JPH06189798A - プローブによるｄｎａの測定 - Google Patents

プローブによるｄｎａの測定

Info

Publication number
JPH06189798A
JPH06189798A JP5237457A JP23745793A JPH06189798A JP H06189798 A JPH06189798 A JP H06189798A JP 5237457 A JP5237457 A JP 5237457A JP 23745793 A JP23745793 A JP 23745793A JP H06189798 A JPH06189798 A JP H06189798A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
sequence
probe
seq
sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP5237457A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3759629B2 (ja
Inventor
Rebecca L Reynolds
エル．レイノルズ レベッカ
P Sean Walsh
ウォルシュ ピー．シーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPH06189798A publication Critical patent/JPH06189798A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3759629B2 publication Critical patent/JP3759629B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は試料中に含まれるヒトＤＮＡの量の
評価のための方法および試薬、並びに試料中に含まれる
ＤＮＡの品質の評価のための方法および試薬を提供す
る。 【構成】 前者の方法は、固定化された試料ＤＮＡをヒ
トゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡ配列にハイブリダ
イズするビオチン化オリゴヌクレオチドプローブにハイ
ブリダイズせしめる。次いで結合したプローブへのスト
レプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼの結合に
より、ルミノール系試薬とＸ線フィルムを使った化学発
光検出を可能にする。後者の方法は、試料をアガロース
ゲル電気泳動によりサイズ分画し、次いで固定化し、ビ
オチン化オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズ
せしめ、そして本発明の量評価方法において使ったよう
な化学発光法を使って検出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中に含まれるヒト
の核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの量と品質を評
価する方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトα
サテライト遺伝子座、例えばD17Z1 に、またはミトコン
ドリア調節領域中の保存配列にハイブリダイズするビオ
チン化プローブの利用、および固定化されたＤＮＡを分
析するための化学発光検出アッセイに関する。更に、本
発明は、試料中のＤＮＡの分解状態を評価するためのゲ
ル電気泳動に続くサザンブロットの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】分子
生物学の技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によるＤＮＡの増幅（Saiki ら, 1988, Science 239: 4
87-491 ; 米国特許第 4,683,195号；同第4,683,202号
および同第 4,965,188号）および制限断片の長さ多形性
（RFLP）に基づくＤＮＡ型決定（Jeffereys ら, 1985,
Nature 314 :67-73）により、ヒトの遺伝子多様性のよ
り一層詳細な分析が可能になった。
【０００３】ＰＣＲ増幅の特異性および感受性は、法医
学の分野（Blake ら, 1991, Journal of Forensic Scie
nces 37(3): 700-726）、古代ＤＮＡ試料の研究（Paab
o ら, 1988, Nucleic Acids Research 16:9775-978
7）、遺伝病の分析（Gibbs ら,1989, Erlrich 編, PCR
Technology: Principles and Applications for DNA Am
plification, Stockton Press, New York, 153-169）お
よび集団遺伝学の研究（Helmuth ら, 1990, American J
ournal of Human Genetics 47:515-523）におけるその
ような方法の広範な利用をもたらした。
【０００４】特に、法医学の分野は、法医学的証拠試料
からＤＮＡを抽出して型決定できることによって大変革
が起こった（Reynold ら, 1991, Analytical Chemistry
63: 1-15）。法医学では、多数の生物学的証拠試料が
極めて少量のＤＮＡかまたは分解されてしまっているＤ
ＮＡを含む場合、適当な分析方法を選択する上でＤＮＡ
の量と品質が重要な要因となり得る。
【０００５】例えば、RFLPに基づく型決定方法は、比較
的多量の、典型的には50ナノグラムより多い、未分解の
ＤＮＡを必要とする。わずか数ナノグラムの恐らく分解
されているであろうＤＮＡを含む試料の分析は、高感度
で特異性を有するＰＣＲに基づく方法を更に必要とする
だろう。一般に、ＰＣＲ増幅の効率は試料ＤＮＡの量、
品質および純度により影響を受ける。大部分のＤＮＡ分
析法の成功はＤＮＡ試料の量と品質に依存するため、分
析前に試料中のＤＮＡを定量しそしてＤＮＡの品質を評
価できることは重要である。
【０００６】現在のＤＮＡ定量方法としては、ＵＶ分光
法、蛍光法、およびアガロース電気泳動後に臭化エチジ
ウムで染色することによる半定量が挙げられる。しかし
ながら、それらの方法は何ナノグラムもの量の未変性の
ＤＮＡを分析に必要とし、しかもヒトＤＮＡに特異的で
ない。その上、それらは核酸ＤＮＡとミトコンドリアＤ
ＮＡを識別しない。
【０００７】ヒトＤＮＡに特異的な定量方法は、細菌ま
たは真菌ＤＮＡを含むことがある試料、例えば法医学的
証拠試料、古代ＤＮＡ試料および臨床試料の分析に重要
である。最近、Wayeら, 1989, Bio Techniques 7(8):8
52-855がヒトＤＮＡに比較的特異的である方法を報告し
ている。しかしながら、この方法は放射性標識を必要と
し、結果を得るのに数時間を要する。放射能の使用を必
要としない、試料中のＤＮＡを定量するための迅速で高
感度で且つヒト特異的な方法への要望が存在する。
【０００８】ＤＮＡ試料の品質は通常、ＤＮＡのアガロ
ースゲルサイズ分画に続く臭化エチジウム染色により評
価される。高品質の、即ち未分解のゲノムＤＮＡは、も
っぱら高分子量ＤＮＡのみから成る。ＤＮＡの分解は様
々な長さの断片を生じ、それがゲル上に低分子量ＤＮＡ
のスミアを生成する。臭化エチジウムは変性（一本鎖）
ＤＮＡを容易には染色しないので、従来の方法は加熱も
しくは煮沸段階またはアルカリ処理を必要とする方法を
使って抽出された試料には不満足である。
【０００９】例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使う増幅
用のＤＮＡ抽出のChelex法は、細胞溶解のための煮沸を
必要とする〔Walsh ら, 1991, Bio Techniques 10(4):
506-513〕。幾つかのＤＮＡ抽出法はプロテイナーゼＫ
の不活性化のために95℃への加熱を必要とする（Higuch
i, 1979, Erlich 編, PCR Technology: Principles and
Applications for DNA Amplification, Stockton Pres
s, New York, 31-38を参照のこと）。従って一本鎖と二
本鎖ＤＮＡ試料の両方の品質を評価する高感度方法への
要望が存在する。本発明はそれらの要望を満たす。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、実施が容易で
且つ迅速である、試料中に含まれるヒトの核ＤＮＡとミ
トコンドリアＤＮＡの定量のための高感度方法を提供す
る。ＤＮＡを膜上に固定化し、反復ヒトゲノム配列また
はミトコンドリア配列にハイブリダイズするビオチン化
