３０４，平均値＋／−標準偏差）が、ＭＰ ＴＰのみで処理した動物（１７５６＋／−１６１）およびＭＰＴＰ−モーライン 処理群（１８７２＋／−１８７，１９０４＋／−３０８および１８０５±１８５ ）において有意に減少したことを示す（マンーホイットニ（Ｍａｎｎ−ｆｈｉｔ ｎｅｙ）試験、ｐ＜０．００１）。それゆえ、ＭＰＴＰはそれら３種のＭＰＴＰ 前処理群（図４黒棒）においてＴＨ十細胞体の３６．３８および４２％の平均喪 失を引き起こした。すべてのＭＰＴＰセーライン対照群は統計的に同じ（ｐ＞０ ．０５）であった。図４はまた、ＭＰＴＰ−セーライン（１７０６＋／−２１３ ，６）およびＭＰＴＰ−クロルシリン（１７２５＋／−２１３，６）の値が統計 的に同じであるために、ＭＡＯ−Ａ阻害剤であるクロルシリンがニューロンを回 復しないことを示す。

デプレニールは、ＭＰＴＰ投与後投下後−１＋　ＳＮｃ細胞体数を、それぞれ１ ０．０．２５．０．０１ｍｇ／ｋｇの投薬量において、２５８６＋／−１６１（ 喪失１４％）　、２５３５＋／−１６９（喪失１６％）および２７４７　＋／− １４５にまで増加させた。よって、すべてのデプレニール投薬量は、ＭＰＴＰに より引き起こされるＴＨ十細胞体の喪失を、ＭＰＴＰの後セーライン処理した場 合に見られる喪失の５０％以下に減少させた。すなわち、３種のダブレニール投 薬量すべてが、セーライン処理動物と比べて、同様かつ統計的に有意（ｐ＜０． ００１）なニューロン数の増加を生じた。

図３および４に示した結果は、上で議論したＭＰＴＰ誘導によるＴＨ＋　ＳＮＣ の喪失を考慮すると、ずっと衝撃的なものである。５日目までに、２０日目んま でに死んだであろうところのＴＨ＋　ＳＮｃニューロンのうち７５％がすでにそ のＴＨ−免疫反応性を失っており、死んだであろうところの２５％のＴＨ十ＳＮ ｃニューロンのみが５〜２０日の間にＴＨ−免疫反応性を失い続けた。ニューロ ン喪失の経時変化が本研究のはじめの部分とその継ぎの部分で同様であると仮定 すると、ＴＨ十　ＳＮｃ細胞体数は、３日目に平均値３０１４細胞体／核から２ １６９へと減少し、ついで、さらに２０日目までに平均値１８７２細胞体／核に まで減少するであろう。ダブレニール処理マウス（０，２５ｍｇ／ｋｇ）はそれ により平均値２５３５細胞体／核を有しており、ダブレニールが、投与１７日間 に死んだすべてのＴＨ＋ＳＮｃニューロンを回復させ、もはやＴＨ十免疫反応性 によって確認できない幾分かのＴＨ＋　ＳＮｃニューロンを回復させることさえ てきることを示す。

図２Ｃ１〜Ｃ３の組み合わせニソスル／ＴＨ十総数を、ＭＰＴＰに続（ダブレニ ール０．２５ｍｇ／ｋｇ投与処理した３匹の動物の蓄積したデータに関してプロ ットした。図２Ｃ２は、ＭＰＴＰ−セーライン処理動物（図２Ｂ２）と比較した 場合のニラスルおよびＴＨ＋の中サイズのＳＮｃ細胞体の喪失の組み合わせの減 少を示す。ＭＰＴＰ−セーライン処理動物（図２Ｂ３）と比べると、ＭＰＴＰ− デプレニール処理動物（図２Ｃ３）に関する大サイズの細胞体の相対的に小さい 減少が起こる。組み合わせニソスル／ＴＨ＋プロットは、ＭＰＴＰ−ダブレニー ル処理マウスにおけるＴＨ＋　ＳＮｃ細胞体の抑えられた喪失が、ＴＨ免疫反応 性でないニューロン数の減少というよりもむしろニューロンの死の減少によるも のであることを確認する。

実施例２ ＭＰＴＰ処理マウスに実施例１で示した方法に従いダブレニール（０，０１ｍｇ ／ｋｇまたは０．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの 測定値を、以下に示す方法により、最初の０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．２５ｍ ｇ／ｋｇのデプレニール投与後２４時間および１８日後（２０日目に免疫化学的 分析のために動物をと殺した丁度その後である２１日目に相当）に得た。ウルト マン、アール・ノエイ（Ｗｕｒｔｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、）およびアクセルロド、ジ エイ（＾ｘｅｌｒｏｄ。

Ｊ、　）、　ハイオケム・７フー７コル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＰｈａｒＩＩｌａ ｃｏｌ、　）　１９６３年；１２：１４３９−１４４４の方法により、ＭＡＯ− ＡとＭＡＯ−Ｂを区別するために基質を変更して、新鮮組織ホモジネートにおい てＭＡＯ活性を測定した。本性は、トルエン／酢酸エチル中の（１４−Ｃ）−セ ロトニン（ＭＡＯ−Ａ用）または（１４−Ｃ）フェニルエチルアミン（ＭＡＯ− Ｂ用）いずれかの酸性代謝物の抽出物に基づく。組織ホモジネートを、放射性標 識したセロトニン（１００マイクロモラー）またはフェニルエチルアミン（１２ ５マイクロモラー）いずれかを含むりん酸カリウム緩衝液中、３７℃にてインキ ュベーションした。ＨＣＩを添加することにより反応を停止し、トルエン／酢酸 エチル中に酸性代謝物を抽出した。トルエン／酢酸エチル層の放射活性を液体シ ンチレーションスペクトル分析により測定した。ｌ！！沸組織組織ホモジネート は酵素（クレイン、ニス・ビー（ｃｒａｎｅ、　Ｓ、　Ｂ、　）およびグリーン ウッド、ノー・イー（Ｇｒｅｅ口ｗｏｏｄ、ｃ、Ｅ、）、ｒ食物脂肪源はラット のミトコンドリアのモノアミノキンダーゼ活性およびメクロニュートリエントセ レクションに影響する］、ファーマコル・バイオヶム・ビヘイビ（Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｅｈａｖ、）　、１９８７年：　２７　：１−６ ）を含む反応混合物のいずれががら盲検値を得た。

