JPH0646842A - クローン化増幅可能遺伝子の真核細胞内導入法及びタンパク性産物の産生方法 - Google Patents
クローン化増幅可能遺伝子の真核細胞内導入法及びタンパク性産物の産生方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 選択又は識別可能な形質をコードする機能欠
除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIIと選択又は識別が
可能な別の形質をコードする機能性増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIII とを含むデオキシリボ核酸分子と、所
望のタンパク性産物を産生するための遺伝情報をコード
する機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩとを、共
に用いて適切な真核細胞を同時形質転換することによ
る、ＤＮＡＩのマルチコピーを真核細胞内に導入する方
法、並びに、この方法を利用するｍＲＮＡ転写体および
有用タンパク質の産生方法。 【効果】 有用タンパク質の産生量の増大を可能にす
る。
除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIIと選択又は識別が
可能な別の形質をコードする機能性増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIII とを含むデオキシリボ核酸分子と、所
望のタンパク性産物を産生するための遺伝情報をコード
する機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩとを、共
に用いて適切な真核細胞を同時形質転換することによ
る、ＤＮＡＩのマルチコピーを真核細胞内に導入する方
法、並びに、この方法を利用するｍＲＮＡ転写体および
有用タンパク質の産生方法。 【効果】 有用タンパク質の産生量の増大を可能にす
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク性産物をコー
ドする遺伝子を含むデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）
の、真核細胞内導入及び発現に係る。本発明は、動植物
界の生体を含め、高等生物界（Super Kingdom ）の真核
生物（Eucaryotes）として分類される生体由来又はこれ
ら生体に関連した細胞の遺伝的構成を変更するのに使用
し得る。より特定的には、本発明は、クローン化した増
幅し得る遺伝子を真核細胞内に導入し、それによってコ
ードされている産物を産生するための改良ＤＮＡ媒介遺
伝子移入法に係る。
ドする遺伝子を含むデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）
の、真核細胞内導入及び発現に係る。本発明は、動植物
界の生体を含め、高等生物界（Super Kingdom ）の真核
生物（Eucaryotes）として分類される生体由来又はこれ
ら生体に関連した細胞の遺伝的構成を変更するのに使用
し得る。より特定的には、本発明は、クローン化した増
幅し得る遺伝子を真核細胞内に導入し、それによってコ
ードされている産物を産生するための改良ＤＮＡ媒介遺
伝子移入法に係る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】外来
ＤＮＡを真核細胞内に導入するのに同時形質転換（co-t
ransformation ）を使用することは既に記載されてい
る。1981年 9月 3日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ81／02
425 号及び第ＷＯ81／02426 号並びにそこに記載されて
いる科学文献。高度の遺伝子発現を得る手段としての遺
伝子増幅についても既に記載がある。Alt, F. W.他、J.
Biol. Chem., 253, 1357-1370(1978) 及びWahl, G.
M. 他、J. Biol. Chem., 254, 8678-8689(1979) 。真
核遺伝子プロモータは既に公知である。Mc Knight, S.
L.他、Cell, 25, 385-398(1981) 。そして、クローン化
した増幅し得る遺伝子についても既に記載されている。
Lee, D. E.他、 Nature,294, 228-232(1981) 。
ＤＮＡを真核細胞内に導入するのに同時形質転換（co-t
ransformation ）を使用することは既に記載されてい
る。1981年 9月 3日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ81／02
425 号及び第ＷＯ81／02426 号並びにそこに記載されて
いる科学文献。高度の遺伝子発現を得る手段としての遺
伝子増幅についても既に記載がある。Alt, F. W.他、J.
Biol. Chem., 253, 1357-1370(1978) 及びWahl, G.
M. 他、J. Biol. Chem., 254, 8678-8689(1979) 。真
核遺伝子プロモータは既に公知である。Mc Knight, S.
L.他、Cell, 25, 385-398(1981) 。そして、クローン化
した増幅し得る遺伝子についても既に記載されている。
Lee, D. E.他、 Nature,294, 228-232(1981) 。
【０００３】増幅の選択が可能な公知のクローン化した
増幅し得る遺伝子には、その産物が、（ａ）細胞成長阻
害剤と直接的又は間接的に相互作用してその阻害剤を無
効にするか、又は、（ｂ）細胞の生存に必要で且つ外因
性供与物質により阻害され得るものがある。どちらの場
合でも増幅プロセスは、細胞が生存するために、ますま
す多量の産物が増大する阻害剤の存在下で産生されてい
かなければならないという性質を有する。
増幅し得る遺伝子には、その産物が、（ａ）細胞成長阻
害剤と直接的又は間接的に相互作用してその阻害剤を無
効にするか、又は、（ｂ）細胞の生存に必要で且つ外因
性供与物質により阻害され得るものがある。どちらの場
合でも増幅プロセスは、細胞が生存するために、ますま
す多量の産物が増大する阻害剤の存在下で産生されてい
かなければならないという性質を有する。
【０００４】前述の（ｂ）タイプの遺伝子産物には、ジ
ヒドロホレートレダクターゼ（dihydrofolate reductas
e ＝ＤＨＦＲ）とアスパラギン酸トランスカルバモイラ
ーゼ（aspartate transcarbamoylase ＝ＡＴＣａｓｅ）
とがあり、これらの酵素は、夫々、高濃度のメトトレキ
セート（methotrexate）とＰＡＬＡとに対して耐性をも
つ細胞内で増幅される。ＡＴＣａｓｅ遺伝子は既にクロ
ーン化されているが、動物細胞に形質転換されたことは
なく増幅されたこともない。完全なＤＨＦＲ遺伝子がク
ローン化されたことはない。ＤＨＦＲを発現する cＤＮ
Ａが構築され且つクローン化されているが、増幅したこ
とはない。
ヒドロホレートレダクターゼ（dihydrofolate reductas
e ＝ＤＨＦＲ）とアスパラギン酸トランスカルバモイラ
ーゼ（aspartate transcarbamoylase ＝ＡＴＣａｓｅ）
とがあり、これらの酵素は、夫々、高濃度のメトトレキ
セート（methotrexate）とＰＡＬＡとに対して耐性をも
つ細胞内で増幅される。ＡＴＣａｓｅ遺伝子は既にクロ
ーン化されているが、動物細胞に形質転換されたことは
なく増幅されたこともない。完全なＤＨＦＲ遺伝子がク
ローン化されたことはない。ＤＨＦＲを発現する cＤＮ
Ａが構築され且つクローン化されているが、増幅したこ
とはない。
【０００５】（ａ）タイプの遺伝子産物にはクローン化
した細菌性ネオマイシン耐性遺伝子（bacterial neomyc
in resistance gene）がある。この産物は真核生物内に
おいて発現することが示されているが、増幅することは
いまだに示されていない。
した細菌性ネオマイシン耐性遺伝子（bacterial neomyc
in resistance gene）がある。この産物は真核生物内に
おいて発現することが示されているが、増幅することは
いまだに示されていない。
【０００６】本発明は予想もつかないような別の増幅法
を開示する。選択し得る又は識別（同定）し得る生化学
的マーカーをコードする遺伝子に特異突然変異を導入す
ることができ、その結果これらの遺伝子の機能は欠除す
る。形質転換後、前記突然変異遺伝子の発現を大幅に増
幅しその結果正常遺伝子に特徴的なレベルで発現するよ
う稀にある変異株細胞サブクローンを識別することがで
きる。
を開示する。選択し得る又は識別（同定）し得る生化学
的マーカーをコードする遺伝子に特異突然変異を導入す
ることができ、その結果これらの遺伝子の機能は欠除す
る。形質転換後、前記突然変異遺伝子の発現を大幅に増
幅しその結果正常遺伝子に特徴的なレベルで発現するよ
う稀にある変異株細胞サブクローンを識別することがで
きる。
【０００７】より特定的には、哺乳類細胞中で突然変異
遺伝子の活性化に係る遺伝子再配列（genetic rearrang
ement ）の性格を研究すべく、遺伝子転移（gene trans
fer）に関連したシステムが開発された。完全なアデニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（adenine phosph
oribosyltransferase ＝aprt）遺伝子をプロモータ配列
の欠けた切頭チミジンキナーゼ（thymidine kinase＝t
k）遺伝子と共に含んでいるプラスミドのシングルコピ
ーを、aprt- tk- マウス細胞内に導入するには同時形質
転換が使用されてきた。このプラスミドを含む細胞はap
rt+ 表現型に形質転換されるがtk- のままである。tk+
表現型に突然変異する稀変異株はある種のＤＮＡ再配列
を示すであろうと考えられた。分析された全てのtk+ 変
異体は、かなり長いフランキング配列と共にプロモータ
を欠いたtk遺伝子を大幅に増幅した結果生じている。テ
ストにかけた40以上のtk+ 突然変異体では別の再配列原
因は全く観察されない。
遺伝子の活性化に係る遺伝子再配列（genetic rearrang
ement ）の性格を研究すべく、遺伝子転移（gene trans
fer）に関連したシステムが開発された。完全なアデニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（adenine phosph
oribosyltransferase ＝aprt）遺伝子をプロモータ配列
の欠けた切頭チミジンキナーゼ（thymidine kinase＝t
k）遺伝子と共に含んでいるプラスミドのシングルコピ
ーを、aprt- tk- マウス細胞内に導入するには同時形質
転換が使用されてきた。このプラスミドを含む細胞はap
rt+ 表現型に形質転換されるがtk- のままである。tk+
表現型に突然変異する稀変異株はある種のＤＮＡ再配列
を示すであろうと考えられた。分析された全てのtk+ 変
異体は、かなり長いフランキング配列と共にプロモータ
を欠いたtk遺伝子を大幅に増幅した結果生じている。テ
ストにかけた40以上のtk+ 突然変異体では別の再配列原
因は全く観察されない。
【０００８】これらの増幅したaprt+ tk+ クローンの顕
著な特徴の１つは、aprt- tk+ 変異体の出現率にある。
増幅したＤＮＡの構造を調べると、所与のaprt- 細胞内
の全ての増幅した単位は同一の突然変異を受けているこ
とが確認される。これらのデータは、反復する遺伝子エ
レメント内の配列の等質性（sequence homogeneity）を
維持するようにデザインされている補正進行（correcti
on procession ）が高い頻度で生じることを示唆してい
る。
著な特徴の１つは、aprt- tk+ 変異体の出現率にある。
増幅したＤＮＡの構造を調べると、所与のaprt- 細胞内
の全ての増幅した単位は同一の突然変異を受けているこ
とが確認される。これらのデータは、反復する遺伝子エ
レメント内の配列の等質性（sequence homogeneity）を
維持するようにデザインされている補正進行（correcti
on procession ）が高い頻度で生じることを示唆してい
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】発明の概要 所望のタンパク性産物を産生するための遺伝情報をコー
ドする機能性増幅可能遺伝子を含むＤＮＡＩのマルチプ
ルコピーを真核細胞内に導入し得る。適当な真核細胞
を、外来ＤＮＡＩと選択又は識別可能な形質（trait ）
をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡ
IIとで、同時形質転換する。この同時形質転換は、タン
パク産物を産生せしめるがＤＮＡIIによりコードされた
形質は発現せしめない適切な条件下で遂行する。所望の
産物を産生する同時形質転換された真核細胞を回収し、
ＤＮＡIIによりコードされた形質を発現せしめる適当な
条件下でクローン化する。クローン化した同時形質転換
細胞はこの形質の発現に基づいて選択又は識別されて回
収される。回収された細胞はＤＮＡＩのマルチプルコピ
ーを含んでおり、メッセンジャーＲＮＡ転写体又はタン
パク性産物を産生するのに使用され得る。
ドする機能性増幅可能遺伝子を含むＤＮＡＩのマルチプ
ルコピーを真核細胞内に導入し得る。適当な真核細胞
を、外来ＤＮＡＩと選択又は識別可能な形質（trait ）
をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡ
IIとで、同時形質転換する。この同時形質転換は、タン
パク産物を産生せしめるがＤＮＡIIによりコードされた
形質は発現せしめない適切な条件下で遂行する。所望の
産物を産生する同時形質転換された真核細胞を回収し、
ＤＮＡIIによりコードされた形質を発現せしめる適当な
条件下でクローン化する。クローン化した同時形質転換
細胞はこの形質の発現に基づいて選択又は識別されて回
収される。回収された細胞はＤＮＡＩのマルチプルコピ
ーを含んでおり、メッセンジャーＲＮＡ転写体又はタン
パク性産物を産生するのに使用され得る。
【００１０】本発明の好ましい具体例では、選択又は識
別可能な形質をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIIと選択又は識別が可能な別の形質をコー
ドする機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIII とを
含むデオキシリボ核酸分子と、ＤＮＡＩとを、共に用い
て適切な真核細胞を同時形質転換することにより、ＤＮ
ＡＩのマルチプルコピーをこれら細胞内に導入する。同
時形質転換は、ＤＮＡIII によりコードされた形質は発
現せしめるがＤＮＡIIによりコードされた形質は発現せ
しめない適切な条件下で遂行される。ＤＮＡIII により
コードされた形質を発現する同時形質転換された真核細
胞を回収し、ＤＮＡIIによりコードされた形質を発現せ
しめる適切な条件下でクローン化される。同時形質転換
され且つクローン化された細胞はＤＮＡIIによりコード
された形質の発現に基づいて選択又は識別されて回収さ
れる。回収された細胞はＤＮＡＩのマルチプルコピーを
含んでおり、メッセンジャーＲＮＡ転写体又はタンパク
性産物の産生に使用され得る。
別可能な形質をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIIと選択又は識別が可能な別の形質をコー
ドする機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIII とを
含むデオキシリボ核酸分子と、ＤＮＡＩとを、共に用い
て適切な真核細胞を同時形質転換することにより、ＤＮ
ＡＩのマルチプルコピーをこれら細胞内に導入する。同
時形質転換は、ＤＮＡIII によりコードされた形質は発
現せしめるがＤＮＡIIによりコードされた形質は発現せ
しめない適切な条件下で遂行される。ＤＮＡIII により
コードされた形質を発現する同時形質転換された真核細
胞を回収し、ＤＮＡIIによりコードされた形質を発現せ
しめる適切な条件下でクローン化される。同時形質転換
され且つクローン化された細胞はＤＮＡIIによりコード
された形質の発現に基づいて選択又は識別されて回収さ
れる。回収された細胞はＤＮＡＩのマルチプルコピーを
含んでおり、メッセンジャーＲＮＡ転写体又はタンパク
性産物の産生に使用され得る。
【００１１】外来ＤＮＡを適切な真核細胞内に導入する
のに使用し得る形質転換ベクターも開示されている。
のに使用し得る形質転換ベクターも開示されている。
【００１２】詳細な説明 タンパク性産物の産生をコードする機能性増幅可能遺伝
子を含む外来ＤＮＡＩのマルチプルコピーは適切な真核
細胞内に導入し得る。この結果はＤＮＡＩと、その発現
が選択又は識別し得る表現型の形質に基づいている機能
欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIIとで、共に細胞
を同時形質転換させることにより達成される。真核細胞
の同時形質転換は、タンパク産物を産生せしめるがＤＮ
ＡII上の遺伝子によりコードされた形質は発現せしめな
いような適切な条件下で行う。所望の産物を産生する同
時形質転換された真核細胞は、例えば選択などにより識
別して回収され、次いでＤＮＡII上の遺伝子によりコー
ドされた形質を発現する真核細胞の選択と識別とを可能
にする適切な条件下でクローン化される。機能欠除遺伝
子を発現する同時形質転換された細胞を回収すれば、Ｄ
ＮＡＩのマルチプルコピーを含み且つ発現する細胞が同
様に得られる。
子を含む外来ＤＮＡＩのマルチプルコピーは適切な真核
細胞内に導入し得る。この結果はＤＮＡＩと、その発現
が選択又は識別し得る表現型の形質に基づいている機能
欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIIとで、共に細胞
を同時形質転換させることにより達成される。真核細胞
の同時形質転換は、タンパク産物を産生せしめるがＤＮ
ＡII上の遺伝子によりコードされた形質は発現せしめな
いような適切な条件下で行う。所望の産物を産生する同
時形質転換された真核細胞は、例えば選択などにより識
別して回収され、次いでＤＮＡII上の遺伝子によりコー
ドされた形質を発現する真核細胞の選択と識別とを可能
にする適切な条件下でクローン化される。機能欠除遺伝
子を発現する同時形質転換された細胞を回収すれば、Ｄ
ＮＡＩのマルチプルコピーを含み且つ発現する細胞が同
様に得られる。
【００１３】本発明の実施に使用される適切な真核細胞
は、一般には、ＤＮＡＩ上の増幅可能遺伝子によりコー
ドされたタンパク性産物を産生せず、且つＤＮＡII上の
機能欠除増幅可能遺伝子によりコードされた選択又は識
別し得る形質を発現しない細胞である。しかし乍ら本発
明は、細胞によって発現される産物の生産量を高めるた
めに使用し得る。但しその量はＤＮＡＩのマルチプルコ
ピーが細胞内に導入された場合に得られる量よりは少な
い。
は、一般には、ＤＮＡＩ上の増幅可能遺伝子によりコー
ドされたタンパク性産物を産生せず、且つＤＮＡII上の
機能欠除増幅可能遺伝子によりコードされた選択又は識
別し得る形質を発現しない細胞である。しかし乍ら本発
明は、細胞によって発現される産物の生産量を高めるた
めに使用し得る。但しその量はＤＮＡＩのマルチプルコ
ピーが細胞内に導入された場合に得られる量よりは少な
い。
【００１４】同様に、本発明は、関連した選択又は識別
し得る形質ではなく遺伝子が細胞により発現される場合
に、選択又は識別可能な形質と関連した遺伝子の発現を
高めるために使用し得る。
し得る形質ではなく遺伝子が細胞により発現される場合
に、選択又は識別可能な形質と関連した遺伝子の発現を
高めるために使用し得る。
【００１５】従って、タンパク質ＩがＤＮＡＩでコード
