JPH06205680A

JPH06205680A - Ｅａａ５族のカイニン酸結合性ヒトｃｎｓレセプター類

Info

Publication number: JPH06205680A
Application number: JP5255037A
Authority: JP
Inventors: Rajender Kamboj; ラジエンダー・カンボイ; Candace E Elliott; カンダス・イー・エリオツト; Stephen L Nutt; ステイーブン・エル・ナツト
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-09-17
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 1994-07-26
Also published as: DE69312608T2; ATE156188T1; US6322999B1; EP0588642A1; DE69312608D1; ES2105122T3; EP0588642B1; CA2105804A1; DK0588642T3; CA2105804C; US6333161B1

Abstract

(57)【要約】【構成】カイニン酸結合型のＥＡＡレセプター類等を
コードするポリヌクレオチド及び該ヌクレオチドを組み
込んだ組換え細胞株類。【効果】ＥＡＡレセプター刺激を調節する化合物類の
発見のための道具としての用途がこれらの細胞株類にあ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、神経生物学の分野にお
ける組換えＤＮＡ技術の適用に関する。より具体的に
は、本発明は興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）レセプター類、
特にヒトＥＡＡレセプター類をコードするＤＮＡのクロ
ーニング及び発現に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）において
は、神経衝動の伝達は、「送信用」ニューロンにより放
出される神経伝達物質との間の相互作用により調節され
ており、このニューロンはその後「受信用」ニューロン
上の表面レセプターに結合して中枢神経系の興奮を引き
起こす。Ｌ‐グルタミン酸はＣＮＳ中において最も多量
に存在する神経伝達物質であり、脊椎動物における主要
な興奮性経路を仲介する。そのため、グルタミン酸は興
奮性アミノ酸（ＥＡＡ）として引用され、更に、それに
対して反応するレセプター類は、グルタミン酸レセプタ
ー類、あるいは、より一般的にはＥＡＡレセプター類と
してまちまちに引用されている。

【０００３】哺乳類の脳から単離された組織、及び、様
々な合成ＥＡＡレセプターアゴニスト類を使用したおか
げで、ＥＡＡレセプターの薬理学的性質の知識は幾分洗
練されたものになってきた。ＥＡＡレセプター族の一員
は、現在では、そのようなアゴニスト類に対する特異的
結合に基づき３つの主要型に群別されている。ＥＡＡレ
セプターの一つの型はグルタミン酸に加えアゴニストで
あるＮＭＤＡ（Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸）にも
結合し、これはＥＡＡレセプターのＮＭＤＡ型として引
用される。ＥＡＡレセプターの他の２つのグルタミン酸
結合性型はＮＭＤＡに結合せず、これらは、他の２つの
ＥＡＡレセプターアゴニスト、即ちＡＭＰＡ（α‐アミ
ノ‐３‐ヒドロキシ‐５‐メチル‐イソオキサゾール‐
４‐プロピオン酸）及びカイニン酸に結合する傾向に準
じて命名されている。特に、グルタミン酸に結合するが
ＮＭＤＡには結合せず、かつ、ＡＭＰＡに比べてカイニ
ン酸に対してより強い親和性で結合するレセプター類
は、カイニン酸（ｋｉｎａｔｅ）型のＥＡＡレセプター
として引用されている。同様に、グルタミン酸に結合す
るがＮＭＤＡには結合せず、かつ、カイニン酸に比べて
ＡＭＰＡにより強い親和性で結合するＥＡＡレセプター
類を、ＡＭＰＡ型のＥＡＡレセプターとして引用する。

【０００４】このグルタミン酸結合性ＥＡＡレセプター
族は、生理学的及び医学的に非常に重要である。グルタ
ミン酸は、長期増強作用（学習及び記憶）の多くの側
面、シナプスの可形性の発達、癲癇発作、卒中もしくは
他の酸素欠乏状況後の虚血によって生じる神経損傷、並
びに、他の形態の神経変成過程に関連している。しかし
ながら、これらの過程を調節する治療法の発達には非常
な困難がつきまとっており、それは、選択的結合性薬剤
分子を発見するために用いる、ＥＡＡレセプターの界面
で特異的に相互作用するレセプター物質の均一な原材料
の欠乏に起因している。目下候補薬剤類のスクリーニン
グに使用されている脳由来組織は不均一なレセプター原
材料であり、興味の対照となっているＥＡＡレセプター
／リガンド接続の研究を妨害する多くのレセプター型を
その表面上に保有している。ヒトの治療法の探索は、ヒ
ト起源の脳組織を入手することが限定されていることに
より更に複雑である。従って、興味の対照となっている
レセプターのみを産生するように遺伝子的に処理された
細胞を取得することが望ましい。クローン化された遺伝
子を発現する細胞株を使用することにより、薬剤スクリ
ーニング計画のための、希望するレセプターについて均
一である基質が提供される。

【０００５】カイニン酸型のレセプターをコードすると
思われる非ヒト遺伝子も既に報告されている。Egebjerg
et al., Nature 351:745, 1991 、は、ラットからのＧ
ｌｕＲ６と呼ばれる遺伝子の単離を記載しており、この
遺伝子は配列に関してはＡＭＰＡレセプター遺伝子に関
連しているものの、ＡＭＰＡによっては活性化されず、
むしろグルタミン酸、キスカール酸、特に優先的にはカ
イニン酸により活性化されるレセプターを形成している
（ＷＯ９１／０６６４８も参照せよ）。類似した活性
は、Bettler et al., Neuron, 1992, 8:257 によって報
告されているように、他のラット遺伝子ＧｌｕＲ７の産
物についても記載されている。カエル（Wada et al., N
ature 342:684, 1989 ）、ニワトリ（Gregor et al., N
ature 342:689, 1989 ）、及び、ラット（Werner et a
l., Nature 351:742, 1991 ）からの更に他のカイニン
酸結合性蛋白質が記載されている。これら後述の遺伝子
はカイニン酸に結合する蛋白質類をコードしているが、
これらの蛋白質類はそれらのみが発現される場合には機
能を伴うイオンチャンネルを形成することは容易ではな
い。

【０００６】これらの分子クローニングの進歩のおかげ
で、ＥＡＡレセプター類及びそれらのサブユニットの構
造上の特徴は、それらがラットの脳に存在する場合には
もっと良く理解されている。ＥＡＡレセプター構造の現
行のモデルによると、各々の構造はヘテロ型になってお
り、個々の膜固定性サブユニットから構成されており、
各々は４つの膜透過性領域、及び、ある程度リガンドの
結合特性を指令しかつレセプター複合体により提供され
るイオンゲート機能に寄与する細胞外領域を有してい
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ヒトにおけるＣＮＳ疾
患を治療するのに有効な治療法についての探索において
は、当然のことながら、今日までに単離されているラッ
トレセプター類を用いることで可能となるスクリーニン
グ法に比較して、ヒトの状況をより良く表現する、候補
化合物類に関するスクリーニング法を提供することが非
常に望ましい。ヒトの治療用の化合物類についての適切
なスクリーニング法を作成する目的で、ヒトのレセプタ
ー類をコードするクローン化された遺伝子、及び、これ
らの遺伝子を発現する細胞株類を提供することが特に望
ましい。従って、これらが本発明の目的となっている。

【０００８】ヒトＥＡＡレセプターをコードするＤＮＡ
分子を単離された形態で提供することは、本発明のもう
一つの目的である。

【０００９】カイニン酸結合性ヒトＥＡＡレセプターを
産生するように遺伝子的に処理された細胞を提供するこ
とは、本発明の叉別の目的である。本発明の他の目的
は、本発明の以下に示す説明によって明白になるものと
思われる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明に於いて、ヒトの
脳に固有なＥＡＡレセプター類の一族をコードする遺伝
子が同定されかつその性質が決定された。このヒトＥＡ
Ａレセプター族の代表的な一員であり、ヒトＥＡＡ５ａ
と表示されるものは、ＥＡＡレセプターを代表するよう
な親和性を有するグルタミン酸と結合することに加え、
カイニン酸型ＥＡＡレセプター類に特徴的なリガンド結
合特性をも示すレセプター蛋白質をコードしている。ヒ
トＥＡＡ５ａレセプターの天然に存在する変異体をコー
ドする配列関連型遺伝子も同定され、このレセプター族
の追加的な一員となっており、本明細書中ではヒトＥＡ
Ａ５レセプター族として記載する。

【００１１】従って、本発明の目的は、ＤＮＡもしくは
ＲＮＡのいずれかからなる、ヒトＥＡＡ５レセプターも
しくはそのカイニン酸結合性断片をコードする、単離さ
れたポリヌクレオチドを提供することである。

【００１２】本発明のもう一つの目的は、本明細書中で
定義されたＥＡＡ５族に属するカイニン酸結合性のヒト
ＥＡＡレセプターを産生するように遺伝子的に処理され
ている細胞を提供することである。さらに、本発明の関
連する目的は、そのような細胞類を作製するのに有用な
組換えＤＮＡ構造類及び関連方法類を提供することであ
る。

