JPH06502541A - Von Willebrand factor therapeutic fragment - Google Patents

Von Willebrand factor therapeutic fragment

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JPH06502541A
JPH06502541A JP4502228A JP50222892A JPH06502541A JP H06502541 A JPH06502541 A JP H06502541A JP 4502228 A JP4502228 A JP 4502228A JP 50222892 A JP50222892 A JP 50222892A JP H06502541 A JPH06502541 A JP H06502541A
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subunit
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JP4502228A
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Japanese (ja)
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ルッジェリ　ツァヴェリオ　エンメ
ウエア　ジェリー　エル
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ザ スクリップス リサーチ インスティテュート
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

フォノ・ウィルブランド因子の治療断片発明の分野 この発明は、血栓症のような血管障害の処置に有用なポリペプチドに関する。 またこの発明は、フォノ・ウィルブランド病（ｖＷＤ）のような出血性疾患の処 置に有用なポリペプチドにも関する。更にこの発明は、薬理学的に有用な量の本 発明のポリペプチドを組換えＤＮＡを指向した方法によって製造することに関す る。 「止血４という用語は、血管損傷により起る循環血液の喪失に対する体の防御機 構を含むプロセスを指ず。血管損傷に対する生理的応答として通常のプロセスが 、病理学的状況、例えば患者にお＋ｊるアテローム性動脈硬化血管疾患や慢性欝 血性心ｌＩ機能不全の苫しみに至りことがあり、望ましくない血栓（＃血）を形 成し、この結果血管閉塞となる。このような状況下におりる器官への血液流の減 損により重篤な病理状態に至ることがあり、これには開発途−Ｌ国における主要 な死因である心筋梗塞が含まれる。 外傷に応答するものとして、または血管疾患状態の結果としての循環系内での血 液流の１１限または停止トには複雑な・連の反応が関与、し、これは２つのプロ セス、−次および三次止血に分類４ることができる。−次止血は、血小板枠子ま たは軟質凝血形成のブ【】セスを指す。血小板は核のない円盤状の構造で直径約 ２〜５ミク［１ンであり、巨核球細胞から誘導される。有効！、 Field of Fono Willebrand Factor Therapeutic Fragment Invention This invention relates to polypeptides useful in the treatment of vascular disorders such as thrombosis. This invention also provides treatment for bleeding disorders such as Fono Willebrand disease (vWD). The present invention also relates to polypeptides useful for medical treatment. Furthermore, this invention provides pharmacologically useful amounts of the present invention. Concerning the production of polypeptides of the invention by recombinant DNA-directed methods Ru. ``The term hemostasis4 refers to the body's defense mechanism against loss of circulating blood caused by vascular injury. Refers to a process that includes structure. Normal processes occur as a physiological response to vascular injury. , pathological conditions, such as atherosclerotic vascular disease or chronic depression in the patient. May lead to hemorrhagic heart dysfunction, resulting in the formation of undesirable blood clots (#blood). This results in vascular occlusion. Reduced blood flow to organs under these conditions This can lead to serious pathological conditions, including This includes myocardial infarction, which is a major cause of death. Blood in the circulatory system as a response to trauma or as a result of vascular disease conditions A complex chain of reactions is involved in stopping or stopping liquid flow, and this involves two processes. Hemostasis can be classified into secondary and tertiary hemostasis. - Next hemostasis is achieved by platelet frame or It also refers to the formation of soft blood clots. Platelets are disc-shaped structures without nuclei with a diameter of approximately It is 2-5 microns and is derived from megakaryocytic cells. valid! ,

【−次止血は血 小板の付着によ−、て行われ、これは血小板と障害を受けた血管内皮との相互作 用であり、障害を受けた血管内皮の１では、基部をなすコラーゲン繊維および／ または他の付着性マクＴ］分−１′−１例えばプロミオグリカンおよびグルコザ ミノグリカンが露呈され、これｊこ対して血小板が結合する。 ニー次１１−血には、軟質血小板凝血物の強化または架橋結合が含まれる。この 二次プロセスは血漿中を循環する蛋白質（凝固因ｒ）によって開始され、これは 外傷または血管疾患状態に応答して一次止血の際に活性化される。これらの因子 の活性化の結果、最終的に蛋白質フィブリノーゲン（この後はフィブリンと呼ば れる）の重合体マトリックスの産生に至り、これにより軟質凝血物が強化される 。 本発明は、抗血小板薬物に関する。抗血小板薬物には、血小板または他の循環系 成分とのその相互作用を変化させることにより一次止血を抑制する薬物が含まれ る。 報告された研究開発 特異的な抗血小板薬物は１または幾つかの機構により作用する。第１の例には、 血小板細胞室内におけるイオン化されたカルシウムの利用性を低減させ、これに より血小板の活性化およびこの結果としての凝集を減損させるものが含まれる。 この戦略の代表的な薬品にはプロスタサイクリンが含まれ、またベルサチン３（ ジビリダモル）があり、これはサイクリックＡＭＰの濃度に影響を与えることに よりカルシウム濃度に影響を与え得るものである。これらの化合物の投与に関し て多数の副作用が報告されている。更なる種類の血小板薬物は、血小板内でのト ロンボキサンＡ２の合成を阻害し、血小板活性化応答を低減させることによって 作用する。非ステロイド系抗炎症剤、例えばイブプロフェン、フェノールブタシ ンおよびナプトロキサンは、トロンボキサンＡ２の前駆体の合成を触媒する特定 のシクロオキシゲナーゼ酵素の競合的阻害によって同様の効果を与え得る。アス ピリンの投与によって同様の治療効果が誘導され得るが、これはトロンボキサン Ａ、を生成するのに必要なンクロオキシゲナーゼ酵素を不可逆的にアセチル化す るものであるこきが示されている。第３の抗血小板ａ構は、表面受容体機能を妨 害すべく血小板の膜に関与するものである。この種の１つの薬物は大きな分岐【 、た多糖であるデキストランであり、凝集の際に露呈される血小板受容体とフィ ブリノーゲンとの相互作用を減損させると考えられている。歴史的に腎臓の問題 により、また心臓障害によりデキストランは患者に対して禁忌である。治療性チ クロピジンは、血小板表面上、のそのそれぞれの受容体に対する７オン・ウィル ブランド因子および／またはフィブリノーゲンの結合を抑制することにより、血 小板の付着および凝集をｎ１害すると述べられている。しかしながら、チクロピ ジンは大量に投５する必要性を除去するには不十分な特異性であることが認めら れており、これにより転じて臨床的副作用が随伴し得るものである。 前記した薬品は体に対しては外来性のものであり、多数の有害な臨床的副作用を 生起し得るが、特に多い投与量が必要な場合、この種の化合物が患者の生理また は生化学の他の観点に関与するのを防止する方法はない。止血の所定の反応につ いて患者に対して少ない投与量で投与し得るような特異性を有する薬品を提供す るのが望ましく、そのようＩヨ投う量は患者においで有害な効果を与える可能性 が非常に少ない。 止血プロセスの天然の成分から誘導された代表的な治療剤である薬品の例が、Ｅ ＰＯ公開第３１７２７８号に記載されている。この刊行物には、血小板膜糖蛋白 ＷＩｂまたはそのサブ断片のα鎖のアミノ末端領域からなる治療ポリペプチドを 患者に投与することによって患習の血栓症を阻害する方法が開示されている。 本発明は、止血機構の蛋白質の１つであるフォノ・ウィルブランド因子から誘導 される抗血栓性ポリペプチドの提供に関する。 本発明の要旨 本発明によれば、親ポリペプチドを模倣し、概して残基４４１　（アルギニン） で開始し概して残基７３３　（バリン）で終了する成熟フォノ・ウィルブランド 因ｆ９ブユニットのその断片のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのい ずれかのサブセフ）であって、親ポリペプチドまたはそのサブセットに通常は存 在するＬ以上のシスティン残基が欠失し、かつ／または１以上の他のアミノ酸に よって置換されており、したがって前記ポリペプチドは、水性媒体中で生理的ｐ Ｈにて、現ポリペプチドまたはそのザブセットより内部または銀量ジスルフィド 結合を形成する傾向が少ないポリペプチドが提供される。 この発明のポリペプチドは、組換え細菌および組換え真核宿主細胞の両者で発現 される。 現ポリペプチドまたはそのサブセットに通常は存在する１以上のンステイン残２ 人の欠失または置換による親ポリペプチドの本発明による修飾の結果、水性媒体 中−Ｃ生理的ｐｏにて、親ポリペプチドまたはそのサブセットより内部または鎮 間ジスルフィド結合を形成する傾向が少ないポリペプチドが与えられる。この実 際的な効果は、本発明のポリペプチドは親ポリペプチドより高い程度の治療活性 、および改良された安定性および溶解性を示す点である。簡便のため、本発明の ポリペプチドはここでは多くの場合「変異体」として言及する。 好適な形態では、この発明は、親システィン含有ｖＷＦポリペプチドまたはその 断片の所定の三次構造を顕著に変更しないと予期されるｌ以−Ｌのシスティン残 基の特定アミノ酸残基を＠換することにより実施することが推奨される。これは 変異体ポリペプチドの治療潜在力の維持に寄与する。好適なアミノ酸置換には、 グリシン、セリン、アラニン、スレオニンおよびアスパラギンが包含され、セリ ン、アラニンおよびグリシンが好適である。 この発明の他の観点は、成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットのシステ ィン残基５０９および６９５は、フォノ・ウィルブランド因子またはこれから誘 導される治療的に有用なポリペプチドの血小板の糖蛋白質１ｂ受容体に対する結 合に関与する特定の三次構造をサブユニットまたはその断片に与える銀量ジスル フィド結合を通常は形成するという知見に基く。よって、この発明の他の観点は 、成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基４４１　（アルギ ニン）から概して残基７３３（バリン）のアミノ酸配列または前記残基のいずれ かのサブセットからなるポリペプチドを含み、これは残基５０９　（システィン ）および６９５　（ンステイン）を含み、１以上のシスティン残基４５９．４６ ２．４６４．４７１および４７４が欠失するか、または１以上の他のアミノ酸に よって置換されている。好適なポリペプチドは、それぞれのシスティン残基４５ ９．４６２．４６４．４７１および４７４がグリシン残基によって置換され、シ スティン残基５０９および６９５が銀量ジスルフィド結合によって連結されたも のである。 本発明の他の観点は、治療的に有効な量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に 許容し得るそのキャリヤからなる治療組成物を提供するものである。 この発明のなお更なる観点によれば、この発明の有効量の１以上の治療組成物を 患者に投与することからなる、患者の血栓症を阻害する方法が提供される。この 発明の１以上のポリペプチドからなる治療組成物は、ジビリダモルのような現在 利用可能な抗血小板薬物より実質的に毒性が少なく、または患昔において生起す るイｊ害な生理的効果が少ないこＬが期待される、。 本発明のポリペプチドを生成する好適な方法は、フォノ・ウィルブランド因子サ ブユニットをコードするＤＮＡヌクレオチド配列またはその断片を変異誘発に供 し、この結果としてシスティン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸化学種 によるその＠ｍを行うものである。この結果得られるコードＤＮＡを組換え細菌 病４ミ細胞に挿入し、ｖＷＦポリペプチドの発現を図ることができる。 またこの発明によれば、組換えｖＷＦ　ＤＮＡ配列を含む真核宿主細胞も提供さ ね、これからｖＷＦの５２／４８ｋＤａのトリプシン断片またはドメインに関連 する治療的に活性なポリペプチドが発現される。ポリペプチドは宿主細胞から成 功裡に分泌される。 このようにして発現されたポリペプチドは、組換え細菌宿主細胞から発現された ポリペプチドと比較し、所定の有利な特徴を有する。 ■）本発明のポリペプチドは、成熟した循環性７オン・ウィルブランド因子に存 在するドメインの特徴である三次元構造を想定するものであり、これらは適切に 形成されたジスルフィド結合を有する。 ２）本発明のポリペプチドは、前記ドメインのグリコジル化特性を有する点で、 天然のｖＷＦ５２／４８機能性ドメインの密接なアナログである。 この種のポリペプチドは、単量体形態で存在する場合、抗血栓症剤として使用す ることができる。二量体形態では（この二量体によりポリペプチドが天然の構造 ドメインを有することが更にｆｉｆｉ認される）、これらは抗出血剤として使用 することができる。本発明のポリペプチドの治療特性は、以下に詳細に記載する ように、そのグリコジル化を変化させることにより増強させることができる。 この発明のポリペプチドの適切な二次元的折畳みおよび分泌に重要なものは、シ グナルペプチド配列のこれに対する最初の付着であり、これは同一または他の宿 主細胞に由来するｖＷＦに関連しない他のポリペプチドの分泌を生起するにも有 効である。 この発明の実際によれば、表面に対する血小板の付着の防止、血小板の活性化ま たは凝集の阻害、および血栓症の阻害に有効な治療的に有用なポリペプチドが提 供される。更に詳しくは、フォノ・ウィルブランド因子多量体の血小板に対する 結合を阻害するのに有効なグリコジル化されたポリペプチドが提供さね、これは 変異体ヒトフォン・ウィルブランド因子サブユニッ１−ＤＮＡ配列の哺乳動物細 胞中での発現によって生成される。この種のポリペプチドは、相同性の非変異体 ポリペプチドより、その治療的有用性に悪影響を与える傾向のある銀量ジスルフ ィド結合を形成する傾向が少ない。 よって、親ポリペプチドを模倣し、概して残基４４１　（アルギニン）で開始し 概して残基７３３（バリン）で終了する成熟７オン・ウィルブランド因子サブユ ニットのその断片のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのいずれかのサ ブセットであって、１以上のシスティン残基４５９．４６２および４６４が欠失 し、かつ／または１以上の他のアミノ酸によって置換されており、前記ポリペプ チドは、前記親ポリペプチドよりは銀量ジスルフィド結合を形成する傾向が少な いポリペプチドが提供される。 この発明のこの観点は、親システィン含有ｖＷＦポリペプチドまたはその断片の 所定の三次構造を有意に変更しない１以上の特定のシスティン残基の特定のアミ ノ酸残基を置換し、これにより変異体ポリペプチドの治療潜在力を維持すること により、最も普通に実施し得ると考えられる。適切なアミノ酸置檜にはグリシン 、セリン、アラニン、トレオニンまたはアスパラギンが包含され、アラニンおよ びグリシンが最も好適である。 また本発明は、患者の血栓症を阻害するのに有用なフォノ・ウィルブランド因子 サブユニットの単量体および適切にグリコジル化された断片の組換えＤＮＡを指 向した方法による調製にも関する。組換え法は、断片の所望の単量体形態の所望 の治療活性に逆行的に影響を与える傾向のある構造、例えば前記断片の二量体、 多量体または凝集体の生産を最少とするものである。よって、主として概して残 基４４１　（アルギニン）から概して残基７３０　（アスパラギン）までのアミ ノ酸配列からなる成熟フォンーウィルブランド因子サブユニットのその断片に対 応するＤＮＡから、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による約５２ｋＤａ の見かけの分子量を有する前記サブユニット断片の生物学的に活性な単量体を製 造する方法であって、 （Ａ）その断片コード領域の上流にその適切なリーディングフレームでシグナル ペプチド配列を含むサブユニット断片をコードするＤＮＡ配列を構成し、（Ｂ） ＤＮＡ配列を変異誘発し、通常は鎮間ジスルフィド接触に関与するシスディン残 基を特定し得るシスティンコドンの数を低減させ、（Ｃ）適切なベクタにＤＮＡ 配列を挿入して発現プラスミドまたはウィルス発現ベクタからなるＨ４成体を生 成しく前記構成体は、前記単量体サブユニット断片の真核細胞中での発現および これからの分泌を指向し得る）、（■））前記構成体により真核宿主細胞を形質 転換し、（Ｅ）ＩＩＩ体サブユニット断片の前記宿主細胞内での発現およびこれ からの分泌を生起する条件Ｆで前記形質転換宿主細胞を培養する（前記条件は前 記断片のグリコジル化も許容する） Ｌ稈を含む方法が提供される。 また本発明は、フォノ・ウィルブランド病（ｖＷＤ）のような出血性疾患の処置 に有用なポリペプチドの調製にも関する。特に、本発明はフォノ・ウィルブラン ド因子の特定の断片の組換えＤＮＡｆｆ’ｆ向方法による調製に関し、その断片 は、面小板膜のＧＰＩｂ（α）受容体と他の血小板細胞−Ｌの類似する受容体と の間の、またはこの種の受容体とコラーゲンを含む内皮下層の成分との間の架橋 作用を行い得るものであり、これにより罹患した個体において元の多量体フォノ ・ウィルブランド因子の非常に重要な生理的役割を果たす。よって、主として概 して残基４４Ｉ　（アルギニン）から概して残基７３０　（アスパラギン）まで のアミノ酸配列からなる成熟７オン・ウィルブランド因子づブユニットのその単 量体断片またはＩＪＥＪＩの残基位置４５９．４６２および４６４を含むそのサ ブ断片に対応するＤＮＡから、前記単量体断片またはサブ断片の生物学的に活性 な二量体を製造する方法であって、 （Ａ）その断片コード領域の上流にその適切なリーディングフレームでシグナル ペプチド配列を更に含む単量体断片またはサブ断片をコードするＤＮＡ配列を構 成し、 （Ｂ）適切なベクタにＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたはウィルス発現 ベクタからなる構成体を生成しく前記構成体は、前記単量体断片またはサブ断片 の真核細胞中での発現およびこれからの分泌を指向し得る）、（Ｃ）前記構成体 により真核宿主細胞を形質転換し、（Ｄ）単量体断片またはサブ断片の二量体形 態の宿主細胞内での発現およびこれからの分泌を生起する条件下で前記形質転換 宿主細胞を培養する（その下で単量体断片またはサブ断片は二量体化およびその 二量体化に適切な三次構造が想定され、その下で前記単量体ラブユニット断片ま たはサブ断片またはその二量体形態のグリコジル化が行われる） 工程を含む方法が提供される。 この発明の他の観点は、クローン化した１１６ｋＤａｖＷＦ断片と血小板との間 のりストセチン誘導相互作用は、１１６ｋＤａ断片上のグリコジル化の量を低減 させることによって増強させることができるという知見に基く。この知見は、血 栓症またはフォノ・ウィルブランド病の処置に有効な更なるポリペプチドの設計 に有用である。よって、概して残基４４９（バリン）で開始し概して残基７２８ 　（リジン）で終了する成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットのその断 片のアミノ酸配列からなる親ポリペプチドを模倣する変異体ポリペプチドまたは その二量体であって、これからＯまたはＮ結合グリコジル化の部位である親の１ 以上のセリン、トレオニンまたはアスパラギン残基が欠失するか、または１以上 の他のアミノ酸によって置換され、前記変異体ポリペプチドが宿主真核生物中で 組換えＤＮＡから発現される場合に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に より測定したものとして５２ｋＤａの見かけの分子量を有する親ポリペプチドの 化学種より少ないグリコジル化を有する前記ポリペプチドが提供される。 この発明およびその変異誘発および蛋白質発現手順を当業界で広範に実施し、改 良された溶解性、安定性および治療活性を備える変異体成熟フォノ・ウィルブラ ンド因子サブユニット断片を生成し得ると考えられる。 治療有用性を有する成熟フォノ・ウィルブランド因子のある種のグリコジル化断 片の哺乳動物細胞からの発現および分泌に関して本発明を最初に記載するが、こ れは哺乳動物細胞中での他の治療ポリペプチドの発現にも適用し得ることを理解 すべきであり、この場合前記ポリペプチドの前記細胞からの分泌は、同様に治療 ポリペプチドのＤＮＡによりコードされ、ヒト７オン・ウィルブランド因子シグ ナルペプチドまたはそのサブセット、およびフォノ・ウィルブランド因子ブロペ プチドの一γミノ末端領域からなるアミノ酸の史なる配列によって促進される。 よって、細胞の小胞体の膜を横切る付加的なポリペプチド配列の輸送を指向し得 るポリペプチドであって、以下のドメイン（Ａ）およびドメイン（Ｂ）ニドメイ ン（Ａ）　：ヒトフォン・ウィルブランド因子サブユニットのシグナルペプチド のいずれかのサブセット（このシグナルペプチドは、小胞体によって、および／ または小胞体および／またはシグナルペプチドと複合する転移受容体によって認 識され得る）、および ドメイン（Ｂ）：主としてフォンーウィルブランド因子プロペプチドのアミノ末 端終端の最初の１０残基までよりなるペプチド配列からなり、前記ドメイン（Ｂ ）は、ドメイン（Ａ）のカルボキシ末端にアミド結合によって連結され、前記付 加的なポリペプチド配列のアミノ末端にアミド結合によって連結し得るものであ り、ドメイン（Ａ）およびドメイン（Ｂ）からなるポリペプチドが、付加的なポ リペプチド配列のアミノ末端終端に付着してドメイン（Ａ）および（Ｂ）から誘 導される配列のサブセットが残存し、付加的なポリペプチド配列の治療活性が全 部または一部保持される様式で、開裂を促進するのに十分なヒト７オン・ウィル ブランド因子シグナルペプチドおよびプロペプチドの配列のサブセットを含むポ リペプチドも提供される。 更に一般的に言うならば、ＤＮＡから治療ポリペプチドを！！造する方法であっ て゛、 （Δ）そのポリペプチドコード領域の」二流にその適切なリーディングフレーム でそれ自体シグナルペプチドに対応するＤＮＡ配列およびその直接下流に半極性 または極性スペーサ配列を含む治療ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を構成 し、 （Ｌ３）適切なベクタに、得られるＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたは ウィルス発現ベクタからなる構成体を生成しくこれは前記治療ポリペプチドの真 核宿主細胞中での発現およびこれからの分泌を指向し得る）、（Ｃ）前記構成体 により真核宿主細胞を形質転換し、（Ｄ）治療ポリペプチドの前記宿主細胞内で の発現およびこれからの分泌を生起する条＋′１下で前記形質転換病１ミ細胞を 培養する工程を含む方法も提供される。 図面の簡単な説明 図１は、残基４３１と残基７５０との間の成熟フォノ・ウィルブランド因子サブ ユニット（ヒト）の先に報告されたアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す表である。 図２は、本発明のシスティンを含まない変異体ポリペプチドによる血小板に対す るｖＷＦのボトロセチン誘導結合の阻害を示すグラフである。 図３は、本発明の変異体ポリペプチドによる血小板に対する抗ＧＰ１ｂモノクロ ーナル抗体の結合の阻害を示すグラフである。 図４は、ｐＣＤＭ８プラスミドのマツプである。 ここでは他に示さない限り、次の用語は示された意味を有する。 コード配列（コードＤＮＡ）−適切なリーディングフレームで蛋白質のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列。本発明の目的から、コード配列の合成または使用は、 トリペプチドＮＨｘ　ａｒｇ　ｇｌｙ　ｇ　Ｉｙ　ＣＯａ　Ｈを「コードする」 ５′−ＣＧＧ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−３’　／３’　−ＧＣＣ−ＣＣＴ−ＣＣＴ−５ ’　１．：より示されるように、対応する相補的鎖の合成または使用を必然的に 伴い得る。１つの鎖に対する説明または請求の範囲の記載は、当業界の慣行で適 切、有用または必要なものとして、他の鎖およびその一本鎖対応物に言及し、請 求の範囲に記載したものとする。 ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ鋳型に存在する配列から酵素的に合成されたＤＮＡ分子また は配列。 転写された鎖〜ＲＮΔポリメラーゼによってそのヌクレオチド配列が３’−５’ に読まれてｍＲＮＡが生成する。この鎖は非コード鎮としても言及する。 −ｙ二Ｆ鎖または非翻訳鎖−この鎖は転写された鎖の逆平行相補体であり、チミ ン塩基が存在する（ｍＲＮＡのウラシン塩基の代り）以外は、転写された鎖から 生成したｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する。これを［コードＪと言及するのは 、ｍＲＮＡ同様、また５′→３′に検討した場合、翻訳についてのコドンを直接 識別し得るからである。 生物学的活性−生物学的意義において（すなわち、生物中でまたは生体内複写物 中′Ｃ）分子によって行われるか生起される１以上の機能、効果、活性。成熟フ ォノ・ウィルブランド因子サブユニットの１１６ｋＤａホモニ量体断片の特徴的 な生物学的活性は、Ｌ以りの血小板Ｇ　Ｐ　Ｉ　ｂ受容体に結合し、これにより 分子がリストセチンの存在下で血小板の凝集を促進するのを可能とする潜在的な 能力である。１１６ｋＤａ化学種の他の結果的または関連する効果には、血栓剤 としての機能および血小板活性化の誘導、および／または表面に対する付着が含 まれる。 同様に、成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットの５２／４８ｋＤａ、− １ｉｔ体断Ｊｉの特徴的な生物学的活性は、１のみの血小板ＧＰＩｂ受容体に結 合し、これにより分子が血小板に対−４る多量体ｖＷＦのポトロセチン誘導結合 を阻害するの苓可能とする潜在的な能力である。二量体化していない５２／４８ ｋＤａ化学種の結果的なまたは関連する効果には、血小板活性化、凝集または表 面に対する付着の阻害、および血栓症の阻害が含まれる。 還元条件−フォノ・ウィルブランド因子またはこれから誘導されるポリペプチド を含む溶液中における［還元Ｊ剤の存在に言及するものであり、この薬剤により ｖＷ　Ｆのジスルフィド結合の破壊が起る。ただし、当業界で典型的な使用と一 貫して、ジチオスレイトール＜ＤＴＴ）のような「還元ノ剤は、ｖＷＦシスティ ンとＤＴＴとの間のジスルフィド結合を形成するこきによりｖＷＦジスルフィド 結合の破壊を起すものであり、関与する硫黄原子の酸化状態の正味の変化はない 。 Ｉ）　Ｎ　Ａまたは他のＤＮＡ配列であり、典型的には１または少数のエンドヌ クレアーゼ認識部位を特徴とし、ここでこの種のＤＮＡ配列を異種起源ＤＮＡの 挿入のために決定し得る様式で切断することができ、ＤＮＡの必須の生物学的機 能、例えば復製、コート蛋白質の生産の随伴する喪失または発現制ｇ１領域、例 えばプロモータまたは結合部位の喪失を伴わず、またこれはこれにより形質転換 された宿主細胞の同定に使用するのに適切な選択し１ｒＪ−る遺伝マーカー、例 えばテトラサイクリン耐性またはアンビンリン耐性を含’Ｐ４’Ｊる。 プラスミド−プラスミドが宿主細胞中で複製されるよう、無傷の「レプリコンＪ からなる非染色体二本鎖ＤＮＡ配列。原核または真核宿主細胞内にプラスミドが 配置された場合、プラスミドのＤＮＡの結果としてその細胞の特徴が変化（また は形質転換）し得る。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴｅｔＲ）の遺伝子を担 持するプラスミドは、テトラサイクランに対して先に感受性であった細胞をこれ に耐性のものに形質転換する。プラスミドによって形質転換された細胞は「形質 転換体」と呼ばれる。 発現プラスミドーフォン・ウィルブランド因子構造遺伝子のようなりローン化す べきＤＮＡを既に挿入したプラスミド。これに挿入されたＤＮＡ配列は、これに 起因するｍＲＮＡの翻訳を制御する配列も含むことができ、また会合を促進し、 また前記発現プラスミドの更なる修飾を促進し得る制限エンドヌクレアーゼ部位 を含むことができる。発現プラスミドは、宿主細胞中でコードされたポリペプチ ドのその中での発現を指向することができ、コードされた構造遺伝子のＤＮＡ配 列の上流の転写ブロモ〜りを通常は含む。発現プラスミドが宿主染色体ＤＮＡに 組込まれるに至ることもあれば、そうでない場合もある。それに拘らず、この発 明の目的のためには、組込まれたプラスミドを発現プラスミドとして言及する。 ウィルス発現ベクターウィルス発現ベクタは、天然の生物学的プロセスを介して 細胞に感染し得るウィルス粒子にＤＮＡをバックし得る以外は発現プラスミドに 類似する。 下流−ヌクレオチドが遺伝子の先の部分の後にＲＮＡポリメラーゼによって正常 に読まれる場合、構造遺伝子の転写された鎖のヌクレオチドは、遺伝子の他の部 分の下流と言われる。非転写類の相補的ヌクレオチド、またはＤＮＡの二本鎖形 態内の対応する塩基対も下流と呼ばれる。 更に、構造遺伝子内での転写および翻訳の方向を参照し、遺伝子の上流（または ５′）に付加された制限エンドヌクレアーゼ配列は、蛋白質のアミノ末端をコー ドする配列の前にこれが付加されることを意味する一方、構造遺伝子の下流〈ま たは３′）に生成された修飾は、これがそのカルボキン末端コード領域を越える ことを意味する。 フォン°ウィルブランド因子（ｖ　Ｗ　Ｆ　）−フォノ・ウィルブランド因子に ついてのここでの全一この参照は、ヒトにおりるｖＷＦにｊ及することが理解さ れる。 Ｆフォノ・ウィルブランド因子１という用語は、以下に直接定義する用語のいず れかおよび全てをその範囲内に含むことを意図する。 更に、フォノ・ウィルブランド因子は、内皮下層マトリックスの成分として、活 性化された血小板によって分泌されるα顆粒の成分として、および循環する血液 血漿蛋白質としで認められる。ｖＷＦの三次元サブユニット構造または多重サブ ユニット構造は、潜在的に生起する３つの異なる意義において、例えばグリコジ ル化の相異によって変動することが可能である。この種の相異は、有用な治療性 ｖＷＦ誘導ポリペプチドが、この発明の実施にまり内皮細胞または巨核球のｖ　 Ｗ　Ｆ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列から生産されることを妨害するものではない。 更に、ここに報告するように、この発明の実施で操作または利用される実際のＤ ＮＡおよびポリペプチドとアミノ酸またはそのヌクレオチドの構造配列との間に 多少の生物学的に重要ではない相異があることも可能である。本発明は、全ゆる この種の生物学的に重要でない斐種に及ぶことが理解される。　プレプロｖＷＦ −フォン・ウィルブランド因子は、広範な翻訳後プロセシングを受ける。［ブレ ブｏｖＷＦＪは、（ＮからＣ末端へと）約２２アミノ酸残基からなるシグナルペ プチド、約７４１アミノ酸のプロペプチド、およびその後の約２．０５０残基の 循環性ｖＷＦを含む。 プロｖ　Ｗ　Ｆ　−シグナルペプチドはプレプロｖＷＦから除去されている。 或暴ヱＷＬ−血漿中に認められるか、または内皮下層に結合したものとしての循 環性ｖＷＦ０これは、典型的にはその多数の種の多量体に会合するポリペプチド ’ｆｌｉｔ体の集団よりなり、そのそれぞれのヅブユニットは２．０５ｎ残基の 長さである。史に、補乳動物細胞中で発現される場合、成熟ｖＷＦは通常はグリ コジル化されている。 シグナルペプチド（配列）−シグナルペプチドは新たに翻訳されたポリペプチド 中の一γミノ酸の配列であり、これにより小胞体の膜を横切って細胞の分泌経路 に至るポリペプチドの転移のシグナルが与えられる。シグナルペプチドは典型的 には蛋白質の最初（−γミノ末端）に存在し、２０〜４０のアミノ酸長さであり 、その中心に約５〜１５の疎水性゛ｒアミノ酸鎖を備える。典型的には、シグナ ルペプチドは、小胞体中への転移の過程に際じＣ１または直後に蛋白質から蛋白 質分解により開裂される。シグナルベブチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡ のその部分は、シグナル配列としても言及される。 表１は、この出願で使用するように、アミノ酸についての標準的な３文字名称を 示すものである。 アスパラギン酸　Ａｓｐ グルタミン酸　Ｇｌｕ フェニルアラニン　Ｐｈｅ グリシン　Ｇｌｙ ヒスチジン　［１１ｓ イソロイシン　ｌｉｅ メチオニン　Ｍｅｔ アスパラギン　Ａｓｎ プロリン　Ｐｒ。 グルタミン　Ｇｌｎ チロシン　Ｔｙｒ 発明の詳細な説明 前記したように、本発明の抗血栓性および抗出血性ポリペプチドの両者は、天然 に存在−４る蛋白質フォノ・ウィルブランド因子（以後ｒｖＷＦ、Ｉ）の断片に 基くものである。背景的目的につき、この蛋白質に関する情報および止血および 血栓におけるその役割を以下に記載する。 止血および血栓におけるｖＷＦの役割の説明ｖＷＦは血管損傷の際の通常の什、 血において必須の（９割を果たし、疾患状態の血管の急性血栓閉塞病原において 中心的に重要なものである。これらの役割の両者は、誘導されて罹患した部位に 結合しぞの後架橋結合する血小板とｖＷＦとの相呼作用を含む。単一の血小板が 最初に血栓表面に付着し、その後これらが活性化されるもの、と考えられ、血小 板内における一１ｇな代謝的変化および顕著な形態的変化を伴うプロセスである 。活性化は、７オン・ウィルブランド因子（付着蛋白質）のような付着物質を含 む血小板貯蔵顆粒の放出、および更なる機能性付着部位の血小板の表面における 発現により明示される。一旦活性化されたならば、また通常の止血の一部りして 、血小板細胞が凝集することとなるが、付着蛋白質の更なる種類との血小板細胞 の広範な架橋結合を含むプロセスである。 前記宣明したように、これらのプロセスは、血管損傷に対する生理的応答として 通常のものである。しかしながら、これらは例えば疾患血管における場合のよう に病理的状況に至ることがあり、結果的に血管閉塞を伴う望ましくない血小板血 栓を形成する。 血管内での血小板の沈着を防止するのが望ましい他の状況には、発作の防止およ び処置、および動脈移植の閉塞の防止が含まれる。手術手順の際の血小板血栓の 形成は、既に存在する血管障害を緩和する試みを妨害することもある。 損傷または疾患血管に対する血小板の付着は、特定のイ：１着分子と相互作用す る特定の血小板膜受容体を含む機構を介ｊ７て起る。この種の血小板受容体の１ つは糖蛋白ｊｉｌｂ−ＩＸ複合体であり、これは２つの一体化膜蛋白質、糖蛋白 質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）および糖蛋白質ＩＸ（Ｇｌ）ＩＸ）の非共有結合会合体より なる。ＧＰ　Ｉ　ｂ　、、、、　Ｉ　Ｘ７３２合体の付着性リガンドは蛋白質７ オン・ウィルブランド因子であり、これは内皮下層マトリックスの成分として、 活性化された血小板により分泌されるα顆粒の成分と１７で、および循環性血液 血漿蛋白質としても認められている。（コＦ’　ｌ　ｂ　−Ｉ　Ｘ受容体に対す るｖＷＦの実際の結合部位は、ＧＰＩｂ（α）により示される糖蛋白質１ｂのα 鎮の゛γミノ末端領域に局在している。 多量体ｖＷＦと糖蛋白質１ｂ−ＩＸ複合体の（ＧＰＩｂ（α））における相互作 用の結果血小板の活性化に至り、現在成長しつつある血栓に対する更なる血小板 の補充が促進されると考えられる。血小板糖蛋白質１１ｂ−１１１ａ受容体部位 におけるフィブリノーゲンの結合により、およびまた恐らくこれらの部位におけ るｖＷＦにより、および／または更なる糖蛋白質１ｂｌＸ受容体部位において、 迅速に蓄積する血小板も架橋結合（ｉ！＃集）される。更に、糖蛋白質１１ｂ／ １１１ａ受容体は、血小板の最初の単層の形成にも関与し得る。このプロセスで 特に重要なのは循環性ｖＷＦの多量体的かつ多重価的性質であり、これによりマ クロ分子がその結合および架橋作用を有効に行うことが可能となる。 患者の血小板上のＧＰＩｂαまたはＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａ受容体の不活性化また は患者の血管系の内皮下層に局在するｖＷＦについての結合部位の不活性化、こ れによるｖＷＦの架橋能力の阻害は、血栓症を処置または阻害するのに大きな医 療的重要性があるものであろう。よって、本発明は、前記の点を達成するのに有 効なポリペプチドの開発に関する。 望ましくない血栓の防止は非常に重要であるが、血栓形成を促進するのが望まし い状況がある。出血性障害の最も普通のものであるフォノ・ウィルブランド病は 、異種の疾患状態を記載するのに使用する用語であり、これはフォノ・ウィルブ ランド因子が不適切な量で生産される場合、または循環性ｖＷＦ分子が幾分欠損 がある場合の結果である。この疾患の種々のサブタイプが記載されている。ＶＷ Ｆの架橋作用を与えることが、フォノ・ウィルブランド病で苦しむ患者の処置に おいて中心的に重要なことであることは明らかである。また本発明は、血小板膜 のＧＰｌｂ（α）受容体またはＧＰＩｒｂ／ｒｌＩａ受容体と他の血小板」二の 受容体との間の、またはこの種の受容体と内皮下層の成分との間の架橋作用を行 い、これにより罹患した患者において元の多量体７オン・ウィルブランド因子の 非常に重要な生理的役割を行い得るフォノ・ウィルブランド因子の断片の調製に も関する。 ｖＷＦの構造に関する情報およびこれから誘導される治療剤の設ス１血小板糖蛋 白質［ｂ−ＩＸ受容体（ＧＰＩｂ（α））に結合するフォノ・ウイルブランド因 子サブユニットのドメインは、ｖＷＦの断片内で同定された。この断片は、トリ プシン消化の後、ジスルフィド還元を行うことにより生成することができ、循還 性ガブユニットの概して残基４４９　（バリン）からその概して残基７２８（Ｉ Ｊリジンに延在するものである。現在の証拠では、この断片は（その残基５０９ と６９５との間に）コラーゲンおよびプロテオグリカンのような内皮下層の成分 についての結合ドメインも含むことが示されているが、成熟ｖＷＦサブユニット の他の領域もこれらの物質の認識により重要である（更なるプロテオグリカンま たはヘパリン結合部位が成熟サブユニットの残基ｌ〜２７２に局在し、更なるコ ラーゲン結合部位がその残基９１０〜１１１０内にある）。 図１　（配列番号＝１）は、残基４３１と残基７５０との間の成熟フォノ・ウィ ルブランド因子サブユニット（ヒト）について先に報告されたアミノ酸およびＤ ＮＡ配列を示す。トリプシン消化により製造された５２／４８ｋＤａ断片は残基 ４４９　（バリン）にアミノ末端を有し、概して残基７２８（ＩＪリジンに延在 する。 標準的な３文字表示によってアミノ酸を示す。ＤＮＡ配列はコードｔａ（非転写 類）によって示す。５２／４８ヒト配列については多形性は実に殆ど報告されて いないが、１つの有意な例外は位置７０９のヒスチジン／アスパラギン酸であり 、マンクツ・ディ・ジェイ（Ｍａｎｃｕｓｏ、　Ｄ、、１．）　ら、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２６４（３：３）：１９５１４−４９５２７、表Ｖ（１９８９＞ を参照することができる。 以下の実施例部分に記載する実験に使用したＤＮＡ断片は、残基７０９について −ｒアスパラギン酸コドンＧＡＣ）を含むが、この発明の実施には残基位置７０ ９のヒスチジンの置換（ヒト配列におけるこの位置での他の公知の天然に存在す る一ｒアミノ酸コドンＣへ〇）も有用である。 本発明の治療性抗血栓ポリペプチドに関し、ｖＷＦに関する以下の情報は特に興 味あるものである。 約１１６．０００　（１１６ｋＤａ）の分子量の、血小板糖蛋白ｇｌｂ（ｆｆ） 結合活性を有する成熟フォノ・ウィルブランド因子の断片は、トリプシンを用い るｖＷＦの消化によりｔＰ−離する。ジスルフィド結合を開裂し得る還元剤を用 いて１１６ｋＤａ断片を処理した場合、一対の同一の新島が生成される。同一の 断片のそれぞれ（−シょになって１１６ｋＤａポリペプチドを構成する）は約５ ２゜０００　（５２ｋＤａ）の見かけの分子量を有する。（ポリペプチドの分子 量は、典型的には変性ゲル電気泳動系で標準物に相対する移動によって測定する 。この結果の重量の値は概略に過ぎない。） 典型的には、５２．０００分子量断片は、ヒトの酵素系がその分子量に寄与する 断片をグリコジル化するという点を反映してｒ５２／４Ｆｌ＋断片として言及す る。グリコジル化の量は、分子毎に変動するが、２つの重量、５２．０００およ び４８．０００が最も普通である。 ５２／４８断片は、そのアミノ末端として成熟サブユニットの残基４４９　（バ リン）を、またそのカルボキシ末端としてその残基７２８（リジン）を有するこ とが示されている。グリコジル化による更なる重量がない場合、ペプチドは約３ ８．０００の分子量を有する。 ５２／４８断片は、血小板に対するフォノ・ウィルブランド因子の結合を競合的 に阻害することが示された。したしながら、５２／４８断片またはそのグリコジ ル化されていない３８ｋＤａ等価物の操作は困難であることが分った。この断片 の成功した操作には、典型的にはそのシスティン残基が還元され永久的にアルキ ル化されることが必要であった。この処理がない場合、そのシスティン残基の望 ましくない反応が必ず起り、治療剤としての有効な使用には不適切な不溶性で生 物学的に不活性なポリペプチド凝集物の形成に至る。 血小板糖蛋白質１ｂ（α）を含む成熟７オン・ウィルブランド因子サブユニット の残基４４９〜７２８断片は、位置４５９．４６２．４６４．４７１．４７４． ５０９および６９５にシスティン残基を有することが知られている。また、成熟 ｖＷＦサブユニットの全てのシスティン残基は、ジスルフィド結合に関与するこ とも知られている（レガズ（Ｌｅｇａｚ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４８ ：３９４６−３９５５　（１９７３））。　マルチ・ティ（Ｍａｒｔｉ、　Ｔ、 ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：８０９９−８１０９　（１９８７） では、成熟サブユニット残基４７１および４７４が領内ジスルフィド結合に関与 することが結論的に同定された。残基５０９および６９５はジスルフィド結合に 関与するものとして同定されたが、この対合が領内であるか銀量である（すなわ ち、同一の成熟ｖＷＦサブユニｙ）内）かは示されなかった。 モー　リ・エッチ（Ｍｏｈｒｉ、Ｉｔ、）　ら１．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２ ６３　（３４）：１７９０１−．１７９０４　（１９８ｇ）では、４４９〜７２ ８サブユニット断片のパブ１ドヅブ断片を用いてホルマリン固定血小板に対する １２５１標識多量体ＶＷＦのリストセチン誘導結合が阻害された。長さ１５残基 のペプチドサブ断片が合成されで試験された。２つの別個の領域Ｌ　ｃｕ４＠９ −Ａ　５ｐ４１１８およびＧｌｕ６”〜Ｖａｌ”′に含まれるか重複するサブユ ニット配列を示すこれらのペプチドは活性である（！：認められた。 モーりの結論では、ｖＷＦのＧＰＩｂ（α）結合ドメインは、ジスルフィド結合 により元のｖＷＦ中で適切な立体配座に維持された２つの不連続的配列Ｃｙｓ４ ７４〜ｐ　ｒＯ４！１８およびり、　ｅｕ６９４〜Ｐ　、　０７Ｑ＠に含まれる 残基によって形成されるとされたが、この著者らは安定化させる結合を形成する システィン残基およびどの結合が内部または鎮間であるかを同定できなかった。 本発明は、成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニ７）の残基４４９〜７２８ 領域から誘導されるポリペプチドを提供するものであり、これは血栓症のような 血管障害の処置に有用である。 この種の分子は、主として概して残基４４１　（アルギニン）から概して残基７ ：３３＜バリン）までのアミノ酸配列からなる成熟フォノ・ウィルブランド因子 サブユニットのその断片をコードする、または前記アミノ酸配列のいずれかのサ ブセットまたは変異体ポリペプチド断片、またはそのザブセットをコードする、 また比較し得る野生型アミノ酸配列の場合より含有するシスティン残基が少ない ＤＮＡから最も効率的に作製することができる。分子の調製に好適な方法は、変 異体フォノ・ウィルブランド因子またはそのサブセットの宿主生物による発現を 行う条件Ｆで、前記７オン・ウィルブランド因子サブユニットの一部をコードす る変異体ＤＮＡ配列を含む生物学的に機能性の発現プラスミドにより形質転換し た宿ト生物を培養し、前記断片をこれから回収することからなる。 ｖＷＰのシスティンコドンからジスルフィド結合が不可能なアミノ酸をコードす るコドンへの変異誘発を行う好適な手段は、クンケル・ティ・ニー（Ｋｕｎｋｅ ｌ、　Ｔ、　Ａ、　）、ｒ”ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ 、８２：４８８−４９２（＋９８５）の部位指向性変異誘発手順に基くものであ る。この種の変異体ＤＮＡ配列は、その後組換え細菌または組換え真核宿主細胞 系から発現させることが化手順からの結果物）における望まれないジスルフィド 結合により生起する凝集および変性の傾向が従前の調製物より少ないＩＹｌ記ｖ 　Ｗ　Ｆ　Ｋ導ポリペプチドの組成物の提供である。この事例では、前記ポリペ プチド内に存在するシスティン残基の数を制限する変異誘発を用いる。 成熟サブユニット残基４４９〜７２８領域をコードするｖＷＦ　ＤＮＡの変異廼 琴 システィンコドンを他のアミノ酸のものに変化させるのに使用することのできる 種々の分子生物学技術が利用可能である。適切な技術には、ポリメラーゼ連鎖反 応、ギャップ化デユーブレックス変異誘発、および単一のヌクレオチド位置で相 異するＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドの示差ハイブリダイゼーションが 含まれる。適切なコドン変更技術の総説については、クライク・シー（Ｋｒａｉ ｋ、Ｃ）、「部位特異的変異誘発のためのオリゴヌクレオチドの使用Ｊ、Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊａｎ／Ｆｅｂ　１９８５、第１２頁を参照することが できる。 この態様の実施において、クンケル・ティ・ニー、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１． 　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：４８８−４９２　（１９８５）の部位指向 性または部位特異的変異誘発を使用するのが好適である。この手順では、ウラシ ル含有ＤＮＡ鋳型を最初に生成し、その後これに対して選択する一連の工程を利 用する。 本発明の実施例１では、変異体ｖＷＦｃＤＮＡを生成するのに使用した変異誘発 明の詳細な説明する。 部位指向性変異誘発を開示する他の刊行物には、ギエセ・エヌ・ニー（Ｇｉｅｓ ｅ、　Ｎ。 八、）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３６．１３１５　（１９８７）、米国特許ｆｆ１ ４，５１８．５８４号および米国特許第４．９５９，３１４号がある。 この態様の実施では、野生型ＤＮＡ配列コドンの１以」−のシスティンコドンの １以−Ｌの以下アミノ酸：アラニン、トレオニン、セリン、グリシンおよびアス Ｘラギンによる置換を生起するのも好適である。アラニンおよびグリシンコドン による置換が最も好適Ｃある。いずれかの特定のコドンについての置換の選択は 、一般に全ゆる他の位置における適切な置換の選択に依存する。 以上は、例としてシスティン残基４５９を使用して行い得るコドン置換の種類の 代表的な例である： （Ａ）　システィン４５９のコドンは、グリシンのコドンによって置換し得る、 または （Ｂ）システィン４５９のコドンは、１つはセリンのおよび１つはグリシンのよ うな２以」二のコドンによって置換し得て、この種の置換の結果新たなアミノ酸 配列ニーＨｉｓ”＠−５ｅｒ”　（ａ）−Ｇｌｙ”’　（ｂ）−Ｇｉｎ”’−が 与えられる、または （Ｃ）システィン４５９のコドンはｃＤＮＡから欠失させることができ、この種 の欠失の結果−〇　ｉ　ｓ４５”　−Ｇ　ｌ　ｎ”’−により示される短くなっ たアミノ酸配列が得られる、または （Ｉ））システィン残基４５９に隣接する残基の１以上のコドンは、−Ｇｌ　ｕ ”−（月０４６０−により示されるようなコドン４５９と共に欠失させ得る。 アラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアスパラギン以外のアミノ酸の コドンも、標的シスディン残基の特定の一次、二次、三次および四次環境に依存 してこの発明の実施に有用であり得るど考えられる。 この態様の実施において、４４９〜７２８のトリプシンｖＷＦサブユニット断片 の全ゆる特定のシスティン残基の置換体として、システィン位置が局在する野生 型アミノ酸配列サブ断片の三次構造（例えばαヘリンクスまたはβシート）の最 小の動揺をもつ−Ｃクシステン位置に収容され得るアミノ酸を与えるのが望まし いと考えられる。本発明の実施において、アラニン、トレオニン、セリン、グリ シンおよびアスパラギンは、システィンと同様に中性に荷電しており、大きさが 小さいか比較的小さい側鎖を有するため、一般に満足し得るものである。 蛋白質のどの構造ドメインの種類（αヘリックス、βシートまたはランダムコイ ル）内で、アミノ酸の特定の化学種を認めるのに最もよいかを予測する点につい て実質的な検討を行った。セリンは、システィンの大きさおよび極性を最も密接 に近似し、αヘリックスおよびβシートドメインを破壊しないと考えられるため 、この発明の実施における使用に好適なアミノ酸である。 例えば、チュ’ビー・ワイ（［ｈｏｕ、　Ｐ、Ｙ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、１３（２）：２１１−２２２　（１９７４）およびチュ・ピー・ワイら、 「蛋白質立体配座の予測Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３　（２）、２２２ −２４４　（１９７４）を参照することにより、置換アミノ酸の選択に有用な更 なる情報が与えられる。チュ・ビーワイらは、その中のどのアミノ酸の種が例え ばαヘリックス領域の中心に認められる可能性が高く、そのどの残基がへリック ス帯域の進展を停止させ、これにより境界残基またはへリックス破壊体となる可 能性が高いかを決定する規則に基いて特定のポリペプチド配列断片の二次構造を 予測した。チュ・ビー・ワイら、前記第２２３頁によれば、システィン並びにト レオニン、セリンおよびアスパラギンの群は、この種の領域の破壊体または形成 体たるとは異なり、αヘリックス構造には無関係であると認められる。よって、 トレオニン、セリンおよびアスパラギンは、潜在的な標的システィンが局在し得 るαヘリックス領域を乱さずにそのままにする可能性が高い。同様に、グリシン 、アラニンおよびセリンは、β領域の形成に概ね無関係であることが認められた 。セリン、トレオニンおよびアスパラギン残基は、グリコジル化の可能な新たな 部位を提示し、グリコジル化に供する分泌性蛋白質におけるある種の位置での潜 在的に不適切な置換残基となることが銘記される。 一般に、適切なアミノ酸置換体を選択する際に関連して考慮すべき主要な配慮は 、企図した置換が断片の三次構造に有害な効果を有し得るか否かということであ る。よって、新たな残基が４４９〜７２８断片の三次構造に望ましくない変化を 導入しない限り、他のアミノ酸は特定のシスティン残基の許容し得る置換体とし て適切たり得る。ＮＭＣ−４抗体との反応性は、変異体ポリペプチドが所望の治 療特性を有するか否かの試験として推奨される。 本発明の特に好適な変異体ポリペプチドは、２つの血小板の間の架橋作用を与え 得るその二量体と異なり、成熟サブユニット断片の残基４４９〜７２８ドメイン の単量体形態を模倣するものである。通常、銀量ジスルフィド結合に通常関与す る特定のシスティンについてのｖＷＦ　ＤＮＡ断片中のこれらのコドンは置換す べきである。銀白結合がサブユニット断片に重要な構造的特徴を与えることが示 される場合、および鎮内結合を適切に形成し得る条件が認められ得る場合は、釦 内ジスルフィド結合を形成するシスティンコドンコード残基を変異させないまま とすべきである。 更に詳しくは、残基４４１　（アルギニン）のアミノ末端および残基７３３（バ リン）のカルボキシ末端を有する成熟フォノ・ウィルブランドサブユニットのそ の断片に対応するが、そのそれぞれのシスティン残基がグリシン残基によって置 換された点でこれとは異なる変異体ポリペプチド断片の調製を開示する。 またこの態様は、４４９〜？２８ｖＷＦサブユニツト領域に対応するポリペプチ ド内におけるある種のジスルフィド結合の保持は、これから誘導される治療性分 子の設計に特に重要であることも教示する。この点について、実施例４に記載す るようにｐ５Ｅプラスミドによって発現され銀白ジスルフィド結合を含む変異体 ｖＷＦ断片が提供される。 この発明の好適な変異体ポリペプチドの設３１に関与する重要な因子は以下に記 載する。 コラーゲンおよびヘパリン様グリコサミノグリカンに対する潜在的な結合部位は 、システィン残基５０９と６９５との間のループ領域の４４９〜７２８　）　Ｉ Ｊブンン断片に存在する。これらの部位での結合により、例えばコラーゲンに対 する結合も与えることによって分子の抗血栓治療の有用性が損なわれる事態に際 しては、ポリペプチドを再設計しく例えば化学合成または蛋白質分解による）ル ープ領域を欠失させることができる。 細菌の発現系から誘導されるフォノ・ウィルブランド因子ポリペプチドは、ゴル ジ体またはワイベル・バラーデ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）体におけるよう な翻訳後プロセシングの結果として通常は得られるグリコジル化ｖＷＦを実質的 に欠失する。 本発明はその範囲内に、イー・コ１ＪＢＬ２１　（ＤＥ３）または他の適切な原 核宿主細胞により作製され、酵素的または化学的にグリコジル化されて哺乳動物 細胞により発現される分子に更に近似する分子を包含する。 また、Ｉ）ＮＡコード配列は、哺乳動物宿主細胞中での発現を生起して通常のグ リコジル化を与え得る発現プラスミドまたはウィルス発現ベクタに移すことがで きる。 血小板およびフォノ・ウィルブランド因子分子の両者は、例えばシアル酸により 与えられたもののように多数の陰性荷電を含むことが確定された。この種の荷電 は、非損傷条件下で分子の所望の相互反発を促進することができる。５２／４８ トリプシン断片またはその組換え等漬物のアミノおよび／またはカルボキシ末端 から延在するリジンおよび／またはアルギニンの１以上の陽性に荷電した残基の 付加により、抗血栓治療剤としての断片の使用を促進するＧＰＩｂ−ＩＸ受容体 についての電気的反発を克服することができる。　更に、４４９〜７２８ｖＷＦ サブユニット断片を模倣するポリペプチドについて、部位指向性変異誘発によっ である種のシスティン残基を除去した後、例えばＳ−カルボキシメチル化のよう なその化学的不活性化により全ゆる残留するシスティン残基を不活性化すること は、この発明の範囲内である。 不溶性である変異体ポリペプチドは、例えばポリアクリルアミドのような水溶性 重合体のサブドメインをこれに共有結合によって結合させることにより可溶性と することができる。他の技術を使用し、そうでない場合は不溶性のポリペプチド に溶解性を与えることもできる。 この発明のポリペプチドの全てに対して一般的に適用し得る前記した点に照らし て、この発明の第１の態様の変異体ポリペプチドを調製し得る手段の説明を以下 に行う。 これを達成するため、フォノ・ウィルブランド因子遺伝子（プレプロペプチドに ついて）をコードするｃＤＮＡクローンを利用した。その後、示した領域に側面 を接する（ｆｌａｎｋ）オリゴヌクレオチドを使用し、ｃＤＮＡをポリメラーゼ 連鎖反応における酵素的増幅に供した。コード鎖ＤＮＡを表す第１のオリゴヌク レオチドは、残基４４１　（アルギニン）のコドンにつき５′のＥｃｏＲ１部位 を含み、残基４４６　（グリシン）のコドンまで延在した。非コード鎖ＤＮＡに 対応する第２のオリゴヌクレオチドは、アミノ酸７２５〜７３３をコードし、コ ドン７３３につき３′のＨｉｎｄｌｌｌ制限配列をコードした。　（成熟サブユ ニットの）残基４４１から残基７３３までのアミノ酸配列に対応する得られた二 本鎖フォノ・ウィルブランド因子ｃＤＮＡを、その後ＥＣｏＲＩおよびＨｉｎｄ ｌＩＩ制限酵素を使用し、和合性のＥｃｏＲＴおよびＨｉｎｄｌｌｌ配列を有す る多重クローン化部位を含むバタテリオファージＭ１３ｍｐ１８の二本鎖複製形 態に挿入した。 クンケル−ティ・ニー、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８ ２：４８８−４９２　（１９８５）の手順に従い、個々のグリシンコドンによっ てシスティンコドンの全て（残基位、１ｉ１４５９．４６２．４６４．４７１． ４７４．５０９および６９５）　（実施例１参照）、または例えば個々のグリシ ンコドンによって５つのシスティンコドン、残基位置４５９．４６２．４６４． ４７１および４７４（実施例４参照）を置換するのに適切なハイブリダイズする オリゴヌクレオチドを使用して部位指向性変異誘発を行った。この手順から誘導 された変異体二本鎖ｖＷＦｃＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ制 限エンドヌクレアーゼを用いる処理によってＭＩ３ｍｐ１８ファージから除去し た後、ｖＷＦｃＤＮＡ断片の端部をＢ　ａ　ｍＨＩ　’）ンカを用いて修飾した 。 ５または７個のＣｙｓからＧｌｙへの変異を含む２種類の変異体ｖＷＦｃＤＮＡ をその後ｐＥＴ−３Ａ発現ベクタ（ロゼンベルグ・ニー・エッチ（Ｒｏｓｅｎｂ ｅｒｇ。 ＾、Ｈ１）ら、Ｇｅｎｅ、５６　：１２５−１３６　（１９８７）参照）に別々 にクローン化し、イー・コリ株ＢＬ２１　（ＤＥ３）　（ノバゲ７　（Ｎｏｖａ ｇｅｎ）社、マジラン、ウィスコンシン州）からの発現を図った。７個のシステ ィンからグリシンへの変異を有するｖ　Ｗ　Ｆ　”Ｊブユニット断片のｃＤＮＡ を含むｐＥＴ−３Ａ運搬体を「ｐ７ＥＪと言及し、含まれるｖＷＦｃＩ）ＮΔ断 片が５個の前記特定のシスティンからグリシンへの変異をコードする場合はｒｐ ｓＥｒ＆する。発現プラスミドｐ５Ｅを含む細菌培養物によっ−Ｃ生産された変 異体７オン・ウィルブランド因子ポリペプチドを、ｐ　７　Ｉ−、プラスミドを 含む培養物から発現されたものと比較した。 ｐ　Ｓ　Ｅ分−ｒ−は、システィン残基５０！’Ｒ：６９５．’：の間のジスル フィド結合を形成することができるが、ｐ７Ｅ分子はできない。 変異体ポリペプチドは細菌宿主細胞によっ−Ｃ分泌されず、寧ろ僅かに可溶性の 凝集体（「封入体Ｊ）に蓄積されたが、実施例１　（ｐ７Ｅ）および実施例４　 （ｐ５Ｅ）の手順に従ってこれからポリペプチドを成功裡に可溶化した。ｐ７Ｅ およびｐ５Ｅプラスミドから発現されたポリペプチドを、Ｓ　Ｉ）　Ｓポリアク リルアミドゲル電気泳動および免疫プロッティング（実施例２および５ンによっ て特徴付けた。還元条件トで、両者のプラスミドは、ＳＤＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動により測定して約３８．０００の見かけの分子量を有するポリペプ チド化学種を発現し、予期されるアミノ酸配列のグリコジル化されていない分子 量から予想される通りであった。 免疫学的方法を使用してｐ５Ｅおよびｐ７Ｅ抽出物の挙動を検討した（実施例５ 参照）。ｖＷＦ特異的ネズミモノクローナル抗体ＲＧ−４６およびＮＭＣ−４を プローブとして使用した。Ｒ（、−４６は、成熟フォノ・ウィルブランド因子サ ブユニット内の残基６９４〜７０８からなるアミノ酸の線状配列をそのエピトー プとして認識することが示されている。その決定基に対するこの抗体の結合は、 主として立体配座独立性である。モーリーエッチら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。 ２６３　（３４）：１７９０１−１７９０４　（１９８８）。 ただし、ＮＭＣ−４は、糖蛋白質１ｂ結合活性を含むフォノ・ウィルブランド因 子サブユニットのドメインをそのエピトープとして有する。エピトープのマツピ ングにより、これはジスルフィド依存性会合に至る（ＩＩして成熟ｖＷＦサブユ ニット残基４７４〜４８８および同様に概して残基６９４〜７０８からなる）２ つの不連続ドメイン内に含まれることが示されたが（モーリ・エッチら、前記） 、元のｖＷＦ分子中でこの三次立体配座を与えるジスルフィド結合が領内である か鎖間であるかは決定できなかった。同第１７９０３頁。 そこで、　（蛋白質の）７．５μｇのサンプルを１０％ＳＤＳポリアクリルアミ ドゲルで最初に流し、これにより（還元および非還元条件下における）特定の結 合の抗原性挙動を、クーマシーブルー染色により得られた結果と比較し得るもの とした。標準的な手順、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）、Ａ、Ａｎａ＋、Ｂｉ ｏｃｈｅｒｎ。 １１２：１９５−２０３　（１９８１）による免疫プロッティング（［ウェスタ ンブロッティング」）をその後行ってｐ５Ｅおよびｐ７Ｅ抽出物を比較した。 非還元条件下で、（残基４４１〜残基７３３の配列を表す）−重鎖ｐ５Ｅポリペ プチド断片は、ｐ７Ｅから単離した比較し得るシスティンを含有しない化学種と 比較してＮＭＣ〜４についての結合親和力の約１２０倍の増加を示すことが測定 された。（１００ｍＭＤＴＴを利用する）非還元条件下での電気泳動の後、一本 領ｐ５Ｅ化学種はＮＭＣ−４に対する顕著に減少した親和力を示し、このためこ れは還元または非還元条件下におけるシスティンを含有しないｐ７Ｅ化学種の場 合に非常に類似していた。またＮＭＣ−４は、還元または非還元条件下で、ｐ５ Ｅ抽出物に由来するジスルフィド結合二量体をエピトープとして認識し得なかっ た。 初発ＮＭＣ−４８呈応答を減することにより（これは低い抗体滴定値（ｔｉｔｅ ｒ）および短い露呈時間の組合せにより低く維持される）、ＮＭＣ−４に基いて オートラジオグラフを生成するのに使用したニトロセルＩ】−スフィルタをＲＧ −４６により再検索した。フィルタ上の３６．０００ｋＤａのｐ７Ｅポリペプチ ドに対するＲＧ−４６の結合は、還元または非還元いずれの条件を選択した場合 も同一であり、発現したポリペプチドにおけるグリシンによる全てのシスティン の置換と一貫するものであった。 非還元条件−１では、（ＲＧ−４６に反応性の）大きな分子量のｖＷＦ抗原がｐ ５Ｅポリペプチド抽出物中に存在した。（箱間ジスルフィド結合を反映する）こ れらのｐ５ＥｖＷＦ凝集物は、還元条件下でｐ７Ｅポリペプチドと同じ位置に移 動し、そのジスルフィド接触の破壊を示した。しかしながら、非還元条件下でＲ Ｇ−４６によって容易に認識される大きなｐ５Ｅ鎮間ジスルフィド凝集物は、還 元または非還元条件のいずれでもＮＭ（、−４によっては認識されなかった。よ って、元の多量体ｖＷＦサブユニットの残基５０９と６９５との間のジスルフィ ド結合は前向接触を表すことが示された。 成熟ｖＷＦサブユニットの残基４７１と４７４との間のジスルフィド結合は鎖内 接触であることが既に示されており、よって前記した態様は、多重サブユニット 成熟ｖＷ　Ｆにおける制量ジスルフィド結合は、１以上のシスティン残基４５９ ．４６２または４６４を使用１〜で形成し得ることを示唆し得る。 広範な種類の発現プラスミドまたはウィルス発現ベクタが、４４１〜７３３断片 、または類似するｖＷＦ断片の発現に適切である。代表的な例にはｐＢＲ３２２ 、ふよびｐＥＴ−１乃至ｐＥＴ−７のようなその誘導体が含まれる。適切な宿主 細胞には、エンエリキーｒおよびバンルスの細菌属が含まれる。発現系の選択の 際に重要な点は、ＤＮＡ挿入物にクローン化されたｖＷＦに直接隣接する高い効 率の転写プロモータの推奨される存在である。変異体ｖＷＦｃＤＮΔ断片は、真 核宿主細胞中にもり［１−ン化することができる。 この知見は、５２／４８）ＩＪプシン断片（抗血栓剤として使用する）を模倣し た、またはこれに代えてその１１６ｋＤａホモニ量体（抗出血剤として使用する ）を模倣した治療性ｖＷＦポリペプチドの設計に特に有用であることが期待され る。 発明の第２の態様 ＷＷＦの治療性断片の設計および組換え細菌細胞からの発現について前記Ｌ７た 多くの因子は、ｖＷＦ断片の設計および真核宿主細胞からの発現に適用し得る。 この種の適用性は当業者に容易に明らかである。 この第２の態様はその範囲内に、成熟ｖＷＦサブユニットの残基４４９〜７２８ −次配列断片に存在するシスティン残基によって行われる所定の役割の認識を包 含する。この点に関して、この態様は、システイン５０９〜６９５ジスルフイド 結 ンド病を処置する目的で５０９〜６９５結合を組込む有効な治療剤を提供するこ とを確認するものである。 この発明のこの第２の態様の抗血栓ポリペプチドおよび抗出血ポリペプチドの両 者は、成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基４４９〜７２ ８からなり、完全にグリコジル化された場合５　２／　４　８　ｋ　Ｄａ　ｖＷ Ｆサブユニット断片と重量において等価であり得るそのアミノ酸配列ドメインに 基く。実際は、血液血漿から治療的に有用な量のこの種のポリペプチドを誘導す るのは困難である。困難性には、トリプシン消化物の他の成分からの１１６ｋＤ ａおよび５２／４８ｋＤａ断片の有効な分離、および肝炎またはＡＩＤＳのよう なヒトウィルスからの血液誘導成分の有効な殺菌が含まれる。更に、１１６ｋＤ ａ二量体から５２／４８ｋＤａ単量体を生成する文献に報告された方法は完全な ジスルフィド還元を利用したものであり、この結果三次構造の喪失を伴う。５　 ２／４　８断片のある種の重要な操作、例えば生成物の有用性および安定性を改 良する選択的システィン残基の置換は、実際的な意味では組換えＤＮＡ技術によ ってのみ達成することができる。 しかしながら、５　２／４　８　）リブシン断片に類似する治療性ｖＷＦポリペ プチドの組換えＤＮＡ指向手段による生産はある種の制限を受ける。ポリペプチ ドが単に宿主細胞によって作製されるのみならず、最大の治療的有用性のために はこれが正ｊ−２＜折畳まれるのが望ましい。今日まで５２／４８断片の最も治 療的に活性な形態の発現を妨げていた主要な要因は、システィン残基の連結によ って生起し正１．＜ないジスルフィド接触を形成する分子の正しくない折畳みで あると考えられる。更に、この種のポリペプチドは疎水性特性まは溶解性の問題 を示すことが認められるが、これはこれらが完全に天然ｖＷＦサブユニット内に 含まれているか、または適切にグリコジル化されていたならば遭遇しなかったも のである。 したがって、ｖＷＦ誘導治療性ポリペプチドの合成につき非常に重要なことは、 不適切なジスルフィド接触の形成を最小とする条件の選択である。宿主細菌細胞 中での組換えＤＮＡからのこの種のポリペプチドの先の発現はある種の欠点を有 している。第１の態様を参照すると、新たに生産されたｖＷＦポリペプチドは宿 主細胞から脱出することができず、これらはその中の不溶性凝集体（封入体）内 で蓄積されるに至り、ここではシスティン残基の有効な濃度は非常に高くなる。 このような状況下では、血清中に自然に存在するようなりＷＦの特徴ではないジ スルフィド結合の形成が、封入体内で、またはこれからポリペプチドを可溶化す る試みに際して促進され、また実際に起る。 この態様は、ポリペプチドをコードすると共にその存在によりｖＷＦポリペプチ ドを宿主細胞から分泌させるシグナルペプチドをもコードするＤＮＡ配列を使用 し、ｖＷＦ誘導ポリペプチドを哺乳動物細胞中で発現させることにより、このよ うな困難性の解消を与えるものである。正しくないジスルフィド結合の形成は、 封入体におけるような高い局所濃度のポリペプチドの蓄積を制限することによっ て最小化される。 更に、細１ｍ、’−は異なり、宿主真核細胞中に存在する酵素がｖＷＦ誘導ポリ ペプチドをグリコジル化する（炭水化物鎖を付加する）ことができる結果、ヒト 血漿から誘導されるｖＷＦ分子のドメインにより密接に類似する治療性分子が与 えられる。 そのいずれかのシスティンコドンの変異を有さないこの態様により生成した組換 え１１６ｋＤａポリペプチドは、残基４４１〜７３０よりなるサブユニット断１ １のｍ；量体を示すことが明示され、また血漿誘導ｖＷＦの比較し得る領域に認 められるものと等価のグリコジル化の量を有するものである。 第２の態様の有効な組換え手順により生成された、あるいはされ得る治療性ＶＷ Ｆ誘導ポリペプチドの種類の記載を続いて以下に行う。 第２の態様の組換えｖＷＦポリペプチド広範に言えば、この第２の態様は、概し て残基４４９と概して残基７２８との間のアミノ酸のその配列またはそのサブ断 片からなる成熟フォン・ウィルブランドサブユニットの全ゆる断片（これからは 少なくとも１つのそのシスティン残基４５９．４６２および４６４が除去されて いる）を包含する。このような除去により、断片が望ましくない箱間ジスルフィ ド結合（およびこの結果の二量体）を形成する傾向が低減され、この結果抗血栓 剤としての治療有用性が改良される。 この態様の更なる観点は、前記特定したポリペプチドのグリコジル化形態に及ぶ 。 ｖＷＦの前記した領域から誘導される抗血栓性ポリペプチドの設計に際し、シス ティン残基を位置５０９および６９５に保持し、これにより成熟ｖＷＦサブユニ ット断片のＧＰＩｂ（α）結合ドメインの三次構造を保存するのが好適である。 この態様の実施に同様に好適なのは、ｖＷＦの前記したｇｉ域から誘導されるグ リコジル化されたポリペプチドであり、この場合システィン残基は位Ｗ５０９お よび６９５に保持され、またシスティン残基４５９．４６２および４６４のそれ ぞれは欠失させるか、または他のアミノ酸の残基によって置換する。 この態様の実施に更に好適なのは、ｖＷＦの前記した領域から誘導されるグリコ ジル化されたポリペプチドであり、この場合システィン残基は位置５０９および ６９５に保持され、またシスティン残基４５９．４６２および４６４のいずれか １つは欠失させるか、または他のアミノ酸の単一の残基によって置換する。 この発明の好適な変異体ポリペプチド（抗血栓剤）の設計または更なる修飾に関 与する重要な因子は以下に記載する。 コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（またはプロテオグリカン）に対する潜 在的な結合部位は、システィン残基５０９および６９５の間のループ領域の４４ ９〜７２８トリプシン断片に存在する。この種のマクロ分子によるこれらの部位 における結合が、例えば同様にコラーゲンに対する架橋も与えることにより、こ の発明のいずれかの組換えポリペプチドの抗血栓治療の有用性を損なう事態に際 しては、ポリペプチドを（例えば蛋白質分解、共有結合標識または変異誘発によ って）再設計し、ループ領域またはそのサブドメインを欠失または変化させるこ とができる。 また第２の態様は、出血性疾患の処置に有用なポリペプチドの調製にも関する。 広範に言えば、循環性ｖＷＦから誘導される１１６ｋＤａ）！Ｊプシン性断片き 実質的に等価の二量体ポリペプチドを組換えＤＮＡ指向方法によって製造する方 法が提供される。この方法によれば、最初に形成される単量体断片は二量体化に 適切な三次構造を想定し、その二量体化を遂行するものとする（実施例７参照） 。 更に、プロセス条件は、適切にグリコジル化された二量体ポリペプチドを形成す ることができるようなものとする。 以Ｆに続けて第２の態様のポリペプチドを調製することのできる手段の説明を行 うが、これによりこの種のポリペプチドを適切に折畳まれた形態で宿主細胞から 効果的に分泌させ、好ましくはその存在が治療的有用性と一貫するようなジスル フィド結合のみを有するものとすることができる。 この態様の実施に必要な必須の要素は次の通りである：　（Δ）成熟ｖ　Ｗ　Ｆ 　”ｊブユニ７）の残基４４９〜７２８ドメインをコードするか、またはそのサ ブドメインをコードするＩ）ＮＡ配列、（Ｂ）真核細胞中で前記残基４４９〜７ ２８ドメインまたはそのザブドメインのその中での発現を指向し得る発現プラス ミドまたはウィルス発現ベクタ、および（Ｃ）前記発現を行い得る真核宿主細胞 。 ７オン・ウィルブランド因子サブユニット断片のＤＮＡ配列の発現は、残基４４ ９〜７２８コードＤＮＡの上流（５′）に真核コンセンサス翻訳開始配列および メチオニン開始コドンを配置することにより促進される。ｖＷＦ　ＤＮＡ配列は 、ｃＤＮＡ配列、まｊこは例えばポリメラーゼ連鎖反応てゲノｌ、クローンから 酵素的増幅によって製造し得るようなゲノム配列とすることができる。残基４４ ９〜７２８コ一ド配列の発現は、その下流にＴＧＡのような翻訳終ｌ、コドンを 配置することによって史に促進される。このようにして発現したｖＷＦポリペプ チドは、発生期のｖＷＦポリペプチドに対するシグナルペプチドの付着が欠如じ Ｃいるため、典型的には宿主細胞内に残留する。このような状況では、その中で 発現された蛋白質の精製およびその薬理学的に有用な量の抽出は、ポリペプチド が宿主細胞の培養培地中に分泌された場合と比較し、遂行するのがより困難であ る。 それにも拘らずこの種の発現系は、例えば患者において血小板ＧＰＩｔｌ−ＩＸ 受容体複合体の適切な機能を試験するような診断検定の目的にはなお有用である 。 ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるこの発明の好適な実施では、適切な宿主 細胞に挿入するためのｖＷＦコードＤＮＡ配列が提供さね、この場合その残基４ ４９〜７２８コ一ド配列の上流に、ｖＷＦシグナルペプチドをコードするＤＮＡ 配列も挿入するものとする（実施例７参照）。成熟ｖＷＦサブユニットの異なる 領域に対応するか、またはプロペプチドまたはこの種の領域のいずれかの組合せ に対応する他のｖＷＦコードＤＮＡ配列を、適切なコードＤＮＡ中でｖＷＦシグ ナルペプチド配列の上流に同様に配置することによって同様に発現させることが できる。ｖＷＦサブユニットの残基４４９〜７２８断片のアミノ末端終端に付着 させた場合、シグナルペプチドにより、細胞から最終的に分泌させるために加工 すべき種類のポリペプチドとして断片が細胞構造によって認識さね、４４９〜７ ２８断片からのシグナルポリペプチドの随伴する開裂を伴うこととなる。 真核発現系の構成、および成熟サブユニッ１−ｖＷＦのトリプシン５２／４８　 ｋＤａドメイン（残基４４９〜７２８断片）のその中での発現については、残基 ４４１（アルギニン）〜７３０　（アスパラギン）により表される僅かに大きい 断片を操作するのが便利であることが認められた（実施例７参照）。更なるアミ ノ酸の小さい領域を含む他の類似する断片（４４９〜７２８残基配列を除く）（ この更なるアミノ酸は前記断片の機能には有意に影響を与えない）も発現させる ことができる。 同様に機能性断片を発現させることができ、これから４４９〜７２８断片と比較 した場合、ＧＰＩｂ（α）結合配列を損なわない限り、アミノふよびカルボキシ 末端に隣接する幾つかの残基を除去した。 残基４４１〜７３０断片をコードし発現する適切なりＮＡ配列の構成について、 シグナルペプチドのカルボキシ末端をコードするＤＮＡと残基４４１のコドンと の間に、ｖＷＦプロペプチドの最初の３つのアミノ酸のコドン（アラニンーグル タミン酸−グリシン）　（前記コドンは、ヒトｖＷＦ遺伝子中でシグナル配列に ついて直接Ｆ流（３′）に天然に纏められる）を挿入するのが有効であることも 認められた。以下に更に詳述するように（実施例１７参照）、この種のプロペプ チド配列（スペーサ）の存在により、シグナルペプチドによる適切な開裂部位の 纏識が促進され、このプロセスにより、適切な大きさの治療性ｖＷＦポリペプチ ドが生成し、治療性生成物の宿主細胞からの分泌が促進される。以下に詳述する ように、このスペーサ配列は半極性または極性の特性のものとすべきである。 この発明によれば、ｖＷＦプロペプチドのアミノ末端領域の１から最初の１０ま での残基からなるスペーサ配列が提供される。４４１〜７３０残基配列の所望の 三次構造は有害な影響を受けないという理解の下で、より長いプロペプチドコー ド配列を利用することはこの発明の範囲内である。 広範な種類の発現プラスミドまたはウィルス発現ベクタが、残基４４１〜７３０ 成熟ｖＷＦサブユニット断片または類似するｖＷＦ断片の発現に適切である。 発現系を選択する際に重要な１つの要因は、クローン化したｖＷＦ挿入物に直接 隣接する高い効率の転写プロモータをプラスミドまたはベクタ中に与えることで ある。 発現プラスミドまたはウィルス発現ベクタの選択の際に重要な他の要因は、プラ スミドまたはベクタ中に抗生物質耐性遺伝子マーカーを与えることであり、これ により例えば安定な形質転換体真核宿主細胞について連続的な選択を適用するこ Ｌができる。 この発明の実施で使用するのに適切なプラスミドの例には、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤ Ｍ８”’　、ｐｃＤＮＡｌ、ｐｃＤＮＡｌ”。、ｐＭＡＭ”。およびＲｃ／ＣＭ Ｖが包含される。好適なプラスミドには、ｒ＋ｃＤＭ８”。、ｐｃＤＮＡ１″＠ ０、ｐＭＡＭ”。およびＲＣ／ＣＭＶが包含される。 この発明の実施に適切なウィルス発現ベクタ系の例には、レトロウィルスに基く もの、およびバ手ユ■】ウィルス、オートグラファ・カルホルニ力（Ａｕｔｏｇ ｒａｐｈａｃａ　Ｉ　１ｆｏｒｎ　１ｃａ）核多角体病ウィルスに基くものが包 含される。 この発明の実施で使用するのに適切な永久的な細胞系列からなる代表的な宿主細 胞には、ＣＨＯ−Ｋｌチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣ（、−ＣＣＬ− ６１、ｃｏｓ−ｉ細胞、５Ｖ−４０形質転換アフリカミドリザル腎臓、ＡＴＣＣ −ＣＲＬ　１６５０、ＡＴＴ２０ネズミ下垂体細胞、ＲＩＮ−５Ｆラツト膵臓β 細胞、培養昆虫細胞、スポドブテラ・フルキベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆ ｒｕｑｉｐｅｒｄａ）、または酵母（サツカロミセス）が包含される。 実施例７は、４４１〜７３０配列を発現し分泌させるのに使用する好適な手順の 詳細な説明を含む。その実施例では、ンステイン残基４５９．４６２および４６ ４を含む１以上のジスルフィド結合によって互いに保持されたホモニ量体として 断片を分泌させる。抗血栓剤として有用な単量体断片の発現には、単量体のジス ルフィド結合能力を構成する制御が必要であり、これは最も好ましくは前記した 発明の第１の態様に記載したような変異誘発手順によって達成される。 それぞれの残基位置４５９．４６２および４６４にシスティンからグリシンへの 置換を含む変異体ｖＷＦ残基４４１〜７３０断片を生成するのに使用した特定の 手順は実施例９に記載する。ここで使用した発現プラスミドはｐＡＤ４／Δ３Ｃ と命名した。 実施例９で採用し、３つの変異体残基４４１〜７３０断片（そのそれぞれは（位 置４５９．４６２または４６４に）異なる単一のＣｙｓ−４Ｇｌｙ変異を含む） を生成するのに使用した特定の手順を実施例１１に記載する。そこで使用したそ れぞれの発現プラスミドは、ｐＡＤ４／Ｇ”’　、ｐＡＤ４／Ｇ””およびｐＡ Ｄ／Ｇ４６’　（集合的にはｒｐＡＤ４／ΔＩＣプラスミド」）と命名した。類 似する手順を使用し、前記した３つ内２つの位置にＣｙｓ４Ｇｌｙ変異を有する 変異体残基４４１〜７３０断片を製造することができる。 以下の実施例７は、変異誘発されていない残基４４１〜７３０ｖＷＦサブユニッ ト断片を発現すべく安定に形質転換したＣ）１０−Ｋｌ細胞の使用を開示するも のである。以下の実施例１０に記載するように、変異誘発されていない断片は、 不安定なＣＯ３−１形質転換体でも発現された。 ＣＨＣ）−Ｋｌ細胞から誘導され分泌されて免疫沈殿させた蛋白質のＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動は、非還元条件下で、クーマシーブルーによる染色 によって検出される１ミ要なりＷＦ誘導ポリペプチドが、約１１６．０００の見 かけの分子量を有することを示す（実施例７）。この結果は、３５５標識蛋白質 のオートラジオグラフを使用し、ｐＡＤ４／ＷＴ形質転換ＣＯ５−１細胞により 分泌されるポリペプチドを特徴付けることにより確認された（実施例１２）。ジ スルフィド還元条件下（例えば１００ｍＭジチオスレイトールの存在下）で、１ １６ｋＤａ断片は最早検出されず、ｖＷＦ誘導物質は、予期される５２／４８ｋ Ｄａ単量体として現れる。 組換え１１６ｋＤａポリペプチドの見かけの分子量は、４４１〜７３０断片のホ モニ単体としての前記ポリペプチドの存在と一貫していた。このホモニ量体は、 成熟血ｉｔ（循環性）ｖＷＦのトリプシン消化によって単離された１１６ｋＤａ ポリペプチドにおいて観察されたものと等価の量のグリコジル化を担持する。よ って、この発明の哺乳動物細胞培養物における４４１〜７３０断片の発現には、 そのジスルフィド依存性１１６ｋＤａ二量体の形成が有利であり、血漿中で認め られる構造を模倣するものであることが示される。このように形成された１１６ ｋＩ）ａ断片が正しく折畳まれたポリペプチドを表すことは、立体配座依存性Ｎ ＭＣ−４抗体との（非還元条件下での）その反応によ−７て証明された。この抗 体は、適切に会合したＧＰＩｂ（α）結合部位を認識する（実施例７）。ＮＭＣ −４との反応性は還元条件Ｆでは消失する。 本態様の範囲内であり、２つのｃｐｉｂｃα）結合部位を含む二量体１１６ＫＤ ａ断片は、その２価性の特徴によりリストセチン誘導血小板凝集を支持する。 これは以下の実施例８に明示した。 システィン残基４７１および４７４また同様に残基５０９および６９５は前向結 合に関与することが（細菌により発現されたｖＷＦ断片を使用する）第１の態様 で示されたため、１１６ｋＤａポモニ量体を安定化させる箱間結合は１以上の残 基４５９．４６２および４６４から形成されなければならない。残基４５９．４ ６２および４６４はいずれの単量体でも非常に密接に近接しているため、どの特 定の１または複数の残基が、いずれかの特定の成熟ｖＷＦ二量体または多量体ま たは組換え１１６ｋＤａ断片におけるポリペプチド間接触を形成する１または複 数の箱間ジスルフィド結合に寄与するかについては変動があり得ることが更に銘 記される。治療的に活性の二量体分子の集団は、箱間ジスルフィド結合の全ゆる 可能な組合せを利用して本発明の実施によって生成することができる。 この発明の組換え１１６ｋＤａ二量体の治療的に活性な立体配座の生成またはそ の中でのジスルフィド交換に伴う幾つかの構造的折畳みまたはジスルフィド結合 の形成は、ポリペプチドが宿主細胞から分泌された後に生起することも可能であ ることが銘記される。 ４４１〜７３０ｖＷＦ断片内にはコラーゲン、プロテオグリカンおよびゲルコサ ミノグリカンに対する潜在的な結合部位も含まれているため、１１６ｋＤａポリ ペプチドは、血小板と内皮下層との間の架橋作用を行うことができる。このこと により、例えば血管内皮下層のような表面に対する血小板付着を誘導する方法で これを使用することが可能となる。また、有効量の組換え１１６ｋＤａポリペプ チドと血小板とを接触させることからなる、血小板活性化および／または凝集を 誘導する方法も提供される。この種の方法は、フォノ・ウィルブランド病の処置 に有用である。 ホモニ量体を安定化させる１以上の潜在的な箱間ジスルフィド結合の少なくとも １つが無傷のまま止まり、２つのＧＰＩｂ（α）架橋部位からなるアミノ酸配列 が保存される限り、必要に応じてそのｌ以りの２つの単量体断片の他の領域を欠 失させ、二量体の治療特性を改変することができることが銘記される。 ５２／４ｇｋＤａｌ量体ｖＷＦ断片 この発明の第２の態様の重要な観点は、正常な三次構造の実質的な要素を有する ｖＷＦサブユニットのグリコジル化された５２／４８ｋＤａ単量体断片の提供で ある。この種の断片は、抗血栓性治療剤としての使用に不適切な場合が多い二量 体を形成する傾向が低減されている。 部位指向性変異誘発の前記した手順に従い、１以上のシスティン残基４５９．４ ６２および４６４をグリシン残基で置換した残基４４１〜７３０　ｖＷＦ断片を 製造した。以下の実施例９．１０および１１は、これらの変異体ｖＷＦポリペプ チドを発現するｃｏｓ−を細胞形質転換体を生成するのに必要な変異誘発および 細胞培養条件を説明するものである。この発明の実施例１２〜１４では、ｐＡＤ ４／ＷＴ形質転換ＣＯ３−１細胞から製造された組換え１１６ｋＤａボリペプチ ド乏比較し、このように誘導された分子の性質を記載する。 ｐＡＤ４／Δ３Ｃ形質転換ＣＯ３−１細胞により発現されたｖＷＦ誘導ポリペプ チド（ｖＷＦ４４１−７３０ＤＮＡ配列を含むが、そのそれぞれのシスティンコ ドン４５９．４６２および４６４は単一のグリシンコドンによって置換されてい る）を、ｐＡＤ４／ＷＴ形質転換ＣＯ５−１細胞によって分泌されたポリペプチ ドと比較した。比較を行うため、等量のＮＭＣ−４およびＲＧ−４６抗ｖ　Ｗ　 Ｆ抗体（実施例１２）を使用し、それぞれの培養からの３５５−メチオニン補填 培養培地を免疫ｉｉＪに供し、ｖＷＦ誘導分泌蛋白質を集めた。その後ＳＤＳポ リアクリル゛γミトゲン−Ｆでの３５５標識のオートラジオグラフィにより免疫 沈殿させたＶＷＦポリペプチドを解析した。非還元条件下ではｐＡＤ４／Δ３Ｃ 形質転換細胞の培養抽出物には１１６ｋＤａポリペプチドは検出されなかった。 その代り、還元または非還元条件下で、５２ｋＤａの見かけの分子量を有するバ ンドが認められた。これに対して、ｐＡＤ４／ＷＴ形質転換ｃｏｓ−ｉ細胞は、 非還元条件下で、予期されるように１１６ｋＤａの見かけの分子量のポリペプチ ドを生産する。 立体配座依存性ＮＭＣ−４抗体（実施例１３）のみを使用し、免疫沈殿手順を同 様に繰返した。ｐＡＤ４／ＷＴ形質転換細胞の培養培地から単離された主要なり ＷＦ誘導成分は、この場合も非還元条件下で１１６ｋＤａ、および還元条件下で ５２ｋＤａの見かけの分ＰＩを有していた。ｐＡＤ４／Δ３Ｃ誘導ポリペプチド 材料のゲル十で非還元条件下で、見かけの５２ｋｌ）ａ分子量のバンドを検出し た。実施例１３に記載するように、ＮＭＣ−４抗体との反応性は、ｐＡＤ４／Δ ３Ｃ形質転換細胞で検出された５２ｋＤａ断１１が天然の残基４４１〜７３０ド メインの三次構造を有することの＠要な証拠である。 免疫沈殿手順を同様に使用し、３″Ｓメチオニンの存在下でｐΔＤ４／ＷＴおよ びΔ３Ｃ形質転換体についてのものと類似する条件下で培養したｐＡＤ４／ΔＩ Ｃ形質転換ｃｏｓ−を細胞により生産されたＮＭＣ−４反応性ｖＷＦポリペプチ ドを検出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で還元および非還元条件下で免 疫沈殿させた蛋白質を流し、ｐ　Ａ　Ｄ　４　／ＷＴおよびｐΔＤ４／Δ３Ｃ形 質転換体により生産されたｖＷＦポリペプチドと比較した（実施例１４）。 いずれか１つのンステイン残基４５９．４６２または４６４のグリシン残基によ る置換の結果、主として非還元または還元条件下で５２ｋＤａの見がけの分子量 を有するポリペプチドが与えられ、１１６ｋＤａ化学種の形成は防止されたこと が明らかとなった。 ｐＡＤ４／Δ３ＣまたはｐＡＤ４／ΔＩＣプラスミドにより形質転換されたＣ０ ８−１細胞から誘導された組換えポリペプチドについての５２ｋＤａの見かけの 分子量は、４４１〜７３０断片の単量体である前記ポリペプチドと一貫するが、 成熟血漿（循環性）ｖＷＦのトリプシン消化および還元から単離された５２ｋＤ ａポリペプチドで認められるものと等価の量のグリコジル化も担持する。 見かけの１１６ｋＤａ分子量の二量体ポリペプチドとは異なり、ｐＡＤ４／ΔＩ ＣおよびｐＡＤ４／Δ３Ｃプラスミドにより生産された単量体５２ｋＤａポリペ プチドは、二量体に随伴する架橋作用を行い得る見込みはない。よって、有効量 の変異体組換え５２／４８ｋＤａポリペプチドと血小板とを接触させることから なる血小板活性化および／または凝集を防止する方法が提供され、このポリペプ チドは、非変異体（野生型）組換え５２／４８ｋＤａポリペプチドと比較した場 合に少なくとも実質的に低減された二量体する傾向を有する。 更に、非変異体組換え５２／４８ｋＤａポリペプチドと比較した場合に少なくと も実質的に低減した二量体の傾向を示す有効量の変異体組換え５２／４８ｋＤａ ポリペプチドと血小板とを接触させることからなる表面に対する血小板の付着を 防止する方法が提供される。 ＧＰＩｂα結合部位に加えて、４４１〜７３０ｖＷＦ断片に含まれるのは、コラ ーゲン（概して残基５４２〜６２２）およびグリコサミノグリカンおよびプロテ オグリカン（同様に残基５０９〜６９５ジスルフイドループ内）に対する潜在的 な結合部位である。立体性に関する考慮からすれば、恐らく残基４４１〜７３０ からなる単一の断片は、架橋し、潜在的に血栓性の分子として挙動し得ない。 しかしながら、（概して一次配列領域４７４〜４８８および６９４〜７０８、お よび５０９〜６９５ジスルフィド結合により一部寄与されたその三次ドメインよ りなる）５２／４８ｋＤａ単量体のＧＰＩｂ（α）結合ドメインが保存される限 り、前記５２／４８ｋＤａ単量体断片の他の領域（例えばヘパリンおよびコラー ゲン結合ループの一部）を、必要に応じて蛋白質分解または変異誘発によって欠 失または変化させ、その抗血栓治療性特性を改変または保存し得る。 この発明の組換え５２／４８ｋＤａｆｌ量体の治療的に活性な立体配座の生成に 随伴する幾つかの構造的折畳みまたはジスルフィド結合形成またはそのジスルフ ィド交換が、ポリペプチドが宿主細胞から分泌された後に生起するのも可能であ る。 治療活性を増強するｖＷＦ誘導ポリペプチドのグリコジル化の制限フォノ・ウィ ルブランド因子および血小板糖蛋白質１ｂ（α）は糖蛋白質、すなわち炭水化物 分子（例えば糖）が付着する蛋白質である。フメン・ウィルブランド因子の場合 、炭水化物を付加するこの天然のプロセス（グリコジル化と呼ばれる）は、蛋白 質の分子量を実質的に増加させる。例えば、残基４４９〜７２８よりなる成熟ｖ 　Ｗ　Ｆ　”Ｉブユニットのトリプシン断片について、前記グリコジル化の結果 としてヒトでは見かけの分子量が約３８ｋＤａから５２ｋＤａに上昇する。 新たに合成されたポリペプチドのグリコジル化は真核細胞（例えば畦乳動物細胞 ）では、細菌細胞の場合より非常に複雑である。ＧＰＩｂ（α）のような膜受容 体として働く蛋白質種、およびこれと相互作用する蛋白質（例えばｖ　Ｗ　Ｆ　 ）において、グリコジル化は特に普通に認められている。 背景としては、グリコジル化は典型的には桶乳動物細胞で幾つかの段階において 行ｔ）れ、発生期ポリペプチドがリポソーム上に出現した直後から始まり、蛋白 質が史に加トされて最終的に細胞膜内に挿入されるか、または細胞から分泌され るにつれて継続する。グリコジル化は多くの糖蛋白質の機能に非常に重要である ため（ｖＷＦについてのある種の可能な機能に関しては、ワグナ−・ディ・ディ （Ｗａｇｎｅｒ、Ｄ、Ｄ、）ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０２：１３２０− １３２４　（１９８６）を参照することができる）、成熟フォノ・ウィルブラン ド因子サブユニットの残基４４９〜７２８領域のＧｌ）Ｉｂ（α）結合活性にお けるグリコジル化の役割を検討した。ここに示すように、ｖＷＦ　ｌ　１．６　 ｋ　Ｄａ二量体の治療活性は、そのグリコジル化を制限することにより増強させ ることができる。このことは、５２／４８ｋＤａｌｌ量体の活性も同様に増強さ れる筈であることを示す。 全ゆる適切な手段を使用し、ｖＷＦ１１６ｋＤａ二量体または５２／４８ｋＤａ 単量体のグリコジル化を制限するこきができる。 背景としては、循環性成熟フォノ・ウィルブランド因子サブユニットの５２／４ ８トリプシン断片のグリコジル化は、主として残基位置４６８（アスパラギン） 、５００および７２３　（セリン）、および４８５．４９２．４９３．７０５． ７１４および？２４　（）レオニン）で起ることが示されている。チタニ・ケー （Ｔｉｔａｎｉ。 Ｋ、）　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５　二　３１７１−３１８４　（ １９８６）　。 アスパラギンのグリコジル化はく側鎖アミド基からの）Ｎ結合である。セリンお よびスレオニンの水酸基は、０結合グリコジル化部位に存在する。本発明は、Ｎ および０結合部位の両者でのグリコジル化の修飾に及ぶ。 ストレプトミセスの培養物から単離し得る抗生物質であるツニカマイシンは、真 核細胞における蛋白質のグリコジル化を阻害することが示されている。トスキン ・デ（Ｄｕｓｋｉｎ、　Ｄ、）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７　（６）： ３１０５−３１０９　（１９８２）、特にツニカマイシン（ｔｕｎ　ｉｃａｍｙ ｃ　ｉｎ）は、　（アスパラギンＮ結合部位における）Ｎ型グリコシド結合の合 成を阻害する。マホネイ・ダブリュ・シー（Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｗ、Ｃ，）　ら、 Ｊ、Ｃｈ　ｒ　ｏｍａ　ｔ　ｏｇ、　１９８：５０６−５１０（１９８０）を参 照することができる。よって、ツニカマイシンを用いる真核細胞の処理により、 中で生産される糖蛋白質を修飾する有効な系が与えられる。 実施例１５の手順に従い、ｐＡＤ５／ＷＴプラスミドを含み、組換え１１６ｋＤ ａｖＷＦ断片（実施例１参照）を分泌し得る安定なＣｌ１Ｏ−Ｋｌ形質転換体を ソニカマインンの存在下で培養した。約３６時間後、培養培地を回収して濃縮し た。濃縮した培養培地（この中で主要なりＷＦ誘導ポリペプチド化学種は、１１ ６ｋＤａの見かけの分子量を有する）をリストセチン誘導血小板凝集検定（実施 例９参照）で試験し、未処理細胞培養物（通常のＮ結合グリコジル化を有するポ リペプチドを生成する）に由来する培養培地と比較した。分泌された１１．６ｋ ＤａＶＷＦ断片のＮ結合グリコジル化に対するツニカマイシンにより誘導された 制限により、リストセチン誘導血小板凝集を支持するその能力が実質的に増加す ることが示された。 Ｎ結合グリコジル化を阻害する目的のためには、この発明の実施に際してｖＷＦ 誘導ポリペプチドを発現する細胞の培養培地に対し、約０，３〜約１．５μｇ／ ｍｌの濃度のソニカマインンを添加するのが好適である。約０．３μｇ　／　ｍ 　Ｉ未満では、抗生物質の作用により、結果的に異なって開裂されたポリペプチ ドの異種の集団が与えられる傾向がある。宿主細胞を抗生物質含有培地に比較的 長く露呈することによってこの効果を顕著に減少させることは期待されない。発 生期のｖＷＦポリペプチドは、恐らく翻訳後の限定された時間期間の間にのみグ リコジル化酵素によって加工されるからである。約１．５μｇ／ｍｌを越えると 、ＣＨＯ，−Ｋｌ細胞に対する毒性の徴候があった。これは、細胞の機能および 生育に必要なグリコジル化のようなＣＨＣ）−に１蛋白質のグリコジル化の阻害 によって起ったものと考えられる。適切なツニカマイシン濃度の範囲は、異なる 細胞培養条件により、または異なる宿主細胞系統により異なり得るが、前記の量 を使用し、他の細胞系統について適切なツニカマイシンによるインキュベート条 件を容易に確認することができる。 血小板に対する５２／４８ｖＷＦ断片の結合におけるシアル酸含有炭水化物側鎖 の役割 ５２／４８）Ｕブンン断片のＮおよび０結合炭水化物側鎖の両者上に認められる 最も重要な種類の炭水化物の１つはシアル酸である。シアル酸は陰性に荷電し、 ｖＷＦ多量体および同様に血小板ＧＰＩｂ（α）受容体の表面上の正味の陰性荷 電の領域に寄与する。シアル酸は、非損傷条件下でｖＷＦおよびＧＰＩｂ（α） の相互反発を促進する。実際、血小板および循環性ｖＷＦは、相互作用を何ら生 起することなく通常は血液中に共存するが、恐らく損傷により誘導された化学的 または物理的変化の結果として内皮下層に結合したｖＷＦは血小板に結合する。 ｖＷＦ−−血小板ＧＰＩｂ（α）相互作用を試験管内で示すことができ、陽性に 荷電したグリコペプチド、リストセチンのようなある種の媒介体の存在下とし、 またはｖＷＦ分子自体の化学的操作に追従し、例えば炭水化物側鎖からの末端陰 性荷電シアル酸残基の除去によるものとする。デマルコ・エル（ＤｅＭａｒｃｏ 、　１．、）ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、６８：３２Ｌ−３２８（１９８ １）。シアル酸残基は、残基４４９〜？２８ｖＷＦ断ハのセリンおよびトレオニ ン部位（０結合）おにび同様に−ｒアスパラギンＮ結合）部位に付着した炭水化 物側鎖に認められる。 １１６ｋＤａ断片の治療能力を増強するツニカマイシンの効果は、部分的には１ １６ｋＩ）ａ二２量体のンーｒル酸含量を制限することに起因する。この効果は 、５２／４８ｋＤａ単量体に同等に適用し得る筈である。よって、単量体５２／ ４８ｋＤａｖＷＦ断片を生産する発現プラスミド（例えばｐＡＤ４／Δ３Ｃまた はｐＡＤ４／ΔｌＣ１実施例９および１１）を含む宿主細胞のツニカマイシンに よる処理により、増加したＧＰＩｂ（α）結合活性を有する抗血栓治療剤がこれ から発現され得る。 よってこの発明は、前記断片またはその二量体のグリコジル化を制限する目的の ためにツニカマイシンを用い、４４９〜７２８トリプシンｖＷＦ断片をコードす るＤＮＡ配列を含む真核宿主細胞を処理する方法に及ぶ。 またこの発明は、その治療有用性を改良する目的のために、ｖＷＦ誘導ポリペプ チドのグリコジル化を制限する更なる方法にも及ぶ。 （Ａ）炭水化物側１ｍ（Ｎまたは０結合を含む）を糖蛋白質から開裂させるのに 使用することのできる多数の酵素があることが銘記される。代表的な例には、（ １）０−グリカナーゼ５、エンド−α−Ｎ−アセチルカ′ラクトサミニダーゼ（ これは、セリンまたはスレオニン残基に結合したｇａｌ−β−（１，３）　ｇａ ｌＮＡｃコアニ糖があるＯ結合糖を開裂させる）、（２）Ｎ−グリカナーゼ５、 Ｎ−１’リコシダーゼＦ、ペプチド−Ｎ’　［Ｎ−アセチル−β−グルコサミニ ル］アスパラギンアミダーゼ（これはアスパラギン結合オリゴ糖を加水分解する ）、および（３）ｇａｌ−β−１，４−ＧＩｃＮＡｃ−ａ−２，６−シアリルト ランスフェラーゼ、（これはシアル酸部位を修飾するのに使用することができる ）（全てゲンザイム（ＧｅｎｚｙＩｌｌｅ）社、ボストン、マサチューセッツ州 由来、またはシグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州由来のエンド−Ｈ およびエンド−Ｆ）が含まれる。 （Ｂ）実施例１６は、概して残基４４９（バリン）で開始し概して残基７２８（ リジン）で終了する成熟７オン・ウィルブランド因子のその断片のアミノ峻配列 からなる親ポリペプチドを模倣した変異体ポリペプチドの部位指向性変異誘発に よる製造を記載するものである。実施例１６では、（ｖＷＦｃＤＡＮによってコ ードされる親ポリペプチドについて）それぞれ０またはＮ結合グリコシ７１／化 の部位であるか潜在的にそうであるセリン、トレオニンおよび同様にアスノＮ＋ ラギン残基をコードする特定のフド：ノを欠失させるか、または他のアミノ酸の コドンで置換することができ、これにより親ｖＷＦポリペプチドと比較して少な いグリコジル化（シアル化炭水化物を含む）を有するポリペプチドの宿主細胞中 での発現およびこれからの分泌を可能とすることが教示される。 実施例７．９および１１に教示されるように、発現されたポリペプチドが二量体 か単量体かの制御は、１以上のシステインニ】トン４５９．４６２および４６４ の変異によって行われる。このように誘導された単量体ポリペプチドは有用な抗 血栓剤であるのに対し、二量体形態は７オン・ウィルブランド病の患者の出血を 処置するのに有用である。システィン残基の適切な置換アミノ酸を選択する際に 先に記載した同一の二次および三次構造因子を適用し、グリコジル化部位である セリン、トレオニンおよびアスパラギン残基を置換することができることが銘記 される。更に、また変異体ｖＷＦ誘導ポリペプチドを設計する目的のためには、 七リン、トレオニンおよびアスパラギンは大半のシスティン残基の置換に適切で あると考えられるが、ｃｙＳ−＋ｔｈｒ、ｃ　ｙ　ｓ−＋ｓ　ｅ　ｒまたはｃｙ ｓ−＋ａｓｎ置換はｖＷＦ誘導ポリペプチドに新たなグリコ化部化部位を導入し 得るものであり、この結果増加した炭水化物含量のポリペプチドとなる可能性を 考慮しなければならない。 また、成熟ｖＷＦサブユニットの４４９〜７２８領域から誘導された変異体ポリ ペプチドは、ポリペプチドをグリコジル化した後にこれを分泌し得る宿主細胞内 のＤＮＡに更なるセリン、トレオニンおよびアスパラギンコドンを導入する部位 指向性変異誘発手順を使用することにより、実質的に増加した炭水化物含量を（ ｆするよう設計することができることも銘記される。 非ｖＷＦ誘導ポリペプチドの宿主細胞からの分泌を行うフォノ・ウイＪレブラン ド因ｆシグナルベブチドの使用 またこの発明は、成熟７オン・ウィルブランド因子サブユニ・ノドの概して残基 ４４９〜７２８配列に対応する生物学的に活性な単量体および二量体をコードＤ ＮＡ配列から製造する方法も提供するものであり、このポリペプチドは宿主細胞 から分泌される。この方法の成功に中心的に重要ｌヨものは、ｖＷＦシグナルペ プチドをコードするＩＮＮΔ配列も付着したｖＷＦ　ＤＮＡ配列の構築である。 細胞成分によるシグナル配列の認識により、ｖＷＦポリペプチドが細胞から、実 質的に不溶性のポリペプチドの凝集物として蓄積されずに分泌されることが可能 となる。封入体に捕えられた蛋白質は、一般に不適切な折畳みおよびジスＪレフ イド結合を示すと考えられる。ウィリアムス・ディ・シー（ｌｌｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ ａｍｓ、口、Ｃ３）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２１５：６８７　（１９８２）を参照 することができる。 ｖＷＦサブユニット残基４４１〜７３０を示す組換えポリ・クブチドを宿主細胞 から分泌させるためには、シグナルペプチドと成熟ｖＷＦサブユニット配列とを 組合せる発生期ポリペプチドが、分泌の過程に必要な転移受容体およびシグナル ペプチダーゼのような小胞体および細胞成分によって認識されることが必要であ る。シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの力Ｊレボキシ末端終端の適 切な認識が一般に必要である。組換え４４１〜７３ＱｖＷＦ断片または他の関連 しない治療性ポリペプチドの宿主細胞からの分泌を増強する目的のため（こ番よ 、ｖＷＦシグナルペプチドをコードするＤＮＡと治療性ポリペプチドの構造配列 をコードするＤＮＡとの間に小さいスペーサＤＮＡ配列を挿入することもできる 。 スペーサＤＮＡの好適な例には、ｖＷＦプロペプチドのアミノ末端配列領域から なる約１〜約１０のアミノ酸残基をコードする配列が含まれる。スペーサＤＮＡ 配列として特に好適なのは、 ＮＨｘ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　Ｉ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−ＣＯ２Ｈ。 ＮＨｚ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ　Ｃ０２Ｈまた（まＮＨ２−Ａ　Ｉ　 ａ　−Ｇ　Ｉ　ｕ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｔｈ　ｒ−Ａｒｇ−Ｇｏ２Ｈであり、これら はｖＷＦプロペプチドのアミノ末端領域の最初の３．４および５アミノ酸残基を 表す。　実施例１７は、この種の組合せた構成体を宿主細胞中で発現させ得る条 件を教示する。この発明の実施例１７に示すよ引こ、ｖＷＦシグナルペプチドは （大半のシグナルペプチドがそうであるよう１こ）実質的ｉこ疎水性の領域を含 むのに対し、ｖＷＦプロペプチドのアミノ末端領域番ま実質約１こ親水性である 。 標的開裂部位のシグナルペプチダーゼによる適切な認識に番よ、一般ｌこシグナ ルペプチドのカルボキシ末端領域に隣接するか接続した半極性またｌま極性の領 域が必要である。７オンーヘイジン・ジー（Ｖｏｎ　ｔｌｅｉｊｉｎｅ、　Ｇ、 ）　、Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ｂ　ｉ　。 １．１８４：９９−１０５　（１９８５）。 ｖＷＦサブユニー／　）の５２／４８ｋＤａドメインの分泌を生起するこの発明 の実施に使用するＤＮＡ配列は、ｖＷＦプロペプチド（Ａ　１　ａ　−Ｇ　Ｉ　 ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ）から誘導されるスペーサをシグナルペプチドに連結し、その後 に成熟サブユニット配列の高い極性のＡｒｇａａ＋　Ａｒｇａａｘ残基を後続さ せることにより、この種の極性のドメインを与えるものである。 この発明のこの観点は、ポリペプチドの治療性断片の発現および分泌に対して特 に重要である。この種の断片は、全ポリペプチドのアミノ末端領域を含まない。 アミノ末端は、シグナルペプチドのカルボキシ末端に直接隣接して位置する親水 性ドメインを通常は与え得る。このような場合、半極性または極性のスペーサ（ 例えばｖＷＦのａ　ｌ　ａ−ｇ　ｌ　ｕ−ｇ　Ｉ　Ｖ）をシグナル配列と治療性 ポリペプチド断片の配列との間に挿入させ、適切なシグナルペプチダーゼ開裂部 位としての認識を促進することができる。また、ポリペプチド断片の活性に影響 がない場合、前記クローン化した治療性ポリペプチド断片のアミノ末端からなる 正確な残基位置を選択し、認識配列を形成し得る親木性残基の領域を開始するこ とができる。 ５２／４８ｋｌ）ａ断片の残基４４１〜４５０領域の実質的に親水性の特性は、 シグナルペプチドと成熟サブコニット配列との間のスペーサを使用することなく 、断片が真核細胞内で成功裡に発現されこれから分泌され得ることを示す。 スペーサポリペプチドの好適な化７種（例えばｖＷＦプロペプチドの最初の３． ４または５残基）の使用は、これにより治療ポリペプチドの機能に恐らく影響し ない生物学的に重要でない外来アミノ酸の配列のみを細胞からの分泌に際して治 療ポリペプチドに付着して止まらせる点で有利である。 以下の情報は、この発明の実施に有用な半極性および極性スペーサ配列の分泌を 促進すべく提供するものである。 比較的大きなポリペプチド内に存在する場合に特定のペプチド配列が示し得る相 対的な疎水性または親水性の程度を予測することは可能である。この種のモデル の１つは、カイテ・ジェイ〈にｙｔｅ、　ｊ、）ら１．Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １５６：　１０５−１３２　（１９８２）により記載されたような相対的疎水性 ／親水性指数である。全体の指数値は、個々の残基の寄りおよびペプチド内にお ける特定のアミノ酸残基の位置に基いで指定される。ここに記載された疎水性の 最大値はＡ４゜５（イソロイシンと等価）である。ここに記載された親水性の最 大値は−４，５（アルギニンと等価）である。本発明の実施に際し、カイテ・ジ エイら、前記の方法によればスペーサペプチドは半極性または極性と考えられ、 これは約０〜約−４，５の全体の指数値を有する。ただし、隣接する治療ポリペ プチド配列が高い極性である場合、非常に短く僅かに疎水性のスペーサはそれに も拘らず機能性を示すことが銘記される。 この発明の実施に有用なスペーサペプチドの代表的な指数値は次の通りである。 添字番号は、組合せた配列領域の相対的親水性を顕著に変化させると認められ得 る成熟ｖＷＦサブユニット配列内の残基位置を指す。 （Ａ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−０，７（Ｂ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ　−０，７（Ｃ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　−１，４６ＣＤ ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ４ｎｔ　−Ａｒｇｍ　−２，２２（Ｅ）Ａｌ ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇｓｎ＋−Ｌｙｓｎｎｔ　１．１６（１’）ｖＷＦプ ロペプチドの最初の１０（アミノ末端）残基　−１，４５適切なりＮＡを含む発 現プラスミドまたはウィルス発現ベクタにより形質転換された宿主細胞を生成す べく組換えＤＮＡｔｅ向方法を使用するフォノ・ウィルブランド因子または他の 蛋白質から誘導された治療性ポリペプチドの発現について、多様な真核シグナル ペプチドが適切であることが一般に認められる。更に、その必要な疎水性ドメイ ンを供給するシグナルペプチドのアミノ酸配列号ブセットが、この発明の実施に 有用である。 標的ポリペプチドおよびｖＷＦシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を 構成することにより宿主細胞から成功裡に分泌され得る更なるポリペプチドとし て好適ｆｌのは、「Ａ」型配列ドメインからなるポリペプチドである。標的；ト リペプチドおよびｖＷＦシグナルペプチド／プロペプチド配列をコードするＤＮ Ａ配列を構成することにより宿主細胞から成功裡に分泌され得る更なるポリペプ チドとして好適なのも、「ＡＪ型配列ドメインからなるポリペプチドである。 ｒＡ、＋型ドメインは共通の構造遺伝子要素の遺伝子重複に由来したものであり 、この結果これらは、概して残基５００〜７００の成熟ｖＷＦサブユニットの領 域と実質的なｒミノ酸配列相同性（約１５〜２０％を越える）を共有する。マン クツ−ディ’ジェイ（Ｍａｎｃｕｓｏ、口、　、１．　）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６４　（３３）：１９５１４−１９５２７　（１９８９）。この種 の蛋白質の代表例には、相補的因子Ｂ、相補的成分Ｃ２、軟骨マトリックス蛋白 質、α１コラーゲンタイプＶｌ、白血球吸着受容体Ｍａｃ−１のαサブユニット 、およびＬＦΔ−１、ＶＬＡ−１およびＶＬＡ−２がある。２．０５０残基の成 熟フォノ・ウィルブランドサブユニット自体は、２つの他の「Ａ」ドメイン、Ａ ２　（［して残基７１０〜９１０）およびＡ、（ｌｌて残基９１０〜１１１０） を含む。 治療活性を備える抗体 抗体、特に立体配座依存性抗体は、マクロ分子の構造および機能を分析するため の強力な道具である。マクロ分子相互作用をブロックすることにより、抗体は重 要な治療的有用性をも有し得る。 よって、この発明はその範囲内に、ｖＷＦサブユニソ）またはそのサブセットを 含む全ゆるポリペプチドに特異的な抗体を包含し、この抗体は、概してその残基 ４４１と残基７３０との間の成熟ｖＷＦザブユニット配列を模倣し、模倣配列の １以−にのシスティン残基４５９．４６２または４６４の欠失または置換により これが模倣するポリペプチドより銀量ジスルフィド結合を形成する傾向が少ない ポリペプチドを用いて動物を免疫化することを含む方法によって作製される。更 なる診断的または治療的に有用な抗体は、前記した配列領域をこのように模倣し 、ンスデイン残基５０９および６９５がジスルフィド結合を形成し、これにより 三次構造の重要なドメインを再構成するポリペプチドによって生成することがで きる。 治療組成物 本発明の１以七のポリペプチドは、治療的、診断的または他の用途のための薬学 的調製物に処方することができる。静脈内投与のためにこれらを調製する際は、 塩化ナトリウム（例えば０．３５〜２．０Ｍ＞、グリシン等のような生理的に和 合性の物質を含み、生理的条件に和合性の緩衝ｐＨを有する水（この水および生 理的に和合性の物質は、薬学的に許容し得るキャリヤを含む）に組成物を溶解す る。 少なくとも実質的に低減された二量体化の傾向を有するこの発明の単儀体５２ｋ Ｄａポリペプチドについては、血栓の予防または阻害のための投与の量は、患者 が血栓に至り易い重篤性に依存し得るが、全ゆる特定の患者について容易に決定 することができる。 この発明の組換え１１６ｋＤａポリペプチドまたはその他の二量体ポリペプチド サブ断片については、フォノ・ウィルブランド病の処置のために投与する儀は、 患者が出血に至り易い重篤性に依存し得るが、全ゆる特定の患者について容易に 決定することができる。 実施例 以下の実施例は、この発明の実施の代表例である。 （プレプロペプチドについて）全フォン・ウィルブランド因子遺伝子をコードす るｃＤＮＡクローンは、デニス・リンチ（Ｄｅｎｎｉｓ　Ｌｙｎｃｈ）博士、ダ カーファーバ・キャンサー・インスチチュート、ボストン、マサチューセッツ州 により提供さ汰すンチ・ディ・シーら、Ｃｅ１ｌ、４１：４９−５６　（１９８ ５）に記載されたように調製した。ｖ　Ｗ　Ｆ　ｍ　ＲＮ　Ａの大きさは、ヒト ２８Ｓ型ｒＲＮＡを可能性として越えることを妥当とした。よって、ｃＤＮＡラ イブラリーの構成のために選択した２８Ｓより大きいＲＮＡを用い、内皮細胞（ 血漿ｖＷＦの主要供給源）からの全ＲＮＡをショ糖勾配で沈降させた。 ポリ　（Ｕ）−セファデックス５クロマトグラフイの２つの別々のサイクルを使 用し、この集積した両分を更に精製し、３′ポリアデニル化終端を有するＲＮＡ 種（ｍＲＮＡ）を選択した。リンチら（前記）はこの画分中のｖＷＦｍＲＮＡの 優勢率を約５００中１に確立したが、この両分を使用し、約６０．０００の独立 の組換え体のｃＤＮＡライブラリーを生成した。 ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、標準的な技術を使用した。オリゴ（ｄ 　Ｔ）プライマを使用してｍＲＮＡの集団をプライムし、その後逆転写酵素を用 いて転写した。アリカリ加水分解によりＲＮＡ鎮をその後除去し、（転写された 鎖と等価の）ｃＤＮＡアンチコード鎖を残し、ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して 第２の鎖の合成のためにヘアピンループによりこれをプライムした。Ｓ１ヌクレ アーゼを用いてヘアピンループを除去し、粗製終端をＤＮＡポリメラーゼＩで修 復した。 ＧＣ尾部、マニアディス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）ら、「分子クロー ン化」、第２版、第１巻、第５．５６頁（１９８７）をその後使用し、ｃＤＮＡ をプラスミドベクタｐＢＲ３２２にアニールさせた。ターミナルトランスフェラ ーゼを用いてオリゴ（ｄｃ）尾部をｃＤＮＡ断片に付加し、オリゴ（ｄｃ）尾部 形成したｐＢＲ３２２にアニールさせた。このプラスミドをアンピシリン感受性 イー・コリ株ＨＢＩＯＩに形質転換して増殖を図った。免疫精製したｖＷＦポリ ゾームの逆転写酵素生成物として調製した３２ｐ標識ｃＤＮＡを用いる検索の後 、適切なりローンを同定した。陽性のクローンをｐＳＰ６４　（プロメガ（Ｐｒ ｏｍｅｇａ）社、マジラン、ウィスコンシン州）にサブクローン化した。 ｃＤＮＡのプライマ指向性増幅 ｐＳＰ６４由来の全長プレプロｖＷＦ遺伝子を表すｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連 鎖反応で酵素的増幅に供した。プレプロｖＷＦ遺伝子の確立されたヌクレオチド 配列、ポンスロン・ディ（ＢｏｎＬｈｒｏｎ、　Ｄ、）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ 　Ｒｅｓ、１４　（１７）ニア１．２５−７１２７　（１９８６）　、マンクツ ・ディら、Ｊ、ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖ、２６４　 （３３）：１９５１４−１９５２７　（１９８９）に基き、意図する領域に側面 を接するオリゴヌクレオチド（（１）配列番号：２および（２）配列番号＝３と 命名した）を調製した。 モデル３８０Ｂ自動化システム、アプライド・バイオシステムズ、フォスター・ シティ、カリフォルニア州を使用し、ホスホルアミダイト法、シンハ（Ｓｉ口ｈ ａ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４：５８４３　（１９８ ３）によって、ここで使用した全てのオリゴヌクレオチドを合成した。 オリゴヌクレオチド（１）（配列番号：２）オリゴヌクレオチド（２）（配列番 号＝３）オリゴヌクレオチドは、トリプシンによる消化によって製造することが でき、残基４４９（バリン）で開始し残基７２８（Ｉ７ジン）で終了する成熟ｖ ＷＦサブユニットのその断片をコードする領域の終端に重複する。オリゴヌクレ オチド（１）は、アミノ酸位置４４１〜４４６のコード！ＪＩＤＮＡ　（ｍＲＮ Ａと類似する）に対応し、アミノ酸４４１のコドンの５′にＥｃｏＲＩ制限部位 を付加する。オリゴヌクレオチド（２）は、アミノ酸位置７２５〜７３３の成熟 ｖＷＦ　ＤＮＡの非コード鎖（転写された鎮）に対応し、アミノ酸７３３のコド ンの３′にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加する。（２）に相補的なコード鎖は下 部の場合の文字に示す。 全長のｃＤＮＡを有する前記オリゴヌクレオチドを鋳型として使用し、成熟ＶＷ Ｆ残基番号４４１〜７３３に対応し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌリンカを 含むｃＤ　ＮＩＡ断片を、サイキ・アール・ケー（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、）ら 、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７−４９１　（１９８８）の方法に従うポリメ ラーゼ連鎖反応でその後合成した。 この手順では、二本１ｆｌｖＷＦ　ｃ　ＤＮＡの断片（そのサブ断片を増幅に供 する）、およびサブ断片の終端に側面を接する２つの一重鎖オリゴヌクレオチド ブライフ（この場合はオリゴヌクレオチド（１）、（２））を利用する。（ＤＮ Ａポリメラーゼおよびポリデオキシリボヌクレオチドトリホスファターゼの存在 下で）増幅すべきＤＮＡより非常に高い濃度でプライマオリゴヌクレオチドを添 加した。 特にＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼを使用しくサーマス・アクアティカス（ Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　、ＤＮＡサーマルサイクラ−（ペルキ ン・エルマ社、ノルウオーク、コネチカット州／シータス社、バーケレイ、カリ フォルニア州）を用いて行った。反応は１００μｌ容量で行い、１．　０ｎｇの プレプロｖＷＦｃＤＮＡ、１．０ｎｇのそれぞれの合成オリゴヌクレオチドプラ イマ、および５０ｍＭＫＣＩ、１０ｍＭ）リスＨＣＩ　（ｐＩ（８，３）　、１ ．５ｍＭＭｇＣＩ２．０゜１％ゼラチン（バイオラド社、リッチモンド、カリフ ォルニア州（ＣＡ））よりなる緩衝液並びに２００ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰを 含むものとした。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒および７２℃ で１分の３５サイクルとした。増幅した断片をその後精製し、２％アガロースゲ ルによる電気泳動により単離した（マニアディスら、［分子クローン化、実験室 マニュアル」、１６４１７０、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ、コール ド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク　（ＮＹ）　（１９８２））。 多数回の変性、オリゴヌクレオチドアニーリングおよび合成の後に蓄積された広 範大部分のポリヌクレオチドが、クローン化による更なる増幅に適切な所望の二 本鎖ｃＤＮＡ断片を与える。 幾つかの実験のために、ニューマン・ビー・ジェイ（Ｎｅｗｍａｎ、　Ｐ、Ｊ、 ）ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８２ニア３９−７４３　（１９８８）に 従い、アミノ酸配列位！４４＋で開始し位置７３３で終了する成熟ｖＷＦ断片に 対応するｃＤＮＡを、血小板ｍＲＮＡから直接調製し増幅した。プライマヌクレ オチド番号４４０および７３３を前記のように利用した結果、ＥｃｏＲＩおよび Ｈｉｎｄｌｌｌリンカを含むｃＤＮＡを得た。 Ｍｌ　３ｍｐ１８クローン化運搬体へのｃＤＮＡの挿入ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ ｄ１１１制限酵素を使用し、残基４４１〜７３３のアミノ酸配列に対応するこの 結果得られる二本鎖フォン・ウィルブランド因子ｃＤＮＡを、和合性のＥｃｏＲ ｌ、およびＨｉｎｄｌｌＩ配列を有する多重クローン化部位を含むバクテリオフ ァージＭ１３ｍｐ１８の二本鎖複製形態にその後挿入した。 Ｍ１３系列フィラメント状ファージは、（Ｆ因子を含む）雄イー・コリ株に感染 する。ウィルスの感染形態は一本１ＭＤＮＡ、（゛）鎖により表され、これは宿 主の酵素によってマイナス（−）鎖も含む二本鎖環状形態に変換され、この二本 鎖構造が複製形態（ＲＦ）と呼ばれる。ウィルスの安定な二本鎖（４）形態を単 離することができることは、この中での全ゆるクローン化された配列の一体性を 確認するのに特に有用である。メリック・ジェイ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、）　 、Ｍｅ　ｔ　ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１　：２０−７８　（１９８３ ）　、ヤニシコーペロン・−シー（Ｙａｈｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，）ら、 Ｇｅｎｅ、３３：１０３−１０９　（１９８５）を参照することができる。 よって、Ｍ１３ｍｐ１８の二本鎖（゛）形態を利用し、−水制ジデオキシ方法論 （サンガー・エフら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ、７４： ５４６３−５４６７　（１９７７））を使用してｖＷＦｃＤＮＡ挿入物を完全に 配列決定し、ｖＷＦｃＤＮＡ断片が、成熟ｖＷＦサブユニット残基４４１〜７３ ３の正しいコード配列を含むことを確認した。 システィン残基を置換する部位指向性変異誘発アミノ酸４４１〜７３３に対応す る成熟ｖＷＦ断片内のシスティン残基４５９．４６２．４６４．４７１．４７４ ．５０９および６９５を、対応するｃＤＮＡのシスティンコドンに対するグリシ ンコドンの置換によってグリシン残基で置換した。これを遂行するため、ｖＷＦ ｃＤＮＡのそれぞれのシスティンコドンの領域に及ぶオリゴヌクレオチド（配列 番号＝５〜８参照）を、システィンをグリシンで置換するのに必要な対応する塩 基置換を有する非コード鎖（転写鎮）として調製した。使用したオリゴヌクレオ チドは次の通りである：オリゴヌクレオチド（３）（配列番号：４）（システィ ン４５９．４６２．４６４を同時に置換する）。 オリゴヌクレオチド（４）（配列番号：５）（システィン４７１．４７４を同時 に置換する）オリゴヌクレオチド（５）　（配列番号、６）（システィン５０９ を置換する） オリゴヌクレオチド（６）（配列番号ニア）（システィン６９５を置換する） ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは大文字で示し、転写鎮（非コードＤＮ Ａ）と等価である。等価のコード鎖は、標準的な３文字表示により示した対応す るアミノ酸と共に下部の場合の文字に示す（表示については表１を参照）。 以下に詳述するように、オリゴヌクレオチド（３）を使用してシスティン４５９ ．４６２および４６４を同時に置換した。その後オリゴヌクレオチド（４）を使 用してシスティン残基４７１および４７４を同時に＠換した。その後それぞれオ リゴヌクレオチド（５）および（６）を使用してシスティン残基５０９および６ ９５を個別に置換した。 クンケル・ティ・ニー、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ 、８２：４８８−４９２　（１９８５）の手順に従い、システィンからグリシン へのＣＤＮＡ１ｆ換を行ったが、この手順は、それぞれのオリゴヌクレオチドに いて一連の工程を繰返し、ＤＮＡ鋳型を含むウラシルに対して選択する条件を利 用するものである： （Ａ）アミノ部位、！４４１〜７３３に対応する野生型ｖＷＦｃＤＮＡを含むＭ １３ｍｐ１８ファージを、ウラシルに富む培地中でイー・コＩＪ　ＣＪ　２３　 （３変異体ｄｕｔ−ｕｎｇ−株内で生育させる。このイー・コリ株はデオキシウ リジントリフォスファターゼを欠損するため（ｄｅじ）、ｄＵＴＰの細胞内ブー Ｊｌ、が蓄積１−１これはＤＮＡへの組込みにつきｄＴＴＰと競合する。　（ン ロマイ・ジエイ（ＳｈＩｏｍａ　ｉ、、Ｊ、　）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２５３　（９）：３３０５−３３１２（１９７８）を参照することができる）、 、このような条件下で合成されたウィルスＤＮＡはウィルスゲノム当り幾つかの ウラシル挿入物を含み、ウラシルグリコシラーゼを欠失する（ｕｎｇ−）株のよ うなウラシルを除去し得ないイー・コリ株中でのみ安定である。ウラシルグリコ シラーゼによるある種の不能部位のため、ウラシル含有ヌクレオチドは、ｕｎｇ 十株中の一重鎖（’＞Ｍｌ　３ｍｐ１８ＤＮＡでは致死的である。 （Ｂ）イー・コリ株Ｃ，Ｊ２３６ｄｕじｕｎｇ−中でファージを生育させた培養 培地から一重鎖（＋）ウィルスＤＮＡを単離する。ウィルスの一重鎖（＋）形態 は、その多重クローン化部位に特定のｖＷＦｃＤＮＡを含み、このｃＤＮＡは転 写されないｖＷＦ　ＤＮＡ鎮と等価である。 （Ｃ）位置４５９．４６２および４６４におけるシスティンからグリシンへの置 換に必要なコドン変化を含むオリゴヌクレオチド（３）を、その後−重鎖（４） ファージＤＮＡに試験管内でテニールさせる。一般に、広い範囲のオリゴヌクレ オチド濃度がこの手順に適切である。典型的には４０ｎｇのオリゴヌクレオチド を０．　５〜１．　ＯｔｔｇのＭ１３ｍｐ１８ファージ（’）ＤＮＡにアニール させる。 （Ｄ）　Ｍｌ　３ｍｐ　１８　（−）鎖の全ての欠落配列を、その後ｄＴＴＰに 富む環境中でＴ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを使用して試 験管内で完結させ、これにより成熟ｖＷＦサブユニットのアミノ酸位置４４１〜 ７３３に対応する転写し得るｖＷＦｃＤＮＡ配列を生成する。 （Ｅ）今やチミン通常（−）鎖および幾つかのウラシル置換を有する（゛）鎖を 含む二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ファージを、通常のレベルのウラシルグリコシラーゼ およびデオキシウリジントリフォスファターゼを含む野生型イー・コリＸＬ−１ ブルー（ストラタジーン、う・ジョラ、カリフォルニア州）株に形質転換する。 （Ｆ）新たな宿主中に存在するウラシルグリコシラーゼおよび他の酵素が二本鎖 ファージのウラシル含有（１）鎖の破壊を開始し、複製後に残留するファージ← ）鎖ＤＮＡの宿主中で、オリゴヌクレオチドによって誘導されたグリシン変異を 反映する安定な通常チミン二本鎖（ＲＦ）ＤＮＡが存在するに至る。 （Ｇ）Ｍｌ　３ｍｐ１　ｇファージ内のｖＷＦ配列のそれぞれの連続的なシステ ィンコドンがグリシンコドンによって置換されるまで、前記方法の工程（Ａ）〜 （Ｆ）をその後オリゴヌクレオチド（４）、（５）および（６）のそれぞれにつ いで繰返Ｊ″。 （１１）変異誘発手順の完了に際し、標準的なりＮＡジデＡキシ法（サンガー・ エフら、前記）を使用してｖＷＦｃＤＮＡ挿入物の配列を再確認した。 発現プラスミドの構成 その後７つの部位特異的システィンからグリシンへの変異を含む二本鎖ｖＷＦｅ ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＩ−Ｔｉｎｄｌｌｌ制限エンドヌクレアーゼを 用いる処理によってＭ１３ｒｎｐ１８ファージから除去し、その後高効率イー・ コリ発現ベクタへのクローン化のため、断片の終端を１３ａｍＨｌリンカを用い て修飾するくロバーソ・アール・ジェイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　ＲＪ、）ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、２６５：８２−、−８４　（１９７７））。選択する特定の発現ベク タは、ロセンベルグ・ニー・エッチら、Ｇｅｎｅ、５６：１２５−１３５　（１ ９８７）によって開発されたプラスミドｐＥＴ−３八であり、これはＢａｍＨＩ リンカ部位に直接隣接する高効率（φ１０）Ｔ７転写プロモータを含むｐＢＲ３ ２２誘導体である。前記特定した変異体ｖＷＦｃＤＮＡの断片を含む場合、ｐＥ Ｔ−３Δ運搬体はｒｐ７ＥＪまたはｐ７Ｅ発現プラスミドとして言及する。 反対の方向性でプラスミドにクローン化された同一のｖＷＦコード配列を含む第 ２のｐＥ”Ｆ−３Δ誘導発現プラスミド（ｐ７Ｄとした）を構成した。ｐ７Ｄは ｖＷＦポリペプチド断片を発現できない筈である。　第３の発現プラスミド（ｐ ＪＤ１８）は、残基４４１と７３３との間のｖＷＦアミノ酸配列配列つのシステ ィンを有する）をコードする野生型５２／４８トリプシン性ｖＷＦ断片ｃ　ＤＮ Ａ苓同じｐＥＴ−３Δベクタに含む。 その後↑−分に確立された手順、ハナハン・ディ（ｌｌａｎａｈａｎ、　Ｄ、） 　１．Ｊ、　Ｍｏ　ｌ。 Ｒｉｏｌ、１６６：５５７−５８０　（１９８３）により、ｐ７Ｅ　（またはｐ ７ＤおよびｐＪＤ１８）発現プラスミドを、アンピンリン感受性イー・コリ株Ｂ Ｌ２１　（ＤＥ３）　、ツバケン社、マジラン、ウィスコンンン州（ＷＩ）にク ローン化した。株ＲＬ２１　（ＤＥ３）を操作して１−７　ＲＮΔポリメラーゼ の遺伝子を含むものとすることにより、ｖＷＦ挿入物を高い効率で転写させるこ とができる。 それぞれｐ７Ｅ、ｐ７ＤまたはｐＪＤ１８発現プラスミドを含むイー・コリ株Ｂ Ｌ２１　（Ｉ）Ｅ３）の３つの別々のサンプルを、２００　μｇ／ｍ　ｌの′γ アンピシリン含む生育５〜６ｍｌの２Ｘ−ＹＴ生育培地に接種し、３７℃で一夜 生育させて完全に生育した培養物を生Ｉ＆１−だ。２Ｘ−ＹＴ生育培地は、水リ ットル当り１０ｇｍバクトートリブトン、１０ｇｍ酵母エキスおよび５ｇｍＮａ Ｃ１を含む。 同様に２００μｇ／ｍＩのアンピシリンを含む５００ｍ１の２Ｘ−ＹＴ培地に５ ｍｌのそれぞれの一夜培養物をその後接種し、３７℃で２時間振盪しながら生育 させた。 ２時間のインキュベート期間の後、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノ シドを添加して５ｍＭの濃度とすることにより、蛋白質発現のために培養物を誘 導した。その後３７℃で３時間インキュベートを続けた。 ｖＷＦポリペプチドの高レベルの発現がｐ７ＥおよびｐＪＤ１８により得られた 結果、主として不溶性の形態で高濃度のｖＷＦポリペプチドを含む細胞質顆粒ま たは「封入体」が生成した。以下の手順によってｖＷＦポリペプチドの可溶化を 行った。実施例２に説明するように、ｐ７ＥおよびｐＪＤ１８抽出物は、可溶化 手順に対して非常に異なって応答した。封入体の特性および成功する操作戦略の 一般的な議論については、マニアティス・ティら、「分子クローン化」、第２版 、第３巻、第１７．３７章（１９８９）、コールド−スプリング・ノ＼−バー・ ラボラトリイ・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹを参照すること ができる。 ＪＡ−１４０−ターによる４℃、４０００ｇで１５分間の遠心分離によって細胞 を回収した。ベレット化した細胞を５０ｍ１の水冷緩衝液（０，１ＭＮａｃＩ、 １０ｍＭ）リスｐＩ（９，０，１ｍＭＥＤＴＡ＞中で洗浄し、４℃で４０．００ 　ｇの遠心分離により再ペレット化した。 ｐ７Ｅ、ｐ？ＤおよびｐＪＤ１８培養物からの細胞ベレットを５ｍｌの溶解緩衝 液にそれぞれ再溶解し、３０分間氷冷して保持した。溶解緩衝液は、ショ糖２５ ％（ｗ／ｖ）　、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、 １ｍＭエチレンジ−ｒミンチトラ酢酸（Ｆ、ＤＴＡ）　、２ｍｇ／ｍ！リゾチー ムおよび５０ｍＭ）’Ｊス塩酸（ｐＨ８，０に調製）の溶液からなる。 ；３０分間のインキュベートの後、１．０モルＭｇＣｌ２およびＭｎＣ＋２の両 分を添加し、それぞれの陽イオン１０ｍＭの溶解溶液を作製した。その後６０μ ｇのＮＤＡｓｅｌ（バーリンガー・マンハイノ、）を添加し、室温で３０分間イ ンキュベートを続けた。 その後２０ｍ１の緩衝液番号１　（０，２ＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、および １％（Ｗ／ｖ）３−　［（３−タラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１ −ブ［７パンスルホネート　（Ｃ）（ＡＰＳ）　、１％（ｗ／ｖ）ノンーイデッ ト（Ｎｏｎ−ｉｄｅｔ）４０、および２０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５）をイン キュベート混合物に添加した。１４，０００ｇ　（ＪＡ−２０ｏ−ターで１２． ００Ｏｒｐｍ＞　、４℃で３０分間の遠心分離によって不溶性物質をペレット化 さゼた。 それぞれの培養物（これはｐ７Ｄの場合を除いて所望のポリペプチドを含む）か ら誘導された比較的不溶性のペレット化した物質を、２５℃で１０ｍ１の緩衝液 番号２　（０，５％（ｗ／ｖ））リドンＸ−１００界面活性剤、２ｍＭＥＤＴＡ 、０．０２Ｍ）ＩＪス塩酸、ｐＨ７，５＞中で洗浄し、十分にポルテックス処理 した。 野濁物を１４，０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した後、上澄を廃棄した。ペ レット化した物質を緩衝液番号２中で再髪濁し、ポルテックス処理し、遠心分離 するプロセスを２回繰返した。 その後それぞれのベレットを５ｎ１１の＄Ｉ衝液液番号３（０，０２Ｍ）ＩＪス 塩酸、ｐＨ７，５および２ｍＭＥＤ′ｒＡ）中で２５℃で洗浄し、十分にポルテ ックス処理した。その後懸濁物を４℃で３０分間１４．０００ｇで遠心分離し、 その後と澄を廃棄し、粘ト様のコンシスチンシー苓イｆする封入体誘導物質のベ レット（「湿潤ベレット」）を残した（以Ｆの最終工程およびこれに代るものに ついては、更なる改良された手順を示す実施例２０も参照することができる）。 室温に２時間保持した８モル尿素溶液中で不溶性ベレットを徐々に再溶解させ、 その後ｏＪ溶化を４℃で一夜続けた。２０ｍＭヘベス（Ｎ−［２−ヒドロキシエ チル１ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）　（ｐＨ７，４）を含む０ ．　１５ＭＮａＣｌの溶液（「ヘペス緩衝塩類溶液」）に対して４℃で尿素可溶 性物質を十分に透析した。 可溶化したペプチド抽出物を純度について検定し〈実施例２）、ｖＷＦ結合阻害 検定で使用し〈実施例３）または更なる精製に供した。更なる精製工程は遅らせ るべきではなく、サンプルは冷却したままとすべきである。 システィンを含有しないｖＷＦポリペプチド（ザブユニット位置４４１〜７３３ からなる）は、前記手順により封入体から可溶化した物質の７５％以上を構成す る。６ＭグアニジンＨＣＩ、５０ｍＭ）リス１（ＣＬ　ｐＨ８，８に対して部分 的に精製したペプチド抽出物を再透析した後、６Ｍ尿素、２５ｍＭ）ＩＪスＨＣ Ｉ、２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴΔ、ｐＨ８，０に対して透析することに より、システィンを含有しない変異体ｖＷＦポリペプチドの更なる精製を行った 。その後、陰イオン交換のためにＱ−セファロース３フアスト・フロー（ファル マシア、アップサラ、スウェーデン）を使用し、抽出物を高性能液体クロマトグ ラフィに供した。６Ｍ尿素、２５ｍＭ）リスＨＣＬ　２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍ ＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を用いてカラムを予備平衡化した。ｖＷＦポリペプチ ドの溶出では、ＫＣＩの濃度を２５０ｍＭに上昇させる以外は同じ緩衝液を利用 した。更なる検定のために使用するポリペプチドサンプルを、０．１５ＭＮａＣ １，２０ｍＭヘベス、ｐＨ７，４に対して再透析した。ただし、長期間の保存は 、尿素緩衝液（６Ｍ尿素、２５ｍＭ）リスＨＣＬ　２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。 ｐＨ８，０）中で最も良好に達成された。最終ｐ７Ｅ−ｖＷＦポリペプチド％ア ミノ酸組成（酸加水分解による）は、公開された配列情報から予期された値と密 接に対比されたくポンスロン・ディら、またマンクツ・ディら、実施例１中、前 記、また図１も参照することができる）。 発現プラスミドｐ７Ｅ、ｐ？ＤおよびｐＪＤ１８を含む培養物の封入体から抽出 された尿素可溶化および透析ポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＰＡＧＥ）Ｊよび免疫プロッティングを使用して分析した。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による特徴付け１０％のアクリルアミド 濃度を使用してラエミリ・ニー・ケー（Ｌａｅｍｌｉ、　Ｕ、に、）、Ｎａｔｕ ｒｅ、２２７：６８０−６８５　（１９７０）により改変されたウェーバ・ケー （Ｗｅｂｅｒ、　Ｋ、）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４４：４４０６−４ ４１２（１９６９）の変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル７’ミドゲル電 気泳動手順を使用し、尿素可溶化した後に４〜分に透析した発現プラスミド抽出 物の純度および性状を最初に分析した。この結果得られたゲルをクーマシーブル ーを用いて染色して比較した。 発現プラスミドｐ？Ｅからの抽出物は、約３６，０００ダルトンの見かけの分子 量で移動する変異体フォノ・ウィルブランド因ｒポリペプチドを主要成分として 含む。ポリペプチドは、還元条件（同じ濃度のＤＴＴを含む緩衝液中でゲルを流 す前に、１０”ｌｏＯｍＭジチオスレイトールｒＤＴＴＪをサンプルに５分間１ ００℃で添加する）および非還元条件の両者の下で単一のバンドとして現れるが 、これはその中の全てのシスティン残基に対するグリシン残基の置換と一貫する 結果である。ｖＷＦｃＤＮＡ挿入物の反対の方向性から予期されるように、ＶＷ Ｆポリペプチドは、ｐ？Ｄ発現プラスミドを含む宿主細胞からは抽出され得なか った。 ｐ　、、Ｊ　Ｔ）　１８プラスミドを含み、５２／４８断片の野生型アミノ酸配 列（ここでは残基４４１〜７３：３クロ一ン化断片により表す）を含む宿主細胞 によって発現されたシスティン含有ｖＷＦポリペプチドは、電気泳動の還元およ び非還元条件−ＦＣ異なって挙動した。ｒ、ＪＤｌ　８から発現された野生型配 列は銀量ジスルフィド架橋を形成し、結果的に１０％アクリルアミドゲルに入る ことができない大きな分子量の凝集物を与えた。還元（ｌｏＯｍＭＤＴＴを用い て１００℃で５分間インキュベートする）の後、ｖＷＦペプチドは、約３８．０ ００の分子量を有する単〜のバンドとして移動した。 免疫プロッティングによる特徴付は バーネットら、Ａ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１２：１９５−２０３　（１ ９８１）の標準的な手順により、また試薬供給業者により推奨されるようにして 、ｐ７ＥＳｐ７ＤＪ５よびｐＪＤ１８から発現されたポリペプチドを免疫プロッ ティング（［ウェスタンブロッティング」）によって更に特徴付けた。宿主細胞 （ｐ７Ｅ、ｐ７ＤおよびｐＪＤ１ｇプラスミドを含む）の尿素可溶化および透析 封入体抽出物に由来する約ＩＯμｇの蛋白質を含むサンプルを、２％濃度のドデ シル硫酸ナトリウムの存在下で、１０％ポリアクリルアミドゲル（ラエミリ・ニ ー・ケー、Ｎａｔｕｒｅ、２２７＋６８０−６８５　（１９７０））上で電気泳 動に供した。 蛋白質をニトロセルロースシート　（シュライベル・アンド・シュエル、ケーネ 、ＮＨ）上にプロットして固定化し、その後免疫活性を使用してパターンを視覚 化した。 ポリペプチドを同定するのに使用したくマウス由来の）フォノ・ウィルブランド 因子特異的モノクローナル抗体は、Ｒ（、−４６（ツギムラ・ワイ（Ｐｕｇ　ｉ ｍｕｒａ、　Ｙ、　）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　（１）：３８１− ３８５　（１９８６）　、フルチェル・シー−ｘ−（Ｆｕｌｃｈｅｒ、　Ｃ，Ａ 、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵｓＡ、７９　：１６４８ １６５２　（１９８２）参照）、およびＮＭＣ−４（シマ・エム（Ｓｈｉｍａ、 　Ｍ、）　ら、Ｊ、Ｎａｒａ　Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、３６：６６２−６６９　（ １９８５））としたが、この両者はこの発明の発現されたｖＷＦポリペプチド内 にエピトープを有する。 フレーカ−・ピー・ジェイ（Ｆｒａｋｅｒ、　Ｐ、Ｊ、）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、８０　：８４９−８５７　（１９７８ ）の方法により標識した二次抗体（＋２５　１ウサギ抗マウスＩｇＧ＞を、ニト ロセルロースシート上で２５℃で６０分間インキュベートした。濯ぎの後、オー トラジオグラフィによってシートを現像した。 ｐ７ＥおよびｐＪＤ１８発現プラスミドを含む宿主細胞からのペプチド抽出物は 、ＲＧ−４６抗体に対する強い免疫反応性、およびＮＭＣ−４抗体に対する弱い が明確な親和力を示す。予期されるように、ｒ＋７Ｄプラスミドからのペプチド 抽出物は、ＲＧ−４６またはＮＭＣ−４のいずれに対しても免疫反応性を示さな い。 ボスロブス・ジャララ力（Ｂｏｔｈｒｏｐｓｊａｒａｒａｃａ）の毒から抽出さ れたボトロセチン（ｂｏｔｒｏｃｅｔ　ｉｎ）は、血小板に対する多量体フォノ ・ウィルブランド因子の試験管内結合を変調しくリード（Ｒｅａｄ）ら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ７５：４５１４−４５１８　（１９７８））、またボトロセチンは、　（成熟サ ブユニットの）アミノ酸配列位、！４４１〜７３３を含むその領域内のｖＷＦに 、したがってＧＰＩｂ結合ドメインに結合することが示されている。　（アント リユース・アール・ケー（Ａｕｄｒｅｗｓ、　Ｒ，Ｋｊ　ら、Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ ｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ、２８　：　８３１７−８３２６　（１９８９））。 発現プラスミドｐ７Ｅ、ｐ７ＤおよびｐＪＤ１８を含む培養物から（実施例１の 方法により）得られた尿素可溶化および透析ポリペプチド抽出物を、投与量依存 性基準でホルマリン固定血小板に対するボトロセチン誘導ｖＷＦ結合を阻害する その能力について、更に精製することなく試験した。 マクファーレン・ディ（ＭａｃＰａｒｌａｎｅ、　Ｄ、　）ら、Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｄｅａｔｈ、Ｈａｅｍｏｒｒｈ、３４　：３０６−３０８　（１９７５）の方法 により調製したホルマリン固定血小板を、ｐＪＤ１８、ｐ７Ｄおよびｐ７Ｅプラ スミドを含む培養物から得られたペプチド抽出物の特定の希釈物と共に室温で１ ５分間予備インキュベートした。０．　４μｇ／ｍ＋の最終濃度のボトロセチン （シグマ、セントルイス、ＭＯ）および１２５１標識多量体ｖＷＦ（フルチェル ・シー−ｘ−ら、Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。 Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７９　：１６４８−１６５２　（ １９８２）の方法によりヒト血漿寒冷沈降物から単離し、フラカー・ビー・ジェ イら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｒｎｍｕｎ、８０　：８ ４９−８５７（１９７ｇ）の方法により標識した）をその後インキュベート混合 物に添加し、血小板に結合した”５１−ｖＷＦの量を測定した。 添加するペプチド抽出物の非存在下で結合した”’　Ｉ−ｖＷＦの量として定義 した１００％結合に対し−Ｃ１血小板に対する１２’　Ｉ　−ｖＷＦ結合を対照 した。 図２は、発現プラスミドｐ７Ｄおよびｐ　、Ｊ　Ｄ　１８からのペプチド抽出物 （還元され−Ｃおらずｒルキル化されていない）は、血小板Ｇｒ’Ｉｂ受容体結 合部位について血漿誘導ｖＷＦと競合し得ないことを示す。プラスミドｐ７Ｅか らのペプチド抽出物は、ｖＷＦ結合を阻害するに際し、（０〜１００μｇ抽出物 ／ｍｌの範囲を使用し）役り量依存性の様式で有効であった。インキュベート混 合物中の尿素＋ｉＪ溶化ポリペプチド抽出物の濃度（μｇ／ｍｌ）は、抽出物に 由来する合計の蛋白′Ｒ′ｅｉ度苓反映する。反応混合物に対するペプチド抽出 物の添加によりある種の非特異的な効果が生起し、これは県かけの初発結合を添 加ペプチド抽出物の非存在下で認められる値の１１０％に上昇させる。使用した Ｉ２５−ＩｖＷＦ濃度は２μｇ／ｍｌとした。 以下のように改変する以外は実施例１の手順を利用し、変異体ｖＷＦポリペプチ ド断片（残基４４１から残基７３３の成熟ｖＷＦサブユニット配列に対応する） を調製したが、この場合位置４５９．４６２．４６４．４７１および４７４のシ スティンをそれぞれグリシン残基によって置換した。システィン残基は位置５０ ９および６９５に保持され、前向ジスルフィド結合の形成を可能とした。 部位指向性変異誘発はオリゴヌクレオチド番号４５９および４７１でのみ行われ 、これにより位置４５９．４６２．４６４，４７１および４７４においてのみグ リシンコドンに置換させた。変異誘発手順の完了に際し、−重鎮ジデオキシ法を 使用して変異体ｖＷＦｃＤＮＡの配列を確認した。 ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ制限エンドヌクレアーゼを用いる処理により、 二本鎖形態のｖＷＦｃＤＮＡ挿入物（５つのシスティンからグリシンの変異を含 む）をその後ＭＬ３ｍｐ１８ファージから除去し、ＢａｍＨＩリンカを用いて実 施例１のように改変し、ｒ＋ＥＴ−３Ａにクローン化した。このようにして形成 されたｐＥＴ−３Ａ運搬体はｒｐ５ＥＪまたはｐ５Ｅ発現プラスミドとして言及 する。 ハナハン・ディ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６．５５７−５８０　（１９８３ ）の手順により、ｐ５Ｅ発現プラスミドを、アンピシリン感受性イー・コリ株Ｂ Ｌ２１　（ＤＥ３）　、ノバゲン社、マジラン、Ｗｌにその後クローン化した。 ８モル尿素存在下での封入体ペレット物質の可溶化を室温における最初の２時間 の間を越えて継続する必要がない（この時点で再溶解した物質は２００μｇ／ｍ Ｉの濃度に達した）以外は実施例１の手順に従い、ｐ５Ｅ変異体ポリペプチドを イー・コリＢＬ２１　（ＤＥ３）の培養物から発現させた。ジスルフィド結合を 形成させるシスティン残基５０９および６９５の酸化は、ヘベス緩衝塩類溶液に 対して一夜透析することによって行った。鎮間ではなく前向ジスルフィド結合の 形成は、例えば５０〜１００μｇ／ｍＩのような低い蛋白質濃度でチオール酸化 を進行さぜることにより有利となる。 ｐ７Ｅ抽出物に適する実施例１のように、尿素可溶化封入体調製物の最終精製を 、６Ｍグアニジンおよび６Ｍ尿素緩衝液に対する透析、その後の陰イオン交換ク ロマトグラフィによって行った。 発現プラスミドｐ５Ｅを含む培養物によって生産された変異体フォノ・ウィルブ ランド因子ポリペプチドを、実施例２の手順を利用して特徴付け、特にプラスミ ドｐ７Ｅによって発現されたｖＷＦ断片と比較した。 封入体から抽出した尿素可溶化および透析ポリペプチド（実施例４の手順による ）を、実施例１におけるように作製したｐ７Ｅプラスミドからの類似する抽出物 と比較した。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による特徴付は実施例２の変性ドデンル 硫酸ナトリウムゲル手順を使用し、システィン残基５０９および６９５を使用し てジスルフィド結合を形成し得るｐ５ＥｖＷＦ断片と、システィン残基を有さな いｐ７Ｅ断片とを比較した。還元（１００ｍＭジチオスレイトール）および非還 元条件下で１０％アクリルアミドゲル上でレーン当り７゜５μｇの蛋白質抽出物 を使用して電気泳動を行った。 還元条件下では、クーマシーブルーによる染色の後、ｐ７Ｅおよびｐ５Ｅからの 抽出物は同一の電気泳動移動度を有する。 しかしながら、非還元条件下での電気泳動では、残基５０９および６９５が関与 するジスルフィド結合の効果を示される。実質的な量のｐ５Ｅ抽出物は、ゲルに 僅かしか入らない高分子量複合体く錫量ジスルフィド結合に起因する）としてツ １れる。初発調製物のゲルのデンシトメータによる走査は、非還元ゲル上に認め られるｐ５Ｅ、′ｊ′！’Ｊペプチド物質の約２５％が、約３８．０００の見か けの分子量を有する４４１〜７３３断片の単量体によって表されることを示す。 尿素可溶化、透析、および鎮間より寧ろ鎖内ジスルフィド結合形成に有利な５０ 〜１００μｇ／ｍｌのような更に稀薄な蛋白質濃度でのＦｔ−ル酸化を行うこと により、ｐ５Ｆ抽出物中に存在する単量体のパーセントを顕著に改良するこきが できる。 このｐ５Ｅ単量体化学種は、非還元条件下で、システィン残基を有さない比較し 得るｐ７Ｅ生成物化学種より僅かに高い移動度を有する。これらのｐ５Ｅおよび ｐ７Ｅ単量体３８ｋＤａ化学種の移動度は、還元条件下では同一と認められる。 非還元条件下でＳＤＳの存在下で三次構造を保持するポリペプチドの僅かに促進 された移動度は、陰イオン性界面活性剤によって前記条件下で陰性に荷電した十 分に剛性の棒体に完全に変換する同種ポリペプチドの移動度と比較した場合、一 般に前向ジスルフィド結合の存在を示唆するものと考えられる。 免疫プロッティングによる特徴付け ｐ５Ｅおよびｐ７Ｅ抽出物の挙動も、免疫プロッティング法を使用して検討した 。 実施例２のように、ｖＷＦ特異的ネズミモノクローナル抗体Ｒ（、−４１よびＮ ＭＣ−４をプローブとして使用した。ＲＧ−４６は、成熟フォノ・ウィルブラン ド因子サブユニット内で、残基６９４〜７０８からなるアミノ酸の線状配列をそ のエピトープとして認識することが示されている。その決定基に対するこの抗体 の結合は主として立体配座依存性である。モーリ・エッチら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、２６３　（３４）：１７９０１−１７９０４　（１９８ｇ）。 しかしながら、ＮＭＣ−４は、そのエピトープとして、糖蛋白質Ｉｂ結合部位を 含むフォノ・ウィルブランド因子サブユニットのドメインを有する。エピトープ のマツピングにより、これはジスルフィド依存性会合をもたらす２つの不連続的 なドメイン（概して成熟ｖＷＦザブユニット残基４７４〜４８８および同様に概 して残基６９４〜７０８からなる）内に含まれることが示されたが（モーリ・エ ッチら、前記）、元のｖＷＦ分子中でこの三次立体配座を与えるジスルフィド結 合が前向であるか、または鎮間であるかは知られていなかった。同第１７９０３ 頁。 （蛋白質の）７．５μｇのサンプルを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 最初に流し、これにより（Ｍ元および非還元条件下における）特定のバンドの抗 原性挙動を、クーマシーブルー染色によって前記得られた結果と比較し得た。 実施例２におけるように免疫プロッティングを行い、ｐ５Ｅおよびｐ７Ｅ抽出物 を比較した。 ニトロセルロースシートへの抗体の塗布は、通常は次のように調製した抗体溶液 を用いて行った。Ｂリンパ球ハイブリドーマ生成ＮＭＣ−４またはＲ（、−４６ を用いてマウスを注射した。腹膜腫瘍からの腹水流体を集めたが、典型的には約 ５ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含んでいた。腹水流体を（１０００当り１ 部）ブロック流体（５％（Ｗ／Ｖ）無脂肪乾燥ミルクを含むＰＢＳ、カルナジョ ン）に混合し、非特異的バックグラウンド結合を最小にした。抗体含有ブロック 流体をその後ニトロセルロースに塗布した。 非還元条件下で、−重鎖ｐ５Ｅポリペプチド断片（残基４４１〜残基７３３の配 列を表す）は、同様に残基４４１〜７３３の一次配列を表ずｐ７Ｅから単離した 比較し得るシスティンを含有しない化学種と比較し、ＮＭＣ−４に対する結合親 和力の約１２０倍の増加を示した。非還元条件下（１００ｍＭＤＴＴを利用する ）における電気泳動の後、−末鎖ｐ５Ｅ化学種はＮＭ（、−４に対する顕著に減 少した親木１力を示し、よってこれは還元または非還元条件いずれかにおけるシ スティンを含有しないｐＩＥ化学種の場合と非常に類似していた。還元または非 還元条件Ｆで、ＮＭＣ−４も、ｐ５Ｅ抽出物からのジスルフィド結合二量体をエ ピトープとして認識できない。 ＮＭＣ−４に基くオートラジオグラフを作製するのに使用したニトロセルロース フィルタを、初発ＮＭＣ１ｆ！呈応答（低い抗体滴定値および短い露呈時間の組 合せにより低く維持される）を減することによりＲＧ−４６で再検索した。フィ ルタ上でｐ７Ｅ３６，０００ｋＤａポリペプチドに対するＲＧ１６の結合は、選 択した還元または非還元条件によらず同一であり、発現されたポリペプチドにお けるグリシンによる全てのシスティンの置換と一貫していた。 大きな分′ｆ−量のｖＷＦ抗原（ＲＧ−４６に対して反応性）が、非還元条件下 でｐ５Ｅポリペプチド抽出物中に存在する。これらのｐ５ＥｖＷＦ凝集物（錫量 ジスルフィド結合を反映する）は、還元条件下でｐ７Ｅポリペプチドと同じ位置 にて非還元条件Ｆで容易に認識される大きなｐ５Ｅ鎖間ジスルフィド凝集物は、 還元または非還元条件のいずれにおいてもＮＭ（、−４によって認識されない。 よって、元の多量体ｖＷＦサブユニットにおける残基５０９と６９５との間のジ スルフィド結合は鎖内接触を表すことが示される。 モノクローナル抗体ＬＪ−１ｂｌは、フォノ・ウィルブランド因子−血小板糖蛋 白質１ｂ相互作用を完全に阻害することが知られている。ハンダ・エム（ｌｌａ ｎｄａ。 賛、）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　（２７）：１２５７９−１２５８ ５（１９８６）。これは、ｖＷＦ結合部位を含むＧＰＩｂαのアミノ末端４５ｋ Ｄａドメインと特異的に反応する。ビセンテ・ブイ（Ｖｉｎｃｅｎｔｅ、　Ｖ、 ）ら、Ｊ、Ｂｉｏ−１、Ｃｈｅｍ、２６５：２７４−２８０　（１９９０）。 抗体結合に対するｐ５Ｅ抽出物の阻害活性を評価するため、ｐ５Ｅ抽出物の非存 在下で最大の半分の結合を与え得るＬ　、１−１　ｂ　１の濃度を最初に選択し た。 アマジャム、アーリントン・ハイソ、ＩＬからのｌ１２５′Ｊ６よびヨードゲン （ｌｏｄｎｇｅｎ）　（ビエルセ・ケミカル社、ロックフォード、ＩＬ）を使用 し、フレーカ−・ディージエイら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、８０：８４９−８５７　（１９７８）の手順によりＬＪ−、Ｉｂ ｌをヨード化した。ジルシュら、Ｂｒ、Ｊ、Ｈａｅｍａｊｏｌ、３６，２８１− ２９８　（１９７７）のアルブミン密度勾配技術により洗浄した血小板を調製し 、ｌＸｌ０＠／ｍｌのカウントで使用した。血小板に対する抗体の最大の半分の 結合は１０μｇ／ｍＩのＬＪ−１ｂｌ濃度で観察され、この濃度をｐ５Ｅポリペ プチド阻害検討のために選択した。 ６．０Ｍグアニジンおよび尿素溶液に対する透析の後にＱ−セファロース５クロ マトグラフイを行うことによる尿素可溶化封入体調製物の最終精製を含む実施例 ４の手順により、ｐ５Ｅポリペプチド抽出物を精製した。 結合を評価するため、ＬＪ−１ｂｌ　（１０μｇ／ｍＮおよび図３に示すような 精製ｐ５Ｅ蛋白質の濃度（，００２〜ｌ０１０μモル）を用いて２２〜２５℃で ３０分間血小板をインキュベートした。２μｇ／ｍ＋ボトロセチン、シグマ・ケ ミカル社、セントルイス、ＭＯ（図３、黒丸）の存在下およびボトロセチンの非 存在下（白丸）で阻害をプロットした。 １００倍過剰の非標識ＬＪ−１ｂｌの存在下での結合競合実験により測定したも のとして、血小板に結合した＋２５１標識の５パ一セント未満がＬＪＩｂｌ以外 の標識した物質の寄与によるものだった。バックグラウンド標識をデータ点から 分率として表現した。ボトロセチンがない場合は血小板に対する”ＩＬＪ−１ｂ 　ｌの５０％阻害はｌＯμＭのｐ５Ｅポリペプチドで達成されたのに対し、ボト ロセチン（２ｂｇ／ｍ＋）の存在下では、５０％阻害は０．１μＭ未満で達成す ることができる。ボトロセチンは、循環性多号ブユニットフオン・ウィルブラン ド因子およびその単一のサブユニットにおいて、ＧＰＩｂα受容体に対する結合 を増強または許容する立体配座変化を誘導することが知られている。この例は、 ｐ５Ｅポリペプチド（釦内システィン５０９〜６９５結合を含む）は、その活性 がボトロセチンによってどのように変調されるかという点で、元の循環性フォノ ・ウィルブランド因子と非常に類似した挙動をすることを示す。したがって構造 的類似性が示される。 この例は、残基４４１　（アルギニン）のアミノ末端および残基７３０　（アス ノクラギン）のカルボキン末端を有する成熟ｖ　Ｗ　Ｆ　”ｊブユニット断片を コードするＤＮＡ配列が発現され得る条件、および元の三次構造を有する４４１ 〜？３０ｖＷＦ断片のグリコジル化されたホモニ量体形態の培養された哺乳動物 宿主細胞からの分泌の例示である。 次の構造要素を５′〜３′の方向に組合せたＤＮＡ構成体を使用して１１６ｋＤ ａホモ二量体の発現を行う（コードまたは非転写類に言及する）：（Δ）真核コ ンセンサス翻訳開始配列、ＣＣＡＣＣｌおよび（ｔ３）ｖＷＦシグナルペプチド の残余の２１アミノ酸が後続する開始ｖＷＦメチオニンコドン、および （Ｃ）ｖＷＦプロペプチドのアミノ末端領域から最初の３つのアミノ酸に対応す るコード配列、および （Ｄ）ｖＷＦ−γミノ酸残基４４１〜７３０のコニド配列、および（Ｉ’：）　 ｒＴ（’、Δ」翻訳終止コドン。 ブレブロフォン・ウィルブランド因子ｍＲＮＡからのｃＤＮＡクローンの調製全 プレプロｖＷＦ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローン、ｐｖＷＦを、デニス・リ ンチ博士、ダカーファーバ・キャンサー・インキュベート、ボストン、ＭＡから 取得し、リンチ・ディーシーら、Ｃｅｌ　１．４１．４９−５６　（１９８，５ ）に記載されたように調製した。ｐｖＷＦの調製は実施例１に記載した。 ｃＤＮＡのプライマ指向増幅一段階Ｉ 実施例１に記載したようにサイキ・アール・ケー（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、）ら 、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７−４９１　（１９８８）の方法により、ｐＳ Ｐ６４からの全長ブレブレｖＷＦ遺伝子を表すｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反 応における酵素的増幅に供した。　ＰＣＲ増幅のため、モデル３８０Ｂ自動装置 、アプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティ、ＣＡを使用し、ホスホ ルアミダイト法、シンハら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４： ５８４３（１９８３）により以下のオリゴヌクレオチドを合成した。 オリゴヌクレオチド（７）−配列番号＝８参照オリゴヌクレオチド（８）−配列 番号：９参照ここで使用するオリゴヌクレオチドを設計するに際し、プレプロｖ ＷＦ遺伝子の確立されたヌクレオチド配列、ポンスロン・ディら、Ｎｕｃ　１． 　Ａｅ　ｉ　ｄｓＲｅｓ、１４　（１７）：　７１２５−７１２７　（１９８６ ）　、７：’クツーディら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　（３３）：１９ ５１４−４９５２７　（１９８９）を参照した。 オリゴヌクレオチド（７）を使用し、ｖＷＦｃＤＮＡの開始メチオニンコドンに 先行する真核コンセンザス翻訳開始配列（ＣＣＡＣＣ）に５′融合した５ａ１１ 制限部位を生成した。コザク・エム、Ｃｅ１ｌ、４４：１８３−２９２　（１９ ８６）を参照することができる。 オリゴヌクレオチド（８）は、ｖＷＦｃＤＮＡの非転写類（コード鎖）に７％イ ブリダイズし、プレプロｖＷＦｃＤＮΔの開始メチオニンから約３６０塩基対で 、これにより（プレプロｖＷＦｃＤＮＡ配列内の残基１２０および１２１で）Ｘ ｂａｌ制限部位に及ぶヌクレオチドと重なる。 したがってポリメラーゼ連鎖反応により、　（コード鎖上で５′から３′に読ん で）Ｓａ　ｌ　ＩＢ位、コンセンサス開始配列、開始メチオニンコドン、シグナ ルペプチドのコドン配列、およびＸｂａ　１部位が後続するプロペプチドの概し て最初の１００コドンを含むｃＤＮＡ断片を合成した。 Ｍ１３ｍｐ１８クローン化運搬体へのｃＤＮＡの挿入５ａｉｌおよびＸｂａ　Ｉ 制限酵素を使用し、和合性の５ａｌＩおよびＸｂａ　１配列を有する多重クロー ン化部位を含むバタテリオファージＭ１３ｍｐ１８の二本ｔｉ複製形態に、増幅 したｃＤＮＡ断片をその後挿入した。この結果得られるりτ】−ンはｒ＋ＡＤ１ として知られている。５ａｉｌおよびＸｂａ　Ｉ制限酵素の性質については、そ れぞれアランド・ジェイ・アール（＾ｒｒａｎｄ、　Ｊ、Ｒ，）ら、Ｊ、Ｍｏｌ 。 Ｂｉｏｌ、１１８：１２７−１３５　＜１９７８’）およびザイン・ニス・ニス （Ｚａｉｎ、Ｓ、Ｓ、）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１５　：２４９−２５５ 　（１９７７）を参照することができる。一本鎖ジデオキシ方法論（→Ｊツガー ・エフら、Ｐｒ。 ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４　：　５４６３−５４６７　（ １９７７））を使用してｖＷＦｃＤＮΔ挿入物を完全に配列決定し、ｖＷＦｃＤ ＮＡ断片は正しいｖＷＦコード配列を含むことを確認した。 ｃＤＮＡのプライマ指向増幅一段階ＩＩ成熟ｖＷＦアミノ酸配列４４１〜７３２ に対応するｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応でその後増幅した。増幅のため、全 ブレフロｖＷＦ遺伝子をコードするｐｖＷＦクローンを使用した。また、ニュー マン・ビー・ジエイら１．Ｊ、（、Ｉｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８２ニア３９−７４ ３　（１９８ｇ）の手順に従い、成熟サブユニット残基４４１〜７３２に対応す るｃＤＮＡを血小板ｍＲＮＡから調製した後に直接増幅することができる。 適切な側面を接するオリゴヌクレオチドは次のように合成した：オリゴヌクレオ チド（９）−配列番号：１０参照オリゴヌクレオチド（ｌＯ）−配列番号＝１１ 参照または 製造した二本鎖ｖＷＦｃＤＮＡ断片の終端をその後ＢａｍＨＩリンカを用いて修 飾しくロバ−ツーアール・ジエイら、Ｎａｔｕｒｅ、２６５：８２−８４　（１ ９７７））　、ＢａｍＨＩにより消化し、ｐＡＤｌのＢａｍＨ１部位に挿入した （この部位はＸｂａ　Ｉ部位の直接下流（３′）である）。この結果得られたプ ラスミドをｐＡＤ２と命名した。 ｐＡＤ２のループアウト変異誘発 部位指向性（ループアウト）変異誘発をその後行い、第１の挿入物と第２の挿入 物とのリーディングフレームを同期させ、同時に全てのプロペプチドコドン配列 （プロペプチドの最初の３つのアミノ末端残基をコードするものを除く）および Ｘｂａ　ＩおよびＢａｍＨ１部位の間の残余の塩基を欠失させた。 ループアウトプライマとして、シグナルペプチドの４つのカルボキシ末端アミノ 酸残基、プロペプチドの３つのアミノ末端残基、および成熟ｖＷＦサブユニット 配列のアミノ酸残基４４１〜４４６をコードする以下のオリゴヌクレオチドを利 用した。 オリゴヌクレオチド（１１）−配列番号＝１２参照クンケル・ティ・ニー、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８２：４８８−４９２　（ １９８５）の手順に従い、所望しないヌクレオチド配列のループアウトを行った 。この手順は、ウラシル含有ＤＮＡ鋳型に対して選択する条件を利用する一連の 工程の実行を含む：（Ａ）Ｍ１３ｍｐ１８ファージ（コンセンサス翻訳開始配列 に対応するｃＤＮＡ、シグナルペプチド、プロペプチドの概して最初の１２１ア ミノ酸、残余の介在Ｍ１　：３ｍｐ　１８ポリリン力配列、および成熟サブユニ ット配列残基４４１〜７３２に対応する」トンを含む）をウリジンに富む培地中 でイー・コリＣ，Ｊ２３６変異体ｄｕじｕｎｇ−枕内で生育させる。このイー・ コリ株はデオキシウリジントリフォスファターセを欠損するため（ｄｕｔ口、ｄ ＵＴＰの細胞内プールが蓄積し、これはＤＮＡへの取込みについてｄＴＴＰと競 合する。（シロマイ・ジェイら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３　（９）：３ ３０５−３３１２　（１９７８）参照）。このような条件下で合成されたウィル スＤＮＡは、ウイルスゲノｌ、当り幾つかのウラシル含有を含み、ウラシルグリ コシラーゼを欠失する（ｕｎｇ−）株のようなウラシルを除去できないイー・コ リ株中でのみ安定である。ウラシル含有ヌクレオチドは、ウラシルグリコシラー ゼによるある種の不能部位のため、ｕｎｇ’株中の一本鎖（’）ＭＩ　３ｍｐ１ ．８ＤＮＡでは致死的である。 （Ｔ３）イー・コリ株ＣＪ２３６ｄｕｔ−ｕｎｇ−中でファージを生育させた培 養培地から一本鎖（゛）ウィルスＤＮＡを単離する。ウィルスの一本鎖（゛）形 態は、その多重クローン化部位に特定のｖＷＦｃＤＮＡを含む。このｃＤＮＡは 、転写されたｖＷＦｃＤＮＡ＃Ａと等価である。 （Ｃ）その後オリゴヌクレオチド（１１）を一本領（゛）ファージＤＮＡに対し て試験管内でアニールさせ、これにより所望しない配列をループアウトさせる。 一般に、この手順では広い範囲のオリゴヌクレオチド濃度が適切である。典型的 には４０ｎｇのオリゴヌクレオチドを、０．　５〜１．　０７４ｇのＭ１３ｍｐ １８ファージ（’　）ＤＮＡにアニールさせる。 （Ｄ）その後ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰを含む環境中でＴ。 Ｔ）ＮＡポリメラーゼおよびＴ、ｆ）ＮＡリガーゼを使用し、Ｍ１３ｍｐ１８　 （−）鎖の全ての欠落する配列を試験管内で完結させ、これにより所望しない中 間配列のないキメラｖＷＦｃＤＮＡ配列を生成する。 （Ｅ）今やチミン通常（−）鎖および（’）　ｉｎ　＜幾つかのウラシル置換を 有する）を含むゴ一本鎖Ｍ　ｌ　３ｒｎｐ　Ｉ　８フアージを、通常のレベルの ウラシルグリコシラーゼおよびデオキシウリジントランスフェラーゼを含む野生 型イー・コリＸＬ−１ブルー（ストラタジーン、う・ジョラ、ＣＡ）株に形質転 換する。 （Ｆ）新たな宿主中に存在するウラシルグリコシラーゼおよび他の酵素が二重鎖 ファージのウラシル含有（゛）鎖の破壊を開始し、残留するファージ（−）鎮Ｄ ＮＡの宿主中での複製の後に、所望の欠失を反映する安定なチミン通常二本鎖（ ＲＦ）ＤＮＡが存在するに至る。変異誘発手順の完了に際し、ｖＷＦｃＤＮＡ挿 入物の配列を、一本鎖ＤＮＡジデオキシ法を使用して確認した。（サンガー・エ フら、前記）。 前記工程（Ａ）〜（Ｆ）に従う第２の変異誘発手順を行い、翻訳終止コドン（Ｔ ＧＡ）およびＸｂａ　Ｉ制限部位（ＴＣＴＡＧＡ）をｃＤＮＡ挿入物に付加した 。同様にホスホルアミダイト法によって合成し、Ｍｌ　３ｍｐ１８運搬体配列と の配列相同性もその３′終端に含むオリゴヌクレオチドはＶｌ下の通りである。 停止コドンは残基７３０の後に付加した。 オリゴヌクレオチド（１２）−配列番号：１３参照Ｓａ　ｌ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ挿 入物として所望の構成体を含む最終的なＭｌ　３ｍｐ　１８組換え体をｐＡＤ３ −１と命名した。終止コドンの３′に生成したＸｂａ　Ｉ部位に加えて、５ａｉ ｌ部位の直接５′のＭ１３ｍｐ１８のボＩＪ　１７ンカ領域のＸｂａ１部位が存 在する。ジデオキシ法によってｖＷＦ挿入物を再度配列決定し、構成成分の構成 および一体性を確認した。 ｐブルースクリプトＩＩＫＳ（−）ベクタへのｐＡＤ３−１の５ａｌＩ−Ｘｂａ ｌ断片のクローン化 ５ａｌＩ−ＸｂａＩ断片をその後ｐＡＤ３−１から（Ｘｂａ　Ｉ−ＸｂａＩ断片 内に含まれるものとして）除去し、Ｘｂａ　Ｉにより予め消化したｐブルースク リプトＩＩＫＳ（−）ベクタ（ストラタジーン、う・ジョラ、ＣＡ）に挿入した 。 ｐブルーｘり’）ブ）　Ｉ　ＩＫＳ　（−）　ハ、ＸｂａｌｈＴｉ入物に対しテ ５′テあるｘｈｏ１制限部位およびＸｂａ　Ｉ挿入物に対して直接３′であるＮ ｏｔ１部位を含む。 適切な挿入物の方向性を有するものとして選択した結果的に得られたプラスミド をｐＡＤ３−２と命名した。 また、Ｓａ　ｌ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ断片自体をｐＡＤ３−ｉから除去し、５ａｌＩ およびＸｂａ　Ｉ制限酵素により予め消化したものとし得るｐブルースクリプト ＩＩＫＳ（−）ベクタに挿入することができる。この結果得られるプラスミド＜ ｐＡＤ３−２の形態）も、５ａｌＩ部位に対して直接５′であるＸｈｏＩ制限部 位、およびＸｂａ　１部位に対して直接３′であるＮｏｔ１部位を含み得る。こ の種の構成体（以下参照）も、ｐＣＤＭ８”’ベクタへの挿入に適切である。 哺乳動物細胞への組込みのためのプラスミドの構成アミノグリコシド系抗生物質 耐性に基く選択手順をその後用いて、ｖＷＦ発現プラスミドを保持する形質転換 体を連続的に選択した。 ｐＣＤＭ８ベクタ　（ビー・シードら、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０−８４２ （１９８７）により開発され、インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡから入手可能 である）は、ヂモンー・オッール（Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｏ’　Ｔｏｏｌｅ）博士、 スクリップス・クリニック・アンド・リサーチ・ファウンデーンヨン、う・ジョ ラ・ＣＡにより改変され、ネオマイシン耐性遺伝子（ホスホトランスフェラーゼ ＴＩ＞を含むものとされたが、これは２０００塩基対ＢａｍＨＩ断片の一部とし てｐＣＤＭ８のＢａｍＨＩ制限部位にクローン化されている。ＢａｍＨＩ挿入物 の部位を図４に矢印により示す。ネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子によって生産さ れる蛋白質は、硫酸ゲネチシンＲＧ４１８（ギブコ／ライフ・チクノロシーズ社 、ガイサースバーグ、ＭＤ）のような他のアミノグリコシド系抗生物質に対する 耐性も与える。ｎｅ。 遺伝子はＴｎ５転移性要素によって１えられ、原核生物に広く分布する。レウィ ン・ジェイ化ｅｗｉｎ、　Ｊ、）、［遺伝子］、第３版、第５９６頁、ライレイ ・アンド−リング（１９８７）。最終構成体では、ｎｅｏ遺伝子はＳＶ４０初期 プロモータの制御下に置かれている。 ネオマイシン耐性マーカーを含む幾つかの他の適切な発現ベクタが市販されてい る：ｐｃｌ）ＮΔ１ｎｅｏ（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ）　、Ｒｃ／Ｃ ＭＶ（インビトロゲン、づンジェゴ、ＣＡ）およびｐＭＡＭ”’　（クロンチッ ク、バロ・アルド、ＣＡ）がある。必要に応じて、これらの他の発現プラスミド 中での発現能力を図るべく、ｖＷＦ断片を種々に制限または修飾することができ る。 したがって、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩで制限処理したｐＣＤＭ８″＠０にｐＡＤ ３−２のＸｈｏｌ−Ｎｏｔｌ断片を挿入した。ハナマン・ディ、Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、１６６．５５７−５８０　（１９８３）の方法に従い、結果的に得 られる連結ＤＮＡ混合物を用いて、−ｒノビシリン感受性イー・コリ株ＸＳ−１ ２７細胞（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ）を形質転換した。 この結果得られるコロニーからのプラスミドを制限マツピングおよびＤＮＡ配列 決定によって特徴付け、意図する挿入物を含むコロニーを同定した。この種の適 切なプラスミドの１つ（ｐＡＤ５／ＷＴと命名した）をイー・コリ株ｘｓ−ｉ２ ７中で維持し、哺乳動物細胞形質転換手順のために選択した。 哺乳動物細胞の形質転換に使用する前に、アルカリ細胞溶解手順、バーンボイム ・エッチ・シー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　ＬＣ，）とドリイ・ジェイ（Ｄｏｌｙ、 　Ｊ、）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、７：１５１３　（１９ ７９）によってスーパーコイル状プラスミド（ｐＡＤ５／ＷＴ）を宿主イー・コ リから回収し、その後マニアナイス・ティら、「分子クローン化」、第２版、第 １．４２頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ・プレス（１９８ ７）により、Ｃ９Ｃ１／臭化エチジウム平衡遠心分離による精製を行った。 チャイニーズハムスター卵巣細胞の形質転換標準的なリン酸カルシウム媒介形質 移入手順により、ｐＡＤ５／ＷＴをＣＨＯ−Ｋｌチャイニーズハムスター卵巣細 胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ・６１）に導入した。 チェノ・シー（Ｃｈｅｎ、　Ｃ，）ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７　（８ ）：２７４５−２７５２　（１９８７）。 ｌＯ％熱不熱性活性化ウシ胎児血清Ｃ３）　、０．５ｍＭの各非必須アミノ酸（ ＮＥＡＡサブルメント、ライツタカー、ウォーカーズビル、メリーランド州（Ｍ Ｄ）から）および２ｍＭＬ−グルタミンを補填したドルベコス改変イーグルス培 地（ＤＭＥＭ）　（ギブコ／ライフ・チクノロシーズ社、ガイサースバーグ、メ リーランド州（ＭＤ））中３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気下にＣＨＯ−Ｋｌ細胞を 生育させ、その後２４時間サブ培養し、その後に６０ｍｍ組織培養皿当り１゜５ Ｘ１０’細胞の密度で形質転換した（約２５％の集合）。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞は、 これらの条件下でＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で約１６時間の倍加時間を有する。 形質転換を完遂するため、バーンボイム・エッチ・シーとドリイ・ジェイ、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、７：１５１３　（１９７９）の方 法により、ｐＡＤ５／ＷＴプラスミドをイー・コリ株ＸＳ−，１２７の培養物か ら回収した。チェノら、前記の方法により、リン酸カルシウム溶液中で各６０ｍ ｍ皿の細胞に対し１０μｇのプラスミドを適用した。プラスミドによる接種の後 、細胞をＩ）ＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で８時間、５％ＣＯ２雰囲気中に３７℃で 維持した。 その後、リン酸緩衝塩類溶液、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、４゜３ ｍＭＮａ、ＨＰＯ，・７Ｈ２０／１．４ｍＭＫＨ，ＰＯ，、ｐＨ７，４（ｒＰＢ Ｓと後記する、１０％（ｖ／ｖ）グリセリンも含む）の溶液により生育培地を取 替えた。その後培養物をグリセリン−））ＢＳ中で２分間維持し、形質転換の効 率を増加させたくアウスケル（Ａｕｓｕｋｅｌ）ら編、「分子生物学の現代の手 順」、第９、　１．　３頁、ライレイ・−アンド・リング（１９８７）を参照す ることができる）。 ２分後にグリセリン−ＰＢＳ溶液をＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３により取替えた。 ５％ＣＯ７雰囲気中３７′Ｃでの約２４時間の生育の後、次のように細胞をトリ プシン処理した。８皿の生育培地をＰＩ３５中の１ｍｌの０．２５％トリプシン によって取替えた。トリプシン処理は３分間行−うた。トリプシン含有培地を除 去し、その後皿をインキュベータ内に更に１５分間置き、その後１０％ウシ胎児 血清を含むＤＭＥＭ中に細胞を再懸濁した。８皿からの細胞をその後２０倍に分 割し、３Ｘ１０’細胞／６０ｍｍ皿の密度でプレート処理した（約５％の集合） 。 その後、（’ｉＱｍｍ皿に対して０．８ｍｇ／ｍｌの濃度にゲネチシ：／”Ｇ４ １８を添加することにより、プラスミドＤＮＡを組込んだ安定な形質転換体の生 産を行った。５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でｌＯ〜１４日間生育を継続した。クロ ーン化リングを使用して生存する独立コロニーを１２穴プレートに移し、その後 ０゜８ｍｇ／ｍｌのゲネチシン５を補填したＤＭＥＭ／１０％Ｉ”Ｃ３中で更に ７０間生育させた。これらの条件下で、プレート当り３〜７の生存するコロニー が１０〜１４後に認められた。集合のプレート密度５０〜７０％で元は約５ＸＩ Ｏ’細吻を含むそれぞれ元の６０ｍＭ皿から約ｌＯＯの安定な形質転換体を単離 するこきができる。 Ｇ４＋８耐性細胞系統の５０〜７０％が４４１〜７３０成熟ｖ　Ｗ　Ｆ　”ｊブ ユニツト断片を生産する。それぞれのクローンの組込みの特定の幾何学構成によ り、全ての場合における発現が妨げられていると考えられる。安定な形質転換体 をその後培養し、硫酸ゲネチシン”Ｇ４１８　（，８ｍｇ／ｍｌ）を含む培地中 で常に維持し、継続的な選択に供した。 １０ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ７，８，１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ１１ ０ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、１％＜ｗ／ｖ）ノンーイデット４０（ 平均９モルのエチレンオキシド１モルフェノールを含むオクチルフェノール−エ チレンオキシド縮合物）、シグマ、セントルイス、ＭＯからなる破壊緩衝液（ク レン、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２：６８４−７０４ 　（１９８７）参照）中での溶解の後、ニトロセルロース上でのドツトプロット 分析によって、組換え４４０〜７３０ｖＷＦポリペプチドを発現するコロニーを 検出した。 ＲＧ−４６（ツギムラ・ワイら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１　（１）：３ ８１−３８５　（１９８６）およびフルチヱル・シー・ニーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７９　：１６４８−１６５２　（１９ｇ２ ）参照）を−吹拭体として使用した。フラカ・ピー・ジエイら、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉ。 ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、８０　：８４９−８５７　（１９７８）の方 法により標識した二次抗体（１２５Ｉウサギ抗マウスＩｇＧ）をニトロセルロー ス上で２５℃で６０分間インキコベートした。濯ぎの後、ニトロセルロースをオ ートラジオグラフィにより現像し、ｖＷＦ断片を発現するコロニーを同定した。 ７オン・ウィルブランド因子断片の分泌ＣＨＯ−Ｋｌ細胞による培養培地中への ４４１〜７３０成熟ｖＷＦサブユニット断片の分泌は、培養培地の免疫沈殿およ び免疫クロマトグラフィによって確認した。 集合形質転換ＣＨＯ−Ｋｌ細胞をＰＢＳにより３回濯いでウシｖＷＦを除去し、 その後ＦＣ３のないＤＭＥＭ中で５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で１６時間インキ ュベートした。５ｍｌ容量の培養培地に対し、１００ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ７ ゜５．１．５ＭＮａＣ１，１０ｍＭＥＤＴＡおよび１０％（ｗ／ｖ）ノンーイデ ット４０からなるＩＯＸ免疫沈殿緩衝液（１０ｘ　ｌ　ＰＢ）の１７１０容璧（ ０，５ｍｌ）を添加した。ウシ胎児血清中に存在するウシｖＷＦ誘導ポリペプチ ドは、ＮＭＣ−４とは反応しないことが確立されている。 その後約０．０５ｍｇのＮＭＣ−４または０．０５ｍｇのＲＧ−４６ネズミモノ クローナル抗ｖＷＦ抗体（またはブロスの０．１ｍｇ）と共に混合物を４℃で１ ６時間インキュベートし、ＩｇＧ−ＶＷＦ複合体を形成させた。一般にクロノ・ ビー（Ｃｕｌｌｅｎ、　Ｂ、）ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２　 ：６８４−７０４　（１９８７）の方法に従い、重鎮抗体ポリペプチドの一定領 域に対するプロティンＡ（スタフィロコッカス・オーレウスの細胞壁から単離さ れる）の親和力を利用することにより、免疫複合体を沈殿させた。バーロウ・イ ー（ｌｌａｒｌｏｗ、　Ｂ、　）ら編、［抗体、実験室マニュアルＪ、第１４〜 １５章、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ・プレス（１９８８） も参照することができる。 プロティンＡ−セファロース３ビーズは、シグマ、セントルイス、ＭＯから購入 した。その後３ＭＮａＣ１／１．５Ｍグリシン（ｐＨ８，９）の存在下で免疫複 合体をビーズにより沈殿させ、１ｘｌＰＢにより２回洗浄した後、ノンーイデッ ト４０を含まない］、　Ｘ　Ｉ　Ｐ、Ｂを１回用いた。 ウェーバ・ケーら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４４　：４４０６−４４１２（ １９６９）の方法に従い、またはラエミリ・ニー・ケー、Ｎａｔｕｒｅ、２２７ ：６８０−６８５　（１９７０）によって改変されたものにより、１０％のアク リルアミド濃度を使用し、免疫沈殿した蛋白質をドデシル硫酸ナトリウムを含む ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。非共有結合を 破壊する非還元かつ２％ＳＤＳ含有アクリルアミドゲルサンプル緩衝液中１００ ℃で５分間加熱することにより、免疫複合したｖＷＦ蛋白質のサンプルを電気泳 動の前に解離させた。プ１コテインＡ−セファロース”４Ｂビーズを振落として 廃棄した。クー７シーブルー染色により視覚化を行い、これにより分子量マーカ ーに基いて約１１６．０００ダルトンの見かけの分子量を有する主要なりＷＦ誘 導ポリペプチド化学種が明らかとなった。 二連のゲル中の蛋白質バンドをニトロセルロースシート（シュライベル・アンド ・ンユ１ル社、ケネ、Ｎ）（）　、ににプロットして固定化し、その後高感受性 ［ウェスタンプロット」技術により免疫反応性を使用してパターンを視覚化した 。バーネットら、Ａ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１２：１９５−２０３　（ １９８１）。 ポリペプチドを同定するのに使用した７メン・ウィルブランド因子特異的モノク ローナル抗体（マウス由来）は、ＲＧ−４６（ツギムラ・ワイら、Ｊ、Ｂｉ。 １、Ｃｈｅｍ、２６１　（１）：　３８１−３８５　（１９８６）　、フルチェ ・シー・ニーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９：１６ ４８−１６５２　（１９８２）参照）、およびＮＭＣ−４（シアー　エムら、Ｊ 、ＮａｒａＭｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、３６　：　６６２−６６９　（１９８５））と したが、両者ともこの発明の発現されたｖＷＦポリペプチド内にエピトープを有 するものである。 二次抗体（１２’　Ｉウサギ抗マウスＩｇＧ、フラカ・ビー・ジェイら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ＋ｉｎ、８０：８４９−８５７　 （１９７８）の方法により標：ｉｎ）を、ニトロセルロースシート上２５℃で６ ０分間インキュベートした。濯ぎの後、オートラジオグラフィによってシートを 現像した。 非形質転換ＣＨＯ−に１細胞からの生育培地は、同一条件下でＲＧｉ６およびＮ ＭＣ−４抗ｖＷＦモノクローナル抗体と免疫反応性を小さない。 １１６ｋＤａ断片は、免疫アフィニティクロマトグラフィを使用してＣｌ−４０ −に１細胞の培養培地から単離することもできる。セファロース”４Ｂの粒子に 共役させたＮＭＣ−４抗体を使用し、形質転換ＣＨＣ）−Ｋｌ培養プレートから 誘導した５００ｍ１の培養培地から３００μｇの１１６ｋＤａ断片を回収するこ とがトリプシン性１１６ｋＤａ断片は、それぞれｖＷＦのトリプシン性５２／４ ８ｋＤａ断片に対応し、残基４４９から残基７２８までの成熟サブユニット配列 を含む２つの同一のジスルフィド結合サブユニットよりなる二量体として先に特 徴付けた。その２価性の特性により二量体１１６ｋＤａ断片がリストセチン誘導 血小板凝集を支持することができるのに対し、構成成分５２／４８ｋＤａサブユ ニツトはできない（モー９・エッチら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　（２ ９）：１７３６１−１７３６７　（１９８９）参照）。 安定なｐＡＤ５／ＷＴＣＨＯ−に１形質転換体、および対照としての形質転換さ れていないＣＨＯ−Ｋ］細胞を、５％Ｃ０２雰囲気にてＤＭＥＭ／１０％ＦＣ８ 中３７℃で９０％の集合にそれぞれ生育させた。その後６０ｍｍプレートをＰＢ Ｓにより２回濯ぎ、ＤＭＥＭ　（ＦＣ３を含まない）中で２４時間インキュベー ートを続けた。この結果得られる血清を含まない培養培地を集め、遠心分離ろ過 装置、セントリコン３０、アミコン社、レキシントン、ＭΔにて３００倍に（１ ８℃で）濃縮した。 役５量依存性血小板凝集曲線は、血小板に対するｐＡＤ５／ＷＴ形質転換細胞か らの濃縮した培養培地の添加の結果である。形質転換されていないＣＨＯ−に１ 細胞から誘導された対照培養培地の存在下では凝集は認められなかった。ジルシ ュ（Ｉｌａｌｓｈ）　ら、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ、ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 ３６：２８１−２９８　（１９７７）の手順によってアルブミン密度勾配を使用 し、検定のための血小板を調製した。ルミ血小板懸濁物（クロノ−ログ社、ハー バ−タウン、ペンシルバニア州（ＰＡ））により、一定に攪拌＜１２００ｒｐｍ ）しつつ３７℃に維持したシリコン処理したガラスキュベツト中で凝集をモニタ ーした。凝集実験は、一般にモー９・エッチら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６ ４　（２９）：１７３６１−１７３６７　（１９８９）の手順に従った。２０ｍ Ｍヘベス、Ｎ−［２−ヒドロキシエチルコピペラジン−Ｎ’４２−エタンスルホ ン酸］　（ｐＨ７，４）および０．１５ＭＮａＣ！からなる「ヘベス」緩衝塩類 溶液を用いる希釈により、ｐΔＩ）５／ＷＴ形質転換および対照非形質転換ＣＨ ＣＬ４１細胞（ＣＭ）の培養物に由来する２〜ｌＯμｍ量の３００倍濃縮ＦＣ３ 非含有ＤＭＥＭを１００μｌとした。その後１００μｍのサンプルを２００μｍ の血小板懸濁物（４ＸｌＯ”／ｍｌ）と混合し、その後血小板凝集針内で攪拌し ながら５分間インキュベートした。その後注入時点（時間ゼロ）でリストセチン を添加し、１ｍｇ／ｍＩの最終濃度とした。光透過度の変化を記録することによ り凝集をモニターシ、た。血小板凝集は、ｐＡＤ５／ＷＴ形質転換細胞系統由来 の濃縮せず血清を含まない培地の僅か１００μｌ程度で観察することができる。 ３００倍まで濃縮ｌ〜、ｌＯμＩの濃縮培地／１００μｍサンプルまでで検定し た対照非形質転換培養物からの血清を含まない培地は、血小板凝集を誘導しなか った。 モノクローナル抗体を用いる予備インキュベートリストセチン誘導１１６ｋＤａ ｖＷＦ断片−血小板相互作用の特異性を確認する更なる対照として、ｖＷＦ−血 小板ＧＰＩｂ−ＩＸ受容体相互作用をブロックすることが特に示されている抗血 小板糖蛋白質１ｂモノクローナル抗体Ｌ　Ｊ　７１ｂｌ（ハンダら、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１２５７９−１２５８５（１９８６））と共に血小板を 予備インキュベートした。 凝集検定を行う前に血小板表面受容体特異的ＬＪ−１ｂｌモノクローナル抗体と 共に血小板を予備インキュベートする効果を検討した。この予備インキュベート に供した血小板は凝集応答を示さなかったのに対し、モノクローナル抗体ＬＪ− ＣＰ３　（）ラバ二一ロンバルド（Ｔｒａｎｐａｎｉ−Ｌｏｍｂａｒｄｏ）　ら 、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７６：１９５０−１９５８　（１９８５）を 用いて同様に予備インキュベートした血小板は有効な凝集応答を与えた。ＬＪ− ＣＦ２は、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体部位をブロックし、ｖＷＦ特異的 ＧＰＩｂ−ＩＸ受容体をブロックしないことが示された。検定を行うため、１０ ０μｇ／ｍｌの濃度で、血小板凝集針内で混合物を攪拌しつつ血小板／血清混合 物に対し、リストセチン（ｍｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）を添加する時点の１分 前の時点で、抗体ＬＪ−１ｂｌまたは抗体ＬＪ−ＣＰ３を添加した。その他の点 では検定は前記したものと同一とした。 約５分（ＬＪ−１ｂｌ）または４分（ＬＪ−ＣＦ２）間隔で光透過度の変化をモ 異を有する単量体４４１〜７３０成熟フオン・ウィルブランド因子サブユニット 断片の発現のための哺乳動物形質転換体の構成この例は、残基４４１　（アルギ ニン）のアミノ末端および残基７３０（アス）＜ラギン）のカルボキシ末端を有 し、その位置４５９．４６２および４６４にシスティン残基を置換したグリシン 残基を更に含む成熟ｖＷＦサブユニー／　ト断片をコードするＤＮＡ配列を構成 し、哺乳動物細胞中に形質移入することができる条件を例示するものである。 ｐＡＤ３−２　（実施例７参照）の５ａＩＩ−ＸｂａＴ挿入物を制限処理により 除去した後、Ｘｈｏｌおよびｘｂａ■制限酵素で予め消化したｐ　ｃ　ＤＮＡ　 １ベクタ（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ）にクローン化した。Ｘｈｏｌお よび５ａｌＩ制限部位は同一の内諾配列−ＴＣＧＡ、−／−ＡＧＣＴ−を含むた め、Ｓａ１■制限処理断片ｔｘｈａ１部位にアニールさせることができる。断片 をＴ、ＤＮＡＩＪガーゼにより連結したが、Ｘｈｏ　１部位の一体性は保存しな かった。このプラスミド構成体をｐＡＤ４／ＷＴと命名した。 Ｍ１３ｍｐ１８を使用する部位指向性変異誘発ｐＡＤ４／ＷＴをＥｃｏＲｌおよ びＳｍａｌ酵素により制限処理した。ｐｃＤＮＡＩベクタは、ＸｈｏＩ　（ｒｓ ａｌｌＪ）部位の上流のそのポリリンカ領域内にＥｃｏＲ１部位を含むが、Ｓｍ ａＩ部位は含まない。図１に示すように（配列番号　１）、独特のＳａｍＩ部位 （ＣＣＣＧＧＧ）はｖＷＦｃＤＮＡ挿入物内に含まれ、成熟サブユニット残基７ １６（グリシン）〜残基７１８（グリシン）に及ぶ。 よって、ｐＡＤ４／ＷＴの約９５０塩基対ＥｃｏＲＩ−３ｍａｌ断片を、Ｍ１３ ｍｐ１８フアージのポリリンカ領域内のＥｃｏＲＩ−３ｍａ１部位にサブクロー ン化した。その後Ｍ１３ｍｐ１８のｖＷＦ配列を変異誘発し、予め制限処理した ｐＡＤ４／ＷＴ構成体に再挿入し、無傷の残基４４１〜７３０　ｖＷＦ配列の構 成を導くものとした。 変異誘発は、実施例１の手順およびクンケル・ティ・ニー、前記に従い、次のオ リゴヌクレオチドを利用するものとした。 オリゴヌクレオチド（１３）−配列番号：１４参照３　’　−ＧＧＡＣＴＣＧＴ ＧＣＣＧＧＴＣＴＡＡＣＣＧＧＴにＣＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧ　−５’５’　− ｃｃｔｇａｇｃａｃ工掘ｃａｇａｔｔｇｇＨｃａｃ壓氏ｇａｔｇｔｔｇｔｃ　− ３’ＧＩＹｅ＊　ＧＩＹ４６ｉ　ＧＩＹ４６１ハイブリダイズするオリゴヌクレ オチドは（３’−５”）に大文字で示し、転写類（非コード鎖ＤＮＡ）と等価で ある。下線を付した文字は、変異体コドンについて単一塩基置換を示す。等価の コード鎖を下部の場合の文字に示すが、３文字表示によって同定される対応する グリシン置換を有する。 変異体９５０塩基対ＥｃｏＲＩ−３ｍａｌ断片を、その後予め制限処理したｐＡ Ｄ４／ＷＴプラスミドのＥｃｏＲＩ−５ｍａ　１部位に再挿入した。変異体構成 体はｐＡＤ４／Δ３Ｃと命名した。長期間の保存および繁殖を促進するため、／ ’％ナハン・ディ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６：５５７−５８０　（１９８ ３）の方法により、ｐＡＤ４／八３Ｃをアンピシリン感受性イー・コリ株ＸＳ− １２７に形質転換した。 実施例１の手順に一貫するものとして、変異体ｃＤＮＡの配列をジデオキシ法に よって確認し、ＣｓＣｌ／臭化エチジウム平衡遠心分離によってプラスミドを精 製した。 ＣＯ３−］細胞の形質転換 標準的なリン酸カルシウム媒介形質移入手順により、ＣＯ３−１細胞（ＳＶ４０ 形質転換アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ−ＣＲＬｌ　６５０）にｐＡＤ ４／Δ３Ｃを導入した。チェノ・シーら、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、７　 （８）：２７４５−２７５２　（１９８７）。 ｌＯ％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補填したドルベコス改変イーグルス培地（ＤＭ ＥＭ）　（ギブコ／ライフ・チクノロシーズ社、ガイサースバーグ、ＭＤ）中で ５％ＣＯ，雰囲気下に３７℃でＣＯ５−１細胞を生育させ、１．５Ｘ１０’細胞 ／６０ｍｍ組ｍ培養皿の密度（約２５％の集合）で形質転換の前に２４時間サブ 培養した。これらの条件下で、ｃｏｓ−を細胞はＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で約 ２０時間の倍加時間を有する。 