されたタンパク質であり、形質IIがＤＮＡIIでコードさ
れた形質であれば、適切な細胞は通常タンパク質Ｉ陰
性、形質II陰性の細胞ということになり、ＤＮＡＩのマ
ルチプルコピーを含む細胞はタンパク質Ｉ陽性、形質II
陽性の細胞ということになろう。
されたタンパク質であり、形質IIがＤＮＡIIでコードさ
れた形質であれば、適切な細胞は通常タンパク質Ｉ陰
性、形質II陰性の細胞ということになり、ＤＮＡＩのマ
ルチプルコピーを含む細胞はタンパク質Ｉ陽性、形質II
陽性の細胞ということになろう。
【００１６】ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIは、単一分子の一部
もしくはセグメントであり、又は物理的且つ化学的に結
合していない別々の分子であり得る。本発明のこの具体
例では、ＤＮＡＩ及びIIは単一の分子であることが好ま
しい。更に、現在一般的に理解されている同時形質転換
システムに鑑みて考察すると、別個の分子を使用して
も、こられ分子は受容体細胞の染色体内に組込まれる前
に同時形質転換の過程で相互に結合されるものと思われ
る。
もしくはセグメントであり、又は物理的且つ化学的に結
合していない別々の分子であり得る。本発明のこの具体
例では、ＤＮＡＩ及びIIは単一の分子であることが好ま
しい。更に、現在一般的に理解されている同時形質転換
システムに鑑みて考察すると、別個の分子を使用して
も、こられ分子は受容体細胞の染色体内に組込まれる前
に同時形質転換の過程で相互に結合されるものと思われ
る。
【００１７】ＤＮＡＩに保有されている遺伝子はヒト又
は動物成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン
タンパク質部分、凝血因子、インフルエンザウイルス抗
原、肝炎ウイルス抗原、ヒト血清アルブミン、抗体又は
他の任意のタンパク質もしくはタンパク性物質を産生す
るための遺伝情報をコードし得る。勿論、ＤＮＡＩ上の
遺伝子がこのような産物をコードすれば、その産物を含
み且つ発現する形質転換された細胞の選択又は識別は困
難になり得る。逆に、ＤＮＡＩ遺伝子が選択又は識別し
得る形質に関連したタンパク質をコードしていればプロ
セスはより容易に実施されることになる。従ってタンパ
ク質産物、例えばアデニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（aprt）、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキ
ナーゼ（tk）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）、キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（xprt）又はアスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ
（ATCase）等選択又は識別し得る表現型に関連した産物
をコードする遺伝子は、ＤＮＡＩ上の遺伝子であり得
る。また、Ｇ418 もしくはネオマイシン耐性などの薬剤
耐性か又は受容体細胞内での形態学的変化の如き表現型
に関連したタンパク質産物を産生する他の遺伝子も使用
し得る。
は動物成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン
タンパク質部分、凝血因子、インフルエンザウイルス抗
原、肝炎ウイルス抗原、ヒト血清アルブミン、抗体又は
他の任意のタンパク質もしくはタンパク性物質を産生す
るための遺伝情報をコードし得る。勿論、ＤＮＡＩ上の
遺伝子がこのような産物をコードすれば、その産物を含
み且つ発現する形質転換された細胞の選択又は識別は困
難になり得る。逆に、ＤＮＡＩ遺伝子が選択又は識別し
得る形質に関連したタンパク質をコードしていればプロ
セスはより容易に実施されることになる。従ってタンパ
ク質産物、例えばアデニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（aprt）、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキ
ナーゼ（tk）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）、キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（xprt）又はアスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ
（ATCase）等選択又は識別し得る表現型に関連した産物
をコードする遺伝子は、ＤＮＡＩ上の遺伝子であり得
る。また、Ｇ418 もしくはネオマイシン耐性などの薬剤
耐性か又は受容体細胞内での形態学的変化の如き表現型
に関連したタンパク質産物を産生する他の遺伝子も使用
し得る。
【００１８】ＤＮＡIIに保有されている遺伝子は、機能
を欠除した増幅し得る遺伝子である。適切な遺伝子とし
ては、初期プロモータ（primary promoter）が除去され
た遺伝子と構造的突然変異を含む遺伝子とがあり、例え
ば、プロモータが欠除しているか或いは機能が欠除して
いる遺伝子で、チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、ジヒドロホレートレダクター
ゼ、キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸トランスカルバモイラーゼを産生するため
の遺伝情報をコードするか、又はネオマイシンもしくは
Ｇ418 耐性の如き薬剤耐性を得るための情報をコードす
る遺伝子が挙げられる。
を欠除した増幅し得る遺伝子である。適切な遺伝子とし
ては、初期プロモータ（primary promoter）が除去され
た遺伝子と構造的突然変異を含む遺伝子とがあり、例え
ば、プロモータが欠除しているか或いは機能が欠除して
いる遺伝子で、チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、ジヒドロホレートレダクター
ゼ、キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ア
スパラギン酸トランスカルバモイラーゼを産生するため
の遺伝情報をコードするか、又はネオマイシンもしくは
Ｇ418 耐性の如き薬剤耐性を得るための情報をコードす
る遺伝子が挙げられる。
【００１９】ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIは担体のない（carr
ier-free）クローン化した遺伝子であるのが好ましい。
その場合には、所望でない産物の産生が回避され且つ所
望の産物の単離と精製とが容易になるという利点が得ら
れる。これらの利点は、ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIが同一の
デオキシリボ核酸分子のセグメンドであれば極めて容易
に実現される。
ier-free）クローン化した遺伝子であるのが好ましい。
その場合には、所望でない産物の産生が回避され且つ所
望の産物の単離と精製とが容易になるという利点が得ら
れる。これらの利点は、ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIが同一の
デオキシリボ核酸分子のセグメンドであれば極めて容易
に実現される。
【００２０】ここで用いられているように、外来ＤＮＡ
とは、該ＤＮＡが導入される受容体細胞に固有ではない
ＤＮＡを意味する。このようなＤＮＡは受容体と同一の
細胞タイプである種々の細胞を含む様々な細胞に由来し
得、例えば正常なマウスセルラインより得られる染色体
ＤＮＡは突然変異マウス系に導入される。該ＤＮＡはウ
イルス性または細菌性染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
もしくはバクテリオファージＤＮＡからも派生し得る。
ＤＮＡはまた、塩基添加又は酵素的方法により、ｃＤＮ
Ａ合成の如く化学的に合成し得る。種々のＤＮＡが種々
の源から又は種々の方法により派生し得、例えばＤＮＡ
Ｉはヒトのセルラインより派生し得、ＤＮＡIIはウイル
ス由来でもよい。
とは、該ＤＮＡが導入される受容体細胞に固有ではない
ＤＮＡを意味する。このようなＤＮＡは受容体と同一の
細胞タイプである種々の細胞を含む様々な細胞に由来し
得、例えば正常なマウスセルラインより得られる染色体
ＤＮＡは突然変異マウス系に導入される。該ＤＮＡはウ
イルス性または細菌性染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
もしくはバクテリオファージＤＮＡからも派生し得る。
ＤＮＡはまた、塩基添加又は酵素的方法により、ｃＤＮ
Ａ合成の如く化学的に合成し得る。種々のＤＮＡが種々
の源から又は種々の方法により派生し得、例えばＤＮＡ
Ｉはヒトのセルラインより派生し得、ＤＮＡIIはウイル
ス由来でもよい。
【００２１】同時形質転換の適切な条件は当業者には公
知であり、前掲の文献の幾つかに記載されているが、本
明細書中実験の詳細な説明に記載する。好ましい方法で
は、細胞の同時形質転換に使用する前に、ＤＮＡＩ及び
ＤＮＡIIをリン酸カルシウムで処理する。ＤＮＡＩ対Ｄ
ＮＡIIのモル比は広範囲の値をとり得、例えば、１００
０：１乃至１：１であってよい。ＤＮＡＩ及びＤＮＡII
が同一ＤＮＡ分子のセグメントであれば、この比は勿論
１：１になる。更に、現在の所、ＤＡＮＩ及びＤＮＡII
の双方が細菌性プラスミド又はファージＤＮＡをも含む
ＤＮＡ分子、より好ましくは単一ＤＮＡ分子に担持され
ていることが好ましい。最後に、現在理解されている同
時形質転換メカニズムによれば、ＤＮＡＩとＤＮＡIIと
は同時形質転換された受容体細胞の染色体ＤＮＡ内に安
定した状態で組込まれるものと推測される。
知であり、前掲の文献の幾つかに記載されているが、本
明細書中実験の詳細な説明に記載する。好ましい方法で
は、細胞の同時形質転換に使用する前に、ＤＮＡＩ及び
ＤＮＡIIをリン酸カルシウムで処理する。ＤＮＡＩ対Ｄ
ＮＡIIのモル比は広範囲の値をとり得、例えば、１００
０：１乃至１：１であってよい。ＤＮＡＩ及びＤＮＡII
が同一ＤＮＡ分子のセグメントであれば、この比は勿論
１：１になる。更に、現在の所、ＤＡＮＩ及びＤＮＡII
の双方が細菌性プラスミド又はファージＤＮＡをも含む
ＤＮＡ分子、より好ましくは単一ＤＮＡ分子に担持され
ていることが好ましい。最後に、現在理解されている同
時形質転換メカニズムによれば、ＤＮＡＩとＤＮＡIIと
は同時形質転換された受容体細胞の染色体ＤＮＡ内に安
定した状態で組込まれるものと推測される。
【００２２】本発明の実施には、動物又は植物に由来す
る細胞と酵母細胞とを含む種々のタイプの真核細胞を使
用し得る。ヒト成長ホルモン又はヒト血清アルブミンの
如き特定産物の産生には哺乳類の細胞が特に適している
と思われる。
る細胞と酵母細胞とを含む種々のタイプの真核細胞を使
用し得る。ヒト成長ホルモン又はヒト血清アルブミンの
如き特定産物の産生には哺乳類の細胞が特に適している
と思われる。
【００２３】同時形質転換した細胞の回収法と、このよ
うな細胞のクローニング法及びサブクローニング法と、
表現型形質又は遺伝子型形質に基づく同時形質転換細胞
の選択又は識別法とは、適切な条件をも含めて当業者に
は公知である。
うな細胞のクローニング法及びサブクローニング法と、
表現型形質又は遺伝子型形質に基づく同時形質転換細胞
の選択又は識別法とは、適切な条件をも含めて当業者に
は公知である。
【００２４】前述の方法により適切な条件下で外来ＤＮ
Ａのマルチプルコピーを導入した真核細胞を維持してお
くと、メッセンジャーＲＮＡ転写体とタンパク質産物と
が産生され且つ回収され得る。このような転写とタンパ
ク質産生との適切な条件は当業者には公知である。
Ａのマルチプルコピーを導入した真核細胞を維持してお
くと、メッセンジャーＲＮＡ転写体とタンパク質産物と
が産生され且つ回収され得る。このような転写とタンパ
ク質産生との適切な条件は当業者には公知である。
【００２５】ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIのみを使用する真核
細胞内への外来ＤＮＡＩマルチプルコピーの導入法は、
特定の産物を産生するのに使用し得る。しかし乍ら、商
業的に重要な種々のタンパク質又はタンパク性産物の産
生をコードする外来ＤＮＡのマルチプルコピーを真核細
胞内に導入したい場合は、ＤＮＡIIでコードされた形質
とは異なる選択又は識別可能な形質をコードする機能性
増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIII も使用することが
好ましい。
細胞内への外来ＤＮＡＩマルチプルコピーの導入法は、
特定の産物を産生するのに使用し得る。しかし乍ら、商
業的に重要な種々のタンパク質又はタンパク性産物の産
生をコードする外来ＤＮＡのマルチプルコピーを真核細
胞内に導入したい場合は、ＤＮＡIIでコードされた形質
とは異なる選択又は識別可能な形質をコードする機能性
増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIII も使用することが
好ましい。
【００２６】即ち、所望の産物をコードする機能性増幅
可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩのマルチプルコピーを真
核細胞内に導入する好ましい方法は、適切な真核細胞
を、ＤＮＡＩの他に、選択又は識別し得る第１表現型形
質をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮ
ＡIIと、第１表現型形質とは異なる選択又は識別可能な
第２表現型形質をコードする機能性増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIII と、を含有するＤＮＡ分子と共に同時
形質転換させることである。この同時形質転換は、ＤＮ
ＡIII に担持された遺伝子の発現とその関連形質に基づ
く同時形質転換細胞の選択又は識別とを可能にするが、
ＤＮＡIIに担持された遺伝子又はその関連形質の発現は
可能にしない適切な条件下で実施する。ＤＮＡIII 上の
遺伝子に関連した形質を発現する同時形質転換された細
胞を回収し、ＤＮＡIIに保有された遺伝子を発現する真
核細胞を選択または識別せしめる適切な条件下でクロー
ン化する。前記の如き細胞を識別して回収することによ
り、ＤＮＡＩのマルチプルコピーを含有する細胞が識別
されて回収される。適切な真核細胞は前述の通りであ
る。本発明のこの具体例では、ＤＮＡII上の遺伝子に関
連した形質又はＤＮＡIII 上の遺伝子に関連した形質の
いずれをも発現しない二重突然変異細胞も使用し得る。
好ましくは、突然変異セルラインを使用する必要がない
ように、形質の一方又は双方が優性活動遺伝子と関連し
ているとよい。即ち、例えば、ネオマイシン耐性に関連
した遺伝子を使用すると、正常の細胞では発現されない
形質が受容体細胞に付与され、突然変異セルラインの使
用は不要となる。
可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩのマルチプルコピーを真
核細胞内に導入する好ましい方法は、適切な真核細胞
を、ＤＮＡＩの他に、選択又は識別し得る第１表現型形
質をコードする機能欠除増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮ
ＡIIと、第１表現型形質とは異なる選択又は識別可能な
第２表現型形質をコードする機能性増幅可能遺伝子を含
む外来ＤＮＡIII と、を含有するＤＮＡ分子と共に同時
形質転換させることである。この同時形質転換は、ＤＮ
ＡIII に担持された遺伝子の発現とその関連形質に基づ
く同時形質転換細胞の選択又は識別とを可能にするが、
ＤＮＡIIに担持された遺伝子又はその関連形質の発現は
可能にしない適切な条件下で実施する。ＤＮＡIII 上の
遺伝子に関連した形質を発現する同時形質転換された細
胞を回収し、ＤＮＡIIに保有された遺伝子を発現する真
核細胞を選択または識別せしめる適切な条件下でクロー
ン化する。前記の如き細胞を識別して回収することによ
り、ＤＮＡＩのマルチプルコピーを含有する細胞が識別
されて回収される。適切な真核細胞は前述の通りであ
る。本発明のこの具体例では、ＤＮＡII上の遺伝子に関
連した形質又はＤＮＡIII 上の遺伝子に関連した形質の
いずれをも発現しない二重突然変異細胞も使用し得る。
好ましくは、突然変異セルラインを使用する必要がない
ように、形質の一方又は双方が優性活動遺伝子と関連し
ているとよい。即ち、例えば、ネオマイシン耐性に関連
した遺伝子を使用すると、正常の細胞では発現されない
形質が受容体細胞に付与され、突然変異セルラインの使
用は不要となる。
【００２７】ＤＮＡＩと、ＤＮＡII及びＤＮＡIII を保
有する分子とは、クローン化した担体なしの遺伝子であ
ると共に、同時形質転換に先立ちリン酸カルシウムで処
理された２つの別個の分子であることが望ましい。クロ
ーン化したＤＮＡＩ対クローン化したＤＮＡII及びＤＮ
ＡIII 担持分子、例えばプラスミド、の比は広範囲の値
をとり得るが、好ましくは約６５０：１乃至２５：１の
範囲内である。
有する分子とは、クローン化した担体なしの遺伝子であ
ると共に、同時形質転換に先立ちリン酸カルシウムで処
理された２つの別個の分子であることが望ましい。クロ
ーン化したＤＮＡＩ対クローン化したＤＮＡII及びＤＮ
ＡIII 担持分子、例えばプラスミド、の比は広範囲の値
をとり得るが、好ましくは約６５０：１乃至２５：１の
範囲内である。
【００２８】外来ＤＮＡＩは、タンパク質又はタンパク
質含有産物を産生するための遺伝情報をコードする遺伝
子を含んでいる。その例としては、ヒト及び動物の成長
ホルモン、インシュリン、インターフェロン、凝血因
子、インフルエンザウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、
ヒト血清アルブミン、抗体又は酵素が挙げられる。
質含有産物を産生するための遺伝情報をコードする遺伝
子を含んでいる。その例としては、ヒト及び動物の成長
ホルモン、インシュリン、インターフェロン、凝血因
子、インフルエンザウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原、
ヒト血清アルブミン、抗体又は酵素が挙げられる。
【００２９】ＤＮＡII上の機能欠除増幅可能遺伝子とＤ
ＮＡIII 上の機能性増幅可能遺伝子とは広範囲に亘り得
る。適切なＤＮＡIIの例は既に挙げた通りである。適切
なＤＮＡIII の例も一般には同一の群より選択される
が、相違点としてＤＮＡIII 上の遺伝子は機能欠除とい
う特徴をもたない。
ＮＡIII 上の機能性増幅可能遺伝子とは広範囲に亘り得
る。適切なＤＮＡIIの例は既に挙げた通りである。適切
なＤＮＡIII の例も一般には同一の群より選択される
が、相違点としてＤＮＡIII 上の遺伝子は機能欠除とい
う特徴をもたない。
【００３０】他の点に関しては、ＤＮＡＩ，IIおよびII
I を使用する方法は、ＤＮＡＩ及びIIを使用する方法と
同じである。如何なる変形又は変更も当業者には明白で
あろう。ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIを用いる方法と同様に、
ＤＮＡＩ，IIおよびIII を用いる方法はＤＮＡのメッセ
ンジャーＲＮＡ転写体とそれによってコードされたタン
パク性産物とを産生し且つ回収するのに使用し得る。
I を使用する方法は、ＤＮＡＩ及びIIを使用する方法と
同じである。如何なる変形又は変更も当業者には明白で
あろう。ＤＮＡＩ及びＤＮＡIIを用いる方法と同様に、
ＤＮＡＩ，IIおよびIII を用いる方法はＤＮＡのメッセ
ンジャーＲＮＡ転写体とそれによってコードされたタン
パク性産物とを産生し且つ回収するのに使用し得る。
