JPH0576368A - ヒトｇｌｕ４遺伝子プロモーター - Google Patents
ヒトｇｌｕ４遺伝子プロモーターInfo
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- JPH0576368A JPH0576368A JP4009594A JP959492A JPH0576368A JP H0576368 A JPH0576368 A JP H0576368A JP 4009594 A JP4009594 A JP 4009594A JP 959492 A JP959492 A JP 959492A JP H0576368 A JPH0576368 A JP H0576368A
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- dna
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は哺乳動物細胞のヒトglut４グルコー
ス輸送体の発現に関与する独特なＤＮＡ配列の単離、精
製，クローニング及び配列決定に関する。 【効果】 本発明に係るＤＮＡ配列は選択された組織か
らの細胞において関心のあるタンパク質についてコード
する遺伝子の発現を調節するために用いられる。
ス輸送体の発現に関与する独特なＤＮＡ配列の単離、精
製，クローニング及び配列決定に関する。 【効果】 本発明に係るＤＮＡ配列は選択された組織か
らの細胞において関心のあるタンパク質についてコード
する遺伝子の発現を調節するために用いられる。
Description
【０００１】細胞によるグルコースの取込みは組織特異
的に発現されることが示された５群のグルコース輸送タ
ンパク質によって媒介される〔総説として、ベルら，ジ
アベテス・ケア，第１３巻，第１９８−２０８頁，１９
９０年（Bell et al., Diabetes Care１３：１９８−２
０８（１９９０））；ミュエクラー，ジアベテス，第３
９巻，第６−１１頁，１９９０年（Mueckler, Diabetes
３９：６−１１（１９９０））参照〕。その群の１つ、
glut４は骨格筋、脂肪及び心臓で特に発現され〔バーン
バウム，セル，第５７巻，第３０５−３１５頁，１９８
９年（Birnbaum, Cell５７：３０５−３１５（１９８
９））；チャロンら，プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８６
巻，第２５３５−２５３９頁，１９８９年（Charron et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA８６：２５３５−２
５３９（１９８９））；フクモトら，ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー，第２６４巻，第７７
７６−７７７９頁，１９８９年（Fukumoto et al., J.
Biol. Chem. ２６４：７７７６−７７７９（１９８
９））；ジェームズら，ネーチャー，第３３８巻，第８
３−８７頁，１９８９年（James et al., Nature３３
８：８３−８７（１９８９））〕、これらの組織による
インシュリン誘導グルコース取込みに関与する主要輸送
体イソ型であると思われる〔バーガー（Berger) ら，ネ
ーチャー，第３４０巻，第７０−７２頁，１９８９年；
ガービーら，サイエンス，第２４５巻，第６０−６３
頁，１９８９年（Garvey et al., Science２４５：６０
−６３（１９８９））；カーンら，ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション，第８４巻，第４
０４−４１１頁，１９８９年（Kahn et, al., J. Clin.
Invest.８４：４０４−４１１（１９８９））；シビッ
ツ（Sivitz) ら，ネーチャー，第３４０巻，第７２−７
４頁，１９８９年；ストロートら，エンドクリノロジ
ー，第１２６巻，第２７２８−２７３２頁，１９９０年
（Strout et al., Endocrino. １２６：２７２８−２７
３２（１９９０））；ゾーザノ（Zorzano)ら，ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第２６４
巻，第１２３５８−１２３６３頁，１９８９年〕。
的に発現されることが示された５群のグルコース輸送タ
ンパク質によって媒介される〔総説として、ベルら，ジ
アベテス・ケア，第１３巻，第１９８−２０８頁，１９
９０年（Bell et al., Diabetes Care１３：１９８−２
０８（１９９０））；ミュエクラー，ジアベテス，第３
９巻，第６−１１頁，１９９０年（Mueckler, Diabetes
３９：６−１１（１９９０））参照〕。その群の１つ、
glut４は骨格筋、脂肪及び心臓で特に発現され〔バーン
バウム，セル，第５７巻，第３０５−３１５頁，１９８
９年（Birnbaum, Cell５７：３０５−３１５（１９８
９））；チャロンら，プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８６
巻，第２５３５−２５３９頁，１９８９年（Charron et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA８６：２５３５−２
５３９（１９８９））；フクモトら，ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー，第２６４巻，第７７
７６−７７７９頁，１９８９年（Fukumoto et al., J.
Biol. Chem. ２６４：７７７６−７７７９（１９８
９））；ジェームズら，ネーチャー，第３３８巻，第８
３−８７頁，１９８９年（James et al., Nature３３
８：８３−８７（１９８９））〕、これらの組織による
インシュリン誘導グルコース取込みに関与する主要輸送
体イソ型であると思われる〔バーガー（Berger) ら，ネ
ーチャー，第３４０巻，第７０−７２頁，１９８９年；
ガービーら，サイエンス，第２４５巻，第６０−６３
頁，１９８９年（Garvey et al., Science２４５：６０
−６３（１９８９））；カーンら，ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション，第８４巻，第４
０４−４１１頁，１９８９年（Kahn et, al., J. Clin.
Invest.８４：４０４−４１１（１９８９））；シビッ
ツ（Sivitz) ら，ネーチャー，第３４０巻，第７２−７
４頁，１９８９年；ストロートら，エンドクリノロジ
ー，第１２６巻，第２７２８−２７３２頁，１９９０年
（Strout et al., Endocrino. １２６：２７２８−２７
３２（１９９０））；ゾーザノ（Zorzano)ら，ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第２６４
巻，第１２３５８−１２３６３頁，１９８９年〕。
【０００２】最近、glut４及びそのメッセンジャーＲＮ
Ａの発現に関する減少はインシュリン耐性の動物モデル
で観察された〔バーガーら，ネーチャー，第３４０巻，
第７０−７２頁，１９８９年；ガービーら，サイエン
ス，第２４５巻，第６０−６３頁，１９８９年；カーン
ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション，第８４巻，第４０４−４１１頁，１９８９年；
シビッツら，ネーチャー，第３４０巻，第７２−７４
頁，１９８９年；ストロートら，エンドクリノロジー，
第１２６巻，第２７２８−２７３２頁，１９９０年〕。
骨格筋脂肪glut４発現に関する減少は疾患性の肥満糖尿
病患者でも観察されたが〔カロら，ジアベ・メタボ・レ
ビュー，第５巻，第６６５−６８９頁，１９８９年（Ca
ro et al., Diab. Metab. Rev.５：６６５−６８９（１
９８９））〕、有意の減少はやせた及びやや肥満の糖尿
病患者ではみられなかった〔ペダーセン（Pedersen)
ら，ジアベテス，第３９巻，第８６５−８７０頁，１９
９０年〕。この証拠は、翻訳レベルにおけるglut４の発
現低下がＮＩＤＤＭの一部患者で観察されるインシュリ
ン耐性、ひいては高血糖で役割を果たすことを示唆して
いる。
Ａの発現に関する減少はインシュリン耐性の動物モデル
で観察された〔バーガーら，ネーチャー，第３４０巻，
第７０−７２頁，１９８９年；ガービーら，サイエン
ス，第２４５巻，第６０−６３頁，１９８９年；カーン
ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション，第８４巻，第４０４−４１１頁，１９８９年；
シビッツら，ネーチャー，第３４０巻，第７２−７４
頁，１９８９年；ストロートら，エンドクリノロジー，
第１２６巻，第２７２８−２７３２頁，１９９０年〕。
骨格筋脂肪glut４発現に関する減少は疾患性の肥満糖尿
病患者でも観察されたが〔カロら，ジアベ・メタボ・レ
ビュー，第５巻，第６６５−６８９頁，１９８９年（Ca
ro et al., Diab. Metab. Rev.５：６６５−６８９（１
９８９））〕、有意の減少はやせた及びやや肥満の糖尿
病患者ではみられなかった〔ペダーセン（Pedersen)
ら，ジアベテス，第３９巻，第８６５−８７０頁，１９
９０年〕。この証拠は、翻訳レベルにおけるglut４の発
現低下がＮＩＤＤＭの一部患者で観察されるインシュリ
ン耐性、ひいては高血糖で役割を果たすことを示唆して
いる。
【０００３】ネズミglut４遺伝子が最近クローニングさ
れ、特徴付けられた〔ケストナー（Kaestner）ら，プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ，第８６巻，第３１５０−３１５４
頁，１９９０年〕。そのプロモーターはＣ／ＥＢＰに関
する特異的結合部位を有しかつ３Ｔ３−Ｌ１細胞におい
てこのタンパク質によりトランス活性化されることが示
された。本発明はＰＣＲ増幅及びハイブリッド形成技術
を利用した独特なヒトglut４ ５′フランキング領域の
クローニングについて開示している。この領域の配列分
析は適切に位置したＣＣＡＡＴボックスと推定ＭyoＤ、
Ｃ／ＥＢＰ、ＩＲＥ−Ａ及びＳＰ１結合部位との存在に
ついて証明する。
れ、特徴付けられた〔ケストナー（Kaestner）ら，プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ，第８６巻，第３１５０−３１５４
頁，１９９０年〕。そのプロモーターはＣ／ＥＢＰに関
する特異的結合部位を有しかつ３Ｔ３−Ｌ１細胞におい
てこのタンパク質によりトランス活性化されることが示
された。本発明はＰＣＲ増幅及びハイブリッド形成技術
を利用した独特なヒトglut４ ５′フランキング領域の
クローニングについて開示している。この領域の配列分
析は適切に位置したＣＣＡＡＴボックスと推定ＭyoＤ、
Ｃ／ＥＢＰ、ＩＲＥ−Ａ及びＳＰ１結合部位との存在に
ついて証明する。
【０００４】少なくとも２つの配列要素、即ちプロモー
ター及びエンハンサーが哺乳動物細胞でメッセンジャー
ＲＮＡについてコードする遺伝子の調節に必要である。
プロモーターは転写開始部位から上流に位置しており、
鎖長が通常約１００塩基対である〔ダイナン（Dynan)及
びティアン（Tjian)，ネーチャー，第３１６巻，第７７
４頁，１９８５年；マックナイト及びティアン，セル，
第４６巻，１９８６年（McKnight and Tjian,Cell ４
６：（１９８６））〕。プロモーターは正確かつ効率的
な転写開始に必要であり、一方エンハンサーはプロモー
ターからの転写速度を増加させる。エンハンサーは同種
及び異種プロモーター双方からの転写を促進しうるそれ
らの能力で特徴付けられる〔ボス（Voss) ら、ＴＩＢ
Ｓ，第１１巻，第２８７頁，１９８６年〕。エンハンサ
ーは、それらが配向非依存的にかなりの距離をおいてシ
スリンクしたプロモーターで作用でき、しかも転写ユニ
ットから下流で機能できるという点で独特である〔サー
フリングら，トレンズ・ジェネテ，第１巻，第２２４
頁，１９８５年（Serfling et al., Trends. Genet.
