【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
本発明は免疫学的診断試薬に関し、詳しくは、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなり、ラテツクス凝集反応
において非特異的凝集反応がなく、且つ、凝集反
応の判定が容易であると共に、保存安定性にすぐ
れる免疫学的診断試薬に関する。
（従来の技術）
近年、人間や動物の病理的状態或いはその他の
状態の医学的診断のために、血液、尿その他の体
液中の生理活性物質が有する免疫活性を利用する
免疫学的診断方法が広く用いられている。この方
法は、免疫学的な反応を起こす抗原又は抗体のい
ずれか一方、又は両者を組合せて体液等の被検液
と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対応する
抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原
抗体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によ
つて、上記のような免疫活性成分の存在を決定す
る方法である。この場合、肉眼による観察を容易
にするために、一般に、抗原又は抗体は微粒子状
の担体、例えば、ラテツクス、赤血球等に担持さ
せて診断試薬とされ、このような粒子の凝集反応
を利用して、血清等の体液中の被検成分が測定さ
れる。
例えば、ラテツクスからなる診断試薬の凝集反
応について説明すると、抗原又は抗体を担持させ
たラテツクスを含有する水性分散液からなる診断
試薬を被検液と混合すると、上記抗原又は抗体に
対応する被検液中の抗体又は抗原は、ラテツクス
上の抗原又は抗体と特異的に反応し、ラテツクス
凝集反応、即ち、肉眼的に観察し得る微粒子の凝
集反応が生じる。しかし、被検液中に測定すべき
抗体又は抗原が存在しない場合は、肉眼的に観察
し得る凝集は起こらない。このようにして、抗原
又は抗体を固定化した微粒子の凝集反応の有無に
よつて、被検液中の抗体又は抗原の存在を測定す
ることができる。
このような免疫学的学的診断試薬は、免疫活性
物質、即ち、抗原又は抗体が微量にでも被検液中
に存在すれば、これを検出し得る高い感度と、目
的とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性
を有することが要求される。更に、長期間の保存
によつても、高い感度及び特異性を保持すること
が要求される。
このような免疫学的診断試薬としては、従来、
ポリスチレンラテツクス粒子表面に抗原及び抗体
を物理吸着により固定化してなる診断試薬や、カ
ルボキシル化ラテツクス粒子にカルボジイミド、
ジアルデヒド等を用いて共有結合により固定化し
てなる診断試薬等が提案されている。しかし、従
来のかかる診断試薬は、いずれも、血清と反応さ
せたとき、対応する抗体又は抗原を含む陽性血清
のみならず、対応する抗体又は抗原を含まない陰
性血清に対しても凝集反応を起こすことがある。
このような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれ
ており、しばしば診断を誤まらせることがある。
このような非特異的凝集反応が起こる理由は必ず
しも明らかではないが、一つには血清中に含まれ
る補体等の因子によるものと考えられる。
従つて、従来、ラテツクス粒子の非特異的凝集
を防ぐことを目的として、ラテツクス凝集反応の
有無の判定を行なう際に、血清をグリシン等の緩
衝液で希釈したり、或いは血清中の補体を失活さ
せる非働化処理を施すことが行なわれている。し
かし、このような処理によつては、非特異的凝集
を十分に抑制することは困難であり、また、手間
を要して、診断に時間がかかるという問題があ
る。
このようなラテツクス診断試薬における問題を
解決するために、従来より、非特異的凝集反応を
抑制することを目的として、添加剤を添加するこ
とが一般に行なわれており、かかる添加剤とし
て、例えば、グリコール類や、ゼラチン、アルブ
ミン等のタンパク質、或いはポリアニオン等が知
られている。しかし、これらの添加剤の効果は一
般に十分ではないので、近年、添加剤として、例
えば、シヨ糖及び塩化コリン（特開昭54−026327
号公報）、グアニジン、グアニジン塩酸塩、グア
ニジニウムチオシアン酸塩、尿素等を代表とする
ケイオトロピツク剤（特開昭56−158947号公報）、
Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミドやジ低級アルキルスル
ホキシド（特開昭55−160853号公報）等が提案さ
れているが、これらの添加剤も非特異的凝集を抑
制する効果は十分ではない。
（発明の効果）
本発明物らは、免疫学的診断試薬における上記
した問題を解決するために鋭意研究した結果、免
疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体粒
子水性分散液にスルホランを共存させることによ
り、非特異的凝集が起こらず、且つ、凝集反応の
有無の判定が容易であると共に、保存安定性にす
ぐれる免疫学的診断試薬を得ることができること
を見出して、本発明に至つたものである。
従つて、本発明は、血清を希釈することなく、
しかも、非働化処理も行なわずに、非特異的凝集
が抑制され、且つ、凝集反応の有無の判定が容易
であると共に、保存安定性にすぐれる免疫学的診
断試薬を提供することを目的とする。
（発明の構成）
本発明による免疫学的診断試薬は、免疫活性物
質を固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性
分散液中にスルホランが配合されてなることを特
徴とする。
本発明による免疫学的診断試薬において、免疫
活性物質を固定化するための担体である水分散型
高分子重合体粒子の平均粒径は、好ましくは0.03
〜2μｍ、特に好ましくは0.1〜1μｍである。平均
粒径が小さすぎると、免疫活性物質を固定化した
水分散型高分子重合体粒子の抗原抗体反応による
凝集を肉眼で観察することが困難であり、一方、
大きすぎるときは、重合体粒子に安定な分散状態
を保持させるのが困難となるからである。また、
重合体粒子の比重は、0.9〜1.5の範囲にあること
が好ましく、更に、後述するように、免疫活性物
質を固定化した後の比重が1.0〜1.3の範囲にある
ことが好ましい。重合体粒子が免疫活性物質の固
定化の前後に上記範囲よりも小さい比重を有する
ときは、重合体粒子がその水性分散液における水
性媒体表面に浮遊して、分散安定性に劣るように
なり、一方、上記範囲よりも大きいときは、粒子
が分散液の水性媒体中に沈降し、凝集しやすくな
つて、同様に分散安定性に劣るようになるからで
ある。
本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、通常、不飽和二重結合を有する単量体の一
又は二以上の乳化重合によつて調製される。かか
る単量体としては、例えば、エチレン、プロピレ
ン等のオレフイン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビ
ニル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチ
レン、クロロスチレン等のスチレン系単量体、ア
クリル酸メチル等のアクリル酸エステル系単量
体、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エステ
ル系単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が
用いられる。
また、これら単量体の単独重合体又は共重合体
を改質するために、アクリル酸、メタクリル酸、
アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリ
ルアミド等の単量体を前記単量体と共重合させる
こともできる。
更に、上記単量体と共に、単量体成分として多
官能性単量体を内部架橋剤として乳化共重合させ
て、架橋させた水分散型高分子重合体粒子を得る
こともできる。内部架橋剤は、重合体に架橋構造
を導入するので、診断試薬中に含まれれば好まし
くない水溶性重合体の生成を抑制すると共に、得
られる重合体粒子のガラス転移温度を高めること
ができる。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒
体中での分散安定性を高めるのに効果がある。
かかる内部架橋用多官能性単量体としては、例
えば、脂肪族多価アルコールのポリ（メタ）アク
リレートが好ましく用いられる。具体例として、
例えば、エチレングリコールジメタクリレート、
ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエ
チレングリコールジメタクリレート、ジプロピレ
ングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が好ましく用いられる。また、
ジビニルベンゼンやＮ，N′−メチレンビスアク
リルアミド等も内部架橋剤として用いることがで
きる。
尚、個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子重合体粒子が融着、凝集を起こさ
ないように、所要のガラス転移点を有するように
選ばれるが、ガラス転移点は、診断試薬の保存温
度及び診断試薬の使用温度を考慮して、通常10℃
以上、好ましくは室温以上である。
免疫活性物質が共有結合にて上記水分散型高分
子重合体粒子に固定化される場合は、重合体粒子
はその表面に官能基を有することが必要である。
このような官能基としては、例えばカルボキシル
基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ヒドラジ
ド基等を挙げることができる。従つて、これらの
官能基を有する重合体粒子を調製するには、単量
体成分として、例えば、アクリル酸、メタクリル
酸のようなカルボキシル基を有する単量体、例え
ば、ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロ
キシメチルメタクリレートのような水酸基を有す
る単量体、例えば、グリシジルメタクリレートの
ようなグリシジル基を有する単量体を、必要に応
じて、他の共重合性単量体と乳化共重合させるこ
とによつて得ることができる。
また、所要の単量体成分を重合させた後、得ら
れた水分散型高分子重合体粒子に官能基を導入す
ることもできる。このための方法としては、例え
ば、アクリル酸エステルを単量体成分として重合
させて得た重合体粒子を加水分解することによ
り、カルボキシル基を有する重合体粒子を得るこ
とができる。また、アミノ基やヒドラジド基を有
する水分散型高分子重合体粒子を調製するには、
例えば、アクリルアミドのようなアミド基を有す
る単量体、又はアクリル酸メチルのようなメチル
エステル基を有する単量体をそれぞれ他の単量体
と乳化共重合し、得られた共重合体中のアミド基
をホフマン分解し、又はメチルエステル基をヒド
ラジンと反応させることにより得ることができ
る。
しかし、このように官能基を有する水分散型高
分子重合体粒子に免疫活性物質を共有結合にて固
定化するための方法は、特に制限されず、従来よ
り知られている任意の方法によることができる。
例えば、好ましい方法の一つとして、水溶性カル
ボジイミドの存在下に、免疫活性物質の有するア
ミノ基と水分散型高分子重合体粒子の有するカル
ボキシル基とを反応させ、アミド結合を形成させ
ることにより結合することができる。水溶性カル
ボジイミドとしては、例えば、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエ
ンスルホネート等を挙げることができる。このよ
うな水溶性カルボジイミドを用いる免疫活性物質
の共有結合による重合体粒子への固定化は、従来
より知られている通常の条件下で行なうことがで
き、重合体粒子の水性分散液に免疫活性物質と共
に適宜量、例えば、水性分散液の単位容量当りに
0.01〜10mg／mlとなるように水溶性カルボジイミ
ドを添加し、通常の条件、例えばPHを４〜10に保
持して、５〜60℃程度の温度で数分乃至数十時
間、通常、１〜５時間程度反応させればよい。
また、官能基が水酸基であるときは臭化シアン
法により、また、アミノ基であるときはジアルデ
ヒドと反応させ、これら官能基を活性化すること
によつて、タンパク質の共有結合による固定化の
常法を用いて固定化することができる。
更に、本発明による免疫学的診断試薬において
は、水分散型高分子重合体粒子に免疫活性物質を
共有結合によつて固定化するに際して、必要に応
じて、免疫活性物質の重合体粒子上での自由度を
高めるために、重合体粒子と免疫活性物質とをス
ペーサ基を介在させて共有結合にて結合させるこ
とができる。このスペーサ基は、予め重合体粒子
に結合させ、この後にこのスペーサ基と免疫活性
物質とを結合させてもよく、或いはスペーサ基を
予め免疫活性物質に結合させ、これを重合体粒子
に結合させてもよい。更に、必要に応じて、重合
体粒子及び免疫活性物質の両方に予めスペーサ基
を結合させ、これらを相互に結合させることもで
きる。
スペーサ基として用い得る化合物は、少なくと
も二官能性の有機化合物であり、具体例として、
例えば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレ
ンジアミン、キシリレンジアミン等のジアミン
類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、γ−ア
ミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等のアミノアル
キルカルボン酸、アミノ酸類等が好ましく用いら
れるが、これらに限定されるものではない。
尚、本発明においては、水分散型高分子重合体
粒子に免疫活性物質を固定化するに際して、前述
したような共有結合法によらずに、物理吸着法や
イオン結合法によつて重合体粒子に固定してもよ
いことはいうまでもない。
本発明において用いる免疫活性物質としては、
特に制限はなく、抗原、抗体及びハプテン等いず
れを用いてもよい。例えば、ヒト及び動物免疫グ
ロブリン、変性免疫グロブリン、α−フエトプロ
テイン、Ｃ反応性タンパク（CRP）や肝炎ウイ
