JPH06237771A - Ｄｎａの抽出方法 - Google Patents
Ｄｎａの抽出方法Info
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- JPH06237771A JPH06237771A JP2567393A JP2567393A JPH06237771A JP H06237771 A JPH06237771 A JP H06237771A JP 2567393 A JP2567393 A JP 2567393A JP 2567393 A JP2567393 A JP 2567393A JP H06237771 A JPH06237771 A JP H06237771A
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- Japan
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- dna
- soil
- microorganisms
- treatment
- suspension
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 土壌から高収率で、かつ所望としないＤＮＡ
の混入なしに土壌微生物由来のＤＮＡを高純度で回収で
きる方法を提供すること。 【構成】 土壌微生物からＤＮＡを抽出する前に、微生
物に保持されているＤＮＡは保護しつつ、土壌に含まれ
るＤＡＮを分解する。
の混入なしに土壌微生物由来のＤＮＡを高純度で回収で
きる方法を提供すること。 【構成】 土壌微生物からＤＮＡを抽出する前に、微生
物に保持されているＤＮＡは保護しつつ、土壌に含まれ
るＤＡＮを分解する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、土壌中に含まれる微生
物由来のＤＮＡを土壌試料から簡便な操作で直接抽出で
きる方法に関する。
物由来のＤＮＡを土壌試料から簡便な操作で直接抽出で
きる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】土壌中には多種多様な微生物が存在して
いるが、その極一部のものしか同定されておらず、その
大部分についてが未知のままである。更に、そのほとん
どのものについての分離培養に必要な条件すら知られて
いない。このような土壌中の未知の微生物の同定、ポピ
ュレーションの把握は、土壌という特殊な環境からくる
多くの困難をともない、このことが微生物生態学の研究
を阻んでいる。これまでにも、微生物の分離培養法に改
良を加えることにより土壌微生物生態学上の研究が進め
られてきているが、これまでの方法では分離培養が困難
で、かつ、それらの活動が生態学的に重要な微生物がな
お数多く土壌中に存在しているとみられている。実際に
土壌微生物でその分離培養法が確立しているものは、土
壌微生物のたかだか０．１％であるといわれている。従
って、分離培養の困難な微生物の生態を把握すること
は、基礎科学のみならず、排水処理、環境浄化などの応
用技術の分野においてもとりわけ重要な課題の一つであ
るといえる。
いるが、その極一部のものしか同定されておらず、その
大部分についてが未知のままである。更に、そのほとん
どのものについての分離培養に必要な条件すら知られて
いない。このような土壌中の未知の微生物の同定、ポピ
ュレーションの把握は、土壌という特殊な環境からくる
多くの困難をともない、このことが微生物生態学の研究
を阻んでいる。これまでにも、微生物の分離培養法に改
良を加えることにより土壌微生物生態学上の研究が進め
られてきているが、これまでの方法では分離培養が困難
で、かつ、それらの活動が生態学的に重要な微生物がな
お数多く土壌中に存在しているとみられている。実際に
土壌微生物でその分離培養法が確立しているものは、土
壌微生物のたかだか０．１％であるといわれている。従
って、分離培養の困難な微生物の生態を把握すること
は、基礎科学のみならず、排水処理、環境浄化などの応
用技術の分野においてもとりわけ重要な課題の一つであ
るといえる。
【０００３】近年、芳香族炭化水素、パラフィン、ナフ
テンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレ
ンなどの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題な
っており、これらの物質による環境の汚染の拡大を防止
するとともに、すでに汚染されてしまった環境を浄化
し、もとの状態に修復する技術の確立が強く求められて
いる。この環境修復技術としては、例えば曝気処理、天
日処理、真空釜での処理、真空抽出処理等の物理化学的
手段があるが、コスト、操作性、投下エネルギー量、処
理範囲や、有機塩素系化合物を単に抽出しているだけで
あって、無害な化合物に変換するものではない等の観点
から必ずしも実用的であるとはいえない。そこで、上記
の物理化学的方法に対して、微生物を利用した処理が実
用的な汚染環境の修復方法を提供できるものとして期待
されている。
テンなどの脂肪族炭化水素、あるいはトリクロロエチレ
ンなどの有機塩素系化合物などによる環境汚染が問題な
っており、これらの物質による環境の汚染の拡大を防止
するとともに、すでに汚染されてしまった環境を浄化