プローブとハイブリダイズせしめ、そして化学発光アッ
セイを使って検出する。一態様では、前記反復ヒト配列
がヒトαサテライト遺伝子座 D17Z1である。別の態様で
は、該配列がミトコンドリアゲノムの調節領域の一部で
ある。試料中に含まれるＤＮＡの量は、検出されたハイ
ブリダイズしたプローブの量から評価される。全操作を
1.5 時間内に完了することができ、そして75ピコグラム
未満のヒトＤＮＡを検出することができる。
【００１１】加えて、本発明は、試料中に含まれるＤＮ
Ａの品質を評価する方法を提供する。ゲル電気泳動によ
りＤＮＡをサイズ分画し、膜上に固定化し、反復ヒトゲ
ノム配列にハイブリダイズするビオチン化プローブとハ
イブリダイズせしめ、そして化学発光アッセイを使って
検出する。一態様では、前記反復ヒト配列がヒトαサテ
ライト遺伝子座 D17Z1である。ＤＮＡの品質は、観察さ
れる断片サイズ分布から評価される。
【００１２】本発明は更に、本発明の方法において使用
するための、ヒトαサテライト遺伝子座 D17Z1中の配列
におよびミトコンドリアの調節領域中の配列にハイブリ
ダイズするビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを提
供する。本発明は、本発明の方法に使用される試薬を含
有するキットも提供する。
【００１３】
【具体的説明】本明細書中で使用する「試料」なる用語
は、核酸を含有するかまたは含有すると推定される任意
の物質を言い、１または複数の個体から単離された組織
もしくは液体、試験管内細胞培養成分、並びに環境試
料、臨床試料、記録保管試料および古代試料が挙げられ
るが、それらに限定されない。
【００１４】本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチ
ド」なる用語は、２以上のデオキシリボヌクレオチドま
たはリボヌクレオチドを含んで成る分子を言う。正確な
サイズは多数の因子に依存し、これはオリゴヌクレオチ
ドの最終機能または用途に依存するだろう。この用語は
一本鎖と二本鎖の両方のＤＮＡおよびＲＮＡを指す。オ
リゴヌクレオチドは、任意の適当な技術により誘導する
ことができる。そのような技術としては、現存のもしく
は天然の配列の単離、化学合成、ＤＮＡ複製もしくは増
幅、逆転写またはそれらの組合せが挙げられるが、それ
らに限定されない。
【００１５】化学合成法としては、例えば、Narangら,
1979, Methods in Enzymology 68:90 により記載された
ホスホトリエステル法、Brown ら, 1979, Methods in E
nzymology 68:109により記載されたホスホジエステル
法、Beaucageら, 1981, Tetrahedron Letters 22:1859
により記載されたジエチルホスホルアミダイト法、およ
び米国特許第 4,458,066号に開示された固体支持体法を
挙げることができる。オリゴヌクレオチド合成はLevens
onおよびChang, 1990, PCR Protocols, Innis ら編, Ac
ademic Press, New York, 99-112中に記載されている。
【００１６】本明細書中で使用する「部分配列」なる用
語は、別のヌクレオチド配列中に完全に含まれるヌクレ
オチド配列について言う。定義の通り、配列はそれ自身
の部分配列でもある。本明細書中で使用する時、ハイブ
リダイゼーションプローブに適当な部分配列は、長さ約
10〜140 ヌクレオチド、好ましくは長さ40〜130 ヌクレ
オチドである。
【００１７】本明細書中で使用する「品質」なる用語は
ＤＮＡ試料の分解の程度を言う。高品質試料は、ほとん
どまたは全く分解を受けていないＤＮＡを含有する。Ｄ
ＮＡ試料の品質は、ゲル電気泳動サイズ分画により試料
ＤＮＡの分子量を測定することによって評価することが
できる。例えば、１％アガロースゲルを使った時、ヒト
ゲノムＤＮＡの高品質試料は20 kb ＤＮＡマーカーと一
緒に移動し、そして臭化エチジウム染色または本発明の
方法のいずれかにより視覚化すると比較的幅の狭いバン
ドを形成するが、一方低品質のヒトＤＮＡ試料では、Ｄ
ＮＡの分解が様々な長さの断片を生じ、より低分子量の
ＤＮＡ、即ち20 kb 未満のＤＮＡのスメアとして現れ
る。
【００１８】本明細書中で使用する「プローブ」および
「オリゴヌクレオチドプローブ」なる用語は、ＤＮＡ試
料中に含まれる特定の標的配列と安定なハイブリダイゼ
ーション二本鎖を形成するのに十分な程に該標的配列に
相補的である標識オリゴヌクレオチドを言う。ハイブリ
ダイゼーションは緊縮条件下で行われる。緊縮ハイブリ
ダイゼーション条件は当業界で公知であり、例えば、Sa
mbrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork 中に記載されている。
【００１９】「ハイブリダイズ領域」という用語は、標
的配列に相補的であり従って該標的配列にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドプローブの領域を言う。ハイ
ブリダイズ領域は典型的にはオリゴヌクレオチド全体を
指すが、プローブは、例えばプローブ配列を固体支持体
に固定するための手段を提供する標識結合部位として機
能する追加のヌクレオチド配列を含むことができる。好
ましい態様では、オリゴヌクレオチドプローブのハイブ
リダイズ領域は標的配列に完全に相補的である。
【００２０】しかしながら、一般的には、完全な相補性
は不要である。安定な二本鎖は不適正塩基または不対塩
基を含むことができる。緊縮条件の変更は、１または複
数の不適正塩基対または不対塩基を有する安定なハイブ
リダイゼーション二本鎖を許容することが必要かもしれ
ない。Sambrookら, 1989, 前掲は、適当な変更のための
手引きを提供する。標的／プローブ二本鎖の安定性は、
オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基
組成および配列、温度並びにイオン条件を包含する多く
の変数に依存する。
【００２１】本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、
プローブ−標的ハイブリダイゼーション二本鎖の検出を
可能にするために標識される。一般に標識は、オリゴヌ
クレオチドプローブに取り付けることができ且つ検出可
能で定量可能なシグナルを提供するために使われている
任意の原子または分子であることができる。標識は様々
な方法で直接的にまたは間接的にオリゴヌクレオチドに
取り付けることができる。
【００２２】使用する標識の種類に依存して、標識は末
端（プローブの３′または５′末端）または非末端ヌク
レオチドに取り付けることができ、そして様々なサイズ
と組成のスペーサーアームを介して間接的に取り付ける
ことができる。市販のホスホルアミダイト試薬を使っ
て、適当に保護されたホスホルアミダイトを経由して
５′末端または３′末端のいずれかに官能基を含むオリ
ゴマーを製造することができ、そして例えばPCR Protoc
ols: A Guide to Methods and Applications, Innis ら
編, Academic Press, Inc., 1990に記載されたプロトコ
ールを使って、そのようなオリゴヌクレオチドを標識す
ることができる。
【００２３】好ましい態様では、標識はオリゴヌクレオ
チドの５′末端に共有結合されたビオチン分子から成
る。本明細書中で使用する「ビオチン化プローブ」なる
用語は、オリゴヌクレオチドに直接的にまたは介在の
「スペーサー」分子を介して間接的に結合された１また
は複数のビオチン分子を有するプローブについて言う。
【００２４】プローブの検出は、好ましくはWhitehead
ら, 1983, Nature 305: 158-159により記載されており
そして市販されている（ECL, Amersham, Arlington Hei
ghts, IL, USA ）ようなルミノール系試薬を使った化学
発光アッセイによる。プローブと標的ＤＮＡとのハイブ
リダイゼーション後、プローブオリゴヌクレオチドに取
り付けられたビオチン分子をストレプトアビジン−西洋
ワザビペルオキシダーゼ（SA-HRP）に接合する。あるい
は、オリゴヌクレオチドプローブを直接西洋ワサビペル
オキシダーゼで標識し、それによって個々の接合段階を
評価することもできる。
【００２５】いずれの場合でも、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ酵素によるその後のルミノールの酸化が光量子の
放出を引き起こし、次いでそれを標準的オートラジオグ
ラフィーフィルム上で検出する。フィルム上のシグナル
の強度はＤＮＡ量の関数である。既知量のＤＮＡを含有
する一連のＤＮＡ標準物を、同じ膜上にブロットした１
または複数の未知の試料と一緒にアッセイする。既知Ｄ
