JPH0634630A - シグナル発生試薬組成物 - Google Patents
シグナル発生試薬組成物Info
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- JPH0634630A JPH0634630A JP10392893A JP10392893A JPH0634630A JP H0634630 A JPH0634630 A JP H0634630A JP 10392893 A JP10392893 A JP 10392893A JP 10392893 A JP10392893 A JP 10392893A JP H0634630 A JPH0634630 A JP H0634630A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、生物学的試料のアッセイ用化学ル
ミネセンスシグナル発生試薬組成物、それを用いるアッ
セイ法及びアッセイ用キットに関し、時間経過に対する
化学ルミネセンスシグナルの変動が少ない組成物等の提
供を目的とする。 【構成】 本発明組成物は、０．００１〜０．０１重量
％の量存在する無機アジドを含む化学ルミネセンスシグ
ナル発生試薬組成物である。
ミネセンスシグナル発生試薬組成物、それを用いるアッ
セイ法及びアッセイ用キットに関し、時間経過に対する
化学ルミネセンスシグナルの変動が少ない組成物等の提
供を目的とする。 【構成】 本発明組成物は、０．００１〜０．０１重量
％の量存在する無機アジドを含む化学ルミネセンスシグ
ナル発生試薬組成物である。
Description
【０００１】本発明は、生物学的試料、例えば、体液の
アッセイに用いるためのシグナル発生試薬組成物、前記
試薬を用いる生物学的試料のアッセイ法、及び前記試薬
を含む生物学的試料のアッセイ用キットに関する。
アッセイに用いるためのシグナル発生試薬組成物、前記
試薬を用いる生物学的試料のアッセイ法、及び前記試薬
を含む生物学的試料のアッセイ用キットに関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】近年、多くの病院関係
の研究室では、ホルモンのような成分について、体液、
例えば、血液試料の分析で得た値が著しく変動すること
が観察されている。この値の変動は、特に甲状腺刺激ホ
ルモン（ＴＳＨ）についてのアッセイの際認められてい
る。甲状腺機能亢進症患者から採取した血液試料は、測
定不能なＴＳＨを有するはずであるのに、測定を２分間
というような短時間後に行うと正の結果がでる時があ
る。正常でない患者が甲状腺機能正常者として誤ってク
ラス分けされた場合は極めて深刻な問題になることがあ
る。長時間後に測定すれば、誤ったシグナルサイズは、
通常約２０分間後には認められなくなるまで徐々に消失
する。
の研究室では、ホルモンのような成分について、体液、
例えば、血液試料の分析で得た値が著しく変動すること
が観察されている。この値の変動は、特に甲状腺刺激ホ
ルモン（ＴＳＨ）についてのアッセイの際認められてい
る。甲状腺機能亢進症患者から採取した血液試料は、測
定不能なＴＳＨを有するはずであるのに、測定を２分間
というような短時間後に行うと正の結果がでる時があ
る。正常でない患者が甲状腺機能正常者として誤ってク
ラス分けされた場合は極めて深刻な問題になることがあ
る。長時間後に測定すれば、誤ったシグナルサイズは、
通常約２０分間後には認められなくなるまで徐々に消失
する。
【０００３】この課題を解決除去するためには、長時間
（例えば、２０分間）後の測定、生物学的試料の凍結及
び解凍又は遠心のような各種対策をとることができる。
しかしながら、これらの解決法は長期間の対策としては
不都合であり許容しがたい。この問題は特にＴＳＨの分
析において認められているが、他のリガンド、例えば、
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＢ型肝炎表面（Ｈ
Ｂs ）抗原に対する抗体の分析においても遭遇する問題
である。
（例えば、２０分間）後の測定、生物学的試料の凍結及
び解凍又は遠心のような各種対策をとることができる。
しかしながら、これらの解決法は長期間の対策としては
不都合であり許容しがたい。この問題は特にＴＳＨの分
析において認められているが、他のリガンド、例えば、
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＢ型肝炎表面（Ｈ
Ｂs ）抗原に対する抗体の分析においても遭遇する問題
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】われわれは、アッセイ値
の変動の問題は、０．００１〜０．０１重量％の量存在
する無機アジドを含む化学ルミネセンスシグナル発生組
成物を用いることにより低減できるとの知見を得た。本
発明はまた、個々にパッケージされた、 ａ．酵素標識化免疫反応体、及び ｂ．０．００１〜０．０１重量％の量存在する無機アジ
ドの緩衝溶液、 を含む化学ルミネセンスイムノアッセイに有用なキット
をも提供する。
の変動の問題は、０．００１〜０．０１重量％の量存在
する無機アジドを含む化学ルミネセンスシグナル発生組
成物を用いることにより低減できるとの知見を得た。本
発明はまた、個々にパッケージされた、 ａ．酵素標識化免疫反応体、及び ｂ．０．００１〜０．０１重量％の量存在する無機アジ
ドの緩衝溶液、 を含む化学ルミネセンスイムノアッセイに有用なキット
をも提供する。
【０００５】更に、本発明のリガンドのイムノアッセイ
法は、 Ａ）リガンドを、リガンドに対して特異的な第１レセプ
ターと接触させてリガンドと第１レセプターの複合体を
形成し、この第１レセプターは酵素で標識化されていな
いか又は標識化されており、第１レセプターが標識され
ていなければ、リガンドはまた、リガンドに対して特異
的な第２レセプターであって酵素標識化されているも
の、又はその酵素標識化類縁物であって第１レセプター
と反応可能であるもの、のいずれかと接触させることを
条件とし、 Ｂ）前記の接触工程Ａに先立って、同時に又はその後
に、リガンドと第１レセプターを不溶化し、 Ｃ）不溶化されたリガンドを非複合化物質から分離し、 Ｄ）前記の複合体又は分離された非複合化物質を、前記
の化学ルミネセンスシグナル発生組成物と接触させ、そ