し、もとの状態に修復する技術の確立が強く求められて
いる。この環境修復技術としては、例えば曝気処理、天
日処理、真空釜での処理、真空抽出処理等の物理化学的
手段があるが、コスト、操作性、投下エネルギー量、処
理範囲や、有機塩素系化合物を単に抽出しているだけで
あって、無害な化合物に変換するものではない等の観点
から必ずしも実用的であるとはいえない。そこで、上記
の物理化学的方法に対して、微生物を利用した処理が実
用的な汚染環境の修復方法を提供できるものとして期待
されている。
【０００４】例えば、土壌汚染を引き起こしている芳香
族炭化水素や有機塩素系化合物等の難分解性化合物を分
解する種々の微生物が土壌中に見出されており、これら
の微生物を汚染土壌に撒くことによる土壌中の汚染物質
の分解が検討されている。またＤＮＡ組換えにより分解
活性を向上させた組換え微生物の土壌への散布も検討さ
れている。このように、微生物を利用した環境浄化事業
を普及させ、これを実用的かつ社会的に有用な技術とし
て定着させていくためにはさまざまな有用微生物の開発
とともに、それらを導入した土壌における有用微生物の
活動、増殖、生残性の把握が重要な課題となる。
族炭化水素や有機塩素系化合物等の難分解性化合物を分
解する種々の微生物が土壌中に見出されており、これら
の微生物を汚染土壌に撒くことによる土壌中の汚染物質
の分解が検討されている。またＤＮＡ組換えにより分解
活性を向上させた組換え微生物の土壌への散布も検討さ
れている。このように、微生物を利用した環境浄化事業
を普及させ、これを実用的かつ社会的に有用な技術とし
て定着させていくためにはさまざまな有用微生物の開発
とともに、それらを導入した土壌における有用微生物の
活動、増殖、生残性の把握が重要な課題となる。
【０００５】また、土壌を利用する農業生産活動におい
ても、利用する土壌内に固有の、あるいはそこに導入し
た微生物の活動、増殖、生残性の把握は重要な課題であ
る。土壌中の微生物の活動、増殖、生残性などを把握す
る方法としては、例えば、土壌の一部を培地に加えて培
養して所望の微生物の生菌数を測定する方法がある。し
かしながら、この方法は土壌から分離培養の困難な微生
物には適用できず、また分離培養が可能な微生物を検出
対象とする場合でも、土壌中には多種多様の微生物が存
在し検出対象の微生物を特定することが困難な場合もあ
る。更に、生菌数測定方法自体の測定精度に限界がある
という問題もある。
ても、利用する土壌内に固有の、あるいはそこに導入し
た微生物の活動、増殖、生残性の把握は重要な課題であ
る。土壌中の微生物の活動、増殖、生残性などを把握す
る方法としては、例えば、土壌の一部を培地に加えて培
養して所望の微生物の生菌数を測定する方法がある。し
かしながら、この方法は土壌から分離培養の困難な微生
物には適用できず、また分離培養が可能な微生物を検出
対象とする場合でも、土壌中には多種多様の微生物が存
在し検出対象の微生物を特定することが困難な場合もあ
る。更に、生菌数測定方法自体の測定精度に限界がある
という問題もある。
【０００６】また、組換え微生物の導入における場合に
は、従来より抗生物質耐性や色素生産性などのマーカー
遺伝子を組み込み生菌数を把握する手法が利用されてき
たが、マーカー遺伝子の脱落や突然変異が生じた場合の
測定誤差が大きいという問題があり、またそれ以前に抗
生物質耐性を有する微生物の野外放出には疫学上の問題
がある。
は、従来より抗生物質耐性や色素生産性などのマーカー
遺伝子を組み込み生菌数を把握する手法が利用されてき
たが、マーカー遺伝子の脱落や突然変異が生じた場合の
測定誤差が大きいという問題があり、またそれ以前に抗
生物質耐性を有する微生物の野外放出には疫学上の問題
がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】近年、分子生物学の進
展とともに、微生物の検出手段として、微生物から抽出
したＤＮＡを分析して、検出対象の微生物に特徴的なＤ
ＮＡ配列の有無を検出する方法が開発されるに至ってい
る。
展とともに、微生物の検出手段として、微生物から抽出
したＤＮＡを分析して、検出対象の微生物に特徴的なＤ
ＮＡ配列の有無を検出する方法が開発されるに至ってい
る。
【０００８】このＤＮＡを利用した微生物の検出方法で
は、まず土壌等の環境試料から目的微生物由来のＤＮＡ
を抽出する必要がある。例えば、土壌からの微生物由来
のＤＮＡの抽出、回収方法には、菌体抽出法と直接溶菌
法がある。菌体抽出法は土壌より微生物菌体を含む画分
を分離した後、集菌した菌体よりＤＮＡを抽出、回収す
る方法である。これに対して、直接溶菌法は土壌試料に
菌体溶菌処理を直接施して菌体からＤＮＡを放出させ、
それを土壌試料から回収する方法である。
は、まず土壌等の環境試料から目的微生物由来のＤＮＡ
を抽出する必要がある。例えば、土壌からの微生物由来
のＤＮＡの抽出、回収方法には、菌体抽出法と直接溶菌
法がある。菌体抽出法は土壌より微生物菌体を含む画分
を分離した後、集菌した菌体よりＤＮＡを抽出、回収す
る方法である。これに対して、直接溶菌法は土壌試料に
菌体溶菌処理を直接施して菌体からＤＮＡを放出させ、
それを土壌試料から回収する方法である。
【０００９】ここで、菌体抽出法では、土壌や目的微生
物の種類に応じて菌体の土壌からの回収率が大きくばら