ＮＡ標準物のシグナル強度はシグナル強度とＤＮＡ量と
の関数関係の実験的測定を可能にし、それが未知の試料
の定量を可能にする。
【００２６】あるいは、３，３′，５，５′−テトラメ
チルベンジジン（ＴＭＢ）と過酸化水素を使うSheldon
ら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9085-9089
に記載されたような色素生成反応を使って、プローブ／
標的ハイブリダイゼーション二本鎖を検出することがで
きる。
【００２７】本発明のプローブは高度反復ヒトゲノム配
列に相補的である。反復配列のゲノム当たりの高コピー
数が多数のハイブリダイゼーション用標的配列を提供す
るため、反復配列を使うと高感度が得られる。ヒトゲノ
ム中には多数の反復配列が存在することが知られてお
り、例えばサテライトＤＮＡおよびAlu 反復配列（Bril
ten ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4770-
4774）が挙げられる。αサテライトＤＮＡは、主として
霊長類染色体の動原体に位置する縦列に反復したＤＮＡ
の複合体群である〔WayeおよびWillard, 1986, Molecul
ar and CellularBiology 6(9):3156-3165 ; Willard, 1
985, American Journal of Human Genetics 37:524-53
2〕。
【００２８】好ましい態様では、該プローブは、染色体
17上に位置する霊長類特異的αサテライトＤＮＡ配列で
あるD17Z1 に相補的である。この配列は、染色体17あた
り500 〜1,000 コピーで存在すると見積もられている
（WayeおよびWillard, 1986,前掲）。主要なD17Z1 反復
配列は長さが2.7 kbであり、16の連続モノマーとして整
列されている。15の縦列モノマーから成るあまり豊富で
ない反復（染色体17あたり約100 コピー）も見つかる。
【００２９】本発明の別の態様では、該プローブはミト
コンドリアゲノムに特異的な配列に相補的である。ミト
コンドリア調節領域は配列レベルで広範囲に渡り特徴づ
けられており、比較的保存された領域により囲まれた２
つの超可変領域を含有する（Vigilantら, 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:9350-9354）。この保存領域
に相補的な２組のプライマーが、ＰＣＲを使って超可変
領域を増幅するのに用いられている。次いでそれらの領
域を直接ＤＮＡ配列決定によりまたは配列特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブ収集物へのハイブリダイゼーショ
ンにより分析することができる（Vigilantら, 1989, 前
掲、およびStoneking ら, 1991, Am. J.Hum. Genet. 4
8:370-382）。好ましい態様では、定量プローブは、調
節領域プライマー部位と重複する配列または調節領域の
保存領域内の配列を含有する。
【００３０】好ましいＤＮＡ定量方法では、実施例２に
記載のような標識プローブとハイブリダイズせしめる前
にＤＮＡ試料をナイロン膜上に固定化する。市販の装置
（例えばthe Convertible, GIBCO BRL, Gaithersburg,
MD, USA ）を使ってＤＮＡ試料を膜上の特定の場所に固
定化することができる。こうして、多数の試料を同一膜
上に限定された配列で固定化することができる。定量プ
ローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中に膜
を浸漬することにより、多数の試料の同時ハイブリダイ
ゼーションを行うことができる。本発明の方法は、多数
の試料を日常的に分析する必要がある用途、例えば商業
的環境における用途に特に適する。
【００３１】好ましいＤＮＡ定性アッセイ法では、ＤＮ
Ａ試料をアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画した
後、分画されたＤＮＡをナイロン膜に移行した後、本発
明のプローブとハイブリダイズせしめる。市販の装置
（例えばPosiblot移行装置、Stratagene, La Jolla, C
A, USA ）を使ってＤＮＡを移行させることができる。
ＤＮＡをナイロン膜に移行させた後、実施例３に記載の
ように80℃で焼成することにより、またはＵＶ照射によ
ってチミジン残基を膜に架橋せしめることにより（Chur
chおよびGilbert, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:1991-1995）、ＤＮＡを膜に固定することができる。
【００３２】本発明の方法で使用する試薬はキットに包
装することができる。キットは標識オリゴヌクレオチド
プローブを含み、または未標識であるなら、特異的標識
試薬を含んでもよい。該キットは、ＤＮＡの固定化およ
び検出に必要とされる適当に包装された試薬および材
料、例えば膜、緩衝液、酵素、ＤＮＡ標準物およびハイ
ブリダイゼーション用トレー、並びにアッセイを実施す
るための取扱説明書を更に含んでもよい。次の実施例は
例示目的で与えられるのであって、何ら本発明を限定す
る意図のものではない。
【００３３】
【実施例】実施例１ ：プローブ 本発明のプローブは、2.7 kb D17Z1遺伝子座中に含まれ
る領域に相補的である。各オリゴヌクレオチドは、直接
またはホスホルアミダイト「スペーサー」分子を介して
５′末端にビオチン分子が結合されている。プローブSW
49（配列番号１），SW1000（配列番号１），SW1001（配
列番号１），SW1002（配列番号１），SW1003（配列番号
１），SW1004（配列番号１）およびSW1005（配列番号
１）は同じオリゴヌクレオチド配列を使って作製した
が、標識の細部が異なっている。各プローブに共通のヌ
クレオチド配列を下記と配列表中に与える。
【００３４】
【化１】
【００３５】オリゴヌクレオチド合成は、Beaucageおよ
びCaruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22:1859-18
62並びにSinha ら, 1984, Nucleic Acids Research 1
2:4539-4557において記載されたようなＯ−シアノエチ
ルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトと500 Å
の気孔制御ガラス支持体とを使ってマイクロモルスケー
ルで自動ＤＮＡ合成装置（Milligen/Biosearch 8750, A
pplied Biosystems 394かEppendorf Biotronik D のい
ずれか）上で実施した。支持体とｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよ
びＴのホスホルアミダイト誘導体は、Millipore/Water
s, Bedford, MA, USAまたはCruachem, Sterling, VA, U
SA から商業的に入手した。
【００３６】２種類のビオチン試薬、すなわちビオチン
ホスホルアミダイトとBioTEGホスホルアミダイトを使っ
た。それらの２つのビオチン試薬は、BioTEG製品の方が
オリゴヌクレオチドからビオチンを隔てるスペーサーが
より長いという点で異なる。オリゴヌクレオチドは末端
のジメトキシトリチル基をそのまま残しながら合成し、
固相抽出カートリッジ（PREP-NENSORB, Dupont）を使っ
た親油性選別により精製した。ビオチン化とオリゴヌク
レオチド精製は、Misiura ら, 1990, NucleicAcids Res
earch 18:4345-4354 ; Alvesら, 1989, Tetrahedron L
etters, 30:3089-3092 ;およびPon, 1991, Tetrahedro
n Letters, 32:1715-1718中に記載されている。
【００３７】定量プローブSW49（配列番号１），SW1000
（配列番号１），SW1001（配列番号１），SW1002（配列
番号１），SW1003（配列番号１），SW1004（配列番号
１）およびSW1005（配列番号１）を下記の表１に概略的
に示す。表１中、Ｂ１はビオチンホスホルアミダイトを
指し、Ｂ２はBioTEGホスホルアミダイトを指し、Spacer
はホスホルアミダイトスペーサーを指す。Oligo はそれ
らのプローブに共通のオリゴヌクレオチド（配列番号
１）を指す。mtOligo はミトコンドリアＤＮＡオリゴヌ
クレオチドを指す（配列は下記に与える）。SW1000（配
列番号１）とSW1003（配列番号１）は配列と標識がSW49
（配列番号１）と同じである。
【００３８】
【表１】
