JPH06138080A - Biosensor - Google Patents

Biosensor

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JPH06138080A
JPH06138080A JP5007244A JP724493A JPH06138080A JP H06138080 A JPH06138080 A JP H06138080A JP 5007244 A JP5007244 A JP 5007244A JP 724493 A JP724493 A JP 724493A JP H06138080 A JPH06138080 A JP H06138080A
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layer
biosensor
enzyme
electrode
sensor
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JP5007244A
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Japanese (ja)
Inventor
Satoko Fujisawa
Mariko Miyahara
Shiro Nankai
Toshihiko Yoshioka
史朗 南海
俊彦 吉岡
万里子 宮原
里子 藤澤
Original Assignee
Matsushita Electric Ind Co Ltd
松下電器産業株式会社
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Publication date
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Abstract

PURPOSE:To provide a highly reliable biosensor. CONSTITUTION:After providing an electrode system composed mainly of a working electrode 4 and counter electrode 5 on an insulating substrate 1, a reactive layer 7 containing a phosphate, enzyme, electron acceptor, and hydrophilic high polymer is formed on the electrode system. In addition, a pH buffer agent (a substance having a pH buffering function in a solution state) is arranged on the substrate 1. Since the optical isomer mobile equilibrium reaction of pyranose is accelerated by the phosphate, a quick sensor response can be obtained. Because of the action of the pH buffer agent, in addition, highly accurate measurement can be performed without adjusting the pH of a sample solution.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定成分について、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することのできるバイオセンサに関する。 The present invention relates to the specific component in the sample, to a biosensor that can perform quick and highly accurate quantification easily.

【0002】 [0002]

【従来の技術】酵素反応過程においてピラノースの光学異性体平衡移動反応を伴う系を有するバイオセンサの一例としてスクロースセンサについて説明する。 For sucrose sensor described in the Related Art enzyme reaction process as one example of a biosensor having a system involving optical isomer equilibrium transfer reaction pyranose.

【0003】酵素電極を用いたスクロースの定量方法としてはインベルターゼ(EC3.2.1.26:以下I [0003] Quantitative methods of sucrose using an enzyme electrode invertase (EC3.2.1.26: hereinafter I
NVと略す)、ムタロターゼ(EC5.1.3.3:以下MUTと略す)、グルコースオキシダーゼ(EC1. Abbreviated as NV), mutarotase (EC5.1.3.3: hereinafter referred to as MUT), glucose oxidase (EC1.
1.3.4:以下GODと略す)の3つの酵素と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを組み合わせた方式が一般に知られている(例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社)。 1.3.4: The following three enzymes and oxygen electrode or system combining a hydrogen peroxide electrode abbreviated as GOD) are generally known (e.g., Shuichi Suzuki ed., "Biosensor" Kodansha). 上記方法について説明する。 It describes the methods described above. 試料中のスクロースはINVによってα−グルコースとフルクトースに加水分解される。 Sucrose in the sample is hydrolyzed to α- glucose and fructose by INV. つぎにMUTによってα−グルコースからβ−グルコースへの異性化が促進され、このβ Then isomerization of β- glucose from α- glucose is promoted by the MUT, the β
−グルコースがGODにより選択的に酸化される。 - glucose is selectively oxidized by GOD. 酸素の存在下では、前記GODによる酸化反応過程において酸素が過酸化水素に還元される。 In the presence of oxygen, oxygen is reduced to hydrogen peroxide in the oxidation reaction process by the GOD. このときの酸素減少量を酸素電極によって計測するか、あるいは過酸化水素の増加量を過酸化水素電極によって計ることでスクロースの定量を行なうものである。 Or to measure the oxygen decrease amount at this time by the oxygen electrode, or an increased amount of hydrogen peroxide and performs determination of sucrose by measuring the hydrogen peroxide electrode.

【0004】 [0004]

【発明が解決しようとする課題】酵素試薬は比較的高価であることが多いが、上記構成のバイオセンサは3種類の酵素を必要とするため、コストが高くなり実用化に際して不利となることがみうけられた。 Enzyme reagent [SUMMARY OF THE INVENTION] are often relatively expensive, since the biosensor constructed as described above which requires three enzymes, can be disadvantageous during practical use, the higher the cost seen it was. また、本測定系は3段階の酵素反応を有しているため、測定に必要な時間が比較的長くなる傾向がみられた。 Also, because it has the measurement system is three-step enzymatic reaction, tends to time required for measurement is relatively long were observed.