図１５は、最初の０．２５ｍｇ／ｋｇまたはＯ，ＯＩｍｇ／ｋｇのダブレニール 投与後２４時間および１８日後（２０日目に免疫化学的分析のために動物をと殺 した丁度その後である２１日目に相当）のＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ測定値を 表す。これより、ＭＡＣ）−Ｂ阻害（１００％のＭＡＯ−Ｂ活性を阻害）は、処 理期間１７日間ずっと徐々に上昇し、２つの測定値（図１の対応した標識ｄ４お よびｄ２２）は、処理期間の始めと終わりにおけるＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂ 活性の図を示す。

各ペアー上の角カッコ内のＫＳ可能性は、コルモゴロフースミルノフ（Ｋｏｌｍ ｏｇ。

１ｏｖ−３ｍｉｒｎｏｖ）の２試料非−パラメーター統計試験（ンーゲル、ニス （ＳｉｅｇｅＬ、　Ｓ、　）。

ノン・バラメトリンク・スタティスティカル・フォー・ザ・ビヘイビアラル・サ イエンス（ｎｏｎ−ｐａｒａｌｌｌｅｔｒｉｃ　５ｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｔｅ ｓｔｉｎｇ）マクグロー・ヒル−ブック０カンバーニー（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ ｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９５６年、１２７−１３６頁）の結果を表 し、デプレニールーセーライン処理ペアーが同じ数の群から誘導されるかどうか を調べるものである。何等かの有意な相違を検出するためにはｐ＜０．５である 値が要求され、ｐ＜０゜０１が好ましい。よって、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤が高投薬量 で弱いＭＡＯ−Ａ阻害を起こしつるという理由で、０．２５ｍｇ／ｋｇデプレニ ール投薬量に関する真の値であるかもしれないｄ４における弱いが検出可能なＭ ＡＯ−Ａ阻害が存在する。０．２５ｍｇ／ｋｇの投薬量は、ｄ４（７２％の活性 、２８％の阻害）およびｄ２２（３１％の活性、６９％の阻害）の両方において 強いＭＡＯ−Ｂ阻害を引き起こす。抗−抑制効果のためには９０％またはそれ以 上のＭＡＯ阻害が必要であるが、考えられる２８〜６９％のＭＡＯ−Ｂ阻害は０ ．２５ｍｇ／ｋｇのデプレニール投与における回復を媒介しつる。

最も重要には、０．０１ｍｇ／ｋｇの投薬量は、ｄ４およびｄ２２において、有 意なＭＡＯ−ＡまたはＭＡＯ−Ｂ阻害を全（起こさない。よって、０．０１ｍｇ ／ｋｇ投与による著しい回復はＱ、２５ｍｇ／ｋｇのものと等価であるが・ＭＡ Ｏ−Ｂ阻害によるものではあり得ない。それゆえ、ダブレニールは、ＭＡＯ−Ｂ をブロックする構造に関連していなくてもよい３次元構造を通して受容体を活性 化しうる。

実施例３ メイン州バー・ハーバ−のジャクラン・ラブダ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ）社 の５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを個別ケージで飼育し、適宜エサと水 を与えた。マウスに最初の２週間のならし期間を与え、２１℃一定の別室で明暗 １２時間ずつのサイクルに置いた。仮定上の「昼」は８時に始まり、仮定上の「 夜」は２０時に始まる。仮定上の昼には光量を２００ルクスに維持した。ストウ ルチング（Ｓｔ。

ｅｌｔｉｎｇ）電気モニターで運動状態を選択的に定量し、それぞれのマウスの センサー・ボックスを各ケーンの下に置いた。エサおよび訓練期間のごとき高頻 度の信号妨害は記録しなかった。個々のマウスの運動状態を、頻繁な暗闇（ＤＤ ）またはＬＤ条件下で９０〜１２０日間連続的にモニターした。約２０日後、マ ウスに１日２回、５日間、セーラインまたはＭＰＴＰ注射処理を行った（注射前 の日を一５〜０日とする）（積算投薬量を３７５．７５．１５０および３００ｍ ｇ／ｋｇとした）。仮定−七の昼の間に注射がすでに行われる。「点灯」４時間 後に最初の注射を行い、「消灯」４時間前に２回目の注射を行った。

運動活性のスペクトル分析（ブルームフィールド、ピー（Ｂ１ｏｏ＋１ｆｉｅｌ ｌｄ、　Ｐ、　）フーリエ・アナリシス・オフ・タイム・シリーズ　アン・イン トロダクンヨン（Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｉｍｅ　５ｅｒ ｉｅｓ：＾ｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）　；シコン・ワイリー・アンド・サ ンズ（Ｊｏｈｎ　！ｙｌｉｅ　ａｎｄ　５ｏｎｓ）ニューヨーク、１９７６年、 プライアム、イー・オー（Ｂｒｉｇｈａｓ、　Ｅ、　Ｏ，）、　ザ・ファスト・ フーリエ・トランスフオーム（Ｔｈｅ　Ｆａｓｔ　Ｆ。

ｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒ＋＊）　；ブレンチスーホール（Ｐｒｅｎｔｉｓ −Ｈａｌｌ）、　ニューヨーク、１９７４年、マーメアリス、ビー・ゼット（Ｍ ａｒｍａｒｅｌｉｓ、Ｐ、Ｚ、）、７−メアリス、ブイ・ゼットＣＭａｒ■ａｒ ｅｌｉｓ、　Ｖ、　Ｚ、　）、アナリシス・オフ・フィジオロジカル・システム ズーザ・ホワイト−ノイズ・アプローチ（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｙｓｔｅｓ＋５−ｔｈｅ　Ｗｈｉｔｅ−ｎｏｉｓｅ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ）　、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、　ニュー ヨークおよびロンドン、１９７８年）を、迅速フーリエ変換を用いたシスシフト （ＳＹＳＴＡＴ）統計ソフトウェア・プログラムにより行った。丁度２４０時間 （約１゜日）または１２０時間（約５日）すぎの期間の活性総数を用いた。試料 数を選択し、丁度１２８または２５６を越えるようにして、２乗の法則を満たす ようにした。フーリエ解析の前に、活性値をスプリット−コサイン−ベル・テー パーで処理して強い成分からの他の成分中への漏れを減らした。ついで、これら の値を０ないし５１２個の試料で埋めた。ついで、これらの値がら平均値を除去 し、５゜１２ないし５１２の時間／サイクル値を包含する１００個ののラグにつ いて、フーリエ変換を計算した。強度を平方して各成分のベキ数を決定し、各時 間／サイクル値に対するベキ数を総ベキ数のパーセンテージとして表した。