して Ｅ）得られた化学ルミネセンスシグナルを測定する、こ
とからなる。
法は、 Ａ）リガンドを、リガンドに対して特異的な第１レセプ
ターと接触させてリガンドと第１レセプターの複合体を
形成し、この第１レセプターは酵素で標識化されていな
いか又は標識化されており、第１レセプターが標識され
ていなければ、リガンドはまた、リガンドに対して特異
的な第２レセプターであって酵素標識化されているも
の、又はその酵素標識化類縁物であって第１レセプター
と反応可能であるもの、のいずれかと接触させることを
条件とし、 Ｂ）前記の接触工程Ａに先立って、同時に又はその後
に、リガンドと第１レセプターを不溶化し、 Ｃ）不溶化されたリガンドを非複合化物質から分離し、 Ｄ）前記の複合体又は分離された非複合化物質を、前記
の化学ルミネセンスシグナル発生組成物と接触させ、そ
して Ｅ）得られた化学ルミネセンスシグナルを測定する、こ
とからなる。
【０００６】
【実施態様】本発明は、酵素、例えば、ペルオキシダー
ゼの存在に対し応答する化学ルミネセンスを発生するよ
うに設計された任意の分析法において有利に実施するこ
とができる。かかるアッセイには、有機もしくは無機過
酸化物（例えば、過酸化水素）もしくはペルオキシダー
ゼ（その遊離型）の検出、又はペルオキシダーゼもしく
は過酸化水素以外の非−免疫被分析体の検出を含むこと
ができる。特に、本発明は、化学ルミネセンスシグナル
を発生する特異的結合アッセイの実施に有用である。
ゼの存在に対し応答する化学ルミネセンスを発生するよ
うに設計された任意の分析法において有利に実施するこ
とができる。かかるアッセイには、有機もしくは無機過
酸化物（例えば、過酸化水素）もしくはペルオキシダー
ゼ（その遊離型）の検出、又はペルオキシダーゼもしく
は過酸化水素以外の非−免疫被分析体の検出を含むこと
ができる。特に、本発明は、化学ルミネセンスシグナル
を発生する特異的結合アッセイの実施に有用である。
【０００７】過酸化水素（又は他の過酸化物）は、本発
明によって測定することができる。加えて、本発明は、
過酸化水素を生成することができる被分析体を測定する
のに用いることができ、ここで過酸化水素は、適切なシ
グナル発生試薬とペルオキシダーゼの存在下で過酸化水
素を生成する反応の１つ又はそれ以上における被分析体
関与物である。
明によって測定することができる。加えて、本発明は、
過酸化水素を生成することができる被分析体を測定する
のに用いることができ、ここで過酸化水素は、適切なシ
グナル発生試薬とペルオキシダーゼの存在下で過酸化水
素を生成する反応の１つ又はそれ以上における被分析体
関与物である。
【０００８】好ましい実施態様において、本発明は、特
異的結合リガンド、又はその対応レセプター（すなわ
ち、そのリガンドと特異的に結合する物質）の測定に有
用である。かかるリガンドとしては、抗体及び他のプロ
テイン（リポプロテイン、血液プロテイン、酵素及びグ
リコプロテイン）、ハプテン、薬剤、ホルモン、ステロ
イド、毒素、ウィルス、バクテリア、ビタミン、サッカ
ライド（ポリサッカライドを含む）、脂質、核酸、非タ
ンパク性血液成分、又は当業者に容易に理解されるそれ
らの成分が挙げられる。
異的結合リガンド、又はその対応レセプター（すなわ
ち、そのリガンドと特異的に結合する物質）の測定に有
用である。かかるリガンドとしては、抗体及び他のプロ
テイン（リポプロテイン、血液プロテイン、酵素及びグ
リコプロテイン）、ハプテン、薬剤、ホルモン、ステロ
イド、毒素、ウィルス、バクテリア、ビタミン、サッカ
ライド（ポリサッカライドを含む）、脂質、核酸、非タ
ンパク性血液成分、又は当業者に容易に理解されるそれ
らの成分が挙げられる。
【０００９】化学ルミネセンスシグナル発生組成物とし
ては、従来の過酸塩のような化学ルミネセンス物質が挙
げられる。好ましい物質としては２，３−ジヒドロ−
１，４−フタルアジンジオン誘導体（本明細書中では
“ＤＰＤ”と略記する）が挙げられる。遊離の又は複合
化２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンジオン誘導
体であって、化学ルミネセンス反応において励起状態に
転化でき、次に発光により非励起状態に戻るものが本発
明において有用である。米国特許第４，５９８，０４４
号明細書及びChemiluminescence in Organic Chemistr
y, Gundermann and McCapra, Spring-Verlag, Berlin,
1987 年204 〜207 頁をはじめとして、相当数のかかる
化合物が当該技術分野において知られている。かかる化
合物は一般に、“ルミノールタイプヒドラジド”として
知られ、これらとしてはフタルヒドラジド、ナフタレン
−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−
２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−
１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、フルオレン−１，２
−ジカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ）ペリ
レン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、コロネン−
１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、及び当業者に容易に
理解される他のものが挙げられる。
ては、従来の過酸塩のような化学ルミネセンス物質が挙
げられる。好ましい物質としては２，３−ジヒドロ−
１，４−フタルアジンジオン誘導体（本明細書中では
“ＤＰＤ”と略記する）が挙げられる。遊離の又は複合
化２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンジオン誘導
体であって、化学ルミネセンス反応において励起状態に
転化でき、次に発光により非励起状態に戻るものが本発
明において有用である。米国特許第４，５９８，０４４
号明細書及びChemiluminescence in Organic Chemistr
y, Gundermann and McCapra, Spring-Verlag, Berlin,