【0005】さらに酵素の比活性は、水素イオン濃度(pH)に依存する性質を有しており、最も高い活性が得られるpH(至適pH)は各酵素についてそれぞれ異なる。 Furthermore the specific activity of the enzyme has a property that depends on the hydrogen ion concentration (pH), pH of highest activity is obtained (optimum pH) are different from each for each enzyme. したがって試料液のpHが異なる場合には一定のセンサ応答を得ることが難しい。 It is difficult to obtain a constant sensor responds to thus when the pH of the sample solution is different. 試料液の前処理なしに測定することは測定操作を極めて簡便ならしめるが、試料液のpHによってセンサ応答が影響を受ける場合にはpHを一定にするための前処理が必要となり、簡便性が損なわれる。 While measuring without pretreatment of the sample solution makes it a measurement operation extremely simple, requires a pretreatment for the pH constant in the case of receiving the sensor response influenced by the pH of the sample solution, the convenience impaired.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するために本発明は、絶縁性の基板上に少なくとも作用極と対極からなる電極系を設け、前記電極系上にリン酸塩と酵素と電子受容体と親水性高分子を主体とする反応層を設置したバイオセンサを提供するものである。 The present invention in order to solve the above problems BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION may, an electrode system consisting of at least a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate provided, and phosphate on the electrode system and the enzyme there is provided a biosensor established a reaction layer mainly composed of an electron acceptor and a hydrophilic polymer. さらに、前記電極系上に溶液状態でpHの緩衝作用を有する物質(本発明では「pH緩衝剤」と記す)を配置したものである。 Further, substances having a buffering action in the pH in solution on the electrode system (in the present invention referred to as "pH buffering agent") is obtained by arranging the.

【0007】 [0007]

【作用】リン酸イオン(PO 4 3- 、HPO 4 2- 、H 2 PO 4 [Action] phosphate ion (PO 4 3-, HPO 4 2- , H 2 PO 4
- )によってピラノースの光学異性体平衡移動反応が加速されるため、迅速なセンサ応答を得ることができる。 -) for optical isomer equilibrium transfer reaction pyranose is accelerated, it is possible to obtain a quick sensor response.
さらに、前記光学異性体平衡移動を触媒する酵素(MU Furthermore, enzymes that catalyze the transfer the optical isomer equilibrium (MU
Tなど)をバイオセンサ構成要素から除外することができる。 The T, etc.) can be excluded from the biosensor components. その結果、安価で高い信頼性を有するバイオセンサが得られる。 As a result, the biosensor having a low cost and high reliability can be obtained.

【0008】さらに、pH緩衝剤の作用によって酵素反応を一定のpHの範囲内で進行させることができ、その結果試料液のpHにかかわらず高精度なセンサ応答を得ることができる。 Furthermore, it is possible to proceed the enzymatic reaction within a certain pH by the action of the pH buffering agent, it is possible to obtain a highly accurate sensor response regardless of the pH of the resulting sample solution.

【0009】 [0009]

【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。 BRIEF DESCRIPTION by the present invention through examples.

【0010】(実施例1)バイオセンサの一例として、 [0010] As an example (Example 1) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor. 図1は本発明のバイオセンサの一実施例として作製したスクロースセンサの断面図、図2は同スクロースセンサのうち反応層を除き、図1の斜め上方向からみた分解斜視図、図3は同スクロースセンサの応答の一例を示す図である。 1 is a sectional view of a sucrose sensor was manufactured as an embodiment of the biosensor of the present invention, FIG. 2, except the reaction layer of the sucrose sensor, exploded perspective view seen obliquely from above of Figure 1, Figure 3 is the same is a diagram illustrating an example of the response of the sucrose sensor.

【0011】以下、スクロースセンサの作製方法について説明する。 [0011] Hereinafter, a method for manufacturing a sucrose sensor. ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷しリ−ド2、3を形成した。 A polyethyleneterephthalate insulating substrate 1 made of phthalate, Ginpe by screen printing - to form a de 2,3 - Prints a list Li. つぎに、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷して作用極4を形成した。 Next, to form a working electrode 4 by printing a conductive carbon paste containing a resin binder. 作用極4はリード2と接触している。 Working electrode 4 is in contact with the lead 2.

【0012】つぎに、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層6を形成した。 [0012] Next, to form an insulating layer 6 by printing an insulating paste. 絶縁層6は、作用極4の外周部を覆っており、これによって作用極4の露出部分の面積を一定に保っている。 The insulating layer 6 covers the outer peripheral portion of the working electrode 4, thereby being kept constant the area of ​​the exposed portion of the working electrode 4. さらに、絶縁層6は、リード2、3を部分的に覆っている。 Furthermore, the insulating layer 6 covers the lead 2 and 3 partially.

【0013】つぎに、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストをリード3と接触するように印刷して対極5を形成した。 [0013] Next, to form the counter electrode 5 by printing so as to contact the conductive carbon paste containing a resin binder and a lead 3.