【００１３】本発明の他の目的は、試験用リガンドとヒ
トＥＡＡレセプターとの間の相互作用を評定するための
方法を提供することであるが、その方法には、遺伝子的
に処理されている本発明の細胞、もしくは、それに由来
する膜調製物を用いて試験用リガンドをインキュベート
し、その後、レセプター／リガンド結合を測定すること
により当該相互作用を評定する段階を含む。

【００１４】本発明の他の側面は本明細書中に記載され
ている発見の様々な適用法を含んでおり、以下に詳細を
記載した説明により、叉、付随する図面により明らかに
なるものと思われる。

【００１５】本発明の好ましい実施態様本発明はヒト起源の興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）レセプタ
ー類に関連し、かつ、より具体的には、本明細書中にお
いてはヒトＥＡＡ５レセプター族と表示されているカイ
ニン酸型のヒトＥＡＡレセプターの新しい族、及び、こ
れらのレセプター類をコードする単離されたポリヌクレ
オチド類に関する。用語「単離された」は、本明細書中
においては、長さが約４，０００ヌクレオチドを一般的
に下回る、更に、別の方法では、他のヒト蛋白質類をコ
ードするＤＮＡから単離された未処理のポリヌクレオチ
ドを意味する。

【００１６】本明細書中で使用されているように、用語
「ヒトＥＡＡ５レセプター」は、ヒトＥＡＡ５ａレセプ
ター、及び、構造的にそのレセプターに関連する、つま
り、そのレセプターと少なくとも９９％のアミノ酸相同
性を共有するＥＡＡ５ａレセプターのカイニン酸結合性
変異体を含むことを意図しており、ＥＡＡ５ａレセプタ
ーの天然に存在する変異体類及び合成由来の変異体もそ
れに含まれる。ヒトＥＡＡ５ａレセプターの天然に存在
する変異体類は、特に、本明細書中においてヒトＥＡＡ
５ｂレセプター及びヒトＥＡＡ５ｃレセプターと表示さ
れるレセプター類を含む。ヒトＥＡＡ５ａレセプターの
合成由来の変異体は、ＥＡＡ５ａと比較して、１つもし
くは複数の、例えば１から１０のアミノ酸置換、欠失、
及び、添加を組込んでいるカイニン酸結合性変異体類を
含む。

【００１７】本明細書中に使用されているように、用語
「カイニン酸結合性」は、本明細書中に記載されている
アッセイ類のような従来の設計のアッセイ類を使用して
決定される、グルタミン酸、ＡＭＰＡ、もしくは、ＮＭ
ＤＡのいずれかと比較してカイニン酸についてより強い
親和性を示すレセプター変異体類及びレセプター断片類
を意味する。

【００１８】ＥＡＡ５レセプター族の天然に存在する各
々の一員は、細胞外性のＮ‐及びＣ‐末端領域を含む、
一般的にＥＡＡレセプター類に特徴的な構造特性を有
し、更に、細胞の表膜中にレセプターを固定化する働き
を担う４つの内部疎水性領域を所有している。

【００１９】ＥＡＡ５ａと表示されるこの特別なヒトＥ
ＡＡレセプターは一本鎖ポリペプチドとして構造的に特
徴付けられる蛋白質であり、これは、もともとは３１残
基のＮ末端シグナルペプチドを有する前駆体形態で産生
され、更に、シグナルペプチドを持たずかつ図１（ＳＥ
ＱＩＤ番号１及び２）において単一文字コードによ
って図示されている配列を成す８７７個のアミノ酸から
なる成熟形態となって細胞表面に輸送される。記述した
ものと別の場合では、用語「ＥＡＡ５レセプター」は、
レセプター蛋白質の成熟形態を意味し、従って、ＥＡＡ
５レセプター類のアミノ酸残基は成熟蛋白質配列に関連
した番号付けが成される。そのレセプターの構造領域に
関しては、ＥＡＡ５ａレセプターのヒドロパシー（hydr
opathy）分析により、ＳＥＱＩＤ番号１及び２の全
てにおいて４つの推定上の膜透過性領域、つまり、残基
５３４‐５５３を含む一つの領域（ＴＭ−１）、残基５
７４‐５９５を含むもう一つの領域（ＴＭ−２）、残基
６０６‐６２４を含む３番目の領域（ＴＭ−３）、及
び、残基７９１‐８１１を含む４番目の領域（ＴＭ−
４）が明らかにされた。その割り振りに基づくと、ヒト
ＥＡＡ５ａレセプター構造は、天然の膜結合型形態にお
いては、５３３個のアミノ酸Ｎ‐末端細胞外領域からな
り、その後に、４つの膜透過性領域及び７７個のアミノ
酸Ｃ‐末端細胞外ドメインが続くものと思われる。

【００２０】図３において示されるように、構造上の関
連性を有し、ヒトの脳組織中に天然に存在するＥＡＡ５
ａレセプターの２つの変異体もやはり同定されており、
ＥＡＡ５ｂ（ＳＥＱＩＤ番号４及び５）レセプター
及びＥＡＡ５ｃ（ＳＥＱＩＤ番号６及び１０）レセ
プターと表示されている。それらをコードする遺伝子の
ヌクレオチド配列から推定されるように、ＥＡＡ５ｂ変
異体は、ＥＡＡ５ａと９９％を上回るアミノ酸相同性を
共有し（ＳＥＱＩＤ番号３、５、７、及び、９）、
位置３２１における単一のアミノ酸変化のみに関して異
なっており、このアミノ酸はＥＡＡ５ａレセプターにお
いてはグルタミン残基であり、ＥＡＡ５ｂレセプターに
おいてはアルギニン残基である。一方、ＥＡＡ５ｃレセ
プターはＥＡＡ５ａのＣ‐末端切断型であり、４８この
アミノ酸に加え、Ｃ‐末端の切断により、最後の２つの
位置においてアミノ酸置換が組み込まれている。

【００２１】ヒトＥＡＡ５レセプター族の他の一員と同
様に、レセプター亜種ＥＡＡ５ａは薬理学的曲線により
特徴付けられているが、これはつまり、リガンド結合
「特性」によるものであり、この特性によりカイニン酸
型の薬理学的特性が強く示されているため、ＮＭＤＡ及
びＡＭＰＡのような他の興奮性アミノ酸レセプター型よ
り際だっていると特徴付けられている。更に、カイニン
酸結合性レセプター類は、薬理学的な意味における機能
を果たすためには複数からなる、そしておそらくはヘテ
ロ型をとるサブユニット構造を必要とするということが
理解されているにも拘らず、ＥＡＡ５ａレセプターのみ
を産生する細胞類は、他のレセプターサブユニットとの
会合に依存せずに興奮性アミノ酸結合の確実な兆候を示
すことが発見されている。従って、本発明の要所となる
側面においては、ヒトＥＡＡ５ａレセプターは、本レセ
プター類と相互作用を行う能力及び／叉は内在性ＥＡＡ
レセプターリガンド類及びその既知の合成アナログ類と
ＥＡＡレセプター相互作用について競合する能力につい
て、候補化合物類をスクリーニングするという目的に利
用される。

【００２２】レセプターと試験用リガンドとの間の相互
作用を評価することにおける用途については、遺伝子処
理技術の応用により、異種性産物としての機能を伴う形
態でのヒトＥＡＡ５レセプターを産生する哺乳類細胞を
作製することが望ましい。このような細胞株類の作製
は、選択された宿主細胞内に、分泌可能形態のヒトＥＡ
Ａ５レセプターをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮ
Ａ構造を組み込ませることにより実行され、つまり、天
然のシグナルペプチドもしくは機能を伴う異種性シグナ
ルペプチド等価物のいずれかを有する形態は、選択され
た宿主内で機能してレセプターをコードするＤＮＡの発
現を行う発現調節性因子と関連しており、そのために希
望するＥＡＡ５レセプター蛋白質を作り出すのである。
このような細胞類は、本明細書においては、「発現可能
な状態」でその細胞中に取り込まれているレセプターコ
ード化ＤＮＡを所有するとして特徴付けている。このレ
セプターコード化ＤＮＡは、このようなＤＮＡが特別な
宿主内に天然に発見されない場合には、特別な細胞性宿
主に関して「異種性」であるとして引用される。

【００２３】ヒトＥＡＡ５レセプターの産生のための宿
主として作用するように選択された特別な細胞型は、原
核生物性と真核生物性のものの両方を含む、この分野に
おいて現在入手することができる数種の細胞型の任意の
ものであることができるが、当然のことながら、興奮性
アミノ酸類に結合することができる表面レセプターを天
然の状態において作り出し、そのために処理された細胞
株から探索されたアッセイ結果を混乱させる細胞型であ
ってはならない。このような問題は従来のものであり、
一般的には、宿主として非神経性細胞型を選択すること
により回避され、又、非ヒト細胞株を使用することによ
り更に回避することができる。それにも拘らず、試験用
リガンドに対する「バックグラウンド」の結合がアッセ
イ結果において説明されるとすれば、神経性でありかつ
ヒト型である細胞が発現宿主類として作用することがで
きるということは評価に価することである。

