JPH0597896A - 味覚修飾物質 - Google Patents
味覚修飾物質Info
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- JPH0597896A JPH0597896A JP3253914A JP25391491A JPH0597896A JP H0597896 A JPH0597896 A JP H0597896A JP 3253914 A JP3253914 A JP 3253914A JP 25391491 A JP25391491 A JP 25391491A JP H0597896 A JPH0597896 A JP H0597896A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新しいアミノ酸配列を有し、二量体として存
在する、安定で、味覚修飾活性効果の強い味覚修飾物資
を提供すること。 【構成】 ２９番目のシステイン残基と５２番目のシス
テイン残基が鎖内結合し、７７番目のシステイン残基同
士及び１０９番目のシステイン残基同士が鎖間結合する
ことにより二量体を形成し、かつ単量体としては下記配
列表のアミノ酸配列を有する味覚修飾物質。 （配列表：Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln ThrLeu H
is Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu
ThrIle Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln As
n Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg
Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly As
n Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn
Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Le
u Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly
Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Ar
g Val Asn Gly ）
在する、安定で、味覚修飾活性効果の強い味覚修飾物資
を提供すること。 【構成】 ２９番目のシステイン残基と５２番目のシス
テイン残基が鎖内結合し、７７番目のシステイン残基同
士及び１０９番目のシステイン残基同士が鎖間結合する
ことにより二量体を形成し、かつ単量体としては下記配
列表のアミノ酸配列を有する味覚修飾物質。 （配列表：Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln ThrLeu H
is Ala Asp His Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu
ThrIle Gln Asn Lys Cys Asn Leu Val Lys Tyr Gln As
n Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr Asp Arg Arg
Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly As
n Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn
Gly Ser Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Le
u Val Leu Gln Lys Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly
Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly Pro Asn Gly Cys Arg Ar
g Val Asn Gly ）
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はクルクリゴ・ラチフォリ
アから得られるクルクリン様の味覚修飾物質からなり、
安定で、味覚修飾効果の強い味覚修飾物質に関する。
アから得られるクルクリン様の味覚修飾物質からなり、
安定で、味覚修飾効果の強い味覚修飾物質に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】先に、
本発明者らは、西マレーシアやタイ南部等に自生するき
んばいざさ科又はひがんばな科きんばいざさ属の植物ク
ルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifolia ）の果
実から味覚修飾物質となるクルクリン（本発明者が命名
した仮名）を見い出し、さらに、このクルクリンは、こ
れを食した後水または酸味物質を飲食することにより、
甘味を感じさせる蛋白質であることを見い出し出願し
た。（特開平２−１０４２６３号）。続いて、本発明者
らは、この蛋白質クルクリンを高度に精製し、そのアミ
ノ酸配列を有する味覚修飾物質を出願した（特開平３−
１９０８９９号）。
本発明者らは、西マレーシアやタイ南部等に自生するき
んばいざさ科又はひがんばな科きんばいざさ属の植物ク
ルクリゴ・ラチフォリア（Curculigo latifolia ）の果
実から味覚修飾物質となるクルクリン（本発明者が命名
した仮名）を見い出し、さらに、このクルクリンは、こ
れを食した後水または酸味物質を飲食することにより、
甘味を感じさせる蛋白質であることを見い出し出願し
た。（特開平２−１０４２６３号）。続いて、本発明者
らは、この蛋白質クルクリンを高度に精製し、そのアミ
ノ酸配列を有する味覚修飾物質を出願した（特開平３−
１９０８９９号）。
【０００３】しかしながら、上記発明にもかかわらず、
更に味覚修飾効果の安定で強いものが望まれている。本
発明は、新しいアミノ酸配列を有し、二量体として存在
する、安定で、味覚修飾効果の強い味覚修飾物質を提供
することを目的とするものである。
更に味覚修飾効果の安定で強いものが望まれている。本
発明は、新しいアミノ酸配列を有し、二量体として存在
する、安定で、味覚修飾効果の強い味覚修飾物質を提供
することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の味覚修飾物質
は、２９番目のシステイン残基と５２番目のシステイン
残基が鎖内結合し、７７番目のシステイン残基同士及び
１０９番目のシステイン残基同士においてそれぞれ鎖間
結合することにより二量体を形成し、かつ、単量体とし
ては下記配列表のアミノ酸配列を有する。
は、２９番目のシステイン残基と５２番目のシステイン
残基が鎖内結合し、７７番目のシステイン残基同士及び
１０９番目のシステイン残基同士においてそれぞれ鎖間
結合することにより二量体を形成し、かつ、単量体とし
ては下記配列表のアミノ酸配列を有する。
【０００５】 配列表： Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser １５ Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn ３０ Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr ４５ Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly ６０ Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn Gly Ser ７５ Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys ９０ Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly １０５ Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly １１４） 以下、本発明の味覚修飾物質について詳述する。
【０００６】本発明の味覚修飾物質は、例えば、次のよ
うにして得られる。まず、クルクリゴ・ラチフォリアの
果実又はその果肉に、水を加えてホモジナイズし遠心分
離する。この時上清は、濃い褐色を示す。さらに、この
沈渣に当初の果実又はその果肉と等量の水を加えてホモ
ジナイズし、遠心分離する。上清が無色になるまで水洗
操作を繰り返し、沈渣を得る。どの上清にも味覚修飾活
性はない。
うにして得られる。まず、クルクリゴ・ラチフォリアの
果実又はその果肉に、水を加えてホモジナイズし遠心分
離する。この時上清は、濃い褐色を示す。さらに、この
沈渣に当初の果実又はその果肉と等量の水を加えてホモ
ジナイズし、遠心分離する。上清が無色になるまで水洗
操作を繰り返し、沈渣を得る。どの上清にも味覚修飾活
性はない。
【０００７】続いて、上記から得られた沈渣は、０．０
１Ｍ以上の濃度の塩の水溶液で抽出して、クルクリン様
物質を含む粗抽出液を得ることができる。上記の塩とし
ては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム若しくはアンモニウムの塩酸塩、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム若しくはアンモニウムの
リン酸塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム若しくはアンモニウムの炭酸塩、ナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム若しくはアンモニウ
ムの硫酸塩又は亜硫酸塩、ナトリウム若しくはカリウム
の硝酸塩または亜硝酸塩、ナトリウム若しくはカルシウ
ムの乳酸塩、ミョウバン、焼ミョウバン、酢酸ナトリウ
ム、ナトリウム若しくはカリウムのピロリン酸塩、ナト
リウム若しくはカルシウムのプロピオン酸塩、安息香酸
ナトリウム、フマル酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナト
リウム等が用いられる。
１Ｍ以上の濃度の塩の水溶液で抽出して、クルクリン様
物質を含む粗抽出液を得ることができる。上記の塩とし
ては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム若しくはアンモニウムの塩酸塩、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム若しくはアンモニウムの
リン酸塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム若しくはアンモニウムの炭酸塩、ナトリウム、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム若しくはアンモニウ
ムの硫酸塩又は亜硫酸塩、ナトリウム若しくはカリウム
の硝酸塩または亜硝酸塩、ナトリウム若しくはカルシウ
ムの乳酸塩、ミョウバン、焼ミョウバン、酢酸ナトリウ
ム、ナトリウム若しくはカリウムのピロリン酸塩、ナト
リウム若しくはカルシウムのプロピオン酸塩、安息香酸
ナトリウム、フマル酸ナトリウム、ポリアクリル酸ナト
リウム等が用いられる。
【０００８】上記の塩の水溶液による抽出手段の一例を
あげると、次の通りである。上記水洗操作後、得られた
沈渣に塩化ナトリウム溶液を加えてホモジナイズし、遠
心分離又は濾過を行なって、クルクリン様物質を含む粗
抽出液を得る。次いで、上記のクルクリン様物質を含む
粗抽出液を以下の通り精製し、高純度味覚修飾物質を得
る。
あげると、次の通りである。上記水洗操作後、得られた
沈渣に塩化ナトリウム溶液を加えてホモジナイズし、遠
心分離又は濾過を行なって、クルクリン様物質を含む粗
抽出液を得る。次いで、上記のクルクリン様物質を含む
粗抽出液を以下の通り精製し、高純度味覚修飾物質を得
る。
【０００９】上記粗抽出液の精製は、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどで塩析
し、通常のクロマトグラフィーによって精製することが
できる。一例としては、硫酸アンモニウムで塩析して得
られた沈澱を、ＣＭ−セファロースイオン交換クロマト
グラフィーにかけ、さらに分子ふるいクロマトグラフィ
ーにかけることによって、高純度クルクリン様の味覚修
飾物質が得られる。
ム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどで塩析
し、通常のクロマトグラフィーによって精製することが