ルス関連抗原、風疹HA抗原等の各種ウイルス抗
原、トキソプラズマ、マイコプラズマ、梅毒トレ
ポネーマ等の種々の細菌、真菌、毒素等の微生物
抗原、アルブミン、補体成分等の各種血漿タンパ
ク成分、エストロゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン（HGC）等の各種ホルモン等が挙げられ、ま
た、これらの抗原成分に対する抗体等も使用する
ことができる。
本発明による免疫学的診断試薬は、上記のよう
に固定した免疫活性物質の失活が起こらないよう
に、水分散型高分子重合体粒子が適当なPH及び濃
度のグリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液等の緩衝液に分散されていると共に、この重合
体粒子の水性分散液に粒子の非特異的凝集を抑制
するための添加剤としてスルホランが配合されて
なる。
本発明による免疫学的診断試薬において、上記
緩衝液の濃度は、通常、0.005〜0.2Mの範囲が適
当であり、好ましくは0.01〜0.1Mの範囲である。
また、緩衝液のPHは、水分散型高分子重合体粒子
の分散安定性及び抗原抗体反応の活性を考慮し
て、通常、６〜９、好ましくは７〜8.5の範囲で
ある。また、診断試薬における固定化重合体粒子
の濃度は、通常、0.01〜５重量％の範囲である
が、好ましくは0.1〜３重量％の範囲である。
スルホランは、免疫活性物質を固定化した水分
散型高分子重合体粒子の水性分散液において、１
〜20重量％、好ましくは２〜15重量％の濃度で含
有される。水性分散液におけるスルホラン濃度が
１重量％よりも少ないときは、陰性血清に対する
非特異的凝集の抑制効果が乏しく、一方、濃度が
20重量％を越えるときは、却つて陽性血清に対す
る特異的凝集が抑制されることとなるからであ
る。尚、本発明による免疫学的診断試薬には、防
腐効果を与えるために、アジ化ナトリウム等の防
腐剤を添加してもよい。
本発明による免疫学的診断試薬を使用する免疫
学的診断は、例えば、診断試薬と被検液とをガラ
ス板又はプラスチツク板の窪み又は平面板上又は
マイクロプレート上において混合し、肉眼又は顕
微鏡観察によつて、重合体粒子の凝集の有無を判
定することにより行なわれる。また、凝集の有無
を光学的な変化として判定するこもできる。
（発明の効果）
以上のように、本発明の免疫学的診断試薬は、
免疫活性物質を固定化した水分散型高分子重合体
粒子の水性分散液からなると共に、スルホランを
含有し、この結果、その理由は必ずしも明らかで
はないが、重合体粒子の非特異的凝集が完全に阻
止されるので、診断に際して、血清を緩衝液で希
釈したり、或いは非働化処理しなくとも、迅速に
正確な判定を行なうことができる。更に、本発明
による診断試薬は、例えば、血清と均一に混じり
やすく、凝集の有無判定が容易である。また、従
来の診断試薬に比較して、その保存安定性に著し
くすぐれる。
また、免疫活性物質の担体として用いる水分散
型高分子重合体粒子は、粒径を含む品質が均一で
あるうえに、それ自体は免疫活性をもたないの
で、固定化操作が容易であると共に、固定化重合
体粒子は高い検出感度と高い特異的とを有し、か
くして、高精度での診断を可能とする診断試薬を
与える。
（実施例）
以下に本発明の実施例を示し、具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
実施例 １
(a) 水分散型高分子重合体粒子の調製
メタクリル酸メチル7.5ｇ、メタクリル酸イソ
ブチル7.5ｇ、アクリル酸1.0ｇ、メタクリロニト
リル3.0ｇ及びトリエチレングリコールジメタク
リレート0.7ｇを蒸留水370ｇに加え、更に蒸留水
10ｇに過硫酸カリウム0.1ｇを溶解させた重合開
始剤水溶液を加え、窒素気流下、75℃の温度で攪
拌速度190rpmで攪拌しつつ、８時間重合を行な
つた。重合率99％にて平均粒径0.28μｍの水分散
型高分子重合体粒子を含む水性分散液を得た。
この重合体粒子の水性分散液を最初、蒸留水に
て４回遠心分離し、次いで、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）にて２回遠心分離して、水相中の水溶性
高分子を除去し、重合体粒子を精製した後、この
重合体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）に固
形分が５重量％となるように再分散させた。
(b) 重合体粒子へのスペーサ基の結合
上で得た水分散型高分子重合体粒子の水性分散
液100mlとε−アミノカプロン酸水溶液（0.02M）
100mlとを混合し、1N水酸化ナトリウム水溶液に
てPH7.5に調製した。0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）
に溶解させた１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（25
mg／ml）20mlを上記水性分散液に加え、室温で３
時間、攪拌下に反応させた。一夜、冷蔵庫に放置
した後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）にて３回
遠心洗浄して、スペーサ基を結合した重合体粒子
を得、これを0.01Mホウ酸緩衝液（PH7.5）に固
形分５重量％となるように再分散させた。
(c) ウサギIgGの固定化
上で得たスペーサ基を有する水分散型高分子重
合体粒子の水性分散液５ml、0.01Mホウ酸緩衝液
（PH7.5）２ml及び蒸留水11mlを混合し、これに１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／ml）２mlを
加え、10分後にウサギIgG水溶液（５mg／ml）を
５ml添加し、15℃で２時間反応させた。次に、反
応混合物中の余剰の水溶性カルボジイミドを消費
するために、10重量％Ｌ−アルギニン水溶液（PH
7.5）５mlを加え、１時間インキユベートした。
次いで、0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）にて遠心
洗浄を３回行なつた後、0.01Mホウ酸緩衝液（PH
8.2）に分散させて全量10mlに調整し、かくして、
ウサギIgGを前記スペーサ基を介して共有結合に
て固定化した水分散型高分子重合体粒子の水性分
散液を得た。
(d) 免疫学的診断試薬の調製
スルホランを0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.2）に溶
解し、PHを8.2に調製した後、上で得たウサギIgG
固定化重合体粒子の水性分散液と混合しスルホラ
ンを種々の濃度で含有する本発明による免疫学的
診断試薬を調製した。
(e) 免疫学的診断試薬の評価
免疫活性物質としてウサギIgGを固定化した本
試薬は、リウマチ因子検出試薬として用いること
ができる。
この診断試薬とリウマチ因子陽性血清及び陰性
血清を原液のままそれぞれガラス板上にて等容量
混合攪拌し、２分後に凝集状態を判定した。その
結果を第１表に示す。本発明による診断試薬にお
いては、特異的凝集反応が起こらないが、スルホ
ランを含有しない対照診断試薬では非特異的凝集