【００２４】本発明の一つの実施態様によると、ＥＡＡ
５レセプター産生のための宿主として作用するように選
択された細胞株は哺乳類細胞である。現在このような細
胞株の数種の型が遺伝的処理作業に利用可能であり、こ
れらには、Ｐｒｏ５変異体（ＡＴＣＣＣＲＬ１２８
１）を含むＫ１ライン（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）を例
とするチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、
ＣＶ−１ライン（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−
１ライン（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、及び、ＣＯ
Ｓ−７ライン（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）というＳ
Ｖ−４０でトランスフォームさせたアルフリカングリー
ンモンキーの腎臓に由来する線維芽細胞様細胞、マウス
Ｌ‐細胞、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６
５８）、マウスＣ１２７細胞、２９３ライン（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５７３）というヒト胎児の腎臓細胞、Ｈｅ
Ｌａライン（ＡＴＣＣＣＣＬ２）の細胞を含むヒト
の癌細胞、及び、株ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣＣＣＬ
１２７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ１
０）、及び、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣＨＴＢ１
１）という神経芽細胞種細胞がある。

【００２５】様々な遺伝子発現系が、これらの宿主を使
用する用途のために改作されており、これらを現在市販
品として入手することができ、更に、これらの系のうち
の任意の一つを選択してＥＡＡ５レセプターコード化Ｄ
ＮＡの発現を行うことができる。典型的にはプラスミド
ベクターの形態で入手することができるこれらの系は発
現カセットを組み込んでおり、この発現カセットの機能
的構成因子にはＤＮＡで構成されている発現調節配列が
含まれているが、この発現調節配列は宿主認識性であ
り、かつ、その５’端に結合した場合にレセプターコー
ド化ＤＮＡの発現を可能にする。この系は更に、レセプ
ターコード化領域の３’端に結合した場合に発現を停止
するＤＮＡ配列をも組み込んでいる。従って、選択され
た哺乳類細胞宿主における発現のためには組換えＤＮＡ
発現構造が作製されており、その構造内で、分泌型のレ
セプターをコードするＤＮＡは宿主により認識される発
現調節用ＤＮＡ配列につながれており、更に、その構造
は、発現を行うためのレセプターコード化ＤＮＡの５’
端領域、及び、発現を停止するための３’端領域を含ん
でいる。この発現構造を宿しているプラスミドベクター
は、典型的には、通常はウイルスに由来する複製起点の
ような他の機能構成因子を組み込んで、発現宿主内での
プラスミドの複製を可能にさせているが、更に、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌性宿主内でのプラスミド
増幅についての機能構成因子を組み込んでいることが望
ましいとされている。安定した状態で形質転換させられ
た組換え細胞の選択を可能にする標識を提供するため
に、ベクターは、この形質転換細胞の生存に有利になる
ある種の特典を与える遺伝子をも組み込んでおり、それ
らの遺伝子は、ネオマイシンを補足してある培地中にそ
の形質転換細胞が培養される場合のネオマイシン耐性を
コードする遺伝子のようなものである。

【００２６】レセプターコード化ＤＮＡの哺乳類細胞発
現を行うのに使用することができる様々な組換えＤＮＡ
発現系には、唾液腺ウイルス（サイトメガロウイルス）
（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアン
ウイルス（ＳＶ４０）、マウスの哺乳類性腫瘍ウイルス
（ＭＭＴＶ）、及び、その他ものが含まれる。発現を行
うのに有用なものは更に、レトロウイルス類のＬＴＲの
ようなプロモーター類、温度により調節されるプロモー
ターやＤｒｏｓｏｐｈｉｌａから単離されたプロモータ
ーのような昆虫細胞のプロモーター類、並びに、重金属
類により調節されるプロモーター類、つまりメタロチオ
ネイン遺伝子プロモーター、及び、他の、ステロイドで
誘導可能なプロモーター類のような哺乳類の遺伝子プロ
モーター類である。

【００２７】組換えＤＮＡ発現ベクター内への組み込み
については、例えば、ＥＡＡ５ａレセプター、もしく
は、ＥＡＡ５ｂ及びＥＡＡ５ｃレセプター類を含む、そ
の、カイニン酸結合性変異体のような、希望するＥＡＡ
５レセプターをコードするＤＮＡを遺伝子単離もしくは
遺伝子合成の選択された技術を応用することによって取
得することができる。本明細書中における実施例におい
てより詳しく詳細が記載されているように、ＥＡＡ５ａ
レセプター、及び、そのＥＡＡ５ｂ及びＥＡＡ５ｃ変異
体はヒトの脳組織のゲノム内にコードされており、その
ため、従来の遺伝子単離及びクローニング技術を注意深
く適用させることにより取得することができる。この技
術は、典型的には、小脳もしくは海馬組織のようなヒト
の脳組織、更に好ましくは胎児の脳組織のような新鮮な
原材料からの総メッセンジャーＲＮＡの抽出、その後に
続く、ｃＤＮＡへのメッセージの変換、及び、例として
は細菌性プラスミド、より典型的にはプラスミドファー
ジ中でのライブラリーの形成を伴うものである。ヒトの
ＤＮＡの断片類を宿しているこのようなバクテリーファ
ージは、典型的には、個々のファージプラークもしくは
コロニーを単離することができるような、感受性の強い
大腸菌細菌の層においてプレート培養することにより増
殖させる。ファージコロニーにより保持されているＤＮ
Ａを、その後、典型的には、ニトロセルロースもしくは
ナイロンを基にしたハイブリッド形成用膜上に固定化
し、その後、注意深く調節した条件下で、適切な配列で
ある、放射線活性（もしくは他の方法で）ラベル化した
オリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリッド形成
させて、レセプターコード化ＤＮＡもしくはその断片を
保持している特別なファージコロニーを同定する。典型
的には、そのようにして同定された遺伝子もしくはその
一部分を、核酸配列分析のためにプラスミドベクター内
にサブクローン化させる。

【００２８】本発明の具体的な実施態様においては、選
択されたＥＡＡ５レセプターは、ＥＡＡ５ａレセプター
については、図１Ａ〜図１Ｆ（ＳＥＱＩＤ番号１）
において図示されているＤＮＡ配列によりコードされて
おり、ＥＡＡ５ｂ及びＥＡＡ５ｃレセプターについて
は、図３（ＳＥＱＩＤ番号３‐６）において図示さ
れているＤＮＡ配列によりコードされている。理解しや
すい別な方法においては、選択されたレセプターをコー
ドするＤＮＡ配列は、図示されているＤＮＡ配列の同義
コドン等価物であることができる。

【００２９】本明細書中には様々なヒトＥＡＡ５レセプ
ター類のヌクレオチド配列が提供されているが、遺伝子
合成及び／又は増幅の自動化された技術により、それら
をコードするＤＮＡを作製することができるということ
は評価に価するものであろう。ＥＡＡ５レセプターコー
ド化ＤＮＡの長さのために、自動化合成の適用には、長
さが約３００ヌクレオチド間での遺伝子の領域を個々に
合成し、その後、正しい順番で最終組立品にとつなぎ合
わせてゆくという段階的な遺伝子構築が必要である。個
々に合成された遺伝子領域は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）技術を使用して組み立て前に増幅させること
ができる。

【００３０】自動化遺伝子合成技術の適応により、ＥＡ
Ａ５遺伝子族の天然に存在する一員の配列変異体類を作
製する機会が提供されている。例えば先に記載したよう
に、本明細書中に記載されているＥＡＡ５レセプター類
をコードするポリヌクレオチド類を、本明細書中におい
て同定されている天然に存在するポリヌクレオチド配列
内に表現されているコドンを同義コドンで置換すること
により作製することができるということは評価に価する
であろう。更に、本明細書中に記載されているＥＡＡ５
レセプター類の、例えば、一つもしくは複数の単一アミ
ノ酸置換、欠失、もしくは、添加を組み込んでいる合成
変異体類をコードするポリヌクレオチド類を作製するこ
とができる。スクリーニングという目的のために、レセ
プターの天然のリガンド結合曲線を維持しておくことは
大部分のものについて望ましいことであるため、アミノ
酸置換を、同荷電のアミノ酸が置換されるいわゆる同類
置換に限定し、かつまた、置換を、例えば、成熟したレ
セプターの最初の約２０残基分のＮ‐末端、及び、レセ
プタードメインマッピングにおいて説明されているよう
な他の領域内のような、レセプター活性にとって余り重
大でない部位のものに限定することが望ましい。