できる。一例としては、硫酸アンモニウムで塩析して得
られた沈澱を、ＣＭ−セファロースイオン交換クロマト
グラフィーにかけ、さらに分子ふるいクロマトグラフィ
ーにかけることによって、高純度クルクリン様の味覚修
飾物質が得られる。
【００１０】上記高純度の味覚修飾物質のアミノ酸配列
の決定は、該高純度物質を還元しＳＨ基をブロックした
後、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチ
ダーゼ等の酵素で加水分解した後、水系の逆相のカラム
を用いＨＰＬＣで各ペプチドフラグメントを精製し、さ
らに、このペプチドフラグメントの構造を決定すること
によって行う。
の決定は、該高純度物質を還元しＳＨ基をブロックした
後、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチ
ダーゼ等の酵素で加水分解した後、水系の逆相のカラム
を用いＨＰＬＣで各ペプチドフラグメントを精製し、さ
らに、このペプチドフラグメントの構造を決定すること
によって行う。
【００１１】上記味覚修飾物質は、クルクリン様蛋白質
の二量体で形成されることにより、安定で、味覚修飾効
果の高い味覚修飾物質として得られ、二量体は、７７番
目のシステイン残基同士及び１０９番目のシステイン残
基同士において、それぞれ鎖間結合（ジスルフィド結
合）することにより形成する。鎖間結合の決定は、高純
度味覚修飾物質を、サーモリシン、トリプシン等の各種
蛋白質分解酵素を用いて断片化し、この中からシスチン
を含むペプチドフラグメントをＨＰＬＣ等により精製
し、このペプチドフラグメントの構造を決定し、さら
に、一次構造と比較することにより確認する。
の二量体で形成されることにより、安定で、味覚修飾効
果の高い味覚修飾物質として得られ、二量体は、７７番
目のシステイン残基同士及び１０９番目のシステイン残
基同士において、それぞれ鎖間結合（ジスルフィド結
合）することにより形成する。鎖間結合の決定は、高純
度味覚修飾物質を、サーモリシン、トリプシン等の各種
蛋白質分解酵素を用いて断片化し、この中からシスチン
を含むペプチドフラグメントをＨＰＬＣ等により精製
し、このペプチドフラグメントの構造を決定し、さら
に、一次構造と比較することにより確認する。
【００１２】さらに、本発明の味覚修飾物質の一量体に
おいて、２９番目のシステイン残基と５２番目のシステ
イン残基において、鎖内結合（ジスルフィド結合）して
いる。鎖内結合の決定は、鎖間結合の決定と同様にして
行う。即ち、上記高純度味覚修飾物質を、サーモリシ
ン、トリプシン等の各種蛋白質分解酵素を用いて断片化
し、この中からシスチンを含むペプチドフラグメントを
ＨＰＬＣ等により精製し、このペプチド断片の構造を決
定し、さらに、一次構造と比較することにより確認すれ
ばよい。
おいて、２９番目のシステイン残基と５２番目のシステ
イン残基において、鎖内結合（ジスルフィド結合）して
いる。鎖内結合の決定は、鎖間結合の決定と同様にして
行う。即ち、上記高純度味覚修飾物質を、サーモリシ
ン、トリプシン等の各種蛋白質分解酵素を用いて断片化
し、この中からシスチンを含むペプチドフラグメントを
ＨＰＬＣ等により精製し、このペプチド断片の構造を決
定し、さらに、一次構造と比較することにより確認すれ
ばよい。
【００１３】以上から得られる高純度味覚修飾物質は、
液状調味剤として１０-7Ｍ以上の濃度で存在することが
望ましく、また乾物調味剤として１０ppm w/w ％以上存
在させることが望ましい。また、本発明に係る高純度味
覚修飾物質は、前記のアミノ酸配列を有するので、この
アミノ酸配列通りに、適当な合成方法、例えば、固相合
成、部分固相合成、フラグメント縮合または溶液合成に
よって合成してもよいし、適当な宿主を選び、組み換え
ＤＮＡ技術を用いても得ることができるものである。
液状調味剤として１０-7Ｍ以上の濃度で存在することが
望ましく、また乾物調味剤として１０ppm w/w ％以上存
在させることが望ましい。また、本発明に係る高純度味
覚修飾物質は、前記のアミノ酸配列を有するので、この
アミノ酸配列通りに、適当な合成方法、例えば、固相合
成、部分固相合成、フラグメント縮合または溶液合成に
よって合成してもよいし、適当な宿主を選び、組み換え
ＤＮＡ技術を用いても得ることができるものである。
【００１４】
【発明の効果】本発明の味覚修飾物質は、高純度クルク
リン様物質からなる甘味を誘導する物質で、二量体を形
成してなる安定で、味覚修飾効果の強い甘味物質とし
て、食品、飲料、飼料、ペットフード又は薬剤などに適
宜含有させて用いることができる。
リン様物質からなる甘味を誘導する物質で、二量体を形
成してなる安定で、味覚修飾効果の強い甘味物質とし
て、食品、飲料、飼料、ペットフード又は薬剤などに適
宜含有させて用いることができる。
【００１５】又、本発明の味覚修飾物質は、そのアミノ
酸配列を決定したので、化学的および遺伝子工学的手法
により、大量に製造することが可能で有用である。
酸配列を決定したので、化学的および遺伝子工学的手法
により、大量に製造することが可能で有用である。
【００１６】
〔実施例１〕（水洗および塩化ナトリウム溶液による抽
出） クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇをとり４０mlの
水を加えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００rp
m、６０分間）した。この上清は褐色を示し、味覚修飾
活性はなかった。更に得られた沈渣に、４０mlの水を加
えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００rpm、２
０分間）した。この上清は、無色で、味覚修飾活性はな
かった。
出） クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇをとり４０mlの
水を加えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００rp
m、６０分間）した。この上清は褐色を示し、味覚修飾
活性はなかった。更に得られた沈渣に、４０mlの水を加
えてホモジナイズし、遠心分離（１２，５００rpm、２
０分間）した。この上清は、無色で、味覚修飾活性はな
かった。
【００１７】次に、得られた沈渣に０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液を加えてホモジナイズし、遠心分離（３０，０
００rpm、６０分間）した。得られた上清は、無色で、
味覚修飾活性を示した。更に、４０mlの０．５Ｍ塩化ナ
トリウム溶液による抽出操作を２回繰り返し、これら３
回分の上清を合わせ、クルクリン様の味覚修飾物質を含
む粗抽出液を得た。 〔実施例２〕（硫酸アンモニウムによる塩析） 実施例１で得られた粗抽出液に、８０％飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを添加して活性物質を析出させた。
これを遠心分離（３２，０００rpm、６０分間）して得
た沈澱を、１００ｍｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）に溶解した。 〔実施例３〕（ＣＭ−セファロースイオン交換クロマト
グラフィー） 実施例２で得られた溶液を、ＣＭ−セファロースＣＬ−
６Ｂカラム（直径２．２cm×長さ１８cm、ベッド体積６
８ml、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）に
流し吸着させた。
ウム溶液を加えてホモジナイズし、遠心分離（３０，０
００rpm、６０分間）した。得られた上清は、無色で、
味覚修飾活性を示した。更に、４０mlの０．５Ｍ塩化ナ
トリウム溶液による抽出操作を２回繰り返し、これら３
回分の上清を合わせ、クルクリン様の味覚修飾物質を含
む粗抽出液を得た。 〔実施例２〕（硫酸アンモニウムによる塩析） 実施例１で得られた粗抽出液に、８０％飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを添加して活性物質を析出させた。
これを遠心分離（３２，０００rpm、６０分間）して得
た沈澱を、１００ｍｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）に溶解した。 〔実施例３〕（ＣＭ−セファロースイオン交換クロマト
グラフィー） 実施例２で得られた溶液を、ＣＭ−セファロースＣＬ−
６Ｂカラム（直径２．２cm×長さ１８cm、ベッド体積６
８ml、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）に
流し吸着させた。
【００１８】続いて、０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）で素通り画分を除去した後、塩化ナトリウム溶
液０〜１．０Ｍの直線濃度勾配溶出法でクルクリン様味
覚修飾物質を溶出させた（流速５ml／１時間、１分画５
ml、全溶出液量５００ml）。溶出した蛋白質は２８０nm
の吸収によりモニターした。その結果を第１図に示し
た。第１図に示すピーク（Ｂ）が味覚修飾物質を含む画
分である。 〔実施例４〕（分子ふるいクロマトグラフィー） 実施例３で得られた第１図のピーク（Ｂ）の斜線部分に
示された画分に、８０％飽和になるように硫酸アンモニ
ウムを添加して、活性物質を析出させた。これを遠心分
離（３２，０００rpm、６０分間）して得た沈澱を、
１．５mlの０．０１Ｍリン酸緩衝液（PH ６．８）に溶
解した。
６．８）で素通り画分を除去した後、塩化ナトリウム溶
液０〜１．０Ｍの直線濃度勾配溶出法でクルクリン様味
覚修飾物質を溶出させた（流速５ml／１時間、１分画５
ml、全溶出液量５００ml）。溶出した蛋白質は２８０nm
の吸収によりモニターした。その結果を第１図に示し
た。第１図に示すピーク（Ｂ）が味覚修飾物質を含む画
分である。 〔実施例４〕（分子ふるいクロマトグラフィー） 実施例３で得られた第１図のピーク（Ｂ）の斜線部分に
示された画分に、８０％飽和になるように硫酸アンモニ
ウムを添加して、活性物質を析出させた。これを遠心分
離（３２，０００rpm、６０分間）して得た沈澱を、
１．５mlの０．０１Ｍリン酸緩衝液（PH ６．８）に溶
解した。
【００１９】この濃縮液をセファデックス（ファルマシ
アＬＫＢバイオテクノロジー社製）Ｇ−１００カラム
（直径１．６cm×５８cm、ベッド体積１６０ml）を用い
０．５ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）により分離した（流速８．４ml／１時間、１分
画２．８ml、全溶出量１８２ml）。蛋白質は２８０nmの
吸収によりモニターした。その結果を第２図に示した。
第２図に示すピーク（Ａ）がクルクリン様味覚修飾物質
を含む画分である。
アＬＫＢバイオテクノロジー社製）Ｇ−１００カラム
（直径１．６cm×５８cm、ベッド体積１６０ml）を用い
０．５ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．８）により分離した（流速８．４ml／１時間、１分
画２．８ml、全溶出量１８２ml）。蛋白質は２８０nmの
吸収によりモニターした。その結果を第２図に示した。
第２図に示すピーク（Ａ）がクルクリン様味覚修飾物質
を含む画分である。
【００２０】この第２図に示すピーク（Ａ）の画分を、
８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して、
活性物質を析出させた。これを遠心分離（３２，０００
rpm、６０分間）して得た沈澱を、１．５mlの２Ｍ酢酸
アンモニウム溶液に溶解した。この溶液を、２Ｍ酢酸ア
ンモニウム溶液で平衡化したセファデックスＧ−２５
（９．１ｍｌ）カラムで処理後、凍結乾燥することによ
り高純度味覚修飾物質８．６mgが得られた。 〔実施例５〕（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質の純度及び分
子量を、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（ネイチャ
ー、２２７巻、６８０頁、１９７０年）により、還元剤
（β−メルカプトエタノール）存在下及び非存在下で、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し
た。
８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して、
活性物質を析出させた。これを遠心分離（３２，０００
rpm、６０分間）して得た沈澱を、１．５mlの２Ｍ酢酸
アンモニウム溶液に溶解した。この溶液を、２Ｍ酢酸ア