1987 年204 〜207 頁をはじめとして、相当数のかかる
化合物が当該技術分野において知られている。かかる化
合物は一般に、“ルミノールタイプヒドラジド”として
知られ、これらとしてはフタルヒドラジド、ナフタレン
−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、アントラセン−
２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−
１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、フルオレン−１，２
−ジカルボン酸ヒドラジド、ベンゾ〔ｇ，ｈ，ｉ）ペリ
レン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、コロネン−
１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、及び当業者に容易に
理解される他のものが挙げられる。
【００１０】本発明組成物の第２試薬は、この用語が当
該技術分野において理解されているように化学ルミネセ
ンスエンハンサーである。公知のエンハンサーとして
は、米国特許第４，５９８，０４４号明細書に記載され
ているようなフェノール性化合物が挙げられ、ｐ−ヨー
ドフェノールは好ましいフェノール性化学ルミネセンス
エンハンサーの１つである。他の有用なエンハンサーは
４′−ヒドロキシアセトアニリドである。
該技術分野において理解されているように化学ルミネセ
ンスエンハンサーである。公知のエンハンサーとして
は、米国特許第４，５９８，０４４号明細書に記載され
ているようなフェノール性化合物が挙げられ、ｐ−ヨー
ドフェノールは好ましいフェノール性化学ルミネセンス
エンハンサーの１つである。他の有用なエンハンサーは
４′−ヒドロキシアセトアニリドである。
【００１１】他の有用なフェノール性化学ルミネセンス
エンハンサーは４′−ヒドロキシ及び４′−アルコキシ
置換化合物であり、これらは以下の構造式（Ｉ）のいず
れかを有する：
エンハンサーは４′−ヒドロキシ及び４′−アルコキシ
置換化合物であり、これらは以下の構造式（Ｉ）のいず
れかを有する：
【００１２】
【化１】
【００１３】前記式中、Ｒ1 は水素又は炭素原子数１〜
４個のアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピ
ル、ヒドロキシメチル、アミノメチル及びメトキシメチ
ル）であり、好ましくは、Ｒ1 は水素である。構造
（Ｉ），（II），（III)及び（IV）において、Ｒ2 は水
素、炭素原子数１〜４個のアルキル（例えば、メチル、
エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル及びイソブチル）、
炭素原子数１〜４個のアルコキシアルキル（例えば、メ
トキシメチル及びメトキシエチル）、炭素原子数１〜４
個のヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシメチル、
１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル及び２，
３−ジヒドロキシプロピル）、炭素原子数１〜４個のア
ミノアルキル（例えば、アミノメチル、２−アミノエチ
ル、３−アミノプロピル、２，４−ジアミノブチル、メ
チルアミノメチル、２，２−ジメチルアミノエチル及び
４−アミノブチル）、炭素原子数１〜４個のハロアルキ
ル（例えば、クロロメチル、ブロモメチル、２−クロロ
エチル、１，１−ジクロロメチル、１，１，１−トリク
ロロメチル、２，２，２−トリクロロエチル及び３−ク
ロロプロピル）又は炭素原子数２〜５個のアルケニル
（例えば、エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル
及び２−ブテニル）である。好ましくは、Ｒ2 は水素、
メチル又はエテニルである。
４個のアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピ
ル、ヒドロキシメチル、アミノメチル及びメトキシメチ
ル）であり、好ましくは、Ｒ1 は水素である。構造
（Ｉ），（II），（III)及び（IV）において、Ｒ2 は水
素、炭素原子数１〜４個のアルキル（例えば、メチル、
エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル及びイソブチル）、
炭素原子数１〜４個のアルコキシアルキル（例えば、メ
トキシメチル及びメトキシエチル）、炭素原子数１〜４
個のヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシメチル、
１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル及び２，
３−ジヒドロキシプロピル）、炭素原子数１〜４個のア
ミノアルキル（例えば、アミノメチル、２−アミノエチ
ル、３−アミノプロピル、２，４−ジアミノブチル、メ
チルアミノメチル、２，２−ジメチルアミノエチル及び
４−アミノブチル）、炭素原子数１〜４個のハロアルキ
ル（例えば、クロロメチル、ブロモメチル、２−クロロ
エチル、１，１−ジクロロメチル、１，１，１−トリク
ロロメチル、２，２，２−トリクロロエチル及び３−ク
ロロプロピル）又は炭素原子数２〜５個のアルケニル
（例えば、エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル
及び２−ブテニル）である。好ましくは、Ｒ2 は水素、
メチル又はエテニルである。
【００１４】Ｒ3 は水素又は炭素原子数１〜４個のアル
キル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブ
チル、ｎ−ブチル及びイソブチル）である。好ましく
は、Ｒ 3 は水素又はメチルである。Ｒ4 及びＲ5 は独立
して水素又はハメットシグマ値が少くとも約０．０１、
好ましくは少くとも約０．３の電子吸引基である。ハメ
ットシグマ値は、例えば、Steric Effects in Organic
Chemistry, John Wiley & Sons. Inc., 1956年、570 〜
574 頁及びProgress in Physical Organic Chemistry.