１：２２４（１９８５））〕。多くの状況下において、
１状況下でプロモーター活性をもつある配列は他の状況
下で機能的エンハンサーとして重要であることから、エ
ンハンサー及びプロモーター配列間で明確な区別はない
ようである。更に一部プロモーター配列のタンデムコピ
ーはエンハンサーの性質を獲得できるが、このことはそ
れが結合タンパク質の固有的性質であるそれら以外のそ
の機能的特徴を決定する所定配列の関係によることを示
唆している〔ラ・タングー及びリグビー，第６頁，転写
及びスプライシング，ハーメス及びグローバー編集，Ｉ
ＲＬプレス，ワシントン，Ｄ，Ｃ．，１９８８年（La T
angue and Rigby, pg. 6, in Transcription and Splic
ing, Hames and Glover, Eds., IRL Press, Washingto
n, D.C.,１９８８）〕。
ター及びエンハンサーが哺乳動物細胞でメッセンジャー
ＲＮＡについてコードする遺伝子の調節に必要である。
プロモーターは転写開始部位から上流に位置しており、
鎖長が通常約１００塩基対である〔ダイナン（Dynan)及
びティアン（Tjian)，ネーチャー，第３１６巻，第７７
４頁，１９８５年；マックナイト及びティアン，セル，
第４６巻，１９８６年（McKnight and Tjian,Cell ４
６：（１９８６））〕。プロモーターは正確かつ効率的
な転写開始に必要であり、一方エンハンサーはプロモー
ターからの転写速度を増加させる。エンハンサーは同種
及び異種プロモーター双方からの転写を促進しうるそれ
らの能力で特徴付けられる〔ボス（Voss) ら、ＴＩＢ
Ｓ，第１１巻，第２８７頁，１９８６年〕。エンハンサ
ーは、それらが配向非依存的にかなりの距離をおいてシ
スリンクしたプロモーターで作用でき、しかも転写ユニ
ットから下流で機能できるという点で独特である〔サー
フリングら，トレンズ・ジェネテ，第１巻，第２２４
頁，１９８５年（Serfling et al., Trends. Genet.
１：２２４（１９８５））〕。多くの状況下において、
１状況下でプロモーター活性をもつある配列は他の状況
下で機能的エンハンサーとして重要であることから、エ
ンハンサー及びプロモーター配列間で明確な区別はない
ようである。更に一部プロモーター配列のタンデムコピ
ーはエンハンサーの性質を獲得できるが、このことはそ
れが結合タンパク質の固有的性質であるそれら以外のそ
の機能的特徴を決定する所定配列の関係によることを示
唆している〔ラ・タングー及びリグビー，第６頁，転写
及びスプライシング，ハーメス及びグローバー編集，Ｉ
ＲＬプレス，ワシントン，Ｄ，Ｃ．，１９８８年（La T
angue and Rigby, pg. 6, in Transcription and Splic
ing, Hames and Glover, Eds., IRL Press, Washingto
n, D.C.,１９８８）〕。
【０００５】ＴＡＴＡボックスのようなシスリンクした
プロモーターの一部は多数のプロモーターで共有されて
おり、一般的転写因子と結合する。ＳＰ１結合部位及び
ＣＣＡＡＴボックスのような他のプロモーターは選択さ
れたプロモーターでみられる（ラ・タングー及びリグビ
ー，第６頁，転写及びスプライシング，ハーメス及びグ
ローバー編集，ＩＲＬプレス，ワシントン，Ｄ．Ｃ．，
１９８８年）。プロモーター／エンハンサー系はプロモ
ーター／エンハンサー系のセグメントに対する特定タン
パク質又はポリペプチドの結合によって更に調節される
かもしれない。実際に、インシュリンはグルコース輸送
タンパク質の調節に関して機能する。
プロモーターの一部は多数のプロモーターで共有されて
おり、一般的転写因子と結合する。ＳＰ１結合部位及び
ＣＣＡＡＴボックスのような他のプロモーターは選択さ
れたプロモーターでみられる（ラ・タングー及びリグビ
ー，第６頁，転写及びスプライシング，ハーメス及びグ
ローバー編集，ＩＲＬプレス，ワシントン，Ｄ．Ｃ．，
１９８８年）。プロモーター／エンハンサー系はプロモ
ーター／エンハンサー系のセグメントに対する特定タン
パク質又はポリペプチドの結合によって更に調節される
かもしれない。実際に、インシュリンはグルコース輸送
タンパク質の調節に関して機能する。
【０００６】したがって、ヒトglut４グルコース輸送体
のプロモーター領域を単離かつ精製することが本発明の
目的である。もう１つの目的は異種遺伝子の組織特異的
発現のために新規glut４プロモーター領域を提供するこ
とである。
のプロモーター領域を単離かつ精製することが本発明の
目的である。もう１つの目的は異種遺伝子の組織特異的
発現のために新規glut４プロモーター領域を提供するこ
とである。
【０００７】哺乳動物細胞のヒトglut４グルコース輸送
体の発現に関与する独特なＤＮＡ配列が単離、精製、ク
ローニング及び配列決定された。このＤＮＡ配列は関心
のあるタンパク質についてコードする遺伝子の発現を調
節するために用いられる。そのＤＮＡ配列は望ましいタ
ンパク質に関する遺伝子に作動的に結合されて、ベクタ
ーに組込まれる。新規ベクターはプロモーターが望まし
いタンパク質に関する遺伝子の発現を調節するように真
核細胞宿主を形質転換させるために用いられる。
体の発現に関与する独特なＤＮＡ配列が単離、精製、ク
ローニング及び配列決定された。このＤＮＡ配列は関心
のあるタンパク質についてコードする遺伝子の発現を調
節するために用いられる。そのＤＮＡ配列は望ましいタ
ンパク質に関する遺伝子に作動的に結合されて、ベクタ
ーに組込まれる。新規ベクターはプロモーターが望まし
いタンパク質に関する遺伝子の発現を調節するように真
核細胞宿主を形質転換させるために用いられる。
【０００８】本発明は哺乳動物細胞でタンパク質につい
てコードするＤＮＡの発現を調節するために使用できる
哺乳動物glut４プロモーターＤＮＡ配列の単離、精製、
特徴付け及び配列決定に関する。ここで用いられるプロ
モーターとは、１以上のプロモーターＤＮＡ配列を含む
のみならず、１以上のエンハンサー配列も含んでいてよ
いＤＮＡ配列として定義される。その配列は包括的に調
節配列と称される。エンハンサー及びプロモーター配列
間で明確な区別はなく、しかも一部プロモーター配列の
タンデムコピーはエンハンサーの性質を獲得できること
から、プロモーターという用語は双方の要素を含めて解
釈される。ここで用いられるプロモーターはＲＮＡポリ
メラーゼの結合に関するシグナルとして作用する遺伝子
の上流でみられるヌクレオチド配列としても定義され
る。プロモーターと同様に、エンハンサーは転写に関与
する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列
の短鎖配置からなる。異なる認識配列の組合せ及び同族
転写因子の量は所定遺伝子が具体的細胞タイプで転写さ
れる効率について決定する。本発明はこのプロモーター
に作動的に結合された異種遺伝子でコードされるポリペ
プチド及びタンパク質の産生のためのこの独特なプロモ
ーターの利用にも関する。ここで用いられる異種遺伝子
とはglut４グルコース輸送遺伝子以外の構造遺伝子に関
し、構造遺伝子とはポリペプチド鎖を産生するように細
胞で転写及び翻訳されるヌクレオチド配列に関する。作
動的に結合されたとは、関心のある遺伝子を転写及び翻
訳する様々なＤＮＡセグメントの向きとして定義され
る。本発明は骨格筋細胞、脂肪細胞、皮膚線維芽細胞及
び同様の特異性がある他の細胞タイプにおいて作動的に
結合された異種遺伝子の特異的発現のための独特なプロ
モーターの使用にも関する。本発明にはglut４グルコー
ス輸送遺伝子に関するすべてのプロモーターＤＮＡ配列
と異種遺伝子を発現させる上記プロモーターに関連した
あらゆるすべてのエンハンサーＤＮＡ配列とを含むと解
釈される。調節配列の配置はglut４プロモーターに作動
的に結合された異種遺伝子を転写及び翻訳するＤＮＡ配
列又はいずれかの配置でみられるものである。
てコードするＤＮＡの発現を調節するために使用できる
哺乳動物glut４プロモーターＤＮＡ配列の単離、精製、
特徴付け及び配列決定に関する。ここで用いられるプロ
モーターとは、１以上のプロモーターＤＮＡ配列を含む
のみならず、１以上のエンハンサー配列も含んでいてよ
いＤＮＡ配列として定義される。その配列は包括的に調
節配列と称される。エンハンサー及びプロモーター配列
間で明確な区別はなく、しかも一部プロモーター配列の
タンデムコピーはエンハンサーの性質を獲得できること
から、プロモーターという用語は双方の要素を含めて解
釈される。ここで用いられるプロモーターはＲＮＡポリ
メラーゼの結合に関するシグナルとして作用する遺伝子
の上流でみられるヌクレオチド配列としても定義され
る。プロモーターと同様に、エンハンサーは転写に関与
する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列
の短鎖配置からなる。異なる認識配列の組合せ及び同族
転写因子の量は所定遺伝子が具体的細胞タイプで転写さ
れる効率について決定する。本発明はこのプロモーター
に作動的に結合された異種遺伝子でコードされるポリペ
プチド及びタンパク質の産生のためのこの独特なプロモ
ーターの利用にも関する。ここで用いられる異種遺伝子
とはglut４グルコース輸送遺伝子以外の構造遺伝子に関
し、構造遺伝子とはポリペプチド鎖を産生するように細
胞で転写及び翻訳されるヌクレオチド配列に関する。作
動的に結合されたとは、関心のある遺伝子を転写及び翻
訳する様々なＤＮＡセグメントの向きとして定義され
る。本発明は骨格筋細胞、脂肪細胞、皮膚線維芽細胞及
び同様の特異性がある他の細胞タイプにおいて作動的に
結合された異種遺伝子の特異的発現のための独特なプロ
モーターの使用にも関する。本発明にはglut４グルコー
ス輸送遺伝子に関するすべてのプロモーターＤＮＡ配列
と異種遺伝子を発現させる上記プロモーターに関連した
あらゆるすべてのエンハンサーＤＮＡ配列とを含むと解
釈される。調節配列の配置はglut４プロモーターに作動
的に結合された異種遺伝子を転写及び翻訳するＤＮＡ配
列又はいずれかの配置でみられるものである。
【０００９】プロモーターはＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７
ベクターに含まれるヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリー
から単離される。そのゲノムライブラリーはクロンテッ
ク（Clontech) （パロアルト，カリフォルニア州）から
市販で得ることができる。他のゲノムライブラリーは促
進性グルコース輸送タンパク質に関するプロモーターを
単離及び精製するために使用できると理解される。適切
なプロモーターはglut４輸送遺伝子を発現できるあらゆ
るヒト細胞から単離及び精製でき、プロモーターはゲノ
ムであるため、それはあらゆるヒト細胞から単離できる
ことが更に理解される。ゲノムライブラリーＤＮＡは精
製され、ライブラリーファージストックは下記プロセス
で増幅される。約１００ mM NaCl、約８ mM MgSO4 及び
約０．０１％ゼラチンを含有したpH約７．５の約５０ m
M トリスHCl 約１０μｌ中における約１×１０6 プラー
ク形成単位（pfu)のライブラリーファージは約０．２％
マルトース及び約１０ mM MgSO4を含有したルリア・バ
ータニ (Luria Bartani)（ＬＢ）ブロス中において約１
００μｌの約１０ mM MgSO4 、約１０ mM CaCl2及び約
７５μｌのlog ファージＬＥ３９２大腸菌と混ぜられ
る。ファージは３７℃で約３０分間かけて細胞に前吸着
され、しかる後ＬＢブロス約６mlが加えられ、細胞は約
２２５回転／min （rpm)で回転させながら約３７℃で約
１６時間インキュベートされる。この操作は全部で約
２．６×１０7 pfu に増幅させるため約２６回繰返さ
れ。インキュベート後に溶離物がプールされ、細胞砕片
が遠心（約８０００xgで約１０分間）で除去される。ラ
イブラリーファージＤＮＡは製造業者〔プロメガ（Prom
ega)〕により示されたプロトコールでラムダゾルブ・フ
ァージ・アドゾーベント（Lambdasorb Phage Adsorben
t) を用いて単離される。
ベクターに含まれるヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリー
から単離される。そのゲノムライブラリーはクロンテッ
ク（Clontech) （パロアルト，カリフォルニア州）から
市販で得ることができる。他のゲノムライブラリーは促
進性グルコース輸送タンパク質に関するプロモーターを
単離及び精製するために使用できると理解される。適切
なプロモーターはglut４輸送遺伝子を発現できるあらゆ
るヒト細胞から単離及び精製でき、プロモーターはゲノ
ムであるため、それはあらゆるヒト細胞から単離できる
ことが更に理解される。ゲノムライブラリーＤＮＡは精
製され、ライブラリーファージストックは下記プロセス
で増幅される。約１００ mM NaCl、約８ mM MgSO4 及び
約０．０１％ゼラチンを含有したpH約７．５の約５０ m
M トリスHCl 約１０μｌ中における約１×１０6 プラー
ク形成単位（pfu)のライブラリーファージは約０．２％
マルトース及び約１０ mM MgSO4を含有したルリア・バ
ータニ (Luria Bartani)（ＬＢ）ブロス中において約１
００μｌの約１０ mM MgSO4 、約１０ mM CaCl2及び約
７５μｌのlog ファージＬＥ３９２大腸菌と混ぜられ
る。ファージは３７℃で約３０分間かけて細胞に前吸着
され、しかる後ＬＢブロス約６mlが加えられ、細胞は約
２２５回転／min （rpm)で回転させながら約３７℃で約
１６時間インキュベートされる。この操作は全部で約
２．６×１０7 pfu に増幅させるため約２６回繰返さ
れ。インキュベート後に溶離物がプールされ、細胞砕片
が遠心（約８０００xgで約１０分間）で除去される。ラ
イブラリーファージＤＮＡは製造業者〔プロメガ（Prom
ega)〕により示されたプロトコールでラムダゾルブ・フ
ァージ・アドゾーベント（Lambdasorb Phage Adsorben