神経化学的分析を、最後のＭＰＴＰ注射後、５．１０．１５および２０日に行っ た。けい椎を外すことによりと殺し、脳を除去した。線状組織を解剖し、核アキ ュムベンおよび原状を含めた。組織を、そのカテコールアミン濃度を電気化学的 検出する逆相イオンペアー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定 するまで、２−メチルブタン（コダック社製）中、−７０℃に冷却した。組織試 料を秤量し、ついで、ジヒヂリキシベンジルアミンを内部標準として含有する０ ２Ｎ過塩素酸中でホモジネートし、アルミナ上に抽出した（メフォード、アイ・ エア・ジェイ（Ｍｅｆｆｏｒｄ、　１．　Ｎ、　Ｊ、　）、　ニュー　ｏサイエ ンス・メソ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｖｅ　Ｍｅｔｈ、）１９８１年、３．２０ ７−２２４）。カテコールアミンを０．ＩＮりん酸中に脱離させ、濾過し、ウル トラスフエア０Ｄ８５μｍカラムに注入した。移動相は７．１ｇ／ｌのＮａ２Ｈ ＰＯ，，５０ｍｇ／ｌのＥＤＴＡ、１００ｍｇ／Ｉのオクチル硫酸ナトリウムお よび１０％メタノールを含有する。検出器電位はＡｇ−ＡｇＣ！リファレンス電 極に対して＋０．７２であった。インターラン変化性は約５％であった。

図５は、９２日間の典型的な記録を示し、黒棒はＭＰＴＰ注射間隔（合計１５０ ｍｇ／ｋｇ、５日間毎日３０ｍｇ／ｋｇ）を示す。活性変化の上のそれぞれの垂 直な棒は１時間の活性の合■を表す。活性ピークのの大きさの循環的変化を導入 する速いはう（約２４時間）の規則的なリズムの上に乗った１００〜２００時間 のゆっくりとしたリズムがあることに注意すべきである。活性強度のみならずこ れらのパターンの規則正しさは、ＭＰＴＰ注射期間（６７５〜８４２時間）に優 位に影響されているが、１２００時間、すなわち注射後１５〜２０日までには「 回復」するように思われた。

時間領域における運動活性分析は、多数の内因性の活性サイクルの付加により複 雑化し、その結果、フーリエ分析を用いてデータを定量した。セーライン注射マ ウスからのＬＤおよびＤＤブレインジェクションコントロール期間に関する高分 析能スペクトルを図６に示す。該スペクトルを２５６個の活性総数について計算 し、ついで、フーリエ変換を適用する前に、４０９６個の値をゼロで埋めた。

図６８において、Ｌ　Ｉ）およびＤＤ両方のスペクトルは約２４時間／サイクル における主ピークを示し、それは全ベキ数の７５％以上を含む。ＬＤピークより も約９分短いサイクル長へのＤＤピーク中心のシフトに注意すべきである。図６ ｂにおいて、２番目のピークが１００〜２５０時間／サイクルに生じており、そ れは図５の粗データからの先の観察結果と矛盾しない。このピークは、ＬＤスペ クトルと比べると、ＤＤスペクトルに関して約５０時間／サイクルだけシフトし ている。より長い時間／サイクル値は他のピークと重ならない。ＬＤに乗ってい る間だけ生じる３番目の小さなピークが６０−９０時間／サイクルにわたり生じ ることに注意すべきである。ゆっくりしたピークからの周期的なピークのはっき りした分離が、ＭＰＴＰ注射後の主たる２４時間目の成分のベキ数の変化を個々 に評価することを可能にした。それゆえ、運動活性を２２〜２６時間／サイクル のピーク下のベキ数のパーセンテージとして表す。

図７において、パネルＡは、セーライン注射による動物の内在性活性の妨害が、 注射前および注射後の日々に対するＰ２２〜２６のベキ数のパーセンテージを減 少させるに十分であったことを示す。よって、パネルＢのような活性変化は、Ｍ ＰＴＰ注射期間に関する信頼出来る解釈とはなりえない。セーライン注射は、注 射後の期間（例えばパネルＣ）におけるＰ２２〜２６に何の変化も起こさなかっ た。対照的に、１５０および３００ｍｇ／ｋｇの投薬量（図８参照）は、Ｐ２２ 〜２６の著しい抑制を生じたが、１２ないし２０日までには回復した（パネルＢ およびＤ）。

図８は、セーラインおよび３７．５または７５ｍｇ／ｋｇＭＰＴＰ注射は、Ｐ２ ２〜２６の運動活性を、対照の注射前の日々の運動活性から変化させなかったこ とを示す（誤差を示す棒は、プールした対照の活性に関して＋／−１の標準偏差 を表す）。対照的に、Ｐ２２〜２６のピークのベキ数は、１５０または３００ｍ ｇ／ｋｇのＭＰＴＰ処理後５日に平均対照値の２０〜６０％にまで減少し、中心 となる２０日までには正常に戻った。

１５０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰまたはセーライン処理した２番目のシリーズの動物 を、ＭＰＴＰ注射後５．１０．１５．２０および６０日目にＴＨ免疫化学的分析 用にと殺し、切片をアビジン−結合西洋ワサビ・ペルオキシダーゼおよびジアミ ノベンジジンで可視化した。バラホルムアルデヒドを拡散させた脳を中心に沿っ て２つの部分に分け、ティッシュ−チック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）を用いてセ ーライン注射およびＭＰＴＰ注射動物の半分ずつの脳を貼り合わせた。一連の１ ０μｍｇ切片を、脳幹を通して取り、両方の動物からのＳＮｃを含むようにし、 その結果、セーラインおよびＭＰＴＰ処理動物からのＳＮｃニューロンが直接隣 合い、同様の濃度の抗体および試薬にさらされるようにした。パネルＡおよびパ ネルＢ（図９）は、５および２００回目貼り合わせたＳＮｃ切片を表す。

