【発明の詳細な説明】
本発明は免疫抑制作用および抗ウイルス作用な
どの生理活性を示す新規オキセタノシン類に関す
るものである。
〔従来の技術〕
従来免疫抑制剤として、アルキル化剤、代謝拮
抗剤、抗生物質、ステロイド剤、葉酸拮抗剤、植
物アルカロイドなどが知られている。
またオキセタノシン自体はジヤーナル・オブ・
アンチバイオテイツクス（Journal of
Autibiotics）39巻、11号、1623−25（1986）およ
び特開昭61−293992号に開示されている。
〔本発明が解決しようとする問題点〕
従来の免疫抑制剤のうち、ステロイド剤は消炎
作用リンパ球溶解作用等により免疫抑制を示すと
いわれ、作用が多岐にわたるため、様々な副作用
を伴うことは周知である。その他の免疫抑制剤
は、いわゆる細胞毒性に属すことも周知である。
リンパ球等の免疫担当細胞にのみ選択的に作用
し、免疫抑制作用以外の副作用が可及的に軽微な
薬剤が望まれている。
〔問題を解決するための手段〕
そこで、本発明者らは種々の研究の結果、
一般式 ()
()〔式中、Ｒは
【式】または
【式】
で示される式を意味する〕
で示される新規オキセタノシン類およびその薬理
学的に許容される塩が免疫抑制作用および抗ウイ
ルス作用を有することを見い出し、本発明を完成
した。
本発明の一般式()の化合物を例示すると、次
の通りである。
化合物略号 １般式()のＲ（塩基の名称）
２−aminoOXT−Ａ【式】
（２，６−ジアミノプリン）
OXT−Ｇ【式】（グアニン）
本発明のオキセタノシン類はオキセタノシン
（Oxetanocin）を微生物学的、化学的、そして酵
素学的手法を用いてその塩基部を変換することに
より得ることができる。
また一般式()
（式中、Ｙは【式】
【式】
【式】
【式】を示し、R1は水素原子ま
たはアシル基または低級アルキル基を示す。）
で示される新規オキセタノシン類は化合物２−
amino OXT−ＡおよびOXT−Ｇの原料または
合成中間体として有用なものである。
これら一般式()の化合物を例示すると次の通
りである。
【表】
【表】
【表】
本発明の一般式()及び()の化合物は酸と塩
を形成する。塩を形成するための酸としては、一
般式の()の化合物の場合、例えば薬理学上許容
される酸であればよく、例えば、塩酸、硫酸、リ
ン酸などが好ましい。一般式()の化合物は薬理
学上許容させる酸との塩の他、事情に応じて各種
の酸との塩の形で使用することも可能である。
次に化合物OXT−Ｘ，２−amino OXT−Ａ
およびOXT−Ｇの製造法について簡単に説明す
る。
化合物OXT−Ｘの製造方法：
上記式でアデニン塩基を有するオキセタノシン
（Oxetanocin）(1)にOXT−Ａを酸化してOXT−
Ｘにする能力を有する酵素、例えば微生物培養物
およびそそ処理物または動物組織からの採取物
（例えばラツト肝臓のホモジネートもしくはそれ
らから精製単離された酵素を作させると、上記式
で化合物(2)を経由して、キサンチン塩基を有する
新規化合物OXT−Ｘを得ることができる。
酵素は精製した酵素である必要はなく、微生物
起源の酵素を使する場合には、上記酵素を生産す
る能力を有する微生物を栄養培地で培養して得ら
れる微生物培養物（菌体）をそのまま使用するこ
とができる。その他、微生物のアセトン乾燥菌
体、菌体の磨砕物、超音波処理物、界面活性剤、
トルエンあるいはリゾチーム等での処理物から採
取した粗酵素標品および天然あるいは合成ポリマ
ーに固定した菌体を同様に使用することができ
る。また化合物(2)を精製単離する必要はなく、化
合物(1)から化合物OXT−Ｘまで連続して反応さ
せることができる。
具体的には、例えば下記に示す微生物が使用さ
れる。
【表】
【表】
本発明において化合物OXT−Ｘの製造をより
具体的に説明すると、表１に示した微生物を栄養
培地にて40時間培養した後、培養物をそのまま使
用してもよいが、好ましくは遠心分離により生菌
体を集めＭ／20リン酸緩衝液（PH7.5）にて懸濁
液を調整し、化合物(1)と混ぜ20℃〜50℃、10〜70
時間反応させることにより反応液中に目的とする
化合物OXT−Ｘが生成される。反応液より生成
物を採取するのは公知の方法に従つて行えばよく
遠心分離等により菌体を除去し、水や有機溶媒に
対する溶解度の差を利用する方法や、活性炭や吸
着樹脂およびイオン交換樹脂による吸脱着法など
適当に組み合せて用いることができる。
例えば、化合物(1)を、表１に記載の洗浄菌体の
作用により、化合物OXT−Ｘとした後、遠心分
離操作により不活性物質あるいは使用済み菌体を
除去する。
得られた液を、活性炭に通塔し、生成物を吸
着させ、水洗後、含水メタノールにて溶出し、濃
縮・乾固して得られた粗生成物をカチオン交換樹
脂に吸着させ、水にて溶出し、濃縮乾固すること
により無色粉末の化合物OXT−Ｘを得る。化合
物２−amino OXT−Ａの製造方法（第１）
（式中、R1及びR2は保護基を示す。）
２，６−ジアミノプリン塩基を有する化合物２
−aminoOXT−Ａの製造は化合物OXT−Ｘの
3′−CH2OH及び4′−CH2CHの水酸基を何らかの
保護基で保護しておき、更に化合物(3)の塩基部の
２位及び６位のカルボニル基を保護しておき、さ
らにアンモノリシスの工程を経て行なわれる。式
(3)の水酸基の保護基（式中R1）としては核酸化
学あるいは糖化学の分野において使用される公知
の水酸基の保護基が用いられる。3′−CH2OH及
び4′−CH2OHの水酸基の保護基の例としては、
ホルミルまたは置換基を有してもよい低級アルキ
ルカルボニル（置換基としてはハロゲン原子、低
級アルコキシ、ベンゾイルなど）例えばアセチ
ル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリ
フロロアセチル、メトキシアセチル、ピバロイ
ル、αまたはβ−ベンゾイルプロピオニル、フエ
ノキシアセチル、トリチルオキシアセチルなど、
またはベンゾイルなどのアシル基、置換基を有し
てもよい低級アルキル基例えばｔ−ブチル基など
の非置換低級アルキル、トリチルまたはモノトキ
シトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシ
トリチルなどの低級アルコキシトリチルなどの置
換又は非置換トリリチル基などの置換低級アルキ
ルが挙げられる。
上記の保護基を導入するには、公知の方法によ
り行なうことができるが、後に保護基を脱離する
際に効率よく脱離できる様な保護基を選択するの
が好ましい。
式(4)でカルボニル基の保護基（式中R2）とし
ては、核酸化学の分野において使用される公知の
保護基が用いられる。２位及び６位のカルボニル
基の保護基の例としては、ｐ−トルエンスルホニ
ル、２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスル
ホニル基などが挙げられる。上記の保護基の導入
には公知の方法によつて行なうことができるが、
後に２位及び６位にアミノ基を導入する際に置換
されやすい保護基を選択するのが好ましい。
化合物２−amino OXT−Ａを製造するには化
合物(4)のアンモノリシスを行なえば良く、アンモ
ノリシスは公知の方法により行なうことができ
る。
化合物２−amino OXT−Ａ製造方法（第２）
化合物(1)をＮ−オキシド化してＮ−オキシド体
(5)を得るが、このＮ−オキシド化は適当な酸化剤
で酸化することにより行なわれる。上記酸化剤と
してはｍ−クロロ過安息香酸、過酢酸などの有機
過酸、過酸化水素などが挙げられ、上記の反応は
通常、適当な溶媒中で行なわれ、反応溶媒として
は含水してもよい酢酸、アセトンジオキサンなど
の有機溶媒が挙げられる。反応は通常室温で進行
し、反応液からＮ−オキシド体(5)を得るには、反
応溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラ
フイーにより精製することができる。
次、Ｎ−オキシド体(5)を亜硝酸ナトリウムで処
理して化合物(6)を得る。
上記の反応は通常水中にて、室温で進行する。
反応後から化合物(6)を得るには、反応液を濃縮
後、カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグ
ラフイーにより精製することができる。式(8)の水
酸基のの保護基（式中R1）としては、アセチル、
クロロアセチル、ピバロイル、ベンゾイルなどの
アシル基、トリチル、モノメトキシトリチルなど
トリチル基類が挙げられる。上記の保護基を導入
するには、公知の方法により行なうことができる
が、後に保護基を脱離する際に効率よく脱離でき
るような保護基を選択するのが好ましい。上記の
反応は通常室温にて進行し、反応液から化合物(7)
を得るには溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロ
マトグラフイーにより精製することができる。
次に、化合物(7)を含水メタノールに溶解し20〜
70℃で数日間攪拌すると化合物(8)が無色粉末とし
て析出する。これを取し、化合物(8)を得ること
ができる。
このようにして得られた化合物(8)は、適当な有
機塩基存在下、新たに蒸発されたオキシ基化りん
によりクロル化される。上記、有機塩基として
は、トリエチルアミン、ピリジン、２−ピコリン
などが挙げられる。
反応は通常、加熱下にて進行する。反応液から
化合物(9)を得るには、反応液を減圧濃縮し、残渣
を適当な有機溶媒に溶かし、飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液と分配する。有機溶媒としてはクロロ
ホルム、酢酸エチルなどが挙げられる。有機層を
飽和食塩水にて洗つた後、有機層を濃縮し、シリ
カゲルカラムクロマトグラフイーにより精製する
ことができる。
次に、化合物(9)をアミノ化し、化合物２−
amino OXT−Ａを得るには、化合物(9)を適当な
無水有機溶媒に溶解し、液体アンモニアを加える
とにより行なわれる。
上記有機溶媒としては、メタノール、エタノー
ル、アセトニトリルなどが挙げられ、上記の反応
温度は通常、加熱下にて進行する。反応液から化
合物２−amino OXT−Ａを得るには、溶媒を留
去し吸着樹脂を用いたカラムクロマトグラフイー
により精製することができる。
化合物OXT−Ｇ製造方法
化合物２−amino OXT−Ａ→化合物OXT−Ｇ
化合物OXT−Ｇを製造するには化合物２−
amino OXT−Ａにアデノシンデアミナーゼある
いは同様な能力を有する微生物培養物および処理
物または動物組織からの採取物を作用させ化合物
OXT−Ｇを得ることができる。アデノシンデア
ミナーゼは市販品でよく、具体的には、シグマ社
（Sigma）EC3，５，４，４がある。
また同様の能力を有することが知られている動
物組織よりの採取物あるいは微生物培養物および
それより採取したアデノシンデアミナーゼ等その
起源を問わず使用することができる。
酵素は精製した酵素である必要はなく、微生物
起源の酵素を使用する場合にはアデノシンデアミ
ナーゼを生産する能力を有する微生物を栄養培地
で培養して得られる微生物培養物（菌体）をその
まま使用することができる。
具体的には例えば表２に示す微生物が使用され
る。
【表】
本発明において化合物OXT−Ｇを製造するに
は化合物２−amino OXT−Ａとアデノシンデア
ミネースを1/10Ｍ燐酸緩衝溶液（PH7.5）中25℃
で数時間反応させることにより反応液中に目的と
する化合物OXT−Ｇが生成される。また培養微
生物を用いる場合は、表１に示した微生物を栄養
培地にて24時間培養した後、培養物をそのまま使
用してもよいが好ましくは遠心分離により生菌体
を集め、Ｍ／20リン酸緩衝液（PH7.0）にて懸濁
液を調製し、化合物２−amino OXT−Ａと混
ぜ、20℃〜70℃、最高20時間反応させることによ
り、反応液中に目的とする化合物OXT−Ｇが生
成される。反応液より生成物を採取するには公知
の方法に従つて行えばよく、遠心分離等によつて
不活性物を除去し、水や有機溶媒に対する溶解度
の差を利用する方法や、活性炭や吸着樹脂および
イオン交換樹脂による吸脱着法など適当に組み合
せて用いることができる。
例えば、化合物２−amino OXT−Ａを上記酵
素あるいは表記載の洗浄菌体と反応させた後、
遠心分離操作により不活性物質あるいは使用済み
菌体を除去する。得られた液を多孔性樹脂に通
塔し生成物を吸着させ、水洗後、含水メタノール
にて溶出し、濃縮、乾固することにより無色粉末
の化合物OXT−Ｇが得られる。
尚必要に応じてセフアデツクス類の使用も可能
である。
一般式()の化合物を免疫抑制剤および抗ウイ
ルス剤などの医薬として用いる場合は、単独また
は賦形剤あるいは担体と混合して注射剤、経口
剤、または坐剤などとして投与される。賦形剤及
び担体としては薬剤学的に許容されるものが選ば
れ、その種類及び組成は投与経路や投与方法によ
つて決まる。
製剤中における本化合物の含量は製剤により
種々異なるが、通常0.1〜100盾量％好ましくは１
〜90重量％である。例えば、注射液の場合には、
通常0.1〜５重量％の本化合物を含むようにする
ことがよい。経口投与する場合には前記固体担体
もしくは液状担体とともに錠剤、カプセル剤、粉
剤、顆粒剤、液剤、ドライシロツプ剤等の形態で
用いられる。カプセル、錠剤、顆粒、粉剤の場合
は一般に本化合物の含量は約３〜100重量％好ま
しくは５〜90重量％であり、残部は担体である。
投与量は、患者の年令、体重、症状、治療目的
等により決定されるが、治療量は一般に非経口投
与で１〜300mg／Kg・日、経口投与で５〜500mg／
Kg・日である。
本化合物は低毒性であり、またいずれの化合物
も連続投与による毒性の蓄積性が小さいことが特
徴的である。
本発明の一般式()の化合物を用いて製剤とす
るときは、例えば一般式()の化合物の塩酸塩30
重量部に対し精製水を加え全量を2000部としてこ
れを溶解後ミリポアフイルターGSタイプを用い
て除菌過する。
この液２ｇを10mlのバイアル瓶にとり凍結乾
燥し、１バイアルに一般式()の化合物の塩酸塩
30mgを含む凍結乾燥注射剤を得た。
（作用）
化合物OXT−Ｘ、２−amino OXT−Ａおよ
びOXT−ＧはWaithe等による方法（Waithe
etal.，Handbook of EXperimental
Immunology 頁26.1，1978）に準じ、リンパ球
幼若化反応に対する作用を調べたところ化合物
OXT−Ｘ，２−amino OXT−ＡおよびOXT−
ＧはCon Ａ（コンカナバリンＡ）で刺激を受けた
Ｔリンパ球の幼若化し、LPS（リボポリサツカラ
イド）で刺激を受けたＢリンパ球の幼若化反応を
著しく抑制した。
本化合物OXT−Ｘ，２−amino OXT−Ａお
よびOXT−ＧがＢリンパ球及びＴリンパ球の機
能を抑制することを示す。この抑制作用は、それ
ぞれ体液性免疫及び細胞性免疫の抑制を意味する
ので、その異色亢進が原因と考えられる臓器移植
あるるいは皮膚移植における拒絶反応の抑制、各
種の自己免疫が主たる原因と考えられる自己免疫
病例えば多発性硬化症、溶血性貧血、Ｉ型糖尿
病、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、ペーチエツト
症候群リウマチの治療またはアレルギー疾患の治
療にも本化合物を有効成分とする免疫抑制剤は極
めて有用である。本化合物は従来の免疫抑制剤と
異なる作用機作が考えられるので細胞毒性物質に
属する抑制剤に共通に認められる造血器障害等、
またステロイドホルモンで認められる胃潰瘍、白
内障等の重篤な副作用はないと考えられ、副作用
の面でも大変すぐれている。
次に本化合物の薬理作用を試験例により具体的
に説明する。
試験例 １
Con ＡによるＴリンパ球幼若化反応の抑制
BALB／マウスの脾細胞をマイクロプレー
トに２×105個／0.2ml／ウエルになるように分注
し、対照群以外の各ウエルに各濃度の被験化合物
を添加し、さらにすべてのウエルにCon Ａを5μ
ｇ／mlになるよう加えたのち、この細胞浮遊液を
37℃で５％の炭酸ガス培養器で72時間培養した。
リンパ球幼若化反応は、培養終了の６時間前に
3H−チミジンを1μCl／ウエル添加し、培養細胞
への取込み量を液体シンチレーシヨンカウンター
で測定した。Con Ａのみを添加したときの取込
みカウントをAdpm.Con Ａ及び薬物を加えたと
きのカウントをBdpmとして（１−Bdpm／
Adpm）×100の数値を、幼若化に対する各薬物の
抑制率とした。その結果を表２に示す。
【表】
上表から明らかなように本化合物はＴリンパ球
幼若化反応を強く抑制した。
試験例 ２
LPS（リポポリサツカライド）によるＢリンパ
球幼若化反応の抑制
試験例２の方法に準じ（ただし、Con Ａの代
りに、大腸菌のLPSを100μｇ／mlになるよう加
えた）、幼若化Ｂ細胞に取りこまれた3H−チミジ
ン／量を測定した。被験化合物による抑制率を同
様に求めた。
表３に示すように、本化合物はLPSによるＢリ
ンパ球幼若化を著しく抑制した。
【表】
また本発明化合物はウイルスに対し活性を示
し、抗ウイルス剤として有用なもので、その各種
のウイルスに対し、抗ウイルス活性が期待され
る。
DNAウイルス
ポツクスウイルス、ヘルペスウイルス、アデ
ノウイルス、パポバウイルス、ヘパドトウイル
ス、パルボウイルス
RNAウイルス
ラブドウイルス、フイロウイルス、パラミク
ソウイルス、オルソミクソウイルス、アレナウ
イルス、レトロウイルス、コロナウイルス、ブ
ニヤウイルス、トガウイルス、フラビウイル
ス、カリシウイルス、ピコルナウイルス、レオ
ウイルス
そして、各種のウイルス性疾患、例えばヘルペ
ス、エイズなどの治療剤として期待される。