形質転換を遂行するため、バーンボイム・エッチ・シーとドリイ・ジエイ、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、７：１５１３　（１，９７９）の 方法により、イー・コリ株ＸＳ−１２７の培養物からｐＡＤ４／Δ３Ｃプラスミ ドを回収した。チェノら、前記の方法により、リン酸カルシウム溶液中各６０ｍ ｍ皿の細胞に対し１０μｇのプラスミドを適用した。プラスミドの接種の後、５ ％ＣＯ３雰囲気中３７℃で８時間ＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で細胞を維持した。 リン酸緩衝塩類溶液／１０％（ｖ／ｖ）グリセリンの溶液によりその後生育培地 を取替えた。その後培養物をグリセリン＝ＰＢＳ中で２時間維持し、形質転換体 の生成を促進したくアウスケルら編、［分子生物学の現代の手順」、第９．１゜ ３頁、ライレイ・アンド・ソング（１９８７））。２分後、グリセリン−ＰＢＳ 溶液をＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３て取替えた。安定な形質転換体を選択するのに抗 生物質耐性は使用しなかった。その後５％Ｃ０２雰囲気にてＤＭＥＭ／ｌｏ％Ｆ Ｃ８中３７℃で細胞を維持した。 実施例１Ｏ−ｐＡＤ４／ＷＴプラスミドによるＣＯ３−１細胞の形質転換ｐＡＤ ４／ＷＴプラスミドによりＣＯ３−１細胞も成功裡に形質転換された。 安定な形質転換体を選択するために抗生物質耐性は使用しなかったが、ｐＡＤ４ ／Δ３Ｃプラスミドにより生産された１１６ｋＤａ変異誘発ポリペプチドの性質 をｐＡＤ４／ＷＴＩ　１６ｋＤａホモニ量体の場合と比較する目的には、これか らの１１６ｋＤａ断片の遷移発現が特に有用だった。 実施例９０手順に従い、イー・コリ株ＸＳ−１２７の保存培養物からｐＡＤ４／ ＷＴプラスミドを回収した。実施例９の手順を使用し、ｐＡＤ４／ＷＴによるＣ Ｏ５−１細胞の形質転換をその後行った。その後５％ＣＯ□雰囲気にてＤＭＥＭ ／１０％ＦＣ３中３７℃で細胞を維持した。 実施例１１−変異体４４１〜７３０成熟フオン・ウィルブランド因子サブユニッ ト断片を発現する哺乳動物形質転換体の構成（この場合それぞれの変異体は単一 のシスティンからグリシンの置換を含む）実施例９の手順に従い、また部位指向 性変異誘発のための適切なオリゴヌクレオチドを使用し、３つのプラスミド（ｐ ＡＤ４／Ｇ”’　、ｐＡＤ４／Ｇ””およびｐＡＤ４／Ｇ””　、集合的にｒ　 ｐＡ　＋）　４　／ΔＩＣプラスミド」として言及する）を構成した。それぞれ 成熟ｖ　Ｗ　Ｆ　”ｊブユニット残基位置４５９．４６２および４６４に単一の システィンからグリシンへの置換に対応する単一塩基対変異をそれぞれが含む以 外は、この種のプラスミドはｐ　Ａ　Ｄ　４　／ＷＴと同一である。それぞれが そのオリゴヌクレオチドの３つの変異体コドンの１のみを含む以外は（他の２つ のコドンは野生型コード配列によって表される）、使用したオリゴヌクレオチド は、ｐＡＤ４／Δ３Ｃを調製するのに使用したオリゴヌクレオチド（１３）と同 一である。長期間の保存および増殖を促進するため、ｐＡＤ４／Ｇ”″、ｐＡＤ ４／Ｇ”’およびｐＡＤ４／Ｇ”’のサンプルを、実施例９の方法に従ってアン ピシリン感受性イー・コリ株ＸＳ−１２７にそれぞれクローン化した。　実施例 ９の手順と一貫するものとして、変異体ｃＤＮＡの配列をジデオキシ法によって 確認し、ＣｓＣｌ／臭化エチジウム平衡遠心分離によってプラスミドを精製した 。 実施例９の手順により、ｐＡＤ４／Ｇ””、ｐＡＤ４／Ｇ”またはｐＡＤ４／Ｇ ”’プラスミドによるｃｏｓ−ｉ細胞の形質転換を行った。安定な形質転換体を 選択するために抗生物質耐性は使用しなかった。その後５％ＣＯ２雰囲気にてＤ ＭＥＭ／ｌｏ％ＦＣ３中３７℃で細胞を維持した。 実施例１２−ｐＡＤ４／ＷＴおよびｐＡＤ４／Δ３Ｃプラスミドで形質転換され たＣＯ３−１細胞によるフォノ・ウィルブランド因子サブユニット断片の発現お よび特徴付け それぞれ実施例９および１０の手順によりｐＡＤ４／Δ３ＣまたはｐＡＤ４／Ｗ Ｔプラスミドにより形質転換したＣＯ５−１細胞を培養し、以下に説明するよう にコードしたｖＷＦ　ＤＮＡを発現させた。ｐｃＤＮΔ１プラスミドベクタ（ｖ ＷＦｃＤＮＡ挿入物を含有しない）により同様に形質転換したＣ０３Ｉ細胞を対 照として使用した。 時間ゼロでｌＯμｇのｐＡＤ４／ＷＴ、ｐＡＤ４／Δ３Ｃまたはｐ　ｃ　ＤＮＡ 　１プラスミドを添加することにより、４〜５ｘ１０’　／６０ｍｍ皿の密度で Ｃ０８−１細胞を形質転換した。実施例９および１０の手順に従い、８時間の期 間の後に細胞をグリセリンショックに供した。その後３２時間、５％ＣＯ２雰囲 気中３７℃でＤＭＥＭ／１０％ＦＣ５により細胞を覆った。 その後それぞれの培養物の細胞をＰＢＳにより３回濯ぎ、１００μＣｉ／ｍｌの 最終濃度上した１００ＱＣｉ／ｍｍｏ　ｌの比活性を有する３ＳＳメチオニン（ アマジャム社、アーリントン・ハイツ、イリイ州（ＩＬ））を補填したＤＭＥＭ （Ｆｅ２を含まない）を用いてインキュベートを続けた。細胞を１６時間インキ ュベータに戻し、その時間の後に分泌されたｖＷＦポリペプチドの免疫沈殿によ る精製のため、そのぞれの培養培地を回収した。 免疫沈殿は、概して実施例７の手順に従った。０．５ｍｌのＩＯＸ免疫沈殿緩衝 液、０．０５ｍｇのＮＭＣ−４抗体および０．０５ｍｇのＲＧ−４６抗体を用い て、５ｍｌ容量の培養培地を１６時間インキュベートした。 実施例７により、プロティンＡ−セファロース”４Ｂによる処理を行った。Ｉｇ Ｇ複合ｖＷＦ蛋白質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥの前にＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で 解離させた。 還元条件下でのｖＷＦポリペプチドの分析のため、サンプル緩衝液を改変して１ ００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むものとした。 結果 還元および非還元条件下でゲルを流し、乾燥させ、ＳＳＳ標識を現像するオート ラジオグラフィに供した。還元または非還元条件いずれにおいても、（未修飾ｐ ｃＤＮＡ１運搬体により形質転換された＞　ｃｏｓ−を細胞の対照培養物から誘 導された免疫沈殿物として”５ａｓａ蛋白質は検出されなかった（ＭＯＧＫとし たゲルレーン参照）。 ｐＡＤ４／ＷＴプラスミドにより形質転換したＣ０８−１細胞は、非還元条件下 で、約１１６．０００の見かけの分子量の顕著な３ｓ３標識バンドを生成する。 この値は、４４１〜７３０断片の適切な哺乳動物グリコジル化と一貫する。還元 条件下で流した場合、１１６ｋＤａ物質は認められず、１１６ｋＤａホモ二量体 を安定化させるジスルフィド結合の還元と一貫する。還元条件下では、約５２゜ ０００の見かけの分子量の３ＳＳ標識バンドが視覚化される。見かけの５２ｋＤ ａの値は、還元された単量体４４１〜７３０断片の適切なグリコジル化とやはり 一貫する。 ｐＡＤ４／Δ３Ｃによる形質転換に対応４−るゲルレーンは、明らかな１１６に １）ａ物質を示さない。その代り、還元および非還元条件下で、約５２，０００ の見か【ノの分子＠においてバンドが明らかである。 よ−、て、４４１〜７３０ｖＷＦ断片内のンステイン残基４５９．４６２および ４６４をグリシン残基で置換する変異誘発の結果、おそらく前向（４７１〜４７ ４および５０９〜６９５）ジスルフィド結合のみを有する非二量体ポリペプチド の発現が成功１．たことになる。ＮＭ（、−４との相互作用（実施例７も参照） は無傷の５０９〜６９５釦内ジスルフィド結合を必要とすることが知られており 、これｉこよりｐＡ　Ｄ　４　／Δ３Ｃにより生産されたポリペプチドにおける 元の野生型三次構造の存在が示される。 ゲルは（還元および非還元条件下で）低分子頃３５３標識物質の存在も示すが、 おそら＜ｐＡＤ４／Ｗ′Ｆ構成体により生産された全てのｖＷＦポリペプチドが 成功裡に二量体化されておらず、ポリペプチドの蛋白質分解および／または不完 全なグリコジル化が更に高い収率を妨げているがもじれないことを示している。 蛋白質分解および／または不完全なグリコジル化は、ｐＡＤ４／Δ３ｃ形質転換 体によって生産された単量体ｖＷＦポリペプチドの収率にもおそらく影響を与え ている。幾つかの高分子量凝集体物質（主としてゲルに入らない）が、ｐＡＤ４ ／ＷＴおよびｐＡＤ４／Δ３Ｃからの非還元サンプル中に存在する。 ＭＭＣ−４モノクローナル抗体は、糖蛋白質ｒｂ結合部位を含むフォノ・ウィル ブランド因子サブユニットのドメインをそのエピトープとして有する。エピトー プのマツピングにより、これは前向（残基５０９〜６９５）ジスルフィド結合に よるジスルフィド依存性会合に至る（［ｔして成熟ｖＷＦサブユニット残基４７ ４〜４８８および同様に概して残基６９４〜７０８からなる）２つの不連続的な ドメイン内に含まれることが示されている。 よッテ、ＮＭＣ−４と（７）反応性は、特定の組換え４４１〜７３０ｂｉ熟ｖ　 Ｗ　Ｆ　”ｆブユニット断片が、類似する野生型残基４４１〜７３０ドメインの 三次構造を想定したか否かの重要な証拠である。 よッテ、実施例１２０手順に従い、ｐＡＤ４／ＷＴおよびｐＡＤ４／Δ３Ｃ形質 転換ｃｏｓ−を細胞によって分泌されたｖＷＦポリペプチドを特ｆｆ１（Ｎ１け たが、培養培地の免疫沈殿をＮＭＣ−４抗体のみによって行った（０．５ｍｌの ＩＯＸ免疫沈殿緩衝液を添加した５ｍｌの培養培地当り０．０５ｍｇのＮＭＣ− ４）点を改変した。 還元および非還元条件下でサンプルを流した。実施例１２の結果と一貫するもの として、ｐＡＤ４／ＷＴ培養培地から単離した主要成分は、非還元条件下で１１ ６ｋＤａ、還元条件下で５２ｋＤａの見かけの分子量を有する。 全ｐＡＤ４／Δ３Ｃ誘導ｖＷＦポリペプチド物質の小さな両分のみがＮＭＣ−４ に結合するが（を体配座非依存性ＲＧ−４６と比較＞、５２ｋＤａの見かけの分 子量のバンドは、ＮＭＣ−４免疫沈殿物のゲル中で還元および非還元条件下で認 めることができる。 実施例１４−ｐＡＤ４／Ｇ’”、ｐＡＤ４／Ｇ””またはｐＡＤ４／Ｇ”’プラ スミドで形質転換されたｃｏｓ−ｉ細胞によって生産されたフォノ・ウィルブラ ンド因子サブユニット断片の発現および特徴付は実施例１１の手順により、ｐＡ Ｄ４／Ｇ”　、ｐＡＤ４／Ｇ４８２またはｐＡＤ４／Ｇ”’プラスミド（集合的 にｒｐＡＤ４／ΔＩＣプラスミド」）によるＣＯ５−１細胞の形質転換を行った 。実施例７の手順により、免疫沈殿のためにＮＭＣ−４のみを使用し、分泌され たｖＷＦポリペプチドについて培養培地を分析した。 実施例１２により調製した３５５標識蛋白質をＮＭ（，４により免疫沈殿させ、 還元および非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で流し、ｐＡＤ４／ ＷＴおよびｐＡＤ４／Δ３Ｃ形質転換体によって生産されたｖＷＦ抗原と比較し た。 ゲルは、元の成熟サブユニットにおける錫量ジスルフィド接触に関与すると考え られる３つのシスティン（４５９，４６２，４６４）のいすか１つの置換により 、ｐＡＤ４／ＷＴ形質転換ＣＯ８〜１細胞の特徴であるホモ二量体１１６ｋＤＡ ポリペプチドの形成が妨げられることを示した。単一のグリシン置換を有するこ れらの３つのｖＷＦ抗原は、主として還元または非還元条件下で５２．０００の 見かけの分子量の単量体ポリペプチドとして現れる。主要な物質が５２ｋＤａの 見かけの分Ｆ−１１を有することは、ヒ）５２／４８ｋＤａ　）’）プシン性ｖ ＷＦ断片で認められるグリコジル化を重複させるＣＯ３−１細胞形質転換体によ る正しいグリコジル化を強く示唆するものである。不適切にグリコジル化されへ かつ／または蛋白質分解された幾つかのｖＷＦ抗原（５２ｋＤａ未満の分子量） もゲル中に認められる。成功裡に折畳まれて分泌され、これによりＮＭ（、−４ エピトープを５えるｐＡＤ４／Δ３ＣｖＷＦポリペプチドの相対的に小さい両分 が、５２゜０００の見かけの分子量のｐＡＤ４／Δ３Ｃ形質転換体オートラジオ グラフバンドの低い強度によって示された。 この例は、１１６ｋＤａポリペプチド中に存在するＮ結合グリコジル化の量を低 減させることにより、血小板に対する組換え１１６ｋＤａｖＷＦ断片の親和力を 増強することができることを示す。 ０．５ｍＭの各非必須アミノ酸、２ｍＭＩ−−−グルタミンおよび更に０．８μ ｇ／ｍｌのツニカマイシン（ストレプトミセス生成物Ｔ７７６５に由来し、その Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ異性体を含む、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズー リ州（ＭＯ）　）と共に１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭ中で（約５Ｘ１０５細胞／ ６０ｍｍ組織培養皿の初発細胞密度として概して実施例Ｉの細胞培養手順に従い ）ｐＡＤ５／ＷＴプラスミドからのＤＮＡを含む安定なＣＨＯ−に１形質転換体 を一夜インキユベートした。 その後ＰＢＳにより細胞を２回洗浄し、０．５ｍＭの各非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．４μｇ／ｍｌツニカマイシンを用いるＤＭＥＭ中で更 に２４時間インキュベートした。培養培地を回収し、遠心分離ろ過装置、モデル セントリコン３０、アミコン社、レキシントン、ＭＡにより３００倍に濃縮した 。 対照として、ツニカマイシンを用いないで（他は同一の条件下で）インキュベー トした安定な形質転換体からの培地も回収した。（処理および未処理培養物から の）ＶＷＦ誘導組換え１１６ｋＤａ二量体ポリペプチドのりストセチン（ｒｉｓ ｔｏｃｅｔｉｎ）誘導血小板凝集を支持するそれぞれの能力を比較した。 ｖＷＦ誘導抗原の量は、それぞれの組織培養皿中での生育の正確な程度に依存し て調製物から調製物で変動した。処理および未処理細胞から誘導されるＦＣＳを 含有しない培地の特定のサンプルのＮＭＣ−４反応性の比率に基き、リストセチ ン検定における比較のために等量のｖＷＦ抗原を反映させるべくそれぞれμｌ量 の３００倍濃縮培地を選択した。等しいＮＭＣ−４親和力定数を想定した。 標準化した比率を決定するため、１０〜１００μｍ量のＦＣＳを含有しない培養 培地サンプル（処理および未処理培養物由来）を実施例１に記載したようにＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、その後標準的な手順によりバンドを ニトロセルロースシートに移した。バーネットら、Ａ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、１１２：１９５−２０３　（１９８１）、−吹拭体としてＮＭＣ１を使用し 、その後二次抗体として１２５Ｉウサギ抗マウスＩｇＧを用い、またオートラジ オグラフィによる視覚化（実施例１参照）によってニトロセルロースシート上で の検出を行った。標準化のため、それぞれの培養物からのＮＭＣ，、、−４と反 応性の全ｖＷＦ抗原を、オートラジオグラフの濃度計による走査から測定した。 実施例２の手順によりリスト七チン誘導血小板凝集検定を行い、ツニカマイシン 処理した細胞は、通常のＮ結合グリコジル化を有するポリペプチドを生成した未 処理細胞によって製造されたものより大きい血小板凝集誘導能力を有するＮＭＣ −４反応性抗原を生産したことが示された。比較する凝集の様子を示すものでは 、０．５．０．７５および１．０ｍｇ／ｍｌのリスト七チン濃度を使用した。 史に、未処理細胞からのＮＭ（、−４反応性１１６ｋＤａポリペプチド物質を、 ウェスタンブロッティングによって僅かに異なる電気泳動移動度を有する多数の 化学種に分別した。ツニカマイシンによる処理の後、単一の化学種のみが観察さ れた。よって、組換え１１６ｋＤａ断片のＮ結合グリコジル化は異種性であり、 この種のグリコジル化のレベルは断片の生物学的活性に影響を与えることが示さ れる。 実施例１６−低減されたレベルのグリコジル化を有する残基４４１〜７３０フオ ン・ウィルブランド因子サブユニット断片の単量体または二量体形態の発現のた めの哺乳動物形質転換体の構成 この例は、成熟サブユニット４４９〜７２８配列（５２／４８ｋＤａ断片）また はぞの二量体を模倣するが、循環性血漿ｖＷＦから単離されたような５２／４８ 断片またはその二量体中に存在するものより少ないグリコジル化を含むｖ　Ｗ　 Ｆ誘導ポリペプチドの調製を示す。 ｖＷＦｃＤＮＡの変異誘発 そのセリン、スレオニンまたはアスパラギン残基をコードする成熟サブユニット 残基４４１〜７３０断片をコードするｃＤＮＡの１以−Ｆの特定のコドンは、実 施例１および３の手順に従い、例えばアラニンまたはグリシンのような他のアミ ノ酸のコドンで置換することができる。 簡略には、ｖＷＦサブユニット残基４４１−７３０をコードしｐＡＤ３−１（実 施例７）と命名したＭ１３ｍｐ１８組換えＤＮＡ断片を（実施例９の手順により ）ｐｃＤＮＡ１ベクタにクローン化してｐＡＤ４／ＷＴプラスミドを生成するこ とができる。 ｐ　Ａ　Ｄ　４　／ＷＴプラスミドは、ＥｃｏＲｌおよびＳｍａｌ酵素を用いて 制限処理することができる。実施例９に説明したように、ｐｃＤＮＡｌはそのポ リリンカ領域内にＥｃｏＲ１部位を含むがＳｍａ　Ｉ部位はない。独特のＳｍａ 　１部位（ＣＣＣＧＧＧ）は、成熟サブユニット残基７１６（グリシン）から残 基７１８（グリシン）に及ぶｖＷＦｃＤＮＡ挿入物内に含まれる。 ｐＡＤ４／ＷＴのこの約９５０塩基対ＥｃｏＲＩ−３ｍａｌ断片は、Ｍ１３ｍｐ １８ファージのポリリンカ領域内のＥｃＯＲＩ−Ｓｍａ１部位にサブクローン化 することができる。ｖＷＦ配列をその後変異誘発し、先に制限処理したｐＡＤ４ ／ＷＴ構成体中に再挿入する前に（グリコジル化の潜在的な部位をコードする） １以上のセリン、トレオニンまたはアスパラギンコドンを欠失または置換し、無 傷残基４４１〜７３０ｖＷＦ配列の再会合へと導くことができる。 変異誘発の好適な形態は、クンケル・ティ・ニー、前記（実施例７）の手順に従 い、１以上のセリン、トレオニンまたはアスパラギンコドンを欠失させるのに適 切な、またはこれに代えてグリシンまたはアラニンのような他のアミノ酸の１以 上のコドンを置換するのに適切なハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用 するものである。低減されたグリコジル化の潜在能力を有するポリペプチドをコ ードするｖＷＦｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ１誘導プラスミドはｐＡＤ４／−Ｇと することができる。 実施例９および１０の手順に従い、ｐ　Ａ　Ｄ　４　／　−Ｇプラスミドを用い てＣ０８−１細胞を形質転換することができる。この方法で発現されたポリペプ チドは、ｐＡＤ４／ＷＴポリペプチドと比較して少ないグリコジル化の潜在的部 位を有する１１６ｋＤａホモニ量体を形成し得る。他の多くの発現プラスミド／ 宿主細胞系を使用し、実施例７のｐ　ＣＤＭ　８　”。／ＣＨＯ−Ｋｌ系を特に 含む変異体ｖＷＦｃＤＮＡを発現させることができる。 単量体断片の発現 実施例９の手順に従い、４４１〜７３０配列内の１以上の前記した潜在的なグリ コジル化部位をコードする１以上のコドンの欠失または置換は、例えばシスティ ン残基位置４５９．４６２および４６４にｃｙｓ−＋ｇｌｙコドン変化もコード するオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。また、２回目の変異誘発を Ｍｌ　３ｍｐ１　ｇファージ中で行って、システィンからグリシンへの変異を行 い得る。 再構成した場合、ｖＷＦサブユニット位置４５９．４６２および４６４にｃｙｓ −＋ｇｌｙ変異、方よびコードされたｖＷＦポリペプチドのグリコジル化を制限 する１以上の更なるコドン変異を含むｐ　ｃ　ＤＮＡ　１プラスミド構成体は、 ｐＡＤ４／Δ３Ｃ，−Ｇとすることができる。１１６ｋＤａホモニ量体（実施例 １２および１４参照）を安定化させるシスティン残基を欠如するこのポリペプチ ドは、単量体断片として宿主細胞により発現させ分泌させ得る。 実施例１７−他の治療ポリペプチドの真核細胞による発現および分泌実施例７お よび実施例１２〜１４は、２２残基ヒ１−ｖＷＦシグナルペプチドおよびヒトｖ ＷＦプロペプチドの最初の３つのアミノ酸よりなるポリペプチドは、残基４４１ 〜７３０よりなる成熟ｖＷＦサブユニット断片のＣＨＯ−に１およびＣＯ３−１ 細胞からの成功裡の分泌に向かうことを示す（これと異なる場合その断片は、細 胞溶解によって宿主細胞から回収し得るのみである）。 アミノ酸配列（配列番号：１５参照） Ｓ＠ｒ−Ｔｈｒ−ＣＯＪ　↑ 公知のシグナルペプチド開裂部位 およびその断片および断片の組合せは、ｖＷＦ分子の他の領域からなるかその断 片の他の蛋白質化学種よりなる治療ポリペプチドの小胞体内腔への、したがって 真核宿主細胞培養培地への分泌を傷内する方法に有用たり得る。 また、ＮＨ２−ａ　ｌ　ａ　−ｇ　ｌ　ｕ−ｇ　Ｉ　ｙ−ＣＯ２Ｈからなるアミ ノ酸配列は、前記アミノ酸配列がヒ）ｖＷＦシグナルペプチドのＣ末端側に位置 した場合に、シグナルベブチダーゼによる適切な開裂部位の同定を促進し得るこ とも考えられる。 実施例７の手順に従い、治療ポリペプチドの発現に有用なりＮＡ配列は、次の構 造要素を５′〜３′方向に会合させ得るものとして構成することができる（コー ドまたは非転写鎮に言及する）： ＜Ａ）制限に適切なヌクレオチドの配列、（Ｂ）真核コンセンサス翻訳開始配列 、（Ｃ）２１の他のコドンが後続するメチオニンコドン（共にヒトｗＷＦシグナ ルペプチドをコードし得る）、 （Ｄ）ＩＩしてヒ）ｖＷＦプロペプチドのアミノ末端領域の最初の３つのアミノ 酸に対応するコード配列、 （Ｅ）治療ポリペプチドのコード配列、（Ｆ）翻訳終止コドン、および （Ｇ）制限に適切なヌクレオチドの配、にこの構成体をその後プラスミドまたは ウィルス発現ベクタに挿入することができ、次にこのクローン化運搬体を使用し て適切な真核宿主細胞を形質転換することができ、これから治療ポリペプチドを 発現させ得る。 実施例１８−５２／４８　ｋＤａポリペプチドのサブセットのｗ４製この例は、 ｖＷＦサブユニットの残基４４１〜７３３断片から誘導されたシスティン欠損サ ブセットであるこの発明の態様を示すポリペプチドの調製を例示するものである 。またこの例は、この種のサブセットを組換え細菌宿主細胞から発現させ得る条 件も例示するものである。サブセットは、例えば実施例７および９の一般的手順 に従い、組換え真核細胞から発現させることもできる。サブセットは、多量体ｖ ＷＦと血小板ＧＰＩｂαとの相互作用を妨害することができる。すなわち、これ らは抗血栓剤としての有用性を有する。 次に、前記した種類のサブセットからなる３つの群のポリペプチドの調製を以下 に説明するが、最初の群のサブセットはシスティンを含有せず、第２および第３ の群のサブセットの場合は２のみのシスティン残基を有する（システィン残基の ５つが除去されている）。第２および第３の群のサブセットは、ポリペプチドの Ｎ末端領域（第２の群）またはＣ末端領域（第３の群）で保持されるかという点 で異なる。 ｖＷＦサブユニットの残基４４１〜７３３ドメインのポリペプチドサブセット（ システィンを含有しない） 残基４４１−７３３配列よりなるが、内部Ｇ１０（残基４７４〜４８８）または Ｄ５（残基６９４〜７０８）領域を欠落する変異体（融合）ポリペプチドを、ｐ ７Ｅ構成体の制限断片のＭ１３ｍｐ１８ファージ中でのループアウト変異誘発を 使用して生成し、その後抗血栓活性について試験した。 特に、アルカリ細胞溶解手順、バーンボイム・エッチ・シーとドリイ・ジェイ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７：１５１３　（１９７９ ）を使用し、ｐ７Ｅプラスミドをイー・コＩＪＢＬ２１　（ＤＥ３）の培養物か ら回収し、その後ＣｓＣ１／臭化エチジウム平衡遠心分離による精製を行った。 ＸｂａＩ制限部位は、（親ｐＥＴ−３Ａベクタが関与する）ｐ７Ｅプラスミド中 でＴ７転写プロモータの上流に存在する。よって、Ｍ１３ｍｐ１８ファージ中で のループアウト変異誘発（実施例１参照）のため、（残基４４１〜７３３の）ｖ ＷＦ挿入物をＸｂａｌ−ＨｉｎｄｌＩＩ制限断片として除去した。非コード鎖（ 転写Ｍ）ＤＮＡを示す以下のオリゴヌクレオチドを使用し、それぞれＧＩＯ領域 またはＤ５領域のループアウトを行った。以下に示す２つの３′→５′オリゴヌ クレオチドは、対応するコード鎖およびこの結果のアミノ酸配列である。 オリゴヌクレオチド（１４）−配列番号：１６参照３１　−　ＧＡＧ　ＴＧＧ　 ＣＣＡ　Ｃ’ＩＴ　ＣＧＧ　ＣＡＣＴＣＧ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　−５’Ｇ ＩＯ結合ペプチドの欠失 オリゴヌクレオチド（１５）−配列番号＝１７参照３’　−ＣＴＣＴＡＧ　ＣＡ Ａ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＧＴ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　−５’Ｇ５結合 ペプチドの欠失 ＤＮＡ配列分析を使用し、意図するｖＷＦコード配列が生産されたことを確認し た。その後２つの変異誘発したＸｂａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限断片を、ＸｂａＩ およびＨｉｎｄｌｌＩ制限エンドヌクレアーゼで切断した別々のｐＥＴ−３Ａプ ラスミドに挿入し、その後これらをｐ７Ｅ／ΔＧＩＯおよびｐ７Ｅ／ΔＧ５と命 名した。 この結果得られた変異体（融合）ｖＷＦポリペプチドを、その後ＧＰＩｂαに結 合するその能力について試験した。実施例６の検定手順を使用しくボトロセチン 変調剤非存在下におけるＧＰＩｂαに対するＬＪ−ＩｂＩ抗体の結合の阻害）、 ｐ７Ｅから発現されこれから「Ｇ１０Ｊペプチド配列が欠失した残基４４１〜７ ３３断片がＧＰＩｂαに結合することを決定した。「Ｄ５」ペプチド配列を欠落 するｐ７Ｅ誘導融合断片はこれを行わない。しかしながら、結合の変調剤として ボトロセチンを使用して実験を繰返した場合（実施例６の方法参照）、融合した サブ断片の両者はＬＪ−１ｂｌによる結合を阻害するのに有効であり、したがっ て抗血栓の有用性を有する。 抗血栓性活性を有するｖＷＦ誘導ポリペプチドを同定するのに使用することがで きる他の試験管内検定には、変異体ポリペプチドによる血小板に対するｖＷＦの ボトロセチン誘導結合の阻害（実施例３参照）、およびウシｖＷＦを使用する系 （ただしボトロセチンまたはりストセチンのような変調剤は含まない）における ヒト血ＩＮ反凝集の阻害が含まれる。 Ｎ末端欠失を有するシスティン欠損ポリペプチドサブセット残基４４１〜７３３ ｖＷＦサブユニツト断片を模倣するが、Ｎ末端欠失を含む抗血栓剤として有効な 治療ポリペプチドサブセットを調製した。 ｐ５Ｅ発現プラスミドからのＸｂａｌ−ＨｉｎｄｌＩ　Ｉ制限断片のＭ１３ｍｐ １８ファージ中でのループアウト変異誘発を使用してこの種のポリペプチドの調 製を行った。よって、ｖＷＦコード配列（ｐ　５　Ｅ）は、残基位置５０９およ び６９５にシスティン、および残基位置４５９．４６２．４６４．４７１および ４７４にグリシンをコードした。ｐ７Ｅ配列もこの種の抗血栓性ポリペプチドの 発現に有用である。ｐ７Ｅ楕成体から発現されたものと等価の抗血栓性ポリペプ チドは、そのままではこれに含まれるシスティン残基の還元またはアルキル化に よって作製することができる。 ｖＷＦサブユニット断片にお：ノるＮ末端欠失を生成するのに使用したオリゴヌ クレオチドの設計では、ｖＷＦ残基４４１をコードするコドンから上流（５′） にあるｐＥＴ−３ＡベクタのＤＮＡ配列を参照した。ｐＥＴ−３ＡにおけるＥｃ ｏＲｌ−ＨｉｎｄＩＴＩ挿入物としての残基４４１〜７３３断片の発現（Ｂａｍ ＨＩリンカによって修飾されたその５′および３′終端の両者を有する、実施例 １）は、ｖＷＦ断片のアミノ末端に付着して止まる２０残基アミノ酸配列（配列 番号：１８）の発現も含む。以下に示すように、この配列はＴ７ブロモータ部位 から下流のベクタＤＮＡによってコードされるが、ｖＷＦポリペプチドの治療活 性には逆行的な影響を与えない。 開始コドン ６氏Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｍａ ｔＥｃｏＲＩから この特定の場合、ＥｃｏＲＩコード配列（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）は、Ｔ、ＤＮＡリガ ーゼ手順（★施例１）におけるＢａｍＨＩ！Ｊンカによる修飾後も残存すること が銘記される。開始メチオニンおよび残基４４１　（アルギニン）から上流に局 在する対応するｐＥＴ−３Ａベクタコ一ド配列は次の通りである。　オリゴヌク レオチド（１６）−配列番号゛１９参照 よって、ベクタからの配列（開始メチオニンで終止する）およびその後の新たな りＷＦポリペプチドの意図するＮ末端領域をコードするハイブリダイズするオ・ ノゴヌでレオチドを用いるループアウト変異誘発を使用し、Ｎ末端欠失の生成を 行った。 治療ポリペプチドの調製に必要なオリゴヌクレオチドの代表例は、非コード鎖（ 転写鎮）ＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチド１７　（配列番号：２０）である 。 以下に示すこのオリゴヌクレオチドは、対応するコード鎖およびこの結果のアミ ノ酸である。。 ３’　−ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＴＡＣＧＴＣＣＴＣにＧＣＣＣＴ　 ＣＣＧ　−５１この種のＮ末端欠失を反映するシスティン欠損ポリペプチドの代 表例は、ＭｅｉＧＩｎ４７５〜Ｖａｎ７３’、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ”２〜Ｖａ　Ｉ” ’およびＭｅｉＴｙｒ”＠〜Ｖａｌ”’である。この種のポリペプチド（および １以上のシスティン残基を含むｖＷＦ残基４４１〜５０８配列の全ゆるサブセッ トの末端欠失を有する他の化学種）は抗血栓治療活性を有する。これらのポリペ プチドは、ｐ５ＥＩＩ成体から発現される場合、システィン５０９〜６９５ルー プも与えることができる。 Ｃ末端欠失を有するシスティン欠損ポリペプチドサブセットｐＥＴ−３Ａベクタ を使用して組換え細菌ポリペプチドを発現するのに使用する手順は、Ｖａ１７３ ３のＣ末端側に一連のアミノ酸も含むポリペプチドを結果的に与えるが、付加的 な残基はベクタ配列の翻訳から生ずるものである（配列番号：２１参照）。 特に、ｐ５Ｅ　（またはｐ７Ｅ）構成体から発現された残基４４１〜７３３断片 は、最初のベクタ停止コドンの前のベクタ配列の発現に起因する残基７３３（） ＜リン）のＣ末端側に融合した２２残基も含む。 ＢａｍＨＩリンカによるＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片のＨｉｎｄＩＩＩ部位 の修飾（実施例１）を同様に反映するこのｐＥＴ−３Ａベクタ配列は次の通りで ある（配列番号：２１） Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　 ＡｌａＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ、　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｔｈｒため、非コード＠ＤＮＡを模倣するハイブリダイズするオリゴヌ クレオチドを使用し、ｐＳＥ中でループアウト変異誘発を行った。ポリペプチド を調製するため（例として残基Ａｓｐ”’で終了するポリペプチドを使用する） 、ｖＷＦサブユニット配列（例えば残基７０６〜７１３）をコードするハイブリ ダイズするオリゴヌクレオチドを生成したが、これはその所定のコドン（例えば コドン７０９とコドン７１０）の間に停止コドン／リーディングフレームシフト 配列３’　−ＡＣＴ−ＡＣＴ−Ｔ−５’　も含むものとした。 よって、Ｃ末端欠失を有し、それぞれ残基７０９．７０４．７００および６９６ で終端するｖＷＦ誘導ポリペプチドを生成した。 発明の実施に有用な株の寄託 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１　パークローン・ ドライブ、ロックビル、メリーランドにより、ブダペスト条約の下で、以下の株 の生物学的に純粋な培養物の寄託を行った。成功裡の生存性試験の後に示した受 託番号が与えられ、必要な手数料を支払った。 前記培養物の利用は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，ｆｉｌ、１４および３５Ｕ、Ｓ、　Ｃ， ｌＡ１２２によりこれに対して資格を与えられた米国特許商標局の特許局長によ って決定された者に対して特許出願の継続の間、またはブダペスト条約によりこ のような利用がめられた場合に可能となる。公衆に対する前記培養物の利用の制 限は、出願に基く特許の付与に際して全て取消し得ないものとして撤回され、ま た前記培養物は、サンプル調製に対する最も最近の申請の徒歩なくとも５年の期 間、およびいずれの場合であっても寄託の日付の徒歩なくとも３０年の期間の間 は永久的に利用可能のままとされる。万一培養物が非生存となるか、または不注 意により破壊された場合は、同一の分類学的記載の生存培養物により取替えるも のとする。 株／プラスミド　ＡＴＣＣ番号　寄託日付イー・コリｐ５Ｅ　ＢＬ２１　（ＤＥ ３）　９６．３　ＡＴＣ［：　６８４０６　９／１９／９０イー−、：］　ＩＪ 　Ｘ５１２７９６．４　ＡＴＣＣ６８４０７９／１９／９０ポリペプチド抽出物 （μｇ／ｍ１１ ＦＩＧ、２ ９５Ｅペプチド濃度（μＭ） 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　１５／１２ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００ （３１）優先権主張番号　６７５，５２９（３２）優先臼　１９９１年３月２７ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） Ｉ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ 、ＵＳ （７２）発明者　ウェア　シェリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２０２４　エンシニタス　サマーヒル　ドライヴ　２１１９[-The next stop is blood. This occurs through the attachment of platelets, which facilitates the interaction between platelets and damaged vascular endothelium. In damaged vascular endothelium, the underlying collagen fibers and/or or other adhesive MacT]min-1'-1 such as promyoglycan and glucosa Minoglycan is exposed to which platelets bind. Secondary 11-Blood involves strengthening or cross-linking of soft platelet clots. this The secondary process is initiated by proteins circulating in the plasma (coagulant r), which Activated during primary hemostasis in response to trauma or vascular disease states. These factors As a result of activation, the protein fibrinogen (hereafter called fibrin) is finally produced. leading to the production of a polymeric matrix (which strengthens the soft blood clot) . The present invention relates to antiplatelet drugs. Antiplatelet drugs include platelets or other circulatory system Contains drugs that inhibit primary hemostasis by altering its interaction with components Ru. Reported research and development Specific antiplatelet drugs act by one or several mechanisms. In the first example, Reduces the availability of ionized calcium in the platelet cell chamber, and These include those that impair platelet activation and consequent aggregation. Typical drugs for this strategy include prostacyclin and versatin 3 ( diviridamol), which affects the concentration of cyclic AMP. It can affect calcium concentration more. Regarding the administration of these compounds Many side effects have been reported. A further class of platelet drugs is By inhibiting the synthesis of rhomboxane A2 and reducing the platelet activation response act. Non-steroidal anti-inflammatory drugs, e.g. ibuprofen, phenolbutaci and naproxane are specific compounds that catalyze the synthesis of thromboxane A2 precursors. A similar effect can be produced by competitive inhibition of the cyclooxygenase enzyme. As A similar therapeutic effect can be induced by administration of piline, which A. It is shown that the koki is the one that is used for the purpose. A third antiplatelet mechanism interferes with surface receptor function. It is involved in the membrane of platelets to cause damage. One drug of this kind has a large branch [ , is a polysaccharide called dextran, which interacts with platelet receptors and fibrils exposed during aggregation. It is thought to impair the interaction with brinogen. historically kidney problems Dextran is contraindicated in patients due to cardiac disorders. Therapeutic Chi Clopidine has a 7-on-viral effect on its respective receptors on the surface of platelets. blood by inhibiting the binding of Brand factor and/or fibrinogen. It has been stated that n1 impairs platelet adhesion and aggregation. However, Tiklopi It has been found that gin is insufficiently specific to obviate the need for large doses. This may in turn be associated with clinical side effects. The drugs mentioned above are foreign to the body and have many harmful clinical side effects. However, this type of compound may interfere with the patient's physiology or There is no way to prevent it from being involved in other aspects of biochemistry. About the prescribed reaction of hemostasis The aim is to provide drugs with such specificity that they can be administered to patients in smaller doses. It is desirable that such dosages be administered in a manner that may cause harmful effects on the patient. There are very few. Examples of drugs that are representative therapeutic agents derived from natural components of the hemostatic process include E. It is described in PO Publication No. 317278. This publication contains information on platelet membrane glycoproteins. A therapeutic polypeptide consisting of the amino-terminal region of the alpha chain of WIb or a subfragment thereof Disclosed are methods of inhibiting thrombosis in patients by administering them to patients. The present invention is derived from Fono Willebrand factor, which is one of the proteins in the hemostasis mechanism. The present invention relates to providing antithrombotic polypeptides. Summary of the invention According to the invention, mimicking the parent polypeptide, generally residue 441 (arginine) The mature phono Willebrand starting at and generally ending at residue 733 (valine) A polypeptide consisting of the amino acid sequence of a fragment of the factor f9 unit or its fragment. any subceph) which is normally present in the parent polypeptide or a subset thereof. L or more cysteine residues present are deleted and/or one or more other amino acids are replaced. and thus the polypeptide has a physiological pH in an aqueous medium. H, internal or silver disulfide from the current polypeptide or subset thereof Polypeptides are provided that have a reduced tendency to form bonds. The polypeptides of this invention can be expressed in both recombinant bacteria and recombinant eukaryotic host cells. be done. One or more protein residues normally present in the present polypeptide or a subset thereof2 As a result of the modification according to the invention of the parent polypeptide by deletions or substitutions in an aqueous medium At the mid-C physiological po, the parent polypeptide or a subset thereof Polypeptides with a reduced tendency to form inter-disulfide bonds are provided. This fruit The significant effect is that the polypeptides of the invention exhibit a higher degree of therapeutic activity than the parent polypeptide. , and exhibit improved stability and solubility. For convenience, the present invention Polypeptides are often referred to herein as "variants." In a preferred form, the invention provides a parent cysteine-containing vWF polypeptide or l to L cysteine residues that are not expected to significantly alter the predetermined tertiary structure of the fragment. It is recommended that this be done by @-substitution of specific amino acid residues in the group. this is Contributes to maintaining the therapeutic potential of variant polypeptides. Suitable amino acid substitutions include: Includes glycine, serine, alanine, threonine and asparagine, including serine Preferred are alanine, alanine and glycine. Another aspect of the invention is that the mature phono Willebrand factor subunit system In residues 509 and 695 are derived from Fono Willebrand factor or from binding of the derived therapeutically useful polypeptide to the platelet glycoprotein 1b receptor. The amount of silver disulfide that gives the subunit or its fragments a specific tertiary structure that participates in the This is based on the knowledge that fido bonds are normally formed. Therefore, another aspect of this invention is , generally residue 441 of the mature Phono Willebrand factor subunit (alg. amino acid sequence from residue 733 (valine) to generally residue 733 (valine) or any of the foregoing residues. contains a polypeptide consisting of a subset of ) and 695 (instein), including one or more cysteine residues 459. 46 2. 464. 471 and 474 are deleted or one or more other amino acids Therefore, it has been replaced. A preferred polypeptide contains each cysteine residue 45 9. 462. 464. 471 and 474 are replaced by glycine residues, Stein residues 509 and 695 are linked by a silver disulfide bond. It is. Another aspect of the invention provides a therapeutically effective amount of a polypeptide of the invention and a pharmaceutically A therapeutic composition comprising an acceptable carrier thereof is provided. According to a still further aspect of the invention, an effective amount of one or more therapeutic compositions of the invention is provided. A method of inhibiting thrombosis in a patient is provided comprising administering the method to the patient. this Therapeutic compositions consisting of one or more polypeptides of the invention are currently available, such as diviridamol. Substantially less toxic than available antiplatelet drugs or occur earlier in the disease It is expected that there will be fewer harmful physiological effects. A preferred method of producing the polypeptides of the invention includes the Fono Willebrand factor A DNA nucleotide sequence encoding a block unit or a fragment thereof is subjected to mutagenesis. and this results in the deletion of cysteine residues or other amino acid species. This is what @m is done. The resulting coding DNA is transformed into recombinant bacteria. The vWF polypeptide can be expressed by inserting it into diseased cells. The invention also provides eukaryotic host cells containing recombinant vWF DNA sequences. Well, we're going to talk about the 52/48 kDa tryptic fragment or domain of vWF. A therapeutically active polypeptide is expressed. Polypeptides are produced by host cells. successfully secreted. The polypeptide thus expressed was expressed from a recombinant bacterial host cell. It has certain advantageous characteristics compared to polypeptides. ■) The polypeptide of the present invention is present in mature circulating 7-on Willebrand factor. It assumes a three-dimensional structure, which is a characteristic of the existing domain, and these can be appropriately with disulfide bonds formed. 2) The polypeptide of the present invention has the glycosylation property of the domain, It is a close analog of the natural vWF52/48 functional domain. Polypeptides of this type, when present in monomeric form, are useful for use as antithrombotic agents. can be done. In the dimeric form (this dimer allows the polypeptide to have its natural structure) fifi domain), these are used as anti-hemorrhagic agents. can do. The therapeutic properties of the polypeptides of the invention are described in detail below. can be enhanced by changing its glycosylation. Critical to proper two-dimensional folding and secretion of the polypeptides of this invention are This is the first attachment of the signal peptide sequence to this, which may be the same or other host. It also has the potential to cause secretion of other polypeptides unrelated to vWF derived from principal cells. It is effective. According to the practice of this invention, prevention of platelet adhesion to surfaces, platelet activation or therapeutically useful polypeptides that are effective in inhibiting aggregation or aggregation, and inhibiting thrombosis. Served. More specifically, the effects of Fono Willebrand factor multimer on platelets This provides a glycosylated polypeptide that is effective in inhibiting binding. Mutant human von Willebrand factor subunit 1-DNA sequence in mammalian cells. produced by expression in cells. This type of polypeptide is a homologous non-mutant The amount of silver disulfide that tends to adversely affect its therapeutic utility than that of the polypeptide less tendency to form ion-do bonds. Thus, mimicking the parent polypeptide and generally starting at residue 441 (arginine) The mature 7-on Willebrand factor subunit generally ends at residue 733 (valine). a polypeptide consisting of the amino acid sequence of that fragment of the one or more cysteine residues 459. 462 and 464 deleted and/or substituted by one or more other amino acids, said polypeptide tide has less tendency to form silver disulfide bonds than the parent polypeptide. A new polypeptide is provided. This aspect of the invention provides that the parent cysteine-containing vWF polypeptide or fragment thereof A specific amino acid of one or more specific cysteine residues that does not significantly alter a given tertiary structure. substituting amino acid residues and thereby preserving the therapeutic potential of the variant polypeptide. This is considered to be the most commonly implemented method. Glycine is a suitable amino acid , serine, alanine, threonine or asparagine; and glycine are most preferred. The present invention also provides fono Willebrand factor useful for inhibiting thrombosis in patients. Recombinant DNA of subunit monomers and appropriately glycosylated fragments It also relates to the preparation by suitable methods. Recombinant methods can be used to obtain the desired monomeric form of the fragment. structures that tend to adversely affect the therapeutic activity of, e.g. dimers of said fragments, The production of multimers or aggregates is minimized. Therefore, the main Amino acids from group 441 (arginine) to generally residue 730 (asparagine) For that fragment of the mature von Willebrand factor subunit, which consists of a Approximately 52 kDa was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis from the corresponding DNA. producing biologically active monomers of said subunit fragments having an apparent molecular weight of A method of creating (A) A signal upstream of the fragment coding region in its appropriate reading frame. (B) constructing a DNA sequence encoding a subunit fragment containing a peptide sequence; Mutagenizing the DNA sequence to remove cysdin residues, which are normally involved in inter-disulfide contacts. reducing the number of cysteine codons that can specify groups; (C) inserting DNA into an appropriate vector; Generate H4 adults consisting of expression plasmids or viral expression vectors by inserting sequences. The construct is capable of expressing the monomeric subunit fragments in eukaryotic cells and ), (■)) the construct can direct eukaryotic host cells. (E) expression of the body III subunit fragment in the host cell; The transformed host cells are cultured under conditions F that cause secretion from (Also allows glycosylation of fragments) A method is provided that includes an L culm. The invention also provides treatment for bleeding disorders such as Fono Willebrand disease (vWD). It also relates to the preparation of polypeptides useful for. In particular, the present invention Regarding the preparation of specific fragments of the DNA factor by recombinant DNAff'f methods, The GPIb(α) receptor on the platelet membrane and similar receptors on other platelet cells-L crosslinks between or between this type of receptor and components of the subendothelial layer, including collagen effect and thereby restore the original multimeric phonoform in affected individuals. - Willebrand factor plays a very important physiological role. Therefore, mainly from residue 44I (arginine) to generally residue 730 (asparagine) The mature 7-on Willebrand factor block unit consists of the amino acid sequence of mer fragment or residue position 459 of IJEJI. Its support including 462 and 464 biological activity of said monomeric fragment or subfragment from DNA corresponding to said monomeric fragment or subfragment. A method for producing a dimer, the method comprising: (A) A signal upstream of the fragment coding region in its appropriate reading frame. Constructing a DNA sequence encoding a monomeric fragment or subfragment further comprising a peptide sequence accomplished, (B) Expression plasmid or viral expression by inserting the DNA sequence into an appropriate vector. to produce a construct consisting of a vector, said construct comprising said monomeric fragment or sub-fragment; (C) said construct capable of directing expression in and secretion from eukaryotic cells of (D) transforming a eukaryotic host cell with a dimeric form of the monomeric fragment or subfragment; said transformation under conditions that result in expression in the host cell and secretion from the Cultivate host cells under which monomeric fragments or subfragments undergo dimerization and their A suitable tertiary structure for dimerization is assumed, under which the monomeric love unit fragments or or sub-fragments or their dimeric forms) A method is provided comprising steps. Another aspect of the invention is that the cloned 116kDavWF fragment and platelets Noristocetin-induced interaction reduces the amount of glycosylation on the 116 kDa fragment This is based on the knowledge that it can be enhanced by This finding suggests that blood Design of additional polypeptides effective in the treatment of embolism or Fono Willebrand disease It is useful for Thus, generally starting at residue 449 (valine) and generally starting at residue 728 The fragment of the mature phono Willebrand factor subunit that terminates in (lysine) A variant polypeptide that mimics a parent polypeptide consisting of the amino acid sequence of a fragment or the parent 1 which is the dimer and is now the site of O- or N-linked glycosylation. one or more serine, threonine, or asparagine residues are deleted, or one or more is substituted with other amino acids such that the variant polypeptide is When expressed from recombinant DNA, SDS polyacrylamide gel electrophoresis The parent polypeptide has an apparent molecular weight of 52 kDa as determined by Said polypeptides having less glycosylation than species are provided. This invention and its mutagenesis and protein expression procedures have been extensively practiced and modified in the art. Mutant mature Phono Willbra with improved solubility, stability and therapeutic activity It is believed that it is possible to generate subunit fragments of the subunit factor. Certain glycosylation cleavages of mature Fono Willebrand factor have therapeutic utility. Although the invention is first described with respect to expression and secretion from mammalian cells, this We understand that this may also apply to the expression of other therapeutic polypeptides in mammalian cells. in which case the secretion of said polypeptide from said cells is likewise therapeutic. Encoded by the polypeptide DNA, human 7on Willebrand factor sig nullpeptide or a subset thereof, and Fono Willebrand factor brope This is facilitated by the historical sequence of amino acids that constitute the mono-gamma-terminal region of the peptide. Thus, it is possible to direct the transport of additional polypeptide sequences across the membrane of the endoplasmic reticulum of the cell. A polypeptide comprising the following domain (A) and domain (B) (A): Signal peptide of human von Willebrand factor subunit (this signal peptide is transmitted by the endoplasmic reticulum and/or or recognized by the endoplasmic reticulum and/or translocation receptors in complex with signal peptides. ), and Domain (B): Mainly the amino terminal of the von Willebrand factor propeptide It consists of a peptide sequence consisting of the first 10 residues at the end and ) is linked to the carboxy terminus of domain (A) by an amide bond, and can be linked to the amino terminus of an additional polypeptide sequence by an amide bond. In this case, a polypeptide consisting of domain (A) and domain (B) has an additional polypeptide. Attaches to the amino-terminal end of the lipeptidic sequence and attracts from domains (A) and (B). A subset of the derived sequences remains and the therapeutic activity of the additional polypeptide sequence is fully expressed. sufficient human 7 on virus to promote cleavage in a manner in which part or part is retained. A polypeptide containing a subset of the brand factor signal peptide and propeptide sequences. Ripeptides are also provided. More generally speaking, we can create therapeutic polypeptides from DNA! ! Is there a way to build Tee, (Δ) its proper reading frame second to that of its polypeptide coding region itself a DNA sequence corresponding to the signal peptide and directly downstream of it a semipolar or comprises a DNA sequence encoding a therapeutic polypeptide containing a polar spacer sequence. death, (L3) Insert the resulting DNA sequence into an appropriate vector to create an expression plasmid or A construct consisting of a viral expression vector is generated which contains the therapeutic polypeptide. (C) said construct capable of directing expression in and secretion from a nuclear host cell; (D) transfecting a eukaryotic host cell with a therapeutic polypeptide in said host cell; The transformed disease 1 cells were transformed under the +′1 streak that caused the expression and subsequent secretion of Also provided are methods that include culturing. Brief description of the drawing Figure 1 shows the mature Phono Willebrand factor sub-base between residues 431 and 750. Figure 2 is a table showing the previously reported amino acid and DNA sequences of the unit (human). Figure 2 shows the effect of the cysteine-free mutant polypeptide of the present invention on platelets. FIG. FIG. 3 shows anti-GP1b monochromatography against platelets by the mutant polypeptide of the present invention. Figure 2 is a graph showing inhibition of binding of null antibodies. Figure 4 is a map of the pCDM8 plasmid. Unless otherwise indicated herein, the following terms have the meanings indicated. Coding sequence (coding DNA) - the amino acids of a protein in the proper reading frame DNA sequence encoding. For purposes of the present invention, the synthesis or use of coding sequences includes “Coding” the tripeptide NHx arg gly g Iy COa H 5'-CGG-GGA-GGA-3'/3'-GCC-CCT-CCT-5 '　1. : entails the synthesis or use of the corresponding complementary strand, as indicated by It can be accompanied. Descriptions or claims for one chain may be described or claimed in accordance with industry practice. refer to other strands and their single-stranded counterparts as necessary, useful, or necessary; It shall be stated within the scope of the request. cDNA - A DNA molecule synthesized enzymatically from a sequence present in an mRNA template or is an array. The transcribed strand~RNΔ polymerase converts its nucleotide sequence into 3'-5' is read and mRNA is generated. This chain is also referred to as a non-code chain. -y double F chain or untranslated strand - this strand is the antiparallel complement of the transcribed strand and is from the transcribed strand, except that the uracine base is present (instead of the uracine base in the mRNA). It has the same base sequence as the generated mRNA. This is referred to as [Code J] , similar to mRNA, and when examined from 5' to 3', direct codons for translation. This is because it can be identified. Biological activity - in a biological sense (i.e. in an organism or in vivo) C) One or more functions, effects, or activities performed or produced by a molecule. mature fu Characteristics of the 116 kDa homodimeric fragment of the Ono Willebrand factor subunit biological activity is due to binding to platelet GPIb receptors, thereby Potential that allows the molecule to promote platelet aggregation in the presence of ristocetin It is an ability. Other consequential or related effects of the 116 kDa species include thrombotic agents. inducing platelet activation and/or adhesion to surfaces. be caught. Similarly, the mature phono Willebrand factor subunit, 52/48 kDa, - The characteristic biological activity of 1it-cleaved Ji is that it binds to only 1 platelet GPIb receptor. This allows the molecule to induce potrocetin-induced binding of multimeric vWF to platelets. It is a potential ability that can be used to inhibit. 52/48 not dimerized Consequential or related effects of kDa species include platelet activation, aggregation or expression. Includes inhibition of adhesion to surfaces and inhibition of thrombosis. Reducing conditions - Fono Willebrand factor or polypeptides derived therefrom This refers to the presence of a reducing agent in a solution containing Disruption of the disulfide bond of vWF occurs. However, consistent with typical use in the industry. Throughout, reducing agents such as dithiothreitol (<DTT) vWF disulfide is formed by forming a disulfide bond between DTT and DTT. Causes bond breaking, with no net change in the oxidation state of the sulfur atoms involved . I) N A or other DNA sequence, typically one or a small number of endonucleotides. It is characterized by a clease recognition site, where this type of DNA sequence is recognized as It can be cut in a manner that can be determined for insertion and is essential for biological functions of DNA. function, e.g. regeneration, concomitant loss of production of coat protein or suppression of expression of the g1 region, e.g. e.g., without loss of promoter or binding site, and which allows for transformation. Suitable selected 1rJ-based genetic markers for use in identifying host cells, e.g. For example, 'P4'J includes tetracycline resistance or ambinlin resistance. Plasmid - An intact "replicon J" so that the plasmid can replicate in the host cell. A non-chromosomal double-stranded DNA sequence consisting of Plasmid in prokaryotic or eukaryotic host cell When placed, the characteristics of that cell change (and change) as a result of the plasmid DNA. can be transformed). For example, it carries the gene for tetracycline resistance (TetR). The plasmid that carries this virus can be used to kill cells that were previously sensitive to tetracyclane. Transform into one resistant to. Cells transformed by a plasmid are called “transformed” called "transformants". The expression plasmid von Willebrand factor structural gene can be cloned. A plasmid into which the desired DNA has already been inserted. The DNA sequence inserted into this is It may also include sequences that control the translation of the resulting mRNA, and also promote association and and restriction endonuclease sites that may facilitate further modification of the expression plasmid. can include. Expression plasmids contain polypeptides encoded in host cells. The DNA sequence of the encoded structural gene can direct the expression within it. It usually includes the transfer bromine upstream of the column. Expression plasmid into host chromosomal DNA Sometimes it ends up being incorporated, sometimes it doesn't. Regardless of this, this For purposes of clarity, the integrated plasmid will be referred to as an expression plasmid. Viral Expression Vectors Viral expression vectors are produced through natural biological processes. Expression plasmids, except for the ability to back DNA into virus particles that can infect cells. Similar. downstream - nucleotides that are normally processed by RNA polymerase after the previous part of the gene When read, the nucleotides of the transcribed strand of a structural gene are It is said to be downstream of the minute. Complementary nucleotides of non-transcribed species, or double-stranded forms of DNA The corresponding base pair within the structure is also called downstream. Furthermore, it refers to the direction of transcription and translation within a structural gene, and refers to the direction of transcription and translation within a structural gene. The restriction endonuclease sequence added to 5') encodes the amino terminus of the protein. This means that it is added before the coding sequence, while it is added downstream of the structural gene. or 3′), this modification extends beyond its carboquine terminal coding region. It means that. Von Willebrand factor (v W F) - Von Willebrand factor It is understood that all references herein refer to vWF in humans. It will be done. The term F phono Willebrand factor 1 does not include any of the terms directly defined below. it is intended to include within its scope any and all of the above. Furthermore, Fono-Willebrand factor is active as a component of the subendothelial matrix. as a component of alpha granules secreted by sexualized platelets and circulating blood It is recognized as a plasma protein. Three-dimensional subunit structure or multiple subunits of vWF Unit structure can potentially occur in three different senses, e.g. It is possible to vary depending on the differences in the This kind of difference has useful therapeutic potential. In the practice of this invention, the vWF-inducing polypeptide is used to induce vWF in endothelial cells or megakaryocytes. This does not preclude production from the WFFDNA sequence. Additionally, the actual D operated or utilized in the practice of this invention, as reported herein. between NA and the polypeptide and the structural sequence of amino acids or their nucleotides. It is possible that there are some biologically insignificant differences. The present invention It is understood that this species extends to some biologically unimportant species. Pre-pro vWF - Von Willebrand factors undergo extensive post-translational processing. [Break ovWFJ has a signal chain consisting of approximately 22 amino acid residues (from N to C terminus). peptide, a propeptide of about 741 amino acids, followed by a propeptide of about 2. 050 residues Contains circulating vWF. ProvWF-signal peptide has been removed from preprovWF. Oro WL - found in plasma or circulating as bound to the subendothelium. Cyclic vWF0, which is a polypeptide that typically associates into multimers of its many species. It consists of a group of 'flit bodies, each of which has 2. 