ンモニウム溶液で平衡化したセファデックスＧ−２５
（９．１ｍｌ）カラムで処理後、凍結乾燥することによ
り高純度味覚修飾物質８．６mgが得られた。 〔実施例５〕（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質の純度及び分
子量を、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（ネイチャ
ー、２２７巻、６８０頁、１９７０年）により、還元剤
（β−メルカプトエタノール）存在下及び非存在下で、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し
た。
【００２１】その結果、還元剤存在下では分子量１３，
０００（ｄａｌｔｏｎ）のところにバンドを示したが、
還元剤非存在下では分子量２４，０００（ｄａｌｔｏ
ｎ）のところにバンドが確認された。以上から、実施例
４より得られた高純度味覚修飾物質は、充分に精製され
ていること、及び、ジスルフィド結合により二量体を形
成してることが確認できた。
０００（ｄａｌｔｏｎ）のところにバンドを示したが、
還元剤非存在下では分子量２４，０００（ｄａｌｔｏ
ｎ）のところにバンドが確認された。以上から、実施例
４より得られた高純度味覚修飾物質は、充分に精製され
ていること、及び、ジスルフィド結合により二量体を形
成してることが確認できた。
【００２２】クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇか
ら得られた、各味覚修飾物質の画分の蛋白質含量、活性
収率及び精製度は第１表に示す通りである。第１表 味
覚修飾物質の各精製段階における蛋白質含量、活性収率
及び精製度 ＊１；果肉重量（蛋白質以外の成分も含む） なお、蛋白質含量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）らの方法
により測定した。
ら得られた、各味覚修飾物質の画分の蛋白質含量、活性
収率及び精製度は第１表に示す通りである。第１表 味
覚修飾物質の各精製段階における蛋白質含量、活性収率
及び精製度 ＊１；果肉重量（蛋白質以外の成分も含む） なお、蛋白質含量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）らの方法
により測定した。
【００２３】又、実施例４で得られた高純度味覚修飾物
質の味覚修飾活性は、各試料を３分間口に含んだ後水で
口をすすぎ、０．０２Ｍクエン酸溶液を味わった時の甘
さを各種濃度のショ糖溶液と比較し、同等の甘さのショ
糖濃度を求めることにより測定した。その結果を第３図
に示す。第３図から、高純度味覚修飾物質の活性は、
０．３Ｍショ糖の甘さに相当した。なお、実施例４より
得られた高純度味覚修飾物質は、味覚修飾効果が長く続
いた。 〔参考例１〕（等電点電気泳動） ファーストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍTM、ファ
ルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）により、ファ
ーストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ５−８）を用い
て、実施例４により得られた高純度味覚修飾物質の等電
点電気泳動を行ったところ、等電点は７．１であった。 〔参考例２〕（遊離ＳＨ基の存在しないことの確認） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質１．２mg（５
０n モル）を、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（PH ８．
０）（８Ｍ尿素、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン４酢酸）を含む）２．５mlに溶解し、室温で２０分
放置した。
質の味覚修飾活性は、各試料を３分間口に含んだ後水で
口をすすぎ、０．０２Ｍクエン酸溶液を味わった時の甘
さを各種濃度のショ糖溶液と比較し、同等の甘さのショ
糖濃度を求めることにより測定した。その結果を第３図
に示す。第３図から、高純度味覚修飾物質の活性は、
０．３Ｍショ糖の甘さに相当した。なお、実施例４より
得られた高純度味覚修飾物質は、味覚修飾効果が長く続
いた。 〔参考例１〕（等電点電気泳動） ファーストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍTM、ファ
ルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）により、ファ
ーストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ５−８）を用い
て、実施例４により得られた高純度味覚修飾物質の等電
点電気泳動を行ったところ、等電点は７．１であった。 〔参考例２〕（遊離ＳＨ基の存在しないことの確認） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質１．２mg（５
０n モル）を、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（PH ８．
０）（８Ｍ尿素、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン４酢酸）を含む）２．５mlに溶解し、室温で２０分
放置した。
【００２４】これに、０．０１Ｍ ＤＴＮＢ（５，５−
ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（PH ７．０）を加え、システインと高純度
味覚修飾物質の４１２ｎｍの吸光度を測定した。その結
果、システイン５０ｎモルの吸光度が０．２５となる条
件において、高純度味覚修飾物質５０ｎモルの吸光度は
０．００５以下であった。
ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（PH ７．０）を加え、システインと高純度
味覚修飾物質の４１２ｎｍの吸光度を測定した。その結
果、システイン５０ｎモルの吸光度が０．２５となる条
件において、高純度味覚修飾物質５０ｎモルの吸光度は
０．００５以下であった。
【００２５】以上から、高純度味覚修飾物質の分子中に
は、遊離のＳＨ基が存在しないことが判った。 〔実施例６〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリ
ン様物質の調製） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質７mgを、６Ｍ
グアニジン塩酸塩、２mMＥＤＴＡ及び６０mMジチオスレ
イトールを含む０．４Ｍトリス緩衝液５mlに溶解した。
この溶液を窒素ガス中で３７℃、２４時間インキュベー
トした。この溶液にヨードアセトアミド０．２ｇを加
え、室温で１０分間静置し、続いて、氷水浴中で６０分
間静置した。得られるＳ−カルボキシアミドメチル化ク
ルクリン様物質をセファデックスＧ−２５を用い、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）に溶媒を交換し酵素消化の試料とし
た。 〔実施例７〕（アミノ酸組成） アミノ酸組成の決定は、ウォーターズ社のピコタグシス
テム（Waters Picotagsystem）により実施した。
は、遊離のＳＨ基が存在しないことが判った。 〔実施例６〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリ
ン様物質の調製） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質７mgを、６Ｍ
グアニジン塩酸塩、２mMＥＤＴＡ及び６０mMジチオスレ
イトールを含む０．４Ｍトリス緩衝液５mlに溶解した。
この溶液を窒素ガス中で３７℃、２４時間インキュベー
トした。この溶液にヨードアセトアミド０．２ｇを加
え、室温で１０分間静置し、続いて、氷水浴中で６０分
間静置した。得られるＳ−カルボキシアミドメチル化ク
ルクリン様物質をセファデックスＧ−２５を用い、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）に溶媒を交換し酵素消化の試料とし
た。 〔実施例７〕（アミノ酸組成） アミノ酸組成の決定は、ウォーターズ社のピコタグシス
テム（Waters Picotagsystem）により実施した。
【００２６】すなわち、実施例４より得られた高純度味
覚修飾物質の１０μｇを１％フェノールを含む６Ｎ−Ｈ
Ｃｌにより、１１０℃、２２時間の条件で加水分解し、
得られたアミノ酸をフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）
化して、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（直径
０．４６cm×１５cm、東ソー（株）製）を用いたＨＰＬ
Ｃにより分析した。ＰＴＣ−アミノ酸は、２５４nmの吸
光度により検知した。結果を第２表に示す。
覚修飾物質の１０μｇを１％フェノールを含む６Ｎ−Ｈ
Ｃｌにより、１１０℃、２２時間の条件で加水分解し、
得られたアミノ酸をフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）
化して、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（直径
０．４６cm×１５cm、東ソー（株）製）を用いたＨＰＬ
Ｃにより分析した。ＰＴＣ−アミノ酸は、２５４nmの吸
光度により検知した。結果を第２表に示す。
【００２７】ただし、セリン、トレオニンはそれぞれ分
解による損失を１０％、５％ととして補正した値を示し
た。また、システインは、実施例６で調製したＳ−カル
ボキシアミドメチル化したものを用いて測定した値を使
用し、トリプトファンは、（Ｈ．Ｅｄｅｌｈｏｃｋ）の
方法（バイオケミストリー、７巻、１９４８ページ、１
９６７年）により求めた値を使用した。
解による損失を１０％、５％ととして補正した値を示し
た。また、システインは、実施例６で調製したＳ−カル
ボキシアミドメチル化したものを用いて測定した値を使
用し、トリプトファンは、（Ｈ．Ｅｄｅｌｈｏｃｋ）の
方法（バイオケミストリー、７巻、１９４８ページ、１
９６７年）により求めた値を使用した。
【００２８】 〔実施例８〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリ
ン様物質の酵素消化） 実施例６で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化クル
クリン様物質のリシルエンドペプチターゼ消化を、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）中で３７℃、１７．５時間行った。蛋
白質濃度は１mg／mlで、酵素対基質比が１対１２０（Ｖ
／Ｖ、残量水）である。反応は、ＨＣｌを加えpH ２．
０とすることにより停止した。
ン様物質の酵素消化） 実施例６で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化クル
クリン様物質のリシルエンドペプチターゼ消化を、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）中で３７℃、１７．５時間行った。蛋
白質濃度は１mg／mlで、酵素対基質比が１対１２０（Ｖ
／Ｖ、残量水）である。反応は、ＨＣｌを加えpH ２．
０とすることにより停止した。
【００２９】又、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルク
リン様物質のキモトリプシン消化を上記消化と同じ緩衝
液、蛋白質濃度及び酵素対基質比の下、３７℃、３０分
間行った。消化反応は上記と同じ方法で停止した。さら
に、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物質の
トリプシン消化を上記消化と同じ緩衝液、蛋白質濃度及
び酵素対基質比の下、３７℃、３時間行った。消化反応
は上記と同じ方法で停止した。 〔実施例９〕（ペプチドの分離） 実施例８により得られた三種類のペプチド混合物は、Ｔ
ＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）製）カラム
を用い、ＨＰＬＣにより分離した。各ペプチドは、０．
０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線濃
度勾配溶出法で溶出した。ペプチドは、２１０nmの吸収