t) を用いて単離される。
【００１０】ヒトglut４遺伝子の５′プロモーター領域
のポリメラーゼ鎖反応増幅のための鋳型ＤＮＡを得るた
め、ベクターＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７におけるヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーからのファージストック２．６×
１０7 pfu が必要であると決定された。これは関心のあ
るクローンを９９％の確率で得るために標準ハイブリッ
ド形成法でスクリーニングする上で必要な独立プラーク
の計算数よりも１０倍以上である。ここで利用される増
加した数のクローンは、プロモーター領域がＴ７プロモ
ーターを含む２１キロ塩基（kb) ベクターアームに隣接
している鋳型でのみ成功する増幅戦略で必要とされる
（図１）。約１kbのフラグメンドを増幅させることが望
まれ、平均インサートサイズが約１５kbであることか
ら、計算によれば１５のうち約１つ又は約７％のみのプ
ロモーター含有ファージＤＮＡが適正な鋳型として機能
することがわかった。したがって望ましい配列を増幅さ
せる高い確率を維持するためには、“スクリーニングさ
れる”プラークの数は１０倍以上に増える。２．６×１
０7 pfu が２６の別々の６ml液体溶離物で増幅され、全
部で１×１０12pfu 以上を得る。ラムダゾルブ精製で約
５０μｇの高分子量鋳型ＤＮＡを得る。
のポリメラーゼ鎖反応増幅のための鋳型ＤＮＡを得るた
め、ベクターＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７におけるヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーからのファージストック２．６×
１０7 pfu が必要であると決定された。これは関心のあ
るクローンを９９％の確率で得るために標準ハイブリッ
ド形成法でスクリーニングする上で必要な独立プラーク
の計算数よりも１０倍以上である。ここで利用される増
加した数のクローンは、プロモーター領域がＴ７プロモ
ーターを含む２１キロ塩基（kb) ベクターアームに隣接
している鋳型でのみ成功する増幅戦略で必要とされる
（図１）。約１kbのフラグメンドを増幅させることが望
まれ、平均インサートサイズが約１５kbであることか
ら、計算によれば１５のうち約１つ又は約７％のみのプ
ロモーター含有ファージＤＮＡが適正な鋳型として機能
することがわかった。したがって望ましい配列を増幅さ
せる高い確率を維持するためには、“スクリーニングさ
れる”プラークの数は１０倍以上に増える。２．６×１
０7 pfu が２６の別々の６ml液体溶離物で増幅され、全
部で１×１０12pfu 以上を得る。ラムダゾルブ精製で約
５０μｇの高分子量鋳型ＤＮＡを得る。
【００１１】オリゴヌクレオチドプライマーはglut４プ
ロモーター遺伝子のポリメラーゼ鎖反応増幅用に製造さ
れる。オリゴヌクレオチドプライマーはアプライド・バ
イオシステムズ・モデル８７００（Applied Biosystems
Model 8700)自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、製
造業者により記載されるようなＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８
カートリッジ〔ウォーターズ・アソシエーツ（Waters A
ssoc.)〕で精製される。オリゴヌクレオチドプライマー
はフクモトら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー，第２６４巻，第７７７６−７７７９頁，１
９８９年で示されるようなヒト成人骨格筋グルコース輸
送体の配列より上流のヌクレオチド配列及びＴ７プロモ
ーター領域のヌクレオチド配列から決定される。下記３
種の異なるプライマーが用いられる： プライマー T7,22mer ： 5′TAATACGACTCATATAGGGGAG 3′ （配列番号：１） プライマー JB23, 21mer： 5′GATCCTGGAGTCTCTGACTCC 3 ′ （配列番号：２） プライマー JB24, 22mer： 5′GCGAAGATGAAAGAACCGATCC 3′ （配列番号：３） プライマーＴ７はＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７ベクターの
２１キロ塩基アーム中に位置するＴ７プロモーターのヌ
クレオチド配列を含んでいる。プライマーＪＢ２３及び
ＪＢ２４はフクモトら，ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー，第７７７６−７７７９頁，１９８
９年で記載されるようにヒトglut４ｃＤＮＡ正鎖のヌク
レオチド７７−９７及び９２−１１３に各々相補的な配
列を含んでいる。上記プライマーはglut４プロモーター
領域の増幅に用いられるプライマーの例であるが、但し
他も同定されて下記プロセスで用いてもよいことに留意
すべきである。
ロモーター遺伝子のポリメラーゼ鎖反応増幅用に製造さ
れる。オリゴヌクレオチドプライマーはアプライド・バ
イオシステムズ・モデル８７００（Applied Biosystems
Model 8700)自動ＤＮＡシンセサイザーで合成され、製
造業者により記載されるようなＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８
カートリッジ〔ウォーターズ・アソシエーツ（Waters A
ssoc.)〕で精製される。オリゴヌクレオチドプライマー
はフクモトら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー，第２６４巻，第７７７６−７７７９頁，１
９８９年で示されるようなヒト成人骨格筋グルコース輸
送体の配列より上流のヌクレオチド配列及びＴ７プロモ
ーター領域のヌクレオチド配列から決定される。下記３
種の異なるプライマーが用いられる： プライマー T7,22mer ： 5′TAATACGACTCATATAGGGGAG 3′ （配列番号：１） プライマー JB23, 21mer： 5′GATCCTGGAGTCTCTGACTCC 3 ′ （配列番号：２） プライマー JB24, 22mer： 5′GCGAAGATGAAAGAACCGATCC 3′ （配列番号：３） プライマーＴ７はＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７ベクターの
２１キロ塩基アーム中に位置するＴ７プロモーターのヌ
クレオチド配列を含んでいる。プライマーＪＢ２３及び
ＪＢ２４はフクモトら，ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー，第７７７６−７７７９頁，１９８
９年で記載されるようにヒトglut４ｃＤＮＡ正鎖のヌク
レオチド７７−９７及び９２−１１３に各々相補的な配
列を含んでいる。上記プライマーはglut４プロモーター
領域の増幅に用いられるプライマーの例であるが、但し
他も同定されて下記プロセスで用いてもよいことに留意
すべきである。
【００１２】増幅の第一ラウンドは約２００μM ｄＮＴ
Ｐ、各約１００pMのプライマーＴ７及びＪＢ２４と鋳型
として約２５０ngの前記ヒトゲノムライブラリーＤＮＡ
を含有した１×ＰＣＲ緩衝液（pH約８．３の約１０ mM
トリスHCl 、約５０ ｍＭ ＫＣｌ、約１．５ ｍＭ
ＭｇＣｌ２ 、約０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）約１
００μｌ中で行われる。反応混合物は鉱油約１００μｌ
上におかれた。混合物は約９４℃で約８分間にわたり前
インキュベートされ、しかる後ＤＮＡ熱サイクラー〔パ
ーキン・エルマー（Perkin-Elmer) 、セタス（Cetus)〕
で５５℃まで急速に冷却された。Taq ポリメラーゼ約
１．０単位（パーキン・エルマー・セタス）が加えら
れ、反応は３５サイクルにわたり行われる。各サイクル
は約９４℃で約２分間にわたる熱変性ステップ、しかる
後５５℃で約２分間にわたるｃＤＮＡへのプライマーの
アニーリング及び約７２℃で約１分間にわたるＤＮＡ鎖
伸長を含む。増幅後、インキュベート混合物は次のプロ
セッシング前にクロロホルムで１回抽出される。この初
期増幅では鎖長約５０bpの検出可能なＤＮＡフラグメン
トを産生する。ポリメラーゼ鎖反応はいくつかのより大
きなフラグメントと共により短い鋳型フラグメントを優
先的に増幅させることがわかった。大きなフラグメント
はアガロースゲルの臭化エチジウム染色により検出でき
なかった。
Ｐ、各約１００pMのプライマーＴ７及びＪＢ２４と鋳型
として約２５０ngの前記ヒトゲノムライブラリーＤＮＡ
を含有した１×ＰＣＲ緩衝液（pH約８．３の約１０ mM
トリスHCl 、約５０ ｍＭ ＫＣｌ、約１．５ ｍＭ
ＭｇＣｌ２ 、約０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）約１
００μｌ中で行われる。反応混合物は鉱油約１００μｌ
上におかれた。混合物は約９４℃で約８分間にわたり前
インキュベートされ、しかる後ＤＮＡ熱サイクラー〔パ
ーキン・エルマー（Perkin-Elmer) 、セタス（Cetus)〕
で５５℃まで急速に冷却された。Taq ポリメラーゼ約
１．０単位（パーキン・エルマー・セタス）が加えら
れ、反応は３５サイクルにわたり行われる。各サイクル
は約９４℃で約２分間にわたる熱変性ステップ、しかる
後５５℃で約２分間にわたるｃＤＮＡへのプライマーの
アニーリング及び約７２℃で約１分間にわたるＤＮＡ鎖
伸長を含む。増幅後、インキュベート混合物は次のプロ
セッシング前にクロロホルムで１回抽出される。この初
期増幅では鎖長約５０bpの検出可能なＤＮＡフラグメン
トを産生する。ポリメラーゼ鎖反応はいくつかのより大
きなフラグメントと共により短い鋳型フラグメントを優
先的に増幅させることがわかった。大きなフラグメント
はアガロースゲルの臭化エチジウム染色により検出でき
なかった。
【００１３】プロモーター領域の大きな方のセクション
を更に増幅させるため、第二ラウンドの増幅は第一増幅
のプロセスを用いて行われる。第二ラウンドの増幅は第
一の増合と同様に行われるが、但し利用されるプライマ
ーはＴ７及びＪＢ２３であり、鋳型は１００nlの第一ラ
ウンド増幅反応混合物である。後者の“はめこまれた”
（nested) オリゴヌクレオチドはＪＢ２４でみられるも
のから上流でかつそれに隣接してみられるglut４ｃＤＮ
Ａ配列を含んでいる。アガロースゲル電気泳動による第
二反応混合物の分析では約４５０bpのＤＮＡフラグメン
トの増幅を示す。
を更に増幅させるため、第二ラウンドの増幅は第一増幅
のプロセスを用いて行われる。第二ラウンドの増幅は第
一の増合と同様に行われるが、但し利用されるプライマ
ーはＴ７及びＪＢ２３であり、鋳型は１００nlの第一ラ
ウンド増幅反応混合物である。後者の“はめこまれた”
（nested) オリゴヌクレオチドはＪＢ２４でみられるも
のから上流でかつそれに隣接してみられるglut４ｃＤＮ
Ａ配列を含んでいる。アガロースゲル電気泳動による第
二反応混合物の分析では約４５０bpのＤＮＡフラグメン
トの増幅を示す。
【００１４】第二ラウンドの増幅で得られたプロモータ
ー領域はアガロースゲル電気泳動で精製され、クレノウ
ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化され、ポリヌクレオ
チドキナーゼを利用してリン酸化され、ベクターＳＰ７
２（クロンテック）のＳmaＩ部位に組込んでサブクロー
ニングされる。３つの独立したクローンはサンガー（Sa
nger) ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７４巻，第５４６
３−５４６７頁，１９７７年の方法で同定及び配列決定
される。３つの独立クローンにおけるインサートは、配
列決定されたところ同一である。三重にみられるヌクレ
オチド配列は標準ハイブリッド形成技術で同様のライブ
ラリーから後に単離された大きな第二クローンの配列で
示されるようにヌクレオチド−３１４〜＋１４２を含ん
でいる。図２及び３（配列番号：４）参照。増幅された
フラグメントは鎖長約４５８bpであり、ヒトglut４ｃＤ
ＮＡに関する最初のメチオニンコドンの上流におけるヌ
クレオチド５０−５０８である。
ー領域はアガロースゲル電気泳動で精製され、クレノウ
ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化され、ポリヌクレオ
チドキナーゼを利用してリン酸化され、ベクターＳＰ７
２（クロンテック）のＳmaＩ部位に組込んでサブクロー
ニングされる。３つの独立したクローンはサンガー（Sa
nger) ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７４巻，第５４６
３−５４６７頁，１９７７年の方法で同定及び配列決定
される。３つの独立クローンにおけるインサートは、配
列決定されたところ同一である。三重にみられるヌクレ
オチド配列は標準ハイブリッド形成技術で同様のライブ
ラリーから後に単離された大きな第二クローンの配列で
示されるようにヌクレオチド−３１４〜＋１４２を含ん
でいる。図２及び３（配列番号：４）参照。増幅された
フラグメントは鎖長約４５８bpであり、ヒトglut４ｃＤ
ＮＡに関する最初のメチオニンコドンの上流におけるヌ
クレオチド５０−５０８である。
【００１５】glut４プロモーター／エンハンサー配列は
特定の異種タンパク質についてコードする異種遺伝子に
作動的に結合され、そのプロモーター−遺伝子構築体は
細胞をトランスフェクトするために用いられる。プロモ
ーター／エンハンサー配列は米国特許第４，９３５，３
６３号明細書及びビューデット、アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス，第３７巻，第
３８６−４０６頁，１９８５年〔Beaudet, Am. J. Hum.