第２巻、Interscience Publishers, 1964 年、333 〜33
9 頁に記載されている標準法に従って算出する。正のハ
メットシグマ値を有する代表的電子吸引基としては、シ
アノ、カルボキシ、ニトロ、ハロ（フルオロ、ブロモ、
クロロ又はヨード）、トリハロメチル（例えば、トリフ
ルオロメチル又はトリクロロメチル）、カルボニル、カ
ルバモイル、スルホニル、スルファモイル、エステル及
び当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。好ま
しい電子吸引基はハロ（例えば、クロロ、ブロモ）及び
シアノである。クロロ及びシアノは更に好ましい電子吸
引基であり、クロロはＲ 4 及びＲ5 のいずれについても
最も好ましい。
キル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブ
チル、ｎ−ブチル及びイソブチル）である。好ましく
は、Ｒ 3 は水素又はメチルである。Ｒ4 及びＲ5 は独立
して水素又はハメットシグマ値が少くとも約０．０１、
好ましくは少くとも約０．３の電子吸引基である。ハメ
ットシグマ値は、例えば、Steric Effects in Organic
Chemistry, John Wiley & Sons. Inc., 1956年、570 〜
574 頁及びProgress in Physical Organic Chemistry.
第２巻、Interscience Publishers, 1964 年、333 〜33
9 頁に記載されている標準法に従って算出する。正のハ
メットシグマ値を有する代表的電子吸引基としては、シ
アノ、カルボキシ、ニトロ、ハロ（フルオロ、ブロモ、
クロロ又はヨード）、トリハロメチル（例えば、トリフ
ルオロメチル又はトリクロロメチル）、カルボニル、カ
ルバモイル、スルホニル、スルファモイル、エステル及
び当業者に容易に明らかな他のものが挙げられる。好ま
しい電子吸引基はハロ（例えば、クロロ、ブロモ）及び
シアノである。クロロ及びシアノは更に好ましい電子吸
引基であり、クロロはＲ 4 及びＲ5 のいずれについても
最も好ましい。
【００１５】先の構造（Ｉ）では、Ｒ4 及びＲ5 の少く
とも１つは前記の電子吸引基でなければならない。先の
構造（II），（III)及び（IV）では、Ｒ4 及びＲ5 の少
くとも１つは電子吸引基であってよいが、しかしこのこ
とが要求される訳ではない。更に別の有用な化学ルミネ
センスエンハンサーとしては、米国特許第４，７２９，
９５０号明細書に記載されている芳香族アミンが挙げら
れる。
とも１つは前記の電子吸引基でなければならない。先の
構造（II），（III)及び（IV）では、Ｒ4 及びＲ5 の少
くとも１つは電子吸引基であってよいが、しかしこのこ
とが要求される訳ではない。更に別の有用な化学ルミネ
センスエンハンサーとしては、米国特許第４，７２９，
９５０号明細書に記載されている芳香族アミンが挙げら
れる。
【００１６】本発明の化学ルミネセンスシグナル発生組
成物に場合によって含まれる成分は、ミセルを形成する
ための低分子量カチオン性界面活性剤、又は感度、保存
安定性及び動力学的安定性を高めるために疎水性環境を
提供するためのカチオン性ポリマーである。本発明の化
学ルミネセンスシグナル発生組成物は、一般に当該技術
分野において周知の１種又はそれ以上の適切な緩衝液を
用いて約５〜約１０（好ましくは、約７〜約９．５）の
pHに緩衝化される。
成物に場合によって含まれる成分は、ミセルを形成する
ための低分子量カチオン性界面活性剤、又は感度、保存
安定性及び動力学的安定性を高めるために疎水性環境を
提供するためのカチオン性ポリマーである。本発明の化
学ルミネセンスシグナル発生組成物は、一般に当該技術
分野において周知の１種又はそれ以上の適切な緩衝液を
用いて約５〜約１０（好ましくは、約７〜約９．５）の
pHに緩衝化される。
【００１７】任意の適切な無機アジドを本発明組成物に
包含させることができる。適切な無機アジドとしてはア
ルカリ金属アジド、例えば、ナトリウムアジドが挙げら
れる。適切な無機アジドはアッセイを妨害しないもので
あろう。所望pHを保持するのに必要な緩衝液の量は周知
なので、緩衝液の量は当業者に明らかであろう。基質の
量は一般に少くとも０．０１ミリモル濃度であり、０．
１〜１０ミリモル濃度の範囲の量が好ましい。化学ルミ
ネセンスエンハンサーは一般に少くとも０．０１ミリモ
ル濃度の量存在し、０．０５〜１０ミリモル濃度の範囲
の量が好ましい。無機アジドの量は一般に０．００１〜
０．０１重量％であり、０．００１〜０．００７重量％
が好ましい。０．００５重量％の量が最も好ましい。
０．０１％を有意に超える量の無機アジドを包含する
と、アッセイに用いる酵素、例えば、西洋ワサビペルオ
キシダーゼに悪影響を与えることがある。
包含させることができる。適切な無機アジドとしてはア
ルカリ金属アジド、例えば、ナトリウムアジドが挙げら
れる。適切な無機アジドはアッセイを妨害しないもので
あろう。所望pHを保持するのに必要な緩衝液の量は周知
なので、緩衝液の量は当業者に明らかであろう。基質の
量は一般に少くとも０．０１ミリモル濃度であり、０．
１〜１０ミリモル濃度の範囲の量が好ましい。化学ルミ
ネセンスエンハンサーは一般に少くとも０．０１ミリモ
ル濃度の量存在し、０．０５〜１０ミリモル濃度の範囲
の量が好ましい。無機アジドの量は一般に０．００１〜
０．０１重量％であり、０．００１〜０．００７重量％
が好ましい。０．００５重量％の量が最も好ましい。
０．０１％を有意に超える量の無機アジドを包含する
と、アッセイに用いる酵素、例えば、西洋ワサビペルオ
キシダーゼに悪影響を与えることがある。
【００１８】前記の組成物の他に、本発明はまた各種の
分析法を実施するのに有用な個々にパッケージされた試
薬、装置及び指示をも提供する。キット成分のパッケー
ジは当該技術分野においてよく知られている。一実施態
様においては、キットは、個々にパッケージされた、前
記の化学ルミネセンスシグナル発生組成物、酵素標識化
免疫反応体からなる。特に有用な標識化免疫反応体は酵
