JPH06197795A - Determination of hydrogen peroxide - Google Patents
Determination of hydrogen peroxideInfo
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- JPH06197795A JPH06197795A JP35874992A JP35874992A JPH06197795A JP H06197795 A JPH06197795 A JP H06197795A JP 35874992 A JP35874992 A JP 35874992A JP 35874992 A JP35874992 A JP 35874992A JP H06197795 A JPH06197795 A JP H06197795A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、過酸化水素の測定方法
に関する。更に詳しくは、パーオキシダーゼ(以下PO
Dという)及び一般式FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring hydrogen peroxide. More specifically, peroxidase (hereinafter PO
D) and general formula
【化2】 (式中、R1 及びR3 は、水素原子、炭素数1〜4のア
ルキル基又はスルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアル
カリ金属塩基の置換基を有する炭素数1〜4の置換アル
キル基、R2 及びR4 は、スルホ基、水酸基もしくはス
ルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する炭素数1〜
4の置換アルキル基、R5 は、水素原子、塩素原子、臭
素原子、ヨウ素原子、炭素数1〜4のアルキル基又は−
N(R9 )R10で表わされる基であり、R9 は水素原
子、炭素数1〜4のアルキル基又は、スルホ基、水酸基
もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有する
炭素数1〜4の置換アルキル基、R10はスルホ基、水酸
基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置換基を有す
る炭素数1〜4の置換アルキル基、R6 ,R7 及びR8
は、水素原子、炭素数1〜4のアルキル基又は炭素数1
〜3のアルコキシ基である)。で表わされるトリフェニ
ルメタン誘導体を用いる過酸化水素の測定方法におい
て、スパーオキシドジスムターゼ(以下SODという)
の存在下行う過酸化水素の測定方法に関する。[Chemical 2] (In the formula, R 1 and R 3 are each a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a sulfo group, a substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having a substituent of an alkali metal base such as a hydroxyl group or a sulfo group, R 2 and R 4 are each a sulfo group, a hydroxyl group or a C1-C1 substituent having a substituent of an alkali metal base of the sulfo group.
4 is a substituted alkyl group, R 5 is a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or-
R ( 9 ) is a group represented by N (R 9 ) R 10 , wherein R 9 has a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a sulfo group, a hydroxyl group, or a substituent of an alkali metal base such as a sulfo group, 4 substituted alkyl group, R 10 is a sulfo group, a hydroxyl group or a substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having a substituent of an alkali metal base of a sulfo group, R 6 , R 7 and R 8
Is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or 1 carbon atom
~ 3 alkoxy groups). In the method for measuring hydrogen peroxide using the triphenylmethane derivative represented by the formula, superoxide dismutase (hereinafter referred to as SOD)
And a method for measuring hydrogen peroxide in the presence of.
【0002】[0002]
【従来の技術】従来、過酸化水素を測定する方法とし
て、PODの存在下トリンダー試薬と4−アミノアソチ
ピリンとを反応させて、生成する酸化縮合色素を測定す
る方法が知られている(K.Tamaoku;Ana
l.Chim.Acta.;136,121−127
(1982))。このトリンダー試薬を用いる方法で
は、過酸化水素の濃度が1μM程度までの試料しか測定
することができず高感度測定試薬の出現が望まれてい
た。この問題点を解決するため、PODと発色試薬とし
てトリフェニルメタン誘導体とを用いる方法が見い出さ
れ、過酸化水素の測定に用いられている(特願平3−3
51199号参照)。2. Description of the Related Art Heretofore, as a method for measuring hydrogen peroxide, a method has been known in which a Trinder reagent and 4-aminoasothipyrin are reacted in the presence of POD to measure an oxidative condensation dye produced (K. .Tamaoku; Ana
l. Chim. Acta. 136 , 121-127
(1982)). With the method using the Trinder reagent, only a sample having a hydrogen peroxide concentration up to about 1 μM can be measured, and the advent of a highly sensitive measurement reagent has been desired. In order to solve this problem, a method using POD and a triphenylmethane derivative as a color-developing reagent has been found and used for the measurement of hydrogen peroxide (Japanese Patent Application No. 3-3).
51199).