【００３１】本発明を実施する際、デオキシリボ核酸分
子は形質転換ベクターとして使用される。このような分
子には、２種の外来ＤＮＡ、即ち外来ＤＮＡIIと、ｐＢ
Ｒ３２２の如き細菌性プラスミドなどの非真核源に由来
する補助的ＤＮＡとを保有するものがある。本発明の好
ましい具体例では、これらの分子は環状で、外来ＤＮＡ
III と、外来ＤＮＡIIと、細菌性プラスミド又はバクテ
リオファージの如き非真核源に由来するＤＮＡとを含ん
でいる。このようなベクターの１例は図１に示されてい
る。
子は形質転換ベクターとして使用される。このような分
子には、２種の外来ＤＮＡ、即ち外来ＤＮＡIIと、ｐＢ
Ｒ３２２の如き細菌性プラスミドなどの非真核源に由来
する補助的ＤＮＡとを保有するものがある。本発明の好
ましい具体例では、これらの分子は環状で、外来ＤＮＡ
III と、外来ＤＮＡIIと、細菌性プラスミド又はバクテ
リオファージの如き非真核源に由来するＤＮＡとを含ん
でいる。このようなベクターの１例は図１に示されてい
る。
【００３２】本発明の一用途として、ヒト成長ホルモン
のクローン化した担体のない遺伝子のマルチプルコピー
を、ネズミＬtk- aprt- 細胞内に導入する場合がある。
このような細胞をクローン化したヒト成長ホルモン遺伝
子とプラスミドｐｄＬＡＴ−３とで同時形質転換し、次
いで前述の方法によりＬtk+ aprt+ 細胞を回収すると、
ヒト成長ホルモン遺伝子のマルチプルコピーを含み且つ
発現する細胞が得られ、従って、ヒト成長ホルモンの一
産生方法が提供される。
のクローン化した担体のない遺伝子のマルチプルコピー
を、ネズミＬtk- aprt- 細胞内に導入する場合がある。
このような細胞をクローン化したヒト成長ホルモン遺伝
子とプラスミドｐｄＬＡＴ−３とで同時形質転換し、次
いで前述の方法によりＬtk+ aprt+ 細胞を回収すると、
ヒト成長ホルモン遺伝子のマルチプルコピーを含み且つ
発現する細胞が得られ、従って、ヒト成長ホルモンの一
産生方法が提供される。
【００３３】本発明の別の用途として、ｐｄＬＡＴ−３
に類似しているが、Ｇ418 耐性をコードするプロモータ
を欠いた機能欠除増幅可能遺伝子がtk遺伝子にとって代
わっているという点で異なるプラスミドのマルチプルコ
ピーを真核細胞内に導入する場合が挙げられる。
に類似しているが、Ｇ418 耐性をコードするプロモータ
を欠いた機能欠除増幅可能遺伝子がtk遺伝子にとって代
わっているという点で異なるプラスミドのマルチプルコ
ピーを真核細胞内に導入する場合が挙げられる。
【００３４】本発明は、更に、クローン化した担体なし
のヒト成長ホルモン遺伝子とＧ418耐性をコードするプ
ロモータを欠いた機能欠除増幅可能遺伝子と機能性増幅
可能aprt遺伝子とを保有するプラスミドとを、同時形質
転換することにより、この遺伝子のマルチプルコピーを
真核細胞内に導入する場合にも使用し得る。
のヒト成長ホルモン遺伝子とＧ418耐性をコードするプ
ロモータを欠いた機能欠除増幅可能遺伝子と機能性増幅
可能aprt遺伝子とを保有するプラスミドとを、同時形質
転換することにより、この遺伝子のマルチプルコピーを
真核細胞内に導入する場合にも使用し得る。
【００３５】
【実施例】実験計画 哺乳動物細胞における遺伝子再配列を研究するためのシ
ステムは、次の２つの予知に基づいて開発された；１）
プロモータを欠く遺伝子は、カルチャー内の細胞に導入
しても機能しないであろう；２）切頭された遺伝子（tr
uncated gene）を発現する稀細胞突然変異体は、何らか
の形で遺伝子再配列を受けているであろう。
ステムは、次の２つの予知に基づいて開発された；１）
プロモータを欠く遺伝子は、カルチャー内の細胞に導入
しても機能しないであろう；２）切頭された遺伝子（tr
uncated gene）を発現する稀細胞突然変異体は、何らか
の形で遺伝子再配列を受けているであろう。
【００３６】ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコー
ドする構造遺伝子の転写制御領域は既に正確にマップ
（遺伝地図）化されている［Mc Knight, S. L., Gavis,
E. R., Kingsbury, R. 及びAxel, R., Cell, 25, 385-
398(1981年）］。転写開始部位に直接隣接する５′フラ
ンキングＤＮＡの１１０個のヌクレオチドはtk遺伝子の
発現に必須である。この領域に及ぶ欠失は、特異的転写
の著しい減少とこれに付随する形質転換効率の低下との
原因となる。最初にハムスターaprt遺伝子を含む７．８
kb ＨinｄIII 断片を完全なtk遺伝子を含むプラスミド
内に挿入した。独特なＢｇｌII部位が、tk遺伝子の５′
非翻訳領域内で、イニシエータＡＴＧに対し５０ヌクレ
オチドだけ５′側にある。aprt−tkクローン内の第２Ｂ
ｇｌII部位は、ハムスターＤＮＡ内に位置し、aprt発現
に必要な全ての配列に対し５′側にある。これら２つの
部位で両端が規定されるＢｇｌII断片を切除し、バクテ
リオファージλＤＮＡの２．６kb断片で置換した。この
置換の結果、tk遺伝子のプロモータ要素と５′キャップ
部位とが除去され、一方コード領域とポリＡ付加部位と
が完全な形で残る。このプラスミドは、結合した突然変
異tk遺伝子のマウスＬtk- aprt- 細胞内への導入を可能
にする選択可能マーカーたる機能性aprt遺伝子を含んで
いる。このプラスミドにはaprt遺伝子とtk遺伝子とが逆
の極性をもつように導入されており、そのためaprtプロ
モータからのtk転写体の連続読取り（read-through）転
写体が阻止される。このプラスミドを用いて構成された
形質転換体はaprt+ tk- 表現型である。aprt+ tk- 形質
転換体から発生するtk+ 変異体は、塩基配列の局所的変
更よりむしろ全体的再配列の結果であると推測される。
ドする構造遺伝子の転写制御領域は既に正確にマップ
（遺伝地図）化されている［Mc Knight, S. L., Gavis,
E. R., Kingsbury, R. 及びAxel, R., Cell, 25, 385-
398(1981年）］。転写開始部位に直接隣接する５′フラ
ンキングＤＮＡの１１０個のヌクレオチドはtk遺伝子の
発現に必須である。この領域に及ぶ欠失は、特異的転写
の著しい減少とこれに付随する形質転換効率の低下との
原因となる。最初にハムスターaprt遺伝子を含む７．８
kb ＨinｄIII 断片を完全なtk遺伝子を含むプラスミド
内に挿入した。独特なＢｇｌII部位が、tk遺伝子の５′
非翻訳領域内で、イニシエータＡＴＧに対し５０ヌクレ
オチドだけ５′側にある。aprt−tkクローン内の第２Ｂ
ｇｌII部位は、ハムスターＤＮＡ内に位置し、aprt発現
に必要な全ての配列に対し５′側にある。これら２つの
部位で両端が規定されるＢｇｌII断片を切除し、バクテ
リオファージλＤＮＡの２．６kb断片で置換した。この
置換の結果、tk遺伝子のプロモータ要素と５′キャップ
部位とが除去され、一方コード領域とポリＡ付加部位と
が完全な形で残る。このプラスミドは、結合した突然変
異tk遺伝子のマウスＬtk- aprt- 細胞内への導入を可能
にする選択可能マーカーたる機能性aprt遺伝子を含んで
いる。このプラスミドにはaprt遺伝子とtk遺伝子とが逆
の極性をもつように導入されており、そのためaprtプロ
モータからのtk転写体の連続読取り（read-through）転
写体が阻止される。このプラスミドを用いて構成された
形質転換体はaprt+ tk- 表現型である。aprt+ tk- 形質
転換体から発生するtk+ 変異体は、塩基配列の局所的変
更よりむしろ全体的再配列の結果であると推測される。
【００３７】Aprt+ Tk+ 表現型への突然変異 aprt-tk プラスミドを、aprt+ 表現型を選択する条件下
で、リン酸カルシウム沈殿物としてマウスＬtk- aprt-
細胞内に導入した［Wigler, M., Sweet, R., Sim, G.
K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis,
T., Silverstein,S.及びAxel, R., Cell, 16, 777-785
(1979) ］。aprt+ クローンは全てtk- のままであっ
た。少なくとも１つのaprt-tk プラスミドコピーを取込
んだ８個のクローンが識別された。これら特徴づけられ
たクローンを別個に単離して、これらクローンからtk+
変異体サブクローンが発生する頻度のテストにかけた。
８個のクローンはいずれもアデニン−アザセリン−ＢＵ
ｄＲ中で増殖させた。これは細胞集団（cell populatio
n ）のaprt+ tk- 表現型を維持する成長条件である。次
いで各セルラインを中性培地（neutral medium，アデニ
ンを補足したにすぎない）内で３世代に亘り成長させ、
その後tk- 表現型を選択する成長培地中に置いた。８個
の親クローンはいずれも細胞分裂当り１．６×１０-5乃
至１．８×１０-7の独自の割合でtk- 後代を産生した。
これらtk- 後代は全てaprt+ に留まった。
で、リン酸カルシウム沈殿物としてマウスＬtk- aprt-
細胞内に導入した［Wigler, M., Sweet, R., Sim, G.
K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis,
T., Silverstein,S.及びAxel, R., Cell, 16, 777-785
(1979) ］。aprt+ クローンは全てtk- のままであっ
た。少なくとも１つのaprt-tk プラスミドコピーを取込
んだ８個のクローンが識別された。これら特徴づけられ
たクローンを別個に単離して、これらクローンからtk+
変異体サブクローンが発生する頻度のテストにかけた。
８個のクローンはいずれもアデニン−アザセリン−ＢＵ
ｄＲ中で増殖させた。これは細胞集団（cell populatio
n ）のaprt+ tk- 表現型を維持する成長条件である。次
いで各セルラインを中性培地（neutral medium，アデニ
ンを補足したにすぎない）内で３世代に亘り成長させ、
その後tk- 表現型を選択する成長培地中に置いた。８個
の親クローンはいずれも細胞分裂当り１．６×１０-5乃
至１．８×１０-7の独自の割合でtk- 後代を産生した。
これらtk- 後代は全てaprt+ に留まった。
【００３８】増幅はＴｋ+ 表現型を誘起する aprt+ tk- 親株と４４個のtk+ 突然変異サブクローンの
aprt遺伝子とtk遺伝子の構造をブロットハイブリダイゼ
ーション（blot hybridization）により調べた。ブロッ
ティングにより、８個のtk- 親クローンがaprt-tk プラ
スミドの組込みコピー（integrated copies ）を１つか
数個含んでいることが判明した。各クローン毎に、細胞
ＤＮＡを酵素ＰｖｕIIで消化すると、aprt遺伝市内から
スペーサ配列を通して伸長し且つtk構造遺伝子全体を含
む特徴的５kb結合断片が生じる（図１参照）。aprt配列
に対してのみ相同的である。２．０kb断片も発生する。
第３断片はaprt遺伝子からフランキングＤＮＡ内へと伸
長する。ＤＮＡフランキングからtkコード配列へと伸延
する最後のバンドが細胞ＤＮＡ中に観察される。tk遺伝
子又はaprt遺伝子のいずれかに特異的なプローブでハイ
ブリダイゼーションすると、４４個のtk+ クローンのい
ずれにおいてもtk遺伝子と、結合aprt遺伝子とのコピー
数が２０乃至４０倍に増加したことがわかる。ＰｖｕII
切断ＤＮＡをtk遺伝子配列でプローブした結果、tk- 親
株中に、５．０kb結合断片のシングルコピーとtk遺伝子
のシングルコピーとが存在することが判明した。この断
片の強度（intensity ）は、tk+ サブクローン中では、
２．４kbフランキング断片と同様に、急激に増大してい
た。増幅の規模は約２０乃至４０倍であった。不完全な
tk遺伝子を含む第３断片も該増幅単位内に含まれる。ブ
ロットハイブリダイゼーションによって判断されるよう
に、結合したaprt遺伝子の付随的増幅が全てのtk+ 突然
変異体に見られた。増幅されたＤＮＡ単位は、tk−aprt
プラスミドのみならず４０から２００kbを上回る範囲の
フランキングＤＮＡを含む（下記参照）。テストしたク
ローンの９０％に、全体的再配列を伴わない増幅プロセ
スが生じたことに留意されたい。aprt遺伝子とtk遺伝子
との間の結合はフランキング断片の変化のない完全な形
に維持されていた。
aprt遺伝子とtk遺伝子の構造をブロットハイブリダイゼ
ーション（blot hybridization）により調べた。ブロッ
ティングにより、８個のtk- 親クローンがaprt-tk プラ
スミドの組込みコピー（integrated copies ）を１つか
数個含んでいることが判明した。各クローン毎に、細胞
ＤＮＡを酵素ＰｖｕIIで消化すると、aprt遺伝市内から
スペーサ配列を通して伸長し且つtk構造遺伝子全体を含
む特徴的５kb結合断片が生じる（図１参照）。aprt配列
に対してのみ相同的である。２．０kb断片も発生する。
第３断片はaprt遺伝子からフランキングＤＮＡ内へと伸
長する。ＤＮＡフランキングからtkコード配列へと伸延
する最後のバンドが細胞ＤＮＡ中に観察される。tk遺伝
子又はaprt遺伝子のいずれかに特異的なプローブでハイ
ブリダイゼーションすると、４４個のtk+ クローンのい
ずれにおいてもtk遺伝子と、結合aprt遺伝子とのコピー
数が２０乃至４０倍に増加したことがわかる。ＰｖｕII
切断ＤＮＡをtk遺伝子配列でプローブした結果、tk- 親
株中に、５．０kb結合断片のシングルコピーとtk遺伝子
のシングルコピーとが存在することが判明した。この断
片の強度（intensity ）は、tk+ サブクローン中では、
２．４kbフランキング断片と同様に、急激に増大してい
た。増幅の規模は約２０乃至４０倍であった。不完全な
tk遺伝子を含む第３断片も該増幅単位内に含まれる。ブ
ロットハイブリダイゼーションによって判断されるよう
に、結合したaprt遺伝子の付随的増幅が全てのtk+ 突然
変異体に見られた。増幅されたＤＮＡ単位は、tk−aprt
プラスミドのみならず４０から２００kbを上回る範囲の
フランキングＤＮＡを含む（下記参照）。テストしたク
ローンの９０％に、全体的再配列を伴わない増幅プロセ
スが生じたことに留意されたい。aprt遺伝子とtk遺伝子
との間の結合はフランキング断片の変化のない完全な形
に維持されていた。
【００３９】異常Ｔｋ ｍＲＮＡの増幅された発現 増幅によって細胞がtk+ になるメカニズムを確認すべ
く、親tk- セルラインと増幅したtk+ セルラインとに存
在するＲＮＡ転写体の分析を行った。野生型tk遺伝子で
形質転換された細胞のコントロール集団では、野生型tk
酵素を合成せしめる主１．３kb転写体が発現される。こ
のメッセージの５′末端と３′末端との正確な遺伝子地
図はＳ−１ヌクレアーゼによるマッピンクアッセイを用
いて既に作製されている［Mc Knight, S. L.及びGavis,
E. R., Nucl. Acids Res., 8, 5931-5948(1980) ］。
野生型tk遺伝子のシングルコピーを含むいくかつの形質
転換体は、より小さい０．９kb転写体をも発現する。２
つの転写体を含む１つのこのようなコントロール形質転
換体からのＲＮＡを、Northernブロットハイブリダイゼ
ーションによって調べた。切頭tk遺伝子プラスミドのシ
ングルコピーを含む細胞は、０．９kbＲＮＡ転写体を発
現する。より少ない１．１kb第２ＲＮＡも発現される。
tkプローブでハイブリダイゼーションすると、転写体が
双方共にtk構造遺伝子の一部をコードすることが判明す
る。増幅した１つのtk+ 突然変異体からのtk転写体は、
切頭tk遺伝子の増幅レベルに比例して０．９kb転写体を
過剰に生産した。第２tk+ 突然変異体は、最初極めて低
いレベルでtk- 親株中に存在する１．１kbＲＮＡを同程
度まで過剰生産した。
く、親tk- セルラインと増幅したtk+ セルラインとに存
在するＲＮＡ転写体の分析を行った。野生型tk遺伝子で
形質転換された細胞のコントロール集団では、野生型tk
酵素を合成せしめる主１．３kb転写体が発現される。こ
のメッセージの５′末端と３′末端との正確な遺伝子地
図はＳ−１ヌクレアーゼによるマッピンクアッセイを用
いて既に作製されている［Mc Knight, S. L.及びGavis,
E. R., Nucl. Acids Res., 8, 5931-5948(1980) ］。
野生型tk遺伝子のシングルコピーを含むいくかつの形質
転換体は、より小さい０．９kb転写体をも発現する。２
つの転写体を含む１つのこのようなコントロール形質転
換体からのＲＮＡを、Northernブロットハイブリダイゼ
ーションによって調べた。切頭tk遺伝子プラスミドのシ
ングルコピーを含む細胞は、０．９kbＲＮＡ転写体を発
現する。より少ない１．１kb第２ＲＮＡも発現される。
tkプローブでハイブリダイゼーションすると、転写体が
双方共にtk構造遺伝子の一部をコードすることが判明す
る。増幅した１つのtk+ 突然変異体からのtk転写体は、
切頭tk遺伝子の増幅レベルに比例して０．９kb転写体を
過剰に生産した。第２tk+ 突然変異体は、最初極めて低
いレベルでtk- 親株中に存在する１．１kbＲＮＡを同程
度まで過剰生産した。
【００４０】これらの結果から明らかなように、tk遺伝
子の周りには多数の択一的転写開始部位が存在してお
り、その中の幾つかは第１プロモータが欠失した後に初
めて使用される。このことは、異常な形で開始された
０．９kbメッセージが高コピー数で細胞質中に存在する
時のみ十分なtk酵素を産生し得ることを示唆している。
この短い択一性転写体は、野生型タンパク質の７０％に
当たる同様に短縮されたtk酵素をコードするものと推定
される。tk遺伝子配列を調べると、このメッセージの前
述の５′末端に近い３つの同位相翻訳開始コドンが観察
される。この短い酵素は機能が乏しく、豊富に存在しな
い限り十分に蓄積された酵素活性を発揮してtk+ 表現型
に転換させることはないと推測される。
子の周りには多数の択一的転写開始部位が存在してお
り、その中の幾つかは第１プロモータが欠失した後に初
めて使用される。このことは、異常な形で開始された
０．９kbメッセージが高コピー数で細胞質中に存在する
時のみ十分なtk酵素を産生し得ることを示唆している。
この短い択一性転写体は、野生型タンパク質の７０％に
当たる同様に短縮されたtk酵素をコードするものと推定
される。tk遺伝子配列を調べると、このメッセージの前
述の５′末端に近い３つの同位相翻訳開始コドンが観察
される。この短い酵素は機能が乏しく、豊富に存在しな
い限り十分に蓄積された酵素活性を発揮してtk+ 表現型
に転換させることはないと推測される。
【００４１】増幅されたセルラインがtk+ 表現型を示す
もう１つのメカニズムでは１．１kb転写体の相対的過剰
生産が行なわれる。このＲＮＡはaprt+ tk- 細胞中に極
めて低いレベルで存在するが、その合成は増幅により促
進される。これらの結果は、この異常転写体が、tk遺伝
子が高コピー数で存在する時にのみ十分なｍＲＮＡを発
生させる弱いプロモータにより調節されることを示唆し
ている。
もう１つのメカニズムでは１．１kb転写体の相対的過剰
生産が行なわれる。このＲＮＡはaprt+ tk- 細胞中に極
めて低いレベルで存在するが、その合成は増幅により促
進される。これらの結果は、この異常転写体が、tk遺伝
子が高コピー数で存在する時にのみ十分なｍＲＮＡを発
生させる弱いプロモータにより調節されることを示唆し
ている。
【００４２】増幅したＤＮＡの物理的構造 形質転換用ＤＮＡを増幅させる能力は、増幅した遺伝子
の程度と配列を研究する簡単な実験システムを実現せし
める。同時形質転換の結果、単一の選択可能遺伝子から
成る形質転換用ＤＮＡの結合体（concatenates）は、染
色体の単一の座で１乃至2,000kb の担体ＤＮＡに組込ま
れる［Robins, D. M., Ripley, S., Henderson, A. S.