Gen. ３７：３８６−４０６（１９８５）〕におけるリ
ストで例示されるように、例えば酵素、成長因子、リン
ホカイン、モノカイン及びリポータータンパク質を含め
た多数のポリペプチド及びタンバク質を発現させるため
に使用できる。ほとんどのタンパク質はglut４プロモー
ター系及び前記の細胞タイプを用いて組換え技術により
発現できると理解されるべきである。
特定の異種タンパク質についてコードする異種遺伝子に
作動的に結合され、そのプロモーター−遺伝子構築体は
細胞をトランスフェクトするために用いられる。プロモ
ーター／エンハンサー配列は米国特許第４，９３５，３
６３号明細書及びビューデット、アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス，第３７巻，第
３８６−４０６頁，１９８５年〔Beaudet, Am. J. Hum.
Gen. ３７：３８６−４０６（１９８５）〕におけるリ
ストで例示されるように、例えば酵素、成長因子、リン
ホカイン、モノカイン及びリポータータンパク質を含め
た多数のポリペプチド及びタンバク質を発現させるため
に使用できる。ほとんどのタンパク質はglut４プロモー
ター系及び前記の細胞タイプを用いて組換え技術により
発現できると理解されるべきである。
【００１６】本発明のglut４プロモーター領域はそのプ
ロモーターに及びその後又は下流に作動的に結合された
遺伝子又はＤＮＡ配列の発現をコントロールするために
用いられる。実際には、このプロモーターは選択された
異種構造遺伝子の上流に位置した場合には許容される宿
主細胞でその遺伝子を発現させるようになる。ここで用
いられる上流とはＤＮＡ分子において所定の参照箇所か
ら５′側にみられるＤＮＡ配列に関する。異種又は構造
遺伝子とは通常glut４プロモーター領域に伴われてい
ず、宿主細胞で転写及び翻訳されうるＤＮＡ配列に関す
る。これはベクターのポリリンカー領域における制限エ
ンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩでの開裂でＳＰ
７２ベクターからglut４プロモーター領域を除去するこ
とにより説明される。切出されたglut４プロモーター領
域はアガロースゲル電気泳動で精製され、クレノウＤＮ
ＡポリメラーゼＩで平滑末端化され、構造又は異種遺伝
子を含むベクターの平滑末端化ＢamＨＩ部位に組込んで
サブクローニングされる。本発明のプロモーター配列は
更に同種又は異種コントロール又はプロモーション配列
と共に又はそれなしであらゆる異種遺伝子の転写及び翻
訳のために用いられる。
ロモーターに及びその後又は下流に作動的に結合された
遺伝子又はＤＮＡ配列の発現をコントロールするために
用いられる。実際には、このプロモーターは選択された
異種構造遺伝子の上流に位置した場合には許容される宿
主細胞でその遺伝子を発現させるようになる。ここで用
いられる上流とはＤＮＡ分子において所定の参照箇所か
ら５′側にみられるＤＮＡ配列に関する。異種又は構造
遺伝子とは通常glut４プロモーター領域に伴われてい
ず、宿主細胞で転写及び翻訳されうるＤＮＡ配列に関す
る。これはベクターのポリリンカー領域における制限エ
ンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩでの開裂でＳＰ
７２ベクターからglut４プロモーター領域を除去するこ
とにより説明される。切出されたglut４プロモーター領
域はアガロースゲル電気泳動で精製され、クレノウＤＮ
ＡポリメラーゼＩで平滑末端化され、構造又は異種遺伝
子を含むベクターの平滑末端化ＢamＨＩ部位に組込んで
サブクローニングされる。本発明のプロモーター配列は
更に同種又は異種コントロール又はプロモーション配列
と共に又はそれなしであらゆる異種遺伝子の転写及び翻
訳のために用いられる。
【００１７】glut４プロモーターは遺伝子発現を定量的
に測定しうるリポーター又はインジケーター遺伝子の発
現のためにも用いることができる。プロモーターへのこ
れら遺伝子の結合、しかる後真核細胞へのＤＮＡの導入
は、遺伝子発現レベルにおけるその作動的に結合された
配列の効果の関接的測定を可能にする。インジケーター
遺伝子としては格別限定されず、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ〔アンら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，
第１３巻，第２９２１−２９３０頁，１９８５年（An e
t al., Nucleic AcidsRes. １３：２９２１−２９３０
（１９８５））〕、ガラクトキナーゼ〔シャンパーリ
（Schumperli) ら，プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，
第２５７−２６１頁，１９８２年〕、インターロイキン
−２〔キュレン（Cullen),セル，第４６巻，第９７３−
９８２頁，１９８６年〕、チミジンキナーゼ〔シャール
ら，モレキュラー・セル・バイオロジー，第５巻，第１
４８０−１４８９頁，１９８５年（Searle et al., Mo
l, Cell Biol.５：１４８０−１４８９（１９８
５））〕及び分泌性アルカリホスファターゼ（欧州特許
出願、公開第３２７，９６０号）があるが、アルカリホ
スファターゼが好ましい。
に測定しうるリポーター又はインジケーター遺伝子の発
現のためにも用いることができる。プロモーターへのこ
れら遺伝子の結合、しかる後真核細胞へのＤＮＡの導入
は、遺伝子発現レベルにおけるその作動的に結合された
配列の効果の関接的測定を可能にする。インジケーター
遺伝子としては格別限定されず、大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ〔アンら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，
第１３巻，第２９２１−２９３０頁，１９８５年（An e
t al., Nucleic AcidsRes. １３：２９２１−２９３０
（１９８５））〕、ガラクトキナーゼ〔シャンパーリ
（Schumperli) ら，プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９巻，
第２５７−２６１頁，１９８２年〕、インターロイキン
−２〔キュレン（Cullen),セル，第４６巻，第９７３−
９８２頁，１９８６年〕、チミジンキナーゼ〔シャール
ら，モレキュラー・セル・バイオロジー，第５巻，第１
４８０−１４８９頁，１９８５年（Searle et al., Mo
l, Cell Biol.５：１４８０−１４８９（１９８
５））〕及び分泌性アルカリホスファターゼ（欧州特許
出願、公開第３２７，９６０号）があるが、アルカリホ
スファターゼが好ましい。
【００１８】平滑末端化glut４プロモーターは、例えば
ｐＳＶＯ／ＳＥＡＰのような分泌性アルカリホスファタ
ーゼ（ＳＥＡＰ）を含むベクターの平滑末端化ＢamＨＩ
部位に組込んでサブクローニングされる。ベクターｐＳ
ＶＯＳＥＡＰはヨーンら，ジーン，第６６巻，第１１−
１７頁，１９８８年〔Yoon et al., Gene ６６：１１−
１７（１９８８）〕で記載されたｐＳＶＯＡＰベクター
及びバーガー（Berger) ら，ジーン，第６６巻，第１−
１０頁，１９８８年で記載されたｐＢＣ１２／ＲＳＶ／
ＳＥＡＰベクターから構築させられる。ベクターｐＳＶ
ＯＡＰはそのベクターからラットアルカリホスファター
ゼｃＤＮＡを除去するため制限酵素ＳmaＩ及びＨind II
I で切断される。残ったベクターｐＳＶＯはアガロース
ゲルでの電気泳動により精製される。ベクターｐＢＣ１
２／ＲＳＶ／ＳＥＡＰは、分泌性アルカリホスファター
ゼ（ＳＥＡＰ）についてコードするｃＤＮＡを除去する
ため、制限酵素ＸhoＩで開裂され、クレノウフラグメン
トで補充され、Ｈind IIIで切断される。ＳＥＡＰｃＤ
ＮＡはアガロースゲルでの電気泳動により精製される。
ＳＥＡＰｃＤＮＡはｐＳＶＯＳＥＡＰを得るためｐＳＶ
ＯのＳmaＩ／ＨindIII 部位に結合される。glut４プロ
モーター領域の向きがプロモーターから下流に位置する
遺伝子の発現に適しているクローンが選択された。この
クローンはｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰと表示される。glut
４プロモーター領域が反対向きの第二クローンｐＭ／Ａ
ＧＴ（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰと表示された。その構築体は
リン酸カルシウム共沈降のような公知プロセスで細胞、
通常哺乳動物細胞及び細胞系にトランスフェクトされ、
培地の分泌リポーター遺伝子活性が約７２時間のトラン
スフェクション後に測定される。細胞は安定で多数増殖
させるのが比較的容易であるべきであり、リポーター遺
伝子又は遺伝子産物の否定的バックグラウンドをできる
だけ含んでいないべきである。哺乳動物細胞及び細胞系
は通常glut４グルコース輸送タンパク質を発現する組
織、骨格筋、心臓及び脂肪からの細胞又はglut４プロモ
ーターのコントロール下でタンパク質を発現するように
変えられた細胞に限定してもよい。細胞系としては格別
限定されず、３Ｔ３−Ｌ１及びＣＨＯがある。ｐＭ／Ａ
ＧＴ／ＳＥＡＰでトランスフェクトされた細胞は等量の
ｐＭ／ＡＧＴ（rev)／ＳＥＡＰでトランスフェクトされ
た細胞よりも約１０倍多くアルカリホスファターゼ活性
を生じた。
ｐＳＶＯ／ＳＥＡＰのような分泌性アルカリホスファタ
ーゼ（ＳＥＡＰ）を含むベクターの平滑末端化ＢamＨＩ
部位に組込んでサブクローニングされる。ベクターｐＳ
ＶＯＳＥＡＰはヨーンら，ジーン，第６６巻，第１１−
１７頁，１９８８年〔Yoon et al., Gene ６６：１１−
１７（１９８８）〕で記載されたｐＳＶＯＡＰベクター
及びバーガー（Berger) ら，ジーン，第６６巻，第１−
１０頁，１９８８年で記載されたｐＢＣ１２／ＲＳＶ／
ＳＥＡＰベクターから構築させられる。ベクターｐＳＶ
ＯＡＰはそのベクターからラットアルカリホスファター
ゼｃＤＮＡを除去するため制限酵素ＳmaＩ及びＨind II
I で切断される。残ったベクターｐＳＶＯはアガロース
ゲルでの電気泳動により精製される。ベクターｐＢＣ１
２／ＲＳＶ／ＳＥＡＰは、分泌性アルカリホスファター
ゼ（ＳＥＡＰ）についてコードするｃＤＮＡを除去する
ため、制限酵素ＸhoＩで開裂され、クレノウフラグメン
トで補充され、Ｈind IIIで切断される。ＳＥＡＰｃＤ
ＮＡはアガロースゲルでの電気泳動により精製される。
ＳＥＡＰｃＤＮＡはｐＳＶＯＳＥＡＰを得るためｐＳＶ
ＯのＳmaＩ／ＨindIII 部位に結合される。glut４プロ
モーター領域の向きがプロモーターから下流に位置する
遺伝子の発現に適しているクローンが選択された。この
クローンはｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰと表示される。glut
４プロモーター領域が反対向きの第二クローンｐＭ／Ａ
ＧＴ（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰと表示された。その構築体は
リン酸カルシウム共沈降のような公知プロセスで細胞、
通常哺乳動物細胞及び細胞系にトランスフェクトされ、
培地の分泌リポーター遺伝子活性が約７２時間のトラン
スフェクション後に測定される。細胞は安定で多数増殖
させるのが比較的容易であるべきであり、リポーター遺
伝子又は遺伝子産物の否定的バックグラウンドをできる
だけ含んでいないべきである。哺乳動物細胞及び細胞系
は通常glut４グルコース輸送タンパク質を発現する組
織、骨格筋、心臓及び脂肪からの細胞又はglut４プロモ
ーターのコントロール下でタンパク質を発現するように