【0014】次に、前記電極系(作用極4、対極5)上に親水性高分子としてカルボキシメチルセルロ−ス(以下CMCと略す)の0.5wt%水溶液を滴下、乾燥させてCMC層を形成した。 [0014] Next, the electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) carboxymethylcellulose as hydrophilic polymer on - dropping a 0.5 wt% aqueous solution of the scan (hereinafter abbreviated as CMC), the CMC layer and dried the formed. つづいて、前記CMC層上に酵素としてINV、GODおよび電子受容体としてフェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液(0.2M:KH 2 Subsequently, INV as an enzyme on the CMC layer, phosphate buffer potassium ferricyanide as GOD and electron acceptor (0.2M: KH 2 P
4 −0.2M:Na 2 HPO 4 ;pH=7.4)に溶解させた混合溶液を滴下し、50℃の温風乾燥器中で10 O 4 -0.2M: Na 2 HPO 4 ; pH = 7.4) mixed solution dissolved was added dropwise, 10 in a hot air drier at 50 ° C.
分間乾燥させて反応層7を形成した。 To form a reaction layer 7 minutes and dried.

【0015】リン酸塩、酵素および電子受容体の混合溶液を滴下すると、親水性高分子からなるCMC層は一度溶解し、その後の乾燥過程で酵素などと混合された形で反応層7を形成する。 [0015] Phosphate, when added dropwise a mixed solution of enzyme and the electron acceptor, CMC layer composed of a hydrophilic polymer dissolves once, forming a reaction layer 7 in the subsequent drying process with mixed like enzyme that form to. しかし、撹拌等をともなわないため完全な混合状態とはならず、電極系表面はCMCのみによって被覆された状態となる。 However, not a complete mixed state because with no stirring or the like, surface of the electrode system is in a state of being covered only by CMC. すなわち、酵素および電子受容体などが電極系表面に接触しないために、電極系表面へのタンパク質の吸着などを防ぐことができる。 That is, to such an enzyme and an electron acceptor is not in contact with the surface of the electrode system, it is possible to prevent such adsorption of proteins to the electrode system surface.

【0016】上記のようにして反応層7を形成した後、 [0016] After forming the reaction layer 7 as described above,
カバー9およびスペーサー8を図2中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着してスクロースセンサを作製した。 In Figure 2 the cover 9 and the spacer 8, to prepare a sucrose sensor was bonded in a positional relationship as shown by a chain line.

【0017】このスクロースセンサに試料液としてスクロース水溶液3μlを試料供給孔10より供給した。 The sucrose solution 3μl as a sample solution was supplied from the sample supply port 10 to the sucrose sensor. 試料液は空気孔11部分まで達し、電極系上の反応層7が溶解した。 Sample solution reaches the air vent 11 parts, the reaction layer 7 on the electrode system was dissolved.

【0018】なお、試料液の供給をよりいっそう円滑にするためには、さらに、レシチンの有機溶媒溶液(例えばトルエン)を試料供給部(センサ先端部)から反応層上にわたって広げ、乾燥させることでレシチン層を形成してからカバー9、スペーサー8を接着するとよい。 [0018] In order to further facilitate the supply of the sample solution further broaden the organic solvent solution of lecithin such as toluene over the reaction layer from the sample supply unit (sensor tip), and dried cover 9 to form a lecithin layer, it is preferable to adhere the spacer 8.

【0019】試料液を供給してから一定時間後に電極系の対極5と作用極4間に+0.5Vの電圧を印加し、5 [0019] applying a voltage of + 0.5V between the counter electrode 5 and the working electrode 4 of the sample solution electrode system after a certain time from the supply, 5
秒後の電流値を測定したところ、試料液中のスクロース濃度に比例した値が得られた。 The measured current value after seconds, a value proportional to the sucrose concentration in the sample liquid was obtained.

【0020】本発明のスクロースセンサと前記スクロースセンサのうち反応層中のリン酸塩を除いて作製したセンサについて、センサ応答の測定時間依存特性を図3に示す。 [0020] The sensor was fabricated except for phosphate in the reaction layer of the sucrose sensor and the sucrose sensor of the present invention, showing the measurement time dependence of the sensor response in FIG. 図3中、aは本発明のスクロースセンサ、bは本発明のうちリン酸塩を除いたスクロースセンサ、cはa In Figure 3, sucrose sensor of a present invention, b is sucrose sensor, excluding the phosphate of the present invention, c is a
のスクロースセンサの反応層中にさらにMUTを加えた構成のセンサのスクロース水溶液(20mM)に対する応答である。 Is a response to the configuration of the sucrose solution of sensors plus further MUT in the reaction layer of sucrose sensors (20 mM).

【0021】本発明のスクロースセンサ(a)は、MU [0021] Sucrose sensor (a) of the present invention, MU
Tを含むセンサ(c)に比べるとやや劣るが、リン酸塩を除いたもの(b)と比較するとより短い時間でセンサ応答が一定になることががわかる。 Slightly inferior to the sensor (c) containing the T, but the sensor response in a shorter time when compared to those without the phosphate (b) that is constant is known.

