JPH06321807A - ロタウイルスワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ロータウイルスに対する中和抗体を生成する
ことができ且つ極めて弱毒化されているロータウイルス
ワクチンの製造方法の提供。 【構成】 ロータウイルスを含有する大便からの濾液
を、イン−ビトロ培養された細胞に多量に接種し、イン
−ビトロで継代を反復することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発生は生弱毒ヒト−ロタウイ
ルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）ワクチン及びこのワクチン
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ロタウイルス粒子は１９７４年に、電子
顕微鏡観察により大便サンプル中に同定された〔Bishop
等、“急性胃腸炎を有する子供からの便抽出物の電子顕
微鏡観察による新ウイルスの検出”、ランセット（Ｌａ
ｎｃｅｔ）１９７４，１４９〕。

【０００３】ロタウイルスは現在世界中の小児における
深刻な急性下痢の重要な原因として認識されている。急
性下痢の原因としてロタウイルスが最初に同定された
後、種々の細胞系においてこのウイルスを培養する努力
がなされたが不成功に終った。ヒト−ロタウイルスは、
ゲル電気泳動におけるそのＲＮＡゲノムセグメントの移
動度に基いて広く２つのグループ、すなわち「短いＲＮ
Ａ」（Ｓ）パターンを有するものと「長いＲＮＡ」
（Ｌ）パターンを有するものに分類される。

【０００４】１９８１年、サトー等は、ＭＡ−１０４細
胞のローラー培養を用いて大便試料からのヒト−ロタウ
イルスの培養に成功したことを記載した〔“細胞培養に
おけるヒト−ロタウイルスの分離”アーク．ビロロ．
（Arch. Virol.）６９：１５５−１６０〕。試料をトリ
プシンによって前処理しそして少量のトリプシンを維持
培地に導入した。この技法は、下痢便からのロタウイル
スを培養するために、他人により好結果をもって使用さ
れた。

【０００５】今までに培養された大部分の株が「Ｌ」パ
ターンを有するものである。「Ｓ」パターン株は培養が
困難であることが証明され、そして「Ｓ」パターンを有
するロタウイルスの２株のみが培養されたことが記載さ
れている〔例えば、“クツザワ等、細胞培養におけるヒ
ト−ロタウイルス・サブグループ１及び２の分離”、
Ｊ．クリン. ミクロビオル. (J. Clin. Microbiol.) １
６：７２７−７３０〕。

【０００６】

【本発明の説明】発明者等は、オーストラリア及びパプ
アニューギニアにおいて疫学的に非常に重要な６株のヒ
ト−ロタウイルスの培養、及びワクチンとして有望な生
弱毒ウイルスの調製に成功した。

【０００７】１９７７年〜１９７９年にオーストラリ
ア、メルボルンにおいて、そして１９７９年にパプアニ
ューギニアにおいて下痢を流行させた株はいずれも
「Ｓ」パターン株であったが電子顕微鏡的に異ってい
た。発明者等は、「Ｓ」パターンウイルスを含有する選
択された６個の試料の内２個の試料から「Ｓ」パターン
ウイルスの培養に成功した。他の人は「Ｓ」パターンウ
イルスの培養が困難であることを見出していた。

【０００８】発明者等は、サトー等の原法と異る培養方
法を用いた。培養の出発のために１．０mlの大便濾液を
使用し、そしてその後のすべての継代のために１．０ml
の組織培養液を使用した。この増加した量の接種物が原
法に比べて好結果をもたらしたことは驚くべきことであ
る。この研究に用いた多量の接種物中の増加した数の感
染性粒子が「Ｓ」パターンを有する株の培養に成功する
機会を増加したのかもしれない。

【０００９】発明者等は、−７０℃で貯蔵された全便か
らの株、ＰＢＳ中−２０℃及び−７０℃で貯蔵された便
からの株、並びに−７０℃にて貯蔵されたシュークロー
スクッションペレット化ウイルスからの株を培養するこ
とに成功した。培養された株の数が少ないので、ウイル
スの培養のための便試料の最適貯蔵条件について結論を
導くことはまだできない。

