JPH06245785A - Method for purifying sialic acid - Google Patents
Method for purifying sialic acidInfo
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- JPH06245785A JPH06245785A JP5032900A JP3290093A JPH06245785A JP H06245785 A JPH06245785 A JP H06245785A JP 5032900 A JP5032900 A JP 5032900A JP 3290093 A JP3290093 A JP 3290093A JP H06245785 A JPH06245785 A JP H06245785A
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- sialic acid
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、シアル酸（Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸）の精製方法に関するものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for purifying sialic acid (N-acetylneuraminic acid).
【０００２】[0002]
【従来の技術】シアル酸は、動物の血液、尿、唾液等、
生体中に広く分布して生理的に機能する物質であるが、
その含有量は極めて微量であるために工業的規模での調
製は困難とされている。例えば、特開昭64-40491号公報
にはシアル酸含有天然物 (牛乳、脱脂乳、バターミルク
及びホエー等の乳質物質) を加水分解してシアル酸を遊
離させ、得られたシアル酸含有加水分解液を電気透析に
よって脱塩処理した後、再び脱塩処理を行って高純度の
シアル酸を得る方法が提案されている。しかしこの方法
は多くの手数を必要とし、工業的に実施するには問題が
ある。BACKGROUND OF THE INVENTION Sialic acid is used in animal blood, urine, saliva, etc.
It is a substance that is widely distributed in the living body and functions physiologically,
Since its content is extremely small, it is difficult to prepare it on an industrial scale. For example, JP-A-64-40491 discloses that a sialic acid-containing natural product (milk, skim milk, buttermilk, whey and other milky substances) is hydrolyzed to release sialic acid, and the resulting sialic acid-containing hydrolyzate is obtained. A method has been proposed in which the decomposed solution is desalted by electrodialysis and then desalted again to obtain high-purity sialic acid. However, this method requires a lot of trouble and is problematic for industrial implementation.
【０００３】また特開平2-69492 号公報には、鶏卵を加
水分解したシアル酸含有天然物を陽イオン交換樹脂及び
陰イオン交換樹脂と接触させ、遊離シアル酸を分離精製
する方法が提案されている。しかしこの方法も分離精製
に多くの時間と手数を必要とし、工業的に実施するには
問題があった。Further, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-69492 proposes a method of separating and purifying free sialic acid by bringing a sialic acid-containing natural product obtained by hydrolyzing chicken eggs into contact with a cation exchange resin and an anion exchange resin. There is. However, this method also requires a lot of time and labor for separation and purification, and there is a problem in carrying out it industrially.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような従
来の問題点を解決して、シアル酸含有原料液から高純度
のシアル酸を効率よく分離精製することができるシアル
酸の精製方法を提供するために完成されたものである。The present invention solves such conventional problems and provides a method for purifying sialic acid capable of efficiently separating and purifying high-purity sialic acid from a sialic acid-containing raw material liquid. It has been completed to provide.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、コロミン酸を含有する原料液を
加水分解して得られるシアル酸含有加水分解液を、レク
チンを固定相とするアフィニティカラムに通液すること
により精製処理し、高純度のシアル酸を得ることを特徴
とするものである。Means for Solving the Problems The present invention, which has been made to solve the above-mentioned problems, provides a sialic acid-containing hydrolyzate obtained by hydrolyzing a raw material liquid containing colominic acid, with a lectin as a stationary phase. It is characterized in that a high-purity sialic acid is obtained by performing purification treatment by passing the solution through an affinity column.
【０００６】本発明においては、まずコロミン酸を含有
する原料液を製造する。コロミン酸はシアル酸を構成単
位とした分子量１万程度の高分子ホモポリマーであり、
例えば大腸菌等の微生物を利用して生産させることがで
きる。なお、特開平1-144989号公報に、コロミン酸の生
産に適した菌株が示されている。このようなコロミン酸
を含有する原料液を加水分解すると、シアル酸含有加水
分解液を得ることができる。本発明ではこのシアル酸含
有加水分解液をレクチンを固定相とするアフィニティカ
ラムに通液し、高純度のシアル酸モノマーを分離する。In the present invention, a raw material liquid containing colominic acid is first produced. Colominic acid is a high molecular weight homopolymer having a molecular weight of about 10,000 with sialic acid as a constituent unit,
For example, it can be produced using microorganisms such as Escherichia coli. In addition, Japanese Patent Laid-Open No. 1-144989 discloses a strain suitable for producing colominic acid. By hydrolyzing such a raw material liquid containing colominic acid, a sialic acid-containing hydrolyzed liquid can be obtained. In the present invention, this sialic acid-containing hydrolyzate is passed through an affinity column having a lectin as a stationary phase to separate high-purity sialic acid monomers.
