JPH05507853A - Homologous recombination methods in animal and plant cells - Google Patents
Homologous recombination methods in animal and plant cellsInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 20、請求の範囲第11項の方法によって作成される所望の細胞。[Detailed description of the invention] 20. Desired cells produced by the method of claim 11.
21、請求の範囲第12項の方法によって作成される所望の細胞。21. Desired cells produced by the method of claim 12.
22、請求の範囲第19項の所望の細胞から誘導される細胞を含有する、キメラ 動物もしくは形質転換動物であるヒト以外の動物。22, a chimera containing a cell derived from the desired cell of claim 19 A non-human animal that is an animal or a transformed animal.
23、該動物および該所望の細胞が同じ種に属し、接種がニワトリ、マウス、ラ ット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、お よびヒト以外の霊長類からなる群から選択される請求の範囲第22項のヒト以外 の動物。23, the animal and the desired cells belong to the same species and the inoculation is in chicken, mouse, rat Cat, hamster, rabbit, sheep, goat, fish, pig, cow or bull, or and a non-human primate according to claim 22. animals.
24、請求の範囲第20項の所望の細胞から誘導される細胞を含有する、キメラ 動物もしくは形質転換動物であるヒト以外の動物。24. A chimera containing a cell derived from the desired cell of claim 20. A non-human animal that is an animal or a transformed animal.
25、該動物および該所望の細胞が同じ種に属し、接種がニワトリ、マウス、ラ ット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、お よびヒト以外の霊長類からなる群から選択される請求の範囲第24項のヒト以外 の動物。25, the animal and the desired cells belong to the same species and the inoculation is in chicken, mouse, rat Cat, hamster, rabbit, sheep, goat, fish, pig, cow or bull, or and non-human primates according to claim 24. animals.
26、請求の範囲第21項の所望の細胞から誘導される細胞またはその系統を含 有する、キメラ動物もしくは形質転換動物であるヒト以外の動物。26, including cells derived from the desired cell of claim 21 or a line thereof. A non-human animal that is a chimeric animal or a transformed animal.
27、該動物および該所望の細胞が同じ種に属し、接種がニワトリ、マウス、ラ ット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、お よびヒト以外の霊長類からなる群から選択される請求の範囲第26項のヒト以外 の動物。27, the animal and the desired cells belong to the same species and the inoculation is in chicken, mouse, rat Cat, hamster, rabbit, sheep, goat, fish, pig, cow or bull, or and non-human primates according to claim 26. animals.
28、請求の範囲第5項の所望の細胞から誘導される細胞またはその系統を含有 する、キメラ植物もしくは形質転換植物である非菌類植物。28, containing a cell derived from the desired cell of claim 5 or a line thereof A non-fungal plant that is a chimeric plant or a transformed plant.
29、遺伝子処置を必要とする受容体に所望の選択不可能な遺伝子配列を導入す ることからなる遺伝子処置の方法であって、A、該所望の選択不可能な遺伝子配 列を含有するDNA分子であって、該所望の遺伝子配列に該受容体の前駆体細胞 中に存在する予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る該所望の 遺伝子配列に隣接する2つの相同領域をさらに含有するDNA分子の有効量を該 受容体に与え、B、該DNA分子の該前駆体細胞中への導入を可能にし、C1該 導入されたDNA分子に該前駆体細胞の該ゲノムの該予定した遺伝子配列 −と の相同的組換えを受けさせることによって、該所望の選択不可能な遺伝子配列が 該予定した遺伝子配列中に挿入されている所望の細胞を作成し、該受容体の該細 胞における該導入された遺伝子配列の存在または発現が該遺伝子治療を構成する ことからなる方法。29. Introduction of desired non-selectable gene sequences into receptors requiring gene treatment. A method of gene treatment comprising: A. the desired non-selectable gene sequence; a DNA molecule containing a sequence of the desired gene sequence in a precursor cell of the receptor; the desired gene sequence sufficient to undergo homologous recombination with the intended gene sequence present in the An effective amount of a DNA molecule further containing two homologous regions flanking the gene sequence is B, allowing the introduction of said DNA molecule into said precursor cell; The introduced DNA molecule contains the predetermined gene sequence of the genome of the precursor cell. The desired non-selectable gene sequence is obtained by subjecting it to homologous recombination. Create a desired cell in which the receptor is inserted into the predetermined gene sequence. The presence or expression of the introduced gene sequence in cells constitutes the gene therapy. A method consisting of things.