つくという問題がある。例えば、土壌からの細菌の回収
では、回収率が４０％以上の土壌もあれば、１０％強の
土壌もある。また、この方法では回収されたＤＮＡの起
源が明らかであり、純度も高いという利点があるもの
の、得られるＤＮＡの量が、例えば１００ｇの土壌から
最高で１００μｇ程度、少ない場合では１〜２μｇと非
常に少なく、検査に必要な十分な量のＤＮＡが得られな
かったり、微量のためその取り扱いを特に慎重に行わな
ければならないといった問題もある。
物の種類に応じて菌体の土壌からの回収率が大きくばら
つくという問題がある。例えば、土壌からの細菌の回収
では、回収率が４０％以上の土壌もあれば、１０％強の
土壌もある。また、この方法では回収されたＤＮＡの起
源が明らかであり、純度も高いという利点があるもの
の、得られるＤＮＡの量が、例えば１００ｇの土壌から
最高で１００μｇ程度、少ない場合では１〜２μｇと非
常に少なく、検査に必要な十分な量のＤＮＡが得られな
かったり、微量のためその取り扱いを特に慎重に行わな
ければならないといった問題もある。
【００１０】これに対して、直接溶菌法は、ＤＮＡ回収
量が例えば土壌１００ｇあたり１〜２ｍｇと菌体抽出法
に比べ１０〜１００倍も高いという特長を有するが、土
壌にフリーの状態で残存しているＤＮＡ、例えば起源の
不明な死滅した細菌、糸状菌、原生動物や植物等に由来
するＤＮＡが混入してくる場合が多く、それが測定の妨
げとなるという問題がある。
量が例えば土壌１００ｇあたり１〜２ｍｇと菌体抽出法
に比べ１０〜１００倍も高いという特長を有するが、土
壌にフリーの状態で残存しているＤＮＡ、例えば起源の
不明な死滅した細菌、糸状菌、原生動物や植物等に由来
するＤＮＡが混入してくる場合が多く、それが測定の妨
げとなるという問題がある。
【００１１】このように、ＤＮＡ分析法を土壌微生物の
検出手段として利用していくためには、土壌から目的と
する菌体に由来するＤＮＡを回収する手法が不可欠であ
るが、従来用いられてきた手法には上述のように一長一
短があり、高回収率とともに回収されたＤＮＡの純度も
満足できるＤＮＡの土壌からの抽出方法が強く求められ
ている。
検出手段として利用していくためには、土壌から目的と
する菌体に由来するＤＮＡを回収する手法が不可欠であ
るが、従来用いられてきた手法には上述のように一長一
短があり、高回収率とともに回収されたＤＮＡの純度も
満足できるＤＮＡの土壌からの抽出方法が強く求められ
ている。
【００１２】本発明は、上記の従来技術における問題に
鑑みなされたものであり、土壌から高収率で、かつ所望
としないＤＮＡの混入なしに土壌微生物由来のＤＮＡを
回収できる方法を提供することをその目的とする。
鑑みなされたものであり、土壌から高収率で、かつ所望
としないＤＮＡの混入なしに土壌微生物由来のＤＮＡを
回収できる方法を提供することをその目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明のＤＮＡの抽出方
法は、微生物を含む土壌試料の懸濁液を調製する過程
（ａ）と、該懸濁液中に含まれる遊離のＤＮＡを分解す
る過程（ｂ）と、該過程（ｂ）を経た該懸濁液に含まれ
る微生物から該懸濁液中にＤＮＡを抽出する過程（ｃ）
と、該抽出ＤＮＡを該懸濁液の上清から回収する過程
（ｄ）とを有することを特徴とする。
法は、微生物を含む土壌試料の懸濁液を調製する過程
（ａ）と、該懸濁液中に含まれる遊離のＤＮＡを分解す
る過程（ｂ）と、該過程（ｂ）を経た該懸濁液に含まれ
る微生物から該懸濁液中にＤＮＡを抽出する過程（ｃ）
と、該抽出ＤＮＡを該懸濁液の上清から回収する過程
（ｄ）とを有することを特徴とする。
【００１４】本発明によれば、上記過程（ｂ）におい
て、微生物細胞（菌体）内にあるＤＮＡは保持したまま
で、土壌中に残存、蓄積しているむきだしの所望としな
いＤＮＡ、すなわち遊離のＤＮＡのみを選択的に分解、
除去することにより、回収された目的とするＤＮＡの純
度を挙げることが可能となる。すなわち、本発明によれ
ば、回収率の良好な直接溶菌法における問題、すなわ
ち、過去に死滅した細菌、糸状菌、原生動物などのあり
とあらゆる微生物や植物に由来し、土壌中において分解
されずに残存している所望としないＤＮＡが、土壌中の
微生物から回収した目的とするＤＮＡに混入するという
はなはだ不都合な問題を、上述の過程（ｂ）を導入する
ことで解決するものである。
て、微生物細胞（菌体）内にあるＤＮＡは保持したまま
で、土壌中に残存、蓄積しているむきだしの所望としな
いＤＮＡ、すなわち遊離のＤＮＡのみを選択的に分解、
除去することにより、回収された目的とするＤＮＡの純
度を挙げることが可能となる。すなわち、本発明によれ
ば、回収率の良好な直接溶菌法における問題、すなわ
ち、過去に死滅した細菌、糸状菌、原生動物などのあり
とあらゆる微生物や植物に由来し、土壌中において分解
されずに残存している所望としないＤＮＡが、土壌中の
微生物から回収した目的とするＤＮＡに混入するという
はなはだ不都合な問題を、上述の過程（ｂ）を導入する
ことで解決するものである。
【００１５】以下に本発明をより具体的に説明する。本
発明の方法の過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解手段とし
ては、例えば、酸処理や各種酵素を利用した処理を用い