が著しい。
(Industrial Application Field) The present invention relates to an immunological diagnostic reagent, and in detail,
It is composed of an aqueous dispersion of water-dispersed polymer particles on which an immunoactive substance is immobilized, and there is no non-specific agglutination reaction in the latex agglutination reaction, and it is easy to judge the agglutination reaction and has good storage stability. This article relates to excellent immunological diagnostic reagents. (Prior Art) In recent years, immunological diagnostic methods that utilize the immune activity of physiologically active substances in blood, urine, and other body fluids have been developed for medical diagnosis of pathological or other conditions in humans and animals. Widely used. In this method, either an antigen or an antibody that causes an immunological reaction, or a combination of both, is reacted with a test fluid such as a body fluid, and the relationship between the antigen or antibody and the corresponding antibody or antigen is detected. This method determines the presence of an immunoactive component as described above by a specific reaction, that is, an agglutination reaction or an agglutination inhibition reaction based on an antigen-antibody reaction. In this case, in order to facilitate observation with the naked eye, antigens or antibodies are generally used as diagnostic reagents by supporting them on microparticulate carriers, such as latex or red blood cells, and using the agglutination reaction of such particles. , test components in body fluids such as serum are measured. For example, to explain the agglutination reaction of a diagnostic reagent made of latex, when a diagnostic reagent made of an aqueous dispersion containing latex carrying an antigen or antibody is mixed with a test liquid, the test liquid corresponding to the antigen or antibody is mixed with the test liquid. The antibodies or antigens therein react specifically with the antigens or antibodies on the latex, resulting in a latex agglutination reaction, ie, a macroscopically observable agglutination reaction of the microparticles. However, if the antibody or antigen to be measured is not present in the test liquid, no macroscopically observable agglutination occurs. In this way, the presence of the antibody or antigen in the test liquid can be determined by the presence or absence of an agglutination reaction of the microparticles on which the antigen or antibody is immobilized. Such immunological diagnostic reagents have high sensitivity to detect immunoactive substances, i.e., antigens or antibodies, even if they are present in a trace amount in a sample solution, and have high sensitivity to detect the target immunoactive substance. It is required to have high specificity to react only with Furthermore, it is required to maintain high sensitivity and specificity even during long-term storage. Conventionally, such immunological diagnostic reagents include
Diagnostic reagents are made by immobilizing antigens and antibodies on the surface of polystyrene latex particles by physical adsorption, and carbodiimide and carboxylated latex particles are used.