により検知され、各ピークが集められた。
リン様物質のキモトリプシン消化を上記消化と同じ緩衝
液、蛋白質濃度及び酵素対基質比の下、３７℃、３０分
間行った。消化反応は上記と同じ方法で停止した。さら
に、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物質の
トリプシン消化を上記消化と同じ緩衝液、蛋白質濃度及
び酵素対基質比の下、３７℃、３時間行った。消化反応
は上記と同じ方法で停止した。 〔実施例９〕（ペプチドの分離） 実施例８により得られた三種類のペプチド混合物は、Ｔ
ＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）製）カラム
を用い、ＨＰＬＣにより分離した。各ペプチドは、０．
０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線濃
度勾配溶出法で溶出した。ペプチドは、２１０nmの吸収
により検知され、各ピークが集められた。
【００３０】リシルエンドペプチダーゼ消化物、キモト
リプシン消化物及びトリプシン消化物のＨＰＬＣ溶出パ
ターンを、それぞれ第４図、第５図及び第６図に示す。
ただし、リシルエンドペプチダーゼ消化物及びトリプシ
ン消化物については、アセトニトリル２０％（Ｖ／Ｖ、
残量水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの３０分間
の直線濃度勾配溶出パターンであり、キモトリプシン消
化物については、アセトニトリル１０％（Ｖ／Ｖ、残量
水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの４５分間の直
線濃度勾配溶出パターンである。又、後述するペプチド
の名前は、これらのＨＰＬＣ溶出パターン中のピークの
名前に従った。 〔実施例１０〕（アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列の
決定） 実施例９で得られた各ペプチドは、ウォーターズ社のピ
コタグシステム（Waters Picotag system）によりアミ
ノ酸組成分析を実施し、その結果を第３表及び第４表に
示した。
リプシン消化物及びトリプシン消化物のＨＰＬＣ溶出パ
ターンを、それぞれ第４図、第５図及び第６図に示す。
ただし、リシルエンドペプチダーゼ消化物及びトリプシ
ン消化物については、アセトニトリル２０％（Ｖ／Ｖ、
残量水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの３０分間
の直線濃度勾配溶出パターンであり、キモトリプシン消
化物については、アセトニトリル１０％（Ｖ／Ｖ、残量
水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの４５分間の直
線濃度勾配溶出パターンである。又、後述するペプチド
の名前は、これらのＨＰＬＣ溶出パターン中のピークの
名前に従った。 〔実施例１０〕（アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列の
決定） 実施例９で得られた各ペプチドは、ウォーターズ社のピ
コタグシステム（Waters Picotag system）によりアミ
ノ酸組成分析を実施し、その結果を第３表及び第４表に
示した。
【００３１】 セリン及びスレオニンは、それぞれ分解による損失を１
０％及び５％として補正した値を示す。
０％及び５％として補正した値を示す。
【００３２】 * 配列分析からの結果 ** ＮＤ：検出されず。
【００３３】セリン及びトレオニンは、それぞれ分解に
よる損失を１０％及び５％として補正した値を示す。た
だし、セリン及びトレオニンは、それぞれ分解による損
失を１０％及び５％として補正した値を示した。アミノ
酸配列の決定は、４７０Ａ アプライドバイオシステム
プロテインシークエンサー（Applied Biosystem Protei
n Sequencer ）により行った。すなわち、アミノ酸をフ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）化して、このＰＴＨ
−アミノ酸を、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔカラムを
用いたＨＰＬＣにより分析した。その結果を第５表及び
第６表に示す。
よる損失を１０％及び５％として補正した値を示す。た
だし、セリン及びトレオニンは、それぞれ分解による損
失を１０％及び５％として補正した値を示した。アミノ
酸配列の決定は、４７０Ａ アプライドバイオシステム
プロテインシークエンサー（Applied Biosystem Protei
n Sequencer ）により行った。すなわち、アミノ酸をフ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）化して、このＰＴＨ
−アミノ酸を、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔカラムを
用いたＨＰＬＣにより分析した。その結果を第５表及び
第６表に示す。
【００３４】 カルボキシ末端アミノ酸配列は、カルボキシペプチター
ゼを用いて、次の方法により決定した。
ゼを用いて、次の方法により決定した。
【００３５】すなわち、実施例４より得られた高純度味
覚修飾物質２００μｇを、０．１ＭＮ−エチルモルホリ
ン酢酸緩衝液（pH ８．０）０．９mlに溶解する。この
溶液に、カルボキシペプチターゼＡを１０μｇを加え、
反応混合物を室温でインキュベートする。反応液の一部
を、１５分、３０分、６０分及び１２０分毎に採取す
る。これらの反応液にトリクロル酢酸を加え蛋白質を沈
澱させ、これを遠心分離により除き、上清にある遊離し
たアミノ酸を、ウォーターズ社のピコタグシステム（Wa
ters Picotag system）により分析した。その結果、カ
ルボキシ末端アミノ酸残基は、グリシンであることが明
らかとなった。
覚修飾物質２００μｇを、０．１ＭＮ−エチルモルホリ
ン酢酸緩衝液（pH ８．０）０．９mlに溶解する。この
溶液に、カルボキシペプチターゼＡを１０μｇを加え、
反応混合物を室温でインキュベートする。反応液の一部
を、１５分、３０分、６０分及び１２０分毎に採取す
る。これらの反応液にトリクロル酢酸を加え蛋白質を沈
澱させ、これを遠心分離により除き、上清にある遊離し
たアミノ酸を、ウォーターズ社のピコタグシステム（Wa
ters Picotag system）により分析した。その結果、カ
ルボキシ末端アミノ酸残基は、グリシンであることが明
らかとなった。
【００３６】以上の方法により決定されたアミノ酸配列
は、第７図に示す通りである。第７図において、ＬＥ
Ｐ、ＣＨ及びＴは、各々リシルエンドペプチダーゼ、キ
モトリプシン及びトリプシン消化からのペプチドを、Ｎ
は高純度味覚修飾物質のＮ末端からエドマン分解により
決定したアミノ酸配列を示す。又、実線は、各ペプチド
のエドマン分解により同定されたアミノ酸残基を示し、
点線は、各ペプチドのエドマン分解により同定されなか
ったアミノ酸残基を示す。 〔実施例１１〕（過蟻酸酸化法によるシステイン又はシ
スチンを含むアミノ酸組成の分析法） １．９mgの蟻酸に３０％過酸化水素水０．１mlを加えた
過蟻酸溶液を調製した。次に、高純度味覚修飾物質又は
その酵素消化ペプチドフラグメント０．５ｎモル〜１ｎ
モルに、上記過蟻酸溶液５０μl を添加して、０℃で２
５時間反応させた。
は、第７図に示す通りである。第７図において、ＬＥ
Ｐ、ＣＨ及びＴは、各々リシルエンドペプチダーゼ、キ
モトリプシン及びトリプシン消化からのペプチドを、Ｎ
は高純度味覚修飾物質のＮ末端からエドマン分解により
決定したアミノ酸配列を示す。又、実線は、各ペプチド
のエドマン分解により同定されたアミノ酸残基を示し、
点線は、各ペプチドのエドマン分解により同定されなか
ったアミノ酸残基を示す。 〔実施例１１〕（過蟻酸酸化法によるシステイン又はシ
スチンを含むアミノ酸組成の分析法） １．９mgの蟻酸に３０％過酸化水素水０．１mlを加えた
過蟻酸溶液を調製した。次に、高純度味覚修飾物質又は
その酵素消化ペプチドフラグメント０．５ｎモル〜１ｎ
モルに、上記過蟻酸溶液５０μl を添加して、０℃で２
５時間反応させた。
【００３７】反応後、該高純度味覚修飾物質含有過蟻酸
溶液を乾燥させ、ウォーターズ社のピコタグシステム
（Waters Picotag system）によりアミノ酸組成分析を
行った。この方法により、以下の実施例１２〜１４にお
けるシステイン又はシスチンを含むアミノ酸組成を決定
した。 〔実施例１２〕（２９番目のシステイン残基と５２番目
のシステイン残基の鎖内結合の決定） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質をトリプシン
消化した。すなわち、高純度味覚修飾物質０．５mgを、
２００μl の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（８Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶
解し、３７℃で４時間変性させた。
溶液を乾燥させ、ウォーターズ社のピコタグシステム
（Waters Picotag system）によりアミノ酸組成分析を
行った。この方法により、以下の実施例１２〜１４にお
けるシステイン又はシスチンを含むアミノ酸組成を決定
した。 〔実施例１２〕（２９番目のシステイン残基と５２番目
のシステイン残基の鎖内結合の決定） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質をトリプシン
消化した。すなわち、高純度味覚修飾物質０．５mgを、
２００μl の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（８Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶
解し、３７℃で４時間変性させた。
【００３８】次に、上記溶液は、尿素の最終濃度が２Ｍ
となるように０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（２mM酢酸カルシウムを含む）で希釈した。上
記高純度味覚修飾物質含有溶液に対して、酵素対基質比
が重量比で１対２５となるようにトリプシンを加え、３
７℃で３時間消化を行った。反応後、この消化液は、下
記条件のＨＰＬＣ処理することにより、各ペプチドを分
取した。結果を第８図に示す。ＨＰＬＣの条件は以下の
通りである。
となるように０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（２mM酢酸カルシウムを含む）で希釈した。上
記高純度味覚修飾物質含有溶液に対して、酵素対基質比
が重量比で１対２５となるようにトリプシンを加え、３
７℃で３時間消化を行った。反応後、この消化液は、下
記条件のＨＰＬＣ処理することにより、各ペプチドを分
取した。結果を第８図に示す。ＨＰＬＣの条件は以下の
通りである。
【００３９】カラム：ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニト
リル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまでの４０分間
の直線濃度勾配） 検出方法：ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０．５） 流速：１ml／分 以上から得られたペプチドのうち、第８図のＴ２に示さ
れる画分の物質について、実施例１０と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。
結果をそれぞれ第７表、第８表に示す。
リル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまでの４０分間
の直線濃度勾配） 検出方法：ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０．５） 流速：１ml／分 以上から得られたペプチドのうち、第８図のＴ２に示さ
れる画分の物質について、実施例１０と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。
結果をそれぞれ第７表、第８表に示す。
【００４０】 以上から、２９番目のシステイン残基と５２番目のシ
ステイン残基の鎖内結合が確認された。 〔実施例１３〕（７７番目のシステイン残基の鎖間結合
の位置決定） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質のサーモリシ
ン消化を行なった。
ステイン残基の鎖内結合が確認された。 〔実施例１３〕（７７番目のシステイン残基の鎖間結合