【００３９】本発明の方法において有用である追加のオ
リゴヌクレオチドプローブを下記に与える。
【００４０】
【化２】
【００４１】オリゴヌクレオチドプローブ配列は D17Z1
構成モノマーの部分配列である。SW33（配列番号４）は
モノマー11の部分配列であり、SW34（配列番号５）はモ
ノマー12の部分配列であり、そしてSW35（配列番号６）
はモノマー13の部分配列である。その他のオリゴヌクレ
オチド配列は上記３つのオリゴヌクレオチドのうちの１
つの部分配列である。配列番号１、SW56（配列番号７）
およびSW59（配列番号８）はSW33（配列番号４）の無重
複部分配列である。
【００４２】配列番号１はSW52（配列番号９）の部分配
列であり、SW52はSW57（配列番号10）の部分配列であ
り、SW57はSW58（配列番号11）の部分配列であり、それ
らは全てSW33（配列番号４）の部分配列である。SW31
（配列番号２）はSW34（配列番号５）の部分配列であ
り、そしてSW32（配列番号３）はSW35（配列番号６）の
部分配列である。
【００４３】本発明の追加のプローブは、ミトコンドリ
ア調節領域内の様々な保存配列に相補的である。
【００４４】
【化３】
【００４５】RR70（配列番号18）とRR71（配列番号19）
はRR65（配列番号13）の重複部分配列である。RR72（配
列番号20）はRR67（配列番号15）の部分配列である。RR
66（配列番号14）とRR69（配列番号17）は重複する。
【００４６】実施例２：ＤＮＡ量の評価 試料中のＤＮＡの量を評価するために、抽出した試料Ｄ
ＮＡをヒトゲノムＤＮＡ標準物の滴定シリーズと一緒に
ナイロン膜上に固定し、ビオチン化プローブ SW49 （配
列番号１）にハイブリダイズせしめた。該プローブの合
成は上記実施例１に記載した通りであった。化学発光検
出プロトコールを使ってハイブリダイゼーションを視覚
化した。試料中に存在するＤＮＡの量は、試料ＤＮＡか
ら得られたハイブリダイゼーションシグナルとＤＮＡ標
準物から得られたハイブリダイゼーションシグナルとの
比較により評価した。実験プロトコールの詳細は次の通
りである。
【００４７】５つのヒト血痕試料、６つのヒト全血試
料、７つのヒト毛髪試料および３つのヒト頬試料からの
抽出物中のヒトＤＮＡの量を評価した。加えて、プロー
ブ特異性の試験として１μg のウシＤＮＡと１μg のマ
ウスＤＮＡから成る試料も使った。Walsh ら, 1991, 前
掲に記載されたChelex法によるか、またはMillerら, 19
88, Nucl. Acids Res. 6(3):1215 に記載された塩析法
により、試料からＤＮＡを抽出した。Chelex法では、３
mm2 の血痕、頬切屑、または１cmの毛根切片を200 μl
の5% Chelex 中で56℃でインキュベートし、次いで８分
間煮沸した。
【００４８】抽出した各ＤＮＡ試料５μl を 100μl の
スポット用緩衝液（0.4N NaOH, 25mM EDTA）に添加し
た。次の量のヒトＤＮＡを 100μl のスポット用緩衝液
に添加することによりＤＮＡ標準物を調製した：10, 5,
2.5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 ng。ＤＮＡを全く含まない
ブランクも調製し 100μl のスポット用緩衝液に添加し
た。一枚のBiodyne B 膜（Pall Biosupport, Glen Cov
e, NY, USA ）を蒸留水中で予め湿らせ、スロットブロ
ット装置（The Conbertible, 0.75 ×0.75 mm, GIBCO B
RL, Gaithersburg, MD, USA ）中に置いた。試料と標準
調製物をウエルに添加し（全容量）、次いで真空を適用
した。膜を装置中にまだ置いた状態で、各ウエルに200
μl の15％過酸化水素を添加し、再び真空を適用した。
【００４９】膜を装置から取り出したらすぐに、予め50
℃に温められた５×SSPE（20×SSPEは3.6M NaCl, 200mM
NaH2PO4・H2O, 20mM EDTA, pH 7.4である）および0.5
％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) 中に入れ、振盪湯浴中
で50℃にて15分間インキュベートした。次いで15ピコモ
ルのプローブ SW49 （配列番号１）を含む30 ml のハイ
ブリダイゼーション緩衝液（5 ×SSPE, 0.5% SDS）に膜
を移し、振盪湯浴中で50℃にて15分間インキュベートし
てハイブリダイゼーションを起こさせ、次いで1.5 ×SS
PE, 0.5% SDS中で手短に洗浄した。
【００５０】緊縮洗浄段階と接合（ビオチンをSA-HRPに
接合）段階を同時に実施した。膜を90μl のSA-HRP（Pe
rkin Elmer, Norwalk, CT, USA）を含む30 ml の1.5 ×
SSPE, 0.5% SDS中に置き、振盪湯浴中で50℃にて10分間
インキュベートした。1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で膜を手
短にすすぎ、次いで200 mlの1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で
旋回振盪器上で室温にて15分間洗浄した。次いで 0.1Ｍ
クエン酸ナトリウム,pH 7.5中で膜をすすいだ。
【００５１】ハイブリダイズしたプローブの検出は、増
強化学発光検出に使われるルミノール系試薬であるＥＣ
Ｌ（Amersham, Arlington Heights, IL, USA）を使って
行った。10 ml のＥＣＬ試薬１と10 ml のＥＣＬ試薬２
の混合物中に膜を置き、室温で１分間振盪した。膜を一
枚のBenchkote (Whatman, Maidstone, England) 上に置
き、サランラップで覆い、そして余分な水分を拭き取っ
た。ＤＮＡを可視化するために、膜をHyperfilm (Amers
ham, Arlington Heights, IL, USA)またはKodax XAR5フ
ィルム (Kodak, Rochester, NY, USA)に室温で15分間暴
露した。結果を図１に示す。
【００５２】ＤＮＡの定量は、試料ＤＮＡのスロットブ
ロット強度とＤＮＡ標準物のそれとの外観比較と、フィ
ルム上のスロットブロット結果のコンピューター画像処
理分析の両方により決定された。スロットブロット結果
のコンピューター分析用には、８ビット灰色目盛り平台
走査装置（Abaton Corporation, Fremont, CA, USAから
入手可能）を使ってフィルムを走査し、そして得られた
画像をコンピュータープログラム Image 1.41 （Wayne
Rasband により記録されたもの、NIH, Bethesda, MD, U
SAから入手可能）を使ってマッキントッシュコンピュー
ター上で解析した。
【００５３】各スロットブロットシグナルの平均シグナ
ル密度（0 〜255 の範囲に渡る実際に走査された絵素
値）を測定した。スロットブロットシグナルを完全に含
む一定サイズの長方形の上に平均シグナル密度を限定し
た。こうして限定され測定された平均シグナル密度の比
較は、各スロットブロットからの全シグナルの比較と同
等である。各スロットの隣で測定されたバックグラウン
ド密度を各平均密度から差し引いた。バックグラウンド
シグナルは膜上で直接観察されなかったが、おそらく膜
の走査の人為結果だったのだろう。
【００５４】次いでこのデータを、スロットブロット平
均シグナル密度とＤＮＡ標準物からのデータに対するＤ
ＮＡ量との関係を説明する式に合わせる別のコンピュー
タープログラム（Kaleidagraph, Abelback Software ）
に伝えた。データは指数方程式Ｙ＝Ｃ・ｅ(r.X) によく
合う。ここで、ＹはＤＮＡ量（ナノグラム）、Ｃ＝0.17
87ナノグラム、ｒ＝0.0308、そしてＸは平均シグナル密
度である。走査絵素値として定義されたシグナル密度は
０〜255 の大きさのない数である。一度決定されれば、
この指数方程式を使って平均シグナル密度測定値から未
知の試料中のＤＮＡ量を決定することができる。
【００５５】上記方程式を使って、観察されたスロット
ブロット結果からヒトＤＮＡを含む各試料中のＤＮＡの
量を評価した。ＤＮＡ量の評価を下記に示す。試料の位
置は縦の段を指し、原位置は図２に示されている。ウシ
またはマウスＤＮＡ試料からは全くシグナルが観察され
なかった。このことは、プローブSW49（配列番号１）が
ヒトＤＮＡにのみ特異的にハイブリダイズしたことを示
す。
【００５６】
【表２】
【００５７】試料中のミトコンドリアＤＮＡの量を評価
するために、核ＤＮＡの定量について上述したプロトコ
ールを使った。ただし、次の例外を含んだ： １．予備ハイブリダイゼーションを50℃に代わりに46℃
で行う。 ２．ハイブリダイゼーションを20ピコモルのプローブRR