次に抗ウイルス活性につき試験例により具体的
に示す。
試験例 ３
(a) 抗ヘルペスウイルス活性
96穴（Well）のマイクロプレートを使用し、
Vero細胞の一重層上に本発明化合物の一定量
を含む培地およびヘルペス−型（HSV−）
５〜10TCID50を加え、37℃、５％（ｖ／ｖ）
炭酸ガスフ卵器中にて96〜120時間培養したの
ち、顕微鏡下でVero細胞に対するHSV−の
CPE（cytopathic effect）の観察により抗ウイ
ルス活性を測定した。抗ウイルス活性はCPE
の50％阻害濃度（μｇ／well）で表５に示す。
表５ 抗ウイルス作用（HSV−）
CPEの50％阻害
化合物 濃度（μｇ／well）
OXT−Ｘ 107.5
OXT−Ｇ 9.7
２−amino OXT−Ａ 17.6
また本化合物はHSV−のチミジンキナー
ゼ感受性株ばかりでなく耐性株に対しても優れ
た抗ウイルス作用を示す。
(b) 抗HIV（Human Immunodeficiency Virus）
活性24穴トレーにMT−４細胞約10万個／ml
入れ、されに本発明化合物の一定量を含む溶液
100μを加え、37℃、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガ
スフ卵器中にて５時間培養した後、HIV103〜
104感染単位を加え、４日間培養後、培養液の
一部をスライドグラスに塗抹し、アセトン固定
をした後、間接螢光抗体法にてウイルス抗原の
発現をみた。
なお、螢光抗体法の一次抗体にはエイズ患者
の血清、二次抗体にはFITCをラベルした抗ヒ
トIgGを用いた。
尚、本発明化合物のMT−４細胞に対する細
胞変性は、ウイルスを加えずに行い、顕微鏡下
で観察した。
本発明化合物のHIVに対する活性
【表】
以上から明らかなように本発明化合物は各種
ウイルスに対して優れた抗ウイルス活性を示し
エイズ、ヘルペスなどのウイルス性疾患の治療
剤として期待さるものである。
次に本発明化合物の製造法を実施例により具体
的に示す。
実施例 １
〔化合物OXT−Ｘの製造法〕
酵母粉末エキス１％、デキストロース１％を含
むPH7.0の培地100mlを500ml容三角フラスコに分
注したのち、120℃、20分間オートクレープ滅菌
した。
このフラスコにノカルデイアインテルフオルマ
（M4−C5）（Nocardia interforma M4−C5）を
１白金耳接種し、280℃、48時間好気的に振盪培
養を行なつた。これとは別に同一組成培地100ml
を500ml容三角フラスコに分注したのち、120℃、
20分間滅菌したフラスコに上記培養液２mlを移植
し、280℃、40時間振盪培養した。
次に、この培養液11.7を6500回転／分にて12
分間遠心分離し、生菌体を集めＭ／20リン酸緩衝
液（PH7.5）500mlにて２回洗浄したのち、同緩衝
液5.4にて懸濁した。この懸濁液を100mlづつ
500ml容三角フラスコ60本に分注し、これに各々
化合物(1)２mg／mlのＭ／20リン酸緩衝溶液10mlを
加え37℃にて18時間振蘯したのち、上記条件にて
遠心分離にて除菌し、得られた上清液を活性炭末
（和光純薬K.K.クロマト用）300mlを充填したカ
ラムに通塔し、生成物を吸着させ、水洗後50％含
水メタノール2.1にて溶出し、濃縮乾固するこ
とにより化合物
OXT−Ｘの黄色粉末1.4ｇを得た。この粗粉末を
50mlの水に溶かし、Dowae×
50W×４（Ｈ型、
50〜100メツシユ）90mlを充填したカラムに付し、
吸着させ、水1.5にて溶出し濃縮、乾固するこ
とにより無色粉末状の化合物OXT−X1.02ｇ（収
率79.6％）を得た。
FD−MS；269（Ｍ＋Ｈ）+
UV；λPH8.0
max（log ε）250.5nm（4.01），276.5nm
（3.95）
NMR（400MHz，D2O）δppm；3.67〜3.94（5H，
ｍ，3′−Ｈ，3′−CH 2OH，4′−CH 2OH），
4.72（1H，ｍ，4′−Ｈ），6.28（1H，ｄ，
2′−Ｈ），7.84（1H，ｓ，８−Ｈ）
本実施例に準じて下記の微生物を用いても同様
にOXT−Ｘを得ることができる。
【表】
【表】
実施例 ２
〔化合物(3)（R1＝−COCH3）の製造〕
アセトニトリル50mlに化合物OXT−X1.02ｇを
懸濁させ、トリエチルアミン1.06ml、４−ジメチ
ルアミノピリジン11.6mg、無水酢酸0.72mlの順に
加え、室温で４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮
後、クロロホルム−メタノール（９：１）５mlに
溶かし、シリカゲル（メルク社製、Art7734）40
ｇのカラムに付し、クロロホルム−メタノール
（９：１）500ml、クロロホルム−メタノール
（85：15）800mlの順で溶出した。シリカゲル
TLC（メルク社製、Art.5715）
〔展開溶媒；クロロホルム−メタノール（３：
１）〕でRf0.2付近のフラクシヨンを集め減圧濃
縮、乾固して化合物(3)1.21ｇを得た。（収率90％）
FD−MS：352（M+）
NMR（60MHz，CD3OD）δppm；2.08（3H，
ｓ，【式】，2.17（3H，ｓ，
【式】），3.82（1H，ｍ，3′−Ｈ），4.39（4H，ｍ，【式】
【式】），4.65〜4.71（1H，
ｍ，4′−Ｈ），6.34（1H，ｄ，2′−Ｈ），8.10
（1H，ｓ，８−Ｈ）
実施例 ３
〔化合物(4)（R1＝−COCH3，
【式】の製造〕
化合物(3)1.34ｇを塩化メチレン45mlに溶解し、
トリエチルアミン4.24ml、４−ジメチルアミノピ
リジン23.2mg、２，４，６−トリイソプロピルベ
ンゼンスルホニルクロリド4.61ｇの順に加え、室
温で３時間攪拌した。
反応液を減圧濃縮、乾固後クロロホルム15mlに
溶解し、シリカゲル120ｇのカラムに付しクロロ
ホルムで溶出した。シリカゲルTLC（メルク社
製、Art.5715）
〔展開溶媒；エーテル〕でRf0.41付近のフラクシ
ヨンを集め減圧濃縮、乾固し、化合物(4)の粉末
2.65ｇを得た。（収率78.7％）
FAB−MS；885（Ｍ＋Ｈ）+
NMR（60MHz，CDCl3）δppm；1.14〜1.32
（36H，ｍ，−CH＜ＣＨ 3
ＣＨ 3×６），2.92（2H，
ｍ，−ＣＨ＜CH3
CH3×２），3.72〜4.46（9H，
ｍ），4.64〜4.86（1H，ｍ，4′−Ｈ），6.33
（1H，ｄ，2′−Ｈ），7.18（4H，ｍ），8.41
（1H，ｓ，８−Ｈ）
実施例 ４
〔化合物２−amino OXT−Ａの製造（第１）〕
実施例３で得た化合物(4)2.65ｇを無水エタノー
ル16mlに溶解し、これに液体アンモニア約50mlを
加え、封管中にて105℃で57時間攪拌した。
アンモニアを除去後、水100mlを加え不溶物を
除去した後、MCI
GEL CHP20P 300mlに吸
着させ、水洗後、水−50％含水メタノール各1200
mlよりなる直線濃度勾配法にて溶出した。シリカ
ゲルTLC（メルク社製、Art.5715）
〔展開溶媒；クロロホルム−メタノール（２：
１）〕でRf0.44付近のフラクシヨンを集め、減圧
濃縮、乾固し、化合物２−amino OXT−Ａの粉
末445mgを得た。（収率55.8％）
FD−MS；266（M+）
UV；H2O
λmax（logε）256nm（3.96），278nm
（3.95）
NMR（400MHz，D2O）δppm；3.68〜3.91（5H，
ｍ），4.68（1H，ｍ），6.25（1H，ｄ），8.13
（1H，ｓ）
実施例 ５
〔化合物２−amino OXT−Ａの製造（第２）〕
(イ)〔化合物(5)の製造〕
化合物(1)の808mg及びｍ−クロロ過安息香酸748
mgを水18ml−ジオキサン60mlの混液に溶解し、暗
室中室温で18時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、
乾固し、残渣をシリカゲル６ｇにまぶし、これを
同シリカゲル45ｇのカラムに付し、クロロホルム
−メタノール（10：１）200ml、クロロホルム−
メタノール（５：１）200ml、クロロホルム−メ
タノール（３：１）500mlの順で溶出した。シリ
カゲルTLC〔展開溶媒；クロロホルム−メタノー
ル（２：１）〕でRf＝0.18付近のフラクシヨンを
集め減圧濃濃縮、乾固し、化合物(5)721mgを得た。
（収率83.9％）
FAB−MS；268（Ｍ＋Ｈ）+
UV；H2O
λmax233，262，295nm
NMR（60MHz，D2O）δppm；3.99〜4.30（5H，
ｍ），4.70（1H，ｍ），6.71（1H，ｄ），8.73
（1H，ｓ），8.87（1H，ｓ）
(ロ) 〔化合物(6)の製造〕
化合物(5)110mgを水1.6ml−酢酸0.6mlの混液に
溶解し、これに亜硝酸ナトリウム276mgを加え、
室温にて３日間攪拌した。