変えられた細胞に限定してもよい。細胞系としては格別
限定されず、３Ｔ３−Ｌ１及びＣＨＯがある。ｐＭ／Ａ
ＧＴ／ＳＥＡＰでトランスフェクトされた細胞は等量の
ｐＭ／ＡＧＴ（rev)／ＳＥＡＰでトランスフェクトされ
た細胞よりも約１０倍多くアルカリホスファターゼ活性
を生じた。
【００１９】下記実施例は本発明について説明するが、
しかしながら本発明をそれらに限定するわけではない。
しかしながら本発明をそれらに限定するわけではない。
【００２０】実施例１ ヒトglut４遺伝子プロモーターの単離、精製及び特徴付
け ゲノムライブラリーＤＮＡの精製 ヒトglut４遺伝子の５′プロモーター領域のポリメラー
ゼ鎖反応増幅のための鋳型ＤＮＡを得るためには、ベク
ターＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７におけるヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーからのファージストック約２．６×１０7
pfu が必要であろうと決定された。これは関心のあるク
ローンを９９％の確率で得るため標準ハイブリッド形成
技術でスクリーニングされるのに必要な独立したプラー
クの計算数よりも約２０倍多い。glut４ ５′フランキ
ング領域が２１kbベクターアームに隣接した鋳型から約
１kbのフラグメントが増幅されると想定された（図
１）。平均インサートサイズは約１５kbであるため、１
／１５又は約７％のみの５′領域含有ファージＤＮＡが
１kbのＴ７プロモーター内でＪＢ２４に相補的な配列を
有し、したがって適正な鋳型として機能すると更に想定
された。したがって望ましい配列を増幅させる高い確率
を維持するために、“スクリーニングされる”プラーク
の数を増加させた。ベクターＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７
におけるヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーはクロンテ
ック（パロアルト、カリフォルニア州）からファージス
トックとして得た。ライブラリーファージストックは下
記のように増幅させた。１００ mMNaCl、８ mM MgSO4
及び０．０１％ゼラチンを含有したpH７．５の５０ mM
トリスHCl １００μｌ中における１×１０6 プラーク形
成単位（pfu)のライブラリーファージを０．２％マルト
ース及び１０ mM MgSO4 含有のルリア ブロス（Luria
Broth)中１００μｌの１０ mM MgSO4 、１０ mM CaCl2
及び７５μｌのログフェース（log phase)ＬＥ３９２大
腸菌と混ぜた。ファージを３７℃で３０分間かけて細胞
に前吸着させ、ＬＢ６mlを加え、インキュベートを３７
℃、２２５rpm で１６時間続けた。この操作を２６回繰
返して、２．６×１０7 pfu に増幅させた。増幅により
全部で１×１０12pfu 以上得た。インキュベート後に溶
離物をプールし、細胞砕片を遠心分離（８０００xgで１
０分間）で除去した。次いでライブラリーファージＤＮ
Ａを吸着剤の製造業者（プロメガ、マジソン、ウィスコ
ンシン州）により示されたプロトコールでラムダゾルブ
・ファージ・アドゾーベントを用いて単離した。５０μ
ｇ以上の高分子量鋳型ＤＮＡを得た。
け ゲノムライブラリーＤＮＡの精製 ヒトglut４遺伝子の５′プロモーター領域のポリメラー
ゼ鎖反応増幅のための鋳型ＤＮＡを得るためには、ベク
ターＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７におけるヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーからのファージストック約２．６×１０7
pfu が必要であろうと決定された。これは関心のあるク
ローンを９９％の確率で得るため標準ハイブリッド形成
技術でスクリーニングされるのに必要な独立したプラー
クの計算数よりも約２０倍多い。glut４ ５′フランキ
ング領域が２１kbベクターアームに隣接した鋳型から約
１kbのフラグメントが増幅されると想定された（図
１）。平均インサートサイズは約１５kbであるため、１
／１５又は約７％のみの５′領域含有ファージＤＮＡが
１kbのＴ７プロモーター内でＪＢ２４に相補的な配列を
有し、したがって適正な鋳型として機能すると更に想定
された。したがって望ましい配列を増幅させる高い確率
を維持するために、“スクリーニングされる”プラーク
の数を増加させた。ベクターＥＭＢＬ−３ＳＰ６／Ｔ７
におけるヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーはクロンテ
ック（パロアルト、カリフォルニア州）からファージス
トックとして得た。ライブラリーファージストックは下
記のように増幅させた。１００ mMNaCl、８ mM MgSO4
及び０．０１％ゼラチンを含有したpH７．５の５０ mM
トリスHCl １００μｌ中における１×１０6 プラーク形
成単位（pfu)のライブラリーファージを０．２％マルト
ース及び１０ mM MgSO4 含有のルリア ブロス（Luria
Broth)中１００μｌの１０ mM MgSO4 、１０ mM CaCl2
及び７５μｌのログフェース（log phase)ＬＥ３９２大
腸菌と混ぜた。ファージを３７℃で３０分間かけて細胞
に前吸着させ、ＬＢ６mlを加え、インキュベートを３７
℃、２２５rpm で１６時間続けた。この操作を２６回繰
返して、２．６×１０7 pfu に増幅させた。増幅により
全部で１×１０12pfu 以上得た。インキュベート後に溶
離物をプールし、細胞砕片を遠心分離（８０００xgで１
０分間）で除去した。次いでライブラリーファージＤＮ
Ａを吸着剤の製造業者（プロメガ、マジソン、ウィスコ
ンシン州）により示されたプロトコールでラムダゾルブ
・ファージ・アドゾーベントを用いて単離した。５０μ
ｇ以上の高分子量鋳型ＤＮＡを得た。
【００２１】glut４プロモーター領域のポリメラーゼ鎖
反応増幅 ３種のオリゴヌクレオチドプライマーをアプライド・バ
イオシステムズ・モデル８７００自動ＤＮＡシンセサイ
ザーで合成し、製造業者により記載されたようにＳＥＰ
−ＰＡＫ Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ・アソシ
エーツ、ミルフォード、マサチューセッツ州）で精製し
た。下記３種の異なるプライマーを用いた： プライマー T7,22mer ： 5′TAATACGACTCACTATAGGGAG 3′ （配列番号：１） プライマー JB23, 21mer： 5′GATCCTGGAGTCTCTGACTCC 3 ′ （配列番号：２） プライマー JB24, 22mer： 5′GCGAAGATGAAAGAACCGATCC 3′ （配列番号：３） プライマーＴ７はＥＭＢＬ−３ ＳＰ６／Ｔ７ベクター
の２１キロ塩基アーム中に位置するＴ７プロモーター中
でみられるヌクレオチド配列を含んでいる。プライマー
ＪＢ２３及びＪＢ２４はヒトglut４ｃＤＮＡ正鎖のヌク
レオチド７７−９７及び９２−１１３に各々相補的な配
列を含んでいる（フクモトら，ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー，第２６４巻，第７７７６−
７７７９頁，１９８９年）。第一ラウンドの増幅はオリ
ゴヌクレオチドＴ７及びＪＢ２４と鋳型ＤＮＡ２５０ng
を利用して行った（下記参照）。この２５０ngで、望ま
しいフラグメントが検出可能なレベルまで増幅されうる
に充分な鋳型ＤＮＡを各ライブラリープラークから供給
しうると計算された。実際に、第一の増幅反応ではアガ
ロースゲル電気泳動で試験したところ検出可能なＤＮＡ
フラグメントを生じた。そのフラグメントは鎖長がわず
か約５０塩基対（bp) であった。第一ラウンドの増幅は
２００μM ｄＮＴＰ、１００pMの各プライマーＴ７及び
ＪＢ２４と鋳型として２５０ngの前記ヒトゲノムライブ
ラリーＤＮＡを含有した１×ＰＣＲ緩衝液（pH８．３の
１０mM トリスHCl 、約５０ mM KCl 、１．５ mM MgCl
2 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）１００μｌ中で行
った。反応混合物を鉱油１００μｌで重ねた。混合物を
９４℃で８分間にわたり前インキュベートし、しかる後
ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー・セタス）で
５５℃まで急速に冷却させた。Ｔaqポリメラーゼ（１．
０単位、パーキン・エルマー・セタス）を加え、反応を
３５サイクルにわたり行った。各サイクルは９４℃で２
分間にわたる熱変性工程、しかる後５５℃で２分間にわ
たるｃＤＮＡへのプライマーのアニーリング及び７２℃
で１分間にわたるＤＮＡ鎖伸長を含んでいた。終了後、
インキュベート混合物を次のプロセッシング前にクロロ
ホルムで１回抽出した。ヒトglut４ｃＤＮＡ ５′非翻
訳領域の配列を再試験したところ、Ｓau３Ａ制限部位は
ＪＢ２３の５′末端から約５０bpに存在していることが
わかった。我々は、このＳau３Ａ部位で開裂されたゲノ
ムＤＮＡがその部位がＴ７プロモーター領域に隣接する
ようにベクターに結合された鋳型から第一ラウンドの増
幅中に産生された主要フラグメントが得られる、と結論
した。ライブラリーはＳau３Ａで部分的に開裂されたゲ
ノムＤＮＡから構築されたため、glut４プロモーター領
域において更に上流の部位で切断されたＤＮＡを含む鋳
型も存在すると想定することは正しいようであった。我
々は、ポリメラーゼ鎖反応は短い方の鋳型フラグメント
を優先的に増幅させるが、但し大きな方のフラグメント
もアガロースゲルの臭化エチジウム染色で検出可能なレ
ベルよりたとえ低いレベルであっても増幅されうると結
論した。大きな方のセクションのプロモーター領域を更
に増幅させるため、第二ラウンドの増幅は第一と同様に
行われたが、但し第一ラウンド増幅の一部が鋳型として
利用され、オリゴヌクレオチドＴ７及びＪＢ２３はプラ
イマーとして機能した。後者の“はめこまれた”オリゴ
ヌクレオチドはＪＢ２４でみられるものから上流でかつ
それに隣接してみられるglut４ｃＤＮＡ配列に相補的で
ある。アガロースゲル電気泳動による反応混合物の分析
では約４５０bpのＤＮＡフラグメントの増幅を示した。
反応増幅 ３種のオリゴヌクレオチドプライマーをアプライド・バ
イオシステムズ・モデル８７００自動ＤＮＡシンセサイ
ザーで合成し、製造業者により記載されたようにＳＥＰ
−ＰＡＫ Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ・アソシ
エーツ、ミルフォード、マサチューセッツ州）で精製し
た。下記３種の異なるプライマーを用いた： プライマー T7,22mer ： 5′TAATACGACTCACTATAGGGAG 3′ （配列番号：１） プライマー JB23, 21mer： 5′GATCCTGGAGTCTCTGACTCC 3 ′ （配列番号：２） プライマー JB24, 22mer： 5′GCGAAGATGAAAGAACCGATCC 3′ （配列番号：３） プライマーＴ７はＥＭＢＬ−３ ＳＰ６／Ｔ７ベクター
の２１キロ塩基アーム中に位置するＴ７プロモーター中
でみられるヌクレオチド配列を含んでいる。プライマー
ＪＢ２３及びＪＢ２４はヒトglut４ｃＤＮＡ正鎖のヌク
レオチド７７−９７及び９２−１１３に各々相補的な配
列を含んでいる（フクモトら，ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー，第２６４巻，第７７７６−
７７７９頁，１９８９年）。第一ラウンドの増幅はオリ
ゴヌクレオチドＴ７及びＪＢ２４と鋳型ＤＮＡ２５０ng
を利用して行った（下記参照）。この２５０ngで、望ま
しいフラグメントが検出可能なレベルまで増幅されうる