70（配列番号18）を使って46℃で行う。
【００５８】胎盤ＤＮＡの市販の調製物 (SIGMA)を希釈
し、ＤＮＡ標準物として使った。抽出した胎盤ＤＮＡは
核ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡの混合物を含むので、
両方の型の量の評価に使うことができる。ミトコンドリ
アＤＮＡは全ＤＮＡ調製物の少量成分であり、未知の量
で存在する。従って、胎盤ＤＮＡ（または他の全ＤＮ
Ａ）調製物をミトコンドリアＤＮＡ定量アッセイの標準
物として使用するためには、存在するミトコンドリアＤ
ＮＡの量を決定しなければならない。
【００５９】この値は、分光光度法により定量されてい
る精製ミトコンドリアＤＮＡ調製物を使って得ることが
できる。精製されたＤＮＡの希釈液を全ＤＮＡ希釈液と
同時に上述のミトコンドリアＤＮＡ特異的プローブとハ
イブリダイズせしめ、そしてシグナル強度を比較して全
ＤＮＡ調製物中のミトコンドリアＤＮＡの量を決定する
ことができる。明らかに、精製されたミトコンドリアＤ
ＮＡ試料が理想的な定量標準であろうが、ミトコンドリ
アＤＮＡを単離する方法は非常に時間を浪費し、非常に
低収率を与える。
【００６０】実施例３：ＤＮＡの品質評価 精製ヒトゲノムＤＮＡを5% Chelex とガラス蒸留水の両
方の中に2 ng／μl に希釈し、次いで沸騰湯浴中で０，
１，３または８分間煮沸した。各試料の７μl(14 ng)
を0.5 μg/mlの臭化エチジウムを含む１％アガロースゲ
ル上での１×ＴＢＥ中 100ボルトで30分間の電気泳動に
かけた。ゲルを写真撮影し、0.25M HCl中に15分間浸漬
してＤＮＡを脱プリン化し、次いで0.5N NaOH, 1.5M Na
Cl中に10分間浸漬してＤＮＡを変性させた。
【００６１】Posiblot移行装置（Stratagene, La Joll
a, CA, USA ）を使って該ＤＮＡをByodine B 膜に移行
せしめた。移行は移行緩衝液として10×SSPEを使って75
mmHgにて１時間行った。膜を真空オーブン中で80℃に
て15分間焼成してＤＮＡを固定した。膜を２×SSPEで湿
らせ、次いで15％過酸化水素中に２分間浸した。結合し
たSW49プローブ（配列番号１）のハイブリダイゼーショ
ンおよび検出は、本質的には実施例１に記載した通り実
施したが、ただし、ブロットを30分間フィルムに暴露し
た。
【００６２】図２Ａおよび２Ｂに示される結果は、ＤＮ
Ａの品質評価のための本発明の方法が、特に変性ＤＮＡ
の分析に、改善された検出感度を提供することを指摘す
る。この分析法では（１％アガロースゲル）、未分解の
ゲノムＤＮＡは、適当な分子量マーカーに関して約20 k
b のところの比較的詰まったバンドとして移動し、分解
したＤＮＡは分子量が20 kb より低いＤＮＡのスメアと
して現れる。
【００６３】図２Ａに示される臭化エチジウム染色した
アガロースゲルの写真は、臭化エチジウム検出を使った
時、煮沸試料について、特に水中で煮沸した試料につい
て、バンド強度が弱いかまたは存在しないことを示す。
これは、臭化エチジウムが容易には変性（一本鎖）ＤＮ
Ａを染色しないためである。図２Ｂに示されるように、
Chelex中で煮沸したＤＮＡは比較的そのまま残る。Chel
ex中で１分間煮沸した試料の二重バンドは、おそらく変
性ＤＮＡと未変性ＤＮＡの両方に該当すると思われる。
Chelex中で３〜８分間煮沸後は全てのＤＮＡが変性され
る。
【００６４】高分子量ＤＮＡの単一バンドの存在は、Ch
elex中での煮沸からはほとんど分解が起こらなかったこ
とを指摘する。対照的に、明白な低分子量ＤＮＡのスメ
アにより指摘されるように、水中で煮沸したＤＮＡは３
分後にわずかな分解を示し、そして８分後には有意な分
解を示した。本発明の方法を使ったブロッティングおよ
び探査により明らかになった検出感度の増加は、ＤＮＡ
品質に対する煮沸の影響を評価する能力の大きな改善を
考慮する。
【００６５】実施例４：プローブ標識 プローブSW49（配列番号１），SW1000（配列番号１），
SW1001（配列番号１），SW1002（配列番号１），SW1003
（配列番号１），SW1004（配列番号１）およびSW1005
（配列番号１）を使って、ＤＮＡ定量アッセイの感度に
対する種々のプローブ標識成分の効果の比較を行った。
上記実施例１に記載のように、それらのプローブの各々
のオリゴヌクレオチド配列はSW49（配列番号１）と同じ
であり、それらのプローブはオリゴヌクレオチドに結合
したビオチン標識の数および間隔が異なっている。比較
のため、上記に列挙したプローブのサブセットを本質的
には上記実施例２に記載の通りである定量アッセイにお
いて使った。
【００６６】１つの比較は、プローブSW1000（配列番号
１），SW1001（配列番号１）およびSW1002（配列番号
１）を使って行った。プローブSW1001（配列番号１）は
プローブSW1000（配列番号１）に比べてわずかな感度の
増加を示した。それらのプローブはSW1001（配列番号
１）中のスペーサーの存在だけが異なっているため、ア
ッセイ感度の改善はおそらくオリゴヌクレオチドとビオ
チン標識との間の間隔の増加から生じるらしい。プロー
ブあたり２つのビオチン分子を含むプローブSW1002（配
列番号１）は、２つの単一ビオチンプローブのいずれよ
りも増加された感度（15分間暴露で150 ピコグラムにつ
いて増加されたシグナル）を示した。
【００６７】もう１つの比較は、プローブSW1001（配列
番号１），SW1004（配列番号１）およびSW1005（配列番
号１）を使って行った。SW1001（配列番号１）とSW1004
（配列番号１）の比較については、事実上スペーサーを
含むBioTEGホスホルアミダイトを使ったビオチン化（SW
1004−配列番号１）が、ビオチンホスホルアミダイトと
別のホスホルアミダイトスペーサーを使ったビオチン化
と同等であるかまたは優れてさえいることが観察され
た。BioTEGホスホルアミダイトと別のホスホルアミダイ
トスペーサーの両方を含むプローブSW1005（配列番号
１）が、最大の感度を提供した。
【００６８】実施例５：アッセイ感度 上記実施例２および４に記載のＤＮＡ定量アッセイの各
々において、15分間のフィルム暴露を使ってスロットブ
ロット結果の視覚化を行った。核ＤＮＡ定量について75
ピコグラムの範囲内のアッセイ感度が認められた。暴露
時間を増加させるとアッセイ感度を増加させることがで
きる。これは、プローブSW1004（配列番号１）を使って
そして15分間と３時間の両方の暴露時間を使って、本質
的には実施例２に記載した通りのＤＮＡ定量アッセイに
より証明された。15分間暴露では下は75ピコグラムに至
るまでの感度を検出することができ、一方３時間暴露は
下は9 〜18ピコグラムに至るまでの感度を示した。
【００６９】実施例６：試料中のＤＮＡの量の好ましい
測定方法（プロトコール）スロットブロット １．各ＤＮＡ試料５μl に 150μl のスポット用緩衝液
（0.4N NaOH, 25mM EDTA, 0.0015％ブロモフェノールブ
ルー）を添加する。次の量のＤＮＡ標準物（５μl 中）
も 150μl のスポット用緩衝液に添加する：10, 5, 2.
5, 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 ng。 ２．Byodine B 膜を50 ml の0.4N NaOH, 25mM EDTA中で
予め湿らせる（５〜30分間）。 ３．膜をスロットブロッター中に置き、各試料の全容量
をウエル中にピペットで添加する。負の対照としてＤＮ
Ａを含まないスポット用緩衝液を幾つかの空のウエルに
適用する。全試料を適用した後でのみ真空をかける。 ４．すぐに予備ハイブリダイゼーション段階を開始する
（下記参照）。
【００７０】ハイブリダイゼーションと検出 １．予備ハイブリダイゼーション：膜を予め温められた
150 mlの 5×SSPE, 0.5% SDS中に置く。次いで5 mlの30
% H2O2を添加する。湯浴中50℃にて15分間振盪する（70
rpm）。 ２．ハイブリダイゼーション：20ピコモルのSW1004を含
む30 ml の 5×SSPE,0.5% SDS中で振盪湯浴（70 rpm）
中で50℃にて20分間インキュベートする。すすぎ ：1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で手短にすすぐ。
【００７１】３．緊縮洗浄／接合：90μl のSA-HRPを含
む30 ml の1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で振盪湯浴（70 rp
m）中で50℃にて10分間インキュベートする。すすぎ ：1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で手短にすすぐ。 ４．洗浄：150 mlの1.5 ×SSPE, 0.5% SDS中で旋回振盪