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかし、トリフェニル
メタン誘導体を用いることにより過酸化水素の濃度が
0.3μM程度までの測定が可能となったものの、臨床
検査の分野の分析においては更なる高感度化が要求され
ているのが現状である。そして有効な測定方法の出現が
久しく期待されていた。However, although the hydrogen peroxide concentration of up to about 0.3 μM can be measured by using the triphenylmethane derivative, it is much higher in the analysis in the field of clinical examination. The current situation is that sensitivity is required. And the appearance of an effective measurement method was expected for a long time.
【0004】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、更なる高
感度過酸化水素の測定方法を見い出すべく鋭意研究した
結果、過酸化水素を含む溶液に、PODと前記一般式
(I)で表わされるトリフェニルメタン誘導体を用いる
方法において、更にSODを加えて行う測定方法を見い
出し本発明を完成した。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted extensive studies to find a method for measuring highly sensitive hydrogen peroxide, and as a result, in a solution containing hydrogen peroxide, POD and the above general formula (I) were used. In the method using the represented triphenylmethane derivative, the present invention has been completed by finding a measuring method performed by further adding SOD.
【0005】本発明の測定方法は、まず過酸化水素を含
む検体に溶液中で発色試薬として前記一般式(I)で表
わされるトリフェニルメタン誘導体、POD及びSOD
とを加えて反応させ、生成する色素を測定することによ
り行うことができる。測定に用いる前記一般式(I)で
表わされるトリフェニルメタン誘導体は、10〜500
μMであればよく、好ましくは100〜200μM用い
ることができる。またPODの添加量は、100〜1
0,000U/Lであり、好ましくは1,000〜3,
000U/Lである。SODの添加量は、10,000
〜1,000,000U/Lであるが、効率よく行うた
めには60,000〜200,000U/Lである。In the measuring method of the present invention, first, a triphenylmethane derivative represented by the above-mentioned general formula (I), POD and SOD, is used as a coloring reagent in a solution containing a sample containing hydrogen peroxide.
It can be carried out by adding and reacting with each other and measuring the resulting dye. The triphenylmethane derivative represented by the general formula (I) used for the measurement is 10 to 500.
It may be μM, and preferably 100 to 200 μM can be used. The amount of POD added is 100 to 1
50,000 U / L, preferably 1,000 to 3,
It is 000 U / L. The amount of SOD added is 10,000
Although it is ~ 1,000,000 U / L, it is 60,000-200,000 U / L for efficient performance.
【0006】反応は、pHが5〜8の緩衝液中で行うこ
とが好ましく、用いる緩衝液としては、例えばトリス−
コハク酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等を挙げることが
できる。反応は、10〜50℃で行うことができるが、
通常37℃付近で行うことが好ましい。反応後の色素の
測定は、反応溶液を一定時間反応させた後、吸光度を測
定するか又は、反応停止液を加えた後吸光度を測定する
方法により行うことができる。さらに吸光度の変化率を
測定するレート法を用いて測定を行うこともできる。ま
た、さらに本発明の測定対象物である過酸化水素の代り
にPODの活性測定も行うことができる。The reaction is preferably carried out in a buffer solution having a pH of 5 to 8, and the buffer solution used is, for example, Tris-
Examples thereof include succinate buffer solution and Tris-HCl buffer solution. The reaction can be carried out at 10 to 50 ° C,
Usually, it is preferably carried out at around 37 ° C. The dye after the reaction can be measured by reacting the reaction solution for a certain period of time and then measuring the absorbance, or by adding a reaction stop solution and then measuring the absorbance. Further, the measurement can be performed using a rate method for measuring the rate of change in absorbance. Furthermore, the activity of POD can also be measured in place of hydrogen peroxide, which is the measurement object of the present invention.
【0007】本発明の測定物質である過酸化水素は、検
体中に含まれる過酸化水素の他、例えば酵素反応等によ
り生成する過酸化水素も測定対象とすることができる。
この過酸化水素の生成反応としては、基質と酸化酵素と
の反応を挙げることができ、例えばグルコースとグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオ
キシダーゼ、尿酸とウリカーゼ、ガラクトースとガラク
トースオキシダーゼ、乳酸と乳酸オキシダーゼ等の反応
である。すなわち、酵素反応により生成する過酸化水素
を測定することにより、基質量の測定又は酸化酵素活性
の測定を行うことができる。The hydrogen peroxide, which is the substance to be measured according to the present invention, can be measured in addition to hydrogen peroxide contained in a sample, for example, hydrogen peroxide produced by an enzymatic reaction or the like.