【００１０】この発明はまた、ヒト−ロタウイルスによ
り惹起される急性下痢に対する免疫学的保護をもたらす
ためのワクチンを提供し、このワクチンはＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ２１０４としてブダペスト条約に基き国際寄託された
Hu／Australia ／１０−２５−１０／７７／Ｌと称され
るウイルスの生弱毒株、又はＡＴＣＣ ＶＲ２１０５と
してブダペスト条約に基き国際寄託されたHu／Australi
a ／１−９−１２／７７／Ｓと称されるウイルスの生弱
毒株を含んで成る。この発明はさらに、前記ウイルスの
両弱毒株を含んで成る、強化された交差保護をもたらす
ワクチンを提供する。

【００１１】ロタウイルスの分離 １９７３年以来、発明者等は急性下痢を有する小児の便
から同定されたロタウイルス株を貯蔵してきた。これら
の試料のほとんどはオーストラリアの小児から得た。さ
らに、発明者等はインドネシア及びパプアニューギニア
において行われた共同疫学調査により得られた試料を使
用した。

【００１２】これら貯蔵された株の多くを、ゲノムＲＮ
Ａのゲル電気泳動により試験した〔例えば、Rodger等、
“ゲノムリボ核酸の電気泳動により決定された、１９７
３〜１９７９年におけるオーストラリア、メルボルンに
おけるヒト−ロタウイルスの分子疫学”、Ｊ．クリン．
ミクロビオル（J. Clin. Mcrobiol.）１３：２７２−２
７８〕。

【００１３】公知の電気泳動的タイプのロタウイルス粒
子を含有する便試料が発明者等により選択された。この
目的は、オーストラリア及び他の地域において小児に急
性下痢の大きな爆発的流行を生じさせたヒト−ロタウイ
ルス株を培養することであった。

【００１４】試料は、全便として、燐酸緩衝化塩溶液
（ＰＢＳ，pH７．０）中２０％便ホモジネートとして、
又はシュークロースクッションペレット化ウイルスとし
て、−７０℃又は−２０℃において、種々の期間にわた
って貯蔵した。培養のために選択された下痢便のすべて
が主として二重殻のウイルス粒子の多数（電子顕微鏡下
で２−４＋又は１０⁸ ウイルス粒子／ml以上）を含有し
ていた。試料の詳細は次の通りである。

【００１５】１．「Ｒ−電気泳動タイプ」を有する８試
料 （Rodger等、上記を参照のこと）。１９７７年にメルボ
ルンの産科病院の新生児室の小児から集め、そしてＰＢ
Ｓ中２０％ホモジネートとして−７０℃にて貯蔵したも
の。

【００１６】２．「Ｍ−電気泳動タイプ」を含有する５
試料 （Rodger等、上記を参照のこと）。１９７７〜１９７８
年にメルボルンにおいて小児から集め、そしてＰＢＳ中
２０％ホモジネートとして、又はシュークロースクッシ
ョンペレット化ウイルスとして−７０℃にて貯蔵したも
の〔１９８３年Albert等による報告、“ゲノムのＲＮＡ
の電気泳動による、パプアニューギニアのハイランドに
おけるロタウイルス下痢の疫学”、Ｊ．クリン．ミクロ
ビオル．（J. Clin. Microbiol) １７：１６２−１６
４〕。

【００１７】３．「ＰＡ−電気泳動タイプ」を含有する
１試料。１９７９年にパプアニューギニアのハイランド
においてロタウイルス下痢の流行にかかった子供から集
め、そしてＰＢＳ中２０％ホモジネートとして−２０℃
において貯蔵したもの。 ４．「Ｌ」パターンのロタウイルスを含有する１試料。
１９８１年にオーストラリア、クイーンスランドにおい
てロタウイルス下痢の流行にかかった小児から集め、そ
して全便として−２０℃で貯蔵したもの。 ５．「Ｌ」パターンのロタウイルスの支配的な電気泳動
タイプを含有する１試料。１９８１年にメルボルンにお
いて小児から集め、そしてＰＢＳ中２０％ホモジネート
として−７０℃にて貯蔵したもの。