に充分な鋳型ＤＮＡを各ライブラリープラークから供給
しうると計算された。実際に、第一の増幅反応ではアガ
ロースゲル電気泳動で試験したところ検出可能なＤＮＡ
フラグメントを生じた。そのフラグメントは鎖長がわず
か約５０塩基対（bp) であった。第一ラウンドの増幅は
２００μM ｄＮＴＰ、１００pMの各プライマーＴ７及び
ＪＢ２４と鋳型として２５０ngの前記ヒトゲノムライブ
ラリーＤＮＡを含有した１×ＰＣＲ緩衝液（pH８．３の
１０mM トリスHCl 、約５０ mM KCl 、１．５ mM MgCl
2 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）１００μｌ中で行
った。反応混合物を鉱油１００μｌで重ねた。混合物を
９４℃で８分間にわたり前インキュベートし、しかる後
ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー・セタス）で
５５℃まで急速に冷却させた。Ｔaqポリメラーゼ（１．
０単位、パーキン・エルマー・セタス）を加え、反応を
３５サイクルにわたり行った。各サイクルは９４℃で２
分間にわたる熱変性工程、しかる後５５℃で２分間にわ
たるｃＤＮＡへのプライマーのアニーリング及び７２℃
で１分間にわたるＤＮＡ鎖伸長を含んでいた。終了後、
インキュベート混合物を次のプロセッシング前にクロロ
ホルムで１回抽出した。ヒトglut４ｃＤＮＡ ５′非翻
訳領域の配列を再試験したところ、Ｓau３Ａ制限部位は
ＪＢ２３の５′末端から約５０bpに存在していることが
わかった。我々は、このＳau３Ａ部位で開裂されたゲノ
ムＤＮＡがその部位がＴ７プロモーター領域に隣接する
ようにベクターに結合された鋳型から第一ラウンドの増
幅中に産生された主要フラグメントが得られる、と結論
した。ライブラリーはＳau３Ａで部分的に開裂されたゲ
ノムＤＮＡから構築されたため、glut４プロモーター領
域において更に上流の部位で切断されたＤＮＡを含む鋳
型も存在すると想定することは正しいようであった。我
々は、ポリメラーゼ鎖反応は短い方の鋳型フラグメント
を優先的に増幅させるが、但し大きな方のフラグメント
もアガロースゲルの臭化エチジウム染色で検出可能なレ
ベルよりたとえ低いレベルであっても増幅されうると結
論した。大きな方のセクションのプロモーター領域を更
に増幅させるため、第二ラウンドの増幅は第一と同様に
行われたが、但し第一ラウンド増幅の一部が鋳型として
利用され、オリゴヌクレオチドＴ７及びＪＢ２３はプラ
イマーとして機能した。後者の“はめこまれた”オリゴ
ヌクレオチドはＪＢ２４でみられるものから上流でかつ
それに隣接してみられるglut４ｃＤＮＡ配列に相補的で
ある。アガロースゲル電気泳動による反応混合物の分析
では約４５０bpのＤＮＡフラグメントの増幅を示した。
【００２２】glut４プロモーター領域のサブクローニン
グ及び配列決定 第二ラウンドの増幅で得られたプロモーター領域をアガ
ロースゲル電気泳動で精製し、クレノウＤＮＡポリメラ
ーゼＩで平滑末端化し、ポリヌクレオチドキナーゼを利
用してリン酸化し、ベクターＳＰ７２（クロンテック）
のＳmaＩ部位に組込んでサブクローニングした。３つの
独立したクローンからのアルカリ変性二本鎖ＤＮＡは
〔α−３５Ｓ〕ｄＡＴＰ及びシークエナーゼ（Sequenas
e)〔ＵＳバイオケミカルズ（US Biochemicals)〕を利用
して配列決定した。増幅されたフラグメントは鎖長４５
８bpであり、ヒトglut４ｃＤＮＡの最初のメチオニンコ
ドンの上流におけるヌクレオチド５０−５０８である。
グ及び配列決定 第二ラウンドの増幅で得られたプロモーター領域をアガ
ロースゲル電気泳動で精製し、クレノウＤＮＡポリメラ
ーゼＩで平滑末端化し、ポリヌクレオチドキナーゼを利
用してリン酸化し、ベクターＳＰ７２（クロンテック）
のＳmaＩ部位に組込んでサブクローニングした。３つの
独立したクローンからのアルカリ変性二本鎖ＤＮＡは
〔α−３５Ｓ〕ｄＡＴＰ及びシークエナーゼ（Sequenas
e)〔ＵＳバイオケミカルズ（US Biochemicals)〕を利用
して配列決定した。増幅されたフラグメントは鎖長４５
８bpであり、ヒトglut４ｃＤＮＡの最初のメチオニンコ
ドンの上流におけるヌクレオチド５０−５０８である。
【００２３】ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析 高分子量ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（クロンテック）をＢam
ＨＩ、ＨindIII 、ＥcoＲＩ又はＸbaＩで切断し、０．
８％アガロースゲルでサイズ分別し、２０×ＳＳＣ中で
強化ニトロセルロースフィルター〔ストラタジーン（St
ratagene) 〕に移動させた。その膜を５×ＳＳＣ、５０
％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、５ｘデンハーツ（Denhar
dt's) 溶液及び１５０μｇ／ml熱変性サケ精子ＤＮＡ中
４２℃で４時間かけて前ハイブリッド形成させ、しかる
後ＰＣＲ誘導ヒトglut４プロモーター領域を含有した同
緩衝液中４２℃で一夜ハイブリッド形成させた。このプ
ローブはランダムプライミング〔プライムタイム（Prim
e time) 、インターナショナル・バイオテクノロジー社
（InternationalBiotechnology, Inc.)〕により製造業
者の方法を利用して約２×１０8cpm／μｇの比活性まで
32Ｐ−ｄＣＴＰ〔３０００Ci／mM、アマーシャム（Amer
sham) 〕で放射線標識した。ハイブリッド形成は２×１
０6cpm／mlハイブリッド形成緩衝液で行った。フィルタ
ーを最後に０．１×ＳＳＣ、０．１％中６０℃で洗浄
し、コダック（Kodak)ＸＡＲ−５フィルムに露出させ
た。
ＨＩ、ＨindIII 、ＥcoＲＩ又はＸbaＩで切断し、０．
８％アガロースゲルでサイズ分別し、２０×ＳＳＣ中で
強化ニトロセルロースフィルター〔ストラタジーン（St
ratagene) 〕に移動させた。その膜を５×ＳＳＣ、５０
％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、５ｘデンハーツ（Denhar
dt's) 溶液及び１５０μｇ／ml熱変性サケ精子ＤＮＡ中
４２℃で４時間かけて前ハイブリッド形成させ、しかる
後ＰＣＲ誘導ヒトglut４プロモーター領域を含有した同
緩衝液中４２℃で一夜ハイブリッド形成させた。このプ
ローブはランダムプライミング〔プライムタイム（Prim
e time) 、インターナショナル・バイオテクノロジー社
（InternationalBiotechnology, Inc.)〕により製造業
者の方法を利用して約２×１０8cpm／μｇの比活性まで
32Ｐ−ｄＣＴＰ〔３０００Ci／mM、アマーシャム（Amer
sham) 〕で放射線標識した。ハイブリッド形成は２×１
０6cpm／mlハイブリッド形成緩衝液で行った。フィルタ
ーを最後に０．１×ＳＳＣ、０．１％中６０℃で洗浄
し、コダック（Kodak)ＸＡＲ−５フィルムに露出させ
た。
【００２４】ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからのglut
４プロモーター領域のクローニング 前記で利用された部分的Ｓau３Ａヒトゲノムライブラリ
ーを５０，０００〜７０，０００プラーク／１５０mmプ
レートの密度でおき、前記のようにＰＣＲ誘導ヒトglut
４プロモーター領域クローンとのハイブリッド形成のた
めに強化ニトロセルロースフィルターに移動させた。１
つの陽性プラークを得た。２ラウンドのプラーク精製後
にファージからＤＮＡを単離したが、これは制限分析に
よると約１６kbのインサートを含むことがわかった。
５．２kb ＸhoＩインサートフラグメントをｐＢluescr
ipt IIＫＳ＋（ストラタジーン社）のＸhoＩ部位に組込
んでサブクローニングした。このフラグメントの制限分
析によれば、それはヒトglut４ｃＤＮＡ５′非翻訳領域
の上流に２kb以上の配列を含むことを示した。
４プロモーター領域のクローニング 前記で利用された部分的Ｓau３Ａヒトゲノムライブラリ
ーを５０，０００〜７０，０００プラーク／１５０mmプ
レートの密度でおき、前記のようにＰＣＲ誘導ヒトglut
４プロモーター領域クローンとのハイブリッド形成のた
めに強化ニトロセルロースフィルターに移動させた。１
つの陽性プラークを得た。２ラウンドのプラーク精製後
にファージからＤＮＡを単離したが、これは制限分析に
よると約１６kbのインサートを含むことがわかった。
５．２kb ＸhoＩインサートフラグメントをｐＢluescr
ipt IIＫＳ＋（ストラタジーン社）のＸhoＩ部位に組込
んでサブクローニングした。このフラグメントの制限分
析によれば、それはヒトglut４ｃＤＮＡ５′非翻訳領域
の上流に２kb以上の配列を含むことを示した。
【００２５】ヒトglut４ ５′フランキング領域の配列
分析 ヒトglut４ ５′フランキング領域のヌクレオチド配列
は図２Ａ及び２Ｂで示されている（配列番号：４）。そ
れはケストナーら，プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８６巻，
第３１５０−３１５４頁，１９９０年で調べられたよう
にネズミglut４ｍＲＮＡの転写開始部位でみられる１０
ヌクレオチドのうち９つと合致する配列ＣＡＣＣＡＧＡ
ＴＣＣを含んでいる。その結果、この部位、即ちその配
列中５番目のヌクレオチドが＋１位と決定された。ヌク
レオチド＋４７〜＋１８９の配列はフクモトら（１９８
９年）により報告されたヒトglut４ｃＤＮＡ５′非翻訳
領域と同一であるが、但し１つの例外はゲノム配列がＴ
を有するヌクレオチド＋４８であり、そのｃＤＮＡはＧ
を有すると報告されていた。そのクローンは所定の転写
開始部位よりも２１２５bp上流に伸びている。明らかな
“ＴＡＴＡ”ボックスは推定転写開始部位の近くでみら
れない。しかしながら、ＣＣＡＡＴボックスはネズミgl
ut４プロモーターにおけるヌクレオチド−９４〜−９０
の位置に似たヌクレオチド−８９〜−８５で存在してい
る。ＣＣＡＡＴボックスを含む５９塩基（−１２４〜−
６６）のスパンにわたり、ヒト配列は２箇所を除き全て
ネズミと同一である。３つの可能性のあるＭyoＤ結合部
位はヌクレオチド−１７８３〜−１７７８、−１１４５
〜−１１４０及び−３８６〜−３８１に存在する。この
配列、ＣＡＣＣＴＧは筋クレアチンキナーゼエンハンサ
ーにおける高親和性ＭyoＤ結合部位と同一である〔ラッ
サー（Lassar) ら，セル，第５８巻，第８２３−８３１
頁，１９８９年〕。更に一般的なＣＡＮＮＴＧ配列を有
する３つの他の推定部位も５′領域に存在している。こ
れらの部位はネズミプロモーターにおける部位と非常に
似た位置及び配列を有する（ケストナーら，プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ，第８６巻，第３１５０−３１５４頁，１９
９０年）。ヒトglut４ ５′フランキング領域は筋クレ
アチンキナーゼ及びネズミglut４遺伝子の双方でみられ
る場合と類似したＭyoＤ結合配列を有しているため、こ
れら領域のうち少なくとも一部はＭyoＤ又は他の筋原性
トランス活性化因子と結合させるために利用しうると仮
定できる。したがって、それらはヒトglut４遺伝子転写
の筋特異的活性化に利用することができた。２つの可能
なＣ／ＥＢＰ結合部位は−３９６〜−３８９及び−４５
８〜−４５１位でみられる。前者の配列は推定Ｃ／ＥＢ
Ｐ結合部位（ＴＴ／ＧＮＮＧＣ／ＴＡＡＧ／Ｔ）の７塩
基のうち６つと合致し〔ライデン及びビーモン，モレキ
ュラー・セル・バイオロジー，第９巻，第１１５５−１
１６４頁，１９８９年（Ryden and Beemon, Mol. Cell
Biol. ９：１１５５−１１６４（１９８９））〕、後者