反応液を減圧濃縮後、濃縮液をDowex
50W
×８（Ｈ型）４mlのカラムに付し、水にて溶出し
た。シリカゲルTLC〔展開溶媒；ｎ−ブタノール
−酢酸−水（３：１：２）〕でRf0.08付近のフラ
クシヨンを集め減圧濃縮、乾固して化合物(6)58.6
mgを得た。（収率53.3％）
FAB−MS；269（Ｍ＋Ｈ）+
UV；0.1NNaOH
λmax256，294nm
NMR（60MHz，D2O）δppm；3.70〜4.30（5H，
ｍ），4.61（1H，ｍ），6.60（1H，ｄ），8.60
（1H，ｓ），8.67（1H，ｓ）
(ハ) 〔化合物(8)（R′1＝−COCH3）の製造〕
化合物(6)206mgをアセトニトリル10mlに懸濁し、
トリエチルアミン0.315ml、４−ジメチルアミノ
ピリジン10mg、無水酢酸0.25mlの順に加え室温に
て18時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、乾固、残
渣をクロロホルムに溶解し、シリカゲル30ｇのカ
ラムに付し、クロロホルム−メタノール（30：
１）200ml、クロロホルム−メタノール（５：１）
300mlの順で溶出した。シリカゲルTLC〔展開溶
媒；クロロホルム−メタノール（10：１）〕で
Rf0.55付近のフラクシヨンを集め減圧濃縮、乾固
し化合物(7)を得た。化合物(7)をメタノール−水
（５：１）20mlに溶解し43℃にて２日間攪拌する
と無色の粉末が析出する。これを取し化合物(8)
198mgを得た。（収率74％）
FAB−MS；353（Ｍ＋Ｈ）+
UV；MeOH
λmax245，251，270nm
NMR（60MHz，CD3OD）δppm；2.10（3H，
ｓ），2.13（3H，ｓ），4.46付近（5H，ｍ），
6.43（1H，ｄ），8.33（1H，ｓ），8.43（1H，
ｓ）
〔化合物(9)（R1＝−COCH3）の製造〕
実施例７と同様にして得た化合物(8)53mgを１ml
のオキシ塩化りんと0.3mlのトリエチルアミンに
懸濁し、20分間加熱還流した。反応液を減圧濃
縮、乾固し、残渣をクロロホルム20mlと飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液20mlとで分配し、有機層を
飽和食塩水10mlで洗つた後無水硫酸ナトリウムで
脱水し、減圧乾固した。残渣をシリカゲル15ｇの
カラムに付し、クロロホルム−メタノール（30：
１）200mlで溶出した。シリカゲルTLC〔展開溶
媒；クロロホルム−メタノール（10：１）〕で
Rf0.56付近のフラクシヨンを集め減圧濃縮、乾固
し化合物(9)13.6mgを得た。（収率23.2％）
FD−MS；388（M+）
UV；MeOH
λmax252，273nm
NMR（60MHz，CD3OD）δppm；2.08（6H，
ｓ），4.47付近（5H，ｍ），6.57（1H，ｄ），
8.83（1H，ｓ）
(ホ) 〔化合物２−amino OXT−Ａの製造〕
実施例８と同様にして得た化合物(9)27mgをエタ
ノール12mlに懸濁させ、これに液体アンモニア15
mlを加え、封管中にて110℃で72時間攪拌した。
アンモニアを除去後、反応液を減圧濃縮、乾固
し、残渣を水に溶解し、MCI
GEL CHP20P
20mlに付し、水−50％含水メタノール（各80ml）
の直線濃度勾配にて溶出した。
シリカゲルTLC〔展開溶媒；クロロホルム−メ
タノール（２：１）〕にてRf0.44付近のフラクシ
ヨンを集め減圧濃縮、乾固し化合物２−amino
OXT−Ａの無色粉末13.1mgを得た。
（収率71.3％）
FD−MS；266（M+）
UV；H2O
λmax（logε）256nm（3.96），278nm
（3.95）
NMR（400MHz，D2O）δppm；3.68〜3.91（5H，
ｍ），4.68（1H，ｍ），6.25（1H，ｄ），8.13
（1H，ｓ）
実施例６ 〔化合物OXT−Ｇの製造〕
化合物２−amino OXT−A240mgをＭ／10リ
ン酸緩衝液（PH7.5）150mlに溶解させ、アデノシ
ン デアミナーゼ（シグマ社製、EC3.5.4.4）
100μ（100ユニツト）を加え、22℃にて41時間
攪拌した。
この反応液をMCI
GEL CHP20P 100mlに吸
着させた後、水で溶出した。
シリカゲルTLC〔展開溶媒；ｎ−ブタノール−
酢酸−水（４：１：２）〕でRf0.42付近のフラク
シヨンを集め減圧濃縮、乾固し無色粉末の化合物
OXT−Ｇを240mg得た。（収率99.6％）
FD−MS；268（Ｍ＋Ｈ）+
UV；PH6.0
λmax（logε）253.5nm（4.09）
NMR（400MHz，D2O）δppm；3.69〜3.87（5H，
ｍ），4.66〜4.69（1H，ｍ），6.29（1H，
ｄ），8.17（1H，ｓ）
実施例７ 〔化合物OXT−Ｇの製造〕
肉エキス0.3％、ペプトン1.0％、食塩0.7％を含
むPH＝7.0の培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注したのち、120℃、20分間オートクレープ滅
菌した。このフラスコにエシエリヒア・コリー
NIHJ（Escherichia coli NIHJ）を１白金耳接種
し、37℃、18時間、好気的に振蘯培養を行つた。
次にこの培養液1000mlを10000回転／分にて10分
間遠心分離し、生菌体を集め同液量のＭ／20リン
酸緩衝液（PH7.0）にて３回洗浄したのち、同緩
衝液100mlにて顕濁した。この懸濁液に化合物２
−amino OXT−A50mgを加え、37℃にて18時間
振蘯にて反応させたのち100℃にて５分間加熱し、
反応を停止し、前記条件にて遠心分離にて除菌
し、得られた上清液をMCI GEL
CHP−
20P50mlを充填したカラムに通塔し、生成物を吸
着させ、水洗後、20％含水メタノール150mlにて
溶出し、濃縮、乾固することにより無色、粉末状
を呈する化合物OXT−G45.1mg（収率90.0％）を
得た。
実施例 ８〔化合物OXT−DCPの製造〕
実施例６の(ニ)で得られた化合物(9)6.3mgを１ml
のメタノールに溶解し、これに1Nアンモニア水
溶液0.04mlを加え室温にて２時間攪拌した後、
1N塩酸0.04mlを加えた。反応液を減圧濃縮、乾
固し、残渣を水に溶解しMCI
GEL CHP20P
（10ml）に付し、水洗後、80％含水メタノールに
て溶出した。シリカゲルTLC〔展開溶媒；クロロ
ホルム−メタノール（10：１）〕にてRf0.35付近
のフラシヨンを集め減圧濃縮、乾固し、化合物(2)
の無色粉末44.mgを得た。（収率91％）
UV；MeOH
λmax252，273nm
FAB−MS；304（M+）
NMR（400MHz，CD3OD）δppm；3.72〜3.93
（5H，ｍ），4.69（1H，ｍ），6.33（1H，
ｄ）．8.89（1H，ｓ） DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to novel oxetanosines that exhibit physiological activities such as immunosuppressive and antiviral effects. [Prior Art] Conventionally known immunosuppressants include alkylating agents, antimetabolites, antibiotics, steroids, antifolates, and plant alkaloids. Also, oxetanosine itself is a journal of
Antibiotics (Journal of
Autibiotics) Vol. 39, No. 11, 1623-25 (1986) and Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-293992. [Problems to be solved by the present invention] Among conventional immunosuppressants, steroid drugs are said to exhibit immunosuppression through anti-inflammatory and lympholytic effects, etc., and because they have a wide range of actions, they are not accompanied by various side effects. It is well known. It is also well known that other immunosuppressants belong to the so-called cytotoxic category.