05n residue It is the length. Historically, when expressed in complemented mammalian cells, mature vWF is usually glycated. It is cozylated. Signal peptide (sequence) - signal peptide is a newly translated polypeptide A sequence of mono-gamma amino acids in A signal is provided for the translocation of the polypeptide leading to. signal peptide is typical It is present at the beginning of the protein (-γmino terminus) and is 20 to 40 amino acids long. , with a chain of about 5 to 15 hydrophobic amino acids in its center. Typically, Signa During the process of translocation into the endoplasmic reticulum, the peptide is transferred from protein to protein at C1 or immediately after. It is cleaved by chromolysis. Gene or cDNA encoding signal conjugate That part of is also referred to as the signal sequence. Table 1 lists the standard three letter names for amino acids as used in this application. It shows. Aspartic acid Asp Glutamic acid Glu Phenylalanine Phe Glycine Gly Histidine [11s isoleucine lie Methionine Met Asparagine Asn Proline Pr. Glutamine Gln Tyrosine Tyr Detailed description of the invention As mentioned above, both the antithrombotic and antihemorrhagic polypeptides of the invention are naturally occurring A fragment of the protein phono Willebrand factor (rvWF, I) present in It is based on For background purposes, information about this protein and its role in hemostasis and Its role in thrombus is described below. Description of the role of vWF in hemostasis and thrombus essential in the blood (acute thrombotic occlusion of blood vessels in diseased states) of central importance. Both of these roles are induced into the affected area. It involves a synergistic action between platelets and vWF that cross-link after binding. a single platelet It is thought that the blood clot first attaches to the surface of the blood clot and then becomes activated. It is a process that involves significant metabolic and significant morphological changes within the plate. . Activation involves attachment substances such as 7on Willebrand factor (attachment proteins). release of platelet storage granules and further functional attachment sites on the surface of platelets. Manifested by expression. Once activated, it also functions as part of normal hemostasis. , platelet cells will aggregate, but platelet cells with further types of adhesion proteins It is a process that involves extensive cross-linking. As declared above, these processes occur as a physiological response to vascular injury. It's normal. However, these undesirable platelet blood loss with consequent vascular occlusion, which can lead to pathological situations. Form a stopper. Other situations in which it is desirable to prevent platelet deposition in blood vessels include stroke prevention and and the prevention of occlusion of arterial grafts. Platelet thrombosis during surgical procedures Formation may also interfere with attempts to alleviate pre-existing vascular damage. Platelet adhesion to damaged or diseased blood vessels is due to interactions with specific A:1 molecules. This occurs through a mechanism involving specific platelet membrane receptors. One of this type of platelet receptor One is the glycoprotein jilb-IX complex, which consists of two integral membrane proteins, the glycoprotein from a non-covalent association of protein Ib (GPIb) and glycoprotein IX (Gl)IX) Become. The adhesive ligand of GP Ib,..., IX732 is protein 7. On Willebrand factor, which as a component of the subendothelial matrix Components of alpha granules secreted by activated platelets and in circulating blood It is also recognized as a plasma protein. (For F’l b-IX receptors The actual binding site of vWF is the α of glycoprotein 1b designated by GPIb(α). It is localized in the gamma-terminal region of the chain. Interaction between multimeric vWF and glycoprotein 1b-IX complex (GPIb(α)) This results in platelet activation, resulting in the production of additional platelets against the currently growing clot. It is thought that the replenishment of Platelet glycoprotein 11b-111a receptor site by the binding of fibrinogen at and also probably at these sites. by vWF and/or at additional glycoprotein 1blX receptor sites, Rapidly accumulating platelets are also cross-linked (i!# collection). Furthermore, glycoprotein 11b/ 111a receptors may also be involved in the formation of the initial monolayer of platelets. In this process Of particular importance is the multimeric and multivalent nature of circulating vWF, which This allows the chromomolecule to perform its bonding and crosslinking effects effectively. Inactivation of GPIbα or GPIIb/l1la receptors on patient platelets or is the inactivation of binding sites for vWF localized in the subendothelial layer of the patient's vasculature. Inhibition of the cross-linking ability of vWF by It may be of medical importance. Therefore, the present invention is useful for achieving the above points. Regarding the development of effective polypeptides. Although prevention of unwanted blood clots is very important, it is desirable to promote blood clot formation. There is a situation. Fono-Wilebrand disease, the most common bleeding disorder, , a term used to describe disparate disease states, which If Rand factor is produced in inadequate amounts or if circulating vWF molecules are somewhat deficient This is the result when there is. Various subtypes of this disease have been described. VW Providing a cross-linking effect of F can be used to treat patients suffering from Fono-Wilebrand disease. It is clear that this is of central importance. The present invention also provides platelet membrane GPlb(α) receptor or GPIrb/rlIa receptor and other platelets. It acts as a cross-linker between receptors or between such receptors and components of the subendothelial layer. This reduces the amount of original multimeric 7-on Willebrand factor in affected patients. For the preparation of fragments of Fono Willebrand factor that can perform very important physiological roles. Also related. Information on the structure of vWF and the development of therapeutic agents derived from it 1. Platelet glycoproteins white matter [fono-Wilebrand factor that binds to b-IX receptor (GPIb(α))] Child subunit domains were identified within fragments of vWF. This fragment is After psine digestion, it can be produced by disulfide reduction and circulated The Gab unit generally ranges from residue 449 (valine) to residue 728 (I It extends to J lysine. Current evidence suggests that this fragment (that residue 509 and 695) components of the subendothelial layer such as collagen and proteoglycans The mature vWF subunit Other regions of the body are also more important for the recognition of these substances (further proteoglycans or Alternatively, the heparin-binding site is localized to residues 1-272 of the mature subunit, and additional co-binding sites The ragen binding site is within its residues 910-1110). Figure 1 (SEQ ID NO: 1) shows the mature phonovirus between residues 431 and 750. Amino acids and D previously reported for Lebrand factor subunit (human) The NA sequence is shown. The 52/48 kDa fragment produced by tryptic digestion consists of residues 449 (valine) and generally extends to residue 728 (IJ lysine) do. Amino acids are indicated by the standard three letter designation. The DNA sequence is code ta (non-transcribed) ). Very few polymorphisms have been reported for the 52/48 human sequence. one significant exception is histidine/aspartic acid at position 709. , Mancuso, D., 1. ) et al, J, Bio l, Chem, 264(3:3):19514-49527, Table V (1989> can be referred to. The DNA fragment used in the experiments described in the Examples section below was -r aspartate codon GAC), but in the practice of this invention residue position 70 Substitution of histidine at 9 (other known naturally occurring at this position in the human sequence) The r-amino acid codon C (〇) is also useful. Regarding the therapeutic antithrombotic polypeptides of the present invention, the following information regarding vWF is of particular interest. It's tasteful. Approximately 116. Platelet glycoprotein glb(ff) with a molecular weight of 000 (116 kDa) Fragments of mature Phono Willebrand factor with binding activity were isolated using trypsin. Digestion of vWF releases tP-. Using a reducing agent that can cleave disulfide bonds When treated with the 116 kDa fragment, a pair of identical neoislets are generated. Same Each of the fragments (taken together to form a 116 kDa polypeptide) contains approximately 5 It has an apparent molecular weight of 2°000 (52 kDa). (polypeptide molecule Quantity is typically measured by migration relative to a standard in a denaturing gel electrophoresis system . The resulting weight values are only approximate. ) Typically, 52. 000 molecular weight fragment, the human enzyme system contributes to its molecular weight. We refer to it as the r52/4Fl+ fragment to reflect the fact that the fragment is glycosylated. Ru. The amount of glycosylation varies from molecule to molecule, but two weights, 52. 000 and and48. 000 is the most common. The 52/48 fragment has residue 449 of the mature subunit as its amino terminus. phosphorus) and with its residue 728 (lysine) as its carboxy terminus. is shown. Without additional weight due to glycosylation, the peptide weighs approximately 3 8. It has a molecular weight of 000. The 52/48 fragment competitively binds Fono Willebrand factor to platelets. was shown to inhibit However, the 52/48 fragment or its glycodi Manipulation of the unmodified 38 kDa equivalent proved difficult. this fragment Successful manipulation of the cysteine residue typically involves reducing and permanently alkylating the cysteine residue. It was necessary that the system be standardized. In the absence of this treatment, the desired cysteine residue Undesirable reactions are bound to occur and the product is insoluble and unsuitable for effective use as a therapeutic agent. leading to the formation of physically inactive polypeptide aggregates. Mature 7-on Willebrand factor subunit containing platelet glycoprotein 1b (α) The residues 449-728 fragment of position 459. 462. 464. 471. 474. It is known to have cysteine residues at 509 and 695. Also, mature All cysteine residues in the vWF subunit are involved in disulfide bonds. Also known as (Legaz et al., J. Biol. Chem., 248 :3946-3955 (1973)). Marti, T. ) et al., Biochemistry, 26:8099-8109 (1987) In , mature subunit residues 471 and 474 are involved in an intradomain disulfide bond. It was conclusively identified that Residues 509 and 695 are disulfide bonds identified as being involved, but this pairing is territorial or silvery (i.e. However, it was not indicated whether the mature vWF subunits (within the same mature vWF subunit) were present. Mohri, It, et al. 1. J, Biol, Chem, 2 63 (34):17901-. 17904 (198g), 449-72 Formalin-fixed platelets using the 8-subunit Pav1 Dodubu fragment Ristocetin-induced binding of 1251-labeled multimeric VWF was inhibited. length 15 residues Peptide subfragments of were synthesized and tested. Two separate areas L cu4@9 -A 5p4118 and Glu6"~Val"' subunits included or duplicated Those peptides exhibiting a knit sequence are active (!: recognized. Mori's conclusion is that the GPIb(α)-binding domain of vWF is a disulfide bond. Two discontinuous sequences Cys4 maintained in the proper conformation in the original vWF by Included in 74~p rO4!18 and eu694~P, 07Q@ residues, but the authors form stabilizing bonds. It was not possible to identify cysteine residues and which bonds were internal or intermediate. The present invention relates to residues 449-728 of mature Phono Willebrand factor subunit 7). It provides polypeptides derived from the Useful in the treatment of vascular disorders. Molecules of this type primarily contain residues 441 (arginine) to 7. :Mature phono Willebrand factor consisting of amino acid sequence up to 33<valine) encoding that fragment of a subunit or subunit of any of said amino acid sequences; encoding a subset or a variant polypeptide fragment thereof, or a subset thereof; It also contains fewer cysteine residues than a comparable wild-type amino acid sequence. It can be produced most efficiently from DNA. A suitable method for preparing the molecule is Expression of a variant phono Willebrand factor or a subset thereof by a host organism Under condition F, encoding a part of the 7-on Willebrand factor subunit. transformed with a biologically functional expression plasmid containing the mutant DNA sequence. The method consists of culturing the host organism and collecting the fragments therefrom. The cysteine codon of vWP encodes an amino acid that cannot form a disulfide bond. A preferred means of mutagenesis of codons is the one described by Kunkel-T.N. l, T, A, ), r”roc, Natl, Acad, Sci, U, S, A 82:488-492 (+985) based on site-directed mutagenesis procedures. Ru. This type of mutant DNA sequence is then used in recombinant bacteria or eukaryotic host cells. Undesired disulfides (results from the conversion procedure) that may be expressed from the system less tendency to aggregation and denaturation caused by binding than previous preparations The present invention provides a composition of WFK-inducing polypeptide. In this case, the polype Mutagenesis is used to limit the number of cysteine residues present within the peptide. Mutations in vWF DNA encoding mature subunit residues 449-728 region Koto can be used to change cysteine codons to those of other amino acids A variety of molecular biology techniques are available. Appropriate techniques include polymerase chain reaction. reactions, gapped duplex mutagenesis, and mutualization at a single nucleotide position. Differential hybridization of oligonucleotides to different DNA molecules included. For a review of suitable codon change techniques, see Krai k, C), “Use of oligonucleotides for site-directed mutagenesis J, Bio Techniques, Jan/Feb 1985, page 12. can. In implementing this aspect, Kunkel T. N., Proc., Nat. Site-oriented Acad, Sci, USA, 82:488-492 (1985) Preferably, sexual or site-directed mutagenesis is used. In this step, Utilizes a series of steps in which a DNA template containing a DNA template is first generated and then selected against. use In Example 1 of the present invention, the mutagenesis used to generate mutant vWF cDNAs A detailed explanation of the details will be provided. Other publications disclosing site-directed mutagenesis include Gies e, N. 8,) et al., 5science, 236. 1315 (1987), U.S. Patent ff1 4,518. No. 584 and U.S. Pat. There is No. 959,314. In practicing this embodiment, one or more cysteine codons of the wild-type DNA sequence codons The following amino acids of 1 or more L: alanine, threonine, serine, glycine and as It is also suitable to make substitutions by Xlagin. Alanine and glycine codons The most preferred substitution is C. The choice of substitution for any particular codon is , generally depends on the selection of appropriate substitutions at all other positions. The above describes the types of codon substitutions that can be made using cysteine residue 459 as an example. A typical example is: (A) The cysteine 459 codon can be replaced by a glycine codon, or (B) The codons for cysteine 459 are one for serine and one for glycine. It can be substituted by two codons, and this type of substitution results in a new amino acid. Sequence knee His"@-5er" (a)-Gly"' (b)-Gin"'- given or (C) The cysteine 459 codon can be deleted from the cDNA and this species As a result of the deletion of - obtained amino acid sequence, or (I)) One or more codons of residues adjacent to cysteine residue 459 are -Glu ”-(month 0460-) may be deleted along with codon 459. of amino acids other than alanine, threonine, serine, glycine or asparagine Codons also depend on the specific primary, secondary, tertiary and quaternary environment of the target cisdine residue It is believed that the present invention may be useful in implementing the present invention. In practicing this embodiment, the tryptic vWF subunit fragment from 449 to 728 The cysteine position is localized as a substitute for all specific cysteine residues in the wild The optimal tertiary structure (e.g. α-helix or β-sheet) of type amino acid sequence subfragments It is desirable to provide amino acids that can be accommodated in the -C cisten position with small perturbations. It is considered that In the practice of this invention, alanine, threonine, serine, glycerin. Syn and asparagine, like cysteine, are neutrally charged and have a small size. They are generally satisfactory because they have small or relatively small side chains. Which structural domain type of protein (α-helix, β-sheet or random coil) Regarding predicting which method is best to recognize a particular species of amino acid within the A substantive study was conducted. Serine most closely matches the size and polarity of cysteine. Because it approximates to , are amino acids suitable for use in the practice of this invention. For example, [hou, P, Y, et al., Biochemist ry, 13(2):211-222 (1974) and Chu P Wai et al. “Prediction of protein conformation J, Biochemistry, 13 (2), 222 -244 (1974) for further information useful in selecting substitute amino acids. Information will be given. Chu Bi-wai et al. It is likely to be found in the center of the α-helical region, and which residues are in the helical region. halts the evolution of the helical band, which can lead to boundary residues or helix breakers. The secondary structure of a particular polypeptide sequence fragment is determined based on rules that determine whether I predicted it. According to Chu Bee Wai et al., supra, p. 223, cysteine and tortoise The group of leonine, serine and asparagine is the destroyer or formation of this type of region Unlike the body, it is recognized that it is unrelated to the α-helical structure. Therefore, Threonine, serine and asparagine are potential targets for cysteine localization. It is highly likely that the α-helical region of the molecule will be left undisturbed. Similarly, glycine , alanine and serine were found to be largely unrelated to the formation of the β region. . Serine, threonine and asparagine residues are new possibilities for glycosylation. latency at certain positions in secreted proteins that present sites and undergo glycosylation. It should be noted that this is a currently inappropriate substituted residue. In general, the main considerations relevant to selecting appropriate amino acid substitutions are: , whether the contemplated substitution could have a deleterious effect on the tertiary structure of the fragment. Ru. Therefore, the new residues may cause undesired changes in the tertiary structure of the 449-728 fragment. Unless introduced, other amino acids are acceptable substitutes for a particular cysteine residue. may be appropriate. Reactivity with the NMC-4 antibody indicates whether the variant polypeptide has the desired therapeutic potential. It is recommended as a test to determine whether it has therapeutic properties. Particularly preferred variant polypeptides of the invention provide a bridging effect between two platelets. Unlike its dimer, residues 449-728 of the mature subunit fragment domain It mimics the monomeric form of Typically, the amount of silver normally involved in disulfide bonds is These codons in the vWF DNA fragment for specific cysteines can be substituted. Should. We show that silver-white bonds provide important structural features to subunit fragments. button, and if the conditions for properly forming a bond can be recognized. The cysteine codon that forms the internal disulfide bond remains unmutated. Should be. More specifically, the amino terminus of residue 441 (arginine) and residue 733 (barrier) That of the mature phono Willebrand subunit with a carboxy terminus of corresponds to a fragment of , in which each cysteine residue is replaced by a glycine residue. Disclosed is the preparation of variant polypeptide fragments that differ in that they have been modified. Also, this aspect is 449~? Polypeptide corresponding to 28vWF subunit region Retention of certain disulfide bonds within the bond may result in therapeutic properties derived from this. It also teaches that this is particularly important for child design. This point is described in Example 4. A mutant expressed by the p5E plasmid and containing a silver-white disulfide bond as shown in FIG. A vWF fragment is provided. Important factors involved in the design of preferred variant polypeptides of this invention are described below. I will post it. Potential binding sites for collagen and heparin-like glycosaminoglycans are , 449-728 of the loop region between cysteine residues 509 and 695) I It exists in the J Bunun fragment. By binding at these sites, e.g. In situations where the usefulness of the molecule as an antithrombotic therapy is compromised by providing additional binding to In order to redesign the polypeptide (e.g. by chemical synthesis or proteolysis) The loop region can be deleted. Phono Willebrand factor polypeptide derived from a bacterial expression system is as in the Di body or Weibel-Palade body. Substantially frees glycosylated vWF, which is normally obtained as a result of post-translational processing. Deleted in The present invention has within its scope produced by nuclear host cells and enzymatically or chemically glycosylated into mammals Includes molecules that more closely resemble molecules expressed by cells. Also, I) the NA coding sequence can be used to effect expression in a mammalian host cell and to can be transferred into an expression plasmid or viral expression vector capable of imparting lycodylation. Wear. Both platelets and Fono Willebrand factor molecules are It was determined that it contains a large number of negative charges, such as the one given. This kind of charge can promote the desired mutual repulsion of molecules under non-damaging conditions. 52/48 Amino and/or carboxy terminus of tryptic fragments or their recombinant pickles of one or more positively charged residues of lysine and/or arginine extending from Addition of the GPIb-IX receptor facilitates the use of the fragment as an antithrombotic therapeutic agent. electrical repulsion can be overcome. Furthermore, 449-728vWF Polypeptides that mimic subunit fragments can be developed by site-directed mutagenesis. After removing certain cysteine residues, e.g. S-carboxymethylation Inactivate all remaining cysteine residues by chemical inactivation. is within the scope of this invention. Variant polypeptides that are insoluble can be prepared using water-soluble polypeptides such as polyacrylamide. Solubility is achieved by covalently linking subdomains of the polymer to it. can do. using other techniques to obtain otherwise insoluble polypeptides It can also give solubility to. In view of the foregoing points which are generally applicable to all polypeptides of this invention. The following is a description of the means by which the variant polypeptide of the first aspect of the invention can be prepared. to be done. To accomplish this, the phono Willebrand factor gene (prepropeptide A cDNA clone encoding the following was used. Then flank the indicated area The cDNA is exposed to polymerase using oligonucleotides that flank the cDNA. It was subjected to enzymatic amplification in a chain reaction. The first oligonucleotide representing the coding strand DNA Reotide has an EcoR1 site 5' to the codon for residue 441 (arginine). and extended to the codon for residue 446 (glycine). to non-coding strand DNA The corresponding second oligonucleotide encodes amino acids 725-733 and A 3' Hindlll restriction sequence was encoded for don733. (mature subyu The resulting binary sequence corresponding to the amino acid sequence from residue 441 to residue 733 of The full-stranded Phono Willebrand factor cDNA was then incubated with ECoRI and Hind. using the III restriction enzyme and having compatible EcoRT and Hindll sequences. Double-stranded replicative form of batatteriophage M13mp18 containing multiple cloning sites inserted into the state. Kunkel-T.N., Proc, Nat 1. Acad, Sci, USA, 8 2:488-492 (1985) by individual glycine codons. All of the cysteine codons (residue position, 1i1459. 462. 464. 471. 474. 509 and 695) (see Example 1), or e.g. five cysteine codons, residue position 459. 462. 464. 471 and 474 (see Example 4). Site-directed mutagenesis was performed using oligonucleotides. Derived from this step The mutant double-stranded vWF cDNA fragment obtained was subjected to EcoRI and HindllI restriction. removed from the MI3mp18 phage by treatment with a restriction endonuclease. After that, the ends of the vWF cDNA fragment were modified using Ba mHI') linker. . Two types of mutant vWF cDNA containing 5 or 7 Cys to Gly mutations The pET-3A expression vector (Rosenb et al. erg. ^, H1) et al., Gene, 56:125-136 (1987)) separately. and cloned into E. coli strain BL21 (DE3) (Novage 7 (Nova gen) Inc., Madziran, Wis.). 7 systems cDNA of vWF”J unit fragment with mutation from gin to glycine The pET-3A carrier containing If the fragment encodes 5 of the specific cysteine to glycine mutations, rp sEr&. -C produced by a bacterial culture containing the expression plasmid p5E. Variant 7on Willebrand factor polypeptide, p7I-, plasmid compared to that expressed from cultures containing . p S E min-r- is cysteine residue 50! 'R:695. ’: Jisuru between can form fido bonds, while p7E molecules cannot. The mutant polypeptide is not secreted by the bacterial host cell, but rather a slightly soluble Although accumulated in aggregates (“inclusion bodies J”), Example 1 (p7E) and Example 4 The polypeptide was successfully solubilized from this following the procedure of (p5E). p7E and the polypeptide expressed from the p5E plasmid into SI) S polyacid. Rylamide gel electrophoresis and immunoplotting (according to Examples 2 and 5) It was characterized as follows. Under reducing conditions, both plasmids were transferred to SDS polyacrylamide. Approximately 38.3% as determined by gel electrophoresis. Polypep with an apparent molecular weight of 000 Non-glycosylated molecules of the expected amino acid sequence that express the tide species It was as expected from the quantity. Immunological methods were used to study the behavior of p5E and p7E extracts (Example 5 reference). vWF-specific murine monoclonal antibodies RG-46 and NMC-4 Used as a probe. R(, -46 is the mature phono Willebrand factor A linear sequence of amino acids consisting of residues 694-708 within a block unit is used to identify its epitope. It has been shown that it is recognized as a type. The binding of this antibody to its determinant is It is mainly conformational independence. Morley et al., J. Biol, Chem. 263 (34): 17901-17904 (1988). However, NMC-4 is a phono Willebrand factor containing glycoprotein 1b binding activity. It has a domain of a child subunit as its epitope. epitope matupi Upon binding, this leads to disulfide-dependent association (II) and mature vWF subunits. nit residues 474-488 and likewise generally consisting of residues 694-708)2 (Mori-Etsch et al., supra) , the disulfide bonds that give this tertiary conformation in the original vWF molecule are within the domain It could not be determined whether it was interchain or interchain. Same page 17903. Therefore, (of protein) 7. 5 μg of sample was added to 10% SDS polyacrylamide. This allows the specific concentration (under reducing and non-reducing conditions) to be The antigenic behavior of the cells can be compared with the results obtained by Coomassie blue staining. And so. Standard procedure, Burnette, A, Ana+, Bi ochern. 112:195-203 (1981). p5E and p7E extracts were then compared. Under non-reducing conditions, the heavy chain p5E polypeptide (representing the sequence from residue 441 to residue 733) The peptide fragment was compared with a comparable cysteine-free species isolated from p7E. It was determined to show an approximately 120-fold increase in binding affinity for NMC~4 in comparison. It was done. After electrophoresis under non-reducing conditions (using 100mM DTT), one The domain p5E species exhibits a markedly reduced affinity for NMC-4, and thus this This is the case for p7E species that do not contain cysteine under reducing or non-reducing conditions. were very similar. NMC-4 can also be used under reducing or non-reducing conditions to reduce p5 The disulfide-bonded dimer derived from the E extract could not be recognized as an epitope. Ta. By reducing the initial NMC-48 response (which may result in lower antibody titers) r) and kept low by a combination of short exposure times), based on NMC-4 The Nitrocell I]-S filter used to generate the autoradiograph was Searched again using -46. 36 on the filter. 000kDa p7E polypeptide The binding of RG-46 to the is also the same, and all cysteines due to glycine in the expressed polypeptide are This was consistent with the replacement of Under non-reducing conditions-1, the large molecular weight vWF antigen (reactive with RG-46) is 5E polypeptide was present in the extract. (reflecting interbox disulfide bonds) These p5EvWF aggregates migrate to the same position as the p7E polypeptide under reducing conditions. movement, demonstrating the disruption of its disulfide contacts. However, under non-reducing conditions R The large p5E disulfide aggregates readily recognized by G-46 are It was not recognized by NM(,-4) either under original or non-reducing conditions. Therefore, the disulfide between residues 509 and 695 of the original multimeric vWF subunit The bond was shown to represent an anterograde contact. The disulfide bond between residues 471 and 474 of the mature vWF subunit is an intrachain It has already been shown that contacting and therefore the embodiments described above are The limiting disulfide bond in mature vWF is linked to one or more cysteine residues at 459 ．． It may be suggested that 462 or 464 can be formed with use 1~. A wide variety of expression plasmids or viral expression vectors are available for fragments 441-733. , or similar vWF fragment expression. A typical example is pBR322 , and its derivatives such as pET-1 to pET-7. suitable host Cells include the bacterial genera Enerichyi r and Banrus. Expression system selection Of particular importance is the high potency of the cloned vWF directly adjacent to the DNA insert. The recommended presence of rate transcription promoters. The mutant vWF cDNAΔ fragment is true It can be ligated into nuclear host cells. This finding suggests that 52/48) mimics the IJ pushin fragment (used as an antithrombotic agent). or alternatively its 116 kDa homodimer (for use as an anti-hemorrhagic agent) ) is expected to be particularly useful in the design of therapeutic vWF polypeptides that mimic Ru. Second aspect of the invention Design of therapeutic fragments of WWF and expression from recombinant bacterial cells described above. Many factors are applicable to the design of vWF fragments and expression from eukaryotic host cells. Applicability of this type will be readily apparent to those skilled in the art. This second embodiment includes within its scope residues 449-728 of the mature vWF subunit. - encompasses the recognition of the specific role played by the cysteine residues present in the next sequence fragment; Contains. In this regard, this embodiment provides cysteine 509-695 disulfide Conclusion To provide effective therapeutic agents incorporating the 509-695 linkage for the purpose of treating This is to confirm that. Both the anti-thrombotic and anti-bleeding polypeptides of this second aspect of the invention generally residues 449-72 of the mature Phono Willebrand factor subunit. 8, and when fully glycosylated 5 2/4 8 k Da vW in its amino acid sequence domain that may be equivalent in weight to the F subunit fragment. Based. In fact, it is difficult to derive therapeutically useful amounts of this type of polypeptide from blood plasma. It is difficult to do so. For difficulty, 116 kD from other components of the tryptic digest effective separation of a and 52/48 kDa fragments, and hepatitis or AIDS-like effective sterilization of blood-derived components from human viruses. Furthermore, 116kD The methods reported in the literature to generate the 52/48 kDa monomer from the a dimer are completely It utilizes disulfide reduction, which is accompanied by a loss of tertiary structure. 5　 Certain important manipulations of the 2/4 8 fragments, such as modifying the availability and stability of the product, In a practical sense, the selective substitution of cysteine residues with good properties cannot be achieved by recombinant DNA technology. It can only be achieved by However, 52/48) Therapeutic vWF polypeptides similar to ribsin fragments Production of peptides by recombinant DNA-directed means is subject to certain limitations. Polypepti For maximum therapeutic utility, it is important that the It is desirable that this is folded as positive j-2<. Most cured 52/48 fragments to date The main factor that prevented the expression of therapeutically active forms was the linkage of cysteine residues. That's correct 1. <With incorrect folding of the molecule to form no disulfide contacts It is believed that there is. Additionally, this type of polypeptide may suffer from hydrophobic properties or solubility issues. It is observed that these are completely within the native vWF subunits. would not have been encountered if it had been included or properly glycosylated. It is. Therefore, of great importance for the synthesis of vWF-induced therapeutic polypeptides: The selection of conditions minimizes the formation of inappropriate disulfide contacts. host bacterial cell Previous expression of this type of polypeptide from recombinant DNA in are doing. Referring to the first aspect, the newly produced vWF polypeptide is Unable to escape from the main cell, these are contained within insoluble aggregates (inclusion bodies). , where the effective concentration of cysteine residues becomes very high. Under these circumstances, dioxins naturally present in the serum and not characteristic of WF Sulfide bond formation solubilizes the polypeptide within or from the inclusion body. It is promoted and actually occurs in attempts to This embodiment encodes a polypeptide and, by virtue of its presence, a vWF polypeptide. uses a DNA sequence that also encodes a signal peptide that causes the host cell to secrete the However, this can be achieved by expressing vWF-inducing polypeptides in mammalian cells. This provides a solution to such difficulties. Formation of incorrect disulfide bonds is by limiting the accumulation of high local concentrations of polypeptides, such as in inclusion bodies. is minimized. Furthermore, the enzymes present in the host eukaryotic cells are As a result of being able to glycosylate peptides (add carbohydrate chains), humans provide therapeutic molecules that more closely resemble domains of the vWF molecule derived from plasma. available. Recombinants produced by this embodiment that do not have mutations in any of their cysteine codons The 116 kDa polypeptide consists of a subunit fragment consisting of residues 441-730. It was clearly shown that m; The amount of glycosylation equivalent to that of Therapeutic VW produced or capable of being produced by the effective recombinant procedure of the second aspect A description of the types of F-inducing polypeptides follows below. Recombinant vWF Polypeptide of the Second Aspect Broadly speaking, this second aspect generally that sequence of amino acids between residue 449 and generally residue 728, or a subfraction thereof; All fragments of the mature von Willebrand subunit (from now on At least one of its cysteine residues 459. 462 and 464 have been removed ). Such removal ensures that the fragments are free of unwanted interbox disulfide. The tendency to form double bonds (and the resulting dimers) is reduced, resulting in antithrombotic Therapeutic utility as a drug is improved. A further aspect of this embodiment extends to glycosylated forms of said identified polypeptides. . In designing an antithrombotic polypeptide derived from the above-mentioned region of vWF, the system Tin residues are retained at positions 509 and 695, which allows for mature vWF subunits. Preferably, the tertiary structure of the GPIb(α) binding domain of the cut fragment is preserved. Also suitable for implementing this aspect are groups derived from the above-mentioned gi region of vWF. A lycodylated polypeptide, in which cysteine residues are located at positions W509 and and 695, and cysteine residues 459. that of 462 and 464 Each is deleted or replaced by other amino acid residues. Further suitable for carrying out this embodiment are glycosylation derived from the above-mentioned regions of vWF. zylated polypeptide, in which the cysteine residues are at positions 509 and 695 and also cysteine residue 459. Either 462 or 464 One is deleted or replaced by a single residue of the other amino acid. Regarding the design or further modification of preferred variant polypeptides (antithrombotic agents) of this invention. The important contributing factors are described below. Potential for collagen and glycosaminoglycans (or proteoglycans) The potential binding site is 44 in the loop region between cysteine residues 509 and 695. 9-728 tryptic fragment. These sites due to this type of macromolecule This is achieved by, for example, also providing cross-linking to collagen. In the event that the usefulness of antithrombotic therapy of any of the recombinant polypeptides of the invention is impaired, (e.g., by proteolysis, covalent labeling, or mutagenesis). ) to delete or change the loop region or its subdomains. I can do it. A second aspect also relates to the preparation of polypeptides useful in the treatment of bleeding disorders. Broadly speaking, 116 kDa derived from circulating vWF)! J pushin sex fragment Production of substantially equivalent dimeric polypeptides by recombinant DNA-directed methods law is provided. According to this method, the initially formed monomer fragments are susceptible to dimerization. The appropriate tertiary structure shall be assumed and its dimerization performed (see Example 7) . Additionally, the process conditions are such that a suitably glycosylated dimeric polypeptide is formed. It shall be possible to do so. Following F, a description of the means by which the polypeptide of the second embodiment can be prepared will be provided. This allows this type of polypeptide to exit the host cell in a properly folded form. a disulfide that is effectively secreted and preferably whose presence is consistent with therapeutic utility. It can have only fido bonds. The essential elements needed to implement this aspect are: (Δ) Maturity v W F "jbuuni 7) encodes the residues 449-728 domain, or I) NA sequence encoding the domain; (B) residues 449-7 in eukaryotic cells; Expression plus capable of directing expression within the 28 domain or its subdomains a mid or viral expression vector, and (C) a eukaryotic host cell capable of carrying out said expression. . Expression of the DNA sequence of the Willebrand factor subunit fragment on residue 44 Upstream (5') of the 9-728 coding DNA is a eukaryotic consensus translation initiation sequence and This is facilitated by placing a methionine initiation codon. vWF DNA sequence is , cDNA sequences, etc. can be obtained from genomic DNA, clones, etc. using polymerase chain reaction, for example. The genomic sequence can be such that it can be produced by enzymatic amplification. residue 44 Expression of the 9-728 cod sequence requires a translation termination codon such as TGA downstream of it. Facilitated by history by placement. The vWF polypeptide thus expressed tide due to the lack of attachment of the signal peptide to the nascent vWF polypeptide. C and therefore typically remain within the host cell. In such a situation, among Purification of the expressed protein and extraction of pharmacologically useful amounts of the polypeptide is more difficult to accomplish than if it were secreted into the host cell culture medium. Ru. Nevertheless, this type of expression system is useful for example in patients with platelet GPItl-IX Still useful for diagnostic assay purposes such as testing the proper function of receptor complexes . In a preferred practice of this invention in which the polypeptide is secreted from a host cell, a suitable host A vWF-encoding DNA sequence is provided for insertion into cells, in this case residue 4. Upstream of the 49-728 code sequence, there is a DNA encoding the vWF signal peptide. Sequences shall also be inserted (see Example 7). Different mature vWF subunits or a propeptide or any combination of regions of this type. other vWF coding DNA sequences corresponding to the vWF signature in the appropriate coding DNA. can be similarly expressed by placing it upstream of the null peptide sequence. can. Attached to the amino-terminal end of the vWF subunit residues 449-728 fragment When released, it is processed by a signal peptide for eventual secretion from the cell. The fragment is not recognized by cellular structures as the type of polypeptide it should be, 449-7 with concomitant cleavage of the signal polypeptide from the 28 fragment. Construction of eukaryotic expression system and trypsin 52/48 of mature subunit 1-vWF For expression within the kDa domain (residues 449-728 fragment), residues Slightly larger represented by 441 (arginine) to 730 (asparagine) It has been found convenient to manipulate fragments (see Example 7). More Ami Other similar fragments containing a small region of amino acids (excluding the 449-728 residue sequence) ( This additional amino acid does not significantly affect the function of the fragment). be able to. Similarly, a functional fragment can be expressed and compared with the 449-728 fragment. In this case, the amino and carboxy Several residues adjacent to the ends were removed. For the construction of a suitable NA sequence encoding and expressing the residues 441-730 fragment, DNA encoding the carboxy terminus of the signal peptide and the codon for residue 441 between the codons of the first three amino acids of the vWF propeptide (alanine-glu Tamic acid-glycine) (The above codon is located in the signal sequence in the human vWF gene. It may also be effective to directly insert the F style (which is naturally summarized in 3') Admitted. As detailed further below (see Example 17), this type of The presence of the tide sequence (spacer) allows for the proper cleavage site by the signal peptide. Coherence is facilitated, and this process allows for the creation of appropriately sized therapeutic vWF polypeptides. secretion of therapeutic products from host cells is stimulated. detailed below As such, this spacer arrangement should be of semipolar or polar character. According to this invention, from 1 to the first 10 of the amino terminal region of the vWF propeptide. A spacer sequence consisting of residues at is provided. The desired sequence of residues 441-730 longer propeptide codes with the understanding that tertiary structure is not adversely affected. It is within the scope of this invention to utilize a code array. A wide variety of expression plasmids or viral expression vectors contain residues 441-730. Suitable for expression of mature vWF subunit fragments or similar vWF fragments. One important factor when choosing an expression system is to directly direct the cloned vWF insert. By providing flanking, highly efficient transcriptional promoters in plasmids or vectors, be. Other factors that are important when selecting an expression plasmid or viral expression vector are the The goal is to provide an antibiotic resistance gene marker in the smid or vector, and this For example, by applying continuous selection for stable transformant eukaryotic host cells. I can do L. Examples of plasmids suitable for use in the practice of this invention include pCDM8, pCD M8'', pcDNAl, pcDNAl''. , pMAM”. and Rc/CM V is included. Suitable plasmids include r+cDM8''., pcDNA1''@ 0, pMAM” and RC/CMV. Examples of viral expression vector systems suitable for practicing this invention include retrovirus-based Virus, Autographa calhouni force (Autog raphaca I 1forn 1ca) Those based on nuclear polyhedrosis virus are enveloped. Included. Representative host cells consisting of permanent cell lines suitable for use in the practice of this invention. The cells contained CHO-Kl Chinese hamster ovary cells, ATC(, -CCL- 61, cos-i cells, 5V-40 transformed African green monkey kidney, ATCC -CRL 1650, ATT20 murine pituitary cells, RIN-5F rat pancreatic β cells, cultured insect cells, Spodoptera f. ruqiperda), or yeast (Saccharomyces). Example 7 describes the preferred procedure used to express and secrete the 441-730 sequence. Contains a detailed explanation. In that example, stein residue 459. 