【００３１】適切な鋳型ＤＮＡを自由に使えれば、ＰＣ
Ｒ増幅の技術を利用して、最終遺伝子の全てもしくは一
部分を直接作製することもできる。この場合には、一固
まりになっているか、あるいは、互いにつなぎ合わせる
ことができる幾つかの固まりになっているかのいずれか
の状態の最終産物のＰＣＲ増幅を開始させるプライマー
類を合成する。これは、平滑末端を有する増幅されたＤ
ＮＡ断片類の段階的接続により、又は、好ましくは、天
然に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を含む断片類
の段階的接続により行うことができる。この適用法にお
いては、ＰＣＲ増幅のための鋳型としてｃＤＮＡもしく
はゲノムＤＮＡのいずれかを使用することが可能であ
る。前者の場合においては、ｃＤＮＡを、海馬及び小脳
を含む様々なヒトの脳組織の、市販品として入手するこ
とが可能な、あるいは、自分で作製したｃＤＮＡライブ
ラリーから取得することができる。

【００３２】これらが取得できたら、レセプターコード
化ＤＮＡを発現のために任意の適切な発現ベクター内に
挿入し、更に、宿主細胞を、ＤＮＡ介在性形質転換、電
気穿孔法、マイクロインジェクション、もしくは、粒子
ショットガン形質転換のような従来の方法を使用してそ
のベクターでトランスフェクトさせる。発現ベクター類
を選択して、レセプターコード化ＤＮＡを一時的にもし
くは安定した方法のいずれかで発現する形質転換させら
れた細胞株類を提供することができる。一過性発現につ
いては、宿主細胞類を典型的には、哺乳類細胞中で機能
する複製起点を宿している発現ベクターで形質転換させ
る。安定性発現については、そのような複製起点は不必
要であるが、ベクター類は典型的には生存に都合の良い
利点を形質転換細胞に付与する産物をコードする遺伝子
を宿しており、それらのベクター類の選択を可能にして
いる。このような選択可能な標識類をコードする遺伝子
には、マイコフェノリン酸に対する耐性を付与する大腸
菌のｇｐｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオマイシン
に対する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５からのｎ
ｅｏ遺伝子、ＤＨＦＲ−細胞のフェノタイプをＤＨＦＲ
＋に変化させるマウス細胞もしくは大腸菌からのｄｈｆ
ｒ配列、及び、ＴＫ−細胞をフェノタイプに関してＴＫ
＋にする単純疱疹ウイルスのｔｋ遺伝子がある。一過性
発現と安定性発現との両方により、形質転換させられた
細胞株、及び、それに由来する膜調製物を、リガンドス
クリーニングアッセイにおける用途のためのに提供する
ことができる。

【００３３】スクリーニングアッセイにおける用途のた
めには、レセプターコード化ＤＮＡを一時的に発現する
細胞類を後々の用途のために冷凍保存することができる
が、早い速度のプラスミド複製が結局は細胞の死を招く
ため、それは一般的には２、３日間とされており、形質
転換させられた細胞類はできる限り早いうちに使用する
べきである。このようなアッセイ類は、未処理の細胞類
もしくはそのような細胞類に由来する膜調製物類を使用
して行うことができる。膜調製物類は、典型的には、リ
ガンド結合実験のためにより都合の良い基質を提供する
ので、結合性基質として好ましい。スクリーニングとい
う目的、つまり、リガンド結合実験のために膜調製物類
を調整するためには、凍結してある未処理の細胞類をし
ばらくの間均一化して冷却水懸濁液にさせ、膜ペレット
を遠心後回収する。その後、このペレットを冷却水中で
洗浄し、透析してグルタミン酸のような内在性ＥＡＡリ
ガンド類を除去するが、そうしないとこれらの内在性リ
ガンドはアッセイにおける結合と競合してしまうのであ
る。その後、透析化した膜を、リガンド結合アッセイに
おいて、それ自体を、あるいは、凍結乾燥型で保存した
後に使用することができる。別の方法として、一過性の
トランスフェクション後約２日で収集した、あるいは、
安定にトランスフェクトさせた細胞類の新鮮なプレート
培養後ほぼ同じ日数の期間を経た後に収集した未処理の
新鮮な細胞類を、膜調製物のために使用したものと同様
な方法によりリガンド結合アッセイのために使用するこ
とができる。細胞類を使用する場合には、細胞類に損傷
を与えないようなより緩和な遠心により細胞類を収集す
る必要があり、更に、全ての洗浄は、例えば、リン酸緩
衝化させた食塩水のような緩衝化させた培地中で行い、
細胞の浸透圧ショックと破裂を避ける必要がある。

【００３４】レセプターコード化ＤＮＡを発現する細胞
類の利用のための別の方法として、ＥＡＡ５レセプター
をコードするメッセンジャーＲＮＡの組み込み後に機能
を伴う膜結合性レセプターを産生する、例えば、アフリ
カツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞のような細
胞を使用してリガンドの性質決定も行うことができる。
この場合には、組み込まれる遺伝子が、Ｔ３もしくはＴ
７バクテリオファージのプロモーター類のようなプラス
ミドベクターにより供給される近隣のＲＮＡ転写プロモ
ーターを介して簡単に転写されることができるように、
本発明のＥＡＡ５レセプター遺伝子を典型的にはプラス
ミドベクター内にサブクローン化させる。その後、ＲＮ
Ａをインビトロにおいて挿入された遺伝子から転写さ
せ、その後更にこれをアフリカツメガエルの卵母細胞中
に注入することができる。ＲＮＡ溶液のｎＬ量の注入
後、この卵母細胞を数日間に及びインキュベートしたま
まにさせ、その後、未処理のままもしくは膜調製物の形
態のいずれかで、浸潤用溶液中に供給される特別なリガ
ンド分子に結合する能力についてテストする。

【００３５】本発明の選択されたヒトＥＡＡ５レセプタ
ーに対する候補リガンドの結合は、典型的には、一般的
に約２５μｇから１００μｇという予め決定された量の
細胞由来性膜（例えば、蛋白質決定法により測定する）
を使用して評定する。一般的には、競合結合アッセイ類
が試験用化合物のカイニン酸と比較した親和性を評定す
るのに有用である。この競合結合アッセイは、様々な濃
度で添加されているラベル化されていない試験用化合物
の存在中で、例えば、［³Ｈ］‐カイニン酸のような放
射線ラベル化したカイニン酸と共に膜調製物をインキュ
ベートすることにより行うことができる。インキュベー
ション後、置換された、つまり結合した放射線ラベル化
カイニン酸を回収及び測定して、基質として使用された
特別なレセプターについての、試験用化合物とカイニン
酸との比較結合親和性を決定することができる。

【００３６】リガンドスクリーニングのための有用な細
胞株類を作製するためにレセプターコード化ＤＮＡを使
用することに加え、本発明の他の側面に従って、ＤＮＡ
の発現を行い可溶性形態のレセプターの断片類を産生さ
せることができ、構造の研究のためには抗体を産生させ
ることができ、更に、他の実験的用途のためにもこれを
行うことができる。カイニン酸結合性断片類、つまり、
リガンド分子の結合の原因となっているＥＡＡ５レセプ
ターの一部分が、細胞の外側に存在している、つまり、
それが細胞外性であることが予期される。従って、最初
の事例においては、大量のかつ単離された形態の、つま
り、残りのレセプターを含まない状態でのこのようなカ
イニン酸結合性断片類を提供することにより、レセプタ
ー‐リガンド相互作用の性質決定を容易にすることが望
まれる。これを行うには、最初の膜透過性ドメイン（Ｔ
Ｍ１）をコードする配列の直ぐ後、つまり、図１Ａ〜図
１Ｆ（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）に示されるように
残基５３４の後の細胞外Ｎ‐末端量域内に翻訳停止コド
ンを組み込ませるように、全長を有するＥＡＡ５レセプ
ターコード化ＤＮＡを部位特異的突然変異誘発により一
部変更することができる。レセプターを膜内に「固定
化」させておく任意の膜透過性ドメインはもはや産生さ
れないため、その結果一部変更させた遺伝子の発現が、
可溶形態における細胞外リガンド結合性ドメインのみの
分泌として生じる。その後、標準的なリガンド結合アッ
セイ類を行って、そのように産生される細胞外ドメイン
に対する候補化合物の結合の度合いを確かめることがで
きる。当然のことながら、単離されたドメインに対する
リガンドの結合の度合いを最高にさせる目的で、部位特
異的突然変異誘発を使用して細胞外領域の異なる様々な
ものを産生する必要があることもある。

【００３７】本発明に従うリガンド結合アッセイ類にお
ける用途のために、レセプターのカイニン酸結合性断片
類を、まず様々な技術の内の一つを使用して固体支持体
に固定化させる。ある方法においては、レセプターペプ
チド断片のＣ‐末端を、例えば、交差結合させたポリス
チレンもしくはポリアミド樹脂のような、誘導化させた
不溶性の重合性支持体に共有結合させることができる。
固体支持体に固定させれば、その断片はレセプター結合
親和性について候補リガンド類をスクリーニングするの
に有用となる。この目的のためには、全長を有するレセ
プターを使用する、先に記載されている競合型リガンド
結合アッセイ類が一般的には使用されている。固体支持
体にしっかりと固定されている断片類は候補リガンドの
存在中において、天然のリガンド、つまり、カイニン酸
に結合する。カイニン酸もしくは候補リガンドの内の一
つを、例えば放射活性でラベル化し、適切なインキュベ
ーション期間の後、カイニン酸置換の度合いを、結合し
たもしくは未結合のラベルの量を測定することにより決
定する。