Diagnostic reagents and the like that are immobilized by covalent bonds using dialdehyde and the like have been proposed. However, when such conventional diagnostic reagents are reacted with serum, they cause an agglutination reaction not only with positive serum containing the corresponding antibody or antigen but also with negative serum without the corresponding antibody or antigen. Sometimes.
Such an agglutination reaction is called a nonspecific agglutination reaction, and can often mislead the diagnosis.
The reason why such a non-specific agglutination reaction occurs is not necessarily clear, but it is thought that one reason is due to factors such as complement contained in serum. Therefore, in order to prevent non-specific agglutination of latex particles, conventionally, when determining the presence or absence of latex agglutination reaction, serum is diluted with a buffer solution such as glycine, or complement in serum is Inactivation treatment is carried out to deactivate it. However, such treatment has the problem that it is difficult to sufficiently suppress nonspecific aggregation, and that it is laborious and time-consuming for diagnosis. In order to solve these problems with latex diagnostic reagents, it has been common practice to add additives for the purpose of suppressing non-specific agglutination reactions. Examples of such additives include, for example: Known examples include glycols, proteins such as gelatin and albumin, and polyanions. However, the effects of these additives are generally not sufficient, so in recent years, additives such as sucrose and choline chloride (Japanese Patent Laid-Open No. 54-026327
chaiotropic agents represented by guanidine, guanidine hydrochloride, guanidinium thiocyanate, urea, etc. (Japanese Unexamined Patent Publication No. 158947/1982);
Although N,N-dialkylamides and di-lower alkyl sulfoxides (JP-A-55-160853) have been proposed, these additives are not sufficiently effective in suppressing non-specific aggregation. (Effects of the Invention) As a result of intensive research to solve the above-mentioned problems in immunological diagnostic reagents, the present invention has discovered that sulfolane is added to an aqueous dispersion of water-dispersed polymer particles immobilized with an immunologically active substance. The present invention has been based on the discovery that by coexisting with the above, it is possible to obtain an immunological diagnostic reagent that does not cause non-specific agglutination, makes it easy to determine the presence or absence of an agglutination reaction, and has excellent storage stability. This is what led to this. Therefore, the present invention allows serum to be diluted without diluting it.
Moreover, the purpose is to provide an immunological diagnostic reagent that suppresses non-specific aggregation without performing inactivation treatment, makes it easy to determine the presence or absence of an agglutination reaction, and has excellent storage stability. do. (Structure of the Invention) The immunological diagnostic reagent according to the present invention is characterized in that sulfolane is blended into an aqueous dispersion of water-dispersed polymer particles on which an immunoactive substance is immobilized. In the immunological diagnostic reagent according to the present invention, the average particle diameter of the water-dispersed polymer particles that are the carrier for immobilizing the immunoactive substance is preferably 0.03
~2 μm, particularly preferably 0.1 to 1 μm. If the average particle size is too small, it will be difficult to visually observe the aggregation of the water-dispersed polymer particles immobilized with the immunoactive substance due to the antigen-antibody reaction;
This is because if it is too large, it becomes difficult to maintain a stable dispersion state of the polymer particles. Also,
The specific gravity of the polymer particles is preferably in the range of 0.9 to 1.5, and more preferably the specific gravity after immobilizing the immunoactive substance is in the range of 1.0 to 1.3, as described later. When the polymer particles have a specific gravity smaller than the above range before and after immobilization of the immunoactive substance, the polymer particles float on the surface of the aqueous medium in the aqueous dispersion, resulting in poor dispersion stability. On the other hand, if the size is larger than the above range, the particles tend to settle and aggregate in the aqueous medium of the dispersion, resulting in similarly poor dispersion stability. The water-dispersed polymer particles used in the present invention are usually prepared by emulsion polymerization of one or more monomers having unsaturated double bonds. Examples of such monomers include olefin monomers such as ethylene and propylene, vinyl monomers such as vinyl acetate and vinyl chloride, styrene monomers such as styrene, methylstyrene, and chlorostyrene, and acrylic acid. Acrylic acid ester monomers such as methyl, methacrylic acid ester monomers such as methyl methacrylate, diene monomers such as butadiene, etc. are used. In addition, in order to modify homopolymers or copolymers of these monomers, acrylic acid, methacrylic acid,
Monomers such as acrylonitrile, methacrylonitrile, acrylamide, etc. can also be copolymerized with the above monomers. Furthermore, crosslinked water-dispersed polymer particles can also be obtained by emulsion copolymerizing a polyfunctional monomer as a monomer component with the above monomer as an internal crosslinking agent. Since the internal crosslinking agent introduces a crosslinked structure into the polymer, when included in the diagnostic reagent, it can suppress the formation of undesirable water-soluble polymers and increase the glass transition temperature of the resulting polymer particles. Furthermore, the internal crosslinking agent is effective in making the water-dispersible polymer particles non-swellable and increasing the dispersion stability of the polymer particles in an aqueous medium. As such a polyfunctional monomer for internal crosslinking, for example, poly(meth)acrylate of aliphatic polyhydric alcohol is preferably used. As a specific example,
For example, ethylene glycol dimethacrylate,
Diethylene glycol dimethacrylate, triethylene glycol dimethacrylate, dipropylene glycol dimethacrylate, 1,3-butylene glycol dimethacrylate, triethylene glycol diacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, tetramethylolmethanetetraacrylate, etc. Preferably used. Also,
Divinylbenzene, N,N'-methylenebisacrylamide, etc. can also be used as internal crosslinking agents. The specific type of each monomer is selected so that the obtained water-dispersed polymer particles have a required glass transition point so as not to cause fusion or aggregation. The point is usually 10°C, considering the storage temperature of the diagnostic reagent and the usage temperature of the diagnostic reagent.