図１０のパネルＡは、全校を取ったＭＰＴＰ処理によるＴＨ＋、ＳＮｃおよびＶ ＴＡニューロン細胞体の総数を対応するセーライン注射動物に対する平均総数の パーセンテージとして示す（誤差の棒は標準偏差）。ＭＰＴＰ注射動物を塗りつ ぶした印で表す。２０日目以降ＴＨ十細胞体数の明らかな維持に伴い、５〜２０ 日目から検出可能なＴＨ免疫反応性のあるＳＮｃ細胞体数が徐々に減少したこと に注意すべきである。パネルＢ、ＣおよびＤはセーラインおよびＭＰＴＰ注射動 物についての線状体ＤＡならびにＤＯＰＡＣ濃度を示す。図８の運動活性の回復 にともなって線条体ＤＡ濃度が正常レベルに回復する経時変化の類似性に注意す べきである。ＭＰＴＰ注射動物のＤＯＰＡＣ／ＤＡ比は５〜１０日目にわたり著 しく増加して急速に減少し、ついで、セーライン注射動物の２倍の一定値を維持 している。

コンピューターによる吸光度（ＯＤ）測定システムを用いて細胞体ＴＨ免疫反応 性ならびに貼り合わせた脳切片について、任意に選んだＳＮｃおよびＶＴＡ細胞 体（シフトン、ダブリュ・ノー（Ｔａｔｔｏｎ、　ｆ、　Ｇ、　）ら、プレイン ・レス（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　）、１９９０年、５２７．２ｌ−３２）に対す る、すぐに隣接した組織におけるバンクグラウンドの免疫反応性を測定した。単 位面積あたりのバックグラウンドＯＤを、各細胞の単位面積あたりの細胞体ＯＤ から差し引いて、単位面積あたりの細胞のＴＨ免疫密度を評価した。各張り合わ せた切片のセーライン注射動物の脳の半分についてのバックグラウンドＯＤを用 いて、ＭＰＴＰのバックグラウンドＯＤおよびセーラインとＭＰＴＰの細胞のＯ Ｄに関する値の規格化を行った。図１０は、セーラインまたは１５０ｍｇ／ｋｇ のＭＰＴＰ注射５注射５巳２０バックグラウンドおよびＴＨ＋　ＳＮｃ細胞体に ついての細胞の測定値に関する分散を表す。この研究および他の研究においては 、張り合わせた脳を用いて、細胞の値を確実に比較できるセーラインおよびＭＰ ＴＰ注射の脳の半分について、有意に（ｐ＜０．０５）バックグラウンド値が異 なることはなかった。セーライン注射動物に関する対照の分散は、平均バックグ ラウンドレベルの２および４倍の並数を持ち、平均バックグラウンドレベルの０ ．５ないし６倍の範囲のＳＮｃ細胞体に関する免疫密度の双峰分散を示した。

ＭＰＴＰ処理したＳＮｃおよびＶＴＡ細胞体に関する細胞のＴＨ免疫密度の著し い減少が５日以内にあり、注射後２０日までにセーライン対照と同等の分散にま で徐々に回復した（図１０および１１）。ＭＰＴＰ処理によるＳＮｃおよび■Ｔ ＡニューロンのＴＨ免疫密度の回復は、線条体ＤＡおよび運動活性の回復と並行 していた。

本発明者らは、ＭＰＴＰで処理したマウスにおける長時間運動活性の分析に対し て高速フーリエ変換による分光分析技術を適合させた。これによって、最近の取 り扱いまたは観察者の存在により覚醒された動物の主観的アセスメントに無関係 な、非常に高感度かつ再現可能なデータが得られる。まず、ラットおよびマウス ＳＮｃニューロンが毒素に対して耐性であるという見解によって、ＭＰＴＰが薩 歯頚において運動欠乏を起こさないことが提案された。これは、主に、ＭＰＴＰ の後の線条体ドーパミンの一過性変化だけが報告された神経化学的データに基づ いていた［リカート，ジー・エイ（Ｒｉｃｕａｒｔｅ．　Ｇ．　Ａ．　）ら、プ レイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　）　１９　８　６、３７６、１１７ 〜１２４、およびウォルターズ。

エイ（Ｗａｉｔｅｒｓ．　Ａ．　）ら、バイオジェニック・アミンズ（　Ｂ　ｉ ｏｇｅｎｉｃ　Ａｍ１ｎｅｓ）１９８４、１、２９７〜３０２］。他には、線条 体ＤＡ濃度の維持された変化と関係すると思われる高用量の毒素で処置されたマ ウスにおける、遅延化された肢の運動、異常歩行および慢性的に減少した運動活 性を報告したものがある［デュボイシン．アール・シー（Ｄｕｖｏｉｓｉｎ，　 Ｒ．　Ｃ．　）ら、シーセント・ディベロープメント・イン・バーキンラング・ ディシーズ（Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１ｎＰａｒｋｉｎｓｏｎ ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ）　：ニス・ファージ（Ｓ．Ｆａｈｎ）ら、レイブン・プ レス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）　：：ユーヨーク、１９８６　；第１４７頁〜 第１５４頁、ヘイッキラ．アール・イー（Ｈｅｉｋｋｉｌａ．　Ｒ．　Ｅ．　） ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９　８　４、２２４、１４５１−１４５ ３、ヘイッキラ，アール・イー（Ｈｅｉｋｋｉｌａ，　Ｒ．　Ｅ．　）ら、ライ フ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．）１９８５、３６、２３１〜２３６］。