【0022】スクロースがINVにより加水分解されてα−グルコースが生成し、このα−グルコースはリン酸塩により迅速にβ−グルコースとなり、このβ−グルコースがGODによって酸化される。 [0022] Sucrose is hydrolyzed α- glucose produced by INV, the α- glucose becomes quickly β- glucose by phosphate, the β- glucose is oxidized by GOD. GODによる酸化反応で移動した電子によってフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。 Potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by electrons transferred in the oxidation reaction by GOD. 次に、前記の電圧印加により、生成したフェロシアン化カリウムの酸化電流が得られ、この電流値は基質であるスクロースの濃度に対応する。 Next, by applying a voltage of the, resulting oxidation current of potassium ferrocyanide is obtained, this current value corresponds to the concentration of sucrose is the substrate.

【0023】(実施例2)バイオセンサの一例として、 As an example of (Example 2) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor.

【0024】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0024] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and to form an insulating layer 6. さらに、CMC層を前記電極系上に形成した。 Further, to form a CMC layer on the electrode system.

【0025】次に、前記CMC層上にINVとGODとフェリシアン化カリウムとリン酸二カリウム塩をマレイン酸−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH=7.5:以下、マレイン酸−Tris緩衝液と略す)に溶解させた混合溶液を滴下し、温風乾燥器中で乾燥させて反応層7を形成した。 Next, INV and GOD and potassium ferricyanide and dipotassium salt of maleic acid onto the CMC layer - tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH = 7.5: the following,-Tris buffer maleate It was added dropwise a mixed solution prepared by dissolving abbreviated as liquid), to form a reaction layer 7 and dried in hot air drier. さらに、実施例1と同様にしてカバー9およびスペーサー8と共に一体化してスクロースセンサを作製した。 Further, to produce a sucrose sensor was integrated with the cover 9 and the spacer 8 in the same manner as in Example 1.

【0026】前記反応層7は電極系表面に接して形成する方法について述べたが、必ずしもその必要はない。 [0026] The reaction layer 7 is described a method of forming in contact with the surface of the electrode system, but not necessarily the same. 図2のようなカバー9およびスペーサー8と一体化する場合には、カバー9とスペーサー8と絶縁性の基板1とによって電極系上部に空間部が形成される。 When integrated with the cover 9 and the spacer 8 as shown in FIG. 2, the space portion to the electrode system top by a cover 9 and the spacer 8 and the insulating substrate 1 is formed. 前記カバー9、スペーサー8、絶縁性の基板1の前記空間部の壁面に相当する部位であれば適当な場所に反応層を形成することができる。 The cover 9, a spacer 8, it is possible to form the reaction layer to a suitable location if portions corresponding to the wall surface of the space portion of the insulating substrate 1. センサに供給された試料液は前記空間部を満たすため、反応層を溶解することが可能である。 Sample liquid supplied to the sensor to meet the space portion, it is possible to dissolve the reaction layer.

【0027】上記のように作製したスクロースセンサに試料液としてスクロース水溶液3μlを実施例1と同様に試料供給孔10から供給してセンサ応答電流を測定したところ、スクロース濃度に比例した値が得られた。 [0027] The measured sensor response current is supplied from the sample supply hole 10 similar to the sucrose sensor was manufactured sucrose solution 3μl as a sample solution as in Example 1 as described above, a value proportional to the sucrose concentration is obtained It was.

【0028】(実施例3)バイオセンサの一例として、 [0028] As an example (Example 3) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor.

【0029】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0029] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and to form an insulating layer 6.

【0030】次に、前記電極系上に0.5wt%ヒドロキシエチルセルロース(以下、HECと略す)水溶液を滴下、乾燥させてHEC層を形成した。 [0030] Next, 0.5 wt% hydroxyethyl cellulose on the electrode system (hereinafter, referred to as HEC) dropwise an aqueous solution to form a HEC layer was dried. つづいて、前記H Subsequently, the H
EC層上にINVとMUTとGODとフェリシアン化カリウムとリン酸二ナトリウム塩を[N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N'−2−エタンスルホン酸] The EC layer and INV and MUT and GOD and potassium ferricyanide and phosphate disodium salt [N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid]
−水酸化ナトリウム緩衝液(pH=7.2:以下、HE - sodium hydroxide buffer (pH = 7.2: the following, HE
PES−NaOH緩衝液と略す)に溶解させた混合溶液を滴下し、温風乾燥器中で乾燥させて反応層7を形成した。 It was added dropwise a mixed solution prepared by dissolving abbreviated as PES-NaOH buffer), to form a reaction layer 7 and dried in hot air drier.

【0031】上記のように作製したスクロースセンサに試料液としてスクロース水溶液10μlを反応層上へ滴下して反応層を溶解させ、一定時間後に実施例1と同様に作用極と対極間に定電圧を印加して応答電流を測定した。 [0031] dissolving the reaction layer by the dropwise addition of aqueous sucrose solution 10μl into the reaction layer as a sample solution to the sucrose sensor was manufactured as described above, the constant voltage across the same manner as in Example 1, the working electrode and the counter electrode after a predetermined time applied to the measured response current.