及びAxel, R., Cell, 23, 29-39(1981) ；Perucho, M.,
Hanahan, D.及びWigler, M., Cell, 22, 309-317(198
0) ］。担体ＤＮＡが充分に規定されたクローン化ＤＮ
Ａ配列集合体から成る場合は、形質転換用要素における
これら配列の長さと順序とを正確な遺伝子地図化し得
る。
の程度と配列を研究する簡単な実験システムを実現せし
める。同時形質転換の結果、単一の選択可能遺伝子から
成る形質転換用ＤＮＡの結合体（concatenates）は、染
色体の単一の座で１乃至2,000kb の担体ＤＮＡに組込ま
れる［Robins, D. M., Ripley, S., Henderson, A. S.
及びAxel, R., Cell, 23, 29-39(1981) ；Perucho, M.,
Hanahan, D.及びWigler, M., Cell, 22, 309-317(198
0) ］。担体ＤＮＡが充分に規定されたクローン化ＤＮ
Ａ配列集合体から成る場合は、形質転換用要素における
これら配列の長さと順序とを正確な遺伝子地図化し得
る。
【００４３】そのためにｐＢＲ３２２誘導体たるｐＡＴ
１５３に挿入されたランダムヒトＤＮＡ配列の５−１５
kbインサートを含む２０個のプラスミドクローンで全体
が構成された担体ＤＮＡを用いてaprt+ tk- セルライン
を構成した。このようにして構成されたセルラインは、
独自に識別し得るｐＢＲ配列が５−１５kbの間隔をおい
て両側に配置されているtk−aprtプラスミドのシングル
コピーを含んでいる。tk+ 突然変異体サブクローンをこ
れらセルラインから誘導し、且つ増幅したｐＢＲ配列の
数と編成とを調べることにより増幅したＤＮＡの機構
（organization）を確認した。
１５３に挿入されたランダムヒトＤＮＡ配列の５−１５
kbインサートを含む２０個のプラスミドクローンで全体
が構成された担体ＤＮＡを用いてaprt+ tk- セルライン
を構成した。このようにして構成されたセルラインは、
独自に識別し得るｐＢＲ配列が５−１５kbの間隔をおい
て両側に配置されているtk−aprtプラスミドのシングル
コピーを含んでいる。tk+ 突然変異体サブクローンをこ
れらセルラインから誘導し、且つ増幅したｐＢＲ配列の
数と編成とを調べることにより増幅したＤＮＡの機構
（organization）を確認した。
【００４４】ゲノムＤＮＡをtk- 親株から単離し、別個
に誘導された８個のtk+ 突然変異体サブクローンを分割
し、ブロットし且つｐＢＲ配列をプローブした。組込ま
れた各ｐＢＲがブロットハイブリダイゼーションの際に
単一のバンドとして表示されるよう、前記ＤＮＡを、ｐ
ＢＲは切断しない２種の酵素ＢｇｌIIとＸbaＩとで切断
した。未増幅tk- 親株はシングルコピーの強度の多数の
ｐＢＲバンドを示す。８個のtk+ サブクローンはいずれ
も、ｐＢＲバンドのサブセットを増幅していた。
に誘導された８個のtk+ 突然変異体サブクローンを分割
し、ブロットし且つｐＢＲ配列をプローブした。組込ま
れた各ｐＢＲがブロットハイブリダイゼーションの際に
単一のバンドとして表示されるよう、前記ＤＮＡを、ｐ
ＢＲは切断しない２種の酵素ＢｇｌIIとＸbaＩとで切断
した。未増幅tk- 親株はシングルコピーの強度の多数の
ｐＢＲバンドを示す。８個のtk+ サブクローンはいずれ
も、ｐＢＲバンドのサブセットを増幅していた。
【００４５】この実験から４つの結論を導くことができ
る。第１に、増幅単位のサイズは可変性であって４０kb
から２００kbを上回るまでの範囲内の値をとる。増幅し
たｐＢＲバンドの数を数えるだけで、この増幅単位のサ
イズが直接推定される。
る。第１に、増幅単位のサイズは可変性であって４０kb
から２００kbを上回るまでの範囲内の値をとる。増幅し
たｐＢＲバンドの数を数えるだけで、この増幅単位のサ
イズが直接推定される。
【００４６】第２に、共通の遺伝的背景にも拘らず、各
増幅単位は独特である。２個のtk+サブクローンが同一
のｐＢＲバンドサブセットを増幅したことは決してな
い。
増幅単位は独特である。２個のtk+サブクローンが同一
のｐＢＲバンドサブセットを増幅したことは決してな
い。
【００４７】第３に、この異質性にも拘らず、全てのク
ローンにおいて共通のバンドコアが増幅され、且つ１つ
の突然変異体がこのコアのみを増幅した。このコアの存
在は、全てのクローンにおいて、増幅が共通の一点で開
始され、種々の間隔をおいて外側へ進みフランキングＤ
ＮＡまで及ぶことを示唆している。この共通点は増幅し
た単位の複製オリジンであり得る。増幅した単位は全体
が既に識別され且つ回収されているｐＢＲクローンから
成るため、このオリジンは容易に単離し得る。
ローンにおいて共通のバンドコアが増幅され、且つ１つ
の突然変異体がこのコアのみを増幅した。このコアの存
在は、全てのクローンにおいて、増幅が共通の一点で開
始され、種々の間隔をおいて外側へ進みフランキングＤ
ＮＡまで及ぶことを示唆している。この共通点は増幅し
た単位の複製オリジンであり得る。増幅した単位は全体
が既に識別され且つ回収されているｐＢＲクローンから
成るため、このオリジンは容易に単離し得る。
【００４８】最後に、増幅中には拡大再配列（extensiv
e rearrangement ）は起こらない。一般に、増幅した各
バンドはシングルコピーバンドとしてtk- 親株中に存在
する増幅したセルラインの１０％に、tk遺伝子とaprt遺
伝子とに関する再配列が検出された。これらの再配列は
親株の遺伝子機構と共存していたが、このことは、増幅
プロセス中に遺伝子変異体が時折発生することを示唆す
る。これら変異体遺伝子は増幅した遺伝子コピーの一分
画にすぎない。
e rearrangement ）は起こらない。一般に、増幅した各
バンドはシングルコピーバンドとしてtk- 親株中に存在
する増幅したセルラインの１０％に、tk遺伝子とaprt遺
伝子とに関する再配列が検出された。これらの再配列は
親株の遺伝子機構と共存していたが、このことは、増幅
プロセス中に遺伝子変異体が時折発生することを示唆す
る。これら変異体遺伝子は増幅した遺伝子コピーの一分
画にすぎない。
【００４９】増幅したＤＮＡの遺伝的作用（genetic ba
havior） 増幅単位内の２つの選択可能なマーカー即ちaprt及びtk
の存在は、増幅したＤＮＡの遺伝的作用の研究を可能に
した。問題は、マルチプルaprt遺伝子を含む増幅したク
ローンが単一世代でaprt- tk+ 表現型に突然変異し得る
か否かという点にあった。これらの表現型に関する要求
は、増幅したaprt遺伝子が全て不活性化される一方でtk
遺伝子は、増幅したままでなければならないというよう
なものである。
havior） 増幅単位内の２つの選択可能なマーカー即ちaprt及びtk
の存在は、増幅したＤＮＡの遺伝的作用の研究を可能に
した。問題は、マルチプルaprt遺伝子を含む増幅したク
ローンが単一世代でaprt- tk+ 表現型に突然変異し得る
か否かという点にあった。これらの表現型に関する要求
は、増幅したaprt遺伝子が全て不活性化される一方でtk
遺伝子は、増幅したままでなければならないというよう
なものである。
【００５０】最初に、aprt- tk+ 突然変異体を次の如く
単離した。単一の未増幅tk- 親株から誘導した約１００
個のaprt+ tk+ コロニーのプールを集団培養（mass cul
ture）で成長させ、三世代に亘り中性培地内に放置した
後、aprt- tk+ 表現型の選択にかけた。この集団から誘
導したaprt- tk+ 突然変異体を１．３×１０-5の頻度で
単離した。更に、１４個の独立したaprt+ tk+ クローン
を別個に分析してaprt- tk+ 表現型への突然変異率を調
べた。１４個のラインの中１２個が３×１０-4乃至４×
１０-7の率でaprt- tk+ 突然変異体を産生した。このよ
うな率は、結合した単一の野生型aprt及び野生型tk遺伝
子を含む細胞がaprt- tk+ 表現型突然変異する時の頻度
に近い。これら突然変異体の単離は従ってかなり意外な
ことであった。各aprt遺伝子が他の全ての増幅したaprt
遺伝子とは独立に突然変異していたとすれば、４０個の
突然変異aprt遺伝子を含む細胞を単離する確率は検出し
得ない程低かったであろう。
単離した。単一の未増幅tk- 親株から誘導した約１００
個のaprt+ tk+ コロニーのプールを集団培養（mass cul
ture）で成長させ、三世代に亘り中性培地内に放置した
後、aprt- tk+ 表現型の選択にかけた。この集団から誘
導したaprt- tk+ 突然変異体を１．３×１０-5の頻度で
単離した。更に、１４個の独立したaprt+ tk+ クローン
を別個に分析してaprt- tk+ 表現型への突然変異率を調
べた。１４個のラインの中１２個が３×１０-4乃至４×
１０-7の率でaprt- tk+ 突然変異体を産生した。このよ
うな率は、結合した単一の野生型aprt及び野生型tk遺伝
子を含む細胞がaprt- tk+ 表現型突然変異する時の頻度
に近い。これら突然変異体の単離は従ってかなり意外な
ことであった。各aprt遺伝子が他の全ての増幅したaprt
遺伝子とは独立に突然変異していたとすれば、４０個の
突然変異aprt遺伝子を含む細胞を単離する確率は検出し
得ない程低かったであろう。
【００５１】aprt- への突然変異率をより正確に測定す
べく、増幅した１つのセルラインを彷徨分析（fluctuat
ion analysis）［Luria, S. E.及びDelbruck, M., Gene
tics, 28, 491-511(1943) ］にかけた。表１にこの実験
の結果が要約されている。平均に対する分散の比はコン
トロール培養においては約１であるが、この値はポアソ
ン分布の場合に予想される値である。実験を続けていく
とこの比は大幅に大きくなるが、これは選択剤の導入に
先立ち中性培地内での成長中に突然変異がランダムに発
生した場合に得られるであろう結果である。突然変異の
全くない培養分画により計算したaprt- への突然変異率
［Lea, D. E.及び Coulson, C. A., J.Genet., 49, 264
-285(1949) ］は、細胞分裂当り１．４１×１０-4の突
然変異体で示される。最後に、この分析は、aprt- への
突然変異能力は全ての細胞の特性であって、このセルラ
インの誘導時に派生し得たような異常な変異体独自の特
性ではないことを示している。
べく、増幅した１つのセルラインを彷徨分析（fluctuat
ion analysis）［Luria, S. E.及びDelbruck, M., Gene
tics, 28, 491-511(1943) ］にかけた。表１にこの実験
の結果が要約されている。平均に対する分散の比はコン
トロール培養においては約１であるが、この値はポアソ
ン分布の場合に予想される値である。実験を続けていく
とこの比は大幅に大きくなるが、これは選択剤の導入に
先立ち中性培地内での成長中に突然変異がランダムに発
生した場合に得られるであろう結果である。突然変異の
全くない培養分画により計算したaprt- への突然変異率
［Lea, D. E.及び Coulson, C. A., J.Genet., 49, 264
-285(1949) ］は、細胞分裂当り１．４１×１０-4の突
然変異体で示される。最後に、この分析は、aprt- への
突然変異能力は全ての細胞の特性であって、このセルラ
インの誘導時に派生し得たような異常な変異体独自の特
性ではないことを示している。
【００５２】aprt- 表現型のへ突然変異における遺伝子
型変化 aprt+ tk+ クローン集団から誘導した７個のaprt- tk+
突然変異体のブロットハイブリダイゼーションによりtk
及びaprt遺伝子の構造を調べた。
型変化 aprt+ tk+ クローン集団から誘導した７個のaprt- tk+
突然変異体のブロットハイブリダイゼーションによりtk
及びaprt遺伝子の構造を調べた。
【００５３】
【表１】
【００５４】＊彷徨実験を実施すべく、aprt+ tk+ セル
ラインの３０個の複製カルチャー（replicate culture
）を、プレート毎に約２０個の細胞で、接種した後、
中性培地中でコンフルエントになるまで成長させた。各
プレート毎に５×１０4 のの割合で細胞を重複して再び
接種し、次いでaprt- tk+ 表現型を選択した。ＲＡの集
団培養も中性培地中に接種し、アリクォットを同様にap
rt- tk+ 表現型の選択にかけた。突然変異率をLea, D.
E.及び Coulson, C. A., J. Genet., 49, 264-285(194
9) に記載の方法で算出した。Ｆ0 計算はコロニーのな
いプレートの分画に基づいている。メジアン計算はプレ
ート毎のaprt- tk+ コロニーのメジアンに基づいてい
る。
ラインの３０個の複製カルチャー（replicate culture
）を、プレート毎に約２０個の細胞で、接種した後、
中性培地中でコンフルエントになるまで成長させた。各
プレート毎に５×１０4 のの割合で細胞を重複して再び
接種し、次いでaprt- tk+ 表現型を選択した。ＲＡの集
団培養も中性培地中に接種し、アリクォットを同様にap
rt- tk+ 表現型の選択にかけた。突然変異率をLea, D.