はその相補体である。この転写因子及びglut４の発現は
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が脂肪細胞に分化された場合に
劇的に上昇することが示された〔バーケンマイアーら，
ジーンズ・デビ，第３巻，第１１４５−１１５６頁，１
９８９年（Birkenmeier et al., Genes Dev.３：１１４
５−１１５６（１９８９））〕。最近、Ｃ／ＥＢＰが３
Ｔ3 −Ｌ１線維芽細胞においてネズミglut４プロモータ
ーをトランス活性化することが同時トランスフェクショ
ン研究で証明された（ケストナーら，１９９０年）。フ
ットプリント研究ではＣ／ＥＢＰが適切な配列を有する
プロモーターにおいて特定部位と結合しているという結
論を支持した。Ｃ／ＥＢＰは少なくとも１つの前記可能
な部位との相互作用でヒトglut４プロモーターを特異的
に活性化し、それにより遺伝子の脂肪細胞特異的発現を
調節する。２つの可能なインシュリン応答要素はヌクレ
オチド−５４９〜−５４３及び−５３７〜−５３１に位
置する。前者はＨＧＡＰＤＨプロモーターＩＲＥ−Ａコ
ア領域と８塩基のうち７つが合致し〔ナスリン（Nasri
n) ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８７巻，第５２７３
−５２７７頁，１９９０年〕、後者はその逆の相補体と
８塩基のうち７つが合致する。このような部位はＨＧＡ
ＰＤＨプロモーター活性に関するインシュリンの促進効
果を一部媒介することが示された。このような部位は、
インシュリンがインシュリン耐性のある動物モデルでgl
ut４の発現を増加させることが示されたため、ヒトglut
４調節領域においても同様の役割を果たすであろう〔バ
ーガーら，ネーチャー，第３４０巻，第７０−７２頁，
１９８９年；ガービーら，サイエンス，第２４５巻，第
６０−６３頁，１９８９年；カーンら，ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インベスティゲーション，第８４巻，
第４０４−４１１頁，１９８９年；シビッツら，ネーチ
ャー，第３４０巻，第７２−７４頁，１９８９年；スト
ロートら，エンドクリノロジー，第１２６巻，第２７２
８−２７３２頁，１９９０年〕。４つの可能なＳＰ１結
合部位も５′フランキング領域においてヌクレオチド−
３０１〜−２９６、−２７８〜−２７３、−１６５〜−
１６０及び＋６２〜＋６７でみられた。最初の２つの部
位はＳＰ１コアヘキサヌクレオチド配列ＧＧＧＣＧＧと
合致し〔ミッチェル（Mitchell) 及びデービス（Davi
s), サイエンス，第２４５巻，第３７１−３７８頁，１
９８９年〕、後の２つはその相補体と合致する。
分析 ヒトglut４ ５′フランキング領域のヌクレオチド配列
は図２Ａ及び２Ｂで示されている（配列番号：４）。そ
れはケストナーら，プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８６巻，
第３１５０−３１５４頁，１９９０年で調べられたよう
にネズミglut４ｍＲＮＡの転写開始部位でみられる１０
ヌクレオチドのうち９つと合致する配列ＣＡＣＣＡＧＡ
ＴＣＣを含んでいる。その結果、この部位、即ちその配
列中５番目のヌクレオチドが＋１位と決定された。ヌク
レオチド＋４７〜＋１８９の配列はフクモトら（１９８
９年）により報告されたヒトglut４ｃＤＮＡ５′非翻訳
領域と同一であるが、但し１つの例外はゲノム配列がＴ
を有するヌクレオチド＋４８であり、そのｃＤＮＡはＧ
を有すると報告されていた。そのクローンは所定の転写
開始部位よりも２１２５bp上流に伸びている。明らかな
“ＴＡＴＡ”ボックスは推定転写開始部位の近くでみら
れない。しかしながら、ＣＣＡＡＴボックスはネズミgl
ut４プロモーターにおけるヌクレオチド−９４〜−９０
の位置に似たヌクレオチド−８９〜−８５で存在してい
る。ＣＣＡＡＴボックスを含む５９塩基（−１２４〜−
６６）のスパンにわたり、ヒト配列は２箇所を除き全て
ネズミと同一である。３つの可能性のあるＭyoＤ結合部
位はヌクレオチド−１７８３〜−１７７８、−１１４５
〜−１１４０及び−３８６〜−３８１に存在する。この
配列、ＣＡＣＣＴＧは筋クレアチンキナーゼエンハンサ
ーにおける高親和性ＭyoＤ結合部位と同一である〔ラッ
サー（Lassar) ら，セル，第５８巻，第８２３−８３１
頁，１９８９年〕。更に一般的なＣＡＮＮＴＧ配列を有
する３つの他の推定部位も５′領域に存在している。こ
れらの部位はネズミプロモーターにおける部位と非常に
似た位置及び配列を有する（ケストナーら，プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ，第８６巻，第３１５０−３１５４頁，１９
９０年）。ヒトglut４ ５′フランキング領域は筋クレ
アチンキナーゼ及びネズミglut４遺伝子の双方でみられ
る場合と類似したＭyoＤ結合配列を有しているため、こ
れら領域のうち少なくとも一部はＭyoＤ又は他の筋原性
トランス活性化因子と結合させるために利用しうると仮
定できる。したがって、それらはヒトglut４遺伝子転写
の筋特異的活性化に利用することができた。２つの可能
なＣ／ＥＢＰ結合部位は−３９６〜−３８９及び−４５
８〜−４５１位でみられる。前者の配列は推定Ｃ／ＥＢ
Ｐ結合部位（ＴＴ／ＧＮＮＧＣ／ＴＡＡＧ／Ｔ）の７塩
基のうち６つと合致し〔ライデン及びビーモン，モレキ
ュラー・セル・バイオロジー，第９巻，第１１５５−１
１６４頁，１９８９年（Ryden and Beemon, Mol. Cell
Biol. ９：１１５５−１１６４（１９８９））〕、後者
はその相補体である。この転写因子及びglut４の発現は
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞が脂肪細胞に分化された場合に
劇的に上昇することが示された〔バーケンマイアーら，
ジーンズ・デビ，第３巻，第１１４５−１１５６頁，１
９８９年（Birkenmeier et al., Genes Dev.３：１１４
５−１１５６（１９８９））〕。最近、Ｃ／ＥＢＰが３
Ｔ3 −Ｌ１線維芽細胞においてネズミglut４プロモータ
ーをトランス活性化することが同時トランスフェクショ
ン研究で証明された（ケストナーら，１９９０年）。フ
ットプリント研究ではＣ／ＥＢＰが適切な配列を有する
プロモーターにおいて特定部位と結合しているという結
論を支持した。Ｃ／ＥＢＰは少なくとも１つの前記可能
な部位との相互作用でヒトglut４プロモーターを特異的
に活性化し、それにより遺伝子の脂肪細胞特異的発現を
調節する。２つの可能なインシュリン応答要素はヌクレ
オチド−５４９〜−５４３及び−５３７〜−５３１に位
置する。前者はＨＧＡＰＤＨプロモーターＩＲＥ−Ａコ
ア領域と８塩基のうち７つが合致し〔ナスリン（Nasri
n) ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８７巻，第５２７３
−５２７７頁，１９９０年〕、後者はその逆の相補体と
８塩基のうち７つが合致する。このような部位はＨＧＡ
ＰＤＨプロモーター活性に関するインシュリンの促進効
果を一部媒介することが示された。このような部位は、
インシュリンがインシュリン耐性のある動物モデルでgl
ut４の発現を増加させることが示されたため、ヒトglut
４調節領域においても同様の役割を果たすであろう〔バ
ーガーら，ネーチャー，第３４０巻，第７０−７２頁，
１９８９年；ガービーら，サイエンス，第２４５巻，第
６０−６３頁，１９８９年；カーンら，ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インベスティゲーション，第８４巻，
第４０４−４１１頁，１９８９年；シビッツら，ネーチ
ャー，第３４０巻，第７２−７４頁，１９８９年；スト
ロートら，エンドクリノロジー，第１２６巻，第２７２
８−２７３２頁，１９９０年〕。４つの可能なＳＰ１結
合部位も５′フランキング領域においてヌクレオチド−
３０１〜−２９６、−２７８〜−２７３、−１６５〜−
１６０及び＋６２〜＋６７でみられた。最初の２つの部
位はＳＰ１コアヘキサヌクレオチド配列ＧＧＧＣＧＧと
合致し〔ミッチェル（Mitchell) 及びデービス（Davi
s), サイエンス，第２４５巻，第３７１−３７８頁，１
９８９年〕、後の２つはその相補体と合致する。
【００２６】実施例２ ＰＣＲ誘導ヒトglut４プロモーター含有発現ベクターの
構築及びそのベクターでのタンパク質発現 ４５８bpのＰＣＲ誘導glut４プロモーター領域を配列決
定した後、それをベクターのポリリンカー領域内におけ
る制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩでの開
裂によりＳＰ７２ベクターから除去した。glut４プロモ
ーター領域（Ｍ／ＡＧＴ）（図４）をアガロースゲル電
気泳動で精製し、クレノウＤＮＡポリメラーゼＩで平滑
末端化し、ベクターｐＳＶＯ／ＳＥＡＰの平滑末端化Ｂ
amＨＩ部位に組込んでサブクローニングした。ｐＳＶＯ
ＳＥＡＰベクターは下記のようにして構築した。ベクタ
ーｐＳＶＯＡＰ（ヨーンら，ジーン，第６６巻，第１１
−１７頁，１９８８年）をＳmaＩ及びＨind III で開裂
させ、そこに含まれるラットアルカリホスファターゼｃ
ＤＮＡを除去した。残りのベクターｐＳＶＯＤＮＡはア
ガロースゲル電気泳動により精製した。ベクターｐＢＣ
１２／ＲＳＶ／ＳＥＡＰ（バーガーら，ジーン，第６６
巻，第１−１０頁，１９８８年）をＸhoＩで開裂させ、
クレノウフラグメントで補充し、Ｈind III で開裂し
て、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）につい
てコードするｃＤＮＡを除去した。ＳＥＡＰｃＤＮＡは
アガロースゲル電気泳動で精製した。ＳＥＡＰｃＤＮＡ
をｐＳＶＯのＳmaＩ／Ｈind III 部位に結合させ、ｐＳ
ＶＯＳＥＡＰを得た。glut４プロモーター領域の向きが
隣接分泌性アルカリホスファターゼ遺伝子の発現を誘導
するようになっているクローンが選択された。このクロ
ーンはｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰと表示された。glut４プ
ロモーター領域が反対向きである第二のクローンはｐＭ
／ＡＧＴ（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰと表示された。
構築及びそのベクターでのタンパク質発現 ４５８bpのＰＣＲ誘導glut４プロモーター領域を配列決
定した後、それをベクターのポリリンカー領域内におけ
る制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩ及びＥcoＲＩでの開
裂によりＳＰ７２ベクターから除去した。glut４プロモ
ーター領域（Ｍ／ＡＧＴ）（図４）をアガロースゲル電
気泳動で精製し、クレノウＤＮＡポリメラーゼＩで平滑
末端化し、ベクターｐＳＶＯ／ＳＥＡＰの平滑末端化Ｂ
amＨＩ部位に組込んでサブクローニングした。ｐＳＶＯ
ＳＥＡＰベクターは下記のようにして構築した。ベクタ
ーｐＳＶＯＡＰ（ヨーンら，ジーン，第６６巻，第１１
−１７頁，１９８８年）をＳmaＩ及びＨind III で開裂
させ、そこに含まれるラットアルカリホスファターゼｃ
ＤＮＡを除去した。残りのベクターｐＳＶＯＤＮＡはア
ガロースゲル電気泳動により精製した。ベクターｐＢＣ
１２／ＲＳＶ／ＳＥＡＰ（バーガーら，ジーン，第６６
巻，第１−１０頁，１９８８年）をＸhoＩで開裂させ、
クレノウフラグメントで補充し、Ｈind III で開裂し
て、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）につい
てコードするｃＤＮＡを除去した。ＳＥＡＰｃＤＮＡは