器（100-125 rpm ）上で室温にて15分間インキュベート
する。すすぎ ：約150 mlの0.1Mクエン酸ナトリウム, pH 5中で
手短にすすぐ。
【００７２】５．ＥＣＬ：10 ml のＥＣＬ試薬Ａを10 m
l のＥＣＬ試薬Ｂに加える。ＥＣＬ試薬中で室温にて正
確に１分間膜を振盪する。 ６．フィルムへの暴露：Benchkote のプラスチック側の
上に膜を置き、膜の上にサランラップ(Saran Wrap)をか
ぶせる。ペーパータオルを使ってサランラップ中の皺を
引き伸ばす。Hyperfilm またはKodax XAR5フィルムに15
分間暴露する。
【００７３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 TAGAAGCATT CTCAGAAACT ACTTTGTGAT GATTGCATTC 40
【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CACTATTTGT AGAATGTGCA AGTGGATATT TAGGCCTCTC 40
【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CAGAAGCATT CTCAGAACCT TCTTCGTGAT GTTTGCATTC 40
【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：１３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 TAGAAGCATT CTCAGAAACT ACTTTGTGAT GATTGCATTC AAGTCACAGA 50 GTTGAACATT CCCTTTGACA GAGCAGTTTG GAAACTCTCT TTGTGTAGAA 100 TCTGCAAGTG GAGATATGGA CCGCTTTAGG 130
【００７７】配列番号：５ 配列の長さ：１３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CAGTAGCATT CACAGAAAAC TCTTGGTGAC GACTGAGTTT AACTCACAGA 50 GCTGAACATT CCTTTGGATG GAGCAGTTTC GAAACACACT ATTTGTAGAA 100 TGTGCAAGTG GATATTTAGG CCTCTCTGAG G 131
【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：１３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CAGAAGCATT CTCAGAACCT TCTTCGTGAT GTTTGCATTC AACTCACAGT 50 GTTGAACCTT TCTTTGATAG TTCAGGTTTG AAACGGTCTT TCTGTAGAAA 100 CTGCAAGTAG ATATTTGGAC CGCTCTGAGG 130
【００７９】配列番号：７ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GAAACTCTCT TTGTGTAGAA TCTGCAAGTG GAGATATGGA 40
【００８０】配列番号：８ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 AAGTCACAGA GTTGAACATT CCCTTTGACA GAGCAGTTTG 40
【００８１】配列番号：９ 配列の長さ：６０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 TAGAAGCATT CTCAGAAACT ACTTTGTGAT GATTGCATTC AAGTCACAGA 50 GTTGAACATT 60
【００８２】配列番号：１０ 配列の長さ：８０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 TAGAAGCATT CTCAGAAACT ACTTTGTGAT GATTGCATTC AAGTCACAGA 50 GTTGAACATT CCCTTTGACA GAGCAGTTTG 80
【００８３】配列番号：１１ 配列の長さ：１００塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 TAGAAGCATT CTCAGAAACT ACTTTGTGAT GATTGCATTC AAGTCACAGA 50 GTTGAACATT CCCTTTGACA GAGCAGTTTG GAAACTCTCT TTGTGTAGAA 100
【００８４】配列番号：１２ 配列の長さ：３９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GGCGGTATGC ACTTTTAACA GTCACCCCCC AACTAACAC 39
【００８５】配列番号：１３ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GTCTTTAACT CCACCATTAG CACCCAAAGC TAAGATTCTA 40
【００８６】配列番号：１４ 配列の長さ：４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CGTGAAATCA ATATCCCGCA CAAGAGTGCT ACTCTCCTCG 40
【００８７】配列番号：１５ 配列の長さ：４３塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GAACTGTATC CGACATCTGG TTCCTACTTC AGGGTCATAA AGC 43
【００８８】配列番号：１６ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GACATCACGA TGGATCACAG GTCTATCACC CTATTAACCA C 41
【００８９】配列番号：１７ 配列の長さ：３９塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CATCCTCCGT GAAATCAATA TCCCGCACAA GAGTGCTAC 39
【００９０】配列番号：１８ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GTCTTTAACT CCACCATTAG CACCCAAAGC 30
【００９１】配列番号：１９ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 CTCCACCATT AGCACCCAAA GCTAAGATTC 30
【００９２】配列番号：２０ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ） 配列 GTATCCGACA TCTGGTTCCT ACTTCAGGGT C 31
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２に記載のＤＮＡ定量アッセイ
の結果を表す図面に代る写真である。試料ＤＮＡをナイ
ロン膜上に固定化し、そしてプローブSW49（配列番号
１）とハイブリダイズせしめた。フィルムへの15分間暴
露による化学発光検出を使ってバンドを視覚化した。カ
ラム「Ｓ」は、ＤＮＡ10〜0.15ナノグラムに渡るヒトゲ
ノムＤＮＡ希釈シリーズである。カラム１〜３は、ＤＮ
Ａ量が未知である試料である。カラム１〜３中の抽出Ｄ
ＮＡ試料の起源は次の通りであった：１Ａ〜１Ｅは血
痕、１Ｆ〜２Ｃは全血、２Ｄ〜３Ｂは一本の毛髪、３Ｃ
〜３Ｅは頬試料、３Ｆは１μg のウシＤＮＡ、３Ｇは１
μg のマウスＤＮＡであり、３Ｈには試料を添加しなか
った。
【図２】図２は、実施例３に記載のＤＮＡ定性アッセイ
の結果を表し、電気泳動の結集を示す図面に代る写真で
ある。図２Ａは１％アガロースゲルの写真である。ヒト
ゲノムＤＮＡ（14ナノグラム）を5% Chelex または水中
で０，１，３または８分間煮沸し、次いで電気泳動にか
けた。同時にＤＮＡサイズマーカーを該ゲル上で泳動し
た。サイズマーカーは「Ｍ」で指される。次いでＤＮＡ
をナイロン膜に移行せしめ、プローブSW49（配列番号
１）とハイブリダイズせしめ、そしてフィルムへの15分
間暴露による化学発光検出を使って視覚化した。図２Ｂ
は得られた写真を示す。写真の表示は図２Ａのものと同
じである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピー．シーン ウォルシュ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596, ウォルナット クリーク，ラス ジュンタ ス ウェイ 1370