E.及び Coulson, C. A., J. Genet., 49, 264-285(194
9) に記載の方法で算出した。Ｆ0 計算はコロニーのな
いプレートの分画に基づいている。メジアン計算はプレ
ート毎のaprt- tk+ コロニーのメジアンに基づいてい
る。
【００５５】先ず、aprt遺伝子内からtk遺伝子を通して
伸張する５．０kbＰｖｕII断片の組込みを調べることに
より、aprt遺伝子とtk遺伝子との間の結合再配列を確認
した（図１）。次に、完全なaprt遺伝子を含む４．３kb
ＨinｄIII ／ＢｇｌII断片の組込みに基づきaprt遺伝子
自体の構造を確認した。
伸張する５．０kbＰｖｕII断片の組込みを調べることに
より、aprt遺伝子とtk遺伝子との間の結合再配列を確認
した（図１）。次に、完全なaprt遺伝子を含む４．３kb
ＨinｄIII ／ＢｇｌII断片の組込みに基づきaprt遺伝子
自体の構造を確認した。
【００５６】この分析の結果２種類の突然変異体が判明
した。一方の種類は全てのaprt遺伝子を欠失していた。
４．３kbＨinｄIII ／ＢｇｌII断片は存在せず、aprtに
対して相同の情報はゲノム内に全く残存していなかっ
た。tk遺伝子は予想通り増幅したままであった。前述の
如くaprt+ tk+ 増幅クローンは、ドナープラスミド中に
存在するaprt及びtk間の結合を反映する特徴的５kbＰｖ
ｕＩＩ断片を示す。単一aprt遺伝子の欠失は、欠失の程
度以上にtk遺伝子からフランキングＤＮＡ内へと伸張す
る新しい単一のＰｖｕII結合断片を生ずるものと推測さ
れる。従って、全てのaprt遺伝子を除去するのに必要な
多数の独立した欠失現象は、数個の新しいＰｖｕII断片
を発生させる筈である。全てのaprt遺伝子の欠失の結果
生じる各aprt- tk+ 突然変異クローンにおいて、元来の
結合断片とはサイズの異なる増幅したＰｖｕII断片が１
つしか観察されないのは驚くべきことである。独立した
aprt- tk+ 突然変異サブクローンはいずれも別の単一増
幅ＰｖｕII断片を示す。欠失は独立した突然変異現象で
はなかったように思われる。増幅した系列（array ）の
全メンバーにおいて単一の欠失現象が反復された。
した。一方の種類は全てのaprt遺伝子を欠失していた。
４．３kbＨinｄIII ／ＢｇｌII断片は存在せず、aprtに
対して相同の情報はゲノム内に全く残存していなかっ
た。tk遺伝子は予想通り増幅したままであった。前述の
如くaprt+ tk+ 増幅クローンは、ドナープラスミド中に
存在するaprt及びtk間の結合を反映する特徴的５kbＰｖ
ｕＩＩ断片を示す。単一aprt遺伝子の欠失は、欠失の程
度以上にtk遺伝子からフランキングＤＮＡ内へと伸張す
る新しい単一のＰｖｕII結合断片を生ずるものと推測さ
れる。従って、全てのaprt遺伝子を除去するのに必要な
多数の独立した欠失現象は、数個の新しいＰｖｕII断片
を発生させる筈である。全てのaprt遺伝子の欠失の結果
生じる各aprt- tk+ 突然変異クローンにおいて、元来の
結合断片とはサイズの異なる増幅したＰｖｕII断片が１
つしか観察されないのは驚くべきことである。独立した
aprt- tk+ 突然変異サブクローンはいずれも別の単一増
幅ＰｖｕII断片を示す。欠失は独立した突然変異現象で
はなかったように思われる。増幅した系列（array ）の
全メンバーにおいて単一の欠失現象が反復された。
【００５７】第２の、より稀な種類のaprt- tk+ 突然変
異体はtk又はaprt遺伝子の構造又は編成（arrangement
）の変化を全く示さない。特徴的ＰｖｕII結合断片と
共にaprt遺伝子を含む４．３kb断片は変化しない。更
に、tk及びaprt遺伝子の増幅程度はaprt+ 親株及びaprt
- 突然変異体で同じである。
異体はtk又はaprt遺伝子の構造又は編成（arrangement
）の変化を全く示さない。特徴的ＰｖｕII結合断片と
共にaprt遺伝子を含む４．３kb断片は変化しない。更
に、tk及びaprt遺伝子の増幅程度はaprt+ 親株及びaprt
- 突然変異体で同じである。
【００５８】これらのセルラインのaprt- 表現型は、Ｄ
ＮＡの伝達可能な変化の結果得られるのか、又は付随的
ＤＮＡ変化を伴わないaprt発現の表現型変調（modulati
on）に起因するのかを確認すべく、形質転換アッセイを
使用した。高分子量ＤＮＡを、aprt遺伝子を保持する増
幅したaprt+ セルラインと３つのaprt- 突然変異体とか
ら単離した。aprt- 細胞を４つのＤＮＡサンプルの各々
にさらし、各サンプルがaprt+ コロニーを発生させる効
率を測定した。各aprt- 突然変異ラインからの６０μｇ
のＤＮＡはコロニーを全く生じさせなかった。これらの
データは、この種の突然変異体がブロット分析では容易
に検出し得ないＤＮＡの遺伝性変化に起因して発生する
ことを示している。
ＮＡの伝達可能な変化の結果得られるのか、又は付随的
ＤＮＡ変化を伴わないaprt発現の表現型変調（modulati
on）に起因するのかを確認すべく、形質転換アッセイを
使用した。高分子量ＤＮＡを、aprt遺伝子を保持する増
幅したaprt+ セルラインと３つのaprt- 突然変異体とか
ら単離した。aprt- 細胞を４つのＤＮＡサンプルの各々
にさらし、各サンプルがaprt+ コロニーを発生させる効
率を測定した。各aprt- 突然変異ラインからの６０μｇ
のＤＮＡはコロニーを全く生じさせなかった。これらの
データは、この種の突然変異体がブロット分析では容易
に検出し得ないＤＮＡの遺伝性変化に起因して発生する
ことを示している。
【００５９】突然変異Ａｐｒｔ遺伝子により産生された
異常転写体 これらの突然変異遺伝子からのＲＮＡ転写体を分析する
と、各aprt- セルラインでは増幅したaprt遺伝子の全て
が同一の突然変異を有するという考えに合致するａｐｒ
ｔ ｍＲＮＡの変化が確認される。野生型ハムスターap
rt遺伝子のシングルコピーを含むセルラインは細胞性ポ
リＡ+ ＲＮＡ全体で唯一の１kb転写体を発現する。切頭
tk遺伝子と共に同時増幅されたaprt遺伝子を含むaprt+
tk+ セルラインでは、このｍＲＮＡの量が増幅の度合に
比例して増加する。増幅したaprt- ラインはサザンブロ
ッティング（Southern blotting ）の変化は全く示さな
いが、いずれもＲＮＡ転写体のパターンの変化は示す。
１つのセルラインではこれが特に良く示された。このラ
インは野生型１kb aprt ｍＲＮＡを発現する代りに、２
つの異常転写体を産生する。これら転写体はいずれも増
幅したレベルで存在する。これら２つの転写体は野生型
パターンのスプライシング（splicing）を変化させる突
然変異の結果生じると思われる。第２突然変異ラインは
２つの類似した異常転写体を極めて少量産生する。第３
aprt- 系では適切なサイズの１kb mＲＮＡが、増幅の程
度とはもはや合致しない低レベルで存在する。これら突
然変異の性格、又はこれら突然変異がaprt- 表現型を生
じさせる方式は、現在のところ解明されていない。しか
し乍ら、この種の突然変異体では、欠失突然変異体の場
合同様、独特のaprt突然変異が単一のaprt遺伝子内に生
じ、補正プロセス（correction processes）を通して増
幅したaprt系列（array ）の全メンバーに伝達されたと
推測される。
異常転写体 これらの突然変異遺伝子からのＲＮＡ転写体を分析する
と、各aprt- セルラインでは増幅したaprt遺伝子の全て
が同一の突然変異を有するという考えに合致するａｐｒ
ｔ ｍＲＮＡの変化が確認される。野生型ハムスターap
rt遺伝子のシングルコピーを含むセルラインは細胞性ポ
リＡ+ ＲＮＡ全体で唯一の１kb転写体を発現する。切頭
tk遺伝子と共に同時増幅されたaprt遺伝子を含むaprt+
tk+ セルラインでは、このｍＲＮＡの量が増幅の度合に
比例して増加する。増幅したaprt- ラインはサザンブロ
ッティング（Southern blotting ）の変化は全く示さな
いが、いずれもＲＮＡ転写体のパターンの変化は示す。
１つのセルラインではこれが特に良く示された。このラ
インは野生型１kb aprt ｍＲＮＡを発現する代りに、２
つの異常転写体を産生する。これら転写体はいずれも増
幅したレベルで存在する。これら２つの転写体は野生型
パターンのスプライシング（splicing）を変化させる突
然変異の結果生じると思われる。第２突然変異ラインは
２つの類似した異常転写体を極めて少量産生する。第３
aprt- 系では適切なサイズの１kb mＲＮＡが、増幅の程
度とはもはや合致しない低レベルで存在する。これら突
然変異の性格、又はこれら突然変異がaprt- 表現型を生
じさせる方式は、現在のところ解明されていない。しか
し乍ら、この種の突然変異体では、欠失突然変異体の場
合同様、独特のaprt突然変異が単一のaprt遺伝子内に生
じ、補正プロセス（correction processes）を通して増
幅したaprt系列（array ）の全メンバーに伝達されたと
推測される。
【００６０】aprt- 突然変異体における増幅したＤＮＡ
の物理的構造 補正プロセスの原因となり得るメカニズムを考察する上
で重要なのは、観察される配列変化がaprt遺伝子周辺の
局部的領域に限定されているのか、又は全体的な再配列
（reorganization）が増幅した系列全体に広がっている
のかを認識することである。そこで、規定されたプラス
ミドのみで構成されたセルラインの補正に際して生じる
増幅単位の物理的変化を調べた。前述の如く、これらの
クローン化したセルラインは、クローン化したプローブ
を使用し得るプラスミド配列から成る形質転換エレメン
トを維持する。このようにして、遺伝子地図に示された
増幅系列を補正が生じる前と後とで分析することができ
る。
の物理的構造 補正プロセスの原因となり得るメカニズムを考察する上
で重要なのは、観察される配列変化がaprt遺伝子周辺の
局部的領域に限定されているのか、又は全体的な再配列
（reorganization）が増幅した系列全体に広がっている
のかを認識することである。そこで、規定されたプラス
ミドのみで構成されたセルラインの補正に際して生じる
増幅単位の物理的変化を調べた。前述の如く、これらの
クローン化したセルラインは、クローン化したプローブ
を使用し得るプラスミド配列から成る形質転換エレメン
トを維持する。このようにして、遺伝子地図に示された
増幅系列を補正が生じる前と後とで分析することができ
る。
【００６１】プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を含む３
つのaprt+ tk- ラインをaprt+ tk+表現型の選択により
増幅させた。合計１４個の増幅したサブクローンを取出
して膨脹させた。予想通り、これらの各ラインではaprt
遺伝子がtk遺伝子に結合したままであり、且つ形質転換
用ＤＮＡの有効長(significant lengths) が２０乃至４
０倍に増幅していた。これら１４のラインの中１２個が
検出し得る頻度でaprt- tk+ 突然変異体を産生した。こ
こで強調すべきは、これらラインの各々でaprt遺伝子と
tk遺伝子とが忠実に増幅したことである。このセルライ
ンセットでは増幅プロセス中に変異体遺伝子が発生した
形跡は全く見当らなかった。
つのaprt+ tk- ラインをaprt+ tk+表現型の選択により
増幅させた。合計１４個の増幅したサブクローンを取出
して膨脹させた。予想通り、これらの各ラインではaprt
遺伝子がtk遺伝子に結合したままであり、且つ形質転換
用ＤＮＡの有効長(significant lengths) が２０乃至４
０倍に増幅していた。これら１４のラインの中１２個が
検出し得る頻度でaprt- tk+ 突然変異体を産生した。こ
こで強調すべきは、これらラインの各々でaprt遺伝子と
tk遺伝子とが忠実に増幅したことである。このセルライ
ンセットでは増幅プロセス中に変異体遺伝子が発生した
形跡は全く見当らなかった。
【００６２】先ず、これらaprt- tk+ セルライン毎にブ
ロットハイブリダイゼーションを行うことによりaprt遺
伝子の構造を調べた。いずれの突然変異体でもaprt情報
が欠失していた。増幅した系列を含む単位全体において
単一の欠失が反復されていた。欠失は各セルライン毎に
異なる。また、これら突然変異体の中１０個では、aprt
遺伝子自体内部に欠失遺伝子地図の一つのブレイクポイ
ントが生じる。このことは繰り返しｐＢＲ配列間の組換
えが欠失のメカニズムではないことを意味する。
ロットハイブリダイゼーションを行うことによりaprt遺
伝子の構造を調べた。いずれの突然変異体でもaprt情報
が欠失していた。増幅した系列を含む単位全体において
単一の欠失が反復されていた。欠失は各セルライン毎に
異なる。また、これら突然変異体の中１０個では、aprt
遺伝子自体内部に欠失遺伝子地図の一つのブレイクポイ
ントが生じる。このことは繰り返しｐＢＲ配列間の組換
えが欠失のメカニズムではないことを意味する。
【００６３】増幅単位のフランキングＤＮＡの機構を調
べるべくｐＢＲ３２２配列をプローブとして使用した。
調査の結果、増幅単位は補正時も本質的に変化しないこ
とが判明している。各突然変異体はaprt+ 親株により表
示された唯一のプラスミド配列系列を保持する。親株内
で増幅された２つのバンドはaprt- 突然変異体には存在
しない。aprt遺伝子プローブでハイブリダイゼーション
すると、これらのバンドの中一方がaprt- 突然変異体で
は欠失しているaprt遺伝子を含んでいることがわかる。
第２バンドはフランキングＤＮＡの欠失の一つのブレイ
クポイントを反映し得る。このように、補正プロセスは
極めて保存的であると思われる。再配列は増幅した系列
の全ての単位において同等と思われるaprt遺伝子の周囲
の唯一の変化に限定される。
べるべくｐＢＲ３２２配列をプローブとして使用した。
調査の結果、増幅単位は補正時も本質的に変化しないこ
とが判明している。各突然変異体はaprt+ 親株により表
示された唯一のプラスミド配列系列を保持する。親株内
で増幅された２つのバンドはaprt- 突然変異体には存在
しない。aprt遺伝子プローブでハイブリダイゼーション
すると、これらのバンドの中一方がaprt- 突然変異体で
は欠失しているaprt遺伝子を含んでいることがわかる。
第２バンドはフランキングＤＮＡの欠失の一つのブレイ
クポイントを反映し得る。このように、補正プロセスは
極めて保存的であると思われる。再配列は増幅した系列
の全ての単位において同等と思われるaprt遺伝子の周囲
の唯一の変化に限定される。
【００６４】増幅したＤＮＡの染色体編成 これらのセルラインの増幅したＤＮＡが、染色体内に存
在するのか、又は二重微小染色体（double minute chro
mosomes ）の如き小さな染色体外エレメントとして存在
するのかを確認すべくインシチュ（in situ）ハイブリ
ダイゼーションを使用した［Kaufman, R. J., Brown,
P. C 及びSchimke, R.T., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
76, 5669-5673(1979) ］。一つのaprt+ tk+ セルライ
ンＲＡ中の増幅したＤＮＡの位置と、補正されたaprt-
tk+ 突然変異体ＲＡ- とをインシチュハイブリダイゼー
ションにより確認した。これらの増幅したtk+ セルライ
ンは約６００ｐＢＲ配列を含んでいるためインシチュハ
イブリダイゼーションによる検出が容易になる。コルセ
ミド処理した細胞（colcemid-treated cells）から分裂
中期増殖体（metaphase spreads ）を調製し、 125Ｉ標
識されたｐＢＲ３２２によりインシチュハイブリダイゼ
ーションにかけた。
在するのか、又は二重微小染色体（double minute chro
mosomes ）の如き小さな染色体外エレメントとして存在
するのかを確認すべくインシチュ（in situ）ハイブリ
ダイゼーションを使用した［Kaufman, R. J., Brown,
P. C 及びSchimke, R.T., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
76, 5669-5673(1979) ］。一つのaprt+ tk+ セルライ
ンＲＡ中の増幅したＤＮＡの位置と、補正されたaprt-
tk+ 突然変異体ＲＡ- とをインシチュハイブリダイゼー
ションにより確認した。これらの増幅したtk+ セルライ
ンは約６００ｐＢＲ配列を含んでいるためインシチュハ
イブリダイゼーションによる検出が容易になる。コルセ
ミド処理した細胞（colcemid-treated cells）から分裂
中期増殖体（metaphase spreads ）を調製し、 125Ｉ標
識されたｐＢＲ３２２によりインシチュハイブリダイゼ
ーションにかけた。
【００６５】ｐＢＲ３２２でのハイブリダイゼーション
に続いてaprt+ tk+ ラインＲＮＡの分裂中期プレートを
調べた。標識化は小さな中部動原体染色体に局在化され
ていた。２５以上の分裂中期プレートを調べた結果、増
幅したＤＮＡは独自の染色体領域を占めるらしいことが
判明した。ＲＡのaprt- 誘導体からの分裂中期プレート
も調べた。ハイブリダイゼーション後、標識化はやはり
小さな中部動原体染色体に局在化されていた。約５０の
分裂中期プレートを検査した結果、aprt- への突然変異
後も増幅したＤＮＡは染色体内に留まることが判明し
た。
に続いてaprt+ tk+ ラインＲＮＡの分裂中期プレートを
調べた。標識化は小さな中部動原体染色体に局在化され
ていた。２５以上の分裂中期プレートを調べた結果、増
幅したＤＮＡは独自の染色体領域を占めるらしいことが
判明した。ＲＡのaprt- 誘導体からの分裂中期プレート
も調べた。ハイブリダイゼーション後、標識化はやはり
小さな中部動原体染色体に局在化されていた。約５０の
分裂中期プレートを検査した結果、aprt- への突然変異
後も増幅したＤＮＡは染色体内に留まることが判明し
た。
【００６６】考 察 遺伝子増幅 ２つの遺伝子、即ちプロモータを欠くtk遺伝子に結合し
た野生型aprt遺伝子、を含むプラスミドを用いてaprt-
tk- 細胞を形質転換した。該プラスミドのシングルコピ
ーを取込んだ形質転換体は、aprt+ 表現型を示すが依然
としてtk- である。tk+ 変異体は、かなりの長さのフラ
ンキングＤＮＡと共に結合プラスミドを２０乃至５０倍
に増幅すると出現する。或る種の細胞では、突然変異tk
遺伝子が短い転写体を産生しており、この転写体は、酵
素活性の低下した切頭タンパク質をコードすると推定さ
れる。別の細胞では、異常型転写体が、明らかに弱いプ
ロモータの認識によって生じる。いずれの場合にも、細
胞をtk+ 表現型に転換すべく十分な酵素を生成するに
は、マルチプル遺伝子が必要である。
た野生型aprt遺伝子、を含むプラスミドを用いてaprt-
tk- 細胞を形質転換した。該プラスミドのシングルコピ
ーを取込んだ形質転換体は、aprt+ 表現型を示すが依然
としてtk- である。tk+ 変異体は、かなりの長さのフラ
ンキングＤＮＡと共に結合プラスミドを２０乃至５０倍
に増幅すると出現する。或る種の細胞では、突然変異tk
遺伝子が短い転写体を産生しており、この転写体は、酵
素活性の低下した切頭タンパク質をコードすると推定さ
れる。別の細胞では、異常型転写体が、明らかに弱いプ
ロモータの認識によって生じる。いずれの場合にも、細
胞をtk+ 表現型に転換すべく十分な酵素を生成するに
は、マルチプル遺伝子が必要である。
【００６７】このような実験計画は、無プロモータtk遺
伝子を活性化する遺伝子再配列を含む突然変異を起すた
めに選択されたものである。挿入、欠失又は増幅の如き
再配列による突然変異は、正常細胞プロセス実行中の細
胞のゲノム認識能力を反映する。或る種の遺伝子に於け
る突然変異の原因となる再配列メカニズムを利用して別
の遺伝子の適正な機能を確保し得る。例えば、欠失は免
疫グロブリン遺伝子の活性化に於ける必然的現象である
［H. K. Sakano, G. Heinrich 及び S. Tonegawa (197