Examples of the reaction for producing hydrogen peroxide include a reaction between a substrate and an oxidase. For example, a reaction between glucose and glucose oxidase, cholesterol and cholesterol oxidase, uric acid and uricase, galactose and galactose oxidase, lactic acid and lactate oxidase, etc. Is. That is, by measuring the hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction, it is possible to measure the substrate mass or the oxidase activity.
【0008】本発明で用いるSODとしては、市販又は
容易に入手可能なSODを用いることができ、例えばC
u−SOD,Zn−SOD,EC−SOD(Extra
Cellular),Mn−SOD,Fe−SOD等
を挙げることができる。As the SOD used in the present invention, a commercially available or easily available SOD can be used.
u-SOD, Zn-SOD, EC-SOD (Extra
Cellular), Mn-SOD, Fe-SOD, and the like.
【0009】また前記一般式(I)で表わされるトリフ
ェニルメタン誘導体は、市販されているトリフェニルメ
タン骨格を有する化合物のほか、特願平3−35119
9号に示されるトリフェニルメタン誘導体等を挙げるこ
とができる。このトリフェニルメタン誘導体としては、
例えば4,4′,4″−トリ〔N,N−ジ(3−スルホ
プロピル)アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)アミノ−2−メトキシフェニル)〕〔4−(N,N
−ジエチルアミノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)アミノフェニル)〕〔4−(N,N−ジエチルアミ
ノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔4−
(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロ
ピル)アミノ−2−メチルフェニル)〕〔4−(N,N
−ジエチルアミノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)アミノ−2−メトキシフェニル)〕〔4−(N,N
−ジメチルアミノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)アミノフェニル)〕〔4−(N,N−ジメチルアミ
ノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム塩、ビス〔4−
(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロ
ピル)アミノ−2−メチルフェニル)〕〔4−(N,N
−ジメチルアミノ)フェニル〕メタン 二ナトリウム
塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)アミノフェニル)〕(4−クロロフェニル)メタン
二ナトリウム塩、ビス〔4−(N−エチル−N−(3
−スルホプロピル)アミノフェニル)〕(4−ヒドロキ
シフェニル)メタン 二ナトリウム塩、ビス〔4−(N
−エチル−N−(3−スルホプロピル)アミノフェニ
ル)〕(2−スルホフェニル)メタン 三ナトリウム塩
等を挙げることができる。The triphenylmethane derivative represented by the general formula (I) is not only a commercially available compound having a triphenylmethane skeleton, but also Japanese Patent Application No. 3-35119.
Examples thereof include triphenylmethane derivatives shown in No. 9. As the triphenylmethane derivative,
For example, 4,4 ', 4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt, bis [4- (N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) amino- 2-methoxyphenyl)] [4- (N, N
-Diethylamino) phenyl] methane disodium salt, bis [4- (N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aminophenyl)] [4- (N, N-diethylamino) phenyl] methane disodium salt, bis [ 4-
(N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) amino-2-methylphenyl)] [4- (N, N
-Diethylamino) phenyl] methane disodium salt, bis [4- (N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) amino-2-methoxyphenyl)] [4- (N, N
-Dimethylamino) phenyl] methane disodium salt, bis [4- (N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aminophenyl)] [4- (N, N-dimethylamino) phenyl] methane disodium salt, Screw [4-
(N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) amino-2-methylphenyl)] [4- (N, N
-Dimethylamino) phenyl] methane disodium salt, bis [4- (N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aminophenyl)] (4-chlorophenyl) methane disodium salt, bis [4- (N-ethyl) -N- (3
-Sulfopropyl) aminophenyl)] (4-hydroxyphenyl) methane disodium salt, bis [4- (N
-Ethyl-N- (3-sulfopropyl) aminophenyl)] (2-sulfophenyl) methane trisodium salt and the like can be mentioned.