There is a desire for a drug that selectively acts only on immunocompetent cells such as lymphocytes and has as few side effects as possible other than immunosuppressive effects. [Means for solving the problem] Therefore, as a result of various studies, the present inventors found that the general formula () () [wherein R means [formula] or the formula represented by [formula]] The novel oxetanosines and their pharmacologically acceptable salts have immunosuppressive and antiviral effects. They discovered this and completed the present invention. Examples of the compounds of general formula () of the present invention are as follows. Compound abbreviation 1 R in general formula () (name of base) 2-aminoOXT-A [Formula] (2,6-diaminopurine) OXT-G [Formula] (guanine) The oxetanosine of the present invention is It can be obtained by converting its base portion using microbiological, chemical, and enzymatic techniques. Also, the general formula () (In the formula, Y represents [Formula] [Formula] [Formula] [Formula] and R 1 represents a hydrogen atom, an acyl group, or a lower alkyl group.) The novel oxetanosine represented by the formula 2-
It is useful as a raw material or synthetic intermediate for amino OXT-A and OXT-G. Examples of these compounds of general formula () are as follows. [Table] [Table] [Table] The compounds of general formulas () and () of the present invention form salts with acids. As the acid for forming the salt, in the case of the compound of the general formula (), any pharmacologically acceptable acid may be used, and for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. are preferable. The compound of general formula () can be used in the form of salts with pharmacologically acceptable acids as well as with various acids depending on the circumstances. Next, the compound OXT-X, 2-amino OXT-A
The manufacturing method of OXT-G will be briefly explained. Method for producing compound OXT-X: OXT-A is oxidized to Oxetanocin (1) having an adenine base in the above formula.
When an enzyme having the ability to convert OXT-X, a new compound having a xanthine base, can be obtained through A microbial culture (bacterial cells) obtained by culturing microorganisms in a nutrient medium can be used as is.In addition, acetone-dried microbial cells, ground microbial cells, ultrasonicated products, surfactants,
Crude enzyme preparations collected from products treated with toluene or lysozyme, and bacterial cells immobilized on natural or synthetic polymers can be similarly used. Moreover, there is no need to purify and isolate compound (2), and it is possible to react continuously from compound (1) to compound OXT-X. Specifically, for example, the microorganisms shown below are used. [Table] [Table] To explain in more detail the production of compound OXT-X in the present invention, the microorganisms shown in Table 1 may be cultured in a nutrient medium for 40 hours, and then the culture may be used as is. , preferably by centrifugation, prepare a suspension with M/20 phosphate buffer (PH7.5), mix with compound (1), and incubate at 20°C to 50°C for 10 to 70°C.
By reacting for a period of time, the target compound OXT-X is produced in the reaction solution. The product can be collected from the reaction solution using known methods such as centrifugation to remove bacterial cells and utilizing the difference in solubility in water or organic solvents, activated carbon, adsorption resin, or ion exchange. Adsorption/desorption methods using resins can be used in combination as appropriate. For example, compound (1) is converted into compound OXT-X by the action of washed bacterial cells as shown in Table 1, and then inert substances or used bacterial cells are removed by centrifugation. The obtained liquid was passed through activated carbon to adsorb the product, washed with water, eluted with water-containing methanol, concentrated and dried, and the obtained crude product was adsorbed onto a cation exchange resin, and then dissolved in water. Compound OXT-X is obtained as a colorless powder by elution and concentration to dryness. Method for producing compound 2-amino OXT-A (first) (In the formula, R 1 and R 2 represent a protecting group.) Compound 2 having a 2,6-diaminopurine base
-The production of aminoOXT-A is based on the compound OXT-X.
The hydroxyl groups of 3'-CH 2 OH and 4'-CH 2 CH are protected with some kind of protective group, and the carbonyl groups at the 2- and 6-positions of the base moiety of compound (3) are protected, and further ammonolysis is performed. It is carried out through the following steps. formula
As the hydroxyl-protecting group (R 1 in the formula) in (3), a known hydroxyl-protecting group used in the fields of nucleic acid chemistry or sugar chemistry can be used. Examples of hydroxyl protecting groups for 3′-CH 2 OH and 4′-CH 2 OH are:
Formyl or lower alkylcarbonyl which may have a substituent (substituents include halogen atom, lower alkoxy, benzoyl, etc.) such as acetyl, chloroacetyl, trichloroacetyl, trifluoroacetyl, methoxyacetyl, pivaloyl, α- or β-benzoyl Propionyl, phenoxyacetyl, trityloxyacetyl, etc.
or an acyl group such as benzoyl, a lower alkyl group which may have a substituent, for example, an unsubstituted lower alkyl group such as a t-butyl group, a substituted lower alkoxytrityl such as trityl or monotoxytrityl, dimethoxytrityl, trimethoxytrityl, etc. or substituted lower alkyl such as unsubstituted trilithyl group. The above-mentioned protecting group can be introduced by a known method, but it is preferable to select a protecting group that can be removed efficiently when the protecting group is removed later. As the protecting group for the carbonyl group (R 2 in the formula) in formula (4), a known protecting group used in the field of nucleic acid chemistry is used. Examples of protective groups for the carbonyl groups at the 2- and 6-positions include p-toluenesulfonyl and 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl groups. The above-mentioned protecting groups can be introduced by known methods, but
It is preferable to select a protecting group that is easily substituted when an amino group is later introduced into the 2- and 6-positions. Compound 2-amino OXT-A can be produced by ammonolysis of compound (4), and ammonolysis can be carried out by a known method. Compound 2-amino OXT-A manufacturing method (second) Compound (1) is N-oxidized to give N-oxide form
(5) is obtained, the N-oxidation being carried out by oxidation with a suitable oxidizing agent. Examples of the oxidizing agent include organic peracids such as m-chloroperbenzoic acid and peracetic acid, hydrogen peroxide, etc. The above reaction is usually carried out in a suitable solvent, and the reaction solvent may contain water. Good examples include organic solvents such as acetic acid and acetone dioxane. The reaction usually proceeds at room temperature, and to obtain the N-oxide compound (5) from the reaction solution, the reaction solvent can be distilled off and the product can be purified by silica gel column chromatography. Next, N-oxide compound (5) is treated with sodium nitrite to obtain compound (6). The above reaction usually proceeds in water at room temperature.