ることができる。酸処理剤としては、ＤＮＡの分解に用
いられている各種の酸を含む溶液が利用できるが、例え
ばＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）等を用いることができ
る。酵素処理に用いることのできる具体的な酵素として
は、例えば、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡを同程度
に、かつ非特異的に分解するデオキシリボヌクレアーゼ
（deoxyribonuclease）、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮ
Ａを両端から非特異的に分解するＢａｌ ３１ ヌクレ
アーゼ（Bal 31 nuclease）、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖
ＤＮＡ中の一本鎖部分（ニック）を非特異的に分解する
Ｓ１ ヌクレアーゼ（S1 nuclease）やマング ビーン
ヌクレアーゼ（Mung Bean nuclease）、及び一本鎖Ｄ
ＮＡを非特異的に分解するヌクレアーゼＰ1（nuclease
P1）などを挙げることができる。
発明の方法の過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解手段とし
ては、例えば、酸処理や各種酵素を利用した処理を用い
ることができる。酸処理剤としては、ＤＮＡの分解に用
いられている各種の酸を含む溶液が利用できるが、例え
ばＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）等を用いることができ
る。酵素処理に用いることのできる具体的な酵素として
は、例えば、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡを同程度
に、かつ非特異的に分解するデオキシリボヌクレアーゼ
（deoxyribonuclease）、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮ
Ａを両端から非特異的に分解するＢａｌ ３１ ヌクレ
アーゼ（Bal 31 nuclease）、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖
ＤＮＡ中の一本鎖部分（ニック）を非特異的に分解する
Ｓ１ ヌクレアーゼ（S1 nuclease）やマング ビーン
ヌクレアーゼ（Mung Bean nuclease）、及び一本鎖Ｄ
ＮＡを非特異的に分解するヌクレアーゼＰ1（nuclease
P1）などを挙げることができる。
【００１６】過程（ｂ）において処理される土壌懸濁液
は、試験する土壌を緩衝液等の水性媒体に加えて、土壌
粒子や土壌中の微生物を分散、懸濁させることによって
得ることができる。ここで用いる水性媒体としては、回
収しようとする目的のＤＮＡの種類や過程（ｂ）の分解
処理に用いるＤＮＡ分解酵素の種類などに応じて適宜選
択できる。
は、試験する土壌を緩衝液等の水性媒体に加えて、土壌
粒子や土壌中の微生物を分散、懸濁させることによって
得ることができる。ここで用いる水性媒体としては、回
収しようとする目的のＤＮＡの種類や過程（ｂ）の分解
処理に用いるＤＮＡ分解酵素の種類などに応じて適宜選
択できる。
【００１７】このようにして調製した土壌懸濁液の組成
等を、必要であれば、ＤＮＡの分解処理の種類に応じて
更に調整して、ＤＮＡ分解処理（過程ｂ）を行う。例え
ば、ＤＮＡ分解酵素を用いる場合は、必要に応じて土壌
懸濁液に酵素活性に必要な金属イオン等を補添し、また
ｐＨ、塩濃度等の条件を用いる酵素の種類に応じて適宜
調整してからＤＮＡ分解酵素の適量を加えて、用いた酵
素の種類に応じた温度等の条件でＤＮＡ分解処理を行
う。なお、土壌におけるプロテアーゼ活性が強く、ＤＮ
Ａ分解酵素活性を有効に作用させることができない場合
には、土壌懸濁液に例えば７０℃程度の加熱処理等のプ
ロテアーゼを失活させる前処理を行うと良い。また、二
本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにして分解する場合には、二
本鎖ＤＮＡを一本鎖化するための加熱処理等を行ってお
く。
等を、必要であれば、ＤＮＡの分解処理の種類に応じて
更に調整して、ＤＮＡ分解処理（過程ｂ）を行う。例え
ば、ＤＮＡ分解酵素を用いる場合は、必要に応じて土壌
懸濁液に酵素活性に必要な金属イオン等を補添し、また
ｐＨ、塩濃度等の条件を用いる酵素の種類に応じて適宜
調整してからＤＮＡ分解酵素の適量を加えて、用いた酵
素の種類に応じた温度等の条件でＤＮＡ分解処理を行
う。なお、土壌におけるプロテアーゼ活性が強く、ＤＮ
Ａ分解酵素活性を有効に作用させることができない場合
には、土壌懸濁液に例えば７０℃程度の加熱処理等のプ
ロテアーゼを失活させる前処理を行うと良い。また、二
本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにして分解する場合には、二
本鎖ＤＮＡを一本鎖化するための加熱処理等を行ってお
く。
【００１８】ＤＮＡ分解酵素での処理が終了したところ
で、後続の過程（ｃ）で微生物から抽出された目的のＤ
ＮＡが用いたＤＮＡ分解酵素の残存活性で分解されない