素標識化プロテイン又はオリゴヌクレオチドである。か
かるプロテインとしては、抗体及びアビジンが挙げられ
る。所定の特異的結合種について適切なレセプターはよ
く知られている。アッセイに有用な他の成分（例えば、
以下に述べるオキシダント）を試験キットに包含させる
ことができる。
分析法を実施するのに有用な個々にパッケージされた試
薬、装置及び指示をも提供する。キット成分のパッケー
ジは当該技術分野においてよく知られている。一実施態
様においては、キットは、個々にパッケージされた、前
記の化学ルミネセンスシグナル発生組成物、酵素標識化
免疫反応体からなる。特に有用な標識化免疫反応体は酵
素標識化プロテイン又はオリゴヌクレオチドである。か
かるプロテインとしては、抗体及びアビジンが挙げられ
る。所定の特異的結合種について適切なレセプターはよ
く知られている。アッセイに有用な他の成分（例えば、
以下に述べるオキシダント）を試験キットに包含させる
ことができる。
【００１９】成分及び試薬を化学ルミネセンスシグナル
発生組成物に包含することができる方法が多数ある。多
目的用組成物型として好ましいものは、２種類の固相の
更なる成分と共に無機アジドを含有する緩衝水溶液から
なり、これらの両成分は錠剤型、すなわち、錠剤Ａ及び
Ｂとして含まれ、その各々の錠剤は少くとも１種の試薬
（例えば、基質、オキシダント又はエンハンサー）を含
むものである。好ましい態様では、錠剤Ａは２種類の活
性試薬、例えば、ＤＰＤ及びエンハンサーを含有し、一
方、錠剤Ｂは過ホウ酸塩（例えば、過ホウ酸ナトリウム
塩）を含有する。使用に当っては、錠剤Ａ及びＢを緩衝
液に溶解して試薬を互いに反応させて化学ルミネセンス
シグナルを発生させる。
発生組成物に包含することができる方法が多数ある。多
目的用組成物型として好ましいものは、２種類の固相の
更なる成分と共に無機アジドを含有する緩衝水溶液から
なり、これらの両成分は錠剤型、すなわち、錠剤Ａ及び
Ｂとして含まれ、その各々の錠剤は少くとも１種の試薬
（例えば、基質、オキシダント又はエンハンサー）を含
むものである。好ましい態様では、錠剤Ａは２種類の活
性試薬、例えば、ＤＰＤ及びエンハンサーを含有し、一
方、錠剤Ｂは過ホウ酸塩（例えば、過ホウ酸ナトリウム
塩）を含有する。使用に当っては、錠剤Ａ及びＢを緩衝
液に溶解して試薬を互いに反応させて化学ルミネセンス
シグナルを発生させる。
【００２０】各種の標識、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及
び当該技術分野で知られている他のものを使用すること
ができる。ペルオキシダーゼが好ましい。本明細書にお
いて用いられるものとして、“ペルオキシダーゼ”は、
基質、例えば、ルミノールの酸化を触媒して適切なシグ
ナルを発生させる任意のペルオキシダーゼ物質（酵素性
又はそれ以外）であることを意味する。微生物性ペルオ
キシダーゼ、菌性ペルオキシダーゼ、植物性ペルオキシ
ダーゼが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最も
好ましい。酵素の有用量は当業者に明らかであろうが、
最少量は一般に少くとも１×１０-7I.U.／ml（又は非酵
素性ペルオキシダーゼ物質に対する当量）であろう。
アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及
び当該技術分野で知られている他のものを使用すること
ができる。ペルオキシダーゼが好ましい。本明細書にお
いて用いられるものとして、“ペルオキシダーゼ”は、
基質、例えば、ルミノールの酸化を触媒して適切なシグ
ナルを発生させる任意のペルオキシダーゼ物質（酵素性
又はそれ以外）であることを意味する。微生物性ペルオ
キシダーゼ、菌性ペルオキシダーゼ、植物性ペルオキシ
ダーゼが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最も
好ましい。酵素の有用量は当業者に明らかであろうが、
最少量は一般に少くとも１×１０-7I.U.／ml（又は非酵
素性ペルオキシダーゼ物質に対する当量）であろう。
【００２１】ペルオキシダーゼ及び化学ルミネセンスエ
ンハンサーの存在下で所望シグナルを発生させるのにオ
キシダントが必要である。各種の有用なオキシダントが
知られているが、しかし過ホウ酸塩イオン及び過酸化水
素が好ましく、後者が最も好ましい。各種の特異的結合
アッセイフォーマットが本発明の実施には有用であり、
核酸ハイブリッド形成アッセイ、免疫化学アッセイ（例
えば、酵素イムノアッセイ、サンドウィッチアッセイ、
競争結合アッセイ、直接結合アッセイ）及び当該技術分
野においてよく知られている他のものが挙げられる。本
発明方法は、増幅方法、例えば、ポリメラーゼ鎖反応に
より進行させることができ、目標とする核酸の量を増加
させ、この目標核酸量を次に本発明組成物を用いて検出
することができる。
ンハンサーの存在下で所望シグナルを発生させるのにオ
キシダントが必要である。各種の有用なオキシダントが
知られているが、しかし過ホウ酸塩イオン及び過酸化水
素が好ましく、後者が最も好ましい。各種の特異的結合
アッセイフォーマットが本発明の実施には有用であり、
核酸ハイブリッド形成アッセイ、免疫化学アッセイ（例
えば、酵素イムノアッセイ、サンドウィッチアッセイ、
競争結合アッセイ、直接結合アッセイ）及び当該技術分
野においてよく知られている他のものが挙げられる。本
発明方法は、増幅方法、例えば、ポリメラーゼ鎖反応に
より進行させることができ、目標とする核酸の量を増加
させ、この目標核酸量を次に本発明組成物を用いて検出
することができる。
【００２２】本発明のアッセイ法は、広範囲の物質、例
えば、抗体、ホルモン、薬剤及びプロテインのための生
物学的試料、例えば、血液及び他の生理的液体をアッセ
イするのに用いることができる。本発明は、ヨーロッパ
特許第０ ０８７ ９５９号及び第０ １１６ ４５４
号各公報に記載されているような増強化学ルミネセンス
アッセイ及び化学発光アッセイと関連づけて用いること