【0032】グルコースのα体からβ体への異性化はM [0032] isomerization of β body from α the body of glucose M
UTおよびリン酸イオン双方の作用によって促進される。 It is promoted by UT and phosphate ions both effects. 本実施例のスクロースセンサのように、反応層中にMUTとリン酸イオンとを共に有することにより、グルコースのα体からβ体への異性化の速度をさらに加速することができる。 As sucrose sensor of the present embodiment, by having both the MUT and phosphate ions in the reaction layer, it is possible to further accelerate the rate of isomerization to β body from α body glucose. その結果、より短時間でセンサ応答を得ることが可能となる。 As a result, it becomes possible to obtain a shorter time sensor response.

【0033】(実施例4)バイオセンサの一例として、 [0033] As an example (Example 4) biosensor,
グルコースセンサについて説明する。 The glucose sensor is described.

【0034】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0034] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and to form an insulating layer 6.

【0035】次に、前記電極系上に0.5wt%ヒドロキシプロピルセルロース(以下、HPCと略す)水溶液を滴下、乾燥させてHPC層を形成した。 [0035] Next, 0.5 wt% hydroxypropyl cellulose on the electrode system (hereinafter, abbreviated as HPC) dropwise an aqueous solution to form a HPC layer was dried. つづいて、前記HPC層上にGODとフェリシアン化カリウムとリン酸二カリウム塩をクエン酸二水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液(pH=5.5)に溶解させた混合溶液を滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させて反応層7を形成した。 Subsequently, the HPC sodium dihydrogen citrate of GOD and potassium ferricyanide and dipotassium phosphate salt on the layer - was added dropwise a mixed solution prepared by dissolving sodium hydroxide buffer (pH = 5.5), of 50 ° C. to form a reaction layer 7 and dried in hot air drier for 10 minutes. さらに、カバーおよびスペーサーを実施例1同様に接着してグルコースセンサを作製した。 Further, to produce a glucose sensor by bonding a cover and a spacer in the same manner as in Example 1.

【0036】上記のように作製したグルコースセンサに試料液としてグルコース水溶液10μlを供給して反応層を溶解させ、一定時間後に実施例1と同様に作用極と対極間に定電圧を印加して応答電流を測定した。 [0036] supplying the glucose solution 10μl as a sample solution to the glucose sensor produced as above was dissolved the reaction layer, applying a constant voltage between the same manner as in Example 1, the working electrode and the counter electrode after a predetermined time response the current was measured.

【0037】GODはグルコースの異性体のうちβ体のみを特異的に酸化する機能を有しているが、グルコースは水溶液中ではα体とβ体が平衡状態にある。 The GOD is has the ability to specifically oxidize the β bodies only of the isomers of glucose, glucose in aqueous solution is in the α body and β body equilibrium. 本実施例のグルコースセンサを用いると、反応層中に予め添加したリン酸イオンの作用によってグルコースのα体からβ With the glucose sensor of this example, beta from α body glucose by the action of pre-added phosphate ions in the reaction layer
体への異性化が迅速に行われるため、試料液中の全グルコース量に比例した応答電流を短時間で得ることができる。 Since the isomerization of the body is performed quickly, it is possible to obtain a response current proportional to the total amount of glucose in the sample solution in a short time.

【0038】さらに、反応層中にMUTを添加すると、 [0038] Furthermore, the addition of MUT in the reaction layer,
測定時間をより一層短くすることができると共に、測定精度を高めることも可能である。 The measurement time with can be further shortened, it is possible to improve the measurement accuracy.

【0039】また、本実施例で用いたGODの至適pH Further, pH optimum GOD used in this example
は5付近であり、反応層中に添加したpH緩衝剤(クエン酸二水素ナトリウム−水酸化ナトリウム)の緩衝作用によって試料液のpHにかかわらず、酵素反応をpH5 Is around 5, pH buffering agents (sodium dihydrogen citrate - sodium hydroxide) was added to the reaction layer regardless of the pH of the sample solution by the buffer action of the enzyme reaction pH5
付近で進行させることができる。 It can be allowed to proceed in the vicinity. したがって、精度の高い測定が可能となる。 This enables accurate measurement.

【0040】なお、緩衝液としてはクエン酸二水素ナトリウム−NaOH(pH=5.5)を用いたが、これ以外にもクエン酸−クエン酸三ナトリウム、クエン酸−クエン酸三カリウム、クエン酸二水素カリウム−NaO [0040] Note that as the buffer with sodium dihydrogen citrate -NaOH (pH = 5.5), other citrate also - trisodium citrate, citric acid - Citric acid tripotassium citrate potassium dihydrogen -NaO
H、マレイン酸水素ナトリウム−NaOH、フタル酸水素カリウム−NaOH、コハク酸−四ホウ酸ナトリウムの組合せをpH5〜6付近の値に調整して用いても同様の効果が得られた。 H, sodium hydrogen maleate -NaOH, potassium hydrogen phthalate -NaOH, succinic acid - a four similar effects the combination of sodium borate used is adjusted to a value of around pH5~6 obtained.