の位置決定） 実施例４より得られた高純度味覚修飾物質のサーモリシ
ン消化を行なった。
【００４１】すなわち、高純度味覚修飾物質１０mgを、
０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH ６．５）（８
Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶解させた。サ
ーモリシンは、０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（２mM酢酸カルシウムを含む）に添加、溶解
した。上記の高純度味覚修飾物質含有液に、酵素対基質
比が重量比で１対２５となるようにサーモリシン含有液
を添加し、３７℃で１５時間消化を行った。
０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH ６．５）（８
Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶解させた。サ
ーモリシンは、０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（２mM酢酸カルシウムを含む）に添加、溶解
した。上記の高純度味覚修飾物質含有液に、酵素対基質
比が重量比で１対２５となるようにサーモリシン含有液
を添加し、３７℃で１５時間消化を行った。
【００４２】この消化液は、下記条件でＨＰＬＣを用い
て、分離したペプチドをピーク毎に分取した。結果を第
９図に示す。条件は以下の通りである。 カラム ： ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相 ： ０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまで４０分
の直線濃度勾配） 検出方法： ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０，５） 流速 ： １ml／分 次に、各ピークについて、実施例１１と同様の方法によ
りアミノ酸組成分析したところ、第９図に示されたピー
クＥ４の画分に、システイン酸が検出された（０．３０
pmole／pmole）ため、第９図に示されたピークＥ４の画
分を、さらにＨＰＬＣにより分離した。
て、分離したペプチドをピーク毎に分取した。結果を第
９図に示す。条件は以下の通りである。 カラム ： ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相 ： ０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまで４０分
の直線濃度勾配） 検出方法： ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０，５） 流速 ： １ml／分 次に、各ピークについて、実施例１１と同様の方法によ
りアミノ酸組成分析したところ、第９図に示されたピー
クＥ４の画分に、システイン酸が検出された（０．３０
pmole／pmole）ため、第９図に示されたピークＥ４の画
分を、さらにＨＰＬＣにより分離した。
【００４３】分離は、移動相の直線濃度勾配を２０％ｖ
／ｖアセトニトリルから４０％ｖ／ｖアセトニトリルま
で４０分で行なう以外は、上記ＨＰＬＣの条件と同様に
行なった。分離したペプチドをピーク毎に分取した後、
再び、実施例１１と同様の方法により、アミノ酸組成分
析を行ないシステイン酸の検出を行なった。その結果を
第１０図に示す。
／ｖアセトニトリルから４０％ｖ／ｖアセトニトリルま
で４０分で行なう以外は、上記ＨＰＬＣの条件と同様に
行なった。分離したペプチドをピーク毎に分取した後、
再び、実施例１１と同様の方法により、アミノ酸組成分
析を行ないシステイン酸の検出を行なった。その結果を
第１０図に示す。
【００４４】第１０図に示されたピークＥ４−１の画分
に、システイン酸が検出された（０．４１pmole／pmol
e）ため、再び第１０図に示されたピークＥ４−１の画
分をＨＰＬＣにより分離した。分離は、移動相の直線濃
度勾配を２０％ｖ／ｖから３０％ｖ／ｖまで４０分で行
なう以外は、上記ＨＰＬＣの条件と同様に行なった。
に、システイン酸が検出された（０．４１pmole／pmol
e）ため、再び第１０図に示されたピークＥ４−１の画
分をＨＰＬＣにより分離した。分離は、移動相の直線濃
度勾配を２０％ｖ／ｖから３０％ｖ／ｖまで４０分で行
なう以外は、上記ＨＰＬＣの条件と同様に行なった。
【００４５】その結果、第１１図に示すように、Ｖ−１
及びＶ−２の２本のペプチド（ピーク）を得た。各ぺプ
チドは、実施例１０及び実施例１１と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析し、結果を第９表に示した。 *;過蟻酸酸化法（実施例１１）
による結果 さらに、Ｖ−１画分のペプチドのアミノ酸配列分析を行
なったところ、６サイクル目にシスチンが確認され、該
蛋白質の７７残基目のシステインが分子間ジスルフィド
結合を形成していることを確認した。結果を第１０表に
示す。 〔実施例１４〕（１０９番目のシステイン残基の鎖間結
合の位置決定） 実施例１３と同様に、実施例４より得られた高純度味覚
修飾物質を酵素消化し、その消化物からシスチンを含む
消化断片を取り出しその構造を決定した。その結果、該
蛋白質の１０９番目のシステインが鎖間結合を形成して
いることを確認した。
及びＶ−２の２本のペプチド（ピーク）を得た。各ぺプ
チドは、実施例１０及び実施例１１と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析し、結果を第９表に示した。 *;過蟻酸酸化法（実施例１１）
による結果 さらに、Ｖ−１画分のペプチドのアミノ酸配列分析を行
なったところ、６サイクル目にシスチンが確認され、該
蛋白質の７７残基目のシステインが分子間ジスルフィド
結合を形成していることを確認した。結果を第１０表に
示す。 〔実施例１４〕（１０９番目のシステイン残基の鎖間結
合の位置決定） 実施例１３と同様に、実施例４より得られた高純度味覚
修飾物質を酵素消化し、その消化物からシスチンを含む
消化断片を取り出しその構造を決定した。その結果、該
蛋白質の１０９番目のシステインが鎖間結合を形成して
いることを確認した。
【００４６】以上の方法により決定された味覚修飾物質
は次の通りである。２９番目のシステイン残基と５２番
目のシステイン残基が鎖内結合（ジスルフィド結合）
し、７７番目のシステイン残基同士及び１０９番目のシ
ステイン残基同士においてそれぞれ鎖間結合（ジスルフ
ィド結合）することにより二量体を形成し、かつ、単量
体としては配列表のアミノ酸配列を有する。
は次の通りである。２９番目のシステイン残基と５２番
目のシステイン残基が鎖内結合（ジスルフィド結合）
し、７７番目のシステイン残基同士及び１０９番目のシ
ステイン残基同士においてそれぞれ鎖間結合（ジスルフ
ィド結合）することにより二量体を形成し、かつ、単量
体としては配列表のアミノ酸配列を有する。
【００４７】〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：１１４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：クルクリゴ・ラチフォリア（Curculig
o latifolia） 配列： Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser １５ Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn ３０ Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr ４５ Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly ６０ Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn Gly Ser ７５ Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys ９０ Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly １０５ Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly １１４
o latifolia） 配列： Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser １５ Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn ３０ Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr ４５ Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly ６０ Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn Gly Ser ７５ Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys ９０ Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly １０５ Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly １１４
【図１】クルクリゴ・ラチフォリアの実から水洗、抽
出、塩析操作によって得た味覚修飾物質のＣＭ−セファ
ロースイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターン図
である。
出、塩析操作によって得た味覚修飾物質のＣＭ−セファ
ロースイオン交換クロマトグラフィーの溶出パターン図
である。
【図２】図１のピーク（Ｂ）部分を、セファデックスＧ
−１００分子ふるいクロマトグラフィーの溶出パターン
図である。
−１００分子ふるいクロマトグラフィーの溶出パターン
図である。
【図３】本発明の高純度味覚修飾物質からなる味覚修飾
物質の活性を示す特性線図である。
物質の活性を示す特性線図である。
【図４】Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物
質のリシルエンドペプチターゼ消化により得られるペプ
チドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
質のリシルエンドペプチターゼ消化により得られるペプ
チドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
【図５】Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物
質のキモトリプシン消化により得られるペプチドのＨＰ
ＬＣ溶出パターン図である。
質のキモトリプシン消化により得られるペプチドのＨＰ
ＬＣ溶出パターン図である。
【図６】Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物
質のトリプシン消化により得られるペプチドのＨＰＬＣ
溶出パターン図である。
質のトリプシン消化により得られるペプチドのＨＰＬＣ
溶出パターン図である。
【図７】クルクリンのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】高純度味覚修飾物質のトリプシン消化により得
られるペプチドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
られるペプチドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
【図９】高純度味覚修飾物質のサーモリシン消化により
得られるペプチドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
得られるペプチドのＨＰＬＣ溶出パターン図である。
【図１０】ピークＥ４のＨＰＬＣ抽出パターン図であ
る。
る。
【図１１】ピークＥ４−１のＨＰＬＣ抽出パターン図で
ある。
ある。
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】〔実施例５〕（脱塩及び粉末化） この第２図に示すピーク（Ａ）の画分を、８０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを添加して、活性物質を析
出させた。これを遠心分離（３２，０００rpm、６０分
間）して得た沈澱を、１．５mlの２Ｍ酢酸アンモニウム