【００１８】培養技法 （ｉ）培養技法は一般にサトウ等の方法に従う。ＭＡ−
１０４細胞〔ミクロビオロジカルアソシエーツ（Microb
iological Associates)(MA) ビオプロダクツ (Bioprodu
cts)、ウオーカービレ、MA、米国〕を、１０％のウシ胎
児血清（ＦＣＳ、フローラボラトリーズ、シドニー、オ
ーストラリア）及び１２．５μｇ／mlずつのネオマイシ
ンサルフェート及びポリミキシンＢサルフェートを加え
たドルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変形培地（ＤＭＭ、
フローラボラトリーズ、シドニー、オーストラリア、Ｃ
ａｔ ＮＯ ７４−０１３−５４）中に増殖させた。培
養チューブ中３日間のコンフルエントの細胞層をウイル
スの培養のために使用した。

【００１９】ロタウイルスを含有する便試料を解凍し、
そして全便サンプルを、ＰＢＳ中２０％懸濁液を形成す
るようにホモジナイズした。次にすべての試料を渦流攪
拌しそして３，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。
上清を０．４５μｍメンブランフィルター（ミリポア
社、ベドフォード、MA、米国）を通過せしめることによ
り細胞を除去した。

【００２０】接種物を１０μｇ／mlのトリプシン（シグ
マ、トリプシン１Ｘ、シグマ社、セントルイス、MO、米
国）により前処理した。ウイルスの増殖中の維持培地
（ＤＭＭ）には１μｇ／mlのトリプシンを含有せしめ
た。接種物中のウイルス濃度を電子顕微鏡によりチェッ
クした。ウイルス粒子の濃度が１０⁸ 個／ml以上の濃度
の場合にのみ接種物を使用した。

【００２１】トリプシンで処理された便の１．０mlのア
リコートを、ローラーチューブ中にコンフルエント細胞
単層として増殖したＭＡ−１０４細胞の２．０mlの細胞
培養物中に接種した。サトー等は０．１mlのアリコート
を使用した。０．１mlのアリコートを用いて他のロタウ
イルスを培養するための他の人の多くの試みは失敗に終
った。１．０mlのアリコートへの変更が幾つかのロタウ
イルス株の培養を成功に導いた。

【００２２】各試料を２本ずつのチューブに接種した。
１本のチューブからの細胞を用いて免疫螢光染色（immu
nofluorescent staining) により各継代後にウイルスの
増加を監視した。この場合シミアンウイルスＳＡ−１１
に対するラビット抗血清、及びヤギＦＩＴＣ−接合抗−
ラビットＩｇＧ（フルオレッセインイソチオシアナート
と接合したヤギ免疫グロブリン、タゴ社、バーリンガ
ム、CA、米国から供給される）を用いた。

【００２３】他方の培養チューブは次の継代のために用
いた。各継代において、前継代からの１．０mlの稀釈さ
れない材料を接種物として使用した。この特徴もまたサ
トー等により用いられた技法と対照的である。細胞変性
効果（ＣＰＥ）が明らかになるまで逐次的に継代を行っ
た。次に、電子顕微鏡を用いてウイルスにつき培養液を
試験した〔Whitby等の報文、１９８０、“ポリアクリル
アミドヒドロゲルを用いる、電子顕微鏡によるウイルス
粒子の検出”、Ｊ．クリン・パソル．（J. Clin. Patho
l.) ３３：４８４−４８７〕。

【００２４】（ii）ＦＲｈＬ２細胞（ＤＢＳ−ＦＲｈＬ
₂ −２，ＡＴＣＣ，ロックビレ、マリーランド、米国）
を最少必須培地（イーグル）中で増殖せしめ、これにＥ
ａｒｌｅｓ ＢＳＳ（ＢＭＥ）中非必須アミノ酸、１０
％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、フローラボラトリーズ、シド
ニー、オーストラリア）及び１２．５μｇ／mlずつのネ
オマイシンサルフェート及びポリミキシンＢサルフェー
トを加えた。