【0010】[0010]
【実施例】本発明を以下に示す実施例によりさらに詳細
に説明する。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
【0011】実施例1 過酸化水素の測定 SOD 120,000U/L、POD1,500U/
L及び4,4,′4″−トリ〔N,N−ジ(3−スルホ
プロピル)アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム
塩150μMを含むトリス−コハク酸緩衝液(pH=
6.5,50mM)の試液1mlに過酸化水素(0〜2
50μM)を含む被検液10μlを加え37℃で10分
間放置した。放置後、波長595nmにて過酸化水素を
含まない被検液を対照に吸光光度計により吸光度を測定
した。同様にして前記試液からSODを除いて測定した
ものと比較し、その結果を図1に示す。Example 1 Measurement of hydrogen peroxide SOD 120,000 U / L, POD 1,500 U /
Tris-succinate buffer (pH = 150 μM of L and 4,4, '4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt (pH =
Hydrogen peroxide (0 to 2
10 μl of a test solution containing 50 μM) was added and left at 37 ° C. for 10 minutes. After standing, the absorbance was measured with an absorptiometer using a test solution containing no hydrogen peroxide at a wavelength of 595 nm as a control. Similarly, it was compared with that measured by removing SOD from the test solution, and the result is shown in FIG.
【0012】実施例2 グルコースの測定(1) グルコースオキシダーゼ(アスペルギウス由来、天野製
薬社製)50,000U/L、ムタロターゼ(ブタ腎臓
由来、天野製薬社製)10,000U/L、SOD12
0,000U/L、POD1,500U/L、4,
4,′4″−トリ〔N,N−ジ(3−スルホプロピル)
アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウム塩150μ
Mを含むトリス−コハク酸緩衝液(pH=6.5、50
mM)の試液2mlにグルコース(0〜7mg/dl)を含む
被検液10μlを加え、37℃で10分間放置した。放
置後、波長、595nmにて0mg/dlグルコースを対照
に吸光度を測定した。同様にして前記試液からSODを
除いて測定したものと比較し、その結果を図2に示す。Example 2 Measurement of glucose (1) Glucose oxidase (derived from Aspergius, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 50,000 U / L, mutarotase (derived from porcine kidney, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 10,000 U / L, SOD12
50,000 U / L, POD 1,500 U / L, 4,
4, '4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl)
Amino] triphenylmethane hexasodium salt 150μ
Tris-succinate buffer containing M (pH = 6.5, 50
10 μl of a test solution containing glucose (0 to 7 mg / dl) was added to 2 ml of a test solution of mM), and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. After standing, the absorbance was measured at a wavelength of 595 nm with 0 mg / dl glucose as a control. Similarly, it was compared with that measured by removing SOD from the test solution, and the result is shown in FIG.
【0013】実施例3 グルコースの測定(2) 実施例2で用いた4,4′,4″−トリ〔N,N−ジ
(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔4−〔(N−エチル−N
−(3−スルホプロピル)アミノ〕フェニル〕〔4−
(N,N−ジエチルアミノ)フェニル〕メタン 二ナト
リウム塩を用いた試液を用い実施例2と同様にグルコー
スを測定し吸光度を測定した。その結果を図3に示す。Example 3 Measurement of glucose (2) 4,4 ', 4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane used in Example 2
Bis [4-[(N-ethyl-N
-(3-Sulfopropyl) amino] phenyl] [4-
Glucose was measured and absorbance was measured in the same manner as in Example 2 using a test solution containing (N, N-diethylamino) phenyl] methane disodium salt. The result is shown in FIG.
【0014】実施例4 グルコースの測定(3) 実施例2で用いた4,4′,4″−トリ〔N,N−ジ
(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩の代りにビス〔4−〔(N−エチル−N
−スルホプロピル)アミノ〕フェニル〕(4−クロロフ
ェニル)メタン二ナトリウム塩を用いた試液を用い、実
施例2と同様にグルコースを測定し吸光度を測定した。
その結果を図4に示す。Example 4 Measurement of glucose (3) 4,4 ', 4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane used in Example 2
Bis [4-[(N-ethyl-N
Using a reagent solution containing -sulfopropyl) amino] phenyl] (4-chlorophenyl) methane disodium salt, glucose was measured and absorbance was measured in the same manner as in Example 2.