ができる。本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の
アッセイとの関連で特に有用である。このようなアッセ
イの１つはＡＭＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＴＳＨ−６０
アッセイである。
えば、抗体、ホルモン、薬剤及びプロテインのための生
物学的試料、例えば、血液及び他の生理的液体をアッセ
イするのに用いることができる。本発明は、ヨーロッパ
特許第０ ０８７ ９５９号及び第０ １１６ ４５４
号各公報に記載されているような増強化学ルミネセンス
アッセイ及び化学発光アッセイと関連づけて用いること
ができる。本発明は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の
アッセイとの関連で特に有用である。このようなアッセ
イの１つはＡＭＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＴＳＨ−６０
アッセイである。
【００２３】前記のアッセイにおいては、血液細胞中に
存在する西洋ワサビのペルオキシダーゼに関連するペル
オキシダーゼ酵素はウェル壁上の試料を汚染し、そのた
め偽（増加）シグナルを与えることになり、それが本発
明が克服しようとする課題を引起こすことになる。前記
アッセイは、溶液状又は乾式フォーマット状で実施する
ことができる。溶液アッセイとは一般に適切な容器中で
溶液状で行う方法を指し、不均一特異的結合アッセイの
場合は適切な分離法及び分離装置を用いて非結合物質を
結合物質から分離する。乾式アッセイでは、化学結合反
応もしくは特異的結合反応が乾式要素、試験細片もしく
は繊維状シート中で行われ、被分析体の存在は、本発明
の化学ルミネセンス組成物を添加することにより検出さ
れる。例えば、特異的結合反応は、化学ルミネセンスシ
グナルを発生するのに用いられるペルオキシダーゼ標識
化特異的結合物質を用いて行うことができる。
存在する西洋ワサビのペルオキシダーゼに関連するペル
オキシダーゼ酵素はウェル壁上の試料を汚染し、そのた
め偽（増加）シグナルを与えることになり、それが本発
明が克服しようとする課題を引起こすことになる。前記
アッセイは、溶液状又は乾式フォーマット状で実施する
ことができる。溶液アッセイとは一般に適切な容器中で
溶液状で行う方法を指し、不均一特異的結合アッセイの
場合は適切な分離法及び分離装置を用いて非結合物質を
結合物質から分離する。乾式アッセイでは、化学結合反
応もしくは特異的結合反応が乾式要素、試験細片もしく
は繊維状シート中で行われ、被分析体の存在は、本発明
の化学ルミネセンス組成物を添加することにより検出さ
れる。例えば、特異的結合反応は、化学ルミネセンスシ
グナルを発生するのに用いられるペルオキシダーゼ標識
化特異的結合物質を用いて行うことができる。
【００２４】例１ プロテインの測定 本例は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の検出のため
の本発明の実施を示すものである。ＡＦＰは特異的な胎
児α−グロブリンであり、妊娠中羊水中に存在する。Ａ
ＦＰの増加は、二分脊椎をはじめとする多くの異常の存
在を示すものである。
の本発明の実施を示すものである。ＡＦＰは特異的な胎
児α−グロブリンであり、妊娠中羊水中に存在する。Ａ
ＦＰの増加は、二分脊椎をはじめとする多くの異常の存
在を示すものである。
【００２５】この試験は、市販のＡＭＥＲＬＩＴＥ（登
録商標）ＡＦＰ−２Ｔアッセイ試験キット（Kodak Clin
ical Diagnostic Limited から入手可能）に備えられて
いる指示書に記載されたプロトコールに従って実施され
た。更に具体的には、本アッセイにおいて実施された工
程は以下のとおりである：使用装置、すなわち、振盪イ
ンキュベーター、ワークステーション、ウォッシャー及
び分析器（すべてＡＭＥＲＬＩＴＥ（登録商標）であ
る）を組合せて用意して使用した。細片ホルダーを必要
とされる標準、対照及び試料のすべての実施をするのに
十分なウェルと組合せた。
録商標）ＡＦＰ−２Ｔアッセイ試験キット（Kodak Clin
ical Diagnostic Limited から入手可能）に備えられて
いる指示書に記載されたプロトコールに従って実施され
た。更に具体的には、本アッセイにおいて実施された工
程は以下のとおりである：使用装置、すなわち、振盪イ
ンキュベーター、ワークステーション、ウォッシャー及
び分析器（すべてＡＭＥＲＬＩＴＥ（登録商標）であ
る）を組合せて用意して使用した。細片ホルダーを必要
とされる標準、対照及び試料のすべての実施をするのに
十分なウェルと組合せた。
【００２６】青色複合試薬（１５０μｌ）を、ウェルの
ふちを汚染することなく各々の被覆ウェル中に分配し
た。標準、対照及び試料（５０μｌ）をピペットで適切
なウェル中に入れた。こうすると、青色から青色／緑色
に色が変った。これらのウェルにふたを被せ次いで３７
℃で約１時間振盪しながらインキュベートした。ウォッ
シャーを用いて、すべてのウェルについて吸引洗浄し
た。充填の前後にウェルの頂部に手がふれないように注
意した。
ふちを汚染することなく各々の被覆ウェル中に分配し
た。標準、対照及び試料（５０μｌ）をピペットで適切
なウェル中に入れた。こうすると、青色から青色／緑色
に色が変った。これらのウェルにふたを被せ次いで３７
℃で約１時間振盪しながらインキュベートした。ウォッ
シャーを用いて、すべてのウェルについて吸引洗浄し
た。充填の前後にウェルの頂部に手がふれないように注
意した。
【００２７】適切な化学ルミネセンスシグナル発生組成
物（２５０μｌ）をすべての被覆ウェル中に直ちに分配
した。各ウェル中の得られた化学ルミネセンスシグナル
を分析器２を用いそして添加後２０分後読み取った。本
例では、異なる５種類の試験試料について、無機アジド
を含有する化学ルミネセンスシグナル発生組成物及び無
機アジドを含有しない化学ルミネセンスシグナル発生組
成物を用いてアッセイした。組成物添加後２分及び２０
分後に測定を行った。以下の表Ｉにこれらの結果を記載