462 and 46 as homodimers held together by one or more disulfide bonds containing 4 Secrete fragments. Expression of monomeric fragments useful as antithrombotic agents requires Control is needed to configure the ruphide binding capacity, most preferably as described above. This is achieved by a mutagenesis procedure as described in the first aspect of the invention. Respective residue position 459. 462 and 464 from cysteine to glycine The specific The procedure is described in Example 9. The expression plasmid used here was pAD4/Δ3C It was named. The three variant residues 441-730 fragments, each of which was employed in Example 9, were Place 459. 462 or 464) containing a different single Cys-4Gly mutation) The specific procedure used to generate is described in Example 11. The one I used there The respective expression plasmids were pAD4/G"', pAD4/G"" and pA D/G46' (collectively rpAD4/ΔIC plasmid). kind Using a similar procedure, with Cys4Gly mutations at two of the three positions listed above. Mutant residues 441-730 fragments can be produced. Example 7 below shows the unmutagenized residues 441-730 of the vWF subunit. Discloses the use of C) 10-Kl cells stably transformed to express the It is. As described in Example 10 below, the non-mutagenized fragment is It was also expressed in unstable CO3-1 transformants. CHC)-SDS polypeptides of proteins induced, secreted and immunoprecipitated from Kl cells. Acrylamide gel electrophoresis stained with Coomassie blue under non-reducing conditions The WF-induced polypeptide detected by approximately 116. 000 views (Example 7). This result indicates that the 355-labeled protein using an autoradiograph of pAD4/WT transformed CO5-1 cells. This was confirmed by characterizing the secreted polypeptide (Example 12). Ji Under sulfide reducing conditions (e.g. in the presence of 100mM dithiothreitol), 1 The 16kDa fragment was no longer detected and the vWF inducer was the expected 52/48k Appears as a Da monomer. The apparent molecular weight of the recombinant 116 kDa polypeptide is the 441-730 fragment. This was consistent with the existence of the polypeptide as a monomer. This homodimer is 116 kDa isolated by tryptic digestion of mature blood it (circulating) vWF. It carries an amount of glycosylation equivalent to that observed in the polypeptide. Yo Therefore, for expression of the 441-730 fragment in mammalian cell culture of this invention, Its disulfide-dependent formation of a 116 kDa dimer is advantageous and is observed in plasma. It is shown that the structure imitates the structure shown in the figure. 116 formed in this way The fact that the kI)a fragment represents a properly folded polypeptide is due to the conformation-dependent N -7 by its reaction (under non-reducing conditions) with the MC-4 antibody. This resistance The body recognizes properly associated GPIb(α) binding sites (Example 7). NMC -4 disappears under reducing conditions F. Within the scope of this embodiment, a dimer 116KD containing two cpibcα) binding sites The a fragment supports ristocetin-induced platelet aggregation due to its bivalent character. This is demonstrated in Example 8 below. Cystine residues 471 and 474 and similarly residues 509 and 695 are A first embodiment (using bacterially expressed vWF fragments) Therefore, the interbox bond that stabilizes the 116kDa pomonimer is one or more residues. Group 459. 462 and 464. Residue 459. 4 Since 62 and 464 are in very close proximity in both monomers, no particular certain residues are present in any particular mature vWF dimer or multimer. or one or more polypeptide-to-polypeptide contacts in the recombinant 116 kDa fragment. It is further noted that there may be variation in the number of interbox disulfide bonds that contribute to written down. A population of therapeutically active dimeric molecules contains all of the interbox disulfide bonds. Possible combinations can be utilized and generated by implementation of the present invention. Generation of therapeutically active conformations of the recombinant 116 kDa dimers of this invention or Some structural folds or disulfide bonds associated with disulfide exchange within It is also possible that formation of the polypeptide occurs after the polypeptide is secreted from the host cell. It is noted that Collagen, proteoglycan and gelcosa are present within the 441-730vWF fragment. The 116 kDa polypeptide also contains potential binding sites for minoglycan. Peptides are capable of cross-linking between platelets and the subendothelial layer. this thing by inducing platelet adhesion to surfaces such as the subendothelial layer of blood vessels. It becomes possible to use this. Also, an effective amount of recombinant 116 kDa polypeptide Platelet activation and/or aggregation consists of contacting platelets with platelets. A method of inducing is also provided. This type of method is used to treat Fono-Wilebrand disease. It is useful for at least one or more potential interbox disulfide bonds that stabilize the homodimer Amino acid sequence consisting of two GPIb(α) cross-linking sites, one remaining intact If necessary, other regions of the two monomeric fragments beyond that l are conserved. It is noted that the therapeutic properties of the dimer can be modified. 52/4gkDal mer vWF fragment An important aspect of the second aspect of this invention is that it has substantial elements of normal tertiary structure. By providing a glycosylated 52/48 kDa monomeric fragment of the vWF subunit be. This type of fragment is often unsuitable for use as an antithrombotic therapeutic agent. The tendency to form bodies is reduced. Following the procedure described above for site-directed mutagenesis, one or more cysteine residues 459. 4 Residues 441-730 vWF fragment with 62 and 464 replaced with glycine residues Manufactured. Example 9 below. 10 and 11 are these mutant vWF polypeptides. Mutagenesis and mutagenesis necessary to generate cos-cell transformants expressing This describes cell culture conditions. In Examples 12 to 14 of this invention, pAD Recombinant 116 kDa voripepti produced from 4/WT transformed CO3-1 cells The properties of the molecules thus derived are described. vWF-induced polypeptide expressed by pAD4/Δ3C-transformed CO3-1 cells (contains the vWF441-730 DNA sequence, but its respective cysteine Don 459. 462 and 464 are replaced by a single glycine codon ) is the polypeptide secreted by pAD4/WT transformed CO5-1 cells. compared with de. To perform a comparison, equal amounts of NMC-4 and RG-46 anti-W 355-Methionine supplementation from each culture using F antibody (Example 12) The culture medium was subjected to immunization iiJ, and vWF-induced secreted proteins were collected. After that, the SDS port Immunization by 355-labeled autoradiography with rearyl γ-mitogen-F The precipitated VWF polypeptide was analyzed. pAD4/Δ3C under non-reducing conditions No 116 kDa polypeptide was detected in culture extracts of transformed cells. Instead, under reducing or non-reducing conditions, the buffer has an apparent molecular weight of 52 kDa. was recognized. In contrast, pAD4/WT transformed cos-i cells Under non-reducing conditions, the polypeptide with an apparent molecular weight of 116 kDa as expected. to produce de. The immunoprecipitation procedure was repeated using only the conformation-dependent NMC-4 antibody (Example 13). I repeated it. Main cells isolated from the culture medium of pAD4/WT transformed cells The WF-derived component is again 116 kDa under non-reducing conditions and 116 kDa under reducing conditions. It had an apparent PI of 52 kDa. pAD4/Δ3C-inducing polypeptide A band with an apparent molecular weight of 52 kl) was detected under non-reducing conditions in a gel of the material. Ta. As described in Example 13, reactivity with NMC-4 antibody was determined by pAD4/Δ The 52-kDa fragment 11 detected in 3C-transformed cells corresponds to natural residues 441-730. This is important evidence that it has a main tertiary structure. Using a similar immunoprecipitation procedure, pΔD4/WT and and pAD4/ΔI grown under conditions similar to those for the Δ3C transformants. NMC-4-reactive vWF polypeptide produced by cos-transformed cells detected. Immunized under reducing and non-reducing conditions in SDS polyacrylamide gels. The precipitated proteins were poured into pAD4/WT and pΔD4/Δ3C types. A comparison was made with the vWF polypeptide produced by the transformant (Example 14). Any one protein residue 459. by glycine residue 462 or 464 This substitution results in an apparent molecular weight of 52 kDa under primarily non-reducing or reducing conditions. and the formation of the 116 kDa species was prevented. became clear. CO transformed with pAD4/Δ3C or pAD4/ΔIC plasmids 52 kDa apparent for recombinant polypeptide derived from 8-1 cells. The molecular weight is consistent with the polypeptide being a monomer of the 441-730 fragment, but 52kD isolated from tryptic digestion and reduction of mature plasma (circulating) vWF It also carries an amount of glycosylation equivalent to that found in the a polypeptide. Unlike the dimeric polypeptide with an apparent molecular weight of 116 kDa, pAD4/ΔI Monomeric 52 kDa polypeptides produced by C and pAD4/Δ3C plasmids. It is unlikely that peptides can perform the cross-linking action associated with dimers. Therefore, the effective amount by contacting platelets with a mutant recombinant 52/48 kDa polypeptide of A method for preventing platelet activation and/or aggregation is provided, in which the polypeptide tide compared to the non-mutant (wild type) recombinant 52/48 kDa polypeptide. have at least a substantially reduced tendency to dimerize when Furthermore, when compared to the non-mutant recombinant 52/48 kDa polypeptide, at least An effective amount of the mutant recombinant 52/48 kDa also shows a substantially reduced tendency to dimerize. Adhesion of platelets to a surface consisting of contacting polypeptides with platelets A method for preventing this is provided. In addition to the GPIbα binding site, the 441-730vWF fragment contains (generally residues 542-622) and glycosaminoglycans and proteins. Potential for oglycan (also within residues 509-695 disulfide loop) It is a binding site. Considering steric considerations, probably residues 441-730 A single fragment consisting of a single fragment cannot be cross-linked and behave as a potentially thrombogenic molecule. However, (generally primary sequence regions 474-488 and 694-708, and its tertiary domain contributed in part by the 509-695 disulfide bond. As long as the GPIb(α) binding domain of the 52/48 kDa monomer is conserved and other regions of the 52/48 kDa monomeric fragment (e.g. heparin and collagen). (part of the gene-binding loop) can be deleted by proteolysis or mutagenesis as needed. may be lost or altered, altering or preserving its antithrombotic therapeutic properties. For the generation of therapeutically active conformations of the recombinant 52/48 kDafl mers of this invention. Some concomitant structural folding or disulfide bond formation or disulfide It is also possible that ID exchange occurs after the polypeptide has been secreted from the host cell. Ru. Limiting glycosylation of vWF-induced polypeptides to enhance therapeutic activity Lebrand factor and platelet glycoprotein 1b (α) are glycoproteins, i.e. carbohydrates. A protein to which molecules (e.g. sugars) are attached. In the case of the Humen Willebrand factor , this natural process of adding carbohydrates (called glycosylation) Substantially increases the molecular weight of the quality. For example, the mature v consisting of residues 449-728 The results of the glycosylation described above for the trypsin fragment of WF'' I block unit. In humans, the apparent molecular weight increases from about 38 kDa to 52 kDa. Glycosylation of newly synthesized polypeptides occurs in eukaryotic cells (e.g., mammalian cells). ) is much more complex than in bacterial cells. Membrane receptors such as GPIb(α) Protein species that act as a body, and proteins that interact with these (e.g. v W F ), glycosylation is particularly common. By way of background, glycosylation typically occurs at several stages in mammalian cells. process), starting immediately after the nascent polypeptide appears on the liposome, and the protein The substance is added to the cell membrane and eventually inserted into the cell membrane or secreted from the cell. Continue as time progresses. Glycosylation is critical to the function of many glycoproteins (For certain possible features of vWF, see Wagner D.D. (Wagner, D, D, et al., J. Ce1l Biol, 102:1320- 1324 (1986)), mature phono willbran Gl)Ib(α)-binding activity of the residues 449-728 region of the factor subunit. The role of glycosylation in this study was investigated. As shown here, vWF l1. 6　 The therapeutic activity of k-Da dimer can be enhanced by limiting its glycosylation. can be done. This indicates that the activity of the 52/48 kDall mer is similarly enhanced. Indicates that it is expected to occur. Using any suitable means, vWF116kDa dimer or 52/48kDa It can be used to limit glycosylation of monomers. As a background, 52/4 of the circulating mature phono Willebrand factor subunit Glycosylation of the 8 tryptic fragment is primarily at residue position 468 (asparagine). , 500 and 723 (serine), and 485. 492. 493. 705. 714 and? 24 () Leonine) has been shown to occur. titani k (Titani. K.) et al., Biochemistry, 25 2 3171-3184 ( 1986). The glycosylation of asparagine is an N bond (from the amide group on the side chain). Serin O The hydroxyl groups of and threonine are present at the 0-linked glycosylation site. The present invention is based on N and glycosylation at both the 0-binding site. Tunicamycin, an antibiotic that can be isolated from cultures of Streptomyces, is a true It has been shown to inhibit protein glycosylation in nuclear cells. Toskin ・Duskin, D. et al., J. Biol, Chem, 257 (6): 3105-3109 (1982), especially tunicamycin c in) is the combination of N-type glycosidic bonds (in the asparagine N-binding site). impede growth. Mahoney, W. C., et al. J, Chromat og, 198:506-510 (1980). can be seen. Thus, treatment of eukaryotic cells with tunicamycin results in This provides an effective system for modifying the glycoproteins produced within the system. Following the procedure of Example 15, containing the pAD5/WT plasmid, a recombinant 116 kD Stable Cl1O-Kl transformants capable of secreting the avWF fragment (see Example 1) were Cultured in the presence of sonicamine. After approximately 36 hours, the culture medium was collected and concentrated. Ta. Concentrated culture medium (in which the main WF-inducing polypeptide species are 11 6 kDa) was used in the ristocetin-induced platelet aggregation assay (performed). (see Example 9) and untreated cell cultures (polymerases with normal N-linked glycosylation). The comparison was made with a culture medium derived from A. Secreted 11. 6k Tunicamycin-induced N-linked glycosylation of DaVWF fragments restriction substantially increases its ability to support ristocetin-induced platelet aggregation. Rukoto has been shown. For the purpose of inhibiting N-linked glycosylation, vWF is used in the practice of this invention. from about 0.3 to about 1.0% to the culture medium of cells expressing the induced polypeptide. 5μg/ It is preferred to add sonicamine at a concentration of ml. Approximately 0. 3μg/m Below I, polypeptides are cleaved differently as a result of the action of antibiotics. This tends to give a heterogeneous population of de. Comparatively place host cells in antibiotic-containing medium Longer exposure is not expected to significantly reduce this effect. Departure The nascent vWF polypeptide probably only undergoes grouping during a limited period of time after translation. This is because it is processed by lycodylation enzyme. Approximately 1. If it exceeds 5μg/ml There were signs of toxicity to ,CHO,-Kl cells. This is important for cell function and Inhibition of glycosylation of CHC-1 proteins such as glycosylation required for growth It is thought that this occurred due to The range of appropriate tunicamycin concentrations is different. The amounts listed above may vary depending on cell culture conditions or for different host cell lines. and appropriate tunicamycin incubation conditions for other cell lines. You can easily check the details. Sialic acid-containing carbohydrate side chains in binding of 52/48vWF fragment to platelets role of 52/48) found on both N- and O-linked carbohydrate side chains of the Ubun fragment. One of the most important types of carbohydrates is sialic acid. Sialic acid is negatively charged; Net negative charge on the surface of vWF multimers and likewise platelet GPIb(α) receptors Contribute to the field of electricity. Sialic acid is linked to vWF and GPIb(α) under non-damaging conditions. promote mutual repulsion. In fact, platelets and circulating vWF do not produce any interaction. normally coexist in the blood without causing any damage, but probably damage-induced chemical Alternatively, vWF bound to the subendothelium as a result of physical changes binds to platelets. vWF--platelet GPIb(α) interaction can be demonstrated in vitro and positively in the presence of certain mediators such as the charged glycopeptide ristocetin; or follow chemical manipulations of the vWF molecule itself, e.g. terminal chains from carbohydrate side chains. This is due to the removal of sexually charged sialic acid residues. DeMarco El , 1. ) et al., J. Cl1n, Invest, 68:32L-328 (198 1). The sialic acid residue is from residue 449? 28vWF disconnection of serine and threonine Carbohydrate attached to the -r asparagine (N-bond) site (0-bond) It is recognized in the mono side chain. The effect of tunicamycin in enhancing the therapeutic potential of the 116 kDa fragment is due in part to the 1 16kI) due to limiting the phosphoric acid content of the a dimer. This effect is , should be equally applicable to the 52/48 kDa monomer. Therefore, monomer 52/ An expression plasmid (e.g. pAD4/Δ3C or to tunicamycin in host cells containing pAD4/ΔlC1 Examples 9 and 11). This treatment results in an antithrombotic therapeutic agent with increased GPIb(α) binding activity. can be expressed from. Therefore, this invention aims to limit the glycosylation of the fragment or dimer thereof. The 449-728 tryptic vWF fragment was encoded using tunicamycin for A method of treating a eukaryotic host cell containing a DNA sequence comprising: This invention also provides for the use of vWF-induced polypeptides for the purpose of improving their therapeutic utility. Further methods of limiting glycosylation of tide are also covered. (A) To cleave the carbohydrate side 1m (including N or 0 bonds) from the glycoprotein. It is noted that there are a large number of enzymes that can be used. Typical examples include ( 1) 0-glycanase 5, endo-α-N-acetylcaractosaminidase ( This is a gal-β-(1,3)ga bonded to a serine or threonine residue. (2) N-glycanase 5, N-1' lycosidase F, peptide-N' [N-acetyl-β-glucosamini ] asparagine amidase (which hydrolyzes asparagine-linked oligosaccharides) ), and (3) gal-β-1,4-GIcNAc-a-2,6-sialylt transferase, (which can be used to modify sialic acid sites) ) (all Genzyme Inc., Boston, MA) or Endo-H from Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. and endo-F). (B) Example 16 starts generally at residue 449 (valine) and begins generally at residue 728 (valine). The amino-steep sequence of that fragment of mature 7-on Willebrand factor ending in lysine For site-directed mutagenesis of mutant polypeptides that mimic the parent polypeptide consisting of This paper describes the production by In Example 16, (coded by vWFcDAN) (for the parent polypeptide to be encoded) respectively 0 or N-linked glycosylation serine, threonine and as well as asno N+ which are or potentially are sites of By deleting the specific hood encoding the lagin residue, or by deleting other amino acids. codons can be substituted, which results in fewer Polypeptides with high glycosylation (including sialylated carbohydrates) in host cells is taught to allow expression and subsequent secretion from. Example 7. 9 and 11, the expressed polypeptide is dimeric. The monomer or the monomer can be controlled by using one or more cysteine molecules. 462 and 464 This is done by mutation of The monomeric polypeptides thus derived are useful antibodies. It is a thrombotic agent, whereas the dimeric form reduces bleeding in patients with Willebrand disease. Useful for treatment. When choosing an appropriate replacement amino acid for cysteine residues Applying the same secondary and tertiary structure factors described earlier, the glycosylation site is Note that serine, threonine and asparagine residues can be substituted be done. Furthermore, also for the purpose of designing mutant vWF-inducing polypeptides, Heptaline, threonine, and asparagine are suitable for replacing most cysteine residues. It is thought that there is, but cyS-+thr, c y s- + s e r or cy The s-+asn substitution introduces a new glycosylation site into the vWF-derived polypeptide. resulting in a polypeptide with increased carbohydrate content. must be considered. In addition, a mutant polypeptide derived from the 449-728 region of the mature vWF subunit The peptide is produced within a host cell that can secrete the polypeptide after glycosylation. site for introducing additional serine, threonine and asparagine codons into the DNA of By using a directed mutagenesis procedure, a substantially increased carbohydrate content ( It is also noted that it can be designed to f. Fono Uij LeBlanc for secretion of non-vWF-inducing polypeptides from host cells. Use of signal conjugate The present invention also provides general information on residues of the mature 7-on Willebrand factor subunit node. D encoding biologically active monomers and dimers corresponding to the 449-728 sequence Also provided are methods for producing polypeptides from NA sequences, which polypeptides are produced in host cells. secreted from Centrally important to the success of this method is the vWF signal This is the construction of a vWF DNA sequence to which is also attached an INNΔ sequence encoding a peptide. Recognition of the signal sequence by cellular components causes the vWF polypeptide to be released from the cell. Can be secreted without accumulation as qualitatively insoluble polypeptide aggregates becomes. Proteins trapped in inclusion bodies generally undergo improper folding and It is considered to indicate an id bond. Williams D.C. ams, mouth, C3) et al., 5science, 215:687 (1982) can do. Recombinant polycubtide representing vWF subunit residues 441-730 was introduced into host cells. The signal peptide and mature vWF subunit sequence must be combined in order to be secreted from The combined nascent polypeptides are linked to metastatic receptors and signals necessary for the secretion process. Requires recognition by endoplasmic reticulum and cellular components such as peptidases. Ru. The force of signal peptide activation by signal peptidase There is a general need for serious awareness. Recombinant 441-73QvWF fragment or other related For the purpose of enhancing secretion from host cells of therapeutic polypeptides that do not , DNA encoding vWF signal peptide and structural sequence of therapeutic polypeptide A small spacer DNA sequence can also be inserted between the DNA encoding the . Preferred examples of spacer DNA include from the amino terminal sequence region of the vWF propeptide. Sequences encoding from about 1 to about 10 amino acid residues are included. spacer dna Particularly suitable as an array is NHx - A l a - G I u - G l y - CO2H. NHz Ala Glu Gay Thr C02H (MaNH2-A I a-GIu-GIy-Thr-Arg-Go2H, and these is the first 3.5 minutes of the amino-terminal region of the vWF propeptide. 4 and 5 amino acid residues represent. Example 17 describes conditions under which this type of combined construct can be expressed in host cells. teach the subject. As shown in Example 17 of this invention, the vWF signal peptide is Contains a substantial hydrophobic region (as most signal peptides do). In contrast, the amino-terminal region of the vWF propeptide is essentially hydrophilic. . Depending on the proper recognition of the target cleavage site by the signal peptidase, the general signal a semipolar or semipolar region adjacent to or connected to the carboxy-terminal region of the peptide. area is required. 7 von tleijine, G, ), J, Mo 1. Bi. 1. 184:99-105 (1985). This invention causes secretion of the 52/48 kDa domain of vWF subunit/) The DNA sequence used to carry out is the vWF propeptide (A1a-GI A spacer derived from u-Gl y) is linked to the signal peptide, and then followed by highly polar Argaa + Argaax residues in the mature subunit sequence. This provides this kind of polar domain. This aspect of the invention is specific for the expression and secretion of therapeutic fragments of polypeptides. is important. This type of fragment does not include the amino-terminal region of the entire polypeptide. The amino terminus is a hydrophilic terminal located directly adjacent to the carboxy terminus of the signal peptide. The sex domain can normally be given. In such cases, semi-polar or polar spacers ( For example, the signal sequence and therapeutic properties of vWF A suitable signal peptidase cleavage site is inserted between the sequences of the polypeptide fragment. It is possible to promote recognition as a position. It also affects the activity of polypeptide fragments. If not, the cloned therapeutic polypeptide fragment consists of the amino terminus of the cloned therapeutic polypeptide fragment. Choose the exact residue position and begin the region of parent residues that can form the recognition sequence. I can do it. The substantially hydrophilic character of the residues 441-450 region of the 52/48kl) a fragment is without the use of a spacer between the signal peptide and the mature subconit sequence , showing that the fragment can be successfully expressed in eukaryotic cells and secreted from it. Seven preferred configurations of spacer polypeptides, such as the first three of the vWF propeptide. 4 or 5 residues), thereby possibly affecting the function of the therapeutic polypeptide. Only non-biologically unimportant foreign amino acid sequences are treated during secretion from the cell. This is advantageous in that it attaches to and stops therapeutic polypeptides. The following information describes the secretion of semipolar and polar spacer sequences useful in the practice of this invention. This is provided to promote this. Comparisons that a particular peptide sequence may exhibit when present within a relatively large polypeptide It is possible to predict the relative degree of hydrophobicity or hydrophilicity. this kind of model One is by Kayte J. et al. 1. J, Mo1. Biol, 156:105-132 (1982). / hydrophilicity index. The overall index value is based on the bias of individual residues and within the peptide. It is specified based on the position of a particular amino acid residue in the amino acid residue. The hydrophobic The maximum value is A4°5 (equivalent to isoleucine). The most hydrophilic The maximum value is -4.5 (equivalent to arginine). In carrying out the present invention, the kiteji According to the method described by Ei et al., the spacer peptide is considered semipolar or polar; It has an overall index value of about 0 to about -4.5. However, adjacent treated polyp If the peptide sequence is highly polar, a very short and slightly hydrophobic spacer will Nevertheless, it is noted that it shows functionality. Representative index values for spacer peptides useful in the practice of this invention are as follows. Subscript numbers can be seen to significantly change the relative hydrophilicity of the combined sequence regions. refers to the residue position within the mature vWF subunit sequence. (A) Ala-Glu-Gly-0,7 (B) Ala-Glu-Gly-Th r -0,7(C)Ala-Glu-Gly-Thr-Arg -1,46CD )Ala-Glu-Gly-Arg4nt-Argm-2,22(E)Al a Glu Gly Argsn+-Lysnnt 1. 16(1’)vWF The first 10 (amino-terminal) residues of the peptide -1,45 or NA-containing residues as appropriate. Generate host cells transformed with the current plasmid or viral expression vector. using recombinant DNAte-directed methods such as Fono Willebrand factor or other Diverse eukaryotic signals for expression of therapeutic polypeptides derived from proteins It is generally accepted that peptides are suitable. Furthermore, the necessary hydrophobic domain A set of amino acid sequences of signal peptides that supply Useful. The DNA sequence encoding the target polypeptide and vWF signal peptide sequence is As further polypeptides that can be successfully secreted from host cells by A preferred fl is a polypeptide consisting of an "A" type sequence domain. target; DN encoding the repeptide and vWF signal peptide/propeptide sequences Additional polypeptides that can be successfully secreted from host cells by constructing the A sequence Also suitable as a polypeptide is a polypeptide consisting of an AJ-type sequence domain. The rA, +-type domain is derived from gene duplication of a common structural genetic element. , and thus these generally span the region of the mature vWF subunit from residues 500 to 700. It shares substantial r-mino acid sequence homology (greater than about 15-20%) with the region. man Mancuso, mouth, 1. ) et al., J. Biol. Chem, 264 (33): 19514-19527 (1989). this species Typical examples of proteins include complementary factor B, complementary component C2, and cartilage matrix protein. quality, α1 collagen type Vl, α subunit of leukocyte adsorption receptor Mac-1 , and LFΔ-1, VLA-1 and VLA-2. 2. 050 residue composition The mature phono Willebrand subunit itself contains two other "A" domains, A 2 ([residues 710-910) and A, (residues 910-1110) including. Antibodies with therapeutic activity Antibodies, especially conformation-dependent antibodies, are used to analyze the structure and function of macromolecules. is a powerful tool. By blocking macromolecular interactions, antibodies It may also have necessary therapeutic utility. Accordingly, this invention includes within its scope vWF subuniso) or a subset thereof. encompasses antibodies specific for any polypeptide containing, which antibodies generally mimics the mature vWF subunit sequence between residues 441 and 730, 1 or more cysteine residues 459. By deletion or substitution of 462 or 464 It has less tendency to form silver disulfide bonds than the polypeptide it mimics. A polypeptide is produced by a method that involves immunizing an animal with the polypeptide. Change Diagnostically or therapeutically useful antibodies that mimic the above-described sequence regions in this way , sudane residues 509 and 695 form a disulfide bond, thereby can be generated by polypeptides that rearrange important domains of tertiary structure. Wear. therapeutic composition One to seven polypeptides of the invention may be used in pharmaceutical applications for therapeutic, diagnostic or other uses. can be formulated into commercial preparations. When preparing these for intravenous administration, Sodium chloride (e.g. 0. 35-2. 0M>, physiologically active substances such as glycine, etc. Water that contains compatible substances and has a buffered pH that is compatible with physiological conditions (this water and Physically compatible materials may be used to dissolve the composition (including pharmaceutically acceptable carriers). Ru. Monomers 52k of the invention having at least a substantially reduced tendency to dimerize For Da polypeptides, the amount of administration for prophylaxis or inhibition of thrombosis is determined by the patient. may depend on the severity of susceptibility to thrombosis, but can be easily determined for any particular patient. can do. Recombinant 116 kDa polypeptide or other dimeric polypeptide of this invention Regarding the sub-fragment, the method of administering it for the treatment of Fono-Wilebrand disease is: This may depend on the severity of the patient's susceptibility to bleeding, but is readily available for any particular patient. can be determined. Example The following examples are representative of the practice of this invention. (For prepropeptide) All von Willebrand factor genes are encoded. The cDNA clone was created by Dr. Dennis Lynch, Carfarba Cancer Institute, Boston, Massachusetts Provided by Nchi D C et al., Ce1l, 41:49-56 (198 Prepared as described in 5). The size of v W F m RN A is human It was considered reasonable to possibly exceed the 28S type rRNA. Therefore, cDNA Using RNA larger than 28S selected for library construction, endothelial cells ( Total RNA from plasma (main source of vWF) was precipitated on a sucrose gradient. Two separate cycles of poly(U)-Sephadex 5 chromatography were used. The collected fractions were further purified to obtain RNA with a 3' polyadenylated end. Species (mRNA) was selected. Lynch et al. (supra) determined that vWF mRNA in this fraction We have established a superiority rate of approximately 1 in 500, but using both of these, we have established a superiority rate of approximately 60. 000 independence A recombinant cDNA library was generated. Standard techniques were used to generate the cDNA library. Oligo (d T) Prime the population of mRNA using primers, then reverse transcriptase I transcribed it. The RNA enzyme was then removed by alkali hydrolysis (transcribed using DNA polymerase I, leaving behind the cDNA anticode strand (equivalent to the strand) This was primed with a hairpin loop for second strand synthesis. S1 Nucle The hairpin loops were removed using DNA polymerase I and the crude ends were repaired with DNA polymerase I. Recovered. GC tail, Maniatis, T., et al., “Molecular cloning” 2nd edition, Volume 1, Volume 5. 56 (1987) was subsequently used to generate cDNA was annealed to plasmid vector pBR322. terminal transfer Add an oligo(dc) tail to the cDNA fragment using The formed pBR322 was annealed. Make this plasmid ampicillin sensitive E. coli strain HBIOI was transformed and propagated. Immunopurified vWF poly After searching with 32p-labeled cDNA prepared as a somal reverse transcriptase product. , identified a suitable loan. Positive clones were transferred to pSP64 (Promega (Pr omega) Inc., Madzilan, Wis.). Primer-directed amplification of cDNA The cDNA representing the full-length preprovWF gene derived from pSP64 was subjected to polymerase linkage. It was subjected to enzymatic amplification by chain reaction. Established nucleotides of the preprovWF gene Sequence, BonLhron, D. et al., Nucl, Ac1d Res, 14 (17) Near 1. 25-7127 (1986), Mankutu ・D et al., J., of Biological Chemistry, v, 264. (33): 19514-19527 (1989), ((1) SEQ ID NO: 2 and (2) SEQ ID NO: 3 and (named) was prepared. Model 380B Automation System, Applied Biosystems, Foster City, CA using the phosphoramidite method, a) et al., Tetrahedron Letters, 24:5843 (198 3), all oligonucleotides used here were synthesized. Oligonucleotide (1) (SEQ ID NO: 2) Oligonucleotide (2) (SEQ ID NO: No. = 3) Oligonucleotides can be produced by digestion with trypsin. mature v starting at residue 449 (valine) and ending at residue 728 (I7 gin) It overlaps the end of the region encoding that fragment of the WF subunit. oligonucle Otide (1) is the code for amino acid positions 441-446! JIDNA (mRN Similar to A), there is an EcoRI restriction site 5' of the codon of amino acid 441. Add. Oligonucleotide (2) matures amino acid positions 725-733 vWF Corresponds to the non-coding strand of DNA (transcribed chain), code for amino acid 733 A HindIII restriction site is added to the 3' end of the link. The code strand complementary to (2) is below. Indicates in the case of part. Using the oligonucleotide with full-length cDNA as a template, mature VW Corresponding to F residue numbers 441-733, EcoRI and Hindll linkers The cD NIA fragment containing , 5science, 239:487-491 (1988). It was then synthesized by the enzyme chain reaction. In this procedure, two flvWF c DNA fragments (subfragments of which are subjected to amplification) are ), and two single-stranded oligonucleotides flanking the ends of the subfragment. Bleif (in this case, oligonucleotides (1) and (2)) is used. (D.N. Presence of A polymerase and polydeoxyribonucleotide triphosphatase (below) Add the primer oligonucleotides at a much higher concentration than the DNA to be amplified. added. In particular, the PCR reaction uses Taq polymerase and Thermus aquaticus ( Thermus aquaticus), DNA thermal cycler (Pelki Norwalk, CT / Cetus, Berkeley, Cali Fornia). The reaction was carried out in a volume of 100 μl, and 1. 0ng Prepro vWF cDNA, 1. 0 ng of each synthetic oligonucleotide platinum Imma, and 50mM KCI, 10mM) Lis HCI (pI (8,3), 1 ．． 5mM MgCI2. 0.1% gelatin (Bio-Rad, Richmond, Calif.) buffer solution consisting of A. California, California) and 200 mM of each dNTP. included. PCR conditions were 94°C for 30 seconds, 52°C for 30 seconds and 72°C. The cycle time was set to 35 cycles per minute. The amplified fragments were then purified and grown on a 2% agarose gel. isolated by electrophoresis (Maniadis et al., [Molecular Cloning, Laboratory Manual”, 164170, Cold Spring Harbor Lab, Cole Spring Harbor, New York (NY) (1982). The wide range accumulated after multiple rounds of denaturation, oligonucleotide annealing and synthesis The majority of the polynucleotides are in the desired doublet suitable for further amplification by cloning. Gives a full-strand cDNA fragment. For some experiments, Newman, P.J. ) et al., J., Cl1n, Invest, 82 Near 39-743 (1988). Therefore, the amino acid sequence position! The mature vWF fragment starts at 44+ and ends at position 733. The corresponding cDNA was prepared and amplified directly from platelet mRNA. primanucle As a result of the above-mentioned utilization of octide numbers 440 and 733, EcoRI and A cDNA containing the Hindll linker was obtained. Insertion of cDNA into the Ml3mp18 cloning vehicle EcoRI and Hin Using the d111 restriction enzyme, this protein corresponding to the amino acid sequence of residues 441-733 was The resulting double-stranded von Willebrand factor cDNA was transformed into a compatible EcoR A bacteriophage containing multiple cloning sites with a HindllI sequence, and a HindllI sequence. It was then inserted into a double-stranded replicating form of age M13mp18. M13 series filamentous phages infect male E. coli strains (containing F factor) do. The infection form of the virus is represented by 1M DNA (゛) chain, which is the host The main enzyme converts it into a double-stranded circular form that also includes the minus (-) chain, and these two The chain structure is called the replication form (RF). Converting the stable double-stranded (4) form of the virus into a single Being able to separate the integrity of all cloned sequences in this Particularly useful for checking. Merrick Jay (Messing, J,) , Meth, Enzymology, 101:20-78 (1983 ), Yahish-Perron, C. et al. Gene, 33:103-109 (1985). Therefore, by utilizing the double-stranded (゛) form of M13mp18, -water dideoxy methodology (Sanger F et al., Proc, Natl, Acad, Sci USA, 74: 5463-5467 (1977)) to completely transform the vWF cDNA insert. The vWF cDNA fragment was sequenced and the mature vWF subunit residues 441-73 It was confirmed that it contained the correct coding sequence of 3. Site-directed mutagenesis corresponding to amino acids 441-733 replacing cysteine residues cysteine residue 459 in the mature vWF fragment. 462. 464. 471. 474 ．． 509 and 695 as glycerinase for the cysteine codon of the corresponding cDNA. was replaced with a glycine residue by substituting the codon. To accomplish this, vWF Oligonucleotides spanning the region of each cysteine codon of the cDNA (sequence (see numbers = 5 to 8) and the corresponding salts required to replace cysteine with glycine. It was prepared as a non-coding chain (transfer chain) with group substitution. Oligonucleo used Oligonucleotide (3) (SEQ ID NO: 4) (Cysti N459. 462. 464 at the same time). Oligonucleotide (4) (SEQ ID NO: 5) (cysteine 471. 474 at the same time ) oligonucleotide (5) (SEQ ID NO: 6) (cysteine 509 ) Oligonucleotide (6) (SEQ ID NO: Nia) (replaces cysteine 695) Hybridizing oligonucleotides are shown in uppercase letters, transcriptional chains (non-coding DNs) It is equivalent to A). Equivalent code chains are indicated by the corresponding three-letter notation. The amino acids are shown in the case letters at the bottom (see Table 1 for labeling). cysteine 459 using oligonucleotide (3) as detailed below. ．． 462 and 464 were replaced simultaneously. Then, using oligonucleotide (4) Cystine residues 471 and 474 were simultaneously replaced using Then each Cystine residues 509 and 6 using oligonucleotides (5) and (6) 95 were replaced individually. Kunkel T.N., Proc, Natl, Acad, Sci, USA 82:488-492 (1985). We performed CDNA1f conversion to The series of steps is repeated using the conditions selected for the uracil containing DNA template. It is used for: (A) Amino site,! M containing wild type vWF cDNA corresponding to 441-733 13mp18 phage was incubated with E. coIJ CJ 23 in uracil-rich medium. (grown in the 3 mutant dut-ung- strain. This E. coli strain Due to the lack of lysine triphosphatase (deji), the intracellular boot of dUTP is Jl, accumulates 1-1, which competes with dTTP for incorporation into DNA. (hmm ShIomai, J., et al., J. Biol, Chem. 253 (9): 3305-3312 (1978)), , the viral DNA synthesized under these conditions contains several molecules per viral genome. such as a strain containing a uracil insert and lacking uracil glycosylase (ung-). It is stable only in E. coli strains that cannot remove uracil. uracil glyco Due to certain inability sites by sylase, uracil-containing nucleotides are Single-stranded ('>Ml)3mp18 DNA in ten strains is lethal. (B) Culture of phages grown in E. coli strain C, J236duung- Isolate single-stranded (+) viral DNA from the medium. Single-stranded (+) form of the virus contains a specific vWF cDNA in its multiple cloning site, and this cDNA Equivalent to a vWF DNA block that is not copied. (C) Position 459. Cystine to glycine placement in 462 and 464 The oligonucleotide (3) containing the necessary codon changes is then added to the heavy chain (4). The phage DNA is teniered in vitro. In general, a wide range of oligonucleotides Otide concentrations are appropriate for this procedure. Typically 40 ng of oligonucleotide 0. 