アガロースゲル電気泳動で精製した。ＳＥＡＰｃＤＮＡ
をｐＳＶＯのＳmaＩ／Ｈind III 部位に結合させ、ｐＳ
ＶＯＳＥＡＰを得た。glut４プロモーター領域の向きが
隣接分泌性アルカリホスファターゼ遺伝子の発現を誘導
するようになっているクローンが選択された。このクロ
ーンはｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰと表示された。glut４プ
ロモーター領域が反対向きである第二のクローンはｐＭ
／ＡＧＴ（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰと表示された。
【００２７】キメラ構築体のトランスフェクション キメラ構築体をリン酸カルシウム共沈降により８０％集
密化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトラ
ンスフェクトした。CsCl精製ベクター５μｇを細胞の３
５mm皿で沈降させた。６時間後に細胞を１％グリセロー
ルでショック付加し、リン酸緩衝液で２回洗浄し、しか
る後１０％牛胎児血清含有の新鮮な培地を加えた。更に
７２時間後、培地を細胞から集め、細胞砕片を遠心除去
した。培地を６５℃で６０分間前インキュベートし、し
かる後前記のようにアルカリホスファターゼ活性につい
て調べた（バーガーら，ジーン，第６６巻，第１−１０
頁，１９８８年）。ｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰでトランス
フェクトされた細胞からの培地は等量のｐＭ／ＡＧＴ
（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰでトランスフェクトされた場合よ
りもほぼ１０倍多くホスファターゼ活性を含有してい
た。これはglut４プロモーター領域が正しく向いている
場合にＣＨＯ細胞で分泌性アルカリホスファターゼ遺伝
子の発現を活発に誘導していることを示す。 〔配列表〕
密化チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトラ
ンスフェクトした。CsCl精製ベクター５μｇを細胞の３
５mm皿で沈降させた。６時間後に細胞を１％グリセロー
ルでショック付加し、リン酸緩衝液で２回洗浄し、しか
る後１０％牛胎児血清含有の新鮮な培地を加えた。更に
７２時間後、培地を細胞から集め、細胞砕片を遠心除去
した。培地を６５℃で６０分間前インキュベートし、し
かる後前記のようにアルカリホスファターゼ活性につい
て調べた（バーガーら，ジーン，第６６巻，第１−１０
頁，１９８８年）。ｐＭ／ＡＧＴ／ＳＥＡＰでトランス
フェクトされた細胞からの培地は等量のｐＭ／ＡＧＴ
（ＲＥＶ）／ＳＥＡＰでトランスフェクトされた場合よ
りもほぼ１０倍多くホスファターゼ活性を含有してい
た。これはglut４プロモーター領域が正しく向いている
場合にＣＨＯ細胞で分泌性アルカリホスファターゼ遺伝
子の発現を活発に誘導していることを示す。 〔配列表〕
【００２８】配列番号：１ 配列の長さ：２２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列（yes) アンチセンス（no) 起源 生物名：ヒト 直接の起源 ライブラリー： genomic クローン：ＥＭＢＬ ３ ＳＰ６Ｔ７ 配列： TAATACGACT CACTATAGGG AG 22
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列（yes) アンチセンス（no) 起源 生物名：ヒト 直接の起源 ライブラリー：ｃＤＮＡ クローン：1hＪＨＴ−３ 配列： GATCCTGGAG TCTCTGACTC C 21 刊行物情報：フクモトら，J. Bio. Chem.,第２６４巻，
１４，第７７７６〜７７７９頁，（１９８９年）
１４，第７７７６〜７７７９頁，（１９８９年）
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：２２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列（yes) アンチセンス（no) 起源 生物名：ヒト 直接の起源 ライブラリー：ｃＤＮＡ クローン：1hＪＨＴ−３ 配列： GCGAAGATGA AAGAACCGAT CC 22 刊行物情報：フクモトら，J. Bio. Chem.,第２６４巻，
１４，第７７７６〜７７７９頁，（１９８９年）
１４，第７７７６〜７７７９頁，（１９８９年）
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：２３２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列（yes) アンチセンス（no) 起源 生物名：ヒト 直接の起源 ライブラリー： genomic クローン：ＥＭＢＬ ３ ＳＰ６Ｔ７ 配列：
【化５】
【化６】
【化７】
【図１】プロモーター領域がＴ７プロモーター含有の２
１kbベクターアームに隣接していなければならないこと
を示す増幅戦略
１kbベクターアームに隣接していなければならないこと
を示す増幅戦略
【図２】ヒトglut４プロモーターに関するヌクレオチド
配列
配列
【図３】ヒトglut４プロモーターに関するヌクレオチド
配列
配列
【図４】ヒトglut４プロモーター及びインジケーター遺
伝子を含むプラスミド
伝子を含むプラスミド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/67 15/85 // Ｃ１２Ｎ 15/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ
Claims (11)
- 【請求項１】 ヒトglut４プロモーターからなるＤＮＡ
の実質上精製されたセグメント。 - 【請求項２】 プロモーターが構造遺伝子と作動的に結
合された場合に上記構造遺伝子の転写を開始させる、請
求項１記載のヒトglut４プロモーターＤＮＡ。 - 【請求項３】 異種遺伝子の発現を促進しうる機能的に
作動可能なglut４プロモーター配列を含み、上記プロモ
ーター配列が異種遺伝子の転写開始部位から上流でかつ
それに隣接して位置し、上記プロモーター配列が通常そ
のプロモーター配列の転写コントロール下にある同種遺
伝子から離されている、ヒトＤＮＡの実質上精製された
セグメント。 - 【請求項４】 下記のヌクレオチド配列： 【化１】 【化２】 【化３】 を有し、上記配列が異種遺伝子の発現を促進することが
でき、上記プロモーター配列が異種遺伝子の転写開始部
位から上流でかつそれに隣接して位置し、上記プロモー
ター配列が通常そのプロモーター配列の転写コントロー
ル下にある同種遺伝子から離されている、ＤＮＡの実質
上精製されたセグメント（配列番号：４）。 - 【請求項５】 下記のヌクレオチド配列： 【化４】 を有し、上記配列が異種遺伝子の発現を促進することが
でき、上記プロモーター配列が異種遺伝子の転写開始部
位から上流でかつそれに隣接して位置し、上記プロモー
ター配列が通常そのプロモーター配列の転写コントロー
ル下にある同種遺伝子から離されている、ＤＮＡの実質
上精製されたセグメント（配列番号：４）。 - 【請求項６】 選択された異種構造遺伝子と共にヒトgl
ut４プロモーターを含み、上記構造遺伝子が上記ヒトgl
ut４プロモーターの転写コントロール下にあるように上
記構造遺伝子及びプロモーターが組合されている、ＤＮ
Ａの実質上精製されたセグメント。 - 【請求項７】 請求項３記載のＤＮＡ配列を含んだ組換
えＤＮＡベクター。 - 【請求項８】 請求項７記載の組換えＤＮＡベクターを
含んだ哺乳動物細胞。 - 【請求項９】 請求項４記載のＤＮＡ配列を含んだ組換
えＤＮＡベクター。 - 【請求項１０】 請求項９記載の組換えＤＮＡベクター
を含んだ哺乳動物細胞。 - 【請求項１１】 ａ．細胞をＤＮＡのセグメントで形質
転換させ（そのセグメントは選択された異種構造遺伝子
と共に請求項３記載のglut４プロモーターＤＮＡ配列を
含み、上記構造遺伝子及びプロモーターは上記構造遺伝
子が上記glut４プロモーターの転写コントロール下にあ
るように組合されている）；及び ｂ．異種遺伝子産物を産生する異種遺伝子の発現に適し
た条件下で形質転換された細胞を培養する；ことからな
る、選択された構造遺伝子の発現方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64480191A | 1991-01-23 | 1991-01-23 | |
| US644801 | 1991-01-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576368A true JPH0576368A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=24586387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4009594A Pending JPH0576368A (ja) | 1991-01-23 | 1992-01-23 | ヒトｇｌｕ４遺伝子プロモーター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0496453A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0576368A (ja) |
| CA (1) | CA2059581A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102021729A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-04-20 | 福建红旗股份有限公司 | 电脑收放针横机智能机械手装置 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5943073A (en) * | 1993-01-01 | 1999-08-24 | Canon Kabushiki Kaisha | Ink jet recording apparatus and method |
| DK1210411T3 (da) | 1999-08-25 | 2007-02-19 | Immunex Corp | Sammensætninger og fremgangsmåder til forbedret celledyrkning |
-
1992
- 1992-01-16 EP EP92200112A patent/EP0496453A1/en not_active Withdrawn
- 1992-01-17 CA CA 2059581 patent/CA2059581A1/en not_active Abandoned
- 1992-01-23 JP JP4009594A patent/JPH0576368A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102021729A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-04-20 | 福建红旗股份有限公司 | 电脑收放针横机智能机械手装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2059581A1 (en) | 1992-07-24 |
| EP0496453A1 (en) | 1992-07-29 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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