【0041】(実施例5)バイオセンサの一例として、 [0041] As an example (Example 5) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor. 図4は本実施例のスクロースセンサの断面図である。 Figure 4 is a cross-sectional view of a sucrose sensor of this embodiment.

【0042】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0042] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成し、前記電極系上にCMC層を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and the insulating layer 6 is formed, thereby forming a CMC layer on the electrode system.

【0043】次に、前記CMC層上にINV、MUT、 Next, INV on the CMC layer, MUT,
GODおよびフェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液(0.2M:KH 2 PO 4 −0.2M:Na 2 HPO 4 ;p GOD and potassium ferricyanide and phosphate buffer (0.2M: KH 2 PO 4 -0.2M : Na 2 HPO 4; p
H=7.4)に溶解させた混合溶液を滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させて反応層7を形成した。 It was added dropwise a mixed solution prepared by dissolving H = 7.4), to form a reaction layer 7 and dried in a hot air dryer at 50 ° C. 10 min.

【0044】つぎにCMCをリン酸緩衝液(0.5M: [0044] Next, phosphate buffer CMC (0.5M:
KH 2 PO 4 −0.5M:Na 2 HPO 4 ;pH=7.4) KH 2 PO 4 -0.5M: Na 2 HPO 4; pH = 7.4)
に溶解した溶液をカバー9の内側へ滴下し、乾燥させてpH緩衝剤層20を形成した。 Dissolved was added dropwise to the inside of the cover 9 into to form a pH buffer layer 20 and dried. 前記pH緩衝剤層20を形成したカバー9とスペーサー8とを実施例1同様に接着してスクロースセンサを作製した(図4にその断面を示す)。 To prepare a sucrose sensor was adhered in the same manner as in Example 1 and the cover 9 and the spacer 8 formed the pH buffer layer 20 (showing a cross-section in FIG. 4).

【0045】このスクロースセンサに、pH3〜7のスクロース標準液を試料液として供給し、実施例1と同様にして応答を測定したところ、試料液のpHに依存せず、スクロース濃度に比例した値が得られた。 [0045] The sucrose sensor, supplying a sucrose standard solution pH3~7 as a sample liquid was measured response in the same manner as in Example 1, without depending on the pH of the sample solution, in proportion to the sucrose concentration value was gotten.

【0046】(実施例6)バイオセンサの一例として、 [0046] As an example (Example 6) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor.

【0047】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0047] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and to form an insulating layer 6. さらに、CMC層を前記電極系上に形成した。 Further, to form a CMC layer on the electrode system.

【0048】次に、前記CMC層上にINVとGODとフェリシアン化カリウムとリン酸二カリウム塩の混合水溶液を滴下し、乾燥させて反応層7を形成した。 Next, it was added dropwise a mixed solution of INV and GOD and potassium ferricyanide and dipotassium phosphate salt on the CMC layer, thereby forming a reaction layer 7 and dried. さらに、実施例1と同様にしてカバー9およびスペーサー8 Further, in the same manner as in Example 1 the cover 9 and the spacer 8
と共に一体化してスクロースセンサを作製した。 To prepare a sucrose sensor was integrated with.

【0049】前記スクロースセンサに試料液としてスクロース水溶液3μlを実施例1と同様に試料供給孔10 [0049] the same manner as described sample supply hole 10 as in Example 1 sucrose solution 3μl as a sample liquid sucrose sensor
から供給してセンサ応答電流を測定したところ、スクロース濃度に比例した値が得られた。 Supplied was measured sensor response current from a value proportional to the sucrose concentration was obtained.

【0050】(実施例7)バイオセンサの一例として、 [0050] As an example (Example 7) biosensor,
スクロースセンサについて説明する。 It explained sucrose sensor.

【0051】実施例1と同様にして、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、リ−ド2、3 [0051] In the same manner as in Example 1, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, Li - de 2,3
と電極系(作用極4、対極5)および絶縁層6を形成した。 An electrode system (working electrode 4, the counter electrode 5) and to form an insulating layer 6. さらに、CMC層を前記電極系上に形成した。 Further, to form a CMC layer on the electrode system.