The temperature is preferably room temperature or higher. When an immunologically active substance is immobilized on the water-dispersed polymer particles by covalent bonding, the polymer particles need to have functional groups on their surfaces.
Examples of such functional groups include carboxyl groups, hydroxyl groups, glycidyl groups, amino groups, and hydrazide groups. Therefore, in order to prepare polymer particles having these functional groups, monomers having carboxyl groups such as acrylic acid and methacrylic acid, such as hydroxyethyl acrylate, 2- By emulsion copolymerizing a monomer having a hydroxyl group such as hydroxymethyl methacrylate, for example, a monomer having a glycidyl group such as glycidyl methacrylate, with other copolymerizable monomers as necessary. You can get it. Further, after polymerizing the required monomer components, a functional group can be introduced into the obtained water-dispersed polymer particles. As a method for this purpose, for example, polymer particles having carboxyl groups can be obtained by hydrolyzing polymer particles obtained by polymerizing an acrylic acid ester as a monomer component. In addition, in order to prepare water-dispersed polymer particles having amino groups or hydrazide groups,
For example, a monomer having an amide group such as acrylamide or a monomer having a methyl ester group such as methyl acrylate is emulsion copolymerized with other monomers, and the resulting copolymer is It can be obtained by Hofmann decomposition of an amide group or by reacting a methyl ester group with hydrazine. However, the method for covalently immobilizing an immunoactive substance onto water-dispersed polymer particles having a functional group is not particularly limited, and any conventionally known method may be used. I can do it.
For example, one preferred method is to react the amino group of the immunoactive substance with the carboxyl group of the water-dispersed polymer particles in the presence of water-soluble carbodiimide to form an amide bond. can do. Examples of water-soluble carbodiimide include 1-ethyl-3-
Examples include (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide-meth-p-toluenesulfonate, and the like. Immobilization of an immunoactive substance onto polymer particles by covalent bonding using such a water-soluble carbodiimide can be carried out under conventional and conventional conditions. together with the substance in an appropriate amount, e.g. per unit volume of an aqueous dispersion.
Water-soluble carbodiimide is added at a concentration of 0.01 to 10 mg/ml, and incubated under normal conditions, for example, while maintaining the pH at 4 to 10, at a temperature of about 5 to 60°C for several minutes to several tens of hours, usually 1 to 10. It is enough to react for about 5 hours. In addition, when the functional group is a hydroxyl group, the cyanogen bromide method is used, and when the functional group is an amino group, it is reacted with dialdehyde to activate these functional groups. Immobilization can be performed using conventional methods. Furthermore, in the immunological diagnostic reagent according to the present invention, when immobilizing the immunoactive substance on the water-dispersed polymer particles by covalent bonding, if necessary, the immunologically active substance is immobilized on the polymer particles. In order to increase the degree of freedom, the polymer particles and the immunologically active substance can be covalently bonded via a spacer group. The spacer group may be bonded to the polymer particle in advance and then the immunoactive substance may be bonded to the spacer group, or the spacer group may be bonded to the immunoactive substance in advance and this may be bonded to the polymer particle. It's okay. Furthermore, if necessary, spacer groups can be bonded to both the polymer particles and the immunoactive substance in advance to bond them to each other. Compounds that can be used as spacer groups are at least difunctional organic compounds, and specific examples include:
For example, diamines such as hexamethylene diamine, dodecamethylene diamine, and xylylene diamine, aminoalkyl carboxylic acids such as glycine, β-aminopropionic acid, γ-aminobutyric acid, and ε-aminocaproic acid, and amino acids are preferably used. , but not limited to these. In addition, in the present invention, when immobilizing an immunoactive substance on water-dispersed polymer particles, the polymer particles are immobilized by a physical adsorption method or an ionic bonding method, instead of using the covalent bonding method as described above. Needless to say, it may be fixed to . The immunoactive substances used in the present invention include:
There are no particular limitations, and any antigen, antibody, hapten, etc. may be used. For example, human and animal immunoglobulin, modified immunoglobulin, α-fetoprotein, C-reactive protein (CRP), hepatitis virus-related antigen, various virus antigens such as rubella HA antigen, various virus antigens such as Toxoplasma, Mycoplasma, Treponema pallidum, etc. Examples include microbial antigens such as bacteria, fungi, and toxins, various plasma protein components such as albumin and complement components, various hormones such as estrogen and human chorionic gonadotropin (HGC), and antibodies against these antigen components. can be used. In the immunological diagnostic reagent according to the present invention, the water-dispersed polymer particles are mixed with a glycine buffer or a phosphate buffer with an appropriate pH and concentration so that the immobilized immunoactive substance is not deactivated as described above. The aqueous dispersion of polymer particles is dispersed in a buffer solution such as a liquid or a boric acid buffer solution, and sulfolane is added to the aqueous dispersion of the polymer particles as an additive for suppressing non-specific aggregation of the particles. In the immunological diagnostic reagent according to the present invention, the concentration of the buffer solution is usually in the range of 0.005 to 0.2M, preferably in the range of 0.01 to 0.1M.