ＭＰＴＰの後の謡歯頚における運動活性の変化の従来の測定は、あいに（、短期 間測定［サガール・エイ（Ｓａｇｈａｌ　Ａ．）ら、ニューロサイエンス・レタ ーズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｌｅｔｔ．　）　１　９　８　５、４８、１７９　 〜１８４］または短く単離された測定［ウイリス，ノー・エル（Ｗｉｌｌｉｓ． 　Ｇ．　Ｌ．　）ら、プレイン・リサーチ・ブリチ：／　（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ 　Ｂｕｌｌ）　１９　８　７、１９、５７〜６２］であった。今日まで、ネコ［ シュナイダー，ノエイ・ニス（　Ｓ　ｈｎｅｉｄｅｒ．　Ｊ　、　Ｓ。）ら、イ シスペリメンタル・ニューロロシー（Ｅｘｐ　Ｎｅｕｒｏｌ）　１　９　８　６ 、９１、２９３〜３０７］、マーモセント［ウォーターズ，シー・エム（Ｗａｔ ｅｒｓ，　Ｃ．　Ｍ．　）ら、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ）　１　９　８　７、２３、１０２５〜１０３９］または薩歯頚［チュー、　ノ ー　−　７−（Ｃｈｉｕｅｈ．　Ｃ．　Ｃ．）ら、サイ：１７フー７コロジー・ ブリチン（　ＰｓｙｃｈｏｐｈａｒＩＩｌａｃｏｌ．　Ｂｕｌｌ．　）　１　９ 　８　４、２０、５　４　８〜５　５　３、およびヨハネセン，ンエイ・エム（ 　Ｊ　ｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，　Ｊ　、　Ｍ．　）ら、ライフ・サイエンス（Ｌ ｉｆｅＳｃｉ．）１９８５、３６、２１９〜２２４］を含む種々のＭＰＴＰモデ ルにおいて観察された行動回復の滴定な説明はなかった。

ＳＮｃおよびＶＴＡ細胞体におけるＰ２２−２６ピークの下でパワーによって測 定された運動活性、線条体ＤＡ濃度およびＴＨ免疫密度は、ＭＰＴＰ処置後の正 常に向かう回復において相互に関連させられる。検出可能なＴＨ免疫反応性を持 つＳＮｃおよびＶＴＡ細胞体の数は、ＭＰＴＰ処置後の最初の２０日間にかけて 定常状態レベルに減少する。故に、線条体中のドーパミン濃度は増大し、一方、 検出可能なＴＨ濃度を持つＳＮｃおよびＶＴＡニューロンの数は減少する。Ｄ。

ＰＡＣ／ＤＡ比の急速な上昇および低下は、細胞外空間中のＤＡが喪失する線条 体においてＤＡ終末の死滅に関係すると思われる。しかも、該比率は、ＤＡ全合 成よって、ＭＰＴＰ暴露にかかわらず生存するＳＮｃニューロンが増加すること を示唆する初期の発見を援護して、１５日後の増加したレベルで維持される。

おそらく、ＳＮｃおよびＶＴＡニューロンの細胞体におけるＴＨ免疫密度の測定 によっては、ＴＨ濃度の直線推定値は得られない。おそら（、ペルオキシダーゼ 反応の使用によって、細胞質中の第２抗体ーアビジン複合体数の直線推定値が得 られるが［レイス，ディ・ジェイ（Ｒｅｉｓ．　Ｄ．　Ｊ．）ら、サイトケミカ ル・メソッズ°インーニューロアナトミー（Ｃｙｔｏｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＮｅｕｒｏａｎａｔｏＩＩ＋ｙ）アラン・アール・リス・イ ンコーホレイテッド（Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉ５ｓ．　Ｉｎｃ．）　：ニューヨー ク、１９８２　；第２０５頁〜第２２８頁コ、本発明者らのポリクローナル抗体 に対する親和性定数、ならびに第１および第２抗体間の免疫反応に対する親和性 定数によって、エピトープの濃度およびアビジン分子の濃度間の直線関係は得ら れない。しかも、この結果、おそら＜、ＭＰＴＰ暴露にもがかわらず生存してい るＶＴＡおよびＳＮｃの細胞体中のＴＨ濃度の回復が示される。ＴＨ免疫密度の 回復は、線条体ＤＡ濃度の増加に相当し、これは、ＴＨ合成の回復がＤＡ濃度の 回復の因子であり、かつ、おそらく、個々の生存ニューロンによるＤＡ全合成増 加させることを示唆する。

舊歯頚における新線条体ドーパミン作動性系および他のカテコールアミン作動性 系は、運動活性の発生に関係していた［タバー，ジエイ（Ｔａｂａｒ　Ｊ．）ら 、ファーマコロシー・バイオケミストリー・アンド・ビヘイビャ−（　Ｐ　ｈａ ｒｍａｃｏｌＢｉｏｃｈｅｍ　Ｂｅｈａｖ）　１　９　８　９、３３、１３９〜 １４６、オバーラング−、シー（Ｏｂｅｒｌａｎｄｅｒ．　Ｃ．　）ら、ニュー ロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｌｅｔｔ．　）１９８６、６７ 、１１３　〜１１８、メルニツク，エム・イー（Ｍｅｌｎｉｃｋ．　Ｍ．　Ｅ． 　）ら、第１７回神経科学協会の年次会議（　１　７　ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍ ｅｅｔｉｎｇ　Ｏｆ　ＴｈｅＳｏｃｉｅｔｙ　Ｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ ｅ）　、アメリカ合衆国ルイジアナ州二ニー・オルレアンズ、１９８７年１１月 、１３、マレク，ジー・ジエイ（Ｍａｒｅｋ．　Ｇ．　Ｊ　、　）ら、プレイン ・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５）　１　９　９　０，　５１７、１〜７、コス トブスキー，ダブリｘ　（Ｋｏｓｔｏｖｓｋｉ．Ｗ．）ら、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．　Ｐｏ１．　１　９　８　２、３３、３８５〜３８８、フィンク，ジエ イ・ニス（Ｆｉｎｋ，　Ｊ．　Ｓ．）　、スミス、ジー・ピー（Ｓａ＋ｉｔｈ， Ｇ．　Ｐ．　）　Ｊ，　Ｃｏｍｐ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｓｙｃｈ．　１９　 ７　９、９３、２４〜６５］。

しかも、ＳＮｃまたはＶＴＡニューロンの特異的役割は、たとえあるとしても、 不確実である。故に、運動活性に関連しているＳＮｃおよび線条体パラメーター についての相互に関係した回復は、必ずしも、原因および作用を含まなくてよい 。