ように、このＤＮＡ分解酵素を失活させるための処理を
行う。この処理としては、界面活性剤の存在下で７０℃
程度に土壌懸濁液を加熱する方法などが利用できる。な
お、この過程（ｃ）において小断片化されたＤＮＡは、
後述のＤＮＡ抽出処理後にゲルろ過などの手段により、
これを目的のＤＮＡと分離できる。
で、後続の過程（ｃ）で微生物から抽出された目的のＤ
ＮＡが用いたＤＮＡ分解酵素の残存活性で分解されない
ように、このＤＮＡ分解酵素を失活させるための処理を
行う。この処理としては、界面活性剤の存在下で７０℃
程度に土壌懸濁液を加熱する方法などが利用できる。な
お、この過程（ｃ）において小断片化されたＤＮＡは、
後述のＤＮＡ抽出処理後にゲルろ過などの手段により、
これを目的のＤＮＡと分離できる。
【００１９】過程（ｂ）におけるＤＮＡ分解処理が終了
したところで、土壌懸濁液中において、そこに含まれる
微生物からのＤＮＡの抽出処理を行う（過程ｃ）。この
ＤＮＡ抽出処理には、ガラスビーズを利用した細胞破砕
法、超音波処理、ホモジナイザー処理、加圧型細胞破砕
装置（フレンチプレスなど）処理、凍結融解法等を利用
することができる。
したところで、土壌懸濁液中において、そこに含まれる
微生物からのＤＮＡの抽出処理を行う（過程ｃ）。この
ＤＮＡ抽出処理には、ガラスビーズを利用した細胞破砕
法、超音波処理、ホモジナイザー処理、加圧型細胞破砕
装置（フレンチプレスなど）処理、凍結融解法等を利用
することができる。
【００２０】微生物からのＤＮＡ抽出処理が終了したと
ころで、遠心分離や濾過等の手段によって、土壌懸濁液
の上清を分取し、更にこの上清からＤＮＡをポリエチレ
ングリコールによる沈澱法等の常法により回収し、更に
常法により精製して目的のＤＮＡを得る。このＤＮＡを
目的に応じた分析にかける。例えば微生物の種類に特異
的な塩基配列を有するものがあるかどうか分析すること
で、土壌中におけるその微生物の分布を確認できる。
ころで、遠心分離や濾過等の手段によって、土壌懸濁液
の上清を分取し、更にこの上清からＤＮＡをポリエチレ
ングリコールによる沈澱法等の常法により回収し、更に
常法により精製して目的のＤＮＡを得る。このＤＮＡを
目的に応じた分析にかける。例えば微生物の種類に特異
的な塩基配列を有するものがあるかどうか分析すること
で、土壌中におけるその微生物の分布を確認できる。
【００２１】なお、土壌懸濁液の調製、微生物からのＤ
ＮＡの抽出、上清の分取、上清からのＤＮＡの回収及び
精製の操作、すなわちＤＮＡの分解処理以外は、例えば
Steffanら（Appl. Environ. Microbiol. 54: 2908-2915
(1988)）に記載の直接溶菌法における操作が利用でき
る。
ＮＡの抽出、上清の分取、上清からのＤＮＡの回収及び
精製の操作、すなわちＤＮＡの分解処理以外は、例えば
Steffanら（Appl. Environ. Microbiol. 54: 2908-2915
(1988)）に記載の直接溶菌法における操作が利用でき
る。
【００２２】
実施例１ （デオキシリボヌクレアーゼＩを用いたＤＮＡ分解処理
を利用するＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌ
の０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を７０
℃で３０分間加温、保持した後、室温に冷却してから、
ＭｇＣｌ2を終濃度２０ｍＭ、ＣａＣｌ2を終濃度２０ｍ
Ｍ、デオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ；ＤＮ−２
５）を終濃度１ｍｇ／ｍｌ）となるように加え、３７℃
で２時間反応を行った。酵素反応終了後、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で
１時間処理の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてか
ら、Bead-Beater（Bio-Spec Products, Bartlesville O
kland USA）で５分間処理し、細胞を破砕した。
を利用するＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌ
の０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を７０
℃で３０分間加温、保持した後、室温に冷却してから、
ＭｇＣｌ2を終濃度２０ｍＭ、ＣａＣｌ2を終濃度２０ｍ
Ｍ、デオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ；ＤＮ−２
５）を終濃度１ｍｇ／ｍｌ）となるように加え、３７℃
で２時間反応を行った。酵素反応終了後、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で
１時間処理の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてか
ら、Bead-Beater（Bio-Spec Products, Bartlesville O
kland USA）で５分間処理し、細胞を破砕した。
【００２３】次に、土壌、ガラスビーズ混合物から遠心
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