Further, the pH of the buffer solution is usually in the range of 6 to 9, preferably 7 to 8.5, taking into account the dispersion stability of the water-dispersed polymer particles and the activity of antigen-antibody reaction. Further, the concentration of immobilized polymer particles in the diagnostic reagent is usually in the range of 0.01 to 5% by weight, preferably in the range of 0.1 to 3% by weight. Sulfolane is used in an aqueous dispersion of water-dispersed polymer particles on which an immunoactive substance is immobilized.
It is contained in a concentration of ~20% by weight, preferably 2-15% by weight. When the concentration of sulfolane in the aqueous dispersion is less than 1% by weight, the effect of suppressing nonspecific aggregation against negative serum is poor;
This is because if the amount exceeds 20% by weight, specific agglutination of positive serum will be suppressed. Incidentally, a preservative such as sodium azide may be added to the immunological diagnostic reagent according to the present invention in order to impart a preservative effect. In immunological diagnosis using the immunological diagnostic reagent according to the present invention, for example, the diagnostic reagent and the test solution are mixed in the hollows of a glass plate or plastic plate, on a flat plate, or on a microplate, and then observed with the naked eye or with a microscope. This is done by determining the presence or absence of aggregation of polymer particles. Furthermore, the presence or absence of aggregation can also be determined as an optical change. (Effects of the invention) As described above, the immunological diagnostic reagent of the present invention has
It is composed of an aqueous dispersion of water-dispersed polymer particles on which an immunoactive substance is immobilized, and also contains sulfolane. Therefore, when making a diagnosis, it is possible to quickly and accurately make a diagnosis without diluting the serum with a buffer or inactivating it. Furthermore, the diagnostic reagent according to the present invention is easily mixed with serum, for example, and it is easy to determine the presence or absence of agglutination. Furthermore, it has significantly better storage stability than conventional diagnostic reagents. In addition, the water-dispersed polymer particles used as carriers for immunoactive substances are uniform in quality, including particle size, and do not have immunoactivity themselves, so they are easy to immobilize. The immobilized polymer particles have high detection sensitivity and high specificity, thus providing a diagnostic reagent that allows diagnosis with high accuracy. (Examples) Examples of the present invention will be shown below and specifically explained, but the present invention is not limited to these Examples. Example 1 (a) Preparation of water-dispersed polymer particles 7.5 g of methyl methacrylate, 7.5 g of isobutyl methacrylate, 1.0 g of acrylic acid, 3.0 g of methacrylonitrile, and 0.7 g of triethylene glycol dimethacrylate were added to 370 g of distilled water. in addition to distilled water
An aqueous polymerization initiator solution in which 0.1 g of potassium persulfate was dissolved in 10 g was added, and polymerization was carried out for 8 hours under a nitrogen stream at a temperature of 75° C. with stirring at a stirring speed of 190 rpm. An aqueous dispersion containing water-dispersible polymer particles with an average particle diameter of 0.28 μm was obtained at a polymerization rate of 99%. This aqueous dispersion of polymer particles was first centrifuged four times in distilled water and then twice in 0.01M borate buffer (PH7.5) to increase the water solubility in the aqueous phase. After removing molecules and purifying the polymer particles, the polymer particles were redispersed in 0.01 M borate buffer (PH 7.5) to a solid content of 5% by weight. (b) Binding of spacer group to polymer particles 100 ml of the aqueous dispersion of the water-dispersed polymer particles obtained above and an aqueous solution of ε-aminocaproic acid (0.02M)
100 ml and adjusted to pH 7.5 with 1N aqueous sodium hydroxide solution. 0.01M borate buffer (PH7.5)
An aqueous solution of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (25
mg/ml) to the above aqueous dispersion, and
The reaction was allowed to take place under stirring for an hour. After leaving it in the refrigerator overnight, it was centrifugally washed three times with 0.01M borate buffer (PH7.5) to obtain spacer group-bonded polymer particles. 5) to a solid content of 5% by weight. (c) Immobilization of rabbit IgG Mix 5 ml of the aqueous dispersion of the water-dispersed polymer particles having spacer groups obtained above, 2 ml of 0.01M borate buffer (PH7.5), and 11 ml of distilled water. 1 for this
-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
2 ml of carbodiimide hydrochloride aqueous solution (5 mg/ml) was added, and 10 minutes later, 5 ml of rabbit IgG aqueous solution (5 mg/ml) was added, followed by reaction at 15° C. for 2 hours. Next, in order to consume the excess water-soluble carbodiimide in the reaction mixture, a 10 wt% L-arginine aqueous solution (PH
7.5) 5 ml was added and incubated for 1 hour.