9), Nature, 280, 288-294 ］。より複雑な転位（trans
position ）は、酵母の交配型を決定する不活動配列の
発現を生じる［J. B. Hicks 及びJ. Herskowitz (197
7), Genetics, 85, 373-393 ］。逆位は、原核生物の表
面抗原のサブセットの賦活及び失活の双方を生じさせ得
る［J. Zeing, M. Hilmen,及び M. Simon (1978), Cel
l, 15, 237-244 ］。最後に、絨毛膜遺伝子の増幅はシ
ョウジョウバエ（Drosophila）の幼虫発育過程で生じ絨
毛膜タンパク質の産生を増加する［A. C. Spradling (1
981), Cell, 27, 193-203 ］。
伝子を活性化する遺伝子再配列を含む突然変異を起すた
めに選択されたものである。挿入、欠失又は増幅の如き
再配列による突然変異は、正常細胞プロセス実行中の細
胞のゲノム認識能力を反映する。或る種の遺伝子に於け
る突然変異の原因となる再配列メカニズムを利用して別
の遺伝子の適正な機能を確保し得る。例えば、欠失は免
疫グロブリン遺伝子の活性化に於ける必然的現象である
［H. K. Sakano, G. Heinrich 及び S. Tonegawa (197
9), Nature, 280, 288-294 ］。より複雑な転位（trans
position ）は、酵母の交配型を決定する不活動配列の
発現を生じる［J. B. Hicks 及びJ. Herskowitz (197
7), Genetics, 85, 373-393 ］。逆位は、原核生物の表
面抗原のサブセットの賦活及び失活の双方を生じさせ得
る［J. Zeing, M. Hilmen,及び M. Simon (1978), Cel
l, 15, 237-244 ］。最後に、絨毛膜遺伝子の増幅はシ
ョウジョウバエ（Drosophila）の幼虫発育過程で生じ絨
毛膜タンパク質の産生を増加する［A. C. Spradling (1
981), Cell, 27, 193-203 ］。
【００６８】増幅の原因となる現象を説明するために２
つの普遍的メカニズムが考察された。姉妹染色分体間の
不等乗換の如き緩増幅プロセスは、酵素活性の特異的阻
害剤に耐性の増幅セルラインを生成するに必要な緩徐な
段階式選択を説明すると考えられている［F. W. Alt.,
R. E. Kellems, J. R. Bertino及びR. T. Schimke(197
8), J. Biol, Chem. 253, 1357-1370 ］。急増幅現象
は、正常コントロールメカニズムから逸脱した局在的な
複製の発生を含んでおり、世代当り２回以上の複製過程
で配列の認識及びコピーを行なわせるであろう。本発明
に係る研究では、tk+ 表現型が単一段階選択により生じ
ておりＤＮＡの急増幅メカニズムを示唆する。
つの普遍的メカニズムが考察された。姉妹染色分体間の
不等乗換の如き緩増幅プロセスは、酵素活性の特異的阻
害剤に耐性の増幅セルラインを生成するに必要な緩徐な
段階式選択を説明すると考えられている［F. W. Alt.,
R. E. Kellems, J. R. Bertino及びR. T. Schimke(197
8), J. Biol, Chem. 253, 1357-1370 ］。急増幅現象
は、正常コントロールメカニズムから逸脱した局在的な
複製の発生を含んでおり、世代当り２回以上の複製過程
で配列の認識及びコピーを行なわせるであろう。本発明
に係る研究では、tk+ 表現型が単一段階選択により生じ
ておりＤＮＡの急増幅メカニズムを示唆する。
【００６９】少数のクローン配列のみから成る形質転換
エレメントの増幅により、増幅単位の物理的構造の特性
決定を行なうことが可能である。現在ではまだ、クロー
ンプローブを得ることができない配列中に増幅が進行す
るかも知れないので、増幅された内因性遺伝子の構造の
解析は、多くの場合難しい。単一母体（親株）由来のい
くつかの独立tk+ セルライン中の増幅遺伝子の構造及び
従って共通の遺伝的背景を検討すると、各増幅単位が独
特（unique）であることが判明する。増幅単位のサイズ
は４０から２００kbを超える範囲まで可変である。この
不均質性（heterogeneity ）に関わり無しに、全てのク
ローン中でバンドの共通コアが増幅される。最後に、増
幅されたバンドの各々は母体中のシングルコピー中にも
存在しており、拡大的（extensive ）再配列が増幅プロ
セスに必ずしも伴なわないことを示す。
エレメントの増幅により、増幅単位の物理的構造の特性
決定を行なうことが可能である。現在ではまだ、クロー
ンプローブを得ることができない配列中に増幅が進行す
るかも知れないので、増幅された内因性遺伝子の構造の
解析は、多くの場合難しい。単一母体（親株）由来のい
くつかの独立tk+ セルライン中の増幅遺伝子の構造及び
従って共通の遺伝的背景を検討すると、各増幅単位が独
特（unique）であることが判明する。増幅単位のサイズ
は４０から２００kbを超える範囲まで可変である。この
不均質性（heterogeneity ）に関わり無しに、全てのク
ローン中でバンドの共通コアが増幅される。最後に、増
幅されたバンドの各々は母体中のシングルコピー中にも
存在しており、拡大的（extensive ）再配列が増幅プロ
セスに必ずしも伴なわないことを示す。
【００７０】単一母体由来の全てのtk+ ラインに於いて
共通する４つのコアバンドのセットが増幅されることが
観察されるので、増幅が固定点即ちオリジンから進行す
るであろうと思われる。従って、これら４つのバンドの
１つは複製オリジンを含んでおり単離が容易な筈であ
る。しかし乍ら、同胞セルライン中の増幅単位のサイズ
はまったく不定であり、このため終了部位も不定であろ
う。複製及びその後の増幅は、独自のオリジンから種々
の長さまで進行するであろう。
共通する４つのコアバンドのセットが増幅されることが
観察されるので、増幅が固定点即ちオリジンから進行す
るであろうと思われる。従って、これら４つのバンドの
１つは複製オリジンを含んでおり単離が容易な筈であ
る。しかし乍ら、同胞セルライン中の増幅単位のサイズ
はまったく不定であり、このため終了部位も不定であろ
う。複製及びその後の増幅は、独自のオリジンから種々
の長さまで進行するであろう。
【００７１】絨毛膜遺伝子増幅の検討［A. C. Spradlin
g (1981), Cell, 27, 193-203 ］によって、推定される
染色体複製オリジンに近位の配列は、この座に遠位の配
列よりも高度に増幅されることが判明した。ここで報告
される結果はこの知見に一致する。更にここで報告され
る結果は、前記の如き増幅勾配（amplification gradie
nt）が個々の細胞の特性ではなく、構成細胞の各々が染
色体ＤＮＡの多少とも広い領域を均一に増幅しているよ
うな細胞集団の特性であることを示唆する。
g (1981), Cell, 27, 193-203 ］によって、推定される
染色体複製オリジンに近位の配列は、この座に遠位の配
列よりも高度に増幅されることが判明した。ここで報告
される結果はこの知見に一致する。更にここで報告され
る結果は、前記の如き増幅勾配（amplification gradie
nt）が個々の細胞の特性ではなく、構成細胞の各々が染
色体ＤＮＡの多少とも広い領域を均一に増幅しているよ
うな細胞集団の特性であることを示唆する。
【００７２】活性低下を生じるが失活は生じないように
in vitro突然変異された選択可能遺伝子はin vivoでの
適性選択によって増幅し得ると考えられる。不能（disa
bled）遺伝子を用い別のクローン配列と共に同時形質転
換及び続いて増幅を行なうと、同時形質転換遺伝子によ
りコードされた多量のタンパク産物を産生し得るであろ
う。同時形質転換ＤＮＡを増幅する細胞を選択できるの
で、受容セルゲノムから同時形質転換ＤＮＡをクローニ
ングする作業は大いに簡単になる［M. Perucho, D. Han
ahan, L. Lipsich及び M. Wigler (1980), Nature, 28
5, 207-210 ；I.Lowy, A. Pellicer, J. Jackson, G.
K. Sim. S. Silverstein 及び R. Axel (1980), Cell,2
2, 817-823 ］。
in vitro突然変異された選択可能遺伝子はin vivoでの
適性選択によって増幅し得ると考えられる。不能（disa
bled）遺伝子を用い別のクローン配列と共に同時形質転
換及び続いて増幅を行なうと、同時形質転換遺伝子によ
りコードされた多量のタンパク産物を産生し得るであろ
う。同時形質転換ＤＮＡを増幅する細胞を選択できるの
で、受容セルゲノムから同時形質転換ＤＮＡをクローニ
ングする作業は大いに簡単になる［M. Perucho, D. Han
ahan, L. Lipsich及び M. Wigler (1980), Nature, 28
5, 207-210 ；I.Lowy, A. Pellicer, J. Jackson, G.
K. Sim. S. Silverstein 及び R. Axel (1980), Cell,2
2, 817-823 ］。
【００７３】遺伝子補正（correction） aprt+ tk+ ラインは突然変異型tk遺伝子と野生型aprt遺
伝子とから成る増幅系列を維持する。aprt- tk+ 変異体
の選択には増幅tk遺伝子を維持するための圧力が作用す
るが、２０を超える野生型aprt対立遺伝子の失活が必要
である。aprt-tk+ 変異体は極めて高い頻度で生じる。
彷徨分析から１０-4の突然変異率を算出し得る。従っ
て、２０個の増幅aprt遺伝子の失活率は単一aprt遺伝子
の失活率とほぼ等しい。彷徨検定の結果によれば、この
特性、aprt- 表現型に突然変異する能力は、集団中の全
ての細胞に先天的に存在しており、変異細胞の小集団に
限定されない。
伝子とから成る増幅系列を維持する。aprt- tk+ 変異体
の選択には増幅tk遺伝子を維持するための圧力が作用す
るが、２０を超える野生型aprt対立遺伝子の失活が必要
である。aprt-tk+ 変異体は極めて高い頻度で生じる。
彷徨分析から１０-4の突然変異率を算出し得る。従っ
て、２０個の増幅aprt遺伝子の失活率は単一aprt遺伝子
の失活率とほぼ等しい。彷徨検定の結果によれば、この
特性、aprt- 表現型に突然変異する能力は、集団中の全
ての細胞に先天的に存在しており、変異細胞の小集団に
限定されない。
【００７４】aprt- 表現型の選択作用は単一世代中で生
じる。しかしながら、aprt- 表現型の原因となるマルチ
プル遺伝子的現象は、１つの世代では生じないかも知れ
ないが、表現型に影響を与えること無く時間と共に累積
し、結局全部の遺伝子を失活させるであろう。
じる。しかしながら、aprt- 表現型の原因となるマルチ
プル遺伝子的現象は、１つの世代では生じないかも知れ
ないが、表現型に影響を与えること無く時間と共に累積
し、結局全部の遺伝子を失活させるであろう。
【００７５】増幅ＤＮＡとaprt mＲＮＡとの構造の解析
により、所与のaprt- 細胞内で全ての増幅単位が等しい
突然変異を担うことが判明する。これは、突然変異が１
つのaprt遺伝子内で発生し以後増幅系列内部の全ての他
のaprt遺伝子に伝達される２段階プロセスを示唆する。
このプロセスを補正（correction）と指称する。aprt-
変異体の総出現頻度は測定可能であるが、２つの構成段
階、即ち突然変異と補正との率を直接測定することはで
きない。単一aprt遺伝子の突然変異率を考慮に入れる
と、現在のデータは、補正が記載の実験条件下で極めて
有効なプロセスであり得ることを示唆する。
により、所与のaprt- 細胞内で全ての増幅単位が等しい
突然変異を担うことが判明する。これは、突然変異が１
つのaprt遺伝子内で発生し以後増幅系列内部の全ての他
のaprt遺伝子に伝達される２段階プロセスを示唆する。
このプロセスを補正（correction）と指称する。aprt-
変異体の総出現頻度は測定可能であるが、２つの構成段
階、即ち突然変異と補正との率を直接測定することはで
きない。単一aprt遺伝子の突然変異率を考慮に入れる
と、現在のデータは、補正が記載の実験条件下で極めて
有効なプロセスであり得ることを示唆する。
【００７６】Ａ．収縮及び再膨脹（re-expansion） ２つの基本的メカニズム、即ち収縮：再膨脹と遺伝的組
換とによって補正プロセスが説明されると考えられてき
た。最も簡単な形での収縮：再膨脹には、単一aprt遺伝
子の突然変異と、残存遺伝子の欠失と、tk+ 表現型を維
持するに十分な数のtk遺伝子を与えるための以後の再増
幅とが関与するであろう。これらの現象は、作用する選
択条件下で生存すべく１つの世代又は数世代に於いて発
生する必要があろう。この説明及びこれに類似の説明は
真実から遠いと考えられる。第一には、aprt- tk+ 突然
変異体中の増幅バンドのパターンはaprt+ tk+ 母体に実
質的に等しい。このことは、単一aprt+ tk- クローンの
全てのaprt+ tk+ 誘導体が異なる増幅単位を示す元来の
増幅プロセスと対照的である。再膨脹が発生するなら
ば、母体で観察されるプロフィルに似た新しい増幅バン
ドパターンが予想されない筈である。第二には、このプ
ロセスでの個々のステップ、即ち突然変異、欠失、再増
幅の予想頻度が１０-9以下であり、これは観察された頻
度より５桁も小さい値である。
換とによって補正プロセスが説明されると考えられてき
た。最も簡単な形での収縮：再膨脹には、単一aprt遺伝
子の突然変異と、残存遺伝子の欠失と、tk+ 表現型を維
持するに十分な数のtk遺伝子を与えるための以後の再増
幅とが関与するであろう。これらの現象は、作用する選
択条件下で生存すべく１つの世代又は数世代に於いて発
生する必要があろう。この説明及びこれに類似の説明は
真実から遠いと考えられる。第一には、aprt- tk+ 突然
変異体中の増幅バンドのパターンはaprt+ tk+ 母体に実
質的に等しい。このことは、単一aprt+ tk- クローンの
全てのaprt+ tk+ 誘導体が異なる増幅単位を示す元来の
増幅プロセスと対照的である。再膨脹が発生するなら
ば、母体で観察されるプロフィルに似た新しい増幅バン
ドパターンが予想されない筈である。第二には、このプ
ロセスでの個々のステップ、即ち突然変異、欠失、再増
幅の予想頻度が１０-9以下であり、これは観察された頻
度より５桁も小さい値である。
【００７７】収縮：再膨脹の１つのモデルとしては、ダ
ブルミニッツ（double minutes）の如きマルチプル染色
体外エレメント上に増幅単位の存在を含む場合が考えら
れる。突然変異は１つのエレメント内で発生し、以後、
ランダム不等分離によって１つの細胞内に累積するであ
ろう。本発明に係る研究では増幅ＤＮＡがaprt+ 細胞及
びaprt- 細胞の双方の染色体上に存在することが観察さ
れるので、この説明には適合しない。
ブルミニッツ（double minutes）の如きマルチプル染色
体外エレメント上に増幅単位の存在を含む場合が考えら
れる。突然変異は１つのエレメント内で発生し、以後、
ランダム不等分離によって１つの細胞内に累積するであ
ろう。本発明に係る研究では増幅ＤＮＡがaprt+ 細胞及
びaprt- 細胞の双方の染色体上に存在することが観察さ
れるので、この説明には適合しない。
【００７８】現在のデータに一致する収縮：再膨脹のま
た１つのモデルとしては、増幅ＤＮＡの以後の組込みを
伴なわない単一染色体座での多複製サイクルを含む場合
が考えられる。この“ローカル・ポリテナイゼーショ
ン”プロセスではオニオンスキンに似た構造が発生する
であろう。［M. Botchan, W. Topp 及び J. Sambrook
(1978), Cold, Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43,
709-719 ］。このプロセスは、ショウジョウバエ絨毛
膜遺伝子の特異的発生増幅［A. C. Spradling (1981),
Cell, 27, 193-203 ］のように、組込みウイルス遺伝子
の増幅を説明するために考え出されたものである［M. B
otchan, W. Topp 及びJ. Sambrook (1978),Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 709-719 ］。このモ
デルを本発明に係る研究に当てはめると、aprt+ tk+ 母
体中での増幅のためには組込みaprt−tkプラスミドの近
傍に突然変異体複製オリジンが存在する必要があろう。
この突然変異体オリジンの特性が、ＤＮＡの局在領域を
正常発育コントロールから免除し、単一細胞サイクル内
で多数回の複製を繰返させるであろう。次の世代では全
ての非組込み増幅ＤＮＡが廃棄され、突然変異体オリジ
ンは、継続する各サイクル中に“オニオンスキン”を再
生する。注目すべきは、突然変異体オリジンが関与する
場合、継続する各細胞サイクルに伴なって増幅配列の指
数累積が生じないように増幅ＤＮＡが各世代毎に廃棄さ
れる必要があることである。このようなモデルでは、ap
rt+ tk+ からaprt- tk+ への突然変異のためには、単一
組込みaprt遺伝子内部での突然変異が必要なだけであ
る。野生型非組込みaprtＤＮＡは次の世代で廃棄され、
突然変異を生じた組込みＤＮＡが増幅状態まで複製を行
なう。注目すべきこのような推測は現在のデータとも一
致しており、実験テストも可能である。
た１つのモデルとしては、増幅ＤＮＡの以後の組込みを
伴なわない単一染色体座での多複製サイクルを含む場合
が考えられる。この“ローカル・ポリテナイゼーショ
ン”プロセスではオニオンスキンに似た構造が発生する
であろう。［M. Botchan, W. Topp 及び J. Sambrook
(1978), Cold, Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43,
709-719 ］。このプロセスは、ショウジョウバエ絨毛
膜遺伝子の特異的発生増幅［A. C. Spradling (1981),
Cell, 27, 193-203 ］のように、組込みウイルス遺伝子
の増幅を説明するために考え出されたものである［M. B
otchan, W. Topp 及びJ. Sambrook (1978),Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 709-719 ］。このモ
デルを本発明に係る研究に当てはめると、aprt+ tk+ 母
体中での増幅のためには組込みaprt−tkプラスミドの近
傍に突然変異体複製オリジンが存在する必要があろう。
この突然変異体オリジンの特性が、ＤＮＡの局在領域を
正常発育コントロールから免除し、単一細胞サイクル内
で多数回の複製を繰返させるであろう。次の世代では全
ての非組込み増幅ＤＮＡが廃棄され、突然変異体オリジ
ンは、継続する各サイクル中に“オニオンスキン”を再
生する。注目すべきは、突然変異体オリジンが関与する
場合、継続する各細胞サイクルに伴なって増幅配列の指
数累積が生じないように増幅ＤＮＡが各世代毎に廃棄さ
れる必要があることである。このようなモデルでは、ap
rt+ tk+ からaprt- tk+ への突然変異のためには、単一
組込みaprt遺伝子内部での突然変異が必要なだけであ
る。野生型非組込みaprtＤＮＡは次の世代で廃棄され、
突然変異を生じた組込みＤＮＡが増幅状態まで複製を行
なう。注目すべきこのような推測は現在のデータとも一
致しており、実験テストも可能である。
【００７９】Ｂ．遺伝的組換え 考察が必要な最後の補正メカニズムは遺伝子組換えに関
与する。真核生物ではタンデム系列の個々の反復単位は
多くの場合、顕著な均質性（homogeneity ）を示す。配
列均質性が維持されるのは、不等乗換現象又は遺伝子変
換に由ると考えられている［G. P. Smith (1976). Scie
nce, 191, 528-535; J. W. Szostak及びR. Wu (1980).