【００２５】あらかじめＭＡ−１０４細胞中に培養され
たＲＵ−３ウイルスを、小プラスチックフラスコ中細胞
の７日目コンフルエント単層に接種した。次に、前記の
培養技法を行った。２〜７日の間隔で逐次継代を行い、
そしてウイルスの増加を酵素免疫測定（ＥＩＡ）により
監視し、そして後期には免疫螢光染色により監視した。

【００２６】ウイルスのＲＮＡゲノムのゲル電気泳動 この方法は記載されている（Rodger等、上記）。要約す
れば、便サンプル又は細胞培養液をドデシル硫酸ナトリ
ウムと共に破砕し、そしてフェノール、クロロホルム及
びイソアミルアルコールの組合わせを用いて脱蛋白し
た。脱蛋白されたＲＮＡの電気泳動を、１０％アクリル
アミドスラブゲル中で、Laemmli により１９７０年に記
載さた不連続緩衝系を用いて行った〔“バクテリオファ
ージＴ４の頭部の集合中構造蛋白質の開裂”、ネイチュ
アー（Ｎａｔｕｒｅ）、（ロンドン）２２７：６８０−
６８５〕。まず便からのすべてのウイルスの電気泳動タ
イプを同定し、そして細胞培養物中でのＣＰＥの出現、
すなわち、細胞の層中で増殖するウイルスによる細胞の
損傷をチェックした。

【００２７】ウイルスのプラク形成 静置細胞培養への適応の後、ウイルスの量を測定するた
めに、ウイルスをプラーク形成させた〔１９８１年、ウ
ラサワ等の報文、“ＭＡ−１０４細胞中でのヒト−ロタ
ウイルスの逐次継代”、ミクロビオル．イムノル。（Mi
crobiol Immunol.）２５：１０２５−１０３５〕。上層
は０．６％の精製寒天（オキソイド、英国）及び２μｇ
／mlのトリプシンから成る。ニュートラルレッド（０．
０６７mg／ml）を含有する第２上層を、インキュベーシ
ョン後４〜５日目に適用した。

【００２８】結果 検討した１６個の便試料からの６種類のヒト−ロタウイ
ルス株を細胞培養に適応させることに成功した。これら
の株の内３株はＰＢＳ中に−７０℃で貯蔵された便から
分離され、１株は−７０℃で貯蔵されたシュークロース
クッションペレット化ウイルスから分離され、１株はＰ
ＢＳ中に−２０℃で貯蔵された便から分離され、そして
１株は−７０℃で貯蔵された便から分離された。

【００２９】これら６株について、第１継代からＣＰＥ
の出現まで、特異的細胞質内螢光を観察した。他の１株
は３継代の間初期螢光を示したが、これはやがて消失し
た。残りの９試料は第１継代から第１０継代まで細胞質
内螢光を示さず、この段階でウイルスは培養不能である
と断定した。すべての培養可能な株について、第６継代
〜第９継代の間にＣＰＥが出現した。

【００３０】ＣＰＥの出現は、ＭＡ−１０４細胞単層の
接種後３〜５日目における粒状性の増加、クラスターへ
の球状化、及び極端な腐肉状化（ｓｌｏｕｇｈｉｎｇ）
から成る。種々の株の間でＣＰＥの相違は観察されなか
った。ＣＰＥが出現した後の細胞培養液の試験により、
単殻ウイルス粒子と二重殻ウイルス粒子の混合物が示さ
れた。

【００３１】この明細書においては、６種類のウイルス
を、１９７９年にRodger及びHolmesにより最初に提案さ
れた命名法〔“ゲル電気泳動によるサル、ウシ及びヒト
−ロタウイルスのゲノムの比較、並びにウシ分離体間の
ゲノムの相違の検出”、Ｊ．ビロル．（J. Virol.)３
０：８３９−８４６〕の変法を用いて命名する。この方
法は、次の情報を暗号化したものである。