Next, centrifugal washing was performed three times with 0.01M borate buffer (PH8.2), and then 0.01M borate buffer (PH8.2) was used.
8.2) and adjust the total volume to 10ml, thus,
An aqueous dispersion of water-dispersible polymer particles in which rabbit IgG was covalently immobilized via the spacer group was obtained. (d) Preparation of immunological diagnostic reagent After dissolving sulfolane in 0.1M borate buffer (PH8.2) and adjusting the pH to 8.2, the rabbit IgG obtained above was dissolved.
Immunological diagnostic reagents according to the invention were prepared containing various concentrations of sulfolane mixed with an aqueous dispersion of immobilized polymer particles. (e) Evaluation of immunological diagnostic reagent This reagent in which rabbit IgG is immobilized as an immunoactive substance can be used as a rheumatoid factor detection reagent. This diagnostic reagent, rheumatoid factor positive serum, and negative serum were mixed and stirred in equal volumes on a glass plate as stock solutions, and the state of agglutination was determined after 2 minutes. The results are shown in Table 1. In the diagnostic reagent according to the present invention, no specific agglutination reaction occurs, but in the control diagnostic reagent that does not contain sulfolane, non-specific agglutination is significant.
【表】
実施例 ２
実施例１と同じスペーサ基を結合した重合体粒
子５重量％を含む水性分散液５ml、0.01Mホウ酸
緩衝液（PH7.5）２ml及び蒸留水11mlを混合し、
これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（５mg／
ml）２mlを加えた後、抗ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン抗体溶液（抗HCG、５mg／ml）を５ml添加
し、15℃で３時間反応を行なつた。
この後、実施例１と全く同様に処理して、重合
体粒子を0.01Mホウ酸緩衝液（PH8.2）に分散さ
せて、全量10mlに調製し、抗HCG固定化水分散
型高分子重合体粒子の水性分散液を得た。重合体
粒子１ｇ当りの固定化量は33mgであつた。
この抗HCG固定化重合体粒子の水性分散液を
実施例１と同様に処理して、スルホランを10重量
％濃度で含有すると共に、重合体粒子濃度が1.5
重量％である本発明による免疫学的診断試薬を得
た。
免疫活性物質として抗HCGを固定化した本試
薬は妊娠診断試薬として用いることができる。
この診断試薬と血清を原液のままガラス板上に
て等量混合し、３〜５分後に凝集の有無を判定し
たところ、血清１ml中に１国際単位のHCGがあ
れば凝集が起こり、容易に且つ正確に妊娠の有無
を判定することができた。非特異的凝集は全く起
こらなかつた。
他方、スルホランを含有しない診断試薬によれ
ば、妊娠していないヒト血清の場合も、疑陽性と
判定される非特異的凝集が生じた。[Table] Example 2 5 ml of an aqueous dispersion containing 5% by weight of polymer particles bonded with the same spacer groups as in Example 1, 2 ml of 0.01M borate buffer (PH7.5) and 11 ml of distilled water were mixed,
To this was added an aqueous solution of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (5 mg/
After adding 2 ml of anti-human chorionic gonadotropin antibody solution (anti-HCG, 5 mg/ml), 5 ml of anti-human chorionic gonadotropin antibody solution (anti-HCG, 5 mg/ml) was added, and the reaction was carried out at 15°C for 3 hours. Thereafter, the polymer particles were treated in exactly the same manner as in Example 1, and the polymer particles were dispersed in 0.01M boric acid buffer (PH8.2) to make a total volume of 10 ml. An aqueous dispersion of the combined particles was obtained. The amount of immobilization per gram of polymer particles was 33 mg. This aqueous dispersion of anti-HCG immobilized polymer particles was treated in the same manner as in Example 1 to contain sulfolane at a concentration of 10% by weight and a polymer particle concentration of 1.5%.
% by weight of the immunological diagnostic reagent according to the invention was obtained. This reagent with immobilized anti-HCG as an immunoactive substance can be used as a pregnancy diagnosis reagent. Equal amounts of this diagnostic reagent and serum were mixed in their original form on a glass plate, and the presence or absence of agglutination was determined after 3 to 5 minutes. It was found that if there was 1 international unit of HCG in 1 ml of serum, agglutination occurred, and it was easily detected. Moreover, it was possible to accurately determine the presence or absence of pregnancy. No non-specific aggregation occurred. On the other hand, with a diagnostic reagent that does not contain sulfolane, non-specific agglutination, which was determined to be a false positive, occurred even in the case of non-pregnant human serum.