溶液に溶解した。この溶液を、２Ｍ酢酸アンモニウム溶
液で平衡化したセファデックスＧ−２５（９．１ｍｌ）
カラムで処理後、凍結乾燥することにより高純度味覚修
飾物質８．６mgが得られた。〔実施例６〕（味覚修飾物質の各精製段階における活性
の測定） クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇを用いて、実施
例１〜４で得られた各味覚修飾物質の画分の蛋白質含
量、活性収率及び精製度は第１表に示す通りである。 第１表 味覚修飾物質の各精製段階における蛋白質含量、活性収率及び精製度 ───────────────────────────────── 精 製 段 階 蛋白質含量(g) 活性収率（％） 精製度（倍） ───────────────────────────────── 果 肉 ３０(*1) １００ １ ───────────────────────────────── 0.5M食塩水抽出物 ０．１０６ ８０．０ ２２５ ───────────────────────────────── ＣＭ−セファロース 溶 出 画 分 ０．０１８ ５５．５ ９４０ ───────────────────────────────── セファテックス Ｇ-100 溶 出 画 分 ０．００８６ ３６．０ １２５５ ─────────────────────────────────＊一；果肉重量（蛋白質以外の成分も含む） なお、蛋白質含量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）らの方法
により測定した。また、味覚修飾物質の味覚修飾活性
は、各試料を３分間口に含んだ後水で口をすすぎ、０．
０２Ｍクエン酸溶液を味わった時の甘さを各種濃度のシ
ョ糖溶液と比較し、同等の甘さのショ糖濃度を求めるこ
とにより測定した。上記測定結果より、活性収率を第１
表に示した。さらに、クルクリン濃度と甘さ（ショ糖相
当）の関係を第３図に示した。第３図から、実施例５で
得られた高純度味覚修飾物質の活性は、０．３Ｍショ糖
の甘さに相当した。なお、実施例４より得られた高純度
味覚修飾物質は、味覚修飾効果が長く続いた。 〔実施例７〕（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質の純度及び分
子量を、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（ネイチャ
ー、２２７巻、６８０頁、１９７０年）により、還元剤
（β−メルカプトエタノール）存在下及び非存在下で、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し
た。
なるように硫酸アンモニウムを添加して、活性物質を析
出させた。これを遠心分離（３２，０００rpm、６０分
間）して得た沈澱を、１．５mlの２Ｍ酢酸アンモニウム
溶液に溶解した。この溶液を、２Ｍ酢酸アンモニウム溶
液で平衡化したセファデックスＧ−２５（９．１ｍｌ）
カラムで処理後、凍結乾燥することにより高純度味覚修
飾物質８．６mgが得られた。〔実施例６〕（味覚修飾物質の各精製段階における活性
の測定） クルクリゴ・ラチフォリアの果肉３０ｇを用いて、実施
例１〜４で得られた各味覚修飾物質の画分の蛋白質含
量、活性収率及び精製度は第１表に示す通りである。 第１表 味覚修飾物質の各精製段階における蛋白質含量、活性収率及び精製度 ───────────────────────────────── 精 製 段 階 蛋白質含量(g) 活性収率（％） 精製度（倍） ───────────────────────────────── 果 肉 ３０(*1) １００ １ ───────────────────────────────── 0.5M食塩水抽出物 ０．１０６ ８０．０ ２２５ ───────────────────────────────── ＣＭ−セファロース 溶 出 画 分 ０．０１８ ５５．５ ９４０ ───────────────────────────────── セファテックス Ｇ-100 溶 出 画 分 ０．００８６ ３６．０ １２５５ ─────────────────────────────────＊一；果肉重量（蛋白質以外の成分も含む） なお、蛋白質含量は、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）らの方法
により測定した。また、味覚修飾物質の味覚修飾活性
は、各試料を３分間口に含んだ後水で口をすすぎ、０．
０２Ｍクエン酸溶液を味わった時の甘さを各種濃度のシ
ョ糖溶液と比較し、同等の甘さのショ糖濃度を求めるこ
とにより測定した。上記測定結果より、活性収率を第１
表に示した。さらに、クルクリン濃度と甘さ（ショ糖相
当）の関係を第３図に示した。第３図から、実施例５で
得られた高純度味覚修飾物質の活性は、０．３Ｍショ糖
の甘さに相当した。なお、実施例４より得られた高純度
味覚修飾物質は、味覚修飾効果が長く続いた。 〔実施例７〕（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質の純度及び分
子量を、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（ネイチャ
ー、２２７巻、６８０頁、１９７０年）により、還元剤
（β−メルカプトエタノール）存在下及び非存在下で、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し
た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】その結果、還元剤存在下では分子量１３，
０００（ｄａｌｔｏｎ）のところにバンドを示したが、
還元剤非存在下では分子量２４，０００（ｄａｌｔｏ
ｎ）のところにバンドが確認された。以上から、実施例
５より得られた高純度味覚修飾物質は、充分に精製され
ていること、及び、ジスルフィド結合により二量体を形
成してることが確認できた。
０００（ｄａｌｔｏｎ）のところにバンドを示したが、
還元剤非存在下では分子量２４，０００（ｄａｌｔｏ
ｎ）のところにバンドが確認された。以上から、実施例
５より得られた高純度味覚修飾物質は、充分に精製され
ていること、及び、ジスルフィド結合により二量体を形
成してることが確認できた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】〔参考例１〕（等電点電気泳動） ファーストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍTM、ファ
ルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）により、ファ
ーストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ５−８）を用い
て、実施例５により得られた高純度味覚修飾物質の等電
点電気泳動を行ったところ、等電点は７．１であった。
ルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）により、ファ
ーストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ５−８）を用い
て、実施例５により得られた高純度味覚修飾物質の等電
点電気泳動を行ったところ、等電点は７．１であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】 〔参考例２〕（遊離ＳＨ基の存在しないことの確認） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質１．２mg（５
０n モル）を、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（PH ８．
０）（８Ｍ尿素、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン４酢酸）を含む）２．５mlに溶解し、室温で２０分
放置した。
０n モル）を、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（PH ８．
０）（８Ｍ尿素、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン４酢酸）を含む）２．５mlに溶解し、室温で２０分
放置した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】以上から、高純度味覚修飾物質の分子中に
は、遊離のＳＨ基が存在しないことが判った。 〔実施例８〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリ
ン様物質の調製） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質７mgを、６Ｍ
グアニジン塩酸塩、２mMＥＤＴＡ及び６０mMジチオスレ
イトールを含む０．４Ｍトリス緩衝液５mlに溶解した。
この溶液を窒素ガス中で３７℃、２４時間インキュベー
トした。この溶液にヨードアセトアミド０．２ｇを加
え、室温で１０分間静置し、続いて、氷水浴中で６０分
間静置した。得られるＳ−カルボキシアミドメチル化ク
ルクリン様物質をセファデックスＧ−２５を用い、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）に溶媒を交換し酵素消化の試料とし
た。 〔実施例９〕（アミノ酸組成） アミノ酸組成の決定は、ウォーターズ社のピコタグシス
テム（Waters Picotagsystem ）により実施した。
は、遊離のＳＨ基が存在しないことが判った。 〔実施例８〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリ
ン様物質の調製） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質７mgを、６Ｍ
グアニジン塩酸塩、２mMＥＤＴＡ及び６０mMジチオスレ
イトールを含む０．４Ｍトリス緩衝液５mlに溶解した。
この溶液を窒素ガス中で３７℃、２４時間インキュベー
トした。この溶液にヨードアセトアミド０．２ｇを加
え、室温で１０分間静置し、続いて、氷水浴中で６０分
間静置した。得られるＳ−カルボキシアミドメチル化ク
ルクリン様物質をセファデックスＧ−２５を用い、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）に溶媒を交換し酵素消化の試料とし
た。 〔実施例９〕（アミノ酸組成） アミノ酸組成の決定は、ウォーターズ社のピコタグシス
テム（Waters Picotagsystem ）により実施した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】すなわち、実施例５より得られた高純度味
覚修飾物質の１０μｇを１％フェノールを含む６Ｎ−Ｈ
Ｃｌにより、１１０℃、２２時間の条件で加水分解し、
得られたアミノ酸をフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）
化して、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（直径
０．４６cm×１５cm、東ソー（株）製）を用いたＨＰＬ
Ｃにより分析した。ＰＴＣ−アミノ酸は、２５４nmの吸
光度により検知した。結果を第２表に示す。
覚修飾物質の１０μｇを１％フェノールを含む６Ｎ−Ｈ
Ｃｌにより、１１０℃、２２時間の条件で加水分解し、
得られたアミノ酸をフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）
化して、ＴＳＫゲル ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（直径
０．４６cm×１５cm、東ソー（株）製）を用いたＨＰＬ
Ｃにより分析した。ＰＴＣ−アミノ酸は、２５４nmの吸
光度により検知した。結果を第２表に示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】 第２表 アミノ酸組成 ─────────────────────────── アミノ酸 Ｍｏｌｅ％ アミノ酸 Ｍｏｌｅ％ ─────────────────────────── Asx １７．２ Met ０．４ Thr ５．０ Ile ３．９ Ser ６．６ Leu １３．６ Glx ５．９ Tyr ４．９ Pro １．１ Phe １．２ Gly １１．７ Lys ２．９ Ala ５．０ His ２．２ Half-cys ４．０ Arg ５．７ Val ６．４ Trp ２．３ ─────────────────────────── 合 計 １００．０ ─────────────────────────── 〔実施例１０〕（Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルク
リン様物質の酵素消化） 実施例８で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化クル
クリン様物質のリシルエンドペプチターゼ消化を、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）中で３７℃、１７．５時間行った。蛋
白質濃度は１mg／mlで、酵素対基質比が１対１２０（Ｖ
／Ｖ、残量水）である。反応は、ＨＣｌを加えpH ２．
０とすることにより停止した。
リン様物質の酵素消化） 実施例８で得られたＳ−カルボキシアミドメチル化クル
クリン様物質のリシルエンドペプチターゼ消化を、２Ｍ
尿素及び２mMＥＤＴＡを含む５０mM重炭酸ナトリウム緩
衝液（pH８．０）中で３７℃、１７．５時間行った。蛋
白質濃度は１mg／mlで、酵素対基質比が１対１２０（Ｖ
／Ｖ、残量水）である。反応は、ＨＣｌを加えpH ２．
０とすることにより停止した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】又、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルク
リン様物質のキモトリプシン消化を上記消化と同じ緩衝
液、蛋白質濃度及び酵素対基質比の下、３７℃、３０分
間行った。消化反応は上記と同じ方法で停止した。さら
に、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物質の
トリプシン消化を上記消化と同じ緩衝液、蛋白質濃度及
び酵素対基質比の下、３７℃、３時間行った。消化反応
は上記と同じ方法で停止した。 〔実施例１１〕（ペプチドの分離） 実施例１０により得られた三種類のペプチド混合物は、
ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）製）カラ
ムを用い、ＨＰＬＣにより分離した。各ペプチドは、
０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直
線濃度勾配溶出法で溶出した。ペプチドは、２１０nmの
吸収により検知され、各ピークが集められた。
リン様物質のキモトリプシン消化を上記消化と同じ緩衝
液、蛋白質濃度及び酵素対基質比の下、３７℃、３０分
間行った。消化反応は上記と同じ方法で停止した。さら
に、Ｓ−カルボキシアミドメチル化クルクリン様物質の
トリプシン消化を上記消化と同じ緩衝液、蛋白質濃度及
び酵素対基質比の下、３７℃、３時間行った。消化反応
は上記と同じ方法で停止した。 〔実施例１１〕（ペプチドの分離） 実施例１０により得られた三種類のペプチド混合物は、
ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）製）カラ
ムを用い、ＨＰＬＣにより分離した。各ペプチドは、
０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直
線濃度勾配溶出法で溶出した。ペプチドは、２１０nmの
吸収により検知され、各ピークが集められた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】リシルエンドペプチダーゼ消化物、キモト
リプシン消化物及びトリプシン消化物のＨＰＬＣ溶出パ
ターンを、それぞれ第４図、第５図及び第６図に示す。
ただし、リシルエンドペプチダーゼ消化物及びトリプシ
ン消化物については、アセトニトリル２０％（Ｖ／Ｖ、
残量水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの３０分間
の直線濃度勾配溶出パターンであり、キモトリプシン消
化物については、アセトニトリル１０％（Ｖ／Ｖ、残量
水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの４５分間の直
線濃度勾配溶出パターンである。又、後述するペプチド
の名前は、これらのＨＰＬＣ溶出パターン中のピークの
名前に従った。 〔実施例１２〕（アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列の
決定） 実施例１１で得られた各ペプチドは、ウォーターズ社の
ピコタグシステム（Waters Picotag system ）によりア
ミノ酸組成分析を実施し、その結果を第３表及び第４表
に示した。
リプシン消化物及びトリプシン消化物のＨＰＬＣ溶出パ
ターンを、それぞれ第４図、第５図及び第６図に示す。
ただし、リシルエンドペプチダーゼ消化物及びトリプシ
ン消化物については、アセトニトリル２０％（Ｖ／Ｖ、
残量水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの３０分間
の直線濃度勾配溶出パターンであり、キモトリプシン消
化物については、アセトニトリル１０％（Ｖ／Ｖ、残量
水）から４０％（Ｖ／Ｖ、残量水）までの４５分間の直
線濃度勾配溶出パターンである。又、後述するペプチド
の名前は、これらのＨＰＬＣ溶出パターン中のピークの
名前に従った。 〔実施例１２〕（アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列の
決定） 実施例１１で得られた各ペプチドは、ウォーターズ社の
ピコタグシステム（Waters Picotag system ）によりア
ミノ酸組成分析を実施し、その結果を第３表及び第４表
に示した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】すなわち、実施例５より得られた高純度味
覚修飾物質２００μｇを、０．１ＭＮ−エチルモルホリ
ン酢酸緩衝液（pH ８．０）０．９mlに溶解する。この
溶液に、カルボキシペプチターゼＡを１０μｇを加え、
反応混合物を室温でインキュベートする。反応液の一部
を、１５分、３０分、６０分及び１２０分毎に採取す
る。これらの反応液にトリクロル酢酸を加え蛋白質を沈
澱させ、これを遠心分離により除き、上清にある遊離し
たアミノ酸を、ウォーターズ社のピコタグシステム（Wa
ters Picotag system）により分析した。その結果、カ
ルボキシ末端アミノ酸残基は、グリシンであることが明
らかとなった。
覚修飾物質２００μｇを、０．１ＭＮ−エチルモルホリ
ン酢酸緩衝液（pH ８．０）０．９mlに溶解する。この
溶液に、カルボキシペプチターゼＡを１０μｇを加え、
反応混合物を室温でインキュベートする。反応液の一部
を、１５分、３０分、６０分及び１２０分毎に採取す
る。これらの反応液にトリクロル酢酸を加え蛋白質を沈
澱させ、これを遠心分離により除き、上清にある遊離し
たアミノ酸を、ウォーターズ社のピコタグシステム（Wa
ters Picotag system）により分析した。その結果、カ
ルボキシ末端アミノ酸残基は、グリシンであることが明
らかとなった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】以上の方法により決定されたアミノ酸配列
は、第７図に示す通りである。第７図において、ＬＥ
Ｐ、ＣＨ及びＴは、各々リシルエンドペプチダーゼ、キ
モトリプシン及びトリプシン消化からのペプチドを、Ｎ
は高純度味覚修飾物質のＮ末端からエドマン分解により
決定したアミノ酸配列を示す。又、実線は、各ペプチド
のエドマン分解により同定されたアミノ酸残基を示し、
点線は、各ペプチドのエドマン分解により同定されなか
ったアミノ酸残基を示す。 〔実施例１３〕（過蟻酸酸化法によるシステイン又はシ
スチンを含むアミノ酸組成の分析法） １．９mgの蟻酸に３０％過酸化水素水０．１mlを加えた
過蟻酸溶液を調製した。次に、高純度味覚修飾物質又は
その酵素消化ペプチドフラグメント０．５ｎモル〜１ｎ
モルに、上記過蟻酸溶液５０μl を添加して、０℃で２
５時間反応させた。
は、第７図に示す通りである。第７図において、ＬＥ
Ｐ、ＣＨ及びＴは、各々リシルエンドペプチダーゼ、キ
モトリプシン及びトリプシン消化からのペプチドを、Ｎ
は高純度味覚修飾物質のＮ末端からエドマン分解により
決定したアミノ酸配列を示す。又、実線は、各ペプチド
のエドマン分解により同定されたアミノ酸残基を示し、
点線は、各ペプチドのエドマン分解により同定されなか
ったアミノ酸残基を示す。 〔実施例１３〕（過蟻酸酸化法によるシステイン又はシ
スチンを含むアミノ酸組成の分析法） １．９mgの蟻酸に３０％過酸化水素水０．１mlを加えた
過蟻酸溶液を調製した。次に、高純度味覚修飾物質又は
その酵素消化ペプチドフラグメント０．５ｎモル〜１ｎ
モルに、上記過蟻酸溶液５０μl を添加して、０℃で２
５時間反応させた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】反応後、該高純度味覚修飾物質含有過蟻酸
溶液を乾燥させ、ウォーターズ社のピコタグシステム
（Waters Picotag system）によりアミノ酸組成分析を
行った。この方法により、以下の実施例１２〜１４にお
けるシステイン又はシスチンを含むアミノ酸組成を決定
した。 〔実施例１４〕（２９番目のシステイン残基と５２番目
のシステイン残基の鎖内結合の決定） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質をトリプシン
消化した。すなわち、高純度味覚修飾物質０．５mgを、
２００μl の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（８Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶
解し、３７℃で４時間変性させた。
溶液を乾燥させ、ウォーターズ社のピコタグシステム
（Waters Picotag system）によりアミノ酸組成分析を
行った。この方法により、以下の実施例１２〜１４にお
けるシステイン又はシスチンを含むアミノ酸組成を決定
した。 〔実施例１４〕（２９番目のシステイン残基と５２番目
のシステイン残基の鎖内結合の決定） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質をトリプシン
消化した。すなわち、高純度味覚修飾物質０．５mgを、
２００μl の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（pH
６．５）（８Ｍ尿素、２mM酢酸カルシウムを含む）に溶
解し、３７℃で４時間変性させた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】カラム：ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相：０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニト
リル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまでの４０分間
の直線濃度勾配） 検出方法：ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０．５） 流速：１ml／分 以上から得られたペプチドのうち、第８図のＴ２に示さ
れる画分の物質について、実施例１２と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。
結果をそれぞれ第７表、第８表に示す。
リル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまでの４０分間
の直線濃度勾配） 検出方法：ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０．５） 流速：１ml／分 以上から得られたペプチドのうち、第８図のＴ２に示さ
れる画分の物質について、実施例１２と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析及びアミノ酸配列分析を行った。
結果をそれぞれ第７表、第８表に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】 第７表 ペプチドＴ２のアミノ酸組成分析（単位；モル／ペプチドのモル） アミノ酸 Asn Ser Gly Arg Val Leu Lys ──────────────────────────────── ０．９ １．０ ２．１ ０．６ １．１ １．２ ０．７ 第８表 ペプチドＴ２のアミノ酸配列分析（単位；ピコモル） サイクル １ ２ ３ ４ ５ ───────────────────────────────── アミノ酸 Gly Ser Gly Cystine Arg (pmole) ４８１ １６８ ４０１ ７ ６９ Asn Leu Val Lys ２８９ ４１６ ４０１ １８１ 以上から、２９番目のシステイン残基と５２番目のシス