【００３８】別の方法では、成熟した蛋白質のアミノ末
端に由来するのではなく、むしろその代わりにカルボキ
シ末端に由来するレセプターの細胞外ドメインを産生す
ることが望ましく、それは例えば、４番目の膜透過性ド
メイン（ＴＭ４）の直ぐ後のドメイン類、つまり、図１
Ａ〜図１Ｆ（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）のアミノ酸
残基８１２と８８８との間に存在しているドメイン類で
ある。この場合には、部位特異的突然変異誘発及び／又
はＰＣＲを基にした増幅技術を、興味の対照となってい
るレセプタードメインをコードする遺伝子の定義された
断片を産生させるために使用することができる。遺伝子
断片をコードするＤＮＡが発現ベクターにより提供され
ている翻訳開始コドンの近隣に挿入され、更に、必要な
翻訳読み枠が注意深く保存されているとすると、このよ
うなＤＮＡ配列を使用して、細胞内存在性もしくは分泌
形式のいずれかによる希望するレセプター断片の発現を
支配することができる。

【００３９】このような細胞外リガンド結合性ドメイン
の産生を様々な宿主細胞内で行うことができるというこ
とは評価に価するであろう。ＣＨＯのような哺乳類細胞
をこの目的のために使用することができるが、この発現
は典型的には、例えば、ＣＭＶ（唾液腺ウイルス）のプ
ロモーターのような高レベル発現が可能である発現プロ
モーターにより支配されている。別の方法では、昆虫の
Ｓｆ９（Ｓｐｏｎｄｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）細胞のような非哺乳類細胞類を使用することができ
るが、これらの発現は、典型的には、例えば、強力な後
期ポリヘドリン蛋白質プロモーターのようなバキュロウ
イルスの発現プロモーターにより支配されている。索状
菌類の発現系を使用して、ＥＡＡレセプターのこのよう
な細胞外ドメインを大量に分泌させることもできる。例
えば、発現がａｌｃＡプロモーターにより支配されてい
る為巣性麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａ
ｎｓ）により、このような容認される系を構成すること
が考えられる。このような発現宿主類に加え、更に、細
胞内存在性にせよ細胞外性のものにせよ、異種性の遺伝
子もしくは遺伝子断片を発現することができる任意の原
核生物性もしくは他の真核生物性発現系も同様に容認さ
れるということは評価に価するであろう。

【００４０】例えば、脳組織中において、特にＥＡＡ５
レセプターの存在及び／又は位置を検出することにおけ
る用途のためには、本発明は又、その別の側面におい
て、ヒトＥＡＡ５レセプターに対するラベル化された抗
体を提供する。このような抗体類を作成するためには、
先に記載したような微生物もしくは哺乳類細胞宿主中に
産生される、あるいは、標準的なペプチド合成技術によ
る、未処理で可溶性のレセプターもしくは免疫原性を有
するその断片のいずれかを免疫原として使用することが
できる。免疫原性断片類としての用途に特に適するＥＡ
Ａ５ａレセプターの領域は、特に残基１８７−２０２も
しくは４８６−５２９を含む残基１−５３３からなるペ
プチドのような、レセプターの細胞外領域もしくはその
細胞外領域の一部分に、配列において関連性のある領域
を含み、更に、残基５９６−６０５（ＳＥＱＩＤ番
号１）からなるペプチドのような、膜透過性ドメインＴ
Ｍ−２とＴＭ−３との間の領域に関連しているペプチド
を含む。Ｃ‐末端ドメイン（残基８１２−８８８）から
なるペプチド類もしくはその断片も又、抗体の作成に使
用することができる。実質的には、ヒトＥＡＡ５ｂとＥ
ＡＡ５ｃレセプターの同一領域も又、これらのレセプタ
ー類各々に対する抗体類の産生のために使用することが
できる。

【００４１】ポリクローナル抗体産生のためには、希望
するＥＡＡ５レセプターもしくは免疫原性を有する断片
に対する抗体類の作成を、従来の設計の免疫化計画、及
び、ヒツジ、ヤギ、及び、ウサギのような様々な哺乳類
宿主類を使用して実行することができる。別の方法で
は、モノクローナル抗体の産生のために、脾臓細胞のよ
うな免疫細胞を免疫化した動物から回収し、ハイブリド
ーマ作成技術を使用して骨髄腫細胞類に融合させること
ができる。その後、融合酸部類を選択用培地中で培養す
ることによりスクリーニングし、抗体を産生する細胞類
の継続的な増殖及び抗体の回収のために回収する。回収
された抗体を、その後、放射性ラベル、酵素ラベル、ル
ミネッセントラベル、もしくは、その類のもののような
検出可能なラベルに対して、この目的のために確立され
たリンカー技術を使用して共有結合させることができ
る。

【００４２】例えば、放射ラベル化した形態のような検
出可能なようにラベル化した形態において、ヒトＥＡＡ
５レセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡもしく
はその選択された領域も、本発明の他の側面に従って、
ハイブリッド形成用プローブとして使用して、例えば、
ヒトもしくは他の哺乳類のゲノム（もしくはｃＤＮＡラ
イブラリー）中に存在する配列関連性遺伝子を同定す
る、あるいは、脳組織のような標本中のＥＡＡ５コード
化ＤＮＡの位置を決定することができる。このことは、
例えば３２Ｐのようなもので放射ラベル化されているヌ
クレオチドを内部に取り込ませてある、未処理のコーデ
ィング領域もしくはその断片のいずれかを使用して行う
ことができる。標本中のＥＡＡ５コード化ＤＮＡを同定
するためには、そのＤＮＡをコードする全長分のｃＤＮ
Ａ、あるいは、そのＤＮＡに対して特有な断片のいずれ
かを利用することが望ましい。図１Ａ〜図１Ｆ（ＳＥＱ
ＩＤ番号１及び２）及びそこに示されているヌクレ
オチド番号を参照してみると、そのようなヌクレオチド
断片類は少なくとも約１７個の核酸からなる配列を含ん
でおり、そうでない場合には、配列において、レセプタ
ーのＮ‐末端もしくはＣ‐末端をコードする領域に関連
している、あるいは、その５’端の未翻訳もしくは３’
端の未翻訳領域を表現する配列を含んでいる。当然のこ
とながら、これらの配列、及び、未処理の遺伝子そのも
の自体を利用してＥＡＡ５関連性ヒト遺伝子類、特にそ
のｃＤＮＡ等価物を、標準的なハイブリッド形成技術に
よりクローン化させることもできる。

【００４３】本発明の実施態様は、以下に示す具体的な
実施例において説明されるが、これらの実施例は制限と
してみなすべきものではない。

【００４４】実施例１ヒトＥＡＡ５ａレセプターをコ
ードするＤＮＡの単離ヒトＥＡＡ５ａレセプターをコードするｃＤＮＡは、St
ratagene Cloning Systems社（La Galea, California,
U.S.A.）から大腸菌を基にしたラムダーファージライブ
ラリー（ラムダーＺＡＰ）として入手したヒト胎児脳の
ｃＤＮＡを探索することにより同定した。このｃＤＮＡ
ライブラリーを、Bettler et al によりNeuron, 1990,
5:583 において報告されているラットのＧｌｕＲ５レセ
プター配列の３’端領域に対してアニーリングすること
が可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリ
ーニングした。３２Ｐ‐ラベル化したプローブの特異的
配列（ＳＥＱＩＤ番号１１）を以下に示す。

【００４５】５’‐ＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡ
ＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＴＧＣ‐
３’ 胎児脳のｃＤＮＡライブラリーは、以下に示すハイブリ
ッド形成条件下でスクリーニングした。６×ＳＳＣ、２
５％のホルムアミド、５×デンハート溶液、１０ｍＭの
Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液、０．５％のピロリン酸ナトリウ
ム、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変成させた
サケ精子ＤＮＡ、４２℃。フィルターを０．５％のＳＤ
Ｓを含む６×ＳＳＣで、２５℃で５分間洗浄し、その
後、０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、４２℃で１
５分間洗浄した。最終洗浄は、０．５％のＳＤＳを含む
１×ＳＳＣで、５０℃において１５分間行った。フィル
ターを一晩Ｘ‐線フィルム（Kodak 社）に露出させた。
スクリーニングした１０⁶個のクローンの内、２つのｃ
ＤＮＡ挿入断片のみが同定された。一つはＲＫＣＳ５Ｆ
１３１と表示される約３．３ｋｂの挿入断片で、もう一
つのものはＲＫＣＳ５Ｆ８１と表示される約２．７ｋｂ
の挿入断片である。配列決定のために、’１３１及び’
８１ファージをプラーク精製し、その後、提供者の仕様
書に従ってファゲミドとして切断し、ファゲミドベクタ
ー類の挿入断片保持化ブルースクリプト‐ＳＫ変異体類
を作製した。’１３１クローンの全体の配列にわたる配
列決定により、約８５９塩基からなる３’非コーディン
グ領域及び約２．４ｋｂのコーディング領域と共に停止
コドンが明らかにされた。’８１挿入断片全体の配列決
定により、’１３１との顕著な重複が明らかにされ、
又、推定上のＡＴＧ開始コドンが位置していないもの
の、幾つかの５’端配列が提供された。