しかも、本発明者らは、ＭＰＴＰによって、種々のカテコールアミン作動性系に おけるＴＨ−ニューロンの同様の喪失が引き起こされるので［セニュク，エフ・ エイ（　５ｅｎｉｕｋ．　Ｎ．　Ａ．　）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ 　Ｒｅｓ．）　１　９　９　０，　５２７・第７百〜第２０頁］、本発明者らが ＳＮｃおよびＶＴＡドーノクミン作動性ニューロンについて示したものと同様の これらの系における伝達物質関連機能の回１ｒセニュク、エヌ・エイ（Ｓ　ｅｎ ｉｕｋ、　Ｎ、　Ａ　、　）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、） 　１９９０．５２７・第７百〜第２０頁〕は、運動回復を引き起こすことを示し た。ＤＡ合成の回復は、ＭＰＴＰ！露にかかわらずに生存しているＳＮｃニュー ロンがそれらの仲間の喪失を補償しようとする試みを表し、該補償の成分が回復 に関連し、次いで、ＭＰＴＰ！露にかかわらず生存しているニューロンにおける チロシンヒドロキシラーゼの合成を増加させることを表す。

実施例４ ダブレニールが他の軸索損傷ニューロン表現型、例えばラットの運動ニューロン の死滅を減少させることができるかを測定するために実験を行った。軸索切断後 に死滅したラットの運動ニューロンの割合は、生存の最初の４日間、最大であり （８０〜９０％喪失）、次の３〜４週間にわたって成人レベルに低下した（２０ 〜３０％）［セントナー（Ｓ　ｅｎｄｔｎｅｒ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒ ｅ）　、３４５．４４０〜４４１．１９９０、スナイダー・ダブリュ・ディ（Ｓ 　ｎ１ｄｅｒ　Ｗ、　Ｄ、　）およびサンダー、ニス・ジエイ（Ｔｈａｎｅｄａ ｒ、　Ｓ、　Ｊ　、）　Ｃｏｍｐｌ、　Ｎｅｕｒｏ　１．２７０．４８９．１９ ８９］。１４日齢のラットの２つのグループ（ｎ＝６）に、片側顔面神経横断を 与え（外傷）、２つのグループは外傷を受けなかった（無外傷）。外傷および無 外傷のグループを対にして、これを１日おきにセーラインまたはデプレニール（ １０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。該ラットを、軸索切断後、２１日目に殺し、顔面 神経核のレベルで脳幹の連続冠状組織切片を、コリンアセチルトランスフェラー ゼ（ＣｈＡＴ）免疫細胞化学［本明細書中に引用記載するＴａｔｔｏｎら、Ｂｒ ａｉｎ　Ｒｅｓ、　５２７　：　２１．１９９０１、ニラスル染色り本明細書中 に引用記載する５ｅｎｉｕｋら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５２７　：　７．１９ ９０　；　Ｔａｔｔｏｎら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５５２７・２１．１９９０コにつ いて処理した（第１２図）。

特に、１４日齢のスグラーギュードーレイ（Ｓ　ｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅｙ ）う’７トの２つのグループについて７１０タン−亜酸化窒素麻酔下で、茎乳突 孔について、右顔面神経を七〇軸素で横断し、一方、他の２つのグループは手術 しなかった（各グループにおいてｎ＝６）。手術日に、外傷グループおよび無外 傷グループにダブレニール１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与し始め、殺すまで１日お きに投与した。他の外傷グループおよび無外傷グループには、セーラインを同一 注射した。横断の２１日後に、該ラットを麻酔の過剰投与によって殺し、次いで 、等張性セーラインおよびリン酸塩緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで潅流し た。無外傷グループ由来の脳を中央線に沿うて縦に２等分し、セーライン処置動 物およびデプレニール処置動物由来の半分の脳を、表面ランドマークが符号する ように、ティシュ・チックを使用して一緒に接着した。無外傷動物についての接 着した脳および外傷動物についての無傷脳を一７０℃メチルブタン中で冷凍し、 顔面神経核を含有する髄質の部分を通って、１０μｍ連続切片を切断した。各第 ３連続切片をＣｈＡＴに対するポリクローナル抗体と反応させ、ビオチニル化し た第２抗体とインキュベートし、次いで、ＨＲＰコンジュゲートしたアビジンと インキュベートし、最後に、ジアミノベンジジンおよびＨ２０ｔと反応させた［ Ｔａｔｔｏｎら、　ＢｒａｉｎＲｅｓ、５２７：２１．１９９０］。接着した半 分の脳についての対になった切片は、デプレニールおよびセーライン無外傷対照 グループ間の免疫反応におけるいずれかの差異が、抗体または試薬に対する異な る浸透または暴露によらないことを確実にした。

第１２図は、顔面神経の横断に対して同側の顔面神経核を通る隣接したＣｈＡＴ 免疫反応切片（ＡＩおびＢｌ）ならびにニラスル染色切片（Ａ２およびＢ２）の 顕微鏡写真を示す。ＡおよびＡ２は、セーライン処置動物についてであり、Ｂ１ およびＢ２は、ダブレニール処置動物についてである。

第１３図は、異なる外傷および処置グループの顔面神経核についてのＣｈＡＴ＋ 細胞体の下図についての棒グラフを示す（バー−平均、誤差バー−標準偏差）。

核プロフィールを含有するＣｈＡＴ免疫反応性細胞体は、顔面神経横断体を通っ て連続して採取された各第３切片から計数した。各バーの頂上の値は、平均値で ある。Ｉ　ｐｓｉ、　ＬｅｓｉｏｎおよびＣｏｎｔｒａ、　Ｌｅｓｉｏｎは、各 々、顔面神経横断に対して同側および対側にあることを示す。計数は、顔面神経 核におけるＣｈＡＴ十細胞体の合計数を概算するようには調節されなかった。そ こで、無外傷グループについての数は、ニラスル染色細胞体の数について報告さ れた値の約３分の１である。