【００２４】実施例２ （Ｂａｌ ３１ ヌクレアーゼを用いたＤＮＡ分解処理
を利用するＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌ
の０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を７０
℃で３０分間加温、保持した後、室温に冷却してから、
ＭｇＣｌ2を終濃度２０ｍＭ、ＣａＣｌ2を終濃度２０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌを終濃度６００ｍＭ、Ｂａｌ ３１ ヌク
レアーゼ（東洋紡）を１０単位加え、３０℃で２時間反
応を行った。酵素反応終了後、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処理
の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてから、Bead-Bea
ter（Bio-Spec Products, Bartlesville Okland USA）
で５分間処理し、細胞を破砕した。
を利用するＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌ
の０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を７０
℃で３０分間加温、保持した後、室温に冷却してから、
ＭｇＣｌ2を終濃度２０ｍＭ、ＣａＣｌ2を終濃度２０ｍ
Ｍ、ＮａＣｌを終濃度６００ｍＭ、Ｂａｌ ３１ ヌク
レアーゼ（東洋紡）を１０単位加え、３０℃で２時間反
応を行った。酵素反応終了後、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処理
の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてから、Bead-Bea
ter（Bio-Spec Products, Bartlesville Okland USA）
で５分間処理し、細胞を破砕した。
【００２５】次に、土壌、ガラスビーズ混合物から遠心
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
【００２６】実施例３ （ヌクレアーゼＰ1を用いたＤＮＡ分解処理を利用する
ＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌの０．１２
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）を加え、ブレ
ンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を９５℃で５分
間加温、保持した。この加温処理した土壌懸濁液を氷浴
により急冷することにより、そこに含まれる二本鎖ＤＮ
Ａを変性させて一本鎖化した後、これにヌクレアーゼＰ
1（ニッポンジーン）を１００単位加え、３７℃で２時
間反応を行った。酵素反応の後、ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処
理の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてから、Bead-B
eater（Bio-SpecProducts, Bartlesville Okland USA）
で５分間処理し、細胞を破砕した。
ＤＮＡ抽出法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌの０．１２
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）を加え、ブレ
ンダーを用いて懸濁させた。この懸濁液を９５℃で５分
間加温、保持した。この加温処理した土壌懸濁液を氷浴
により急冷することにより、そこに含まれる二本鎖ＤＮ
Ａを変性させて一本鎖化した後、これにヌクレアーゼＰ
1（ニッポンジーン）を１００単位加え、３７℃で２時
間反応を行った。酵素反応の後、ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処
理の後、５ｇのガラスビーズを更に加えてから、Bead-B
eater（Bio-SpecProducts, Bartlesville Okland USA）
で５分間処理し、細胞を破砕した。
【００２７】次に、土壌、ガラスビーズ混合物から遠心
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
【００２８】実施例４ （トリチウムラベルしたチミジンを用いた土壌回収ＤＮ
Ａの純度の評価）土壌中の微生物の菌体に対してSteffa
nら（Appl. Environ. Microbiol. 54: 2908-2915 (198
8)）の手法を用いてトリチウム標識を行った。すなわ
ち、乾燥重量１００ｇの土壌サンプルに水を加え、完全
に水で飽和させた後、これに５ｍｌの滅菌したリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の１００μＣｉのトリ
チウムラベルされたチミジン（１ｍＣｉ／ｍｌ；Dupon