The result is shown in FIG.
【0015】実施例5 コレステロールの測定 コレステロールオキシダーゼ(ストレプトマイセス属由
来、旭化成社製)50,000U/L、コレステロール
エステラーゼ(シュードモナス属由来、旭化成社製)1
0,000U/L、SOD120,000U/L、PO
D1,500U/L、4,4′,4″−トリ〔N,N−
ジ(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩150μMを含むトリス−コハク酸緩
衝液(pH=6.5,50mM、TritonX−10
0 0.1%を含む)の試液2mlにコレステロール(0
〜10mg/dl)を含む被検液10μlを加え、37℃で
5分間放置した。放置後波長595nmにて0mg/dlコ
レステロールを対照に吸光度を測定した。同様にして前
記試液からSODを除いて測定したものと比較し、その
結果を図5に示す。Example 5 Measurement of cholesterol Cholesterol oxidase (derived from Streptomyces, manufactured by Asahi Kasei) 50,000 U / L, cholesterol esterase (derived from Pseudomonas, manufactured by Asahi Kasei) 1
50,000U / L, SOD120,000U / L, PO
D1,500U / L, 4,4 ', 4 "-Tri [N, N-
Di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt containing 150 μM Tris-succinate buffer (pH = 6.5, 50 mM, Triton X-10)
Cholesterol (0% is included) in 2 ml of test solution (0%)
10 μl of a test solution containing 10 mg / dl) was added and left at 37 ° C. for 5 minutes. After standing, the absorbance was measured at a wavelength of 595 nm with 0 mg / dl cholesterol as a control. Similarly, it was compared with that measured by removing SOD from the test solution, and the result is shown in FIG.
【0016】実施例6 尿酸の測定 ウリカーゼ(酵母由来、東洋紡績社製)50,000U
/L、SOD120,000U/L、POD1,500
U/L、4,4′,4″−トリ〔N,N−ジ(3−スル
ホプロピル)アミノ〕トリフェニルメタン 六ナトリウ
ム塩150μMを含むトリス−コハク酸緩衝液(pH=
8.5,50mM)の試液2mlに尿酸(0〜5mg/dl)
を含む被検液10μlを加え、37℃で5分間放置し
た。放置後、波長595nmにて0mg/dl尿酸を対照に
吸光度を測定した。同様にして前記試液からSODを除
いて測定したものと比較し、その結果を図6に示す。Example 6 Measurement of uric acid Uricase (derived from yeast, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 50,000 U
/ L, SOD120,000U / L, POD1,500
U / L, 4,4 ′, 4 ″ -tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane tris-succinate buffer solution (pH = 150) containing 150 μM hexasodium salt
Uric acid (0 to 5 mg / dl) in 2 ml of the test solution (8.5, 50 mM)
10 μl of a test solution containing the above was added and left at 37 ° C. for 5 minutes. After standing, the absorbance was measured at a wavelength of 595 nm with 0 mg / dl uric acid as a control. Similarly, it was compared with that measured by removing SOD from the test solution, and the result is shown in FIG.
【0017】実施例7 ガラクトースの測定 ガラクトースオキシダーゼ(ダクチリウム由来、東洋紡
績社製)1000U/L、SOD120,000U/
L、POD1,500U/L、4,4′,4″−トリ
〔N,N−ジ(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェ
ニルメタン 六ナトリウム塩150μMを含むトリス−
コハク酸緩衝液(pH=7.0,50mM)の試液2ml
にガラクトース(0〜5mg/dl)を含む被検液10μl
を加え、37℃で5分間放置した。放置後波長595n
mにて0mg/dlガラクトースを対照に吸光度を測定し
た。同様にして前記試液からSODを除いて測定したも
のと比較し、その結果を図7に示す。Example 7 Measurement of galactose Galactose oxidase (derived from dactylium, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 1000 U / L, SOD 120,000 U /
Tris-containing L, POD 1,500 U / L, 4,4 ′, 4 ″ -tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt 150 μM
2 ml of succinate buffer solution (pH = 7.0, 50 mM)
10 μl of test solution containing galactose (0-5 mg / dl)
Was added and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes. Wavelength after standing 595n
Absorbance was measured at m with 0 mg / dl galactose as a control. Similarly, it was compared with the one obtained by removing SOD from the test solution, and the result is shown in FIG. 7.