該値を、マンーホイソトニーＵ試験を使用してペアワイズ法で統計学的に比較し た。

第１３図に示すとおり、顔面神経核の全長を通る各第３連続切片についてｃｈＡ Ｔイムノポジティブ（ＣｈＡＴ＋）細胞体の数は、無外傷−セーライングループ および無外傷−デブレニールグループについて統計学的に同一であった（ｐ＝０ 、５２０）。対照的に、ＣｈＡＴ十細胞体の数は、顔面神経横断に対して同側（ ２３８％無外傷−セーライン、ｐ＝０．００３）および対側（８２，２％無外傷 −セーライン、ｐ＝０．０２４）の顔面神経核についての外傷−セーライングル ープについて有意に減少した。デプレニール処置は、同側外傷顔面神経核につい てのＣｈＡＴ十細胞体の数の２倍以上であり（５２，７％無外傷−セーライン、 ｐ＝０．００４）　、対側核についてのＣｈＡＴ＋数の減少を防止した。その結 果、それらは、無外傷グループと統計学的に同一であった（ｐ＝０゜８７３）。

第１４図は、隣接切片の組合せニソスル／ＣｈＡＴ十数を示す。ＣｈＡＴについ て免疫反応させたものの間の介在切片の各対の一方はニラスル染色であった。

カメラル／ダの助けをかりて、ＣｈＡＴ十細胞体および二・ソスル染色仁含有細 胞体の数［標準についてのＯｐｐｅｎｈｅｉｍ、　Ｒ，Ｗ、ツヤ−ナル・オフ・ ）＼イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、）　、Ｃｏｍｐ、 Ｎｅｕｒｏｌ、２４６　：　２８１．１９８６］を、各動物について各校の長さ を通して２０個の任意選択切片上の隣接する切片の適合領域において計数した。

次いで、二・ンスルの数を、隣接切片についてのＣｈＡＴ＋数に対してプツトし た（各外傷−処置グループの３匹の動物由来の数値を集めた）。ニラスルおよび ＣｈＡＴ＋細胞体数の比較を行って、イムノポジティブ・ソマタの数の減少が運 動ニューロンの死滅または免疫反応性の喪失をもたらすかを決定した。

無外傷グループについてのニソスル／ＣｈＡＴ細胞体数の組合せプロ・ノド（第 １４図Ａ）は、セーラインのグループにッスル２７．６＋／−１２，０４、ｃｈ ＡＴ＋　２７．３＋／−１３，８０、ｐ＝０．５２６、同一グループのニラスル およびＣｈＡＴ数は、対になったｔ試験を使用して比較した）およびデプレニー ルのグループにソスル２８．９＋／−１３，２、ＣｈＡＴ　２８．５＋／１３． ８、ｐ＝０．６４１）について同一の平均値および標準偏差値を有する等価対角 線の回りて対称的である分布を示す。同側外傷−セーライン動物（第１４図Ｂ） は、等価対角線に対して非対称的な分布を有する低い組合せ値を示しく高いニラ スル値へのシフトは、矢印によって記される）　、ＣｈＡＴ＋数（９，７＋／− ４，０、ｎ＝Ｏ，０Ｏ１）と比較してニラスル数（１２，６＋／−４，１８）に ついての高い平均値においてもたらされる。外傷−デプニールの点（第１４図Ｂ ）は、セーラインの点よりも小さい減少を示し、等価対角線の回りで対称的な分 布を有したにソスル１７．６　＋／−十／　−６，５、ＣｈＡＴ＋　１７．５＋ ／−６，１、ｐ＝０．６１６）。最後に、対側外傷動物についてのプロット（第 １４図Ｃ）は、セーラインにツスル２４．６＋／−１０，１、ＣｈＡＴ＋　２４ ．８＋／−１０，７、ｐ−０、１５９）およびデプレニールにツスル２８．９＋ ／−１２，１，２８，５＋／−１２，０、ｐ＝０．７４１）の両グループについ ての点は、等価対角線に対して対称的に分布する。

か（して、前記等価対角線への組合せニツスル／ＣｈＡＴ＋プロットの分布およ び同側外傷−セーライン動物についての組合せニラスルおよびＣｈＡＴ十数間の 有意な差異（第１４図）は、第１３図において示したＣｈＡＴ十細胞体の数の約 ８４％低下の結果、運動ニューロンの死滅を生じ、一方ＣｈＡＴ十免疫反応性の 喪失は、ＣｈＡＴ十運動ニューロンの約１６％の減少を引き起こすだけであった 。組合せ数は、対側核からのＣｈＡＴ十細胞体の喪失のすべてが、結果として運 動ニューロンの死滅を生じることも示した。最も重要には、組合せ数は、ダブレ ニール処置によって、運動ニューロンの死滅の著しい低下を引き起こし、同側核 の生き残っている運動ニューロンにおけるＣｈＡＴ免疫反応性の喪失を逆転また は防止した。

これは、デプレニールが運動ニューロンの死滅を防止することができるという第 １の証拠であり、デプレニールが軸索損傷ニューロンの死滅を低下させることが できることを示す研究からなる。未成熟ラントにおける軸索切断運動ニューロン の死滅は、それらが神経支配した筋肉からの栄養支持体について運動ニューロン 依存性をもたらすと思われる［Ｃｒｅｗｓ、　Ｌ、およびＷｉｇｓｔｏｎ、　Ｄ 、　Ｊ　、　；　Ｊ　。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１０．１６４４３．１９９０　；　５ｎｉｄｅｒ、ＷＥＤお よびＴ　ｈａｎｅｄａｒ、　Ｓ上記］。最近の研究によって、いくつかの神経栄 養因子がこの概念を支持する運動ニューロンの喪失を低下させることができるこ とが示された［５ｅｎｄｔｎｅｒ、　Ｍ。

ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５．４４０．１９９０１゜この研究によって、デプレニ ールが、標的由来栄養剤の喪失に対して補償するいくつかのメカニズムを活性化 する能力を有することが示唆される。神経変性疾患におけるデプレニールの作用 の部分は、低下した栄養支持体について同様の補償をもたらす。

顔面神経横断に対して対側の顔面神経核における少量の運動ニューロンの死滅の 発見は、運動神経の切賄に対して対側の無償神経における軸索の低下した数［Ｔ ａｍａｋｉ　Ｋ、Ａｎａｔ、Ｒｅｃ、５６．２１９．１９３３］および対側核の 他の様々な変化［Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｃ，Ａ　ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、４６３ ．１９８８コの前記報告と一致している。ダブレニールは、対側の運動ニューロ ンの死滅を完全に防止する。