【０００７】レクチンは動植物あるいは微生物中に見い
だされる糖結合性の蛋白質であり、本発明では小麦胚芽
レクチン、ニホンニワトコレクチン等のシアル酸に親和
性を有するレクチンをアフィニティカラムの固定相とし
て利用する。小麦胚芽レクチンは小麦胚芽より調製した
連鎖を持たない蛋白質であり、シアル酸が密になってい
る構造を認識する。その分子量は約36000 で、分子量約
18000 のサブユニット２個からなり、３個のＮ−アセチ
ルグルコサミン結合部位を有している。そしてシアル酸
はこのレクチンへの結合能が高いものである。また、ニ
ホンニワトコレクチンはニホンニワトコの小枝より調製
された糖蛋白質であり、１分子当り２つの糖結合部位を
持ち、やはりシアル酸に対して高い結合能を持ってい
る。Lectin is a sugar-binding protein found in animals and plants or microorganisms, and in the present invention, lectins having an affinity for sialic acid such as wheat germ lectin and Japanese elderberry collectin are used as a stationary phase of an affinity column. Wheat germ lectin is a chainless protein prepared from wheat germ and recognizes a structure in which sialic acid is dense. Its molecular weight is about 36000 and its molecular weight is about
It consists of 2 subunits of 18000 and has 3 N-acetylglucosamine binding sites. And sialic acid has high binding ability to this lectin. The Japanese elderberry collectin is a glycoprotein prepared from a branch of Japanese elderberry, which has two sugar binding sites per molecule and also has a high binding ability to sialic acid.
【０００８】このため、これらのレクチンを固定相とす
るアフィニティカラムにコロミン酸を含有する原料液を
通液すると、アフィニティカラムのレクチンにシアル酸
のみが選択的に吸着される。次に洗浄液を通液すると、
夾雑物等はアフィニティカラムから流出し、シアル酸の
みが残る。そこで解離液をアフィニティカラムに通液す
れば、シアル酸はレクチンから解離し、純度の高いシア
ル酸を得ることができる。Therefore, when a raw material solution containing colominic acid is passed through an affinity column having these lectins as a stationary phase, only sialic acid is selectively adsorbed by the lectins of the affinity column. Next, when the cleaning liquid is passed through,
Contaminants and the like flow out from the affinity column, leaving only sialic acid. Therefore, if the dissociation liquid is passed through the affinity column, the sialic acid dissociates from the lectin, and sialic acid with high purity can be obtained.
【０００９】[0009]
【作用】本発明においては上記したように、コロミン酸
を含有する原料液を加水分解して得られるシアル酸含有
加水分解液を、レクチンを固定相とするアフィニティカ
ラムに通液して分離するので、従来の方法に比較し、精
製時間を極めて短くすることができる。また次の実施例
に示すように、シアル酸の収率もきわめて高い値を示
す。以下に本発明の実施例を示す。In the present invention, as described above, the sialic acid-containing hydrolyzate obtained by hydrolyzing the raw material liquid containing colominic acid is passed through an affinity column having a lectin as a stationary phase for separation. In comparison with the conventional method, the purification time can be extremely shortened. Further, as shown in the following examples, the yield of sialic acid also shows an extremely high value. Examples of the present invention will be shown below.
【００１０】[0010]
〔実施例１〕大腸菌により生産したコロミン酸含有培養
液から菌体を膜濾過して除去した液を加水分解し、原料
液とした。このシアル酸含有加水分解液を、小麦胚芽レ
クチンを固定相とした米国クロマトケム社製の高速アフ
ィニティカラムに通液し、PBS 緩衝液で洗浄した後、0.
1M酢酸ナトリウム(pH4.5) を通液することによりシアル
酸を解離し回収した。得られたシアル酸量を過ヨウ素酸
レソルシノール法で測定したところ、55mgであった。ま
たその純度はチオベルビツール法によると、約98％であ
った。[Example 1] A liquid obtained by removing bacterial cells by membrane filtration from a culture liquid containing colominic acid produced by Escherichia coli was hydrolyzed to obtain a raw material liquid. This sialic acid-containing hydrolyzate was passed through a high-speed affinity column manufactured by U.S. Chromatochem, Inc. using wheat germ lectin as a stationary phase, washed with PBS buffer, and then washed with PBS.