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸配列を含んで成る単離・精製された
    オリゴヌクレオチドプローブであって、前記核酸配列が
    配列番号１〜20の配列およびそれらに相補的な配列から
    成る群から選択された配列に含有される長さ10〜140 ヌ
    クレオチドの配列から成るオリゴヌクレオチドプロー
    ブ。
  2. 【請求項２】 前記核酸配列が配列番号１〜20の配列お
    よびそれらに相補的な配列から成る群から選択される、
    請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  3. 【請求項３】 ビオチン標識を更に含んで成る、請求項
    １または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  4. 【請求項４】 前記核酸配列が配列番号１の配列および
    配列番号１の配列に相補的な配列から成る群から選択さ
    れる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  5. 【請求項５】 プローブ SW49, SW1000, SW1001, SW100
    2, SW1003, SW1004およびSW1005から成る群から選択さ
    れ、該プローブは各々配列番号１のヌクレオチド配列を
    有するが各々異なる標識成分から成る、請求項４に記載
    のオリゴヌクレオチドプローブ。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡを含有する試料中のＤＮＡの量を
    定量する方法であって、 (a) 前記ＤＮＡと既知量の対照ＤＮＡとを膜上の別々の
    位置に固定化し； (b) D17Z1 遺伝子座である反復ヒトゲノム配列にハイブ
    リダイズするプローブを含む溶液と前記膜とを、前記Ｄ
    ＮＡが前記プローブに完全に相補的な配列を含む場合に
    のみハイブリダイゼーション二本鎖が形成するような条
    件下で接触させ、ここで、前記プローブは配列番号１〜
    11の配列およびそれに相補的な配列から成る群から選択
    された配列中の長さ約10〜140 ヌクレオチドから成り； (c) 検出されるハイブリダイゼーション二本鎖の数に強
    度が依存するシグナルを生じるアッセイを使って、ハイ
    ブリダイゼーション二本鎖の存在を検出し；そして (d) 前記シグナル強度から前記対照ＤＮＡの量に対して
    前記試料中のＤＮＡの量を評価する；ことを含んで成る
    方法。
  7. 【請求項７】 前記核酸配列が配列番号１〜11の配列お
    よびそれらに相補的な配列から成る群から選択される、
    請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＤＮＡを含有する試料中のＤＮＡの量を
    定量する方法であって、 (a) 前記ＤＮＡと既知量の対照ＤＮＡとを膜上の別々の
    位置に固定化し； (b) ミトコンドリアゲノムの調節領域中に含まれる配列
    にハイブリダイズするプローブを含む溶液と前記膜と
    を、前記ＤＮＡが前記プローブに完全に相補的な配列を
    含む場合にのみハイブリダイゼーション二本鎖が形成す
    るような条件下で接触させ、ここで、前記プローブは核
    酸配列を含んで成り、前記配列は配列番号12〜20の配列
    およびそれらに相補的な配列から成る群の配列から選択
    された約10〜140 ヌクレオチドから成り； (c) 検出されるハイブリダイゼーション二本鎖の数に強
    度が依存するシグナルを生じるアッセイを使って、ハイ
    ブリダイゼーション二本鎖の存在を検出し；そして (d) 前記シグナル強度から前記対照ＤＮＡの量に対して
    前記試料中のＤＮＡの量を評価することを含んで成る方
    法。
  9. 【請求項９】 前記核酸配列が配列番号12〜20の配列お
    よびそれらに相補的な配列から成る群から選択される、
    請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 試料中のヒトＤＮＡの量を定量するた
    めのキットであって、請求項１〜４のいずれか一項に記
    載のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成るキット。
JP23745793A 1992-08-28 1993-08-30 プローブによるｄｎａの測定 Expired - Lifetime JP3759629B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US938084 1992-08-28
US07/938,084 US5464945A (en) 1992-08-28 1992-08-28 Oligonucleotide probes specific for the human alpha satellite locus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06189798A true JPH06189798A (ja) 1994-07-12
JP3759629B2 JP3759629B2 (ja) 2006-03-29