【0018】実施例8 乳酸の測定 乳酸オキシダーゼ(ダクチリウム由来、旭化成社製)1
000U/L、SOD120,000U/L、POD
1,500U/L、4,4′,4″−トリ〔N,N−ジ
(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェニルメタン
六ナトリウム塩150μMを含むトリス−コハク酸緩衝
液(pH=7.0,50mM)の試液2mlに乳酸(0〜
5mg/dl)を含む被検液10μlを加え、37℃で5分
間放置した。放置後波長595nmにて0mg/dl乳酸を
対照に吸光度を測定した。同様にして前記試液からSO
Dを除いて測定したものと比較し、その結果を図8に示
す。Example 8 Measurement of Lactic Acid Lactic acid oxidase (derived from dactylium, manufactured by Asahi Kasei Corp.) 1
000U / L, SOD120,000U / L, POD
1,500 U / L, 4,4 ', 4 "-tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane
Lactic acid (0 to 0 ml) was added to 2 ml of a Tris-succinate buffer solution (pH = 7.0, 50 mM) containing 150 μM hexasodium salt.
10 μl of a test solution containing 5 mg / dl) was added and left at 37 ° C. for 5 minutes. After standing, the absorbance was measured at a wavelength of 595 nm with 0 mg / dl lactic acid as a control. Similarly, from the test solution to SO
The results are shown in FIG. 8 in comparison with those measured with the exception of D.
【0019】実施例9 グルコースオキシダーゼの活性測定 140mMグルコース、SOD120,000U/L、
POD2,000U/L、4,4′,4″−トリ〔N,
N−ジ(3−スルホプロピル)アミノ〕トリフェニルメ
タン 六ナトリウム塩150μMを含むトリス−コハク
酸緩衝液(pH=5.5,50mM)3mlを37℃の恒
温セル(1cm角)に入れ、20分間放置する。セル内の
温度が一定になったならばグルコースオキシダーゼ(0
〜200U/L)を含む被検液50μlを添加して、波
長595nmにて吸光度の増加量を測定した。同様にし
てSODを含まない試液にて測定したものと比較し、そ
の結果を図9に示す。Example 9 Measurement of glucose oxidase activity 140 mM glucose, SOD 120,000 U / L,
POD 2,000 U / L, 4,4 ', 4 "-Tri [N,
3 ml of tris-succinate buffer solution (pH = 5.5, 50 mM) containing 150 μM of N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt was placed in a 37 ° C. constant temperature cell (1 cm square), and 20 Leave for a minute. If the temperature in the cell becomes constant, glucose oxidase (0
˜200 U / L) was added to the test solution (50 μl), and the increase in absorbance was measured at a wavelength of 595 nm. Similarly, the measurement results were compared with those measured using a reagent solution containing no SOD, and the results are shown in FIG.
【0020】[0020]
【発明の効果】本発明の方法は、実施例に示された通り
PODと前記一般式(I)で表わされるトリフェニルメ
タン誘導体を用い、SODの存在下に行うことにより過
酸化水素濃度として0.1μM程度までの測定が可能で
ある。従来の方法に比べ2〜4倍の感度で行うことがで
きる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The method of the present invention uses POD and the triphenylmethane derivative represented by the general formula (I) as shown in the examples, and is carried out in the presence of SOD to obtain a hydrogen peroxide concentration of 0. It is possible to measure up to about 1 μM. It can be performed with 2 to 4 times the sensitivity as compared with the conventional method.
【図1】本発明による過酸化水素の測定図である。FIG. 1 is a measurement diagram of hydrogen peroxide according to the present invention.
【図2】本発明による発色試薬として4,4′,4″−
トリ〔N,N−ジ(3−スルホプロピル)アミノ〕トリ
フェニルメタン 六ナトリウム塩を用いたグルコースの
測定図である。FIG. 2 shows 4,4 ′, 4 ″ -as a color developing reagent according to the present invention.
It is a measurement diagram of glucose using tri [N, N-di (3-sulfopropyl) amino] triphenylmethane hexasodium salt.