軸素は、コリンアセチルトランスフェラーゼ［Ｈｏｅｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｒ，＆ 　Ｈａｎｃｏｃｋ。

Ｊ、Ｃ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　］　５．４８１．１９８５］を含む顔面運 動ニューロンにおけるタンパク合成の一過性の変化を開始する［Ｔｅｔｚｌａｆ ｆ、　Ｗら、Ｎｅｕｒｏ　Ｓｃｉ。

８．３１９１　（１９８８）］。ＣｈＡＴ免疫反応性を失う、小さい割合の、同 側の核におけるセーライン処置運動ニューロン（１６％）は、おそらく、免疫化 学的に検出てきるのに充分なＣｈＡＴ１度を回復しなかった生存運動ニューロン を示す。ダブレニールは、生存運動ニューロンにおけるＣｈＡＴ免疫反応性の喪 失を防止または逆転した。

デプレニールの用量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭＡＯ−Ｂ活性の大部分およびいく つかの〜ＩＡＯ−Ａ活性をよく遮断するのに充分てあった［Ｄｅｍａｒｅｓｔ、 　Ｋ、　Ｔ、、Ａａｚｚａｒｏ、　Ａ、　Ｊ、、　Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ　０ｘｉ ｄａｓｅ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｅｒ■■ Ｆ　ｕｎｃｔｉｏｎｓ　（Ｓ　ｉｎｇｅｒ、　Ｔ、　Ｐ　、、Ｋｏｒｆｆ、　Ｒ ，ＷおよびＭｕｒｐｈｙ、　Ｄ、　Ｌ編）４２３−３４０、Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７９］。故に、運動ニューロン死滅の減 少は、ＭＡＯ−ＢまたはＭＡＯ−Ａ阻害によるか、または両酵素に無関係である 。しかしながら、０．０１ｍｇ／ｋｇデブレニール用量によって、１０ｍｇ／ｋ ｇ用量で得られたものと同様の運動ニューロン死滅の減少が得られると思われる 。０．０１ｍｇ／ｋｇ用量は、ＭＡＯ−ＡまたはＭＡＯ−Ｂいずれの阻害をも生 じず、０．０１ｍｇ／ｄｇデブレニールによる救助がＭＡＯ−ＡまたはＭＡＯ− Ｂ阻害によらないことを示す。（実施例２を参照）。かくして、運動ニューロン 死滅の減少は、きっと、ＭＡＯ−ＢまたはＭＡＯ−Ａに無関係である。

最近の研究によって、この領域への動脈血供給の一過性の中断後、背側線条体ニ ューロンの壊死の低下において、ＭＡＯ阻害剤がデプレニールよりも有効である ことが示される［Ｍａｔｓｕｉ、　Ｙ、　ａｎｄ　Ｋａｍａｇａｅ、　Ｙ、、Ｎ ｅｕｒｏｓｓｃｉ　１ｅｔｔ　１２６．１７５−１７８．１９９１コ。しかも、 マウスにおいてＭＡＯ−Ａの阻害を生じるには低すぎるが、ＭＡＯ−Ｂの２０〜 ７５％阻害を生じるには充分なダブレニール用量（０，２５ｍｇ／ｋｇ）は、Ｓ Ｎｃニューロンの死滅の防止においてＩＱｍｇ／ｋｇ用量と同様に有効である。

ＭＡＯ−Ｂは、いくつかのセロトン作動性ニューロンおよびヒスタミン作動性ニ ューロン中に存在するが、主として、ダリア細胞中に濃縮されている［Ｖｉｎｃ ｅｎｔ、　Ｓ、　Ｒ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　２８．１８９−１９９　（１９８９） 　；　Ｐｉｎｔａｒｉ、　Ｊ、Ｅ、ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、２７６．１２７− １４０．１９８３］。小ダリア細胞が増殖性応答を示し、大グリアがすぐ近隣の 運動ニューロンを含む軸索に対してタンパク合成の増大によって応答するので、 ダリア細胞は、ニューロン死滅の、ダブレニール誘発防止に含まれる。

％　対照　ＴＨ＋　ＳＮｃ細胞体 ＦＩＧＵＲＥ　２ ・　別区画についての累積カウント ＦＩＧＵＲＥ　３ 活性ＣＮＴ／ＨＲ ＦＩＧＵＲＥ　５ 時間／サイクル ＦＩＧＵＲＥ　６ 正規化合計％ビーク、、−０出力 ＦＩＧＵＲＥ　１１ Ｐ工ＧＩＪＲＥ　１２ ＦＩＧＬＩＲＥ　１３ ＣｈＡＴ十　細胞体数／隣接区画 ＦＩＧＵＲＥ　１４ パーセント活性 国際調査報告 、４１．□１１．。ＮＩ　Ａｅｓ＋、。、、６．エ　ρＣＴ／ＣＡ　９２１００ １３１国際調査報告 ＰＣＴ／Ｃ＾９２１００１３３

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．動物において神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／または回復さ せるためのデプレニールまたはデプレニールの誘導体もしくは類似体の使用。
2. ２．有効成分としてのデプレニールまたはデプレニールの誘導体もしくは類似体 からなる、患者の神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／または回復さ せることによる神経系障害の治療用医薬組成物。
3. ３．有効量のデプレニールまたはデプレニールの誘導体もしくは類似体を患者に 投与することからなる、患者の神経細胞機能を維持し、喪失を防止し、および／ または回復させることによる神経系障害の治療方法。
4. ４．テスト動物に神経毒性活性を有する薬剤を投与し；試験動物に薬物を投与し ；該薬剤の投与終了から２０日以内にテスト動物を殺し；黒質緻密体を通じて脳 の連続切片を採取し：黒質緻密体を通じての脳の別の連続切片中のチロシンヒド ロキシラーゼ陽性細胞体の数を測定し、および、介在する連続切片中のニッスル 染色陽性黒質緻密体の数を測定し；測定したチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞 体およびニッスル染色細胞体の数を、薬物を投与しなかった対照動物の黒質緻密 体を通じての脳の連続切片中のチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞体およびニッ スル染色細胞体の数と比較することからなる、患者の神経細胞機能を維持し、喪 失を防止し、および／または回復させる活性についての該薬物のテスト方法。