t, NEN Research Products）を加え、２５℃で８時間激
しく浸とうすることによりチミジンを菌体内に取込ませ
た。
Ａの純度の評価）土壌中の微生物の菌体に対してSteffa
nら（Appl. Environ. Microbiol. 54: 2908-2915 (198
8)）の手法を用いてトリチウム標識を行った。すなわ
ち、乾燥重量１００ｇの土壌サンプルに水を加え、完全
に水で飽和させた後、これに５ｍｌの滅菌したリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の１００μＣｉのトリ
チウムラベルされたチミジン（１ｍＣｉ／ｍｌ；Dupon
t, NEN Research Products）を加え、２５℃で８時間激
しく浸とうすることによりチミジンを菌体内に取込ませ
た。
【００２９】このようにして放射標識化した土壌サンプ
ルを用いて、実施例１と同様の方法によりＤＮＡを抽
出、精製した。なお、精製は、土壌懸濁液からの上清か
らＰＥＧ沈澱で得られた沈澱を回収し、これを、エタノ
ール沈澱、ゲルろ過、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法
にかけて精製ＤＮＡを得た。なお、菌体に取込まれなか
かった標識チミジンはＤＮＡの抽出及び精製過程で排除
された。
ルを用いて、実施例１と同様の方法によりＤＮＡを抽
出、精製した。なお、精製は、土壌懸濁液からの上清か
らＰＥＧ沈澱で得られた沈澱を回収し、これを、エタノ
ール沈澱、ゲルろ過、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法
にかけて精製ＤＮＡを得た。なお、菌体に取込まれなか
かった標識チミジンはＤＮＡの抽出及び精製過程で排除
された。
【００３０】得られた精製ＤＮＡ中のトリチウム標識チ
ミジン量を放射線計測器を用いて計量し、電気泳動法を
用いた定量により得られたＤＮＡ量に対するチミジン量
の割合を算出して、ＤＮＡの純度を評価した。得られた
結果を表１に示す。
ミジン量を放射線計測器を用いて計量し、電気泳動法を
用いた定量により得られたＤＮＡ量に対するチミジン量
の割合を算出して、ＤＮＡの純度を評価した。得られた
結果を表１に示す。
【００３１】比較例１ デオキリボヌクレアーゼＩによる処理を行わない以外は
実施例４と同様にして精製ＤＮＡの純度を評価した。得
られた結果を表１に示す。
実施例４と同様にして精製ＤＮＡの純度を評価した。得
られた結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】 実施例５ （酸処理を用いたＤＮＡ分解処理を利用するＤＮＡ抽出
法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌの０．２Ｎ塩酸を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させ、５分間放置した。こ
の懸濁液に水酸化ナトリウムを加え中和の後、１ＭのＴ
ｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を終濃度０．１Ｍとなるよ
うに加え、さらに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処理の後、５ｇ
のガラスビーズを更に加えてから、Bead-Beater（Bio-S
pec Products,Bartlesville Okland USA）で５分間処理
し、細胞を破砕した。
法）土壌サンプル５ｇに１０ｍｌの０．２Ｎ塩酸を加
え、ブレンダーを用いて懸濁させ、５分間放置した。こ
の懸濁液に水酸化ナトリウムを加え中和の後、１ＭのＴ
ｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を終濃度０．１Ｍとなるよ
うに加え、さらに、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
を０．２ｇこれに加え、７０℃で１時間処理の後、５ｇ
のガラスビーズを更に加えてから、Bead-Beater（Bio-S
pec Products,Bartlesville Okland USA）で５分間処理
し、細胞を破砕した。
【００３３】次に、土壌、ガラスビーズ混合物から遠心
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
処理により上清を分取し、更に遠心で得られた沈澱物を
１０ｍｌの０．１２Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８）で２回洗い、それぞれの洗浄で得られた上清を先の
上清と合わせ、これに塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍ
になるように加え、更に５０％のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）８０００を全容量の０．５容量分加え、４
℃で一晩放置した。遠心処理により得られた沈澱物を集
め、常法によりＤＮＡを精製した。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、土壌微生物からの目的