【0052】つぎに、前記CMC層上にINVとMUT Next, INV and MUT on the CMC layer
とGODとフェリシアン化カリウムをリン酸緩衝液(0.6M:KH 2 PO 4 −0.6M:Na 2 HPO 4 ;p The GOD and potassium ferricyanide and phosphate buffer (0.6M: KH 2 PO 4 -0.6M : Na 2 HPO 4; p
H=7.4)に溶解させた混合溶液を滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させてCMC−酵素−フェリシアン化カリウム層を形成した。 It was added dropwise a mixed solution prepared by dissolving H = 7.4), dried in a hot air dryer at 50 ° C. 10 min CMC- enzyme - to form a potassium ferricyanide layer. つぎに前記CMC− Next, the CMC-
酵素−フェリシアン化カリウム層上へ、親水性高分子としてポリビニルピロリドン(以下PVPと略す)の2wt Enzyme - to potassium ferricyanide layer, polyvinyl pyrrolidone as a hydrophilic polymer (hereinafter abbreviated as PVP) 2 wt
%エタノール溶液を展開後乾燥させて反応層7を形成した。 % Ethanol solution to form a reaction layer 7 is dried after developing.

【0053】このように反応層の表面を親水性高分子層で被覆した構造にすることにより、表面の平滑性を高めることができる。 [0053] By the structure obtained by coating the surface of such reaction layer with a hydrophilic polymer layer, it is possible to enhance the smoothness of the surface. その結果、試料液をセンサに供給した際に表面の起伏部分に取り残された空気によって生成する気泡の発生を抑えることができ、応答のばらつきを小さくすることができる。 As a result, it is possible to suppress the generation of air bubbles generated by air left in relief portion of the surface upon supplying a sample solution to the sensor, it is possible to reduce variations in response.

【0054】特に、本実施例のように反応層中のpH緩衝剤の濃度が高い場合には結晶析出によって反応層表面に多数の凹凸部が形成されるために、親水性高分子による反応層表面の平滑化が有効である。 [0054] In particular, for a large number of uneven portions are formed in the reaction layer surface by the crystal precipitated when the concentration of the pH buffer agent in the reaction layer as in the present embodiment is high, the reaction layer with a hydrophilic polymer smoothing of the surface is effective.

【0055】なお、上記実施例ではフルクトースセンサとグルコースセンサについて示したが、本発明はグルコース−6−リン酸センサ、マルトースセンサ、ラクトースセンサ、セルロースセンサにも用いることが可能である。 [0055] Incidentally, this embodiment shows the fructose sensor and glucose sensors, but the present invention can be used glucose-6-phosphate sensor, maltose sensor, lactose sensor, also cellulose sensors. この場合、酵素は順番に、アルカリフォスファターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシターゼ、セルラーゼを用いれば良い。 In this case, the enzyme in turn, alkaline phosphatase, maltase, beta-galactosidase, may be used cellulase.

【0056】上記実施例のスクロースセンサでは、緩衝液としてKH 2 PO 4 −Na 2 HPO 4 (pH=7.4)およびHEPES−NaOH(pH=7.2)およびマレイン酸−Tris(pH=7.5)を用いたが、これら以外にもKH 2 PO 4 −K 2 HPO 4 、NaH 2 PO 4 −K 2 [0056] In the sucrose sensor of Example, KH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 (pH = 7.4) and HEPES-NaOH (pH = 7.2) and maleic acid-Tris (pH = 7 as buffer .5) was used but, KH 2 in addition to these PO 4 -K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 -K 2
HPO 4 、NaH 2 PO 4 −Na 2 HPO 4 、クエン酸−N HPO 4, NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4, citric acid -N
2 HPO 4 、クエン酸−K 2 HPO 4 、Tris−Tri a 2 HPO 4, citric acid -K 2 HPO 4, Tris-Tri
s塩酸塩、[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル− s hydrochloride, [N-tris (hydroxymethyl) methyl -
2−アミノエタンスルホン酸]−NaOH、[ピペラジン−N,N'−ビス(2−エタンスルホン酸)]−Na 2-aminoethanesulfonic acid] -NaOH, [piperazine -N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)] - Na
OHの組合せをpH7〜8付近の値に調整して用いても同様の効果が得られた。 Similar effects were obtained using by adjusting the combination of OH to a value of around pH 7-8.

【0057】さらに、上記実施例では親水性高分子としてCMC、HEC、HPC、PVPを用いたが、これらに限定されることはなく、他のセルロース誘導体、具体的には、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロースを用いてもよく、さらには、ポリビニルアルコール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩を用いても同様の効果が得られた。 [0057] Further, in the above embodiment CMC as the hydrophilic polymer, HEC, HPC, was used PVP, is not limited to these, other cellulose derivatives, specifically, methyl cellulose, ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, may be used carboxymethyl cellulose, and further, by using polyvinyl alcohol, gelatin and its derivatives, acrylic acid and its salts, methacrylic acid and its salts, starch and its derivatives, maleic anhydride and salts thereof the same effect was obtained.

【0058】一方、電子受容体としては、上記実施例に示したフェリシアン化カリウム以外に、p−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体なども使用できる。 Meanwhile, as the electron acceptor, in addition to potassium ferricyanide shown in the above example, p- benzoquinone, phenazine methosulfate, methylene blue, and the like ferrocene derivatives can be used.