5-1. Annealed to Ottg M13mp18 phage (’) DNA let (D) Ml 3mp 18 All missing sequences of the (-) strand were then added to dTTP. Test using T7 DNA polymerase and T4 DNA IJ gauze in a rich environment. The mature vWF subunit is completed at amino acid positions 441- A transcribed vWF cDNA sequence corresponding to 733 is generated. (E) now has a thymine normal (-) chain and a (゛) chain with some uracil substitutions. double-stranded M13mp18 phage containing normal levels of uracil glycosylase. and wild-type E. coli XL-1 containing deoxyuridine triphosphatase. Transform into Blue (Stratagene, U. Jola, CA) strain. (F) Uracil glycosylase and other enzymes present in the new host are double-stranded. Phage that initiates destruction of the uracil-containing (1) chain of the phage and remains after replication ← ) oligonucleotide-induced glycine mutations in the stranded DNA host. This results in the existence of stable, normally thymine double-stranded (RF) DNA. (G) Each contiguous system of vWF sequences within the Ml3mp1g phage. Steps (A) of the method until the in codon is replaced by a glycine codon. (F) was then added to each of the oligonucleotides (4), (5) and (6). Then repeat J''. (11) Upon completion of the mutagenesis procedure, standard The sequence of the vWF cDNA insert was reconfirmed using F et al., supra). Construction of expression plasmid Double-stranded vWFe containing subsequent seven site-specific cysteine-to-glycine mutations DNA fragments were treated with EcoRI and I-Tindll restriction endonucleases. removed from the M13rnp18 phage by the treatment used, followed by a highly efficient E. For cloning into the coli expression vector, the ends of the fragment were terminated using 13amHl linkers. Roberts, R.J., et al., Na ture, 265:82-, -84 (1977)). Specific expression vector of choice Rothenberg N et al., Gene, 56:125-135 (1 987), which is a plasmid pET-38 developed by BamHI pBR3 containing a high-efficiency (φ10) T7 transcription promoter directly adjacent to the linker site 22 derivative. If it contains a fragment of the mutant vWF cDNA identified above, pE The T-3Δ carrier is referred to as the rp7EJ or p7E expression plasmid. A second clone containing the same vWF coding sequence was cloned into a plasmid in the opposite orientation. A pE"F-3Δ inducible expression plasmid (referred to as p7D) of 2 was constructed. p7D is It should not be possible to express vWF polypeptide fragments. Third expression plasmid (p JD18) contains the vWF amino acid sequence between residues 441 and 733. wild-type 52/48 tryptic vWF fragment c DN encoding Contained in the same pET-3Δ vector. Procedures established in ↑-minutes thereafter, llanahan, D. 1. J, Mol. Riol, 166:557-580 (1983), p7E (or p7E) 7D and pJD18) expression plasmids into ampinlin-susceptible E. coli strain B. L21 (DE3), Tubaken, Madziran, Wisconsin (WI) I turned it into a loan. Strain RL21 (DE3) was engineered to produce 1-7 RNΔ polymerase By containing the gene, the vWF insert can be transcribed with high efficiency. I can do it. E. coli strain B containing p7E, p7D or pJD18 expression plasmids, respectively. Three separate samples of L21 (I)E3) were mixed with 200 μg/ml ′γ Growth: Inoculate 5-6 ml of 2X-YT growth medium containing ampicillin and overnight at 37°C. Cultures grown and fully grown are called live I&1-. 2X-YT growth medium is 10gm Bacto Tributone, 10gm Yeast Extract and 5gm Na per liter Contains C1. Similarly, in 500 ml of 2X-YT medium containing 200 μg/mI of ampicillin, ml of each overnight culture was then inoculated and grown with shaking at 37°C for 2 hours. I let it happen. After a 2 hour incubation period, isopropyl-β-d-thiogalactopyrano Cultures were induced for protein expression by adding C.I.D. to a concentration of 5mM. guided. Incubation was then continued at 37°C for 3 hours. High level expression of vWF polypeptide was obtained with p7E and pJD18 As a result, cytoplasmic granules or granules containing high concentrations of vWF polypeptide, primarily in insoluble form, or “inclusion bodies” were formed. Solubilize vWF polypeptide by the following steps: went. p7E and pJD18 extracts were solubilized as described in Example 2. responded very differently to the procedure. Properties of inclusion bodies and successful manipulation strategies For a general discussion, see Maniatis T. et al., Molecular Cloning, 2nd ed. , Volume 3, No. 17. Chapter 37 (1989), Cold Spring Nova See Laboratory Press, Cold Spring Harbor-1NY. Can be done. Cells were isolated by centrifugation at 4000g for 15 minutes at 4°C in a JA-140-tar. was recovered. The pelleted cells were dissolved in 50 ml of water-cold buffer (0.1M NacI, 10mM) lis pI (9,0,1mM EDTA) and incubated at 4°C for 40. 00 The cells were re-pelleted by centrifugation at .g. p7E, p? Cell pellets from D and pJD18 cultures were added to 5 ml of lysis buffer. Each was redissolved in a liquid and kept on ice for 30 minutes. The lysis buffer is sucrose 25 % (w/v), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1mM ethylene di-rminated triacetic acid (F, DTA), 2mg/m! Rizochi and 50mM)'JS hydrochloric acid (adjusted to pH 8.0). ; After incubation for 30 minutes, 1. 0 mol both MgCl2 and MnC+2 10 mM of each cation was prepared. then 60μ g of NDAsel (Burlinger Mannheino,) and incubated for 30 min at room temperature. Continued incubation. Then 20ml of buffer number 1 (0,2M NaCl, 2mM EDTA, and 1% (W/v) 3-[(3-thalamidepropyl)-dimethylammonio]-1 -B [7 pansulfonate (C) (APS), 1% (w/v) non-ideal (Non-idet) 40 and 20mM) lithium-hydrochloric acid, pH 7.5). and added to the cubate mixture. 14,000g (12. 00Orpm>, pellet insoluble material by centrifugation for 30 minutes at 4°C. Sazeta. each culture (which contains the desired polypeptide, except in the case of p7D) The relatively insoluble pelleted material derived from Number 2 (0.5% (w/v)) Lydon X-100 surfactant, 2mMEDTA ,0. 02M) IJS Washed in hydrochloric acid, pH 7.5>, and thoroughly treated with portex. did. After centrifugation of the turbid material at 14,000 g for 30 min at 4°C, the supernatant was discarded. Pe Re-turbidize the pelleted material in buffer number 2, portex, and centrifuge. The process was repeated twice. Each pellet was then washed with 5n11 $I buffer solution number 3 (0,02M) IJ. Wash at 25°C in hydrochloric acid, pH 7.5 and 2mM ED'rA) and hydrate thoroughly. x treated. 14. The suspension was then heated at 4°C for 30 minutes. Centrifuge at 000g, Then discard the clear liquid and remove the mixture of inclusion body inducers, which has a slime-like consistency. ("wet pellet") (hereinafter referred to as the final step of F and its alternatives) In this regard, reference may also be made to Example 20 which shows a further improved procedure). Gradually redissolve the insoluble pellet in an 8 molar urea solution kept at room temperature for 2 hours, OJ solubilization was then continued at 4°C overnight. 20mM Hebes (N-[2-hydroxyethyl 0 containing Chil 1 Piperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]) (pH 7,4) ．． Urea soluble at 4°C in a solution of 15M NaCl (“Hepes buffered saline solution”) The substance was thoroughly dialyzed. Solubilized peptide extracts were assayed for purity (Example 2) and vWF binding inhibition It was used in the assay (Example 3) or subjected to further purification. Further refining steps are delayed samples should remain cool. vWF polypeptide without cysteine (subunit positions 441-733) ) constitutes 75% or more of the material solubilized from the inclusion bodies by the above procedure. Ru. 6M Guanidine HCI, 50mM) Lis 1 (CL) pH 8,8 After re-dialysis of the purified peptide extract, 6M urea, 25mM) IJSHC I, 20mM KCl, 0. Dialyzed against 1mM EDTA, pH 8.0. Further purification of the cysteine-free mutant vWF polypeptide was performed. . Q-Sepharose 3 Fast Flow (False) was then used for anion exchange. Macia, Upsala, Sweden) and analyzed the extract using high-performance liquid chromatography. Offered to Rafi. 6M urea, 25mM) Lis HCL 20mM KCl, 0. 1m The column was pre-equilibrated with MEDTA, pH 8.0. vWF polypepti For second elution, the same buffer was used except that the concentration of KCI was increased to 250 mM. did. Polypeptide samples used for further assays were prepared at 0. 15M NaC Redialyzed against 1,20mM Heves, pH 7,4. However, long-term storage , urea buffer (6M urea, 25mM) Lis HCL 20mM KCl, 0. 1mM EDTA. Best achieved at pH 8.0). Final p7E-vWF polypeptide %A The amino acid composition (by acid hydrolysis) is in close agreement with the expected value from published sequence information. In close contrast to Ponceron Di et al. and Mankutu Di et al. in Example 1, supra. (see also Figure 1). Expression plasmid p7E, p? Extracted from inclusion bodies of cultures containing D and pJD18. The urea-solubilized and dialyzed polypeptide was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. (PAGE) J and immunoplotting. Characterization by SDS polyacrylamide gel electrophoresis 10% acrylamide Using concentration, Laemli, N.K., Natu Weber K. re, 227:680-685 (1970). (Weber, K., et al., J. Biol. Chem., 244:4406-4 412 (1969) modified sodium dodecyl sulfate polyacrylic 7' midgel electrolyte. Expression plasmid extraction using a pneumophoresis procedure and dialyzing for 4 min after urea solubilization The purity and properties of the product were first analyzed. Coomassieble this resulting gel. The results were compared by staining using Expression plasmid p? The extract from E. has an apparent molecule of approximately 36,000 Daltons. Mutant Phono Willebrand Factor polypeptide that migrates in large amounts as the main component include. The polypeptide was run under reducing conditions (a buffer containing the same concentration of DTT). Apply 10”loOmM dithiothreitol rDTTJ to the sample for 5 minutes before washing. (added at 00°C) and under non-reducing conditions, it appears as a single band. , which is consistent with the substitution of glycine residues for all cysteine residues in it This is the result. As expected from the opposite orientation of the vWF cDNA insert, VW The F polypeptide is p? D cannot be extracted from host cells containing the expression plasmid. It was. p,, JT) Contains 18 plasmids with 52/48 fragment wild type amino acid sequences. (represented here by residues 441-73:3 cloned fragment) The cysteine-containing vWF polypeptide expressed by and non-reducing conditions-FC behaved differently. r, the wild-type sequence expressed from JDl 8 The column forms silver disulfide bridges and consequently enters a 10% acrylamide gel. It is not possible to give large molecular weight aggregates. reduction (using loOmMDTT) After 5 minutes of incubation at 100° C., the vWF peptide is approximately 38. 0 It migrated as a single band with a molecular weight of 0.00 to 0.00. Characterization by immunoplotting Barnett et al., A. Anal, Biochem, 112:195-203 (1 981) and as recommended by the reagent supplier. , p7ESp7DJ5 and pJD18 were immunoplotted. The cells were further characterized by Western blotting ([Western blotting]). host cell Urea solubilization and dialysis of (containing p7E, p7D and pJD1g plasmids) A sample containing approximately IO μg of protein from the inclusion body extract was treated with a 2% concentration of Dode A 10% polyacrylamide gel (Raemili Ni) in the presence of sodium silsulfate - K., Nature, 227+680-685 (1970)). I submitted it to the movement. Proteins on nitrocellulose sheets (Schreibel & Schuell, Koehne , NH) and then visualize the pattern using immunoreactivity. It became. Fono Willebrand (derived from mice) used to identify polypeptides The factor-specific monoclonal antibody was R(, -46 (Pug i Mura, Y.) et al., J. Biol, Chem, 261 (1): 381- 385 (1986), Fulcher, C, A ) et al., Proc, Nat 1. Acad, Sci, UsA, 79:1648 1652 (1982)), and NMC-4 (Shima, M,) et al., J, Nara Med, As5oc, 36:662-669 ( (1985)), both of which are within the expressed vWF polypeptide of this invention. has an epitope. Fraker, P.J., et al., Biochem, Biophys, Res, Commun, 80:849-857 (1978 A secondary antibody (+25 1 rabbit anti-mouse IgG) labeled by the method of The cells were incubated on a cellulose sheet for 60 minutes at 25°C. After rinsing, The sheets were developed by traradiography. Peptide extracts from host cells containing p7E and pJD18 expression plasmids were , strong immunoreactivity for RG-46 antibodies, and weak immunoreactivity for NMC-4 antibodies. shows a clear affinity. As expected, the peptide from the r+7D plasmid The extract showed no immunoreactivity for either RG-46 or NMC-4. stomach. Extracted from the poison of Bothrops jararaca Botrocetin (botrocetin) is a multimeric phonostimulant for platelets. ・Modulating in vitro binding of Willebrand factor Read et al., Pro. c, Natl, Acad, Sci. 75:4514-4518 (1978)), and botrocetin (mature saline) ) amino acid sequence position of the unit,! vWF in that area containing 441-733 , thus has been shown to bind to the GPIb binding domain. (Ant Reuse RK (Audrews, R, Kj et al., Biochem i s t ry, 28: 8317-8326 (1989)). From cultures containing expression plasmids p7E, p7D and pJD18 (from Example 1) The urea-solubilized and dialyzed polypeptide extract obtained (by the method) was inhibits botrocetin-induced vWF binding to formalin-fixed platelets on a sexual basis Its potency was tested without further purification. MacParlane, D. et al., Thromb, The method of Death, Haemorrh, 34:306-308 (1975) Formalin-fixed platelets prepared by pJD18, p7D and p7E were 1 at room temperature with specific dilutions of peptide extracts obtained from cultures containing Sumid. Pre-incubated for 5 minutes. 0. Botrocetin at a final concentration of 4μg/m+ (Sigma, St. Louis, MO) and 1251-labeled multimeric vWF (Furchel ・C-x-et al., Proc. Nat 1. Acad, Sci, USA, 79:1648-1652 ( It was isolated from human plasma cryoprecipitate by the method of I et al., Biochem, Biophys, Res, Cornmun, 80:8 49-857 (197g)) was then incubated and mixed. The amount of "51-vWF bound to platelets was measured." Defined as the amount of I-vWF bound in the absence of added peptide extract 12'I-vWF binding to -C1 platelets was compared to 100% binding. did. Figure 2 shows peptide extracts from expression plasmids p7D and p, JD18. (reduced -C and not r-rukylated) binds platelet Gr'Ib receptors. shows that it cannot compete with plasma-induced vWF for binding sites. Plasmid p7E? In inhibiting vWF binding, the peptide extract of /ml) in a dose-dependent manner. Incubate mixture The concentration of urea + iJ-solubilized polypeptide extract in the compound (μg/ml) is The total protein 'R'ei derived from the protein is reflected. Peptide extraction on reaction mixtures Some non-specific effects occur due to the addition of 110% of the value observed in the absence of added peptide extract. used The I25-IvWF concentration was 2 μg/ml. Using the procedure of Example 1 with the following modifications, mutant vWF polypeptides were prepared. fragment (corresponding to the mature vWF subunit sequence from residue 441 to residue 733) was prepared, in this case at position 459. 462. 464. 471 and 474 series Each stin was replaced by a glycine residue. Cystine residue is at position 50 9 and 695, allowing the formation of anterograde disulfide bonds. Site-directed mutagenesis was performed only with oligonucleotide numbers 459 and 471. , which results in position 459. 462. 464, 471 and 474 only Replaced with lysine codon. Upon completion of the mutagenesis procedure, the -heavyweight dideoxy method was used. was used to confirm the sequence of the mutant vWF cDNA. By treatment with EcoRI and HindllI restriction endonucleases, vWF cDNA insert in double-stranded form (containing 5 cysteine to glycine mutations) ) was then removed from the ML3mp18 phage and assembled using the BamHI linker. Modified as in Example 1 and cloned into r+ET-3A. Formed in this way The pET-3A carrier is referred to as rp5EJ or p5E expression plasmid. do. Hanahan D., J., Mo1. Biol, 166. 557-580 (1983 ), the p5E expression plasmid was transferred to ampicillin-susceptible E. coli strain B. It was subsequently cloned into L21 (DE3), Novagen, Magilan, Wl. Solubilization of inclusion body pellet material in the presence of 8 molar urea for the first 2 hours at room temperature. (at this point the redissolved material should be at a concentration of 200 μg/m The p5E mutant polypeptide was added according to the procedure of Example 1, except that the concentration of I was reached. It was expressed from a culture of E. coli BL21 (DE3). disulfide bond Oxidation of cysteine residues 509 and 695 to form This was done by dialysis overnight. Anterodisulfide bond instead of Chinma The formation of thiol oxidation at low protein concentrations, e.g. 50-100 μg/mI It will be advantageous to advance the process. Final purification of the urea-solubilized inclusion body preparation was carried out as in Example 1 suitable for p7E extracts. , dialysis against 6M guanidine and 6M urea buffer, followed by anion exchange filter. It was done by romatography. Mutant phonovirus produced by a culture containing the expression plasmid p5E The Rand factor polypeptide was characterized using the procedures of Example 2, specifically for plasmid compared with the vWF fragment expressed by p7E. Urea solubilized and dialyzed polypeptide extracted from inclusion bodies (according to the procedure of Example 4) ) from a similar extract from the p7E plasmid made as in Example 1. compared with. Characterization by SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed using the modified dodenle of Example 2. using a sodium sulfate gel procedure and using cysteine residues 509 and 695. A p5EvWF fragment that can form disulfide bonds and a cysteine residue. The p7E fragment was compared with the original p7E fragment. Reduced (100mM dithiothreitol) and non-reduced 7.5 μg of protein extract per lane on a 10% acrylamide gel under original conditions. Electrophoresis was performed using Under reducing conditions, after staining with Coomassie blue, p7E and p5E The extracts have identical electrophoretic mobilities. However, in electrophoresis under non-reducing conditions, residues 509 and 695 are involved. The effect of disulfide bonds is shown. A substantial amount of p5E extract is added to the gel. The amount of tin contained in a high molecular weight complex (due to disulfide bonds) is very low. 1. A densitometric scan of the gel of the starting preparation showed that it was visible on the non-reducing gel. p5E, 'j'! Approximately 25% of the 'J peptide material is approximately 38. 000 look? 441-733 fragment monomers with a molecular weight of urea solubilization, dialysis, and 50% to favor intrachain disulfide bond formation rather than Perform Ft-ru oxidation at even more dilute protein concentrations, such as ~100 μg/ml. This significantly improves the percentage of monomers present in the p5F extract. can. This p5E monomeric species has no cysteine residue under non-reducing conditions. It has a slightly higher mobility than the resulting p7E product species. These p5E and The mobilities of the p7E monomeric 38 kDa species are found to be identical under reducing conditions. Slight promotion of polypeptides retaining tertiary structure in the presence of SDS under non-reducing conditions The resulting mobility was determined by the anionic surfactant under the above conditions. When compared to the mobility of a homologous polypeptide that completely transforms into a rigid rod in minutes, This is generally considered to suggest the presence of anterograde disulfide bonds. Characterization by immunoplotting The behavior of p5E and p7E extracts was also investigated using immunoplotting methods. . As in Example 2, vWF-specific murine monoclonal antibodies R (, -41 and N MC-4 was used as a probe. RG-46 is a mature phono Willbran Within the factor subunit, a linear sequence of amino acids consisting of residues 694-708 is has been shown to be recognized as an epitope. this antibody against that determinant The binding of is mainly conformationally dependent. Mori et al., J. Biol. Chem, 263(34):17901-17904 (198g). However, NMC-4 has the glycoprotein Ib binding site as its epitope. It has a domain of the Fono Willebrand factor subunit. epitope By mapping, this results in two discontinuous domains (typically mature vWF subunit residues 474-488 and similarly (consisting of residues 694 to 708) et al., supra), disulfide bonds conferring this tertiary conformation in the original vWF molecule. It was not known whether the match was forward or backward. Same No. 17903 page. (of protein) 7. 5 μg of sample was run on a 10% SDS polyacrylamide gel. This allows the detection of specific bands (under M and non-reducing conditions). The genic behavior could be compared with the results obtained above by Coomassie blue staining. Immunoplotting was performed as in Example 2, p5E and p7E extracts compared. Application of antibodies to nitrocellulose sheets is usually done using an antibody solution prepared as follows. This was done using B lymphocyte hybridoma produced NMC-4 or R (, -46 mice were injected with Ascites fluid from peritoneal tumors was collected, typically approximately Contained 5 mg/ml monoclonal antibody. Ascitic fluid (1 per 1000 Part) Block fluid (PBS containing 5% (W/V) non-fat dry milk, carnajo (2000) to minimize non-specific background binding. Antibody-containing block The fluid was then applied to the nitrocellulose. -Heavy chain p5E polypeptide fragment (residues 441 to 733) under non-reducing conditions. (representing the column) similarly represents the primary sequence of residues 441-733 and was isolated from p7E. binding parent to NMC-4 compared to comparable cysteine-free species. It showed an increase of approximately 120 times that of the total power. Under non-reducing conditions (using 100mM DTT) After electrophoresis in NM (, -4), -terminal p5E species were significantly reduced relative to NM (, -4). This indicates a small parent tree strength, and thus this It was very similar to that of the pIE species that did not contain stain. Reduction or non-reduction Under reducing conditions F, NMC-4 also eluted disulfide-linked dimers from p5E extracts. It cannot be recognized as a pitope. Nitrocellulose used to prepare NMC-4 based autoradiographs First NMC1f filter! response (combined with low antibody titers and short exposure times) The search was re-searched on RG-46 by reducing the Fi Binding of RG16 to the p7E36,000 kDa polypeptide on is the same regardless of the reducing or non-reducing conditions chosen and is consistent with the expressed polypeptide. The results were consistent with the replacement of all cysteines by glycines. A large amount of vWF antigen (reactive for RG-46) is present under non-reducing conditions. and is present in p5E polypeptide extracts. These p5EvWF aggregates (tin content (reflecting disulfide bonds) at the same position as the p7E polypeptide under reducing conditions. The large p5E interchain disulfide aggregates that are easily recognized under non-reducing conditions F are Not recognized by NM(,-4) in either reducing or non-reducing conditions. Thus, the difference between residues 509 and 695 in the original multimeric vWF subunit Sulfide bonds are shown to represent intrachain contacts. Monoclonal antibody LJ-1bl is a Fono Willebrand factor-platelet glycoprotein. It is known to completely inhibit white matter 1b interactions. Handa M (lla) nda. J. Biol. Chem. 261 (27): 12579-1258 5 (1986). This is the amino-terminal 45k of GPIbα that contains the vWF binding site. Reacts specifically with Da domain. Vicente Bui (Vincente, V, ) et al., J. Bio-1, Chem, 265:274-280 (1990). To evaluate the inhibitory activity of p5E extract on antibody binding, the absence of p5E extract First select the concentration of L, 1-1b1 that can give half the maximum binding in the presence of Ta. l125'J6 and Iodogen from Amajam, Arlington Hiso, IL (lodngen) (Bielse Chemical Co., Rockford, IL) , Fraker Dzi et al., Biochem, Biophys, Res, Commun, 80:849-857 (1978). l was iodinated. Jirsch et al., Br, J., Haemajol, 36,281- Washed platelets were prepared by the albumin density gradient technique of 298 (1977). , used at a count of lXl0@/ml. half of the maximum of antibodies against platelets Binding was observed at an LJ-1bl concentration of 10 μg/mI, and this concentration was selected for peptide inhibition studies. 6. Q-Sepharose 5 chloride after dialysis against 0M guanidine and urea solution. Example involving final purification of a urea-solubilized inclusion body preparation by performing matography The p5E polypeptide extract was purified by the procedure of 4. To evaluate binding, LJ-1bl (10 μg/mN and as shown in Figure 3) was used. at 22-25 °C using a concentration of purified p5E protein (0.002-1010 μmol). Platelets were incubated for 30 minutes. 2μg/m+Botrocetin, Sigma Ke Michal, St. Louis, MO (Figure 3, black circles) and in the absence of botrocetin. Inhibition is plotted in the presence (open circles). as determined by binding competition experiments in the presence of a 100-fold excess of unlabeled LJ-1bl. As a result, less than 5% of the +251 label bound to platelets is other than LJIbl. This was due to the contribution of the labeled substance. background indicators from data points Expressed as a fraction. “ILJ-1b” against platelets in the absence of botrocetin 50% inhibition of p5E polypeptide was achieved with lOμM of p5E polypeptide, whereas 50% inhibition of In the presence of rosetin (2bg/m+), 50% inhibition is 0. Achieved at less than 1μM can be done. Botrocetin is a circulatory polypropylene unit von Willbran. binding to the GPIbα receptor in the factor and its single subunit It is known to induce conformational changes that enhance or allow for. This example: The p5E polypeptide (containing intrabutton cysteine 509-695 bond) is modulated by botrocetin. - Shows that it behaves very similar to Willebrand factor. Therefore the structure physical similarity is shown. This example shows the amino terminus of residue 441 (arginine) and the amino terminus of residue 730 (arginine). The mature vWF”j unit fragment with the carboxine terminus of Nocragin) 441 conditions under which the encoding DNA sequence can be expressed and have its original tertiary structure. ~? Cultured mammalian glycosylated homodimeric forms of 30vWF fragments 2 is an illustration of secretion from a host cell. 116kD using a DNA construct combining the following structural elements in the 5'-3' direction. Expression of a homodimer (referring to coding or non-transcribed species): (Δ) eukaryotic co Census translation initiation sequence, CCACCl and (t3)vWF signal peptide the starting vWF methionine codon followed by the remaining 21 amino acids of (C) Corresponding to the first three amino acids from the amino-terminal region of the vWF propeptide. code sequence, and (D) Conid sequence of vWF-γ amino acid residues 441-730, and (I’:) rT (’, Δ” translation stop codon. Preparation of cDNA clones from Brebrophon Willebrand factor mRNA A cDNA clone encoding the prepro-vWF gene, pvWF, was created by Dennis Li. From Dr. Nchi, Dakar-Faba Cancer Incubate, Boston, MA Retrieved from Lynch-D.C. et al., Cel 1. 41. 49-56 (198,5 ) was prepared as described. Preparation of pvWF was described in Example 1. Primer-directed amplification of cDNA, step I As described in Example 1, Saiki, R. et al. , 5science, 239:487-491 (1988). The cDNA representing the full-length Bramble vWF gene from P64 was subjected to polymerase chain reaction. It was subjected to enzymatic amplification in the reaction. Model 380B automated equipment for PCR amplification , Applied Biosystems, Foster City, CA; Ruamidite method, Sinha et al., Tetrahedron Letters, 24: 5843 (1983), the following oligonucleotides were synthesized. Oligonucleotide (7) - SEQ ID NO: 8 Reference oligonucleotide (8) - Sequence Reference number: 9 In designing the oligonucleotides used here, preprov Established nucleotide sequence of the WF gene, Pongsuron Di et al., Nuc 1. Ae i dsRes, 14 (17): 7125-7127 (1986 ), 7:'Koutudi et al., J. Biol, Chem, 264 (33): 19 514-49527 (1989). oligonucleotide (7) to the start methionine codon of the vWF cDNA. 5a11 fused 5′ to the preceding eukaryotic Consensus translation initiation sequence (CCACC) Restriction sites were generated. Kozak M, Ce1l, 44:183-292 (19 86). Oligonucleotide (8) has a 7% identity in the non-transcribed (coding strand) of vWF cDNA. approximately 360 base pairs from the starting methionine of preprovWF cDNAΔ. , thereby (at residues 120 and 121 within the preprovWF cDNA sequence) Overlaps the nucleotides spanning the bal restriction site. Therefore, by polymerase chain reaction, (reading from 5' to 3' on the coding strand) ) Sal IB position, consensus start sequence, start methionine codon, Signa codon sequence of the propeptide followed by the Xba1 site A cDNA fragment containing the first 100 codons was synthesized. Insertion of cDNA into M13mp18 cloning vehicle 5ail and XbaI Use restriction enzymes to create multiple clones with compatible 5alI and Xba1 sequences. The double ti-replicated form of batatteriophage M13mp18 containing the amplification site The resulting cDNA fragment was then inserted. The result obtained is r+AD1 known as. Regarding the properties of 5ail and XbaI restriction enzymes, Allan J.R. et al., J. Mol. . Biol, 118:127-135 <1978') and Zain varnish varnish (Zain, S. S.) et al., J. Mo1. Biol, 115:249-255 (1977). Single-chain dideoxy methodology (→J Tsugar -F et al., Pr. c, Natl, Aead, Sci, USA, 74: 5463-5467 ( The vWFcDNAΔ insert was completely sequenced using The NA fragment was confirmed to contain the correct vWF coding sequence. Primer-directed amplification of cDNA Stage 1 II Mature vWF amino acid sequence 441-732 The cDNA corresponding to was subsequently amplified by polymerase chain reaction. For amplification, all A pvWF clone encoding the Breflo vWF gene was used. Also, new Man B.J. et al.1. J, (, Iin, Invest, 82 Near 39-74 3 (198g), corresponding to mature subunit residues 441-732. cDNA can be prepared from platelet mRNA and then directly amplified. Appropriate flanking oligonucleotides were synthesized as follows: Tido (9) - SEQ ID NO: 10 Reference oligonucleotide (IO) - SEQ ID NO: 11 Reference or The ends of the double-stranded vWF cDNA fragment produced were then repaired using BamHI linkers. 265:82-84 (1 977)), digested with BamHI and inserted into the BamH1 site of pADl. (This site is directly downstream (3') of the Xba I site). The resulting output The lasmid was named pAD2. Loopout mutagenesis of pAD2 Site-directed (loop-out) mutagenesis is then performed to separate the first and second inserts. Synchronize the reading frames with the target and simultaneously synchronize all propeptide codon sequences. (except those encoding the first three amino-terminal residues of the propeptide) and The remaining bases between the XbaI and BamH1 sites were deleted. As a loop-out primer, the four carboxy-terminal amino acids of the signal peptide acid residues, the three amino-terminal residues of the propeptide, and the mature vWF subunit. The following oligonucleotides encoding amino acid residues 441-446 of the sequence were used. used. Oligonucleotide (11) - SEQ ID NO: 12 Reference Kunkel T.N., Pr. oc, Nat 1. Acad, Sc, USA, 82:488-492 ( Looping out of undesired nucleotide sequences was performed according to the procedure of (1985). . This procedure consists of a series of conditions that utilize selected conditions for uracil-containing DNA templates. Steps include: (A) M13mp18 phage (consensus translation initiation sequence Generally, the first 121 amino acids of the cDNA, signal peptide, and propeptide corresponding to amino acid, residual intervening M1:3mp 18 polyline force sequence, and mature subunit corresponding to sequence residues 441-732) in uridine-rich medium. The E. coli C, J236 mutant was grown in the duung-pillar. This e- coli strains are deficient in deoxyuridine triphosphatase (dut, d An intracellular pool of UTP accumulates, which competes with dTTP for incorporation into DNA. match. (Shiromay J et al., J. Biol. Chem., 253 (9): 3 305-3312 (1978)). Will synthesized under these conditions The viral genome contains some uracil and uracil glycol. E. coli that cannot remove uracil, such as cosylase-deficient (ung-) strains. It is stable only in restocks. Uracil-containing nucleotides are uracil glycosyl single-stranded (') MI 3mp1 in the ung' strain due to certain incompetence sites caused by ．． 8 DNA is lethal. (T3) Culture medium in which phages were grown in E. coli strain CJ236dut-ung- Isolate single-stranded (゛) viral DNA from the culture medium. Single-stranded (゛) form of virus contains a specific vWF cDNA at its multiple cloning site. This cDNA , equivalent to transcribed vWF cDNA #A. (C) Then oligonucleotide (11) is applied to the single domain (゛) phage DNA. and annealing in vitro, thereby looping out undesired sequences. Generally, a wide range of oligonucleotide concentrations are appropriate for this procedure. typical 40 ng of oligonucleotide and 0.0 ng of oligonucleotide. 5-1. 074g M13mp Anneal to 18 phage (') DNA. (D) Then T in an environment containing dTTP, dGTP, dATP and dCTP. M13mp18 using T) NA polymerase and T, f) NA ligase. All missing sequences of the (-) strand are completed in vitro, thereby Generate a chimeric vWF cDNA sequence with no intervening sequences. (E) now thymine usually (-) chain and (') in < some uracil substitutions single-stranded M13rnpI8 phage containing Wild containing uracil glycosylase and deoxyuridine transferase Transformed into type E. coli XL-1 Blue (Stratagene, U. Jora, CA) strain. exchange. (F) Uracil glycosylase and other enzymes present in the new host are double-chained. Starts destroying the uracil-containing (゛) chain of the phage, and the remaining phage (-) chain D After replication of the NA in the host, a stable thymine that reflects the desired deletion is usually double-stranded ( RF) leading to the existence of DNA. Upon completion of the mutagenesis procedure, the vWF cDNA insert The sequence of the sample was confirmed using the single-stranded DNA dideoxy method. (Sanger E. Fura et al., supra). A second mutagenesis procedure according to steps (A) to (F) above is performed, and the translation stop codon (T GA) and an Xba I restriction site (TCTAGA) were added to the cDNA insert. . Similarly, it was synthesized by the phosphoramidite method, and the Ml3mp18 transporter sequence and Oligonucleotides that also contain sequence homology at their 3' ends are as below. A stop codon was added after residue 730. Oligonucleotide (12) - SEQ ID NO: 13 reference Sa I - Xba I insertion The final Ml3mp18 recombinant containing the desired construct as input is pAD3. It was named -1. In addition to the Xba I site generated 3′ of the stop codon, the 5ai There is an Xba1 site in the bone IJ 17 region of M13mp18 directly 5' of the l site. Exists. The vWF insert was resequenced by the dideoxy method to determine the composition of the components. and confirmed unity. 5alI-Xba of pAD3-1 into pBluescriptIIKS(-) vector Cloning of l fragment The 5alI-XbaI fragment was then extracted from pAD3-1 (XbaI-XbaI fragment p-bluesc (as contained within) and pre-digested with XbaI. inserted into the LyptoIIKS(-) vector (Stratagene, U. Jora, CA). . p blue x ri’) b) I IKS (-) c, The xho1 restriction site is 5' and the N is directly 3' to the XbaI insert. Contains the ot1 site. Resulting plasmid selected as having proper insert orientation was named pAD3-2. In addition, the SaI-XbaI fragment itself was removed from pAD3-i, and the 5alI-XbaI fragment itself was removed from pAD3-i. and pBluescript, which may be pre-digested with Xba I restriction enzyme. It can be inserted into the IIKS(-) vector. The resulting plasmid < pAD3-2) also contains an XhoI restriction site that is directly 5' to the 5alI site. and a Not1 site that is directly 3' to the Xba1 site. child The species constructs (see below) are also suitable for insertion into the pCDM8'' vector. Construction of plasmids for integration into mammalian cells Aminoglycoside antibiotics A resistance-based selection procedure is then used to transform the vWF expression plasmid. The bodies were selected sequentially. pCDM8 vector (B. Seed et al., Nature, 329:840-842 (1987) and available from Invitrogen, San Diego, CA. ) is Dr. Timothy O'Toole, Scripps Clinic and Research Foundation Yong Woo Jo The neomycin resistance gene (phosphotransferase TI>, which was part of a 2000 base pair BamHI fragment. and cloned into the BamHI restriction site of pCDM8. BamHI insert The parts are indicated by arrows in FIG. Produced by the neomycin (neo) gene The protein to be produced is geneticin sulfate RG418 (Gibco/Life Chiknoroses Co., Ltd.). , Gaithersburg, MD) versus other aminoglycoside antibiotics. Also gives resistance. ne. The gene is derived from the Tn5 transposable element and is widely distributed in prokaryotes. Rewi Ewin, J.), [Gene], 3rd edition, p. 596, Riley ・Andring (1987). In the final construct, the neo gene is SV40 early is under the control of a promoter. Several other suitable expression vectors containing neomycin resistance markers are commercially available. pcl) NΔ1neo (Invitrogen, San Diego, CA), Rc/C MV (Invitrogen, Zunjego, CA) and pMAM”’ (Cronchich) (Barro Aldo, CA). These other expression plasmids as needed vWF fragments can be variously restricted or modified to enhance their ability to be expressed in Ru. Therefore, pAD was added to pCDM8″@0 restricted with Xhol and NotI. The Xhol-Notl fragment of 3-2 was inserted. Hanaman D., J., Mo1. Biol, 166. 557-580 (1983), the resulting -r novicillin-susceptible E. coli strain XS-1 using the ligated DNA mixture 27 cells (Invitrogen, San Diego, CA) were transformed. Restriction mapping and DNA sequencing of plasmids from the resulting colonies Colonies containing the intended insert were identified by determination. This type of suitability One of the cut plasmids (named pAD5/WT) was inserted into E. coli strain xs-i2. 7 and selected for mammalian cell transformation procedures. Alkaline cell lysis step, Birnboim, before use for transformation of mammalian cells. ・Ecchi C (Birnboim, LC,) and Dolly Jay (Doly, J, ), Nucleic Ac1d Re5each, 7:1513 (19 79), the supercoiled plasmid (pAD5/WT) was transferred to host E. coli. Recovered from Li, and later Maniacais T. et al., “Molecular Cloning”, 2nd edition, vol. 1. 42 pages, Cold Spring Harbor Laboratory Press (198 Purification by C9C1/ethidium bromide equilibrium centrifugation was performed according to 7). Transformation of Chinese Hamster Ovary Cells Standard Calcium Phosphate Mediated Traits By the transfer procedure, pAD5/WT was transferred to CHO-Kl Chinese hamster ovary cells. cells (ATCC-CCL-61). Chen, C. et al., Mo1. Ce11. Biol, 7 (8 ):2745-2752 (1987). 1O% Thermophilic Activated Fetal Bovine Serum C3), 0. 5mM of each non-essential amino acid ( NEAA Sublument, Lightstakers, Walkersville, Maryland (M D)) and Dorbecos modified Eagles medium supplemented with 2mM L-glutamine. Ground (DMEM) (Gibco/Life Chiknorrhea, Inc., Gaithersburg, ME) CHO-Kl cells were grown in a 5% CO2 atmosphere at 37 °C in Leland, MD. grown and then subcultured for 24 hours, followed by 1°5 per 60 mm tissue culture dish. Transfected at a density of X10' cells (approximately 25% confluence). CHO-Kl cells are It has a doubling time of approximately 16 hours in DMEM/10% FC3 under these conditions. To complete the transformation, Birnboim H.C., Dolly J., and Nu cleic Ac1ds Research, 7:1513 (1979) The pAD5/WT plasmid was isolated from a culture of E. coli strain XS-127 by were collected. Cheno et al., each 60 m 10 μg of plasmid was applied to m dishes of cells. After inoculation with plasmid Cells were grown I) in MEM/10% FC3 for 8 h at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. Maintained. Then phosphate buffered saline, 137mM NaCl, 2. 7mM KCl, 4°3 mMNa, HPO, 7H20/1. 4mM KH, PO, pH 7,4 (rPB Remove the growth medium with a solution of 10% (v/v) glycerin (denoted as S). I changed it. Cultures were then maintained in glycerol-))BS for 2 min to ensure the efficacy of transformation. Ausukel et al., eds., Modern Hands in Molecular Biology. "Order", No. 9, 1. See Riley and Ring (1987), page 3. ). After 2 minutes, the glycerin-PBS solution was replaced with DMEM/10% FC3. After approximately 24 hours of growth at 37'C in a 5% CO atmosphere, cells were cultured as follows. Treated with pushin. 8 dishes of growth medium were mixed with 1 ml of 0.0 ml of PI35. 25% trypsin Replaced by. Trypsin treatment was carried out for 3 minutes. Remove the trypsin-containing medium. then place the dish in the incubator for an additional 15 minutes, then add 10% bovine fetus Cells were resuspended in DMEM containing serum. Cells from 8 dishes were then split 20x. Split and plated at a density of 3X10' cells/60mm dish (approximately 5% confluence) . Then ('iQmm 0. Genetic to a concentration of 8mg/ml:/”G4 By adding 18, stable transformants incorporating plasmid DNA can be produced. gave birth. Growth was continued for 14 days at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Black Transfer surviving independent colonies to a 12-well plate using a ring ring and then Further in DMEM/10% I"C3 supplemented with 0.8 mg/ml Geneticin 5. It was grown for 70 days. Under these conditions, 3-7 viable colonies per plate was observed after 10-14 days. The plate density of the assembly is 50-70% and the original is about 5XI Approximately 100 stable transformants were isolated from each original 60mM dish containing the O' snout. I can do something. 50-70% of G4+8 resistant cell lines mature at 441-730 Produce unit fragments. Due to the built-in specific geometry of each clone. Therefore, expression in all cases is thought to be prevented. stable transformants was then cultured in a medium containing geneticin sulfate "G418" (8 mg/ml). It was always maintained and subjected to continuous selection. 10mM) Lis HCI, pH 7, 8, 150mM NaCl, 5mM EDTA11 0mM benzamidine, 1mM PMSF, 1% <w/v) Non-Idet 40 ( Octylphenol-ether containing an average of 9 moles of ethylene oxide and 1 mole of phenol tyrene oxide condensate), sigma, St. Louis, and MO. Len, Methods in Enzymology, 152:684-704 (1987)), dot plots on nitrocellulose. Colonies expressing recombinant 440-730vWF polypeptide were determined by analysis. Detected. RG-46 (Tsugimura-Y et al., J. Biol. Chem., 261 (1): 3 81-385 (1986) and Furchiel C. N. et al., Proc, Na tl, Acad, Sci, USA, 79:1648-1652 (19g2 ) was used as a wiping body. Fraca P.G. et al., Biochem , Bi. Phys, Res, Commun, 80:849-857 (1978) A secondary antibody (125I rabbit anti-mouse IgG) labeled by the method was added to nitrocellulose. The ink was incubated for 60 minutes at 25°C on a glass plate. After rinsing, turn off the nitrocellulose. Colonies expressing vWF fragments were developed by radiography and identified. Secretion of Willebrand Factor Fragments into the Culture Medium by CHO-Kl Cells Secretion of the 441-730 mature vWF subunit fragment was determined by immunoprecipitation of the culture medium and Confirmed by immunochromatography. The assembled transformed CHO-Kl cells were rinsed three times with PBS to remove bovine vWF; The ink was then inked for 16 hours at 37°C in a 5% CO2 atmosphere in DMEM without FC3. It was incubated. For a 5 ml volume of culture medium, add 100 mM) Squirrel HCI, pH 7. ゜5. 1. 5M NaCl, 10mM EDTA and 10% (w/v) non-ideal 1710 volumes of IOX immunoprecipitation buffer (10 x l PB) consisting of 0.5 ml) was added. Bovine vWF-induced polypeptides present in fetal bovine serum It has been established that NMC-4 does not react with NMC-4. After that, about 0. 05 mg of NMC-4 or 0.05 mg of NMC-4 or 0.05 mg of NMC-4. 05mg RG-46 mouse mono Clonal anti-vWF antibody (or 0.0% of broth) 1 mg) at 4°C. It was incubated for 6 hours to form an IgG-VWF complex. In general, chrono Cullen, B. et al., Meth, Enzymology, 152 : 684-704 (1987). protein A (isolated from the cell wall of Staphylococcus aureus) The immune complexes were precipitated by utilizing the affinity of barlow i - (llarlow, B.) et al., [Antibodies, Laboratory Manual J, No. 14- Chapter 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) You can also refer to Protein A-Sepharose 3 beads were purchased from Sigma, St. Louis, MO. did. Then 3MNaC1/1. Immune replication in the presence of 5M glycine (pH 8,9) The aggregates were precipitated with beads and washed twice with 1xlPB before non-ideal precipitation. 