Sialic acid was dissociated and collected by passing 1 M sodium acetate (pH 4.5). When the amount of sialic acid obtained was measured by the resorcinol periodate method, it was 55 mg. The purity was about 98% according to the Thiovelbitur method.
【００１１】〔実施例２〕実施例１と同様に、大腸菌に
より生産したコロミン酸含有培養液から菌体を膜濾過し
て除去した液を加水分解し、原料液とした。このシアル
酸含有加水分解液を移動相を蒸留水とし、0.1M Na2SO4
の直線濃度勾配で溶出するＤＥＡＥ−陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより分離を行った。210nm のＵＶ吸収
により溶出ピークをモニターしてシアル酸オリゴマーを
シアル酸モノマー、過分解物と分離した。次にシアル酸
モノマー、過分解物を含むピーク画分を小麦胚芽レクチ
ンを固定相としたアフィニティ担体（米国クロマトケム
社製）を１リットル充填したカラムに通液し、20mMリン
酸緩衝液(pH7.6) で洗浄した後、0.1M酢酸ナトリウム(p
H5) で溶出してシアル酸モノマーを過分解物と単離し、
凍結乾燥により白色粉末500gを得た。得られたシアル酸
モノマーの純度をチオベルビツール法により測定したと
ころ、約98％であった。[Example 2] As in Example 1, a liquid obtained by removing bacterial cells from a colominic acid-containing culture liquid produced by Escherichia coli by membrane filtration was hydrolyzed to obtain a raw material liquid. The sialic acid-containing hydrolyzate was used as the mobile phase of distilled water and 0.1M Na 2 SO 4
Separation was performed by DEAE-anion exchange chromatography eluting with a linear concentration gradient of. The elution peak was monitored by UV absorption at 210 nm, and the sialic acid oligomer was separated from the sialic acid monomer and the overlysed product. Next, the peak fraction containing the sialic acid monomer and the overlysed product was passed through a column packed with 1 liter of an affinity carrier (made by Chromatochem, USA) having wheat germ lectin as a stationary phase, and a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7. 6) After washing with 0.1M sodium acetate (p
H5) to elute the sialic acid monomer and isolate it from the over-degradation product,
Lyophilization gave 500 g of white powder. The purity of the obtained sialic acid monomer was about 98% as measured by the thioberbitur method.
【００１２】[0012]
【発明の効果】以上に説明したように、本発明のシアル
酸の精製方法によればコロミン酸を含有する原料液中か
ら、高い収率でシアル酸を精製することができ、また精
製に要する手数も比較的簡単で工業的に実施することが
可能である。よって本発明は従来の問題点を解消したシ
アル酸の精製方法として、産業の発展に寄与するところ
はきわめて大きいものである。As described above, according to the method for purifying sialic acid of the present invention, sialic acid can be purified from a raw material solution containing colominic acid in a high yield, and the purification is required. The number of steps is relatively simple and can be industrially implemented. Therefore, the present invention greatly contributes to industrial development as a method for purifying sialic acid which has solved the conventional problems.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 板倉 美奈 愛知県半田市柊町１丁目217−５ ハイツ 竹長３Ｃ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Mina Itakura 217-5, Hiiragi-cho, Handa-shi, Aichi Heights Takenaga 3C
Claims (1)
して得られるシアル酸含有加水分解液を、レクチンを固
定相とするアフィニティカラムに通液することにより精
製処理し、高純度のシアル酸を得ることを特徴とするシ
アル酸の精製方法。1. A high-purity sialic acid obtained by subjecting a sialic acid-containing hydrolyzate obtained by hydrolyzing a raw material liquid containing colominic acid to an affinity column having a lectin as a stationary phase for purification treatment. A method for purifying sialic acid, which comprises:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5032900A JPH06245785A (en) | 1993-02-23 | 1993-02-23 | Method for purifying sialic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5032900A JPH06245785A (en) | 1993-02-23 | 1993-02-23 | Method for purifying sialic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245785A true JPH06245785A (en) | 1994-09-06 |
Family
ID=12371776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5032900A Pending JPH06245785A (en) | 1993-02-23 | 1993-02-23 | Method for purifying sialic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06245785A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174063A (en) * | 2011-01-12 | 2011-09-07 | 朱莉 | Method for preparing oligomeric sialic acid |
-
1993
- 1993-02-23 JP JP5032900A patent/JPH06245785A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174063A (en) * | 2011-01-12 | 2011-09-07 | 朱莉 | Method for preparing oligomeric sialic acid |
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