する。
物（２５０μｌ）をすべての被覆ウェル中に直ちに分配
した。各ウェル中の得られた化学ルミネセンスシグナル
を分析器２を用いそして添加後２０分後読み取った。本
例では、異なる５種類の試験試料について、無機アジド
を含有する化学ルミネセンスシグナル発生組成物及び無
機アジドを含有しない化学ルミネセンスシグナル発生組
成物を用いてアッセイした。組成物添加後２分及び２０
分後に測定を行った。以下の表Ｉにこれらの結果を記載
する。
【００２８】これらの結果によれば、化学ルミネセンス
発生組成物中にナトリウムアジドが存在すると、このア
ジドを用いないアッセイより、２つのシグナル測定値間
の変動が少ないことがわかる。
発生組成物中にナトリウムアジドが存在すると、このア
ジドを用いないアッセイより、２つのシグナル測定値間
の変動が少ないことがわかる。
【００２９】例２ ホルモンの測定 本例では、市販のＡＭＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＴＳＨ
−６０アッセイ試験キット（Kodak Clinical Diagnosti
cs Limitedから入手可能）に備えられている指示書に記
載されたプロトコールに従って、本発明を実施して甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を測定した。
−６０アッセイ試験キット（Kodak Clinical Diagnosti
cs Limitedから入手可能）に備えられている指示書に記
載されたプロトコールに従って、本発明を実施して甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を測定した。
【００３０】ＴＳＨはヒト血清中に存在し、ＴＳＨの測
定は甲状腺疾患の鑑別診断の助けとなる。標準、対照及
び試験試料（各１００μｌ）の添加後に青色複合体試薬
（１００μｌ）を添加した以外は、例１の操作を行っ
た。結果は、以下の表Ｉに示す。これらの結果によれ
ば、本発明により得られた値は変動せず、改良が実証さ
れた。
定は甲状腺疾患の鑑別診断の助けとなる。標準、対照及
び試験試料（各１００μｌ）の添加後に青色複合体試薬
（１００μｌ）を添加した以外は、例１の操作を行っ
た。結果は、以下の表Ｉに示す。これらの結果によれ
ば、本発明により得られた値は変動せず、改良が実証さ
れた。
【００３１】例３ 抗体の測定 本例では、ヒト血清及び血漿中のＢ型肝炎表面抗原に対
する抗体を測定するために本発明を実施した。この測定
は、肝疾患の原因であるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感
染についてのマーカーとして役立つ。市販のＡＭＥＲＬ
ＩＴＥ（登録商標）抗−ＨＢs 試験キット（Kodak Clin
ical Diagnostic Limited から入手可能）に備えられて
いる指示書に従ってアッセイを行った。
する抗体を測定するために本発明を実施した。この測定
は、肝疾患の原因であるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感
染についてのマーカーとして役立つ。市販のＡＭＥＲＬ
ＩＴＥ（登録商標）抗−ＨＢs 試験キット（Kodak Clin
ical Diagnostic Limited から入手可能）に備えられて
いる指示書に従ってアッセイを行った。
【００３２】基本的には、本例は例１及び２と同様に実
施し、結果は表Ｉに示した。このアッセイでは、以下の
点で例１と異なる：標準及び試験試料は２００μｌであ
り、インキュベーションは約２時間行った。すべてのウ
ェルをSerology Wash Reagent を用いて洗浄し、続いて
複合試薬（２００μｌ）を添加した。これらのウェルを
再び被覆して更に２時間振盪しながらインキュベートし
た。
施し、結果は表Ｉに示した。このアッセイでは、以下の
点で例１と異なる：標準及び試験試料は２００μｌであ
り、インキュベーションは約２時間行った。すべてのウ
ェルをSerology Wash Reagent を用いて洗浄し、続いて
複合試薬（２００μｌ）を添加した。これらのウェルを
再び被覆して更に２時間振盪しながらインキュベートし
た。
【００３３】表に示した結果によれば、アジドが存在し
ないと、２０分後の読みは２分後の読みより実質的に低
下することがわかる。しかしながら、アジドが存在する
と、僅か２分後の読みが、アジドが存在しない場合の２
０分後の読みより低い。このことは、本発明による操作
の有効性を示すものである。
ないと、２０分後の読みは２分後の読みより実質的に低
下することがわかる。しかしながら、アジドが存在する
と、僅か２分後の読みが、アジドが存在しない場合の２
０分後の読みより低い。このことは、本発明による操作
の有効性を示すものである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【発明の効果】本発明組成物によれば、生物学的試料中
のリガンドのイムノアッセイが信頼性の高いものとな
り、既知のアッセイ及び化学ルミネセンスシグナル発生
組成物で得られることが多い信頼できない結果を回避す
ることができる。本発明によれば、時間経過に対して、
シグナルは変動する傾向が少ない。これらの利点は、従
来の化学ルミネセンスシグナル発生組成物に特定量の無
機アジドを包含せしめることにより達成される。アジド
は、通常、非特異的ペルオキシダーゼ様活性を除去する
のに組織化学において用いられる際に実証されるよう
に、ペルオキシダーゼの毒物又は阻害剤である。我々は
極めて低レベルのアジドが、酵素（例えば、ペルオキシ
ダーゼ）標識を妨害することなく、非特異的ペルオキシ
ダーゼ活性を阻害できるとの知見を得、このことは予期
せざることであった。
のリガンドのイムノアッセイが信頼性の高いものとな
り、既知のアッセイ及び化学ルミネセンスシグナル発生
組成物で得られることが多い信頼できない結果を回避す
ることができる。本発明によれば、時間経過に対して、
シグナルは変動する傾向が少ない。これらの利点は、従