Family

ID=25470852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP23745793A Expired - Lifetime JP3759629B2 (ja) 1992-08-28 1993-08-30 プローブによるｄｎａの測定

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5464945A (ja)
EP (1) EP0594959B1 (ja)
JP (1) JP3759629B2 (ja)
CA (1) CA2104767C (ja)
DE (1) DE69323032T2 (ja)
DK (1) DK0594959T3 (ja)
ES (1) ES2128372T3 (ja)
GR (1) GR3029875T3 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004512498A (ja) 2000-07-07 2004-04-22 リー，エレン ディップスティック検定における改良型検出シグナルおよび捕捉

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69429617T2 (de) * 1993-04-30 2002-08-22 Biognostik Gesellschaft Fuer Biomolekulare Diagnostik Mbh Antisense-oligonukleotide zur behandlung des immunsuppressiven effektes des transformierenden wachstumsfaktor-beta1(tgf-beta1)
AT401270B (de) * 1994-09-26 1996-07-25 Immuno Ag Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna
EP0870055B1 (en) * 1995-10-12 2007-05-16 LANSDORP, Peter, M. Method for detecting multiple copies of a repeat sequence in a nucleic acid molecule
US5733732A (en) * 1996-01-03 1998-03-31 University Of Iowa Research Foundation Methods for detecting primary adhalinopathy
US5754524A (en) * 1996-08-30 1998-05-19 Wark; Barry J. Computerized method and system for analysis of an electrophoresis gel test
EP0848059A1 (en) * 1996-12-12 1998-06-17 Vetigen Mammalian ICYP (Iodocyanopindolol) receptor and its applications
US6489095B2 (en) 1998-06-15 2002-12-03 Mitokor Diagnostic method based on quantification of extramitochondrial DNA
US6441149B1 (en) 1998-06-15 2002-08-27 Mitokor Diagnostic method based on quantification of extramitochondrial DNA
US6153389A (en) * 1999-02-22 2000-11-28 Haarer; Brian K. DNA additives as a mechanism for unambiguously marking biological samples
KR20000074881A (ko) * 1999-05-26 2000-12-15 황승용 마이크로웰을 이용한 디엔에이 돌연변이의 확인방법 및 키트
US6759196B2 (en) 2000-02-23 2004-07-06 Childrens Hospital Los Angeles Method of detecting mitochondrial dysfunction
KR20000072201A (ko) * 2000-08-17 2000-12-05 김희태 여러 종류의 디엔에이 프로브들을 사용한 취약-엑스증후군의 진단 방법
WO2002068689A1 (en) * 2001-02-24 2002-09-06 Childrens Hospital Los Angeles Method of detecting mitochondrial dysfunction
KR20020041344A (ko) * 2002-02-26 2002-06-01 김희태 멤브레인 크로마토그래프 기법을 활용하여핵산중합반응으로 증폭된 핵산을 검출하는 방법
US6946285B2 (en) * 2002-04-29 2005-09-20 Agilent Technologies, Inc. Arrays with elongated features
KR100492393B1 (ko) * 2002-12-02 2005-05-30 굿젠 주식회사 멤브레인 크로마토그래프 기법에 의한 핵산 검출 방법 및이를 위한 킷트
WO2004094986A2 (en) 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US9550985B2 (en) * 2009-06-15 2017-01-24 Netbio, Inc. Methods for forensic DNA quantitation
US10519502B2 (en) 2013-10-31 2019-12-31 The Children's Hospital Of Philadelphia Mitochondrial disease genetic diagnostics
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
WO2018093777A1 (en) * 2016-11-15 2018-05-24 The Regents Of The University Of Michigan Centromere analysis

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA2032331A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-23 Annie L. Wu Method and kits for detecting human leukocyte antigen dna

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004512498A (ja) 2000-07-07 2004-04-22 リー，エレン ディップスティック検定における改良型検出シグナルおよび捕捉

Also Published As

Publication number Publication date
EP0594959A1 (en) 1994-05-04
DE69323032T2 (de) 1999-08-26
CA2104767A1 (en) 1994-03-01
ES2128372T3 (es) 1999-05-16
EP0594959B1 (en) 1999-01-13
DE69323032D1 (de) 1999-02-25
US5464945A (en) 1995-11-07
JP3759629B2 (ja) 2006-03-29
CA2104767C (en) 2009-06-23
DK0594959T3 (da) 1999-09-06
GR3029875T3 (en) 1999-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3759629B2 (ja) プローブによるｄｎａの測定
Walsh et al. A rapid chemiluminescent method for quanititation of human DNA
EP1803823B1 (en) Probe set, probe immobilized carrier and gene examination method
EP0486661B1 (fr) Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich
JP5032304B2 (ja) 染色体異常の検出
Becker et al. Twin zygosity
KR100280219B1 (ko) 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약
EP1612282B1 (en) Probe set and substrate for detecting nucleic acid
US6083698A (en) Cancer susceptibility mutations of BRCA1
KR20030021162A (ko) 단일 카피 게놈 교잡 프로브 및 이의 생성 방법
Micka et al. Validation of multiplex polymorphic STR amplification sets developed for personal identification applications
EP0438587B1 (en) Nucleic acid probes for the detection of pneumocystis carinii
EP1988178A2 (en) Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of serum amyloid A1(SAA1)
EP1354059B1 (en) Method for detecting whether an organism is homozygous or heterozygous using labelled primer and rflp
EP1516933B1 (en) Stable hybrids by selecting the position of the probe relative to the target
JP2006508656A (ja) 診断ハイブリダイゼーションアッセイにおける配列変異の影響及び基線上昇の作用の両方を低下させるための方法、このような方法を実施するためのアッセイ及び前記アッセイにおける使用のためのプローブ
KR20130041767A (ko) 정상 안압 녹내장 질환 감수성 유전자 및 그 이용
US20040014101A1 (en) Separating and/or identifying polymorphic nucleic acids using universal bases
US5582970A (en) Competitive hybridization technique
US20120196284A1 (en) Method of Measuring Telomere Length
US5824476A (en) Competitive hybridization technique
Kim et al. Analysis of mitochondrial DNA deletions in four chambers of failing human heart: hemodynamic stress, age, and disease are important factors
Eads et al. [3] Troubleshooting Microarray Hybridizations
EP2261370A1 (en) Method for detecting abnormal spots of nucleic acid microarray
US20100304997A1 (en) Method for detecting abnormal spots of nucleic acid microarray

Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20050118

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050513

A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20050628

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050809

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051013

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20051129

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060104

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090113

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100113

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110113

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110113

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120113

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130113

Year of fee payment: 7