Nature, 284, 426-430 ；H. L. Klein 及びJ. D. Pete
s (1981). Nature, 289, 144-148 ］。有糸酵母細胞中
の反復ＤＮＡ配列間の不等姉妹染色分体交換の頻度を直
接推定した値からは、このメカニズムが観察された均質
性を維持し得ることが示唆される［J. W. Szostak 及び
R. Wu (1980). Nature,284, 426-430 ］。不等乗換
は、２つの理由で突然変異型aprt遺伝子の固定の説明に
用いることができないと考えられる。第一に、これらの
セルライン中の高度に反復されたｐＢＲ配列間の不等乗
換は該配列の互いの関係を混乱させ、サザンブロットバ
ンドパターンの変化を生じる。従って本発明の場合とは
異なっている。第二に、これらセルラインの創成とaprt
- 表現型の選択作用との間には僅か３０世代しか経過し
ない。不等乗換プロセスのコンピュータシミュレーショ
ンによれば、このような少ない世代で３０個の野生型遺
伝子の系列中で突然変異型対立遺伝子が固定される確率
は、世代当り１回の姉妹染色分体交換が生じると仮定す
ると１０-8未満である。
与する。真核生物ではタンデム系列の個々の反復単位は
多くの場合、顕著な均質性（homogeneity ）を示す。配
列均質性が維持されるのは、不等乗換現象又は遺伝子変
換に由ると考えられている［G. P. Smith (1976). Scie
nce, 191, 528-535; J. W. Szostak及びR. Wu (1980).
Nature, 284, 426-430 ；H. L. Klein 及びJ. D. Pete
s (1981). Nature, 289, 144-148 ］。有糸酵母細胞中
の反復ＤＮＡ配列間の不等姉妹染色分体交換の頻度を直
接推定した値からは、このメカニズムが観察された均質
性を維持し得ることが示唆される［J. W. Szostak 及び
R. Wu (1980). Nature,284, 426-430 ］。不等乗換
は、２つの理由で突然変異型aprt遺伝子の固定の説明に
用いることができないと考えられる。第一に、これらの
セルライン中の高度に反復されたｐＢＲ配列間の不等乗
換は該配列の互いの関係を混乱させ、サザンブロットバ
ンドパターンの変化を生じる。従って本発明の場合とは
異なっている。第二に、これらセルラインの創成とaprt
- 表現型の選択作用との間には僅か３０世代しか経過し
ない。不等乗換プロセスのコンピュータシミュレーショ
ンによれば、このような少ない世代で３０個の野生型遺
伝子の系列中で突然変異型対立遺伝子が固定される確率
は、世代当り１回の姉妹染色分体交換が生じると仮定す
ると１０-8未満である。
【００８０】遺伝子変換は不完全相同の配列間の染色分
体（strand）交換の際に生じるであろう。次に、非相同
の領域が多くの場合不可逆的に補正される。酵母での遺
伝子複製の遺伝的挙動に関する最近の分析によれば、複
製エレメント間で最も多く見られる組換えメカニズムは
転換であることが示唆されている［H. L. Klein, J.D.
Petes (1981). Nature, 289, 144-148 ；J. A. Jackso
n, G. E. Fink (1981). Nature, 292, 306-311 ］。従
って、aprt- 状態への補正は、突然変異型遺伝子と野生
型aprt遺伝子との間の反復ストランド対合（pairing ）
が生じ引続いて全ての野生型遺伝子の突然変異表現型へ
の変換が生じたことの結果であろう。観察された補正の
説明となるためには、このメカニズムが高頻度で作用し
ていなければならない。
体（strand）交換の際に生じるであろう。次に、非相同
の領域が多くの場合不可逆的に補正される。酵母での遺
伝子複製の遺伝的挙動に関する最近の分析によれば、複
製エレメント間で最も多く見られる組換えメカニズムは
転換であることが示唆されている［H. L. Klein, J.D.
Petes (1981). Nature, 289, 144-148 ；J. A. Jackso
n, G. E. Fink (1981). Nature, 292, 306-311 ］。従
って、aprt- 状態への補正は、突然変異型遺伝子と野生
型aprt遺伝子との間の反復ストランド対合（pairing ）
が生じ引続いて全ての野生型遺伝子の突然変異表現型へ
の変換が生じたことの結果であろう。観察された補正の
説明となるためには、このメカニズムが高頻度で作用し
ていなければならない。
【００８１】遺伝子変換は、酵母の交配型相互変換の発
生プロセス［J. E. Haber, D. T.Rogers及びJ. H. Mc C
usker (1980), Cell, 22, 277-289 ；A. J. Klar, J. M
cIndoo, J. W. Strathern及びJ. B. Hicks (1980). Cel
l, 22, 291-298 ］、及び、反復遺伝子間の配列の一致
の維持［J. L. Sleightom, A. E. Blechl 及びO. Smith
ies (1980). Cell, 21, 627-638 ；S. Scherer及びR.
W. Davis (1980). Science, 209, 1380-1384 ；J. A. J
ackson 及びG. R. Fink (1981). Nature, 292, 306-311
］に関与していた。従ってこのメカニズムは、体細胞
での別の必然的プロセスの維持に重要であろうが適当な
選択が作用したときにのみ明らかになる。本発明に係る
研究に於いては、増幅aprt遺伝子の補正メカニズムがい
かなるものであっても、分析された形質転換体が反復遺
伝的エレメント間で配列均質性を維持すべく設計された
精巧なメカニズムを有することは明らかである。
生プロセス［J. E. Haber, D. T.Rogers及びJ. H. Mc C
usker (1980), Cell, 22, 277-289 ；A. J. Klar, J. M
cIndoo, J. W. Strathern及びJ. B. Hicks (1980). Cel
l, 22, 291-298 ］、及び、反復遺伝子間の配列の一致
の維持［J. L. Sleightom, A. E. Blechl 及びO. Smith
ies (1980). Cell, 21, 627-638 ；S. Scherer及びR.
W. Davis (1980). Science, 209, 1380-1384 ；J. A. J
ackson 及びG. R. Fink (1981). Nature, 292, 306-311
］に関与していた。従ってこのメカニズムは、体細胞
での別の必然的プロセスの維持に重要であろうが適当な
選択が作用したときにのみ明らかになる。本発明に係る
研究に於いては、増幅aprt遺伝子の補正メカニズムがい
かなるものであっても、分析された形質転換体が反復遺
伝的エレメント間で配列均質性を維持すべく設計された
精巧なメカニズムを有することは明らかである。
【００８２】実験手順 セルカルチャー（細胞培養） ネズミのＬtk- aprt- 細胞を、１０％の仔牛血清（M.
A. Bioproducts ）と５０μｇ／mlのジアミノプリン
（ＤＡＰ）とを加えたダルベッコ変性イーグル培地（Ｄ
ＭＥ）に維持した。ＤＭＥ、１０％仔牛血清、４μｇ／
mlのアザセリン、１５μｇ／mlのアデニン（ＤＭＥ＋Ａ
ｚＡｄ）［M. Wigler, R. Sweet, G. K. Sim, B. Wold,
A. Pellicer, E. Lacy, T. Maniatis, S. Silverstein
及び R. Axel, (1979). Cell, 16, 777-785 ］中でaprt
+ tk- 形質転換体を選択した。aprt+tk- 形質転換体を
ＤＭＥ＋ＡｚＡｄに３０μｇ／mlのＢＵｄＲを加えた培
地に維持した。ＤＭＥ，１０％仔牛血清、１５μｇ／ml
のヒポキサンチン、１μｇ／mlのアミノプテリン、５μ
ｇ／mlのチミジン（ＤＭＥ＋ＨＡＴ）［M. Wigler, S.S
ilverstein, S. L. Lee, A. Pellicer, Y. Cheng 及び
R. Axel (1977). Cell,11, 223-232 ］の中でaprt+ tk
+ 突然変異体を選択した。aprt+ tk+ セルラインを引続
き、ＤＭＥ、１０％仔牛血清、１５μｇ／mlのアデニ
ン、１μｇ／mlのアミノプテリン、５μｇ／mlのチミジ
ン（ＤＭＥ＋ＡＡＴ）中に維持した。aprt-tk+ 突然変
異体を選択し、ＤＭＥ＋ＨＡＴに１００μｇ／mlのジア
ミノプリンを加えた培地（ＤＭＥ＋ＨＡＴ＋ＤＡＰ）中
に維持した。
A. Bioproducts ）と５０μｇ／mlのジアミノプリン
（ＤＡＰ）とを加えたダルベッコ変性イーグル培地（Ｄ
ＭＥ）に維持した。ＤＭＥ、１０％仔牛血清、４μｇ／
mlのアザセリン、１５μｇ／mlのアデニン（ＤＭＥ＋Ａ
ｚＡｄ）［M. Wigler, R. Sweet, G. K. Sim, B. Wold,
A. Pellicer, E. Lacy, T. Maniatis, S. Silverstein
及び R. Axel, (1979). Cell, 16, 777-785 ］中でaprt
+ tk- 形質転換体を選択した。aprt+tk- 形質転換体を
ＤＭＥ＋ＡｚＡｄに３０μｇ／mlのＢＵｄＲを加えた培
地に維持した。ＤＭＥ，１０％仔牛血清、１５μｇ／ml
のヒポキサンチン、１μｇ／mlのアミノプテリン、５μ
ｇ／mlのチミジン（ＤＭＥ＋ＨＡＴ）［M. Wigler, S.S
ilverstein, S. L. Lee, A. Pellicer, Y. Cheng 及び
R. Axel (1977). Cell,11, 223-232 ］の中でaprt+ tk
+ 突然変異体を選択した。aprt+ tk+ セルラインを引続
き、ＤＭＥ、１０％仔牛血清、１５μｇ／mlのアデニ
ン、１μｇ／mlのアミノプテリン、５μｇ／mlのチミジ
ン（ＤＭＥ＋ＡＡＴ）中に維持した。aprt-tk+ 突然変
異体を選択し、ＤＭＥ＋ＨＡＴに１００μｇ／mlのジア
ミノプリンを加えた培地（ＤＭＥ＋ＨＡＴ＋ＤＡＰ）中
に維持した。
【００８３】Ｌtk- aprt- 細胞の形質転換 Ｌtk- aprt- 細胞を、先行文献［F. L. Graham及び A.
J. van der Ed (1973). Virology, 52, 456-467 ；M. W
igler, S. Silverstein, S. L. Lee, A. Pellicer, Y.
Cheng 及びR. Axel (1977). Cell, 11, 223-232 ］に記
載のように、（ＳａｌＩで直線化した）２０ngのaprt−
tk構築体たるプラスミドｐｄＬＡＴ−３で形質転換し
た。いくつかのセルラインを、ｐＢＲ３２２誘導体、ｐ
ＡＴ−１５３にヒトＤＮＡを挿入して構築された異なる
２０種のヒトＤＮＡランダムクローンのみから成る１μ
ｇの担体ＤＮＡを用いて同時形質転換した。
J. van der Ed (1973). Virology, 52, 456-467 ；M. W
igler, S. Silverstein, S. L. Lee, A. Pellicer, Y.
Cheng 及びR. Axel (1977). Cell, 11, 223-232 ］に記
載のように、（ＳａｌＩで直線化した）２０ngのaprt−
tk構築体たるプラスミドｐｄＬＡＴ−３で形質転換し
た。いくつかのセルラインを、ｐＢＲ３２２誘導体、ｐ
ＡＴ−１５３にヒトＤＮＡを挿入して構築された異なる
２０種のヒトＤＮＡランダムクローンのみから成る１μ
ｇの担体ＤＮＡを用いて同時形質転換した。
【００８４】tk+ aprt+ 突然変異体サブクローンの選択 aprt+ tk- 形質転換体をＤＭＥ＋ＡｚＡｄ＋ＢＵｄＲ中
で増殖（膨脹）させた。次に中性培地中（ＤＭＥ＋アデ
ニン）で細胞を３世代成長させ、ＤＭＥ＋ＡＡＴ中でプ
レート当り細胞５×１０5 個に分割した。公式：
で増殖（膨脹）させた。次に中性培地中（ＤＭＥ＋アデ
ニン）で細胞を３世代成長させ、ＤＭＥ＋ＡＡＴ中でプ
レート当り細胞５×１０5 個に分割した。公式：
【００８５】
【数１】
【００８６】を用いて突然変異率を算出した。但し、式
中のＭは単離された突然変異体コロニーの数、Ｎは選択
に用いられた細胞数、Ｇは中性培地中での世代成長数を
示す。
中のＭは単離された突然変異体コロニーの数、Ｎは選択
に用いられた細胞数、Ｇは中性培地中での世代成長数を
示す。
【００８７】aprt- tk+ 突然変異体の選択 aprt+ tk+ 表現型の選択によってaprt+ tk- クローンを
増幅した。このようなクローンを捕集し選択性培地（Ｄ
ＭＥ＋ＡＡＴ）上で約２０世代に亘り増殖した。次に細
胞をプレート当り５×１０5 個で再度プレートし、中性
培地（ＤＭＥ＋ヒポキサンチン＋アデニン＋チミジン）
中で３日間成長させ、次にaprt- tk+ 表現型の選択に用
いた（ＤＭＥ＋ＨＡＴ＋ＤＡＰ）。前記同様に突然変異
率を算出した。
増幅した。このようなクローンを捕集し選択性培地（Ｄ
ＭＥ＋ＡＡＴ）上で約２０世代に亘り増殖した。次に細
胞をプレート当り５×１０5 個で再度プレートし、中性
培地（ＤＭＥ＋ヒポキサンチン＋アデニン＋チミジン）
中で３日間成長させ、次にaprt- tk+ 表現型の選択に用
いた（ＤＭＥ＋ＨＡＴ＋ＤＡＰ）。前記同様に突然変異
率を算出した。
【００８８】ブロットハイブリダイゼーション 細胞ＤＮＡを２ｕヌクレアーゼ／μｇＤＮＡで２時間消
化した。サンプルを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，４ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．９中で０．８％
の平板アガロースゲルの電気泳動にかけた（スロット当
り１０μｇＤＮＡ）。ＤＮＡ断片をニトロセルロースペ
ーパーに移し［E. M. Southern (1973).J. Mol. Biol.
98, 503-517］、フィルタを先行文献に準じてハイブリ
ダイズし、洗浄し、Ｘ線フィルムに感光させた［R. Wei
nstock, R. Sweet, M. Weiss, H.Cedar及び R. Axel (1
979). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 1299-1303 ；
M.Wigler, R. Sweet, G. K. Sim. B. Wold, A. Pellice
r, E. Lacy, T. Maniatis, S. Silverstein及びR. Axel
(1979). Cell, 16, 777-785 ］。tk遺伝子のＤＮＡプ
ローブは［A. Pellicer, D. Robins, B. Wold, R. Swee
t, J. Jackson, I.Lowy, J. M. Roberts, G. K. Sim,
S. Silverstein及び R. Axel (1980). Science, 209,
1414-1422 ］、３．６kbのＢamＨＩ断片は１．９kbのＨ
inｆ断片を含んでおり、aprt遺伝子のＤＮＡプローブは
［I. Lowy, A. Pellicer, J. Jackson, G. K. Sim. S.
Silverstein 及び R. Axel (1980) Cell, 22, 817-823
］２．０kbのＨinｃII断片を含んでいる。プローブを
α−32Ｐデオキシヌクレオチドトリホスフェートで０．
５−１×１０9 cpm/μg の特異活性にニックトランスレ
ーションした［R. Weinstock, R. Sweet, M. Weiss, H.
Cedar及び R. Axel (1979). Proc, Nat, Acad, Sci. U
SA, 75, 1299-1303 ］。
化した。サンプルを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，４ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．９中で０．８％
の平板アガロースゲルの電気泳動にかけた（スロット当
り１０μｇＤＮＡ）。ＤＮＡ断片をニトロセルロースペ
ーパーに移し［E. M. Southern (1973).J. Mol. Biol.
98, 503-517］、フィルタを先行文献に準じてハイブリ
ダイズし、洗浄し、Ｘ線フィルムに感光させた［R. Wei
nstock, R. Sweet, M. Weiss, H.Cedar及び R. Axel (1
979). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 1299-1303 ；
M.Wigler, R. Sweet, G. K. Sim. B. Wold, A. Pellice
r, E. Lacy, T. Maniatis, S. Silverstein及びR. Axel
(1979). Cell, 16, 777-785 ］。tk遺伝子のＤＮＡプ
ローブは［A. Pellicer, D. Robins, B. Wold, R. Swee
t, J. Jackson, I.Lowy, J. M. Roberts, G. K. Sim,
S. Silverstein及び R. Axel (1980). Science, 209,
1414-1422 ］、３．６kbのＢamＨＩ断片は１．９kbのＨ
inｆ断片を含んでおり、aprt遺伝子のＤＮＡプローブは
［I. Lowy, A. Pellicer, J. Jackson, G. K. Sim. S.
Silverstein 及び R. Axel (1980) Cell, 22, 817-823
］２．０kbのＨinｃII断片を含んでいる。プローブを
α−32Ｐデオキシヌクレオチドトリホスフェートで０．
５−１×１０9 cpm/μg の特異活性にニックトランスレ
ーションした［R. Weinstock, R. Sweet, M. Weiss, H.