40], XIP, B was used once. Weber K et al., J. Biol, Chem, 244:4406-4412 ( 1969) or according to the method of Laemili N.K., Nature, 227 :680-685 (1970) with 10% activation. Immunoprecipitated proteins using lylamide concentration containing sodium dodecyl sulfate Electrophoresis was performed in a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). non-covalent bond Destroy non-reducing and 2% SDS-containing acrylamide gels in sample buffer. Samples of immunocomplexed vWF protein were electrophoresed by heating at ℃ for 5 min. dissociated before movement. Shake off the 4B beads. Discarded. Visualization is performed by Cou-7C blue staining, which allows molecular weight markers to be Approximately 116. The main WF inducer has an apparent molecular weight of 000 Daltons. The guiding polypeptide species were revealed. The protein bands in the duplicate gels were separated using a nitrocellulose sheet (Schreibel & Co., Ltd.). ・Plotted and immobilized on Nyuru Co., Ltd., Kene, N) (), then highly sensitive Patterns were visualized using immunoreactivity by the “Western Blot” technique. . Barnett et al., A. Anal, Biochem, 112:195-203 ( 1981). Seven Willebrand factor-specific monochromes used to identify polypeptides The local antibody (mouse-derived) was RG-46 (Tsugimura-Y et al., J. Bi. 1, Chem, 261 (1): 381-385 (1986), Fulce ・Shi Ni et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 79:16 48-1652 (1982)), and NMC-4 (Sheer M et al., J. , NaraMed, As5oc, 36: 662-669 (1985)) and However, both have epitopes within the expressed vWF polypeptide of this invention. It is something to do. Secondary antibody (12' I rabbit anti-mouse IgG, Fraca BJ et al., Bio chem, Biophys, Res, Comm+in, 80:849-857 (1978) for 6 hours at 25°C on a nitrocellulose sheet. Incubated for 0 minutes. After rinsing, the sheets were examined by autoradiography. Developed. Growth medium from non-transformed CHO-1 cells was grown under the same conditions as RGi6 and N There was little immunoreactivity with the MC-4 anti-vWF monoclonal antibody. The 116 kDa fragment was isolated from Cl-40 using immunoaffinity chromatography. - It can also be isolated from the culture medium of single cells. Sepharose "4B particles" Transformed CHC)-Kl culture plates using conjugated NMC-4 antibody. Recovering 300 μg of 116 kDa fragment from 500 ml of induced culture medium. and tryptic 116 kDa fragments are tryptic 52/4 of vWF, respectively. Mature subunit sequence from residue 449 to residue 728, corresponding to the 8 kDa fragment. previously characterized as a dimer consisting of two identical disulfide-bonded subunits containing Commanded. Due to its bivalent property, the dimeric 116 kDa fragment induces ristocetin. can support platelet aggregation, whereas the component 52/48 kDa subunit (Mo9 H et al., J. Biol. Chem., 264 (2 9):17361-17367 (1989)). One transformant with stable pAD5/WTCHO- and one transformant as a control. [CHO-K] cells were incubated with DMEM/10% FC8 in a 5% CO2 atmosphere. Each was grown to 90% confluence at 37°C. Then PB the 60mm plate. Rinse twice with S and incubate for 24 hours in DMEM (without FC3). continued. The resulting serum-free culture medium is collected and centrifuged and filtered. Instrument, Centricon 30, Amicon, Lexington, 300x (1 (at 8°C). The amount-dependent platelet aggregation curve shows whether pAD5/WT transformed cells are sensitive to platelets. This is the result of the addition of concentrated culture medium from et al. 1 for untransformed CHO- No aggregation was observed in the presence of control culture medium derived from cells. Jirshi Ilalsh et al., Br1tish J, of Hematology, 36:281-298 (1977) using an albumin density gradient. and prepared platelets for assay. Lumi Platelet Suspension (Chronolog Co., Ltd., Hearthstone) Bartown, Pennsylvania (PA)) with constant stirring <1200 rpm ) and monitored aggregation in siliconized glass cuvettes maintained at 37°C. -I did. Aggregation experiments are generally performed by Mor9 et al., J. Biol, Chem, 26 4 (29): 17361-17367 (1989). 20m M Hebes, N-[2-hydroxyethylcopiperazine-N'42-ethanesulfo acid] (pH 7,4) and 0. 15M NaC! "Hebes" buffer salts consisting of pΔI)5/WT transformed and control non-transformed CH 2-10 μm amount of 300-fold concentrated FC3 derived from a culture of CL41 cells (CM) 100 μl of non-containing DMEM was used. After that, the 100 μm sample was changed to 200 μm. platelet suspension (4XlO”/ml) and then stirred in a platelet aggregation needle. and incubated for 5 minutes. then ristocetin at the time of injection (time zero) was added to give a final concentration of 1 mg/ml. By recording changes in light transmission The agglomeration was monitored. Platelet aggregation was derived from the pAD5/WT transformed cell line. It can be observed with only about 100 μl of unconcentrated, serum-free medium. Concentrate up to 300 times and assay with up to 10μI concentrated medium/100μm sample. Serum-free medium from control untransformed cultures did not induce platelet aggregation. It was. Pre-incubated ristocetin-induced 116kDa using monoclonal antibodies As a further control to confirm the specificity of vWF fragment-platelet interaction, vWF-blood Antihematologic agents specifically shown to block platelet GPIb-IX receptor interactions Platelet glycoprotein 1b monoclonal antibody LJ71bl (Handa et al., J, Bio Chem, 261:12579-12585 (1986)) along with platelets. Pre-incubated. Before performing the agglutination assay, platelet surface receptor-specific LJ-1bl monoclonal antibody was used. The effect of pre-incubating platelets was also investigated. This pre-incubation Platelets subjected to CP3 () Tranpani-Lombardo et al. , J. CI in Invest, 76:1950-1958 (1985). Platelets similarly pre-incubated with 100 ml of Platelets gave an effective aggregation response. LJ- CF2 blocks platelet GPIIb/IIIa receptor sites and promotes vWF-specific It was shown not to block GPIb-IX receptors. 10 to conduct the test Mix platelets/serum at a concentration of 0 μg/ml while stirring the mixture in a platelet aggregation needle. 1 minute before adding ristocetin (ml mg/ml) to the sample At previous time points, antibody LJ-1bl or antibody LJ-CP3 was added. Other points The test was the same as described above. Monitor changes in light transmittance at approximately 5 minute (LJ-1bl) or 4 minute (LJ-CF2) intervals. Monomeric 441-730 mature Von Willebrand factor subunit with differences Construction of mammalian transformants for expression of fragments This example shows residue 441 (alg. with the amino terminus of residue 730 (as) and the carboxy terminus of residue 730 (as) and its position 459. Glycine with cysteine residues substituted at 462 and 464 Constructing a DNA sequence encoding a mature vWF subunit/t fragment further comprising residues and are illustrative of the conditions under which mammalian cells can be transfected. The 5aII-XbaT insert of pAD3-2 (see Example 7) was modified by restriction treatment. After removal, pc DNA pre-digested with Xhol and xba restriction enzymes 1 vector (Invitrogen, San Diego, CA). Xhol and 5alI restriction sites contain the same endogenous sequence -TCGA, -/-AGCT-. Therefore, the Sa1■ restriction fragment can be annealed to the txha1 site. piece were ligated with T and DNAIJ gauze, but the integrity of the Xho 1 site was not preserved. won. This plasmid construct was named pAD4/WT. Site-directed mutagenesis using M13mp18 pAD4/WT was incubated with EcoRl and and restriction treatment with Smal enzyme. The pcDNAI vector is XhoI (rs contains an EcoR1 site within its polylinker region upstream of the Sm Does not include the aI site. As shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 1), a unique SamI site (CCCGGG) is contained within the vWF cDNA insert and contains mature subunit residue 7. 16 (glycine) to residue 718 (glycine). Therefore, the approximately 950 base pair EcoRI-3mal fragment of pAD4/WT was A subclone was inserted into the EcoRI-3ma1 site within the polylinker region of the mp18 phage. It has become an online version. The vWF sequence of M13mp18 was then mutagenized and pre-restricted. Reinserted into the pAD4/WT construct to construct intact residues 441-730 of the vWF sequence. It was designed to lead to growth. Mutagenesis was performed according to the procedure of Example 1 and Kunkel-T.N., supra, with the following options: We decided to use oligonucleotides. Oligonucleotide (13) - SEQ ID NO: 14 reference 3' - GGACTCGT GCCGGTCTAACCGGT to CCACTACAACAG -5'5'- cctgagcac 工 cagattggHcac 壓士gatgttgtc - 3’GIYe* GIY46i GIY461 hybridizing oligonucleus Otides are shown in capital letters (3’-5”) and are equivalent to transcripts (non-coding strand DNA). be. Underlined letters indicate single base substitutions for variant codons. equivalent The code strands are shown in the lower case letters, with the corresponding identified by the three letter designation Has a glycine substitution. The mutant 950 base pair EcoRI-3mal fragment was then pre-restricted pA It was reinserted into the EcoRI-5ma1 site of the D4/WT plasmid. Mutant configuration The body was named pAD4/Δ3C. To promote long-term storage and propagation, / ’% Nahan Di, J., Mo1. Biol, 166:557-580 (198 3), pAD4/83C was transformed into ampicillin-sensitive E. coli strain XS- 127 was transformed. Consistent with the procedure of Example 1, the mutant cDNA sequences were subjected to the dideoxy method. Therefore, the plasmid was purified by CsCl/ethidium bromide equilibrium centrifugation. Manufactured. CO3-] cell transformation CO3-1 cells (SV40 pAD into transformed African green monkey kidney cells, ATCC-CRL1650) 4/Δ3C was introduced. Cheno S. et al., Mo1. Cel　1. Biol, 7 (8):2745-2752 (1987). Dorbekos Modified Eagles Medium (DM) supplemented with 1O% fetal bovine serum (Fe2) EM) (Gibco/Life Chiknolose Co., Gaithersburg, MD) CO5-1 cells were grown at 37°C in an atmosphere of 5% CO; 1. 5X10' cells 24 hours before transformation at a density of /60 mm culture dishes (approximately 25% confluence). Cultured. Under these conditions, cos-cells in DMEM/10% FC3 have approximately It has a doubling time of 20 hours. To accomplish the transformation, Bernboim H.C. and Dolly G.I., Nu. cleic Ac1ds Research, 7:1513 (1,979) By the method, pAD4/Δ3C plasmid was isolated from a culture of E. coli strain XS-127. Collected the de. 60 m each in calcium phosphate solution by the method described above. 10 μg of plasmid was applied to m dishes of cells. After plasmid inoculation, 5 Cells were maintained in DMEM/10% FC3 for 8 hours at 37°C in a %CO3 atmosphere. Growth medium followed by a solution of phosphate buffered saline/10% (v/v) glycerin. was replaced. The culture was then maintained in glycerol=PBS for 2 hours, and the transformants Auskel et al., eds., [Modern Procedures in Molecular Biology], Vol. 9. 1゜ p. 3, Riley and Song (1987)). After 2 minutes, glycerin-PBS The solution was replaced with DMEM/10% FC3. Antibiotics were used to select stable transformants. Biological resistance was not used. Then DMEM/lo%F in 5% CO2 atmosphere Cells were maintained at 37°C in C8. Example 1 Transformation of CO3-1 cells with O-pAD4/WT plasmid pAD CO3-1 cells were also successfully transformed with the 4/WT plasmid. Antibiotic resistance was not used to select stable transformants, but pAD4 Properties of the 116 kDa mutagenic polypeptide produced by the /Δ3C plasmid For the purpose of comparing with the case of pAD4/WTI 16 kDa homodimer, this Transitional expression of the 116 kDa fragment of et al. was particularly useful. Following the procedure of Example 90, pAD4/ WT plasmid was recovered. C with pAD4/WT using the procedure of Example 9. Transformation of O5-1 cells was then performed. After that, DMEM was added in a 5% CO□ atmosphere. Cells were maintained at 37°C in /10% FC3. Example 11 - Mutant 441-730 Mature Von Willebrand Factor Subunit Construction of mammalian transformants expressing the mutant fragments (in which case each mutant is a single following the procedure of Example 9 (including cysteine to glycine substitution) and also site-directed Using appropriate oligonucleotides for sexual mutagenesis, three plasmids (p AD4/G"', pAD4/G"" and pAD4/G"", collectively r pA+)4/ΔIC plasmid) was constructed. Each Mature v W F”j unit residue position 459. 462 and 464 with a single Each contains a single base pair mutation corresponding to a cysteine to glycine substitution. Otherwise, this type of plasmid is identical to pAD4/WT. each one The oligonucleotide contains only one of the three variant codons (the other two codons represented by the wild-type coding sequence), the oligonucleotides used is the same oligonucleotide (13) used to prepare pAD4/Δ3C. It is one. pAD4/G"", pAD Samples of pAD4/G"' and pAD4/G"' were annealed according to the method of Example 9. Each was cloned into picillin-sensitive E. coli strain XS-127. Example Consistent with procedure 9, mutant cDNA sequences were sequenced by the dideoxy method. confirmed and purified the plasmid by CsCl/ethidium bromide equilibrium centrifugation. . pAD4/G"", pAD4/G" or pAD4/G according to the procedure of Example 9. ``'' plasmid was used to transform cos-i cells. Stable transformants were Antibiotic resistance was not used to select. After that, D in 5% CO2 atmosphere. Cells were maintained at 37°C in MEM/lo%FC3. Example 12 - Transformed with pAD4/WT and pAD4/Δ3C plasmids Expression of Fono Willebrand factor subunit fragments by CO3-1 cells and characterization pAD4/Δ3C or pAD4/W by the procedure of Examples 9 and 10, respectively. CO5-1 cells transformed with the T plasmid were cultured and transformed as described below. The vWF DNA coded for was expressed. pcDNAΔ1 plasmid vector (v C03I cells similarly transformed with It was used as a reference. lOμg pAD4/WT, pAD4/Δ3C or pc DNA at time zero By adding 1 plasmid, at a density of 4-5x10'/60mm dish C08-1 cells were transformed. Following the procedure of Examples 9 and 10 for an 8 hour period. After a period of time, cells were subjected to glycerin shock. 5% CO2 atmosphere for the next 32 hours Cells were overlaid with DMEM/10% FC5 at 37°C in air. Cells in each culture were then rinsed three times with PBS and 100 μCi/ml. 3SS methionine with a specific activity of 100 QCi/mmol (up to final concentration) DMEM supplemented by Amarjam, Arlington Heights, IL) (without Fe2). Ink cells for 16 hours After that time, the secreted vWF polypeptide was immunoprecipitated. Each culture medium was collected for purification. Immunoprecipitation generally followed the procedure of Example 7. 0. 5ml IOX immunoprecipitation buffer liquid, 0. 05 mg of NMC-4 antibody and 0.05 mg of NMC-4 antibody and 0.05 mg of NMC-4 antibody. Using 05mg of RG-46 antibody A 5 ml volume of culture medium was incubated for 16 hours. According to Example 7, treatment with protein A-Sepharose"4B was carried out.Ig G-complex vWF proteins were collected in SDS-containing sample buffer before 5DS-PAGE. Dissociated. For analysis of vWF polypeptides under reducing conditions, the sample buffer was modified to It contained 00mM dithiothreitol (DTT). result Automate running gels under reducing and non-reducing conditions, drying, and developing SSS labels. Subjected to radiography. Under either reducing or non-reducing conditions, (unmodified p >cos- transformed with the cDNA1 carrier were induced from a control culture of cells. 5asa protein was not detected in the derived immunoprecipitate (MOGK). (see gel lane). C08-1 cells transformed with pAD4/WT plasmid were transformed under non-reducing conditions. So, about 116. Generates a prominent 3s3 labeled band with an apparent molecular weight of 0.000. This value is consistent with proper mammalian glycosylation of the 441-730 fragment. reduction When run under these conditions, no 116kDa material was observed, and the 116kDa homodimer Consistent with the reduction of disulfide bonds that stabilize Under reducing conditions, approximately 52° A 3SS labeled band with an apparent molecular weight of 0.000 is visualized. Apparent 52kD The value of a is also consistent with proper glycosylation of the reduced monomer 441-730 fragment. Be consistent. The 4-gel lane corresponding to transformation with pAD4/Δ3C has a clear 116 1) Does not show substance a. Instead, under reducing and non-reducing conditions, approximately 52,000 The band is obvious in the molecule @ of . Yo-, Te, Instein residue 459 within the 441-730vWF fragment. 462 and Mutagenesis to replace 464 with a glycine residue probably resulted in forward (471-47 4 and 509-695) Nondimeric polypeptides with only disulfide bonds Successful expression of 1. That means that. Interaction with NM(,-4 (see also Example 7) is known to require an intact 509-695 intrabutton disulfide bond. , in the polypeptide produced by pA D 4 / Δ3C. The presence of the original wild-type tertiary structure is indicated. The gel also shows (under reducing and non-reducing conditions) the presence of small molecule 353 labeled substances; Presumably all vWF polypeptides produced by the pAD4/W'F construct are Not successfully dimerized, resulting in proteolysis and/or incomplete proteolysis of the polypeptide. It is shown that total glycosylation prevents higher yields but is not compromised. Proteolysis and/or incomplete glycosylation may result in pAD4/Δ3c transformation. It probably also affects the yield of monomeric vWF polypeptide produced by the body. ing. Some high molecular weight aggregate material (mainly not entering the gel) is present in pAD4. /WT and in non-reduced samples from pAD4/Δ3C. The MMC-4 monoclonal antibody has a phonovirus that contains the glycoprotein rb binding site. It has the domain of Brand factor subunit as its epitope. Epitou By mapping this to the forward (residues 509-695) disulfide bond, leading to disulfide-dependent association ([t and mature vWF subunit residue 47 4-488 and likewise generally consisting of residues 694-708) It is shown to be contained within the domain. (7) Reactivity with NMC-4 was determined by specific recombinant 441-730bi mature v. The WF”f unit fragment contains similar wild-type residues 441-730 of the domain. This is important evidence as to whether or not a tertiary structure was assumed. pAD4/WT and pAD4/Δ3C traits according to the procedure of Example 120. The vWF polypeptide secreted by the transformed cos- ff1 (N1 key) However, immunoprecipitation of the culture medium was performed with NMC-4 antibody only (0. 5ml per 5 ml culture medium supplemented with IOX immunoprecipitation buffer. 05mg NMC- 4) The points were changed. Samples were run under reducing and non-reducing conditions. Consistent with the results of Example 12 As, the main components isolated from pAD4/WT culture medium were 11 6 kDa, with an apparent molecular weight of 52 kDa under reducing conditions. Only a small fraction of the total pAD4/Δ3C-induced vWF polypeptide material is NMC-4. (compared to conformation-independent RG-46), with an apparent molecular weight of 52 kDa. The molecular weight bands were observed in gels of NMC-4 immunoprecipitates under reducing and non-reducing conditions. You can Example 14 - pAD4/G'", pAD4/G"" or pAD4/G"' Plasma Phono wilbra produced by cos-i cells transformed with Sumid. Expression and characterization of the factor subunit fragments were performed using the pA D4/G", pAD4/G482 or pAD4/G"' plasmid (collective CO5-1 cells were transformed with the rpAD4/ΔIC plasmid. . The procedure of Example 7 used only NMC-4 for immunoprecipitation and The culture medium was analyzed for vWF polypeptide. The 355-labeled protein prepared in Example 12 was immunoprecipitated with NM (,4), Run in SDS polyacrylamide gels under reducing and non-reducing conditions, pAD4/ Compared to vWF antigen produced by WT and pAD4/Δ3C transformants. Ta. The gel is thought to involve tin content disulfide contacts in the original mature subunit. By replacing one of the three cysteines (459, 462, 464) , a homodimeric 116 kDA characteristic of pAD4/WT transformed CO8-1 cells. It was shown that the formation of polypeptides was prevented. Having a single glycine substitution These three vWF antigens are primarily 52. 000 Appears as a monomeric polypeptide of apparent molecular weight. The main substance is 52kDa Having an apparent amount of F-11 is h) 52/48 kDa)') psinophilic v by CO3-1 cell transformants that duplicate the glycosylation observed in the WF fragment. This strongly suggests correct glycosylation. improperly glycosylated and/or some proteolyzed vWF antigens (molecular weight less than 52 kDa) are also found in the gel. It is successfully folded and secreted, which allows NM(, −4 Both relatively small portions of the pAD4/Δ3CvWF polypeptide contain 5 epitopes. is a pAD4/Δ3C transformant with an apparent molecular weight of 52°000. indicated by the low intensity of the graph bands. This example reduces the amount of N-linked glycosylation present in the 116 kDa polypeptide. The affinity of the recombinant 116kDavWF fragment for platelets by decreasing the Shows that it can be strengthened. 0. 5mM of each non-essential amino acid, 2mM of glutamine and an additional 0. 8μ g/ml of tunicamycin (derived from Streptomyces product T7765 and its Sigma Chemical Co., St. Louis, Mizzou, including A, B, C and D isomers. in DMEM containing 10% FC5 (approximately 5X105 cells/ Generally follow the cell culture procedure of Example I as the initial cell density in a 60 mm tissue culture dish. ) Stable CHO-1 transformants containing DNA from the pAD5/WT plasmid was incubated overnight. Cells were then washed twice with PBS and 0. 5mM each non-essential amino acid, 2mM L-glutamine and 0. Refresh in DMEM with 4 μg/ml tunicamycin. The cells were incubated for 24 hours. Collect the culture medium using a centrifugal filtration device, model Concentrated 300x with Centricon 30, Amicon, Lexington, MA. . As a control, incubation without tunicamycin (under otherwise identical conditions) Medium from stable transformants was also collected. (from treated and untreated cultures ) VWF-induced recombinant 116 kDa dimeric polypeptide ristocetin (ris tocetin)-induced platelet aggregation. The amount of vWF-inducing antigen depends on the exact extent of growth in each tissue culture dish. The results varied from preparation to preparation. FCS induced from treated and untreated cells Based on the proportion of NMC-4 reactivity of a particular sample of media without μl volumes of each to reflect equal amounts of vWF antigen for comparison in the assay. A 300-fold enriched medium was selected. Equal NMC-4 affinity constants were assumed. Cultures containing 10-100 μ m amounts of FCS-free to determine standardized ratios. Media samples (from treated and untreated cultures) were cultured in SD as described in Example 1. Electrophoresis in S polyacrylamide gels followed by band separation using standard procedures. Transferred to a nitrocellulose sheet. Barnett et al., A. Anal, Bioche. M, 112:195-203 (1981), using NMC1 as a wiping body. , then used 125I rabbit anti-mouse IgG as the secondary antibody and autoradiation. on nitrocellulose sheets by visualization by graphography (see Example 1). was detected. For standardization, NMC, , -4 from each culture Responsive total vWF antigen was determined from densitometric scanning of the autoradiograph. Risto7tin-induced platelet aggregation assay was performed according to the procedure of Example 2, and tunicamycin The treated cells produced polypeptides with normal N-linked glycosylation. NMCs with greater platelet aggregation inducing capacity than those produced by treated cells It was shown that -4-reactive antigen was produced. It does not show the state of agglomeration to be compared. ,0. 5. 0. 75 and 1. A list seventin concentration of 0 mg/ml was used. Historically, NM(, -4-reactive 116 kDa polypeptide material from untreated cells was A large number of cells with slightly different electrophoretic mobilities are analyzed by Western blotting. Separated into chemical species. After treatment with tunicamycin, only a single species was observed. It was. Thus, the N-linked glycosylation of the recombinant 116 kDa fragment is heterogeneous; The level of this type of glycosylation has been shown to influence the biological activity of the fragment. It will be done. Example 16 - Residues 441-730 with reduced levels of glycosylation For expression of monomeric or dimeric forms of Willebrand factor subunit fragments. Construction of mammalian transformants An example of this is the mature subunit 449-728 sequence (52/48 kDa fragment) or 52/48 as isolated from circulating plasma vWF, which mimics the dimer of v W containing less glycosylation than that present in the fragment or its dimer Preparation of F-derived polypeptide is shown. Mutagenesis of vWF cDNA The mature subunit encodes its serine, threonine or asparagine residues The specific codons 1 to F of the cDNA encoding the residues 441-730 fragment are Following the procedures in Examples 1 and 3, other amino acids such as alanine or glycine can be added. can be substituted with a no acid codon. Briefly, pAD3-1 (actual) encodes vWF subunit residues 441-730. The M13mp18 recombinant DNA fragment named Example 7) was prepared by the procedure of Example 9. ) can be cloned into pcDNA1 vector to generate pAD4/WT plasmid. I can do it. The pAD4/WT plasmid was purified using EcoRl and Smal enzymes. Limited processing is possible. As explained in Example 9, pcDNA1 The relinker region contains an EcoR1 site but no SmaI site. Unique Sma 1 site (CCCGGG) is the residue from mature subunit residue 716 (glycine). Contained within the vWF cDNA insert spanning group 718 (glycine). This approximately 950 base pair EcoRI-3mal fragment of pAD4/WT is M13mp Subcloned into the EcORI-Sma1 site within the polylinker region of phage 18. can do. The vWF sequence was subsequently mutagenized and the previously restricted pAD4 / before reinsertion into the WT construct (encodes potential sites of glycosylation) Deletion or substitution of one or more serine, threonine or asparagine codons, resulting in no Wound residues 441-730 can lead to reassociation of the vWF sequence. A preferred form of mutagenesis is according to the procedure of Kunkel, T. N., supra (Example 7). suitable for deleting one or more serine, threonine or asparagine codons. one or more other amino acids such as glycine or alanine Utilizes appropriate hybridizing oligonucleotides to replace the above codons It is something to do. Coating polypeptides with reduced glycosylation potential The pcDNA1-derived plasmid containing the coded vWF cDNA is pAD4/-G. can do. Using the pAD 4/-G plasmid according to the procedures in Examples 9 and 10. can be used to transform C08-1 cells. Polypeps expressed in this way pAD4/WT polypeptide has fewer potential sites for glycosylation compared to the pAD4/WT polypeptide. can form a 116 kDa homodimer with the following positions: Many other expression plasmids/ Using host cell lines, the pCDM 8''./CHO-Kl system of Example 7 was used, in particular A mutant vWF cDNA containing a mutant vWF cDNA can be expressed. Expression of monomeric fragments Following the procedure of Example 9, one or more of the aforementioned potential grids within the 441-730 sequence Deletion or substitution of one or more codons encoding a codylation site can be performed, e.g. Residue position 459. Also codes for cys-+gly codon changes at 462 and 464 This can be carried out using oligonucleotides. In addition, the second mutagenesis Ml　3mp1　g phage to mutate cysteine to glycine. I can. If reconfigured, vWF subunit position 459. cys at 462 and 464 −+gly mutation, which restricts glycosylation of the encoded vWF polypeptide A pc DNA 1 plasmid construct containing one or more additional codon mutations that pAD4/Δ3C,-G. 116 kDa homodimer (Example This polypeptide lacks cysteine residues that stabilize the can be expressed and secreted by host cells as monomeric fragments. Example 17 - Expression and secretion of other therapeutic polypeptides by eukaryotic cells and Examples 12-14 show that the 22-residue human 1-vWF signal peptide and the human vWF signal peptide A polypeptide consisting of the first three amino acids of the WF propeptide consists of residues 441 The mature vWF subunit fragment consisting of ~730 CHO-1 and CO3-1 indicating successful secretion from the cell (if different, the fragment (can only be recovered from host cells by cell lysis). Amino acid sequence (see SEQ ID NO: 15) S@r-Thr-COJ　↑ Known signal peptide cleavage site and fragments and combinations of fragments thereof, comprising other regions of the vWF molecule or fragments thereof. fragments of therapeutic polypeptides consisting of other protein species into the endoplasmic reticulum lumen, thus It may be useful for methods of intrawounding secretion into eukaryotic host cell culture media. In addition, an amino acid consisting of NH2-a l a-g l u-g I y-CO2H The amino acid sequence is located at the C-terminal side of the vWF signal peptide. This may facilitate the identification of the appropriate cleavage site by the signal bebutidase when You might also say that. Following the procedure of Example 7, NA sequences useful for expression of therapeutic polypeptides were constructed as follows: The structural elements can be configured so that they can be assembled in the 5' to 3' direction (corresponding to (mentioning de or non-transfer): <A) Sequence of nucleotides suitable for restriction, (B) Eukaryotic consensus translation initiation sequence , (C) methionine codon followed by 21 other codons (both human wWF signal (which may encode a peptide), (D) II) The first three amino acids of the amino-terminal region of the vWF propeptide the coding sequence corresponding to the acid; (E) the coding sequence of the therapeutic polypeptide; (F) the translation stop codon; and (G) placing appropriate nucleotides for restriction, then placing this construct on a plasmid or can be inserted into a viral expression vector and then use this cloning vehicle. suitable eukaryotic host cells, from which therapeutic polypeptides can be transformed. can be expressed. Example 18 - w4 production of a subset of 52/48 kDa polypeptides. Cysteine-deficient protein derived from residues 441-733 fragment of vWF subunit. Figure 3 illustrates the preparation of polypeptides representing embodiments of this invention that are . This example also demonstrates the conditions under which a subset of this type can be expressed from recombinant bacterial host cells. Examples are also provided. A subset includes, for example, the general procedure of Examples 7 and 9. Accordingly, it can also be expressed from recombinant eukaryotic cells. The subset is multimer v Interaction between WF and platelet GPIbα can be interfered with. That is, this They have utility as antithrombotic agents. Next, the preparation of three groups of polypeptides consisting of subsets of the types described above is described below. However, a subset of the first group does not contain cysteine, and the second and third for a subset of the group with only 2 cysteine residues (cystine residues 5 have been removed). Subsets of the second and third groups of polypeptides Whether it is retained in the N-terminal region (second group) or the C-terminal region (third group) It's different. A polypeptide subset of the residues 441-733 domain of the vWF subunit ( (does not contain cysteine) Consists of residues 441-733 sequence, but with internal G10 (residues 474-488) or A mutant (fusion) polypeptide lacking the D5 (residues 694-708) region was Loop-out mutagenesis of the restriction fragment of the 7E construct in M13mp18 phage and subsequently tested for antithrombotic activity. In particular, the alkaline cell lysis procedure, Birnboim H.C. and Dolly J. Nucleic Ac1ds Research, 7:1513 (1979 ) to transform the p7E plasmid into a culture of E. coIJBL21 (DE3). and then purified by CsC1/ethidium bromide equilibrium centrifugation. The XbaI restriction site is located in the p7E plasmid (involving the parental pET-3A vector). and is located upstream of the T7 transcription promoter. Therefore, in M13mp18 phage For loop-out mutagenesis (see Example 1) of v (residues 441-733) The WF insert was removed as an Xbal-HindlII restriction fragment. Non-coding strand ( Transcription M) Using the following oligonucleotides representing the DNA, each of the GIO regions Alternatively, a loop out of the D5 region was performed. The two 3'→5' oligonucleotides shown below Creotides are the corresponding coding strand and the resulting amino acid sequence. Oligonucleotide (14) - SEQ ID NO: 16 reference 31 - GAG TGG CCA C’IT CGG CACTCG GGG TGG TGA -5’G Deletion of IO binding peptide Oligonucleotide (15) - SEQ ID NO: 17 reference 3' - CTCTAG CA A TCG ATG CTG TACCGT GTT CAG -5'G5 bond Peptide deletion DNA sequence analysis was used to confirm that the intended vWF coding sequence was produced. Ta. The two mutagenized Xbal-Hindll restriction fragments were then transformed into XbaI and separate pET-3A proteins cut with HindllI restriction endonuclease. into lasmids and subsequently designated these as p7E/ΔGIO and p7E/ΔG5. I named it. The resulting mutant (fusion) vWF polypeptide is then linked to GPIbα. tested for its ability to match. Botrocetin was tested using the assay procedure of Example 6. Inhibition of binding of LJ-IbI antibody to GPIbα in the absence of modulator), Residues 441-7 expressed from p7E and from which the G10J peptide sequence was deleted It was determined that 33 fragments bind to GPIbα. Missing “D5” peptide sequence p7E-induced fusion fragments that do this do not do this. However, as a binding modulator When the experiment was repeated using botrocetin (see Methods in Example 6), the fused Both subfragments are effective in inhibiting binding by LJ-1bl and therefore It has antithrombotic utility. can be used to identify vWF-inducing polypeptides with antithrombotic activity. Other in vitro assays include testing vWF on platelets with mutant polypeptides. Inhibition of botrocetin-induced binding (see Example 3) and systems using bovine vWF (but does not contain modulators like botrocetin or lystocetin) Includes inhibition of human blood IN anti-aggregation. Cysteine-deficient polypeptide subset with N-terminal deletion residues 441-733 Antithrombotic agents that mimic vWF subunit fragments but contain N-terminal deletions A therapeutic polypeptide subset was prepared. M13mp of Xbal-HindlI restriction fragment from p5E expression plasmid Preparation of this type of polypeptide using loop-out mutagenesis in 18 phage The product was manufactured. Thus, the vWF coding sequence (p5E) consists of residue positions 509 and and cysteine at residue position 459. 462. 464. 471 and 474 was coded for glycine. The p7E sequence also represents this type of antithrombotic polypeptide. Useful for expression. Antithrombotic polypep equivalent to that expressed from p7E ellipsoids Tide is not capable of reducing or alkylating cysteine residues contained in it. Therefore, it can be manufactured. Oligonucleotides used to generate N-terminal deletions in vWF subunit fragments In the cleotide design, upstream (5') from the codon encoding vWF residue 441 The DNA sequence of the pET-3A vector was referred to. Ec in pET-3A Expression of residues 441-733 fragment as an oRl-HindITI insert (Bam Example having both its 5' and 3' ends modified with a HI linker 1) is a 20-residue amino acid sequence that attaches to the amino terminus of the vWF fragment (sequence Also includes the expression of number: 18). This sequence is the T7 bromotor site, as shown below. The therapeutic activity of the vWF polypeptide is encoded by the vector DNA downstream from It does not have any adverse effects on sexuality. start codon Mr. 6 Ala Sir Met Thr Gly Gly Gin Gin Ma From tEcoRI In this particular case, the EcoRI coding sequence (Glu-Phe) is BamHI! in the procedure (★Example 1) Remains even after modification by J-linker is memorized. Upstream from the starting methionine and residue 441 (arginine) The corresponding pET-3A vector code sequence present is as follows. Oligonuku Reotide (16) - see SEQ ID NO: 19 Thus, the sequence from the vector (terminating at the start methionine) and the subsequent new hybridizes to encode the intended N-terminal region of the WF polypeptide. Generating N-terminal deletions using loop-out mutagenesis with leotide in Nogonu went. Representative examples of oligonucleotides needed for the preparation of therapeutic polypeptides include non-coding strands ( oligonucleotide 17 (SEQ ID NO: 20) corresponding to DNA . This oligonucleotide, shown below, includes the corresponding coding strand and the resulting amino acid. It is a noic acid. . 3'-CCT CTA TAT GTA TACGTCCTC to GCCCT CCG-51 A representation of a cysteine-deficient polypeptide reflecting this type of N-terminal deletion. Table examples are MeiGIn475~Van73', Met-Thr"2~Va I" ' and MeiTyr"@~Val"'. This type of polypeptide (and All subsets of vWF residues 441-508 containing one or more cysteine residues Other species with terminal deletions) have antithrombotic therapeutic activity. These polypes When expressed from p5EII adults, cysteine 509-695 You can also give Cysteine-deficient polypeptide subset pET-3A vector with C-terminal deletion The procedure used to express recombinant bacterial polypeptides using Va173 The result is a polypeptide that also contains a series of amino acids on the C-terminal side of 3, but with additional The residues result from translation of the vector sequence (see SEQ ID NO: 21). In particular, the residues 441-733 fragment expressed from the p5E (or p7E) construct is residue 733 () resulting from expression of the vector sequence before the first vector stop codon It also contains 22 residues fused to the C-terminus of <phosphorus). HindIII site of EcoRI-Hindlll fragment with BamHI linker The pET-3A vector sequence, which also reflects the modification of (Example 1), is as follows: Yes (SEQ ID NO: 21) Val Sar Sar Asp Pro Ala Ala Asn Lys AlaArg Lys Glu Ala Glu Leu, Ala Ala Ala　Thr, hybridizing oligonucleotide that mimics non-coding @DNA Loop-out mutagenesis was performed in pSE using cleotide. polypeptide (using as an example a polypeptide ending with the residue Asp”’) , a hybrid encoding a vWF subunit sequence (e.g. residues 706-713) generated oligonucleotides that target codons, e.g. Stop codon/reading frameshift between codon 709 and codon 710) The sequence 3'-ACT-ACT-T-5' was also included. Thus, with a C-terminal deletion, each residue 709. 704. 700 and 696 A vWF-derived polypeptide was generated that terminates in . Deposit of strains useful in carrying out the invention American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland, under the Budapest Treaty, the following stocks: deposit of biologically pure cultures of Acceptance demonstrated after successful viability testing I was given a consignment number and paid the necessary fees. Utilization of the above culture includes 37C, F, R, fil, 14 and 35U, S, C, By the Commissioner of Patents of the United States Patent and Trademark Office, entitled hereto under IA122. during the continuation of the patent application or pursuant to the Budapest Treaty. This will become possible if the following uses are considered. Restrictions on the use of said culture to the public All restrictions shall be irrevocably withdrawn upon grant of a patent pursuant to the application; The culture must be at least 5 years old from the most recent application for sample preparation. and in any case for a period of not less than 30 years following the date of the deposit. shall remain available forever. In the unlikely event that the culture becomes non-viable or If accidentally destroyed, it may be replaced by a viable culture of the same taxonomic description. To be. Strain/Plasmid ATCC number Deposit date E. coli p5E BL21 (DE 3) 96. 3 ATC [: 68406 9/19/90 E-,:] IJ 　X512796. 4 ATCC684079/19/90 polypeptide extract (μg/m11 FIG.2 95E peptide concentration (μM) international search report Continuation of front page (51) Int, C1,5 identification symbol Internal reference number C07K 13100 8517-4HC12N 15/12 //　C07K　99:00 (31) Priority claim number 675,529 (32) Priority mill March 27, 1991 Japan (33) Priority claim country United States (US) I (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE. DK, ES, FR, GB, GR, IT, LU, NL, SE), AU, CA, JP , U.S. (72) Inventor Ware Sherry L. California, United States 92024 Encinitas Summerhill Drive 2119

Claims (86)