【００３２】ａ．ロタウイルスが得られた動物の種。 ｂ．ウイルスの地理的由来。 ｃ．実験室における株同定記号。 ｄ．ウイルスが得られた年代。 ｅ．電気泳動パターン、すなわち「Ｓ」か「Ｌ」か。 血清型及びサブグループの同定のための比較血清が得ら
れる場合には、この情報を各株の暗号に加えることがで
きよう。この発明に従って培養された株の暗号及び実験
室同定記号を次に示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】ＲＶ−１，ＲＶ−２及びＲＶ−３は同一で
あり、そして「Ｒ−電気泳動タイプ」に相当し、ＲＶ−
５は「Ｍ−電気泳動タイプ」（Rodger等上記）に相当
し、そしてＲＶ−６は「ＰＡ−電気泳動タイプ」（Albe
rt等、上記）に相当するようである。この発明に従って
培養されたヒト−ロタウイルスのＲＮＡパターン（Rodg
er等、上記、のゲル電気泳動法を用いる）を、実験室に
おいて日常的に培養したサル由来のウイルスＳＡ１１の
ＲＮＡパターンと共に第１図に示す。第１図中、左から
右にＲＶ−１，ＲＶ−６，ＲＶ−５，ＲＶ−４及びＳＡ
−１１のパターンを示す。もとの便中のウイルスのＲＮ
Ａと細胞培養物に適応されたウイルスのＲＮＡとの同時
電気泳動において相異が示されなかった。

【００３５】３株、すなわちＲＶ−４，ＲＶ−５及びＲ
Ｖ−６は異るサイズ（０．２５mm〜３．５mm）のプラー
クを形成した。１株、すなわちＲＶ−３は、細胞単層が
透明化した通常の領域ではなく、細胞の厚化から成るプ
ラークを形成した。このプラークは動物ロタウイルスの
ｔｓ変異株についてFaulkner−Valle 等〔“ロタウイル
スIII の分子生物学。ウシ−ロタウイルスの温度感受性
変異株の分離及び特徴付け”、Ｊ．ビロロ．（J. Viro
l.)４２：６６９−６７７〕により１９８２年に記載さ
れたものと類似している。他の２株ＲＶ−１及びＲＶ−
２はプラーク形成に適応することができなかった。プラ
ークを形成することができた株の力価は１０⁵ 〜１０⁶
感染粒子／mlの間で異った。

【００３６】第２図に、ヒト−ロタウイルスＲＶ−５
（Ｂ）及びＲＶ−３（Ｃ）によるプラーク形成を未感染
細胞対照（Ａ）と比較する。透明化領域はＢにおいて顕
著であり、そして厚化領域はＣにおいて顕著である。ヒ
ト−ロタウイルスＲＶ−３はＲＮＡゲノムのゲル電気泳
動に基いてロタウイルスサブグループ２に属することが
知られ、そしてポリクローナル抗体及びモノクローナル
抗体に対するその反応に基いて血清型３であることが知
られる。

【００３７】ＲＶ−３はまた特に、Department of Gast
roenterology, Royal children's Hospital メルボル
ン、オーストラリアによって開発されたモノクローナル
抗体によっても同定される。この抗体はＭａｂ ＲＶ−
３：３（前に１０１ＡＢ５−Ｂ８と称された）と称され
る。このものは、試験した他のロタウイルスとよりもＲ
Ｖ−３と１，０００倍強く反応する。

【００３８】ＲＶ−５はＲＮＡゲノムのゲル電気泳動に
よりロタウイルスサブグループ１に属すことが知られ、
そしてポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体との
反応により血清型２であることが知られる。今や、ＲＶ
−５のユニークな生化学的構造の部分が知られる〔Dyal
l-Smith M. L. 及びHolmes I. H.、“ヒト及び動物のロ
タウイルス血清型−特異的糖蛋白質の間の配列の相同
性”、ヌクレイックアシドリサーチ（Nucleic Acids Re
search）（１９８４），１２：１０９〕。

【００３９】ワクチンの製造 この発明のワクチンの製造のための好ましい経路は、適
切な変更を伴って、灰白髄炎生ワクチン（経口）につい
ての最近のＷＨＯの標準に従う〔“灰白髄炎ワクチン
（経口）のための要件”、生物学的標準についてのＷＨ
Ｏ専門委員会、第３３回報告（技術レポートシリーズ６
８７）、１０７−１７４頁、ＷＨＯ、ジュネーブ、１９
８３年〕。