テイン残基の鎖内結合が確認された。 〔実施例１５〕（７７番目のシステイン残基の鎖間結合
の位置決定） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質のサーモリシ
ン消化を行なった。
テイン残基の鎖内結合が確認された。 〔実施例１５〕（７７番目のシステイン残基の鎖間結合
の位置決定） 実施例５より得られた高純度味覚修飾物質のサーモリシ
ン消化を行なった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】この消化液は、下記条件でＨＰＬＣを用い
て、分離したペプチドをピーク毎に分取した。結果を第
９図に示す。条件は以下の通りである。 カラム ： ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相 ： ０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまで４０分
の直線濃度勾配） 検出方法： ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０，５） 流速 ： １ml／分 次に、各ピークについて、実施例１３と同様の方法によ
りアミノ酸組成分析したところ、第９図に示されたピー
クＥ４の画分に、システイン酸が検出された（０．３０
pmole ／pmole ）ため、第９図に示されたピークＥ４の
画分を、さらにＨＰＬＣにより分離した。
て、分離したペプチドをピーク毎に分取した。結果を第
９図に示す。条件は以下の通りである。 カラム ： ＴＳＫゲル ＯＤＳ−１２０Ｔ 移動相 ： ０．０５％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリル水（１０％ｖ／ｖから６０％ｖ／ｖまで４０分
の直線濃度勾配） 検出方法： ＵＶ検出器２１０ｎｍ（レンジ０，５） 流速 ： １ml／分 次に、各ピークについて、実施例１３と同様の方法によ
りアミノ酸組成分析したところ、第９図に示されたピー
クＥ４の画分に、システイン酸が検出された（０．３０
pmole ／pmole ）ため、第９図に示されたピークＥ４の
画分を、さらにＨＰＬＣにより分離した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】その結果、第１１図に示すように、Ｖ−１
及びＶ−２の２本のペプチド（ピーク）を得た。各ぺプ
チドは、実施例１２及び実施例１３と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析し、結果を第９表に示した。 第９表 ペプチドＶ−１のアミノ酸組成分析 （単位；各アミノ酸のモル／ペプチドのモル） アミノ酸 Asx Ser Gly Ala ２．５（３） １．４（１） ３．６（３） １．４（２） Tyr Lys Val Cys* Trp ０．６（１） ０．５（１） １．３（１）０．５（１）ＮＤ（１） *;過蟻酸酸化法（実施例１１）による結果 さらに、Ｖ−１画分のペプチドのアミノ酸配列分析を行
なったところ、６サイクル目にシスチンが確認され、該
蛋白質の７７残基目のシステインが分子間ジスルフィド
結合を形成していることを確認した。結果を第１０表に
示す。 第１０表 ペプチドＶ−１のアミノ酸配列分析（単位；ピコモル） サイクル １ ２ ３ ４ ５ アミノ酸 Val Asn Gly Ser Ala (pmole) １５３７ ６０６ １８５０ ３１４ ９０６ サイクル ６ ７ ８ ９ １０ アミノ酸 Cystine Trp Gly Asp Asn (pmole) １４ １５６ ６３２ ２８７ ３３７ サイクル １１ １２ １３ １４ アミノ酸 Gly Lys Tyr Ala (pmole) ５３４ ２５７ １８６ １４５ 〔実施例１６〕（１０９番目のシステイン残基の鎖間結
合の位置決定） 実施例１５と同様に、実施例５より得られた高純度味覚
修飾物質を酵素消化し、その消化物からシスチンを含む
消化断片を取り出しその構造を決定した。その結果、該
蛋白質の１０９番目のシステインが鎖間結合を形成して
いることを確認した。
及びＶ−２の２本のペプチド（ピーク）を得た。各ぺプ
チドは、実施例１２及び実施例１３と同様の方法によ
り、アミノ酸組成分析し、結果を第９表に示した。 第９表 ペプチドＶ−１のアミノ酸組成分析 （単位；各アミノ酸のモル／ペプチドのモル） アミノ酸 Asx Ser Gly Ala ２．５（３） １．４（１） ３．６（３） １．４（２） Tyr Lys Val Cys* Trp ０．６（１） ０．５（１） １．３（１）０．５（１）ＮＤ（１） *;過蟻酸酸化法（実施例１１）による結果 さらに、Ｖ−１画分のペプチドのアミノ酸配列分析を行
なったところ、６サイクル目にシスチンが確認され、該
蛋白質の７７残基目のシステインが分子間ジスルフィド
結合を形成していることを確認した。結果を第１０表に
示す。 第１０表 ペプチドＶ−１のアミノ酸配列分析（単位；ピコモル） サイクル １ ２ ３ ４ ５ アミノ酸 Val Asn Gly Ser Ala (pmole) １５３７ ６０６ １８５０ ３１４ ９０６ サイクル ６ ７ ８ ９ １０ アミノ酸 Cystine Trp Gly Asp Asn (pmole) １４ １５６ ６３２ ２８７ ３３７ サイクル １１ １２ １３ １４ アミノ酸 Gly Lys Tyr Ala (pmole) ５３４ ２５７ １８６ １４５ 〔実施例１６〕（１０９番目のシステイン残基の鎖間結
合の位置決定） 実施例１５と同様に、実施例５より得られた高純度味覚
修飾物質を酵素消化し、その消化物からシスチンを含む
消化断片を取り出しその構造を決定した。その結果、該
蛋白質の１０９番目のシステインが鎖間結合を形成して
いることを確認した。
Claims (1)
- 【請求項１】２９番目のシステイン残基と５２番目のシ
ステイン残基が鎖内結合し、７７番目のシステイン残基
同士及び１０９番目のシステイン残基同士においてそれ
ぞれ鎖間結合することにより二量体を形成し、かつ単量
体としては下記配列表の、（ 配列表： Asp Asn Val Leu Leu Ser Gly Gln Thr Leu His Ala Asp His Ser １５ Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Lys Cys Asn ３０ Leu Val Lys Tyr Gln Asn Gly Arg Gln Ile Trp Ala Ser Asn Thr ４５ Asp Arg Arg Gly Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Ser Asp Gly ６０ Asn Leu Val Ile Tyr Asp His Asn Asn Asn Asp Val Asn Gly Ser ７５ Ala Cys Trp Gly Asp Asn Gly Lys Tyr Ala Leu Val Leu Gln Lys ９０ Asp Gly Arg Phe Val Ile Tyr Gly Pro Val Leu Trp Ser Leu Gly １０５ Pro Asn Gly Cys Arg Arg Val Asn Gly １１４） アミノ酸配列を有する味覚修飾物質。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3253914A JPH0597896A (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 味覚修飾物質 |
| CA002076830A CA2076830A1 (en) | 1991-10-01 | 1992-08-25 | "curculin c" |
| US08/165,754 US5395921A (en) | 1991-10-01 | 1993-12-10 | Curculin C |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3253914A JPH0597896A (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 味覚修飾物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0597896A true JPH0597896A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=17257796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3253914A Pending JPH0597896A (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | 味覚修飾物質 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5395921A (ja) |
| JP (1) | JPH0597896A (ja) |
| CA (1) | CA2076830A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2113440C1 (ru) * | 1991-03-04 | 1998-06-20 | Курихара Есие | Фрагмент днк, кодирующий куркулин в с активностью модификатора вкуса, куркулин в с активностью модификатора вкуса и способ его получения |
| EP1724341A4 (en) * | 2004-01-28 | 2007-08-01 | Mitsukan Group Corp | NOVEL, TASTE MANAGEMENT MODIFYING PEPTIDE NAS, ITS DNA AND ITS USE |
| MY159747A (en) * | 2008-10-28 | 2017-01-31 | Univ Putra Malaysia | Uses of curculigo latifolia (c. latifolia) extracts |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5178900A (en) * | 1988-06-21 | 1993-01-12 | Yoshie Kurihara | Method for stabilizing taste-modifier |
| US5176937A (en) * | 1988-06-21 | 1993-01-05 | Yoshie Kurihara | Reinforcer for taste-modifier |
| US5242693A (en) * | 1988-06-21 | 1993-09-07 | Yoshie Kurihara | Protein curuculin and application of the same |
| US5178899A (en) * | 1988-06-21 | 1993-01-12 | Yoshie Kurihara | Method for processing taste-modifier |
| JP2509989B2 (ja) * | 1988-06-21 | 1996-06-26 | 良枝 栗原 | 蛋白質クルクリン及びその用途 |
| JP2733352B2 (ja) * | 1989-12-20 | 1998-03-30 | 良枝 栗原 | 味覚修飾物質 |
-
1991
- 1991-10-01 JP JP3253914A patent/JPH0597896A/ja active Pending
-
1992
- 1992-08-25 CA CA002076830A patent/CA2076830A1/en not_active Abandoned
-
1993
- 1993-12-10 US US08/165,754 patent/US5395921A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5395921A (en) | 1995-03-07 |
| CA2076830A1 (en) | 1993-04-02 |
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