とするＤＮＡの抽出の前に、土壌にフリーの状態で含ま
れる所望としないＤＮＡを分解する過程を導入したこと
で、微生物の細胞内に保持されているＤＮＡは保護した
まま、未分解で土壌中に残存、蓄積している起源不明の
むきだしのＤＮＡ等が選択的に分解されるので、土壌微
生物からのＤＮＡの回収率を良好に維持しつつ、その純
度、すなわち得られたＤＮＡ中に含まれる土壌微生物由
来のＤＮＡの量の割合を高めることが可能となる。
とするＤＮＡの抽出の前に、土壌にフリーの状態で含ま
れる所望としないＤＮＡを分解する過程を導入したこと
で、微生物の細胞内に保持されているＤＮＡは保護した
まま、未分解で土壌中に残存、蓄積している起源不明の
むきだしのＤＮＡ等が選択的に分解されるので、土壌微
生物からのＤＮＡの回収率を良好に維持しつつ、その純
度、すなわち得られたＤＮＡ中に含まれる土壌微生物由
来のＤＮＡの量の割合を高めることが可能となる。
Claims (6)
- 【請求項１】 微生物を含む土壌試料の懸濁液を調製す
る過程（ａ）と、該懸濁液中に含まれる遊離のＤＮＡを
分解する過程（ｂ）と、該過程（ｂ）を経た該懸濁液に
含まれる微生物から該懸濁液中にＤＮＡを抽出する過程
（ｃ）と、該抽出ＤＮＡを該懸濁液の上清から回収する
過程（ｄ）とを有することを特徴とする土壌中の微生物
からのＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項２】 過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解を、酵
素を利用して行う請求項１に記載のＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項３】 過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解を、デ
オキシリボヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、Ｓ
１ヌクレアーゼ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ヌクレアーゼ、
ヌクレアーゼＰ1からなる群より選択された１以上によ
り行う請求項２に記載のＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項４】 過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解が、Ｄ
ＮＡの変性処理を行った後の一本鎖ＤＮＡの分解処理に
より行われる請求項１に記載のＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項５】 ＤＮＡの変性処理が、ＤＮＡの熱変性処
理である請求項４に記載のＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項６】 過程（ｂ）におけるＤＮＡの分解を、酸
処理することにより行う請求項１に記載のＤＮＡの抽出
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02567393A JP3450367B2 (ja) | 1993-02-15 | 1993-02-15 | Ｄｎａの抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02567393A JP3450367B2 (ja) | 1993-02-15 | 1993-02-15 | Ｄｎａの抽出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237771A true JPH06237771A (ja) | 1994-08-30 |
| JP3450367B2 JP3450367B2 (ja) | 2003-09-22 |
Family
ID=12172309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02567393A Expired - Fee Related JP3450367B2 (ja) | 1993-02-15 | 1993-02-15 | Ｄｎａの抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3450367B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100410377C (zh) * | 2006-08-29 | 2008-08-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 |
-
1993
- 1993-02-15 JP JP02567393A patent/JP3450367B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100410377C (zh) * | 2006-08-29 | 2008-08-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3450367B2 (ja) | 2003-09-22 |
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