In order to obtain compound (6) after the reaction, the reaction solution can be concentrated and then purified by column chromatography using a cation exchange resin. As the protecting group for the hydroxyl group (R 1 in the formula) in formula (8), acetyl,
Examples include acyl groups such as chloroacetyl, pivaloyl, and benzoyl, and trityl groups such as trityl and monomethoxytrityl. The above-mentioned protecting group can be introduced by a known method, but it is preferable to select a protecting group that can be efficiently removed later when the protecting group is removed. The above reaction usually proceeds at room temperature, and compound (7) is extracted from the reaction solution.
can be obtained by distilling off the solvent and purifying by silica gel column chromatography. Next, compound (7) was dissolved in aqueous methanol and
After stirring at 70°C for several days, compound (8) precipitates as a colorless powder. Compound (8) can be obtained by taking this. Compound (8) thus obtained is chlorinated with freshly evaporated oxyphosphorus in the presence of a suitable organic base. Examples of the organic base mentioned above include triethylamine, pyridine, and 2-picoline. The reaction usually proceeds under heating. To obtain compound (9) from the reaction solution, the reaction solution is concentrated under reduced pressure, the residue is dissolved in a suitable organic solvent, and the solution is partitioned with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. Examples of organic solvents include chloroform and ethyl acetate. After washing the organic layer with saturated saline, the organic layer can be concentrated and purified by silica gel column chromatography. Next, compound (9) was aminated to form compound 2-
To obtain amino OXT-A, compound (9) is dissolved in a suitable anhydrous organic solvent and liquid ammonia is added. Examples of the organic solvent include methanol, ethanol, acetonitrile, and the like, and the reaction is usually carried out at the above-mentioned heating temperature. In order to obtain compound 2-amino OXT-A from the reaction solution, the solvent can be distilled off and the compound can be purified by column chromatography using an adsorption resin. Compound OXT-G manufacturing method Compound 2-amino OXT-A → Compound OXT-G To manufacture compound OXT-G, compound 2-
A compound obtained by reacting amino OXT-A with adenosine deaminase or a microbial culture and treated product having similar abilities or a sample from animal tissue.
OXT-G can be obtained. Adenosine deaminase may be a commercially available product, and specific examples include EC3, 5, 4, and 4 from Sigma. In addition, materials collected from animal tissues or microbial cultures known to have similar abilities, and adenosine deaminase collected therefrom can be used regardless of their origin. The enzyme does not need to be a purified enzyme; if an enzyme of microbial origin is used, a microbial culture (bacteria) obtained by culturing a microorganism capable of producing adenosine deaminase in a nutrient medium is used as is. be able to. Specifically, for example, the microorganisms shown in Table 2 are used. [Table] To produce compound OXT-G in the present invention, compound 2-amino OXT-A and adenosine deaminase are mixed at 25°C in a 1/10M phosphate buffer solution (PH7.5).
By reacting for several hours, the target compound OXT-G is produced in the reaction solution. When using cultured microorganisms, after culturing the microorganisms shown in Table 1 in a nutrient medium for 24 hours, the culture may be used as is, but it is preferable to collect live microorganisms by centrifugation and collect them using M/20 phosphor. By preparing a suspension in an acid buffer (PH7.0), mixing it with compound 2-amino OXT-A, and reacting at 20°C to 70°C for up to 20 hours, the desired compound OXT is added to the reaction solution. -G is generated. The product can be collected from the reaction solution by following known methods, such as removing inert substances by centrifugation, utilizing the difference in solubility in water or organic solvents, or using activated carbon or adsorption. Adsorption/desorption methods using resins and ion exchange resins can be used in appropriate combinations. For example, after reacting the compound 2-amino OXT-A with the above enzyme or the washed bacterial cells listed in the table,
Inert substances or spent bacterial cells are removed by centrifugation. The obtained liquid is passed through a porous resin to adsorb the product, washed with water, eluted with water-containing methanol, concentrated and dried to obtain colorless powder compound OXT-G. Furthermore, if necessary, it is also possible to use Cephadex. When the compound of general formula () is used as a medicine such as an immunosuppressant or an antiviral agent, it is administered alone or in combination with an excipient or carrier as an injection, oral preparation, or suppository. Pharmaceutically acceptable excipients and carriers are selected, and their types and compositions are determined by the route and method of administration. The content of this compound in the preparation varies depending on the preparation, but is usually 0.1 to 100%, preferably 1
~90% by weight. For example, in the case of injections,
It is usually preferable to contain the present compound in an amount of 0.1 to 5% by weight. When administered orally, it is used in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, dry syrups, etc. together with the solid carrier or liquid carrier. In the case of capsules, tablets, granules and powders, the content of the compound is generally from about 3 to 100% by weight, preferably from 5 to 90% by weight, with the balance being carrier. The dose is determined depending on the patient's age, weight, symptoms, therapeutic purpose, etc., but the therapeutic dose is generally 1 to 300 mg/Kg/day for parenteral administration and 5 to 500 mg/kg/day for oral administration.
Kg/day. The present compounds have low toxicity, and each compound is characterized by low toxicity accumulation upon continuous administration. When preparing a preparation using the compound of the general formula () of the present invention, for example, the hydrochloride of the compound of the general formula () 30
Add purified water to each part by weight to make a total volume of 2000 parts, dissolve it, and then sterilize it using a Millipore filter GS type. 2 g of this liquid was placed in a 10 ml vial, freeze-dried, and 1 vial was filled with the hydrochloride of the compound of general formula ().
A lyophilized injection containing 30 mg was obtained. (Action) Compounds OXT-X, 2-amino OXT-A and OXT-G were prepared by the method of Waithe et al.
etal.，Handbook of EXperimental
Immunology, p. 26.1, 1978), we investigated the effect of the compound on the lymphocyte blastogenesis response.
OXT-X, 2-amino OXT-A and OXT-
G significantly suppressed the imaginalization of T lymphocytes stimulated with Con A (concanavalin A) and the imaginalization of B lymphocytes stimulated with LPS (ribopolysaccharide). This shows that the present compounds OXT-X, 2-amino OXT-A and OXT-G suppress the functions of B lymphocytes and T lymphocytes. This suppressive effect means the suppression of humoral immunity and cell-mediated immunity, respectively, so the suppression of rejection reactions in organ transplants or skin transplants, which are thought to be caused by their heterogeneous enhancement, and various types of autoimmunity are thought to be the main cause. Immunosuppressants containing this compound as an active ingredient can also be used in the treatment of autoimmune diseases such as multiple sclerosis, hemolytic anemia, type I diabetes, myasthenia gravis, Hashimoto's thyroiditis, Pehchiet syndrome rheumatism, and allergic diseases. Extremely useful. Since this compound is thought to have a different mechanism of action than conventional immunosuppressants, it may cause hematopoietic organ disorders, which are commonly observed in cytotoxic inhibitors.
In addition, it is thought that there are no serious side effects such as gastric ulcers and cataracts that are observed with steroid hormones, and it is very good in terms of side effects. Next, the pharmacological action of the present compound will be specifically explained using test examples. Test Example 1 Suppression of T lymphocyte priming reaction by Con A Dispense BALB/mouse splenocytes into a microplate at 2 x 10 cells/0.2 ml/well, and place them in each well other than the control group. Add each concentration of test compound and add 5μ of Con A to all wells.
After adding the cell suspension to a concentration of g/ml,
The cells were cultured for 72 hours at 37°C in a 5% carbon dioxide incubator.
Lymphocyte transformation reaction occurs 6 hours before the end of culture.