【００４６】’８１配列中には開始コドンは現われてい
ないので、遺伝子の５’領域を探索した。この目的のた
めに、’８１配列の５’端を表現している０．６５ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を単離し、³²Ｐ‐ラベル化し、その
後、以下に示すハイブリッド形成条件下で、同一の胎児
脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用
した。６×ＳＳＣ、２５％のホルムアミド、５×デンハ
ート溶液、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変成
させたサケ精子ＤＮＡ、４２℃。フィルターを０．５％
のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、２５℃で５分間という条
件で２度洗浄し、その後、０．５％のＳＤＳを含む２×
ＳＳＣで、４２℃で１５分間最終洗浄を行った。これに
より２つの挿入断片が同定され、その一つは、ＲＫＣＡ
Ｇ１３２と表示される約３．９ｋｂのもので、もう一つ
は、ＲＫＣＡＧ１１２と表示される約３．３ｋｂのもの
である。’１３２挿入断片全体の配列決定により、幾つ
かの追加的な５’配列が明らかにされたが、依然として
開始コドンは現われてこなかった。配列決定した際、’
１１２挿入断片では、５’非コーディング領域の約２４
塩基と共に開始コドンが、更に、’１３２挿入断片との
顕著な重複が明らかにされた。

【００４７】昆虫のクローン中のコーディング領域全体
を提供する最初の段階として、’１３２挿入断片中の配
列関連性領域とハイブリッド形成することが可能な２本
のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。この５’
プライマーは、後続のクローニング作業を容易にさせる
ための、共通Ｋｏｚａｋ配列（Kozak,Nucl. Acids Re
s., 1987, 15:8125 により報告されている共通翻訳開始
配列）、推定上のＡＴＧ開始コドン、及び、’１１２挿
入断片の５’端配列、並びに、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位
を有する非ハイブリッド形成化フランクセグメントを取
り込むように設計されている。従来の技術を使用して合
成されたこの２本のプライマー（各々ＳＥＱＩＤ番
号１２及び１３）の配列を以下に記載する。

【００４８】プライマー１：５’‐ＧＧＧＧＴＴＴＡＡ
ＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＣＴＣＣＣ
ＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＴＣＴ‐３’ プライマー２：５’‐ＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣ
ＴＴＴＧＴ‐３’ その後、鋳型として’１３２のＤＮＡを使用して、この
プライマーを使用して、共通Ｋｏｚａｋ配列、開始コド
ン、及び’１１２挿入配列と共通している５’端配列を
含む配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増
幅させた。反応混合物類は、１００μｌ中に、１０ｎｇ
の’１３２ＤＮＡ、１２５ｐモルの各プライマー、及
び、２ＵのＴａｑポリメラーゼ（１０ｍＭのトリス‐Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂中、更に、０．２ｍＭの各デオキシリボヌクレ
オチド種を含んでいる）。その後、９５℃／１分、６０
℃／３０秒、７２℃／２分を４周期、その後、９５℃／
１分、７２℃／２分３０秒を２１周期、後に、７２℃／
１０分の最終周期を１周期を行った。予期されていた
２．７ｋｂの長さを有する増幅化産物を作製した。

【００４９】その後、レセプターの全コーディング領域
を提供するために、図２に描かれている方法を適用させ
て、４．２ｋｂのｐｃＤＮＡ１ファゲミドをバックグラ
ウンドとする３．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ
挿入断片としての未処理のＥＡＡ５ａレセプターコード
化ＤＮＡを保持するファゲミドｐｃＣＮＤＡ１／ｈｕｍ
ＥＡＡ５ａを作製した。４．２ｋｂのファゲミドｐｃＤ
ＮＡ１は、InvitrogenCorporation 社（San Diego, Ca
lifornia, USA；カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市
販品として入手することができる。これは真核生物系に
おけるｃＤＮＡ発現、及び、原核生物におけるｃＤＮＡ
分析の為に設計された多機能ベクターである。ベクター
上に組み込まれているものは、ＣＭＶプロモーター及び
エンハンサー、スプライスセグメント及びポリアデニル
化シグナル、ＳＶ４０及びポリオーマウイルスの複製起
点、及び、配列決定及び突然変異誘発の為に一本鎖ＤＮ
Ａを救済するためのＭ１３の起点、センス及びアンチセ
ンスＲＮＡの産生のためのＳｐ６及びＴ７のＲＮＡプロ
モーター類、及び、ＣｏｌＥ１様の多コピー用プラス
ミド起点である。ポリリンカーは、ＣＭＶプロモーター
（及び、Ｔ７プロモーターの３’端）のほぼ下流側に位
置している。ｐｃＤＮＡ１ベクター上に取り込まれてい
るレセプターコード化ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ挿入
断片の全配列を図１に示している（ＳＥＱＩＤ番号
１及び２）。

【００５０】ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＥＡＡ５ａと表示さ
れる７．８ｋｂのファゲミドは、４．２ｋｂのｐｃＤＮ
Ａ１ファゲミドをバックグラウンドとする３．６ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ挿入断片としてのレセプタ
ーコード化ＤＮＡを保持しており、これをブダペスト条
約の条項に基づき、１９９２年８月２６日に米国のMary
land州Rockville 市にあるAmerican Type Culture Coll
ectionに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５２９６が割り
当てられている。

【００５１】実施例２ヒトＥＡＡ５ａレセプターを産
生する遺伝子的に処理された細胞類の作製哺乳類細胞宿主内における発現のためには、実施例１に
おいて記載されているように取得されたｐｃＤＮＡ１／
ｈｕｍＥＡＡ５ａを、一過性発現のためにＣＯＳ−１ラ
インであるサル由来の線維芽細胞様細胞（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ１６５０として米国のMaryland州Rockville 市に
あるAmerican Type Culture Collectionから入手するこ
とができる）内に組み込ませた。

【００５２】ＥＡＡ５ａコード化ＤＮＡの一過性発現の
ために、ＣＯＳ−１細胞を、１０⁶個のＣＯＳ−１細胞
当たり約８μｇのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＥＡＡ
５ａとして）でＤＥＡＥ仲介性ＤＮＡトランスフェクシ
ョンによりトランスフェクトさせ、更に、従来の方法に
従い、クロロキンで処理した。手短に述べると、ＣＯＳ
−１を５×１０６細胞／培養皿の密度でプレート培養
し、その後、ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中
で２４時間増殖させた。その後、培地を除去し、細胞
を、ＰＢＳ中で、後に培地中で洗浄した。その後、その
細胞に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥＡＥデキストラ
ン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、１００μＭのクロロキン、１
０％のＮｕＳｅｒｕｍ、ＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を
含む１０ｍｌのトランスフェクション用溶液を懸けた。
３７℃における３時間のインキュベーションの後、細胞
を先ほど記載したようにＰＢＳ及び培地中で洗浄し、そ
の後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に含まれる１０％のＤＭ
ＳＯで１分間ショックを与えた。細胞を１０％のＦＢＳ
を補足した培地中で２、３日間増殖させ、インキュベー
ションの最後に、培養皿を氷上に置き、氷冷ＰＢＳで洗
浄し、その後、細胞を掻き取った。その後、細胞を、１
０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心により収集し、リ
ガンド結合アッセイにおける後続の用途のために細胞ペ
レットを液体窒素中で凍結させた。凍結細胞の解凍分注
のノザンブロット分析により、保存した細胞中のレセプ
ターコード化ｃＤＮＡの発現が立証された。

【００５３】類似した方法で、安定にトランスフェクト
させられた細胞株類を、宿主としての２つの異なる細胞
種：ＣＨＯＫ１及びＣＨＯＰｒｏ５を使用して調整
することもできる。これらの細胞株を作製するために、
ヒトＥＡＡ５ａをコードするｃＤＮＡを、安定な発現を
可能にする哺乳類の発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Invi
trogen社）中に挿入する。この部位における挿入によ
り、ｃＤＮＡは唾液腺ウイルスのプロモーターの発現調
節下、及び、ウシの成長ホルモン遺伝子のポリアデニル
化部位及びターミネーターの上流で、かつ、選択可能
な標識としてのネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０の初
期プロモーターにより支配されている）を含むベクター
のバックグラウンド中に置かれる。