【００４０】ワクチンの使用 最初のワクチン経口投与は生後３ヶ月より前に行うのが
好ましく、生後すぐに行うのが特に好ましく、次に３カ
月後、小児の血清中の母体抗体が低レベルに下がったと
きに第２回ワクチン投与を行う。この後で感染が生じた
場合、小児は深刻な臨床的疾患に対して最も傷つきやす
いようである。母親へのワクチン投与は、出生時の小児
において高力価の血清抗体をもたらすが、生後３ヶ月以
後のロタウイルス感染に対する保護をもたらさないよう
である。経口ワクチン中に必要とされるロタウイルスの
株の数はまだ明らかでないが、１つの株による感染が他
の株により惹起される深刻な疾患に対して保護を行うの
に十分であると考えられる。

【００４１】しかしながら、好ましいワクチンは、ヒト
又はモンキーの二倍体細胞株の培養物中に増殖した生弱
毒ロタウイルスの１又は複数のセロタイプの懸濁液を含
有する。このようなワクチンが１回又は２回、経口投与
されるであろう。次に、本発明のワクチンの有効性と無
毒性を実験例により説明する。

【００４２】実験 この実験の目的は、ヒト−ロータウイルスのＲＶ３株に
対する応答（セロコンバージョン、ウイルス放出、臨床
症状、中和抗体価）を研究することである。このロータ
ウイルス株は、ヒト−ロータウイルスの生弱毒株を代表
する。

【００４３】材料及び方法 ウイルス接種物 ：４頭のノトバイオート（Ｇｎ）ブタ
（Ｇｎ５，６，７，８）に、生後３日目に、ヒト−ロー
タウイルスワクチンＲＶ３（クローン２−１３−３−Ａ
ＧＭＫ、ロットＣ−１０８Ｖ）を経口投与した。細胞培
養免疫螢光測定（ＣＣＩＦ）におけるＲＶ３ワクチンの
力価は６×１０⁵ ＦＣＦＵ／mlであった。

【００４４】すべてのブタにシミラック子動物用定型飼
料を与え、そしてノトバイオート条件に維持した。生後
３日目に、ブタに４mlの培地中１mlのＲＶ３を経口接種
した。４頭のブタすべての、第一回接種から１６日目に
同じ量のＲＶ３を２回目として再接種した（０／１６Ｄ
ＰＥ）。第３回目の投与として第１回接種から３２日目
にブタ当り５mlのＲＶ３を経口投与した（０／１６／３
２ＤＰＥ）。すべてのブタを下痢及び臨床症状について
毎日観察した。

【００４５】サンプルの収集及び試験： （ｉ）直腸綿棒 接種後０〜１０日（ＤＰＥ）に各ブタから直腸綿棒を集
め、そして細胞培養免疫螢光測定（文献１：Bohl, E.
H. ら、J. Clin. Microbiol. 19：105-111)によりロー
タウイルス放出について測定した。 （ii）粘膜スメア ２頭のブタを３５ＤＰＥ（第３回接種後３ＤＰＥ）に安
楽死させ、さらに２頭のブタを４２ＤＰＥ（第３回接種
後１０ＤＰＥ）に安楽死させ、そして十二指腸、空腸及
び回腸から粘膜スメアを調製した。固定した組織を、Ｆ
ＩＴＣ−接合抗−ロータウイルス血清を用いる免疫螢光
測定（文献１）によりロータウイルス抗原の存在につい
て試験した。

【００４６】（iii)血清サンプル 選択されたブタから血液サンプルをおよそ毎週集め、そ
して血清を分離した。 （iv）血清学的試験 前記のようにして得た血清サンプルについて、（１）グ
ループ抗原として特異的抗ウイルス血清抗体（ＥＩＡ
Ｉｇ）を検出するための酵素免疫測定；並びに（２）同
一ロータウイルス（ＲＶ３）、関連セロタイプ３動物ロ
ータウイルス（ＳＡ１１）並びにセロタイプＧ１，Ｇ２
及びＧ４を代表する３種類の標準ロータウイルス株、そ
れぞれＲＶ４，ＲＶ５及びＳＴ３に対するロータウイル
ス血清中和抗体（ＶＮ）を検出するための螢光細胞フォ
ーカス測定の阻害；を行った。