【0059】また、上記実施例において酵素および電子受容体については試料液に溶解する方式について示したが、これに制限されることはなく、固定化によって試料液に不溶化させた場合にも適用することができる。 [0059] Further, although the enzyme and the electron acceptor in the above embodiments given for method of dissolving in the sample solution, it is not limited thereto, also applies when insolubilized in the sample solution by the immobilized be able to.

【0060】また、上記実施例では、作用極と対極のみの二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極方式にすれば、より正確な測定が可能である。 [0060] In the above embodiment has been described bipolar electrode system only working electrode and the counter electrode, if the three-electrode system plus a reference electrode, it is possible to more accurate measurements.

【0061】 [0061]

【発明の効果】以上のように本発明によると、高い信頼性を有するバイオセンサを安価に得ることができる。 According to the present invention as described above, according to the present invention, it is possible to obtain a biosensor at low cost with high reliability.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明のバイオセンサの一実施例として作製したスクロースセンサの断面図 Sectional view of a sucrose sensor was manufactured as an embodiment of the biosensor of the present invention; FIG

【図2】同スクロースセンサのうち反応層を除いた分解斜視図 2 is an exploded perspective view, excluding the reaction layer of the sucrose sensor

【図3】同スクロースセンサの応答例を示した図 It illustrates an example response of Figure 3 the sucrose sensor

【図4】本発明の異なる実施例のスクロースセンサの断面図 Sectional view of the sucrose sensor different embodiments of the present invention; FIG

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1 絶縁性の基板 2、3 リード 4 作用極 5 対極 6 絶縁層 7 反応層 8 スペーサー 9 カバー 10 試料供給孔 11 空気孔 20 pH緩衝剤層 1 insulating substrate 2 leads 4 working electrode 5 counter 6 insulating layer 7 reaction layer 8 spacer 9 cover 10 sample supply hole 11 air hole 20 pH buffer agent layer

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Nankai Shiro Osaka Prefecture Kadoma Oaza Kadoma 1006 address Matsushita Electric industrial Co., Ltd. in

Claims (7)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】電気絶縁性の基板と、前記基板上に形成された、作用極および対極を有する電極系と、前記電極系上に形成された反応層とから構成され、前記反応層が少なくとも酵素と電子受容体と親水性高分子とリン酸塩とを含有することを特徴とするバイオセンサ。 And 1. A electrically insulating substrate, which is formed on the substrate, is composed of an electrode system having a working electrode and a counter electrode, a reaction layer formed on the electrode system, the reaction layer of at least biosensor characterized in that it contains an enzyme and an electron acceptor and a hydrophilic polymer and phosphate.
  2. 【請求項2】請求項1において、絶縁性の基板上に接してあるいは近接してpH緩衝剤を形成したバイオセンサ。 2. A according to claim 1, biosensor formed the pH buffering agent in contact with or in proximity to the substrate of insulating.
  3. 【請求項3】請求項1または2において、反応層が、親水性高分子からなる第1の層と少なくとも酵素と電子受容体とリン酸塩を含む第2の層を順に積層してなるバイオセンサ。 3. An apparatus according to claim 1 or 2, bio-reaction layer comprises a second layer comprising a first layer and at least an enzyme and an electron acceptor and phosphate consisting of hydrophilic polymer are laminated in this order sensor.
  4. 【請求項4】請求項1または2において、反応層が、親水性高分子からなる第1の層と、少なくとも酵素と電子受容体とリン酸塩を含む第2の層と、親水性高分子からなる第3の層を順に積層してなるバイオセンサ。 4. The method of claim 1 or 2, the reaction layer comprises a first layer of a hydrophilic polymer, a second layer comprising at least an enzyme and an electron acceptor and phosphate, hydrophilic polymer biosensor a third layer formed by laminating in this order consisting of.
  5. 【請求項5】請求項1または2において、酵素がインベルターゼとグルコースオキシダーゼの組合せ、あるいはグルコースオキシダーゼであるバイオセンサ。 5. A method according to claim 1 or 2, the enzyme is invertase and glucose oxidase combination or biosensor is glucose oxidase.
  6. 【請求項6】請求項1または2において、酵素がインベルターゼとグルコースオキシダーゼとムタロターゼの組合せ、あるいはグルコースオキシダーゼとムタロターゼの組合せであるバイオセンサ。 6. The method according to claim 1 or 2, enzyme invertase and glucose oxidase and mutarotase combination or biosensor is a combination of glucose oxidase and mutarotase.
  7. 【請求項7】請求項1または2において、酵素がアルカリフォスファターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシターゼ、セルラーゼの中から選ばれたものであるバイオセンサ。 7. The method of claim 1 or 2, the biosensor enzymes are those selected from among alkaline phosphatase, maltase, beta-galactosidase, cellulase.
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