Cedar及び R. Axel (1979). Proc, Nat, Acad, Sci. U
SA, 75, 1299-1303 ］。
【００８９】グアニンジチオシアネートと高温フェノー
ル抽出とを用いる手順で全細胞ＲＮＡを調製した。６０
mlの組織培養皿当り０．５−１．０mlの４Ｍグアニジン
チオシアネートを添加した。細胞をダウンス（dounce）
に滴下し６０℃に加熱した。細胞を次に均質になるまで
ダウンスした。１０mlの高温フェノールを溶解物に添加
し６０℃で５分間混合した。１０mlのクロロホルムを添
加し１０mlの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５を添加し
た。６０℃で１０乃至１５分間振盪し、５分間氷冷し
て、遠心（spin）した。水相を除去し、フェノール及び
クロロホルムで抽出を繰返した。次に６０℃で振盪し、
冷却し、遠心して抽出をもう一度繰返した。上清をエタ
ノール沈殿させた。
ル抽出とを用いる手順で全細胞ＲＮＡを調製した。６０
mlの組織培養皿当り０．５−１．０mlの４Ｍグアニジン
チオシアネートを添加した。細胞をダウンス（dounce）
に滴下し６０℃に加熱した。細胞を次に均質になるまで
ダウンスした。１０mlの高温フェノールを溶解物に添加
し６０℃で５分間混合した。１０mlのクロロホルムを添
加し１０mlの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５を添加し
た。６０℃で１０乃至１５分間振盪し、５分間氷冷し
て、遠心（spin）した。水相を除去し、フェノール及び
クロロホルムで抽出を繰返した。次に６０℃で振盪し、
冷却し、遠心して抽出をもう一度繰返した。上清をエタ
ノール沈殿させた。
【００９０】H. Aviv 及びP. Leder (1979), Proc. Na
t. Acad. Sci. USA, 69, 1408-1412に記載の如くポリＡ
選択を実施した。アガロース−ホルムアルデヒドゲル
［H. Lehrach, D. Diamond, J. M. Wozney及びH. Boedt
ker (1977). Biochemistry, 16, 4743-4751 ］を使用
し、 D. Goldberg (1980), Proc. Nat. Acad. Sci. US
A,77, 5794-5798 ］に記載の条件下でニトロセルロース
上のＲＮＡブロッティングを実施した。
t. Acad. Sci. USA, 69, 1408-1412に記載の如くポリＡ
選択を実施した。アガロース−ホルムアルデヒドゲル
［H. Lehrach, D. Diamond, J. M. Wozney及びH. Boedt
ker (1977). Biochemistry, 16, 4743-4751 ］を使用
し、 D. Goldberg (1980), Proc. Nat. Acad. Sci. US
A,77, 5794-5798 ］に記載の条件下でニトロセルロース
上のＲＮＡブロッティングを実施した。
【００９１】コンピュータシミュレーション ｎ個の野生型対立遺伝子の系列中の単一突然変異体対立
遺伝子が姉妹染色分体交換によりｍ世代後に完全系列を
含み得る確率を決定するためにコンピュータプログラム
を設計した。変数は、反復系列中の遺伝子コピーの初期
数と、系列中での突然変異対立遺伝子の初期位置と、不
等乗換現象の結果たる系列の最小許容サイズと姉妹染色
分体対合中の誤対合（misregister ）の最大の割合とで
ある。
遺伝子が姉妹染色分体交換によりｍ世代後に完全系列を
含み得る確率を決定するためにコンピュータプログラム
を設計した。変数は、反復系列中の遺伝子コピーの初期
数と、系列中での突然変異対立遺伝子の初期位置と、不
等乗換現象の結果たる系列の最小許容サイズと姉妹染色
分体対合中の誤対合（misregister ）の最大の割合とで
ある。
【図１】図１は、Tk及びAprt遺伝子配列を含む組換型プ
ラスミドｐｄＬＡＴ−３の制限マップを示す。より特定
的には、プラスミドpdLAT-3 はベクターｐＢＲ３２２の
ＢamＨＩ部位に挿入された単純ヘルペスウイルスゲノム
の２．８kb ＢｇｌII／ＢamＨＩ断片を含んでいる。こ
の断片は、１．６kbの３′フランキングＤＮＡ（斜線部
分）の他、チミジンキナーゼ遺伝子の完全コード配列
（黒塗り部分）を含んでいるが、プロモータと５′フラ
ンキングＤＮＡ配列を欠いている。イニシエータＡＵＧ
はＢｇｌII部位に対し５０ヌクレオチド３′側に配置さ
れている。更に同位相（in-phase）のＡＵＧコドンも示
されている。このプラスミドは約７００bpの５′フラン
キングＤＮＡの他ハムスターaprt遺伝子全体を含むハム
スターＤＮＡの４．３kb ＨinｄIII ／ＢｇｌII断片
（白抜き部分）をも含んでいる。ファージゲノムの位置
36489 から38935 までに由来するバクテリオファージλ
ＤＮＡ（λ）の２．４kb ＢｇｌIIインサートはハムス
ターＤＮＡ配列とヘルペスウイルスＤＮＡ配列とを分断
している。tk遺伝子とaprt遺伝子とは逆の極性（方向
性，polarity）をもつように挿入されている。
ラスミドｐｄＬＡＴ−３の制限マップを示す。より特定
的には、プラスミドpdLAT-3 はベクターｐＢＲ３２２の
ＢamＨＩ部位に挿入された単純ヘルペスウイルスゲノム
の２．８kb ＢｇｌII／ＢamＨＩ断片を含んでいる。こ
の断片は、１．６kbの３′フランキングＤＮＡ（斜線部
分）の他、チミジンキナーゼ遺伝子の完全コード配列
（黒塗り部分）を含んでいるが、プロモータと５′フラ
ンキングＤＮＡ配列を欠いている。イニシエータＡＵＧ
はＢｇｌII部位に対し５０ヌクレオチド３′側に配置さ
れている。更に同位相（in-phase）のＡＵＧコドンも示
されている。このプラスミドは約７００bpの５′フラン
キングＤＮＡの他ハムスターaprt遺伝子全体を含むハム
スターＤＮＡの４．３kb ＨinｄIII ／ＢｇｌII断片
（白抜き部分）をも含んでいる。ファージゲノムの位置
36489 から38935 までに由来するバクテリオファージλ
ＤＮＡ（λ）の２．４kb ＢｇｌIIインサートはハムス
ターＤＮＡ配列とヘルペスウイルスＤＮＡ配列とを分断
している。tk遺伝子とaprt遺伝子とは逆の極性（方向
性，polarity）をもつように挿入されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リチヤード・アクセル アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10025、 ニユー・ヨーク、リヴアーサイド・ドライ ヴ・410 (72)発明者 ジエイムズ・マイケル・ロバーツ アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10032、 ニユー・ヨーク、ヘヴン・アヴエニユー・ 134
Claims (44)
- 【請求項１】 （ａ）所望のタンパク性産物の産生をコ
ードする機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩと初
期プロモータが除去された選択可能又は識別可能な機能
欠除増幅可能チミジンキナーゼ又はアデニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡIIとを
用い、ＤＮＡＩ上の遺伝子によりコードされる所望産物
を産生せしめるがＤＮＡII上の遺伝子によりコードされ
る選択可能又は識別可能な形質を発現せしめない条件下
で、適当な真核細胞を同時形質転換し、但し前記機能性
増幅可能遺伝子と前記機能欠除増幅可能遺伝子は互いに
異なるものであり、（ｂ）所望タンパク性産物を産生す
る同時形質転換真核細胞を回収し、（ｃ）ＤＮＡII上の
遺伝子によりコードされる選択可能又は識別可能な形質
を発現する細胞の選択又は識別を可能にする条件下で、
回収された同時形質転換細胞をクローニングし、（ｄ）
得られたクローン化細胞を回収することによって得られ
ることを特徴とする外来ＤＮＡＩのマルチプルコピーが
導入された真核細胞。 - 【請求項２】 真核細胞が哺乳動物細胞であることを特
徴とする請求項１に記載の真核細胞。 - 【請求項３】 （ａ）所望のタンパク性産物の産生をコ
ードする機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩと初
期プロモータが除去された選択可能又は識別可能な機能
欠除増幅可能チミジンキナーゼ又はアデニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡIIとを
用い、ＤＮＡＩ上の遺伝子によりコードされる所望産物
を産生せしめるがＤＮＡII上の遺伝子によりコードされ
る選択可能又は識別可能な形質を発現せしめない条件下
で、適当な真核細胞を同時形質転換し、但し前記機能性
増幅可能遺伝子と前記機能欠除増幅可能遺伝子は互いに
異なるものであり、（ｂ）所望タンパク性産物を産生す
る同時形質転換真核細胞を回収し、（ｃ）ＤＮＡII上の
遺伝子によりコードされる選択可能又は識別可能な形質
を発現する細胞の選択又は識別を可能にする条件下で、
回収された同時形質転換細胞をクローニングし、（ｄ）
得られたクローン化細胞を回収し、これにより、ＤＮＡ
Ｉのマルチプルコピーを含む真核細胞を得、（ｅ）ＤＮ
ＡＩをメッセンジャーＲＮＡに転写すべく適当な条件下
に細胞を維持するステップを含む外来ＤＮＡＩに相補的
なメッセンジャーＲＮＡ転写体の産生方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法を用いて転写体を
産生し、該産生された転写体を回収するステップを含む
メッセンジャーＲＮＡ転写体の取得方法。 - 【請求項５】 請求項３に記載の方法を用いて外来ＤＮ
ＡＩに相補的なメッセンジャーＲＮＡ転写体を真核細胞
中で産生し、転写体をタンパク性産物に翻訳するための
適当な条件下に細胞を維持するステップを含むことを特
徴とするタンパク性産物の産生方法。 - 【請求項６】 請求項５に記載の方法を用いてタンパク
性産物を産生し、該産生された産物を回収するステップ
を含むタンパク性産物の取得方法。 - 【請求項７】 真核細胞内に外来ＤＮＡＩのマルチプル
コピーを生じさせるための方法であって、 （ａ）所望のタンパク性産物の産生をコードする機能性
増幅可能遺伝子を含む前記外来ＤＮＡＩと、初期プロモ
ータが除去された第１の選択可能又は識別可能な機能欠
除増幅可能チミジンキナーゼ又はアデニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含む外来ＤＮＡII及び優
性の第２の選択可能又は識別可能な表現型形質をコード
する機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡIII の双方
を含むデオキシリボ核酸分子とを用い、前記優性の第２
の表現型形質を発現するがＤＮＡII上の遺伝子によりコ
ードされた前記第１の選択可能又は識別可能な形質を発
現しない同時形質転換細胞の選択又は識別を可能にする
ための条件下で、適当な真核細胞を同時形質転換し、但
し前記機能性遺伝子と前記機能欠除遺伝子は互いに異な
るものであり、 （ｂ）前記優性の第２表現型形質を発現する同時形質転
換真核細胞を回収し、 （ｃ）ＤＮＡII上の遺伝子によりコードされる前記第１
の選択可能又は識別可能な形質を発現する細胞の選択又
は識別を可能にさせる条件下で、回収された同時形質転
換細胞をクローニングし、 （ｄ）得られたクローン化細胞を回収し、これによりＤ
ＮＡＩのマルチプルコピーを含む真核細胞を得る、こと
を包含する方法。 - 【請求項８】 適当な真核細胞が、ＤＮＡIIに保有され
た機能欠除増幅可能遺伝子によりコードされた第１の選
択可能又は識別可能形質を発現しないことを特徴とする
請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 適当な真核細胞が、ＤＮＡIII に保有さ
れた機能性増幅可能遺伝子によりコードされた第２の選
択可能又は識別可能遺伝子を発現しないことを特徴とす
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 適当な真核細胞が、第１又は第２の形
質を発現しないことを特徴とする請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１１】 ＤＮＡＩとＤＮＡIIとＤＮＡIII と
が、同じデオキシリボ核酸分子に保有されていることを
特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡＩが、ＤＮＡIIとＤＮＡIII と
を保有する分子とは別の非結合デオキシリボ核酸分子に
保有されていることを特徴とする請求項７に記載の方
法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡＩの遺伝子が、ヒト又は動物の
成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン、凝血
因子、インフルエンザウイルス抗原、肝炎ウイルス抗
原、ヒト血清アルブミン又は抗体の産生をコードしてい
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１４】 ＤＮＡIIに保有された機能欠除増幅可
能遺伝子が、チミジンキナーゼ又はアデニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼの産生をコードする遺伝子から
誘導されることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＤＮＡIIに保有された機能欠除増幅可
能遺伝子が、初期プロモータが除去された単純ヘルペス
ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子であることを特
徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１６】 ＤＮＡIII に保有された遺伝子が、チ
ミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ、ジヒドロホレートレダクターゼの産生又はネオ
マイシン耐性をコードする遺伝子に由来することを特徴
とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項１７】 ＤＮＡＩとＤＮＡIIとＤＮＡIII とが
無担体のクローン化遺伝子であることを特徴とする請求
項７に記載の方法。 - 【請求項１８】 ＤＮＡＩとＤＮＡIIとＤＮＡIII とが
無担体のクローン化遺伝子であることを特徴とする請求
項１１に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＤＮＡIIとＤＮＡIII と細菌性プラス
ミド又はファージＤＮＡとが同じＤＮＡ分子に保有され
ていることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項２０】 細胞の同時形質転換に使用する前に前
記外来ＤＮＡＩをリン酸カルシウムで処理することを特
徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項２１】 細胞の同時形質転換に使用する前にＤ
ＮＡIIとＤＮＡIIIとをリン酸カルシウムで処理するこ
とを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項２２】 適当な真核細胞が哺乳動物細胞である
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項２３】 ＤＮＡＩが、同時形質転換細胞の染色
体ＤＮＡに組み込まれていることを特徴とする請求項７
に記載の方法。 - 【請求項２４】 ＤＮＡIIとＤＮＡIII とが、細胞の染
色体ＤＮＡに組み込まれていることを特徴とする請求項
７に記載の方法。 - 【請求項２５】 請求項７に記載の方法を使用してＤＮ
ＡＩが導入された真核細胞。 - 【請求項２６】 真核細胞が哺乳動物細胞であることを
特徴とする請求項２５に記載の真核細胞。 - 【請求項２７】 請求項７に記載の方法を使用して外来
ＤＮＡＩのマルチプルコピーを真核細胞に導入し、ＤＮ
ＡＩをメッセンジャーＲＮＡに転写すべく適当な条件下
に細胞を維持するステップを含む外来ＤＮＡＩに相補的
なメッセンジャーＲＮＡ転写体の産生方法。 - 【請求項２８】 請求項２７に記載の方法を用いて転写
体を産生し、該産生された転写体を回収するステップを
含むメッセンジャーＲＮＡ転写体の取得方法。 - 【請求項２９】 請求項２７に記載の方法を用いて外来
ＤＮＡＩに相補的なメッセンジャーＲＮＡ転写体を真核
細胞中で産生し、転写体をタンパク性産物に翻訳するた
めの適当な条件下に細胞を維持するステップを含むこと
を特徴とするタンパク性産物の産生方法。 - 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法を用いてタン
パク性産物を産生し、該産生された産物を回収するステ
ップを含むタンパク性産物の取得方法。 - 【請求項３１】 所望タンパク性産物の産生をコードす
る機能性増幅可能遺伝子を含む外来ＤＮＡＩと選択可能
又は識別可能な形質をコードする機能欠除増幅可能遺伝
子を含む外来ＤＮＡIIと非真核生物ソース由来のＤＮＡ
とを含むことを特徴とする、真核細胞内への外来ＤＮＡ
Ｉ導入用形質転換ベクターとして有用なデオキシリボ核
酸分子。 - 【請求項３２】 前記所望産物が、ＤＮＡII上の遺伝子
によりコードされた形質とは異なる選択可能又は識別可
能な形質の発現と関連していることを特徴とする請求項
３１に記載の分子。 - 【請求項３３】 非真核生物ＤＮＡが細菌性ＤＮＡであ
ることを特徴とする請求項３１に記載の分子。 - 【請求項３４】 非真核生物ＤＮＡがｐＢＲ３２２由来
であることを特徴とする請求項３１に記載の分子。 - 【請求項３５】 産物が、アデノシンホスホリボシルト
ランスフェラーゼであることを特徴とする請求項３２に
記載の分子。 - 【請求項３６】 産物が、ジヒドロホレートレダクター
ゼであることを特徴とする請求項３２に記載の分子。 - 【請求項３７】 産物が、チミジンキナーゼであること
を特徴とする請求項３２に記載の分子。 - 【請求項３８】 選択可能又は識別可能な形質がネオマ
イシン耐性であることを特徴とする請求項３２に記載の
分子。 - 【請求項３９】 機能欠除増幅可能遺伝子がアデノシン
ホスホリボシルトランスフェラーゼの産生をコードする
ことを特徴とする請求項３１に記載の分子。 - 【請求項４０】 機能欠除増幅可能遺伝子がジヒドロホ
レートレダクターゼの産生をコードすることを特徴とす
る請求項３１に記載の分子。 - 【請求項４１】 機能欠除増幅可能遺伝子がチミジンキ
ナーゼの産生をコードすることを特徴とする請求項３１
に記載の分子。 - 【請求項４２】 機能欠除増幅可能遺伝子がネオマイシ
ン耐性をコードすることを特徴とする請求項３１に記載
の分子。 - 【請求項４３】 環状である請求項３１に記載の分子。
- 【請求項４４】 プラスミドｐｄＬＡＴ−３である請求
項４３に記載の分子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35820682A | 1982-03-15 | 1982-03-15 | |
| US358206 | 1982-03-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50148083A Division JPS59500746A (ja) | 1982-03-15 | 1983-03-08 | クロ−ン化増幅可能遺伝子の真核細胞内導入法及びタンパク性産物の産生方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646842A true JPH0646842A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=23408701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5150890A Pending JPH0646842A (ja) | 1982-03-15 | 1993-06-22 | クローン化増幅可能遺伝子の真核細胞内導入法及びタンパク性産物の産生方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0103632B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0646842A (ja) |
| AU (1) | AU555146B2 (ja) |
| CA (1) | CA1214127A (ja) |
| DE (1) | DE3382068D1 (ja) |
| DK (1) | DK523183A (ja) |
| WO (1) | WO1983003259A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB2153363B (en) * | 1983-12-07 | 1988-05-05 | Univ Manchester | Method of preparation of cloning vector |
| IL80511A0 (en) * | 1985-11-05 | 1987-02-27 | Genetics Inst | Multiply amplifiable vectors for high level expression of exogenous dna |
| ATE72837T1 (de) * | 1985-11-05 | 1992-03-15 | Genetics Inst | Vielfach amplifizierbare vektoren fuer hohe expression exogener dns. |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| DE3624453A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung von humanem antithrombin iii (atiii), dafuer geeignete vektoren und wirtszellen, so erhaltenes, biologisch aktives atiii und dieses enthaltende arzneimittel |
| NO881560L (no) * | 1987-05-05 | 1988-11-07 | Hope City | Fremgangsmaate for detektering av begynnende resistens motterapeutiske midler i kreftpasienter. |
| US6284534B1 (en) | 1996-08-23 | 2001-09-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Yeast vector comprising a shortened promoter sequence |
| AU2012242991B2 (en) | 2011-04-11 | 2017-03-02 | Targeted Growth, Inc. | Identification and the use of KRP mutants in plants |
| CA2942826A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Evolutionary Genomics, Inc. | Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness |
| SI3062606T1 (sl) | 2013-10-29 | 2019-09-30 | Biotech Institute, Llc | Gojenje, priprava, predelava in uporaba posebnega kanabisa |
| US11530419B2 (en) | 2020-10-30 | 2022-12-20 | Fortiphyte, Inc. | Pathogen resistance in plants |
| WO2024052856A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg | Plant regulatory elements and uses thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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