来の化学ルミネセンスシグナル発生組成物に特定量の無
機アジドを包含せしめることにより達成される。アジド
は、通常、非特異的ペルオキシダーゼ様活性を除去する
のに組織化学において用いられる際に実証されるよう
に、ペルオキシダーゼの毒物又は阻害剤である。我々は
極めて低レベルのアジドが、酵素（例えば、ペルオキシ
ダーゼ）標識を妨害することなく、非特異的ペルオキシ
ダーゼ活性を阻害できるとの知見を得、このことは予期
せざることであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルコルム ロバート サマーズ イギリス国，バッキンガムシャー エイチ ピー21 ７エルエイチ，アイルズバリー, チャウサー ドライブ 63
Claims (3)
- 【請求項１】 ０．００１〜０．０１重量％の量存在す
る無機アジドを含む化学ルミネセンスシグナル発生試薬
組成物。 - 【請求項２】 個々にパッケージされた、 ａ．酵素標識化免疫反応体、及び ｂ．０．００１〜０．０１重量％の量存在する無機アジ
ドの緩衝溶液、を含む、化学ルミネセンスイムノアッセ
イに有用なキット。 - 【請求項３】 リガンドのイムノアッセイ法であって、 Ａ）リガンドを、リガンドに対して特異的な第１レセプ
ターと接触させてリガンドと第１レセプターの複合体を
形成し、この第１レセプターは酵素で標識化されていな
いか又は標識化されており、 第１レセプターが標識されていなければ、リガンドはま
た、 リガンドに対して特異的な第２レセプターであって酵素
標識化されているもの、又はその酵素標識化類縁物であ
って第１レセプターと反応可能であるもの、のいずれか
と接触させることを条件とし、 Ｂ）前記の接触工程Ａに先立って、同時に又はその後
に、リガンド及び１つ又はそれ以上のレセプターを不溶
化し、 Ｃ）不溶化されたリガンドを非複合化物質から分離し、 Ｄ）前記の複合体又は分離された非複合化物質を、０．
００１〜０．０１％の量存在する無機アジドを含む化学
ルミネセンスシグナル発生組成物と接触させ、そして Ｅ）得られた化学ルミネセンスシグナルを測定する、こ
とからなるリガンドのイムノアッセイ法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9209571:0 | 1992-05-02 | ||
| GB929209571A GB9209571D0 (en) | 1992-05-02 | 1992-05-02 | Signal generating reagent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0634630A true JPH0634630A (ja) | 1994-02-10 |
Family
ID=10714941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10392893A Pending JPH0634630A (ja) | 1992-05-02 | 1993-04-30 | シグナル発生試薬組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0569081A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0634630A (ja) |
| CA (1) | CA2093103A1 (ja) |
| GB (1) | GB9209571D0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9514594D0 (en) * | 1995-07-17 | 1995-09-13 | Johnson & Johnson Clin Diag | Chemiluminescent analytical method |
| US20040248223A1 (en) * | 2003-06-05 | 2004-12-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Reduction of interfering peroxidase activity in peroxidase based detection methods |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU558939B2 (en) * | 1982-03-03 | 1987-02-12 | British Technology Group Limited | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| EP0116454B1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-04-29 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent or luminometric assay |
-
1992
- 1992-05-02 GB GB929209571A patent/GB9209571D0/en active Pending
-
1993
- 1993-03-31 CA CA 2093103 patent/CA2093103A1/en not_active Abandoned
- 1993-04-28 EP EP93201217A patent/EP0569081A1/en not_active Withdrawn
- 1993-04-30 JP JP10392893A patent/JPH0634630A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9209571D0 (en) | 1992-06-17 |
| CA2093103A1 (en) | 1993-11-03 |
| EP0569081A1 (en) | 1993-11-10 |
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