【００４７】結果 各ＲＶ３ワクチン接種後毎日、臨床症状及びロータウイ
ルス放出を分析したが、接種後ウイルス放出は１〜１０
日間においてＣＣＩＦにより検出されず、そして下痢は
起らず又はわずかな特発性の下痢が起ったのみであっ
た。動物を安楽死させた後に十二指腸、空腸及び回腸か
ら調製した粘膜スメアにおいて、免疫螢光法（文献１）
によるロータウイルス抗原は陰性であった。

【００４８】血清学的試験の結果を後の表に示す。すべ
ての４頭のブタはＲＶ３の接種の後セロコンバージョン
を示した。すべてのブタがＥＩＡ Ｉｇ抗ロータウイル
ス抗体、並びにワクチン株（ＲＶ３）及び同セロタイプ
３株（ＳＡ１１）に対する中和抗体を生産した。セロタ
イプ１，２又は４の異種ウイルスに対して中和抗体は生
じなかった。ロータウイルス抗体（ＥＩＡ及びＶＮ）
は、ＲＶ３の最初の投与の後検出されず又は低い力価で
存在するのみであったが、第２の投与の後４頭の子ブタ
の内３頭において高レベルが達成された。これらの３頭
の子ブタにおいて、このレベルは維持され、又は第３回
投与の後にわずかに低下した。第４の子ブタは、第３回
目のＲＶ３の投与の後にのみ最高力価（ＥＩＡ及びＶ
Ｎ）を示した。

【００４９】

【表２】

【００５０】以上の通り、本発明のワクチンは、同系ロ
ータウイルス（Ｇ３）に対して高い中和抗体価を示す
が、投与後、内臓粘膜及び便中にロータウイルスは検出
されず、また下痢を起こさず、極めて弱毒化されている
ことがわかる。

【００５１】寄託 Hu／Australia ／１０−２５−１０／７７／Ｌと称され
るウイルスの生弱毒株がアメリカン・タイプ・カルチュ
アー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９８５年２月１日
にブダペスト条約に基き国際寄託され受託番号ＡＴＣＣ
ＶＲ２１０４が与えられた。Hu／Australia ／１−９
−１２／７７／Ｓと称されるウイルスの生弱毒株がＡＴ
ＣＣに１９８５年２月１日にブダペスト条約に基き国際
寄託され受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１０５が与えられ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は各種ウイルスのＲＮＡのゲル電気泳動図
であり、レーン１はＲＶ−１、レーン２はＲＶ−６、レ
ーン３はＲＶ−５、レーン４はＲＶ−４、そしてレーン
５はＳＡ−１１についてのパターンであり；

【図２】図２はウイルスにより形成されるプラークを示
し、生物の形態を示す図面に代る写真であって、ＢはＲ
Ｖ−５、ＣはＲＶ−３、そしてＡは対照をそれぞれ示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルース フランシス ビショップ オーストラリア国，ビクトリア 3186，ブ ライトン，キナーン ストリート 23

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト−ロタウイルスにより惹起される疾
   患に対して免疫学的保護を与えるワクチンの製造方法で
   あって、ヒト−ロタウイルスを含有する大便サンプルか
   ら濾液を調製し、約２mlに匹敵する量の適当な基質のた
   めの接種物として前記サンプル０．１ｇ以上からの濾過
   された材料を含有する量の前記濾液を使用して該基質上
   で前記ウイルスを増殖せしめ、そして該ウイルスを逐次
   的に継代することによりワクチンとして使用するために
   適当な前記ウイルスの生弱毒株を得る、ことを含んで成
   る方法。
2. 【請求項２】 前記の量の濾液が０．２ｇ以上の前記サ
   ンプルからの濾過された材料を含有する、請求項１に記
   載の方法。
3. 【請求項３】 第１継代において使用したのと同程度の
   量の接種物を稀釈しないで次の継代に使用する請求項１
   又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記基質が細胞系ＭＡ−１０４からの細
   胞を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 前記基質が細胞系ＦＲｈＬ２からの細胞
   を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記ウイルスを５回以上逐次的に継代す
   る請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。