1 μCl/well of 3 H-thymidine was added, and the amount taken up into the cultured cells was measured using a liquid scintillation counter. The uptake count when only Con A is added is Adpm. The count when Con A and drug are added is Bdpm (1-Bdpm/
Adpm) x 100 was defined as the inhibition rate of each drug against juvenile rejuvenation. The results are shown in Table 2. [Table] As is clear from the above table, this compound strongly suppressed the T lymphocyte rejuvenation reaction. Test Example 2 Inhibition of B lymphocyte blastogenesis by LPS (lipopolysaccharide) Follow the method of Test Example 2 (however, instead of Con A, Escherichia coli LPS was added to a concentration of 100 μg/ml). The amount of 3 H-thymidine incorporated into the blastogenic B cells was measured. The inhibition rate by the test compound was determined in the same manner. As shown in Table 3, this compound significantly suppressed LPS-induced B lymphocyte maturation. [Table] Furthermore, the compounds of the present invention exhibit activity against viruses and are useful as antiviral agents, and are expected to have antiviral activity against various viruses. DNA viruses Potsuvirus, herpesvirus, adenovirus, papovavirus, hepadotovirus, parvovirus RNA virus Rhabdovirus, filovirus, paramyxovirus, orthomyxovirus, arenavirus, retrovirus, coronavirus, bunyavirus, togavirus, flavivirus virus, calicivirus, picornavirus, reovirus, and is expected to be used as a therapeutic agent for various viral diseases such as herpes and AIDS. Next, the antiviral activity will be specifically illustrated using test examples. Test Example 3 (a) Anti-herpesvirus activity Using a 96-well microplate,
Medium containing a certain amount of the compound of the invention on a monolayer of Vero cells and herpes-type (HSV-)
Add 5-10TCID 50 , 37℃, 5% (v/v)
After culturing in a carbon dioxide gas incubator for 96 to 120 hours, HSV-infection of Vero cells was determined under a microscope.
Antiviral activity was measured by observing CPE (cytopathic effect). Antiviral activity is CPE
Table 5 shows the 50% inhibitory concentration (μg/well). Table 5 Antiviral effect (HSV-) 50% inhibition compound of CPE Concentration (μg/well) OXT-X 107.5 OXT-G 9.7 2-amino OXT-A 17.6 Furthermore, this compound is effective against not only thymidine kinase-sensitive strains of HSV- Shows excellent antiviral activity even against resistant strains. (b) Anti-HIV (Human Immunodeficiency Virus) activity Approximately 100,000 MT-4 cells/ml in a 24-well tray
A solution containing a certain amount of the compound of the present invention is placed in the container.
After adding 100μ and culturing for 5 hours at 37°C in an incubator under 5% (v/v) carbon dioxide gas, HIV10 3 ~
After adding 10 4 infectious units and culturing for 4 days, a portion of the culture solution was smeared onto a slide glass, fixed with acetone, and then the expression of viral antigen was observed using indirect fluorescent antibody method. For the fluorescent antibody method, serum from an AIDS patient was used as the primary antibody, and FITC-labeled anti-human IgG was used as the secondary antibody. The cytopathic effect of the compound of the present invention on MT-4 cells was carried out without adding any virus, and observed under a microscope. Activity of the compound of the present invention against HIV [Table] As is clear from the above, the compound of the present invention exhibits excellent antiviral activity against various viruses and is expected to be used as a therapeutic agent for viral diseases such as AIDS and herpes. Next, the method for producing the compound of the present invention will be specifically illustrated with reference to Examples. Example 1 [Production method of compound OXT-X] 100 ml of a pH 7.0 medium containing 1% yeast powder extract and 1% dextrose was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask, and then sterilized by autoclaving at 120° C. for 20 minutes. One platinum loop of Nocardia interforma M 4 -C 5 was inoculated into this flask , and cultured with shaking aerobically at 280°C for 48 hours . Separately, 100ml of the same composition medium
After dispensing it into a 500ml Erlenmeyer flask, heat it at 120℃.
2 ml of the above culture solution was transferred to a flask that had been sterilized for 20 minutes, and cultured with shaking at 280°C for 40 hours. Next, this culture solution 11.7 was heated at 6500 rpm for 12
After centrifugation for a minute, viable bacterial cells were collected, washed twice with 500 ml of M/20 phosphate buffer (PH7.5), and then suspended in 5.4 mL of the same buffer. 100ml of this suspension
Dispense into 60 500 ml Erlenmeyer flasks, add 10 ml of M/20 phosphate buffer solution containing 2 mg/ml of compound (1) to each flask, shake at 37°C for 18 hours, and centrifuge under the above conditions. The resulting supernatant liquid was passed through a column packed with 300 ml of activated carbon powder (for Wako Pure Chemical Industries KK Chromato) to adsorb the product, and after washing with water, it was eluted with 50% aqueous methanol 2.1. By concentrating and drying, 1.4 g of yellow powder of compound OXT-X was obtained. This coarse powder
Dissolve in 50ml of water, Dowae x 50W x 4 (H type,
50 to 100 mesh) to a column packed with 90 ml,
The mixture was adsorbed, eluted with 1.5 g of water, concentrated, and dried to obtain 1.02 g (yield: 79.6%) of a colorless powdery compound OXT-X. FD-MS; 269 (M+H) + UV; λPH8.0 max (log ε) 250.5nm (4.01), 276.5nm
(3.95) NMR (400MHz, D 2 O) δppm; 3.67-3.94 (5H,
m, 3′-H, 3′- CH 2 OH, 4′- CH 2 OH),
4.72 (1H, m, 4'- H ), 6.28 (1H, d,
2'- H ), 7.84 (1H, s, 8- H ) OXT-X can be similarly obtained using the following microorganisms according to this example. [Table] [Table] Example 2 [Production of compound (3) (R 1 = -COCH 3 )] 1.02 g of compound OXT-X was suspended in 50 ml of acetonitrile, 1.06 ml of triethylamine, and 11.6 mg of 4-dimethylaminopyridine. and 0.72 ml of acetic anhydride were added in this order, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. After concentrating the reaction solution under reduced pressure, it was dissolved in 5 ml of chloroform-methanol (9:1) and added to 40 mL of silica gel (Merck, Art7734).
g column and eluted with 500 ml of chloroform-methanol (9:1) and 800 ml of chloroform-methanol (85:15) in this order. silica gel
TLC (Merck, Art.5715) [Developing solvent: Chloroform-methanol (3:
1)], the fraction near Rf0.2 was collected, concentrated under reduced pressure, and dried to give 1.21 g of compound (3). (Yield 90%) FD-MS: 352 (M + ) NMR (60 MHz, CD 3 OD) δppm; 2.08 (3H,
s, [formula], 2.17 (3H, s, [formula]), 3.82 (1H, m, 3'- H), 4.39 (4H, m, [formula] [formula]), 4.65-4.71 (1H, m , 4′- H ), 6.34 (1H, d, 2′- H ), 8.10
(1H, s, 8- H ) Example 3 [Compound (4) (R 1 = -COCH 3 ,
Production of [Formula]] Dissolve 1.34 g of compound (3) in 45 ml of methylene chloride,
4.24 ml of triethylamine, 23.2 mg of 4-dimethylaminopyridine, and 4.61 g of 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride were added in this order, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure and dried to dryness, then dissolved in 15 ml of chloroform, applied to a column of 120 g of silica gel, and eluted with chloroform. Silica gel TLC (manufactured by Merck & Co., Art. 5715) [Developing solvent: ether] was used to collect fractions around Rf0.41, concentrated under reduced pressure, and dried to powder of compound (4).
2.65g was obtained. (Yield 78.7%) FAB-MS; 885 (M+H) + NMR (60MHz, CDCl3 ) δppm; 1.14-1.32
(36H, m, -CH<C H 3 C H 3 ×6), 2.92 (2H,
m, -C H < CH 3 CH 3 × 2), 3.72 to 4.46 (9H,
m), 4.64-4.86 (1H, m, 4′- H ), 6.33
(1H, d, 2'- H ), 7.18 (4H, m), 8.41
(1H, s, 8- H ) Example 4 [Production of compound 2-amino OXT-A (1st)] 2.65 g of compound (4) obtained in Example 3 was dissolved in 16 ml of absolute ethanol, and the liquid Approximately 50 ml of ammonia was added, and the mixture was stirred at 105°C for 57 hours in a sealed tube. After removing ammonia, add 100 ml of water to remove insoluble materials, adsorb onto 300 ml of MCI GEL CHP20P, wash with water, and add 1200 ml of water - 50% aqueous methanol each.