【図3】本発明による発色試薬としてビス〔4−〔(N
−エチル−N−スルホプロピル)アミノ〕フェニル〕
〔4−(N,N−ジエチルアミノ)フェニル〕メタン
二ナトリウム塩を用いたグルコースの測定図である。FIG. 3 is a bis [4-[(N
-Ethyl-N-sulfopropyl) amino] phenyl]
[4- (N, N-diethylamino) phenyl] methane
It is a measurement diagram of glucose using a disodium salt.
【図4】本発明による発色試薬としてビス〔4−〔(N
−エチル−N−スルホプロピル)アミノ〕フェニル〕
(4−クロロフェニル)メタン 二ナトリウム塩を用い
たグルコースの測定図である。FIG. 4 is a bis [4-[(N
-Ethyl-N-sulfopropyl) amino] phenyl]
It is a measurement diagram of glucose using (4-chlorophenyl) methane disodium salt.
【図5】本発明によりコレステロールを測定した時の測
定図である。FIG. 5 is a measurement diagram when measuring cholesterol according to the present invention.
【図6】本発明により尿酸を測定した時の測定図であ
る。FIG. 6 is a measurement diagram when measuring uric acid according to the present invention.
【図7】本発明によりガラクトースを測定した時の測定
図である。FIG. 7 is a measurement diagram when measuring galactose according to the present invention.
【図8】本発明により乳酸を測定した時の測定図であ
る。FIG. 8 is a measurement diagram when measuring lactic acid according to the present invention.
【図9】本発明によりグルコースオキシダーゼの活性を
測定した時の測定図である。FIG. 9 is a measurement diagram when measuring the activity of glucose oxidase according to the present invention.
Claims (1)
水素の測定方法において、スパーオキシドジスムターゼ
の存在下行うことを特徴とする該測定方法。(式中、R
1 及びR3 は、水素原子、炭素数1〜4のアルキル基又
はスルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩
基の置換基を有する炭素数1〜4の置換アルキル基、 R2 及びR4 は、スルホ基、水酸基もしくはスルホ基の
アルカリ金属塩基の置換基を有する炭素数1〜4の置換
アルキル基、 R5 は、水素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、
炭素数1〜4のアルキル基又は−N(R9 )R10で表わ
される基であり、 R9 は水素原子、炭素数1〜4のアルキル基又は、スル
ホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の置
換基を有する炭素数1〜4の置換アルキル基、R10はス
ルホ基、水酸基もしくはスルホ基のアルカリ金属塩基の
置換基を有する炭素数1〜4の置換アルキル基、R6 ,
R7 及びR8 は、水素原子、炭素数1〜4のアルキル基
又は炭素数1〜3のアルコキシ基である)。1. A peroxidase and a general formula: In the method for measuring hydrogen peroxide using the triphenylmethane derivative represented by the formula 1, the method is carried out in the presence of superoxide dismutase. (In the formula, R
1 and R 3 are a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a sulfo group, a substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having a substituent of an alkali metal base such as a hydroxyl group or a sulfo group, R 2 and R 4 are A sulfo group, a substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having a substituent of a hydroxyl group or an alkali metal base of a sulfo group, R 5 represents a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom,
An alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a group represented by -N (R 9 ) R 10 , wherein R 9 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a sulfo group, a hydroxyl group or an alkali metal sulfo group. A substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having a base substituent, R 10 is a sulfo group, a substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms having an alkali metal base substituent of a hydroxyl group or a sulfo group, R 6 ,
R 7 and R 8 are hydrogen atom, an alkyl group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms having 1 to 4 carbon atoms).
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---|---|---|---|---|
JP2005110507A (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-28 | Arkray Inc | Method for stabilizing reagent |
JP2013542731A (en) * | 2010-10-23 | 2013-11-28 | ポップ テスト エルエルシー | Apparatus and formulations and methods for detecting, examining and monitoring the level of specific components in body fluids |
CN103760160A (en) * | 2014-01-25 | 2014-04-30 | 福州大学 | Colorimetric detection method of hydrogen peroxide |
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- 1992-12-28 JP JP04358749A patent/JP3097370B2/en not_active Expired - Fee Related
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