【特許請求の範囲】[Claims] １．親ポリペプチドを模倣し、概して残基４４１（アルギニン）で開始し概して 残基７３３（バリン）で終了する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニット のその断片のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのいずれかのサブセッ トであって、親ポリペプチドまたはそのサブセットに通常は存在する１以上のシ ステイン残基が欠失し、かつ／または１以上の他のアミノ酸によって置換されて おり、したがって前記ポリペプチドが、水性媒体中で生理的ｐＨにて、親ポリペ プチドまたはそのサブセットより鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成する傾 向が少ないポリペプチド。1. mimics the parent polypeptide and generally begins at residue 441 (arginine) and generally Mature von Willebrand factor subunit ending at residue 733 (valine) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of that fragment of one or more sites normally present in the parent polypeptide or a subset thereof. The stain residue is deleted and/or replaced by one or more other amino acids. Therefore, the polypeptide is isolated from the parent polypeptide in an aqueous medium at physiological pH. peptides or a subset thereof to form intrachain or interchain disulfide bonds. Polypeptides with few orientations. ２．残基５０９（システイン）および６９５（システイン）を含み、１以上のシ ステイン残基４５９、４６２、４６４、４７１および４７４が欠失するか、また は１以上の他のアミノ酸によって置換された請求の範囲第１項記載のポリペプチ ド。2. contains residues 509 (cysteine) and 695 (cysteine), and contains one or more cysteine Stain residues 459, 462, 464, 471 and 474 are deleted or The polypeptide according to claim 1, wherein is substituted with one or more other amino acids. Do. ３．システイン残基４５９、４６２、４６４、４７１および４７４のいずれかが 欠失または置換された請求の範囲第２項記載のポリペプチド。3. Any of cysteine residues 459, 462, 464, 471 and 474 The polypeptide according to claim 2, which is deleted or substituted. ４．システイン残基５０９および６９５がジスルフィド結合によって共有結合で 連結された請求の範囲第２項記載のポリペプチド。4. Cysteine residues 509 and 695 are covalently linked by disulfide bonds. The linked polypeptide according to claim 2. ５．システイン残基４５９、４６２、４６４、４７１および４７４のそれぞれが 、１以上のアラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアスパラギンの単一 残基によって置換された請求の範囲第２項記載のポリペプチド。5. Cysteine residues 459, 462, 464, 471 and 474 are each , one or more of alanine, threonine, serine, glycine or asparagine 3. The polypeptide of claim 2, substituted by a residue. ６．それぞれのシステイン残基がグリシンによって置換された請求の範囲第１項 記載のポリペプチド。6. Claim 1, wherein each cysteine residue is replaced by glycine. The described polypeptide. ７．それぞれのシステイン残基がグリシンによって置換された請求の範囲第２項 記載のポリペプチド。7. Claim 2, wherein each cysteine residue is replaced by glycine. The described polypeptide. ８．システイン残基４５９、４６２、４６４、４７１、４７４、５０９および６ ９５のそれぞれが、１以上のアラニン、トレオニン、グリシン、セリンまたはア スパラギンの単一残基によって置換された請求の範囲第１項記載のポリペプチド 。8. Cysteine residues 459, 462, 464, 471, 474, 509 and 6 Each of 95 contains one or more alanine, threonine, glycine, serine or alanine. The polypeptide of claim 1 substituted by a single residue of Sparagine. . ９．主として請求の範囲第１項記載のポリペプチドのいずれかのサブセットまた はサブセットの組合せよりなるポリペプチド。9. Primarily a subset of any of the polypeptides according to claim 1 or is a polypeptide consisting of a combination of subsets. １０．親ポリペプチドまたはそのサブセットに通常は存在する１以上のシステイ ン残基が欠失した請求の範囲第１項記載のポリペプチド。10. one or more cysteines normally present in the parent polypeptide or a subset thereof 2. The polypeptide according to claim 1, wherein the polypeptide is deleted. １１．欠失しまたは置換されたシステイン残基に隣接する１以上のアミノ酸残基 も欠失しまたは置換された請求の範囲第１０項記載のポリペプチド。11. one or more amino acid residues adjacent to the deleted or substituted cysteine residue 11. The polypeptide according to claim 10, wherein the polypeptide is also deleted or substituted. １２．リジンおよび／またはアルギニンの少なくとも１つの付加的な残基が、前 記ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端から延在する請求の範囲 第１項記載のポリペプチド。12. At least one additional residue of lysine and/or arginine claims extending from the amino and/or carboxy terminus of the polypeptide; The polypeptide according to item 1. １３．その１以上の遊離のチオール基が化学的に不活性化され、そのジスルフィ ド結合が防止された請求の範囲第１項記載のポリペプチド。13. Its one or more free thiol groups are chemically inactivated and its disulfide 2. The polypeptide according to claim 1, wherein the polypeptide is prevented from binding. １４．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの１以上の断片からなり、 前記ポリペプチドはジスルフィド結合によって連結したシステイン残基５０９お よびシステイン残基６９５を含み、血小板膜糖蛋白質Ｉｂに結合する前記フォン ・ウィルブランド因子サブユニットのドメインを更に含む請求の範囲第９項記載 のポリペプチド。14. consisting of one or more fragments of a mature von Willebrand factor subunit; The polypeptide consists of cysteine residues 509 and 509 linked by disulfide bonds. and cysteine residue 695, and binds to platelet membrane glycoprotein Ib. - Claim 9 further comprising a Willebrand factor subunit domain. polypeptide. １５．グリコシル化された請求の範囲第１項記載のポリペプチド。15. A polypeptide according to claim 1 which is glycosylated. １６．１以上のシステイン残基４５９、４６２および４６４が欠失し、かつ／ま たは１以上の他のアミノ酸によって置換され、前記ポリペプチドが、前記親ポリ ペプチドより鎖間ジスルフィド結合を形成する傾向が少ない請求の範囲第１項記 載のポリペプチド。16.1 or more cysteine residues 459, 462 and 464 are deleted and/or or by one or more other amino acids, such that the polypeptide is Claim 1, which has less tendency to form interchain disulfide bonds than peptides. polypeptides. １７．前記断片またはサブ断片の位置５０９および６９５に対応するシステイン 残基を含み、システイン残基５０９および６９５が鎖内ジスルフィド結合によっ て連結された請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。17. Cysteines corresponding to positions 509 and 695 of the fragment or subfragment cysteine residues 509 and 695 are linked by intrachain disulfide bonds. 17. The polypeptide according to claim 16, which is linked to the polypeptide of claim 16. １８．欠失しまたは置換されたシステイン位置に隣接する１以上のアミノ酸残基 も欠失しまたは置換された請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。18. one or more amino acid residues adjacent to the deleted or substituted cysteine position 17. The polypeptide according to claim 16, wherein the polypeptide is also deleted or substituted. １９．グリコシル化された請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。19. 17. The polypeptide of claim 16 which is glycosylated. ２０．アラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアスパラギンから選択さ れるアミノ酸の１以上の残基によってシステイン残基４５９、４６２および４６ ４のそれぞれが置換され、１つの位置での置換についての選択が、他の位置での 置換の選択と独立である、請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。20. selected from alanine, threonine, serine, glycine or asparagine cysteine residues 459, 462 and 46 by one or more of the amino acid residues 4 are substituted, and the choice for substitution at one position is the same as at the other position. 17. A polypeptide according to claim 16, independent of the choice of substitutions. ２１．アラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアスパラギンから選択さ れるアミノ酸の１以上の残基によってシステイン残基４５９、４６２および４６ ４のいずれか２つがそれぞれ置換され、１つの位置での置換についての選択が、 他の位置での置換の選択と独立するである、請求の範囲第１６項記載のポリペプ チド。21. selected from alanine, threonine, serine, glycine or asparagine cysteine residues 459, 462 and 46 by one or more of the amino acid residues 4 are each substituted, and the choice for substitution at one position is The polypeptide of claim 16, which is independent of the choice of substitution at other positions. Chido. ２２．アラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアスパラギンから選択さ れるアミノ酸の１以上の残基によってシステイン残基４５９、４６２および４６ ４のいずれか１つが置換された請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。22. selected from alanine, threonine, serine, glycine or asparagine cysteine residues 459, 462 and 46 by one or more of the amino acid residues 17. The polypeptide according to claim 16, wherein any one of 4 is substituted. ２３．グリシンの単一残基によってシステイン残基４５９、４６２および４６４ が置換された請求の範囲第２０項記載のポリペプチド。23. Cysteine residues 459, 462 and 464 by a single residue of glycine 21. The polypeptide according to claim 20, wherein: is substituted. ２４．グリシンの単一残基により、置換されたシステイン残基が置換された請求 の範囲第２２項記載のポリペプチド。24. Claim that the substituted cysteine residue is replaced by a single residue of glycine The polypeptide according to item 22. ２５．共有結合で結合した２つのドメインを含み、血小板腹糖蛋白質Ｉｂに対す るフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害する重合体構造であって、ドメイン の一方が、 以ドの（Ａ）または（Ｂ）から選択される重合体（ドメイン１）：（Ａ）成熟フ ォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基４６９（ロイシン）から概 して残基５２０（アスパラギン酸）までの配列を含むアミノ酸の線状配列を有す る重合体またはそのいずれかのサブセット、または（Ｂ）成熟フォン・ウィルブ ランド因子サブユニットの概して残基４６９（ロイシン）から概して残基５２０ （アスパラギン酸）までの配列を含むアミノ酸の線状配列を有する重合体または そのいずれかのサブセット（１以上のシステイン残基４７１、４７４および５０ ９は欠失するか、または１以上の他のアミノ酸によって置換されている）を含み 、ドメインの他方が、以下の（Ｃ）または（Ｄ）から選択される重合体（ドメイ ン２）：（Ｃ）成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基６８ ９（グルタミン酸）から概して残基７１３（バリン）までの配列を含むアミノ酸 の線状配列を有する重合体またはそのいずれかのサブセット、または（Ｄ）成熟 フォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基６８９（グルタミン酸） から概して残基７１３（バリン）までの配列を含むアミノ酸の線状配列を有する 重合体またはそのいずれかのサブセット（システイン残基６９５は欠失するか、 または他のアミノ酸によって置換されている）、を含む重合体構造。25. Contains two covalently linked domains and is highly effective against platelet abdominal glycoprotein Ib. A polymer structure that inhibits the binding of von Willebrand factor One of the Polymer selected from (A) or (B) below (domain 1): (A) matured polymer approximately from residue 469 (leucine) of the Von Willebrand factor subunit. has a linear sequence of amino acids up to and including residue 520 (aspartic acid). or (B) a mature von Wilb Generally residue 469 (leucine) to generally residue 520 of the RAND factor subunit (aspartic acid) or any subset thereof (one or more cysteine residues 471, 474 and 50 9 is deleted or substituted by one or more other amino acids) , the other of the domains is a polymer (domain) selected from the following (C) or (D). (C) Generally residue 68 of the mature von Willebrand factor subunit. Amino acids comprising the sequence from 9 (glutamic acid) to generally residue 713 (valine) or (D) a mature polymer having a linear sequence of Typically residue 689 (glutamic acid) of the von Willebrand factor subunit has a linear sequence of amino acids that generally includes the sequence from to residue 713 (valine) the polymer or any subset thereof (cysteine residue 695 is deleted or or substituted by other amino acids). ２６．ジスルフィド結合で結合した２つのドメインを含み、血小板膜糖蛋白質Ｉ ｂに対するフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害するポリペプチド構造であ って、ドメインの一方が、以下の（Ａ）または（Ｂ）から選択されるペプチド（ ドメイン１）： （Ａ）成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基４６９（ロイ シン）から概して残基５２０（アスパラギン酸）までのアミノ酸の配列を含むペ プチドまたはそのいずれかのサブセット、または（Ｂ）成熟フォン・ウィルブラ ンド因子サブユニットの概して残基４６９（ロイシン）から概して残基５２０（ アスパラギン酸）までのアミノ酸の配列を含むペプチドまたはそのいずれかのサ ブセット（システイン残基４７１および４７４の一方または両方は欠失するか、 または１以上の他のアミノ酸によって置換されている）を含み、ドメインの他方 （ドメイン２）が、成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基 ６８９（グルタミン酸）から概して残基７１３（バリン）までのアミノ酸の配列 を含むペプチドまたはそのいずれかのサブセット（これは残基６９５を含む）を 含み、前記ジスルフィド結合は、ドメイン１のシステイン残基５０９とドメイン ２のシステイン残基６９５とを連結するポリペプチド構造。26. Contains two domains connected by disulfide bonds, platelet membrane glycoprotein I It is a polypeptide structure that inhibits the binding of von Willebrand factor to b. Therefore, one of the domains is a peptide selected from the following (A) or (B) ( Domain 1): (A) Residue 469 of the mature von Willebrand factor subunit (roy a sequence of amino acids from generally residue 520 (aspartic acid) to residue 520 (aspartic acid). putido or any subset thereof, or (B) mature von Wilbra from generally residue 469 (leucine) to generally residue 520 ( peptides containing sequences of amino acids up to (aspartic acid) or any of their (one or both cysteine residues 471 and 474 are deleted or or substituted by one or more other amino acids), and the other of the domains (domain 2) is generally a residue of the mature von Willebrand factor subunit. Sequence of amino acids from 689 (glutamic acid) to approximately residue 713 (valine) or any subset thereof (which includes residue 695) The disulfide bond is between cysteine residue 509 of domain 1 and domain Polypeptide structure connecting cysteine residue 695 of 2. ２７．概して残基４４１（アルギニン）のアミノ末端および概して残基７３３（ バリン）のカルボキシ末端を有する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニッ トの断片をコードするか、またはそのサブ断片をコードするＤＮＡ配列であって 、前記ＤＮＡ配列中に通常は認められる１以上のシステインコドンが欠失するか 、またはミスセンスコドンによって置換されたＤＮＡ配列。27. Generally the amino terminus of residue 441 (arginine) and generally residue 733 ( The mature von Willebrand factor subunit has a carboxy terminus of a DNA sequence that encodes a fragment of a fragment or a subfragment thereof; , one or more cysteine codons normally found in the DNA sequence are deleted. , or a DNA sequence replaced by a missense codon. ２８．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットのアミノ酸残基４５９、４ ６２、４６４、４７１、４７４、５０９および６９５をコードするコドンが欠失 するか、またはミスセンスコドンによって置換された請求の範囲第２７項記載の ＤＮＡ配列。28. Amino acid residues 459, 4 of the mature von Willebrand factor subunit Codons encoding 62, 464, 471, 474, 509 and 695 are deleted or substituted by a missense codon according to claim 27. DNA sequence. ２９．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットのシステイン残基４５９、 ４６２、４６４、４７１および４７４をコードする野生型コドンが欠失するか、 またはミスセンスコドンによって置換された請求の範囲第２７項記載のＤＮＡ配 列。29. cysteine residue 459 of the mature von Willebrand factor subunit; The wild type codons encoding 462, 464, 471 and 474 are deleted, or or a DNA sequence according to claim 27 substituted by a missense codon. Column. ３０．残基４５９、４６２および４６４をコードする１以上の野生型システイン コドンが欠失するか、またはミスセンスコドンによって置換された請求の範囲第 ２７項記載のＤＮＡ配列。30. one or more wild type cysteines encoding residues 459, 462 and 464 Claim 1 in which a codon is deleted or replaced by a missense codon. DNA sequence according to item 27. ３１．ミスセンスコドンのそれぞれがグリシンをコードする請求の範囲第２７項 記載のＤＮＡ配列。31. Claim 27, wherein each missense codon encodes glycine. DNA sequence as described. ３２．ミスセンスコドンがアラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはアス パラギンの１以上をコードする請求の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列。32. Missense codon is alanine, threonine, serine, glycine or as 28. A DNA sequence according to claim 27 encoding one or more paragins. ３３．前記配列のそれぞれの終端に制限エンドヌクレアーゼ部位を更に含む請求 の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列。33. Claim further comprising a restriction endonuclease site at each end of said sequence. The DNA sequence according to item 27. ３４．残基４４１のコドンに先行する制限エンドヌクレアーゼ部位がＥｃｏＲＩ であり、残基７３３のコドンに後続する制限エンドヌクレアーゼ部位がＨｉｎｄ ＩＩＩである請求の範囲第３３項記載のＤＮＡ配列。34. The restriction endonuclease site preceding the codon for residue 441 is EcoRI and the restriction endonuclease site following the codon for residue 733 is Hind 34. The DNA sequence according to claim 33, which is III. ３５．概して残基４４１（アルギニン）のアミノ末端および概して残基７３３（ バリン）のカルボキシ末端を有する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニッ トの断片のいずれかのサブセットまたはサブセットの組合せをコードするＤＮＡ 配列であって、これに通常は認められる１以上で７までのシステインコドンが欠 失するか、またはミスセンスコドンによって置換されたＤＮＡ配列。35. Generally the amino terminus of residue 441 (arginine) and generally residue 733 ( The mature von Willebrand factor subunit has a carboxy terminus of DNA encoding any subset or combination of subsets of the fragments of A sequence that lacks one or more and up to seven cysteine codons that are normally observed. A DNA sequence that is missing or replaced by a missense codon. ３６．システイン残基４５９、４６２および４６４をコードするコドンがミスセ ンスコドンによってそれぞれ置換された請求の範囲第３０項記載のＤＮＡ配列。36. The codons encoding cysteine residues 459, 462 and 464 are 31. A DNA sequence according to claim 30, each substituted by a nscodon. ３７．システイン残基４５９、４６２および４６４の１つをコードするコドンが ミスセンスコドンによって置換された請求の範囲第３０項記載のＤＮＡ配列。37. The codon encoding one of cysteine residues 459, 462 and 464 is 31. A DNA sequence according to claim 30, substituted by a missense codon. ３８．システイン残基４５９、４６２および４６４のいずれか２つをコードする コドンがミスセンスコドンによって置換された請求の範囲第３０項記載のＤＮＡ 配列。38. encodes any two cysteine residues 459, 462 and 464 The DNA according to claim 30, wherein the codon is replaced by a missense codon. array. ３９．置換がなされるそれぞれのシステインコドンが、アラニン、トレオニン、 セリン、グリシンまたはアスパラギンをコードするものから選択される１以上の コドンによって置換され、いずれか１つの位置での置換についての選択は、同様 に置換がなされる全ゆる他の位置での置換の選択と独立である、請求の範囲第３ ０項記載のＤＮＡ配列。39. Each cysteine codon that is replaced is alanine, threonine, one or more selected from those encoding serine, glycine or asparagine codons and the choice for substitution at any one position is similar to Claim 3 is independent of the selection of substitutions at all other positions in which substitutions are made. DNA sequence described in item 0. ４０．グリシンコドンにより、これに置換される全ゆるシステインコドンを置換 した請求の範囲第３９項記載のＤＮＡ配列。40. Glycine codon replaces all cysteine codons it replaces The DNA sequence according to claim 39. ４１．次のドメイン（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）：ドメイン（Ａ）：フォン・ウ ィルブランド因子シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびその下流で ドメイン（Ｂ）：主として９のヌクレオチドよりなり、フォン・ウィルブランド 因子プロペプチドのアミノ末端領域の最初の３つのアミノ酸をコードするＤＮＡ 配列、およびその下流で ドメイン（Ｃ）：成熟フォン・ウィルブラント因子サブユニットの２，０５０ア ミノ酸配列の全部または一部をコードするＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ配列。41. The following domains (A), (B) and (C): Domain (A): Von Woo a DNA sequence encoding the Willebrand factor signal peptide, and downstream thereof Domain (B): mainly consists of 9 nucleotides, von Willebrand DNA encoding the first three amino acids of the amino-terminal region of the factor propeptide sequence, and downstream of Domain (C): 2,050 amino acids of the mature von Willebrand factor subunit. A DNA sequence that encodes all or part of a amino acid sequence. ４２．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットＤＮＡに対応するＤＮＡサ ブ配列、そのドメイン（Ｃ）が、概して残基４４１（アルギニン）から概して残 基７３０（アスパラギン）までのアミノ酸配列をコードする請求の範囲第４１項 記載のＤＮＡ配列。42. DNA subunit corresponding to mature von Willebrand factor subunit DNA sequence, whose domain (C) extends generally from residue 441 (arginine) to Claim 41 encoding the amino acid sequence up to group 730 (asparagine) DNA sequence as described. ４３．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットＤＮＡに対応するＤＮＡサ ブ配列、そのドメイン（Ｃ）が、成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニット アミノ酸一次構造の非連続的サブ配列をコードする請求の範囲第４１項記載のＤ ＮＡ配列。43. DNA subunit corresponding to mature von Willebrand factor subunit DNA domain (C) of the mature von Willebrand factor subunit D according to claim 41, which encodes a non-contiguous subsequence of the primary amino acid structure. NA sequence. ４４．細胞の小胞体の膜を横切る付加的なポリペプチド配列の輸送を指向し得る ポリペプチドであって、以下のドメイン（Ａ）およびドメイン（Ｂ）：ドメイン （Ａ）：ヒトフォン・ウィルブランド因子サブユニットのシグナルペプチドのい ずれかのサブセット（このシグナルペプチドは、小胞体によって、および／また は小胞体および／またはシグナルペプチドと複合する転移受容体によって認識さ れ得る）、および ドメイン（Ｂ）：主としてフォン・ウィルブランド因子プロペプチドのアミノ末 端終端の最初の１０残基までよりなるペプチド配列からなり、前記ドメイン（Ｂ ）は、ドメイン（Ａ）のカルボキシ末端にアミド結合によって連結され、前記付 加的なポリペプチド配列のアミノ末端にアミド結合によって連結し得るものであ り、ドメイン（Ａ）およびドメイン（Ｂ）を含むポリペプチドが、付加的なポリ ペプチド配列の治療活性が全部または一部保持される様式で、付加的なポリペプ チド配列を含む前記ポリペプチドの細胞内開裂が可能となるのに十分なヒトフォ ン・ウィルブランド因子シグナルペプチドおよびプロペプチドの配列のサブセッ トを含むポリペプチド。44. capable of directing the transport of additional polypeptide sequences across the membrane of the endoplasmic reticulum of a cell A polypeptide comprising the following domains (A) and (B): (A): Signal peptide of human von Willebrand factor subunit. (This signal peptide is transmitted by the endoplasmic reticulum and/or is recognized by the endoplasmic reticulum and/or by translocation receptors in complex with signal peptides. ), and Domain (B): Mainly the amino terminal of the von Willebrand factor propeptide It consists of a peptide sequence consisting of the first 10 residues at the end and ) is linked to the carboxy terminus of domain (A) by an amide bond, and can be linked to the amino terminus of an additional polypeptide sequence by an amide bond. In this case, a polypeptide comprising domain (A) and domain (B) is added to an additional polypeptide. additional polypeptides in a manner that retains all or part of the therapeutic activity of the peptide sequence. Sufficient human phosphatide to enable intracellular cleavage of the polypeptide containing the tide sequence. A subset of the Willebrand factor signal and propeptide sequences. A polypeptide containing ４５．請求の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列を含むクローン化ベクタ。45. A cloning vector comprising the DNA sequence according to claim 27. ４６．主として請求の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列を含むＭ１３ｍｐ１８バク テリオファージからなるクローン化ベクタ。46. An M13mp18 bacterium mainly comprising the DNA sequence according to claim 27. A cloning vector consisting of a theriophage. ４７．請求の範囲第３０項記載のＤＮＡ配列を含むクローン化ベクタ。47. A cloning vector comprising the DNA sequence according to claim 30. ４８．概して残基４４１（アルギニン）でアミノ末端をおよび概して残基７３３ （バリン）でカルボキシ末端を有する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニ ットの断片をコードするＤＮＡまたはそのサブ断片を含む生物学的に機能性の発 現プラスミドまたはウイルス発現ベクタであって、前記コードＤＮＡに通常は存 在する１以上のシステインコドンが欠失するか、またはミスセンスコドンによっ て置換され、そのプラスミドまたはベクタは宿主細胞中で複製され得て、前記ｖ ＷＦサブユニット断片またはサブ断片のその中での発現を指示するプラスミドま たはベクタ。48. the amino terminus generally at residue 441 (arginine) and generally at residue 733 Mature von Willebrand factor subunit with carboxy terminus (valine) A biologically functional protein containing a DNA encoding a fragment of the cut or a subfragment thereof. A current plasmid or viral expression vector that is normally present in the coding DNA. One or more existing cysteine codons are deleted or a missense codon is present. the plasmid or vector can be replicated in the host cell, and the v A plasmid or plasmid that directs the expression of a WF subunit fragment or subfragment therein. or vector. ４９．前記プラスミドまたはベクタ内の成熟フォン・ウィルブランド因子サブユ ニットのシステイン残基４５９、４６２、４６４、４７１および４７４をコード するそのコドンが欠失するか、またはミスセンスコドンによって置換された請求 の範囲第４８項記載の発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタ。49. The mature von Willebrand factor subunit in the plasmid or vector encodes cysteine residues 459, 462, 464, 471 and 474 of the A claim in which that codon is deleted or replaced by a missense codon The expression plasmid or viral expression vector according to item 48. ５０．前記プラスミドまたはベクタ内の成熟フォン・ウィルブランド因子サブユ ニットのシステイン残基４５９、４６２、４６４、４７１、４７４、５０９およ び６９５をコードするそのコドンが欠失するか、またはミスセンスコドンによっ て置換された請求の範囲第４８項記載の発現プラスミドまたはウイルス発現ベク タ。50. The mature von Willebrand factor subunit in the plasmid or vector Nit cysteine residues 459, 462, 464, 471, 474, 509 and and the codon encoding 695 is deleted or caused by a missense codon. The expression plasmid or virus expression vector according to claim 48 substituted with Ta. ５１．ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ−１〜ｐＥＴ−７およびこれらから誘導される全ゆ る構成体よりなる群から選択される請求の範囲第４８項記載の発現プラスミド。51. pBR322, pET-1 to pET-7 and all derivatives thereof. 49. The expression plasmid of claim 48, which is selected from the group consisting of constructs comprising: ５２．真核細胞中で、概して残基４４１（アルギニン）にアミノ末端をおよび概 して残基７３０（アスパラギン）にカルボキシ末端を有する成熟フォン・ウィル ブランド因子サブユニットの断片のそこでの発現およびそこからの分泌を指示し 得る発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタまたはそのサブ断片であって、前 記プラスミドまたはベクタが転写プロモータを含み、前記断片またはサブ断片を コードするＤＮＡ配列が下流に続き、シグナル配列が前記コードＤＮＡ配列に対 して上流に適切なリーディングフレームで位置し、前記シグナル配列が、真核細 胞からの断片またはサブ断片の分泌を指示および／または促進するプラスミドま たはベクター。52. In eukaryotic cells, the amino terminus is generally at residue 441 (arginine) and mature von Will with a carboxy terminus at residue 730 (asparagine). directs the expression and secretion therefrom of fragments of Brand factor subunits. an expression plasmid or viral expression vector or sub-fragment thereof, which The plasmid or vector contains a transcription promoter and carries the fragment or sub-fragment. A coding DNA sequence follows downstream, and a signal sequence corresponds to said coding DNA sequence. and the signal sequence is located upstream and in proper reading frame of the eukaryotic cell. Plasmids or subfragments that direct and/or facilitate secretion of fragments or subfragments from cells. or vector. ５３．真核細胞中で、概して残基４４１（アルギニン）でアミノ末端をおよび概 して残基７３０（アスパラギン）でカルボキシ末端を有する成熟フォン・ウィル ブランド因子サブユニットの断片またはそのサブ断片（１以上のシステイン残基 ４５９、４６２および４６４はグリシンの単一残基によって置換されている）の そこにでの発現およびそこからの分泌を指示し得る請求の範囲第４８項記載の発 現プラスミドまたはウイルス発現ベクタであって、したがって前記プラスミドま たはベクタが転写プロモータを含み、前記断片またはサブ断片をコードするＤＮ Ａ配列が下流に続き、シグナル配列が前記コードＤＮＡ配列に対して上流に適切 なリーディングフレームで位置し、前記シグナル配列が、真核細胞からの断片ま たはサブ断片の分泌を指示および／または促進するプラスミド又はベクタ。53. In eukaryotic cells, the amino terminus generally ends at residue 441 (arginine) and mature von Will with a carboxy terminus at residue 730 (asparagine). A fragment of a brand factor subunit or a subfragment thereof (one or more cysteine residues) 459, 462 and 464 are replaced by a single residue of glycine) The agent according to claim 48, which is capable of directing expression in and secretion therefrom. current plasmid or viral expression vector, and therefore or the vector contains a transcription promoter and encodes the fragment or sub-fragment. A sequence follows downstream and a signal sequence is suitably upstream to said coding DNA sequence. The signal sequence is located in a common reading frame, and the signal sequence is a fragment or fragment from a eukaryotic cell. A plasmid or vector that directs and/or facilitates secretion of a subfragment or subfragment. ５４．請求の範囲第４８項記載の発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタによ り形質転換された組換え宿主。54. by the expression plasmid or virus expression vector according to claim 48. A recombinant host that has been transformed. ５５．前記宿主が、エシェリキアまたはバシルスから選択される原核生物、また は酵母（サッカロミセス）、培養昆虫細胞および培養哺乳動物細胞よりなる群か ら選択される真核細胞である請求の範囲第５４項記載の組換え宿主。55. The host is a prokaryote selected from Escherichia or Bacillus, or is a group consisting of yeast (Saccharomyces), cultured insect cells, and cultured mammalian cells? 55. The recombinant host according to claim 54, which is a eukaryotic cell selected from. ５６．宿主がイー・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、その中の発現プラスミド がｐＥＴ−３Ａである請求の範囲第５４項記載の組換え宿主。56. The host is E. coli strain BL21 (DE3), and the expression plasmid therein 55. The recombinant host according to claim 54, wherein is pET-3A. ５７．バキュロウイスルオートグラファ・カリホルニカ核多角体病ウイルス、お よびレトロウイルスよりなる群から選択される請求の範囲第４８項記載のウイル ス発現ベクタ。57. Baculovirus autographa californica nuclear polyhedrosis virus, 49. The virus according to claim 48, which is selected from the group consisting of expression vector. ５８．請求の範囲第５２項記載の発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタによ り形質転換された組換え真核宿主細胞。58. by the expression plasmid or virus expression vector according to claim 52. A recombinant eukaryotic host cell that has been transformed. ５９．主として概して残基４４１（アルギニン）から概して残基７３３（バリン ）までのアミノ酸配列からなる成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの その断片をコードするか、またはそのいずれかのサブ断片をコードするＤＮＡか ら、比較し得る非変異体アミノ酸配列のものの場合より少ないシステイン残基を 含む変異体フォン・ウィルブランド因子断片またはそのサブ断片を製造する方法 であって、前記フォン・ウィルブランド因子サブユニットの一部をコードする変 異体ＤＮＡ配列を含む生物学的に機能性の発現プラスミドにより形質転換した宿 主生物を、変異体フォン・ウィルブランド因子断片またはサブ断片の宿主生物に よる発現を行う条件下で培養し、前記断片またはサブ断片をこれから回収するこ とを含む方法。59. Predominantly from residue 441 (arginine) to residue 733 (valine) ) of the mature von Willebrand factor subunit consisting of the amino acid sequence up to DNA that encodes that fragment or any subfragment thereof have fewer cysteine residues than those of comparable non-variant amino acid sequences. A method of producing a mutant von Willebrand factor fragment or subfragment thereof comprising a variant encoding a portion of the von Willebrand factor subunit; A host transformed with a biologically functional expression plasmid containing a foreign DNA sequence. host organism for the mutant von Willebrand factor fragment or subfragment. The fragment or sub-fragment can be recovered from the fragment or sub-fragment and a method including. ６０．請求の範囲第５９項記載の方法によって製造されたポリペプチド。60. A polypeptide produced by the method of claim 59. ６１．所定の数のシステイン残基を含む親ポリペプチドを模倣した変異体ポリペ プチド（その親ポリペプチドは、概して残基４４１（アルギニン）で開始し、概 して残基７３３（バリン）で終了する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニ ットのその断片のアミノ酸配列を更に含む）またはそのいずれかのサブセット（ その変異体ポリペプチドは、前記所定の数より少ないシステイン残基を含み、こ れは親ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異誘発によって製造され る）。61. Mutant polypeptides that mimic a parent polypeptide containing a defined number of cysteine residues peptide, whose parent polypeptide generally begins at residue 441 (arginine) and generally begins at residue 441 (arginine) The mature von Willebrand factor subunit ends at residue 733 (valine). further comprising the amino acid sequence of that fragment of the set) or any subset thereof ( The variant polypeptide contains less than said predetermined number of cysteine residues; are produced by mutagenesis of the nucleotide sequence encoding the parent polypeptide. ). ６２．欠失しまたは置換されたシステイン位置に隣接する１以上のアミノ酸残基 も欠失しかつ／または置換された請求の範囲第６１項記載の変異体ポリペプチド 。62. one or more amino acid residues adjacent to the deleted or substituted cysteine position 62. The variant polypeptide according to claim 61, which is also deleted and/or substituted. . ６３．親ポリペプチドを模倣した変異体ポリペプチドを製造する方法であって（ その親は成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットの概して残基４４１（ア ルギニン）から概して残基７３３（バリン）までのアミノ酸の配列または前記配 列のサブセットからなり、その変異体ポリペプチドは前記親の１以上のシステイ ン残基が欠失するか、またはアラニン、トレオニン、セリン、グリシンまたはア スパラギンから選択される１以上のアミノ酸残基によって置換された点で親ポリ ペプチドと異なる）、親ＤＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を与え、これ から誘導され親ポリペプチドのシステイン残基に対応する１以上のコドンが欠失 または変異した変異体ヌクレオチド配列を調製し、その後前記変異体ＤＮＡ配列 を含む生物学的に機能性の発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタにより形質 転換した宿主生物を、宿主生物による変異体ポリペプチドの発現を行う条件下で 培養し、これから前記ポリペプチドを回収することを含む方法。63. A method for producing a mutant polypeptide that mimics a parent polypeptide, the method comprising: Its parent is generally residue 441 (alpha) of the mature von Willebrand factor subunit. luginine) to generally residue 733 (valine) or said sequence. the variant polypeptide comprises one or more cysteines of said parent. or alanine, threonine, serine, glycine, or alanine, threonine, serine, glycine, or The parent polypeptide is substituted with one or more amino acid residues selected from Sparagine. a nucleotide sequence encoding the parent DNA sequence (different from the peptide), which derived from a parent polypeptide with one or more codons corresponding to cysteine residues deleted. or preparing a mutated variant nucleotide sequence and then converting said variant DNA sequence into Transfected by a biologically functional expression plasmid or viral expression vector containing The transformed host organism is subjected to conditions that permit expression of the mutant polypeptide by the host organism. A method comprising culturing and recovering said polypeptide therefrom. ６４．主として概して残基４４１（アルギニン）から概して残基７３０（アスパ ラギン）までのアミノ酸配列からなる成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニ ットのその断片または１以上の残基位置４５９、４６２および４６４を含むその サブ断片に対応するＤＮＡから、前記サブユニット断片またはサブ断片の生物学 的に活性な二量体を製造する方法であって、（Ａ）その断片コード領域の上流に その適切なリーディングフレームでシグナルペプチド配列を含むサブユニット断 片またはサブ断片をコードするＤＮＡ配列を与え、 （Ｂ）適切なベクタにＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたはウイルス発現 ベクタからなる構成体を生成し（その構成体は、前記サブユニット断片またはサ ブ断片の真核細胞中での発現およびこれからの分泌を指示し得る）、（Ｃ）前記 発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタにより真核宿主細胞を形質転換し、 （Ｄ）サブユニット断片またはサブ断片の二量体形態の宿主細胞内での発現およ びこれからの分泌を生起する条件下で前記形質転換宿主細胞を培養する（その下 で単量体サブユニット断片またはサブ断片は二量体化に適切な三次構造およびそ の二量体化が想定され、その下で前記単量体サブユニット断片またはサブ断片ま たはその二量体形態のグリコシル化が行われる）、工程を含む方法。64. Mainly from generally residue 441 (arginine) to generally residue 730 (aspart) The mature von Willebrand factor subunit consists of the amino acid sequence up to or a fragment thereof containing one or more residue positions 459, 462 and 464. biology of said subunit fragment or subfragment from the DNA corresponding to the subfragment. A method for producing a dimer that is actively active, the method comprising: (A) upstream of the fragment coding region; The subunit fragment containing the signal peptide sequence in its proper reading frame. providing a DNA sequence encoding a fragment or subfragment; (B) Expression plasmid or viral expression by inserting the DNA sequence into an appropriate vector. Generate a construct consisting of the vector (the construct is the subunit fragment or subunit fragment) (C) the above-mentioned transforming a eukaryotic host cell with an expression plasmid or viral expression vector; (D) Expression and expression of dimeric forms of subunit fragments or subfragments in host cells. The transformed host cells are cultured under conditions that cause secretion from the cells. The monomeric subunit fragments or subfragments have the appropriate tertiary structure for dimerization and their dimerization of the monomeric subunit fragments or sub-fragments or or glycosylation of its dimeric form). ６５．グリコシル化され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し た約１１６ｋＤａの見かけの分子量を有する請求の範囲第６４項記載の方法によ って調製された二量体ポリペプチド。65. Glycosylated and determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis The method of claim 64 has an apparent molecular weight of about 116 kDa. A dimeric polypeptide prepared by ６６．主として概して残基４４１（アルギニン）から概して残基７３０（アスパ ラギン）までのアミノ酸配列からなる成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニ ットのその断片に対応するＤＮＡから、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 による約５２ｋＤａの見かけの分子量を有する前記サブユニット断片の生物学的 に活性な単量体を製造する方法であって、（Ａ）その断片コード領域の上流にそ の適切なリーディングフレームでシグナルペプチド配列を含むサブユニット断片 をコードするＤＮＡ配列を与え、（Ｂ）ＤＮＡ配列を変異誘発し、通常は鎖間ジ スルフィド接触に関与するシステイン残基を特定し得るシステインコドンの数を 低減させ、（Ｃ）適切なベクタにＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたはウ イルス発現ベクタからなる構成体を生成し（前記構成体は、前記単量体サブユニ ット断片の真核細胞中での発現およびこれからの分泌を指示し得る）、（Ｄ）前 記構成体により真核宿主細胞を形質転換し、（Ｅ）単量体サブユニット断片の前 記宿主細胞内での発現およびこれからの分泌を生起する条件下で前記形質転換宿 主細胞を培養する（前記条件は前記断片のグリコシル化も許容する）、 工程を含む方法。66. Mainly from generally residue 441 (arginine) to generally residue 730 (aspart) The mature von Willebrand factor subunit consists of the amino acid sequence up to SDS polyacrylamide gel electrophoresis from the DNA corresponding to that fragment of Biological analysis of the subunit fragment with an apparent molecular weight of approximately 52 kDa by A method for producing a monomer that is active in (A) the fragment upstream of the coding region; subunit fragment containing the signal peptide sequence in the proper reading frame of (B) Mutagenicity of the DNA sequence, usually resulting in interstrand dinucleotides. The number of cysteine codons that can identify cysteine residues involved in sulfide contacts (C) inserting the DNA sequence into an appropriate vector to create an expression plasmid or generate a construct consisting of the virus expression vector (said construct comprises the monomeric subunit (D) can direct the expression and subsequent secretion of the cut fragment in eukaryotic cells. (E) transforming a eukaryotic host cell with the above construct; said transformed host cells under conditions that cause expression in and secretion from said host cells. culturing the principal cells (the conditions also permit glycosylation of the fragments); A method that involves a process. ６７．フォン・ウィルブランド因子の断片または断片の組合せに対応するＤＮＡ から生物学的に活性なポリペプチド構造を製造する方法であって、（Ａ）フォン ・ウィルブランド因子の１または複数の断片をコードするＤＮＡ配列を与え（こ れはその断片コード領域の上流にその適切なリーディングフレームで、請求の範 囲第４４項記載のポリペプチドをコードするＤＮＡサブ配列を更に含む）、 （Ｂ）適切なベクタにＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたはウイルス発現 ベクタからなる構成体を生成し（その構成体は、前記１または複数のサブユニッ ト断片の真核細胞中での発現およびこれからの分泌を指示し得る）、（Ｃ）前記 発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタにより真核宿主細胞を形質転換し、 （Ｄ）前記ポリペプチド構造の宿主内での発現およびこれからの分泌を生起する 条件下で前記形質転換宿主細胞を培養する（この条件はそのグリコシル化も更に 許容する）、 工程を含む方法。67. DNA corresponding to a fragment or combination of fragments of von Willebrand factor A method for producing a biologically active polypeptide structure from (A) von - Provide a DNA sequence encoding one or more fragments of Willebrand factor (this The fragment is in its proper reading frame upstream of the coding region and is claimed in its proper reading frame. further comprising a DNA subsequence encoding a polypeptide according to paragraph 44), (B) Expression plasmid or viral expression by inserting the DNA sequence into an appropriate vector. Generate a construct of vectors (the construct comprises the one or more subunits) (C) the above-mentioned transforming a eukaryotic host cell with an expression plasmid or viral expression vector; (D) causing expression of and secretion of said polypeptide structure within the host; Cultivate the transformed host cell under conditions that also inhibit its glycosylation. allow), A method that involves a process. ６８．ＤＮＡから治療ポリペプチドを製造する方法であって、（Ａ）治療ポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列を与え（これはそのポリペプチドコード領域の上 流にその適切なリーディングフレームで、請求の範囲第４４項記載のポリペプチ ドに対応するＤＮＡ配列を更に含む）、（Ｂ）得られるＤＮＡ配列を適切なベク タに挿入して発現プラスミドまたはウイルス発現べクタからなる構成体を生成し （その構成体は、前記治療ポリペプチドの真核細胞中での発現およびこれからの 分泌を指示し得る）、（Ｃ）前記発現プラスミドまたはウイルス発現ベクタによ り真核宿主細胞を形質転換し、 （Ｄ）治療ポリペプチドの前記宿主細胞内での発現およびこれからの分泌を生起 する条件下で前記形質転換宿主細胞を培養する、工程を含む方法。68. A method for producing a therapeutic polypeptide from DNA, comprising: (A) a therapeutic polypeptide; given the DNA sequence encoding the polypeptide (which extends above its polypeptide coding region). the polypeptide of claim 44 in its proper reading frame. (B) Place the resulting DNA sequence into an appropriate vector. to generate a construct consisting of an expression plasmid or viral expression vector. (The construct provides for the expression and subsequent development of said therapeutic polypeptide in eukaryotic cells. (C) by the expression plasmid or viral expression vector. transform eukaryotic host cells, (D) causing expression of a therapeutic polypeptide within and secretion from said host cell; The method comprises the step of culturing the transformed host cell under conditions of. ６９．フォン・ウィルブランド因子サブユニットまたは１以上のそのサブセット からなるいずれかのポリペプチドに特異的な抗体であって、請求の範囲第１項記 載のポリペプチドにより動物を免疫し、その後これにより生成された特定の抗体 を単離する方法によって製造される抗体。69. von Willebrand factor subunit or one or more subsets thereof An antibody specific for any polypeptide consisting of immunization of an animal with the polypeptide described above, and then the specific antibodies produced thereby. An antibody produced by a method for isolating. ７０．フォン・ウィルブランド因子サブユニットまたはそのサブセットを含むい ずれかのポリペプチドに特異的な抗体であって、前記抗体のエピトープが前記サ ブユニットまたは前記サブユニットのサブセットを含むポリペプチド中の２つの システイン残基の間のジスルフィド結合の存在に依存し、そのシステイン残基は サブユニット残基５０９および６９５であるかこれと等価であり、その抗体は、 請求の範囲第４項記載のポリペプチドにより動物を免疫化し、その後これにより 生成された特定の抗体を単離する方法によって製造される抗体。70. containing a von Willebrand factor subunit or a subset thereof. an antibody specific for any of the polypeptides, wherein the epitope of the antibody is in a polypeptide comprising a subunit or a subset of said subunits. Depends on the presence of disulfide bonds between cysteine residues; subunit residues 509 and 695 or equivalent, and the antibody is Immunizing an animal with the polypeptide according to claim 4, and then immunizing the animal with the polypeptide of claim 4; Antibodies produced by methods that isolate the specific antibodies produced. ７１．血小板に対するフォン・ウィルブランド因子の結合を阻害するのに有効な 請求の範囲第１項記載の１以上のポリペプチドおよび薬学的に許容し得るキャリ ヤを含む治療組成物。71. Effective in inhibiting the binding of von Willebrand factor to platelets one or more polypeptides according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier A therapeutic composition comprising: ７２．血小板と有効量の請求の範囲第７１項記載の組成物とを接触させることを 含む、血小板活性化および／または凝集の阻害方法。72. contacting platelets with an effective amount of the composition of claim 71; A method of inhibiting platelet activation and/or aggregation, comprising: ７３．血小板と有効量の請求の範囲第７１項記載の組成物とを接触させることを 含む、表面に対する血小板の付着の阻害方法。73. contacting platelets with an effective amount of the composition of claim 71; A method of inhibiting platelet adhesion to a surface, comprising: ７４．患者の血栓症を阻害するに際し、請求の範囲第７１項記載の有効量の組成 物をこの種の患者に投与することを含む方法。74. An effective amount of the composition according to claim 71 in inhibiting thrombosis in a patient. A method comprising administering a substance to such a patient. ７５．患者のフォン・ウィルブランド病を処置するに際し、請求の範囲第６５項 記載の有効量の組成物をこの種の患者に投与することを含む方法。75. In treating von Willebrand disease in a patient, claim 65 A method comprising administering to such a patient an effective amount of a composition as described. ７６．コラーゲン、ヘパリン様グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンに 結合し得る請求の範囲第１項記載のポリペプチド。76. Collagen, heparin-like glycosaminoglycans or proteoglycans The polypeptide according to claim 1, which is capable of binding to the polypeptide of claim 1. ７７．親ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列の変異誘 発によって形成される変異体ポリペプチドであって（親ポリペプチドは、フォン ・ウィルブランド因子の「Ａ１」ドメインに対して実質的な配列相同性を有する アミノ酸の配列からなり、所定の数のシステイン残基を更に含む）、親ポリペプ チドの鎖内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むが、前記所定の数 よりシステインが少ない前記変異体ポリペプチド。77. Mutagenesis of a nucleotide sequence encoding all or part of a parent polypeptide a variant polypeptide formed by ・Has substantial sequence homology to the “A1” domain of Willebrand factor consisting of a sequence of amino acids and further containing a predetermined number of cysteine residues), the parent polypeptide containing cysteine residues that form intrachain disulfide bonds, but with a predetermined number of Said variant polypeptide having fewer cysteines. ７８．親ポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列の変異誘 発によって形成される変異体ポリペプチドであって（親ポリペプチドは、フォン ・ウィルブランド因子の「Ａ１」ドメインに対して実質的な配列相同性を有する アミノ酸の配列からなる）、親ポリペプチドに認められない１以上の付加的なシ ステイン残基を含む前記変異体ポリペプチド。78. Mutagenesis of a nucleotide sequence encoding all or part of a parent polypeptide a variant polypeptide formed by ・Has substantial sequence homology to the “A1” domain of Willebrand factor sequence of amino acids), one or more additional sequences not found in the parent polypeptide Said variant polypeptide comprising a stain residue. ７９．主として概して残基４４１（アルギニン）から概して残基７３０（アスパ ラギン）までのアミノ酸配列からなる成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニ ットのその単量体断片またはそのサブ断片（１以上の残基位置４５９、４６２お よび４６４を含む）に対応するＤＮＡから、前記単量体断片またはサブ断片の生 物学的に活性な二量体を製造する方法であって、（Ａ）その断片コード領域の上 流にその適切なリーディングフレームでシグナルペプチド配列を更に含む単量体 断片またはサブ断片をコードするＤＮＡ配列を構成し、 （Ｂ）適切なベクタにＤＮＡ配列を挿入して発現プラスミドまたはウイルス発現 ベクタからなる構成体を生成し（前記構成体は、前記単量体断片またはサブ断片 の真核細胞中での発現およびこれからの分泌を指示し得る）、（Ｃ）前記構成体 により真核宿主細胞を形質転換し、（Ｄ）単量体断片またはサブ断片の二量体形 態の宿主細胞内での発現およびこれからの分泌を生起する条件下で前記形質転換 宿主細胞を培養する（その下で単量体断片またはサブ断片はその二量体化に適切 な三次構造が想定され、その下で前記単量体サブユニット断片またはサブ断片ま たはその二量体形態のグリコシル化が行われる）、 工程を含む方法。79. Mainly from generally residue 441 (arginine) to generally residue 730 (aspart) The mature von Willebrand factor subunit consists of the amino acid sequence up to the monomeric fragment or subfragment thereof (one or more residue positions 459, 462 and and 464) from which the monomer fragment or subfragment is produced. 1. A method for producing a physically active dimer, comprising: (A) a fragment coding region thereof; A monomer that further comprises a signal peptide sequence in its proper reading frame. constitutes a DNA sequence encoding a fragment or sub-fragment; (B) Expression plasmid or viral expression by inserting the DNA sequence into an appropriate vector. generating a construct consisting of the vector, said construct comprising said monomer fragment or subfragment; (C) said construct capable of directing expression in and secretion from eukaryotic cells of (D) transforming a eukaryotic host cell with a dimeric form of the monomeric fragment or subfragment; said transformation under conditions that result in expression in the host cell and secretion from the Cultivate host cells (under which monomeric fragments or subfragments are suitable for their dimerization) A tertiary structure is assumed under which the monomer subunit fragment or subfragment or or glycosylation of its dimeric form), A method that involves a process. ８０．概して残基４４９（バリン）で開始し概して残基７２８（リジン）で終了 する成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットのその断片のアミノ酸配列か らなる親ポリペプチドを模倣する変異体ポリペプチドまたはその二量体であって 、これからＯまたはＮ結合グリコシル化の部位である親の１以上のセリン、トレ オニンまたはアスパラギン残基が欠失するか、または１以上の他のアミノ酸によ って置換され、前記変異体ポリペプチドが宿主真核生物中で組換えＤＮＡから発 現される場合に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したものと して５２ｋＤａの見かけの分子量を有する親ポリペプチドの化学種より少ないグ リコシル化を有する前記変異体ポリペプチド。80. Generally starts at residue 449 (valine) and generally ends at residue 728 (lysine) The amino acid sequence of that fragment of the mature von Willebrand factor subunit A variant polypeptide or dimer thereof that mimics a parent polypeptide consisting of , from which one or more parent serine, tre, sites of O- or N-linked glycosylation are removed. Onine or asparagine residues are deleted or replaced by one or more other amino acids. and the variant polypeptide is generated from recombinant DNA in a host eukaryote. as determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, if less than the parent polypeptide species with an apparent molecular weight of 52 kDa. Said variant polypeptide having lycosylation. ８１．請求の範囲第８０項記載の変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。81. A DNA sequence encoding a variant polypeptide according to claim 80. ８２．患者の血栓症を予防または処置するに際し、この種の患者に対し、（Ａ） 薬学的に許容し得るキャリヤ、および（Ｂ）成熟フォン・ウィルブランド因子サ ブユニットの概して残基４４９（バリン）から概して残基７２８（リジン）まで のアミノ酸配列を模倣するポリペプチド（このポリペプチドは、循環性成熟ｖＷ Ｆから単離されＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による５２ｋＤａの見か けの分子量を有する４４９〜７２８断片に付着して認められるものより少ないグ リコシル化を含む）を含む有効量の治療組成物を投与することを含む方法。82. When preventing or treating thrombosis in a patient, (A) a pharmaceutically acceptable carrier, and (B) a mature von Willebrand factor supplement. from generally residue 449 (valine) to generally residue 728 (lysine) of the unit a polypeptide that mimics the amino acid sequence of circulatory mature vW A 52 kDa protein isolated from F. by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Fewer groups than those observed attached to the 449-728 fragment with a molecular weight of 1. A method comprising administering an effective amount of a therapeutic composition comprising: ８３．フォン・ウィルブランド病患者の出血を処置するに際し、この種の患者に 対し、 （Ａ）薬学的に許容し得るキャリヤ、および（Ｂ）成熟フォン・ウィルブランド 因子サブユニットの概して残基４４９（バリン）から概して残基７２８（リジン ）までのアミノ酸配列を模倣する二量体１１６ｋＤａポリペプチド（この二量体 ポリペプチドは、完全にグリコシル化された循環性成熟ｖＷＦの比較し得るジス ルフィド結合配列領域に認められるものより少ないグリコシル化を含み、かつ／ またはチタニ・ケーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５：３１７１（１９８６ ）により測定されたような前記１１６ｋＤａジスルフィド結合領域の最大グリコ シル化より少なく含む）を含む有効量の治療組成物を投与することを含む方法。83. When treating bleeding in patients with von Willebrand disease, On the other hand, (A) a pharmaceutically acceptable carrier; and (B) a mature von Willebrand. The factor subunits generally range from residue 449 (valine) to generally residue 728 (lysine). ) (this dimeric 116 kDa polypeptide mimics the amino acid sequence up to The polypeptide has a comparable dispersion of fully glycosylated circulating mature vWF. contains less glycosylation than that found in the rufido-binding sequence region, and/ or Chitani K. et al., Biochemistry, 25:3171 (1986 ) of the 116 kDa disulfide bond region as determined by sylated). ８４．成熟フォン・ウィルブランド因子サブユニットに対して概して残基４４９ 〜７２８からなるその断片のみをコードするＤＮＡ配列を含む真核宿主細胞を処 理し、ｖＷＦ断片のグリコシル化を制限するに際し（その中で発現されるその二 量体を含む）、前記宿主細胞の培養培地に、前記グルコシル化を制限するのに十 分な量のッニカマイシンを添加することを含む真核宿主細胞の処理方法。84. Typically residue 449 for the mature von Willebrand factor subunit Treating eukaryotic host cells containing a DNA sequence encoding only that fragment consisting of in limiting the glycosylation of the vWF fragment (the two expressed therein). glycosylation), in the culture medium of said host cells, sufficient to limit said glycosylation. A method of treating eukaryotic host cells comprising adding a sufficient amount of nickamycin. ８５．ポリペプチドの治療潜在力を改良する目的で前記ポリペプチドから１以上 の炭水化物部分を除去し得る酵素を用いて請求の範囲第１項記載のポリペプチド を処理する方法であって、前記酵素の十分な活性を許容する条件下で前記ポリペ プチドのサンプルに前記酸素を添加することを含むポリペプチドの処理方法。85. one or more of said polypeptides for the purpose of improving the therapeutic potential of said polypeptides. The polypeptide according to claim 1 using an enzyme capable of removing the carbohydrate moiety of A method of treating said polypeptide under conditions that permit sufficient activity of said enzyme. A method for processing a polypeptide comprising adding said oxygen to a sample of peptides. ８６．ＤＮＡから治療ポリペプチドを製造するに際し、（Ａ）その治療ポリペプ チドコード領域の上流にその適切なリーディングフレームでそれ自体シグナルペ プチドに対応するＤＮＡ配列およびその直接下流に半極性または極性スペーサ配 列を含む治療ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を与え、 （Ｂ）得られるＤＮＡ配列を適切なベクタに挿入して発現プラスミドまたはウイ ルス発現ベクタからなる一定体を生成し（これは前記治療ポリペプチドの真核宿 主細胞中での発現およびこれからの分泌を指示し得る）、（Ｃ）前記一定体によ り真核宿主細胞を形質転換し、（Ｄ）治療ポリペプチドの前記宿主細胞内での発 現およびこれからの分泌を生起する条件下で前記形質転換宿主細胞を培養する、 工程を含む方法。86. When producing a therapeutic polypeptide from DNA, (A) the therapeutic polypeptide upstream of the coded region and itself in its appropriate reading frame. A DNA sequence corresponding to the peptide and a semipolar or polar spacer immediately downstream of it. providing a DNA sequence encoding a therapeutic polypeptide comprising a sequence; (B) Insert the resulting DNA sequence into an appropriate vector to create an expression plasmid or virus. generate a constant consisting of a virus expression vector (which is a eukaryotic host for the therapeutic polypeptide). (C) by the constant (D) expressing a therapeutic polypeptide in said host cell; culturing the transformed host cell under conditions that cause current and future secretion; A method that involves a process.
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