【００５４】先に記載したように作製したプラスミド類
を取り込ませるためには、宿主のＣＨＯ細胞をまず１０
％のＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地中に５×１０⁵とい
う密度で撒く。２４時間の増殖の後、新鮮な培地を培養
皿に添加し、３時間後に細胞を、リン酸カルシウム‐Ｄ
ＮＡ共沈殿法（Maniatis et al、上述）を使用してトラ
ンスフェクトする。手短に述べると、３μｇのＤＮＡを
混合して、室温で１０分間、緩衝化させたカルシウム溶
液でインキュベートする。等容量の緩衝化リン酸溶液を
添加し、懸濁液を室温で１５分間インキュベートする。
次に、インキュベートした懸濁液を４時間細胞にかぶ
せ、除去し、その後、１５％のグリセロールを含む培地
で細胞にショックを与える。３時間後、細胞を培地で洗
浄し、正常な増殖条件下で２４時間インキュベートす
る。ネオマイシンに対して耐性である細胞を、Ｇ４１８
（１ｍｇ／ｍｌ）を含む、１０％のＦＢＳを補足してあ
るアルファー‐ＭＥＭ培地中で選択する。Ｇ４１８‐耐
性細胞の個々のコロニーを約２、３週間後に単離し、ク
ローンの選択を行い、その後、アッセイの目的のために
増殖させる。

【００５５】実施例３ＥＡＡ５ａレセプター変異体コ
ード化ＤＮＡの単離及びクローニングヒトＥＡＡ５ｂ及びＥＡＡ５ｃレセプターをコードする
ｃＤＮＡをも、実施例１において記載したように、Stra
tagene社により提供されるヒト胎児脳のｃＤＮＡライブ
ラリーを探索することにより同定した。同一のオリゴヌ
クレオチドプローブを利用して、ライブラリーからこれ
らの変異体レセプター類をコードするｃＤＮＡを抽出し
た。更に、取得できたら、実施例２において詳細を記載
してある方法を使用して、各変異体レセプターについて
のｃＤＮＡを、それぞれの一過性発現のために哺乳類の
ＣＨＯ細胞中にクローン化させた。

【００５６】実施例４リガンド結合アッセイ凍結状態でのトランスフェクトさせた細胞を、手動ホモ
ゲナイザーを使用して氷冷蒸留水中に再懸濁させ、５
０，０００ｇで２０分間遠心した。上清を棄却し、膜ペ
レットを−７０℃下に保存した。

【００５７】ＣＯＳ細胞の膜ペレットを氷冷した５０ｍ
Ｍのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５５、５℃）中に懸濁さ
せ、結合について競合すると思われる内在性グルタミン
酸を除去する目的で、５０，０００ｇで１０分間、再度
遠心した。ペレットを、氷冷した５０ｍＭのトリス‐Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５５）緩衝液中に再懸濁させ、結果とし
て生じた膜調製物を、以下に記載する結合実験のための
組織原材料として使用した。蛋白質は、標準物質として
ＢＳＡを用い、Ｐｉｅｒｃｅ試薬を使用して決定した。

【００５８】その後、結合アッセイを、蛋白質測定法に
より判定された２５‐１００μｇに等価な量のＣＯＳ由
来膜、及び、選択された放射ラベル化リガンドを使用し
て実行した。とりわけ、カイニン酸結合アッセイについ
ては、インキュベーション混合物は、１ｍｌの最終容量
の冷却インキュベーション緩衝液中に含まれる、２５‐
１００μｇの組織蛋白質及び［ビニリデン‐³Ｈ］カイ
ニン酸（５８Ｃｉ／ｍモル、最終濃度８５ｎＭ）からな
っていた。非特異的結合は１ｍＭのＬ‐グルタミン酸の
存在下で決定した。試料を氷上で６０分間インキュベー
トし、結合したリガンド及び未結合のリガンドを、ＰＨ
Ｄ細胞ハーベスター及び予め氷冷した０．３％のポリエ
チレンイミン中に浸してあるＧＦ／Ｂフィルターを使用
する高速濾過法により分離した。フィルターは、４ｍｌ
の冷却インキュベーション用緩衝液中で２度洗浄し、そ
の後、計数のために、５ｍｌのBeckman 社のReady-Prot
ein Plusシンチレーション用カクテル溶液と共にシンチ
レーション用バイアル瓶に入れた。

【００５９】ＡＭＰＡ結合アッセイについては、インキ
ュベーション用混合物は、０．１ＭのＫＳＣＮ及び２．
５ｍＭのＣａＣｌ２からなる１ｍｌの最終容量に含まれ
る、２５‐１００μｇの組織蛋白質、及びＤ，Ｌ‐α‐
［５‐メチル‐³Ｈ］アミノ‐３‐ヒドロキシ‐５‐メ
チルイソオキサゾール‐４‐プロピオン酸（³Ｈ‐ＡＭ
ＰＡ、２７．６Ｃｉ／ｍモル、最終濃度１０ｎＭ）から
なっていた。非特異的結合は、１ｍＭのＬ‐グルタミン
酸の存在下で決定した。試料を氷上で６０分間プラスチ
ック製ニミバイアル瓶中でインキュベートし、結合した
リガンド及び未結合のリガンドを５０，０００ｇにおけ
る３０分間の遠心により分離した。ペレットは、４ｍｌ
の冷却インキュベーション用緩衝液中で２度洗浄し、そ
の後、計数のために、５ｍｌのBeckman Ready-Protein
Plusシンチレーション用カクテル溶液シンチレーション
用バイアル瓶に添加した。

【００６０】スキャチャード分析により、組換え体によ
り発現されるヒトＥＡＡ５ａレセプターは、約２．７２
±０．１２ｎＭの解離計数（Ｋｄ）を有する単一種の［
³Ｈ］‐ラベル化カイニン酸塩結合部位を含んでいるこ
とが明らかにされた（図４）。更に、ＥＡＡ５ａレセプ
ターの最高カイニン酸塩結合は、５６４７±１１４０ｆ
モル／ｍｇ蛋白質であることが発見されている。

【００６１】ＣＯＳ細胞中のＥＡＡ５ａレセプターにつ
いて［³Ｈ］‐カイニン酸塩置換アッセイも実行して選
択されたリガンド類の比較結合親和性を決定した。図５
において図示されているように、これらの結果により、
ＥＡＡ５ａレセプターに対する３Ｈ‐カイニン酸結合を
置換することにおけるリガンド類の効力の等級は以下に
示すようなものであることを示している。

【００６２】ドモイン酸＞カイニン酸＞ジヒドロカイニ
ン酸＞ＤＮＱＸ＞Ｌ‐グルタミン酸＝ＣＮＱＸ＞キスカ
ール酸＞＞ＡＭＰＡこれらの結果により、ヒトＥＡＡ５ａレセプターが特異
的にカイニン酸に結合していることが明らかに証明され
た。ＡＭＰＡもしくはＮＭＤＡのいずれの結合も証明す
ることができないほどわずかであるか、あるいは、全く
存在しないという事実と結び合わせると、この活性は、
ＥＡＡ５ａレセプターがＥＡＡレセプターのカイニン酸
型のものであるということに起因することは明らかであ
る。更に、この結合曲線はこのレセプターが信頼すべき
方法で機能していることを示しており、従って、この結
合曲線により、未処理のヒトの脳からの非組換えレセプ
ター相対物のリガンド結合「特性」を信頼性をもって予
測することができる。これらの特色により、組換えレセ
プターは、そのレセプターに結合するリガンド化合物類
の選択及び性質決定、及び／又は、このレセプターを他
のリガンド類に置換することにより反応することができ
るかもしれない化合物類の選択及び性質決定について特
に有用なものとなっている。純粋な形態におけるＥＡＡ
５ａレセプター遺伝子の単離は、そのレセプター遺伝子
を単一で均一なレセプター種として発現することが可能
であるため、ヒトの脳からの複雑で不均一なレセプター
調製物を使用してこのような性質決定を試みる場合に伴
う正確さの欠如を本リガンド結合アッセイから取り去っ
たのである。