Elution was performed using a linear concentration gradient method consisting of ml. Silica gel TLC (Merck, Art.5715) [Developing solvent: Chloroform-methanol (2:
1)], the fraction around Rf0.44 was collected, concentrated under reduced pressure, and dried to obtain 445 mg of powder of compound 2-amino OXT-A. (Yield 55.8%) FD-MS; 266 (M + ) UV; H 2 O λmax (logε) 256 nm (3.96), 278 nm
(3.95) NMR (400MHz, D 2 O) δppm; 3.68-3.91 (5H,
m), 4.68 (1H, m), 6.25 (1H, d), 8.13
(1H, s) Example 5 [Production of compound 2-amino OXT-A (second)] (a) [Production of compound (5)] 808 mg of compound (1) and 748 mg of m-chloroperbenzoic acid
mg was dissolved in a mixture of 18 ml of water and 60 ml of dioxane and stirred at room temperature in the dark for 18 hours. Concentrate the reaction solution under reduced pressure.
After drying, the residue was sprinkled on 6 g of silica gel, and this was applied to a column containing 45 g of the same silica gel.
Elution was carried out in the following order: 200 ml of methanol (5:1) and 500 ml of chloroform-methanol (3:1). Fractions around Rf = 0.18 were collected using silica gel TLC [developing solvent: chloroform-methanol (2:1)] and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain 721 mg of compound (5).
( Yield 83.9%) FAB-MS; 268 (M+H) + UV; H2O λmax233, 262, 295nm NMR (60MHz, D2O ) δppm; 3.99-4.30 (5H,
m), 4.70 (1H, m), 6.71 (1H, d), 8.73
(1H, s), 8.87 (1H, s) (b) [Production of compound (6)] 110 mg of compound (5) was dissolved in a mixture of 1.6 ml of water and 0.6 ml of acetic acid, and 276 mg of sodium nitrite was added to this. ,
The mixture was stirred at room temperature for 3 days. After concentrating the reaction solution under reduced pressure, transfer the concentrated solution to Dowex 50W.
It was applied to a 4 ml column of ×8 (H type) and eluted with water. Fractions around Rf0.08 were collected using silica gel TLC [developing solvent: n-butanol-acetic acid-water (3:1:2)] and concentrated under reduced pressure to dryness to yield compound (6) 58.6
I got mg. (Yield 53.3%) FAB-MS; 269 (M+H) + UV; 0.1NNaOH λmax256, 294nm NMR (60MHz, D2O ) δppm; 3.70-4.30 (5H,
m), 4.61 (1H, m), 6.60 (1H, d), 8.60
(1H, s), 8.67 (1H, s) (c) [Production of compound (8) (R' 1 = -COCH 3 )] 206 mg of compound (6) was suspended in 10 ml of acetonitrile,
0.315 ml of triethylamine, 10 mg of 4-dimethylaminopyridine, and 0.25 ml of acetic anhydride were added in this order and stirred at room temperature for 18 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure to dryness, the residue was dissolved in chloroform, applied to a column of 30 g of silica gel, and chloroform-methanol (30:
1) 200ml, chloroform-methanol (5:1)
It was eluted in the order of 300ml. Silica gel TLC [developing solvent: chloroform-methanol (10:1)]
Fractions around Rf0.55 were collected and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain compound (7). Compound (7) was dissolved in 20 ml of methanol-water (5:1) and stirred at 43°C for 2 days to precipitate a colorless powder. Take this compound (8)
Obtained 198mg. (Yield 74%) FAB-MS; 353 (M+H) + UV; MeOH λmax245, 251, 270nm NMR (60MHz, CD 3 OD) δppm; 2.10 (3H,
s), 2.13 (3H, s), around 4.46 (5H, m),
6.43 (1H, d), 8.33 (1H, s), 8.43 (1H,
s) [Production of compound (9) (R 1 = -COCH 3 )] 53 mg of compound (8) obtained in the same manner as in Example 7 was added to 1 ml.
of phosphorus oxychloride and 0.3 ml of triethylamine, and heated under reflux for 20 minutes. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was partitioned between 20 ml of chloroform and 20 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and the organic layer was washed with 10 ml of saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and dried under reduced pressure. The residue was applied to a column of 15 g of silica gel, and chloroform-methanol (30:
1) Eluted with 200ml. Silica gel TLC [developing solvent: chloroform-methanol (10:1)]
Fractions around Rf0.56 were collected and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain 13.6 mg of compound (9). (Yield 23.2%) FD-MS; 388 (M + ) UV; MeOH λmax 252, 273 nm NMR (60 MHz, CD 3 OD) δppm; 2.08 (6H,
s), around 4.47 (5H, m), 6.57 (1H, d),
8.83 (1H, s) (e) [Production of compound 2-amino OXT-A] 27 mg of compound (9) obtained in the same manner as in Example 8 was suspended in 12 ml of ethanol, and 15 ml of liquid ammonia was added to this.
ml and stirred in a sealed tube at 110°C for 72 hours. After removing ammonia, the reaction solution was concentrated under reduced pressure to dryness, the residue was dissolved in water, and MCI GEL CHP20P
Add 20ml of water to 50% aqueous methanol (80ml each)
It was eluted with a linear concentration gradient of Fractions around Rf0.44 were collected using silica gel TLC [developing solvent: chloroform-methanol (2:1)] and concentrated under reduced pressure to dryness to form compound 2-amino
13.1 mg of OXT-A colorless powder was obtained. (Yield 71.3%) FD-MS; 266 (M + ) UV; H 2 O λmax (logε) 256 nm (3.96), 278 nm
(3.95) NMR (400MHz, D 2 O) δppm; 3.68-3.91 (5H,
m), 4.68 (1H, m), 6.25 (1H, d), 8.13
(1H, s) Example 6 [Production of compound OXT-G] 240 mg of compound 2-amino OXT-A was dissolved in 150 ml of M/10 phosphate buffer (PH7.5), and adenosine deaminase (manufactured by Sigma, EC3. 5.4.4)
100μ (100 units) was added and stirred at 22°C for 41 hours. This reaction solution was adsorbed onto 100 ml of MCI GEL CHP20P, and then eluted with water. Silica gel TLC [Developing solvent: n-butanol-
Collect fractions around Rf0.42 with acetic acid-water (4:1:2) and concentrate under reduced pressure to dryness to form a colorless powder compound.
240 mg of OXT-G was obtained. (Yield 99.6%) FD-MS; 268 (M+H) + UV; PH6.0 λmax (logε) 253.5 nm (4.09) NMR (400 MHz, D2O ) δppm; 3.69-3.87 (5H,
m), 4.66-4.69 (1H, m), 6.29 (1H,
d), 8.17 (1H, s) Example 7 [Production of compound OXT-G] After dispensing 100 ml of a medium with pH = 7.0 containing 0.3% meat extract, 1.0% peptone, and 0.7% salt into a 500 ml Erlenmeyer flask, , autoclave sterilized at 120°C for 20 minutes. Escherichia coli in this flask
One platinum loop of NIHJ (Escherichia coli NIHJ) was inoculated and cultured aerobically at 37°C for 18 hours with shaking.
Next, 1,000 ml of this culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and viable cells were collected and washed three times with the same volume of M/20 phosphate buffer (PH7.0). It became cloudy in 100ml of the solution. Compound 2 is added to this suspension.
-Add 50mg of amino OXT-A, react at 37℃ for 18 hours with shaking, and then heat at 100℃ for 5 minutes.
The reaction was stopped, bacteria were sterilized by centrifugation under the above conditions, and the resulting supernatant was transferred to MCI GEL CHP-
The product was adsorbed through a column packed with 50ml of 20P, washed with water, eluted with 150ml of 20% aqueous methanol, concentrated and dried to obtain a colorless powdery compound OXT-G (45.1mg). rate of 90.0%). Example 8 [Production of compound OXT-DCP] 1 ml of 6.3 mg of compound (9) obtained in (d) of Example 6
After adding 0.04 ml of 1N ammonia aqueous solution and stirring at room temperature for 2 hours,
0.04 ml of 1N hydrochloric acid was added. The reaction solution was concentrated under reduced pressure to dryness, and the residue was dissolved in water to form MCI GEL CHP20P.
(10 ml), washed with water, and eluted with 80% aqueous methanol. A fraction around Rf0.35 was collected using silica gel TLC [developing solvent: chloroform-methanol (10:1)], concentrated under reduced pressure, and dried to form compound (2).
44.mg of colorless powder was obtained. (Yield 91%) UV; MeOH λmax252, 273nm FAB-MS; 304 (M + ) NMR (400MHz, CD 3 OD) δppm; 3.72-3.93
(5H, m), 4.69 (1H, m), 6.33 (1H,
d). 8.89 (1H, s)