【００６３】配列リスト（１）一般情報（ｉ）出願者（Ａ）名前：Ｋａｍｂｏｊ，Ｒａｊｅｎｄｅｒ（Ｂ）街路名：２８６９ＡｒｖｉｄａＣｉｒｃｌｅ（Ｃ）市：Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ（Ｄ）州もしくは省：Ｏｎｔａｒｉｏ（Ｅ）国：Ｃａｎａｄａ（Ｆ）郵便番号：ＬＳＶ１Ｒ４（ｉ）出願者（Ａ）名前：Ｅｌｌｉｏｔ，ＣａｎｄａｃｅＥ．（Ｂ）街路名：７４ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎＳｔｒｅ
ｅｔ，Ａｐｔ．＃１（Ｃ）市：Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ（Ｄ）州もしくは省：Ｏｎｔａｒｉｏ（Ｅ）国：Ｃａｎａｄａ（Ｆ）郵便番号：Ｍ８Ｖ２Ｌ２（ｉ）出願者（Ａ）名前：Ｎｕｔｔ，ＳｔｅｐｈｅｎＬ．（Ｂ）街路名：７４ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎＳｔｒｅ
ｅｔ，Ａｐｔ．＃１（Ｃ）市：Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ（Ｄ）州もしくは省：Ｏｎｔａｒｉｏ（Ｅ）国：Ｃａｎａｄａ（Ｆ）郵便番号：Ｍ８Ｖ２Ｌ２（ｉｉ）発明の名称：ＥＡＡ５族のカイニン酸結合性ヒ
トＣＮＳレセプター類（ｉｉｉ）配列数：１３（ｉｖ）通信用住所（Ａ）住所：Ｆｏｌｅｙ＆Ｌａｒｄｎｅｒ（Ｂ）街路名：Ｓｕｉｔｅ５００，３０００Ｋ
Ｓｔｒｅｅｔ（Ｃ）市：Ｎ．Ｗ．（Ｄ）州：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：２０００７−５１０９（ｖ）コンピューター解読可能形態：（Ａ）媒質種：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ可変性（Ｃ）作動システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエアー：ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａ
ｓｅ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（ｖｉ）現行の出願データ：（Ａ）出願番号：不明（ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報：（Ａ）名前：Ｂｅｎｔ，ＳｔｅｐｈｅｎＡ．（Ｂ）登録番号：２９，７６８（Ｃ）照合／付箋番号：１６７７７／１９２（ｉｘ）電話通信情報：（Ａ）電話：（２０２）６７２−５３００（Ｂ）テレファックス：（２０２）６７２−５３９９（Ｃ）テレックス：９０４１３６（ｘ）以前の出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０７／９４５，２１０（Ｂ）提出年月日：１９９２年９月１７日（２）ＳＥＱＩＤ番号１についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：３６１９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：２本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キーワード：ｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：１６．．１０８（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キーワード：ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）位置：１０９．．２７７２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キーワード：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１６．．２７７２（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号１：

【００６４】

【化１】

【００６５】

【化２】

【００６６】

【化３】

【００６７】

【化４】

【００６８】

【化５】（２）ＳＥＱＩＤ番号２についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：９１９個のアミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：蛋白質（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号２：

【００６９】

【化６】

【００７０】

【化７】

【００７１】

【化８】

【００７２】

【化９】（２）ＳＥＱＩＤ番号３についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：２本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号３：

【００７３】

【化１０】（２）ＳＥＱＩＤ番号４についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：２本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号４：

【００７４】

【化１１】（２）ＳＥＱＩＤ番号５についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：２本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号５：

【００７５】

【化１２】（２）ＳＥＱＩＤ番号６についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：２本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号６：

【００７６】

【化１３】（２）ＳＥＱＩＤ番号７についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５０アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖状：一本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ペプチド（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号７：

【００７７】

【化１４】（２）ＳＥＱＩＤ番号８についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５０アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ペプチド（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号８：

【００７８】

【化１５】（２）ＳＥＱＩＤ番号９についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５０アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖状：一本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ペプチド（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号９：

【００７９】

【化１６】（２）ＳＥＱＩＤ番号１０についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：３７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖状：一本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ペプチド（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号１０：

【００８０】

【化１７】（２）ＳＥＱＩＤ番号１１についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：４０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号１１：

【００８１】

【化１８】（２）ＳＥＱＩＤ番号１２についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：５４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号１２：

【００８２】

【化１９】（２）ＳＥＱＩＤ番号１３についての情報：（ｉ）配列性質：（Ａ）長さ：２０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖状：１本鎖（Ｄ）形態：直線（ｉｉ）分子種：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤ配列番号１３：

【００８３】

【化２０】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図１Ｂ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図１Ｃ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図１Ｄ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図１Ｅ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図１Ｆ】（ＳＥＱＩＤ番号１及び２）は、本発明
の興奮性アミノ酸レセプターをコードするＤＮＡを含む
ｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列、及び、その配列
の推定アミノ酸配列を提供する。

【図２】図１において図示されているＤＮＡ配列を宿す
発現ベクターを作製するのに使用した方法を、直線のプ
ラスミド地図を使用して図示している。

【図３Ａ】（ＳＥＱＩＤ番号３‐１０）は、図１Ａ
〜図１Ｆと関連させて、そこに図示されているＥＡＡレ
セプターの天然に存在する変異体類のＤＮＡ及びアミノ
酸配列を示している。

【図３Ｂ】（ＳＥＱＩＤ番号３‐１０）は、図１Ａ
〜図１Ｆと関連させて、そこに図示されているＥＡＡレ
セプターの天然に存在する変異体類のＤＮＡ及びアミノ
酸配列を示している。

【図４】図１Ａ〜図１Ｆ（ＳＥＱＩＤ番号１及び
２）において提供されているコーディング領域から発現
されるＥＡＡレセプターのリガンド結合特性を図示して
いる。

【図５】図１Ａ〜図１Ｆ（ＳＥＱＩＤ番号１及び
２）において提供されているコーディング領域から発現
されるＥＡＡレセプターのリガンド結合特性を図示して
いる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 15/62 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/566 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 8314−4ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 593137299 ステイーブン・エル・ナツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１ (72)発明者ラジエンダー・カンボイカナダ国、オンタリオ・エル・０・ピー・１・エイ・０、ミシソウガ、アービダ・サークル・2869 (72)発明者カンダス・イー・エリオツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１ (72)発明者ステイーブン・エル・ナツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＥＡＡ５レセプター、もしくは、ヒ
トＥＡＡ５レセプターのカイニン酸結合性断片をコード
する領域を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】請求項１に記載されている単離されたポ
リヌクレオチドであって、当該領域がヒトＥＡＡ５ａレ
セプターをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】ＥＡＡ５ａレセプターの変異体をコード
する領域を含む単離されたポリヌクレオチドであって、
当該変異体が当該ＥＡＡ５ａレセプターと少なくとも９
９％のアミノ酸相同性を共有するポリヌクレオチド。
【請求項４】請求項３に記載されている単離されたポ
リヌクレオチドであって、当該変異体が、ヒトＥＡＡ５
ｂレセプター及びヒトＥＡＡ５ｃレセプターの群から選
択されるポリヌクレオチド。
【請求項５】請求項１から４のいずれか一つにおいて
定義されているポリヌクレオチドを取り込ませてある組
換えＤＮＡ構造物。
【請求項６】カイニン酸結合性ヒトＥＡＡレセプター
を産生するように遺伝子工学的に処理されている細胞で
あって、請求項５において定義されている組換え構造物
を発現可能な状態で取り込んでいる該細胞。
【請求項７】請求項６において定義されている細胞で
あって、哺乳類細胞である細胞。
【請求項８】請求項６もしくは７において定義されて
いる細胞に由来するカイニン酸結合性膜調製物。
【請求項９】ヒトＥＡＡレセプターの実質的に均一な
原材料を取得するための方法であって、請求項１から４
のいずれか一つにおいて定義されているポリヌクレオチ
ドを発現可能な状態で取り込ませてある細胞を培養し、
更にその後、培養した細胞を回収する段階を含む方法。
【請求項１０】ヒトＣＮＳレセプターに結合させるた
めの試験用リガンドをアッセイする方法であって、適切
な条件下において請求項６において定義されてるヒトＥ
ＡＡ５レセプター産生細胞もしくはそれに由来する膜調
製物と試験用リガンドをインキュベートし、更にその
後、ヒトＥＡＡ５レセプターと試験用リガンドとの間の
結合の程度を決定する段階を含む方法。
【請求項１１】ヒト起源の他の蛋白質を本質的に含ま
ない形態でのヒトＥＡＡ５レセプター。
【請求項１２】請求項１１において定義されているヒ
トＥＡＡ５レセプターであって、ヒトＥＡＡ５ａ、ＥＡ
Ａ５ｂ、及び、ＥＡＡ５ｃレセプターからなる群から選
択されるヒトＥＡＡ５レセプター。
【請求項１３】ヒトＥＡＡ５ａ、ＥＡＡ５ｂ、及び、
ＥＡＡ５ｃレセプターからなる群から選択されるヒトＥ
ＡＡ５レセプターのカイニン酸結合性断片。
【請求項１４】ヒトＥＡＡ５ａ、ＥＡＡ５ｂ、及び、
ＥＡＡ５ｃレセプターからなる群から選択されるヒトＥ
ＡＡ５レセプターに結合する抗体。
【請求項１５】ヒトＥＡＡ５ａ、ＥＡＡ５ｂ、及び、
ＥＡＡ５ｃレセプターからなる群から選択されるヒトＥ
ＡＡ５レセプターの免疫原性断片。
【請求項１６】少なくとも約１７個の核酸を含み、か
つ、請求項１から４のいずれか一つにおいて定義されて
いるポリヌクレオチドと選択的にハイブリッド形成する
オリゴヌクレオチド。