30、該受容体が非菌類植物である請求の範囲第29項の方法。30. The method of claim 29, wherein said receptor is a non-fungal plant.
31、該受容体が動物である請求の範囲第29項の方法。31. The method of claim 29, wherein said receptor is an animal.
32、該動物がニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ 、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、ヒト以外の霊長類、およびヒトからなる群か ら選択される請求の範囲第31項の方法。32. The animal is a chicken, mouse, rat, hamster, rabbit, sheep, or goat. , fish, pigs, cows or bulls, non-human primates, and humans? 32. The method of claim 31, wherein the method is selected from:
33、該動物がヒトである請求の範囲第32項の方法。33. The method of claim 32, wherein the animal is a human.
34、細胞のゲノムの予定した遺伝子配列内に挿入された所望の選択不可能な遺 伝子配列を含有する所望の動物細胞または非菌類植物細胞を得る方法であって、 A、前駆体細胞を非選択的培養条件下または箆1の選択的培養条件下で次のi) およびff)の遺伝子配列を含有するDNA分子と共に培養し、[i)該所望の 選択不可能な遺伝子配列(ここに該DNA分子は、該所望の遺伝子配列に該前駆 体細胞の該ゲノムの該予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る 該所望の遺伝子配列に隣接する2つの相同領域をさらに含有する)、および、 ti)選択可能な遺伝子配列であって、該前駆体細胞におけるその存在または発 現を、該第1の選択的培養条件下で該細胞を培養することによって選択すること ができ、かつ、該前駆体細胞におけるその存在または発現を、第2の選択的培養 条件下で該細胞を培養することによって否定的に選択することができる遺伝子配 列] B 該DNA分子の該前駆体細胞中への導入を可能にし、C9該導入されたDN A分子に該前駆体細胞の該ゲノムの該予定した遺伝子配列との相同的組換えを受 けさせることによって、該所望の選択不可能な遺伝子配列が該予定した遺伝子配 列中に挿入されている該所望の細胞を作成し、D、該第1の選択的培養条件下で 該細胞を培養し、次いで非選択的培養条件下で該細胞に染色体内組換えを受けさ せ、次いで該第2の選択的培養条件下で該細胞をインキュベートすることによっ て、該所望の細胞を回収する、ことからなる方法。34. A desired non-selectable gene inserted within a predetermined gene sequence in the genome of a cell. A method for obtaining a desired animal cell or non-fungal plant cell containing a genetic sequence, the method comprising: A, Precursor cells were cultured under non-selective culture conditions or under selective culture conditions of 1) following i) and ff) with a DNA molecule containing the gene sequence of [i) the desired a non-selectable gene sequence (wherein the DNA molecule is a precursor to the desired gene sequence) sufficient to cause homologous recombination of the genome of a somatic cell with the predetermined gene sequence. further containing two homologous regions flanking the desired gene sequence), and ti) a selectable gene sequence, the presence or expression of which in said progenitor cell; selecting the cells by culturing the cells under the first selective culture conditions; and its presence or expression in the precursor cells is determined by a second selective culture. Gene sequences that can be negatively selected by culturing the cells under Column] B. Enables the introduction of the DNA molecule into the precursor cell, C9. A molecule undergoes homologous recombination with the predetermined gene sequence of the genome of the progenitor cell. by causing the desired non-selectable gene sequence to become the predetermined gene sequence. D. Under the first selective culture conditions, the desired cells are inserted into a column. the cells are cultured and then allowed to undergo intrachromosomal recombination under non-selective culture conditions. by incubating the cells under the second selective culture conditions. and collecting the desired cells.
35、該細胞がHPRT酵素欠損性であり、該選択可能な遺伝子配列が活性なH PRT酵素を発現し、該第1の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に 活性なHPRT酵素が存在することを要求する条件下で該細胞をインキュベート することからなり、該第2の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に活 性なHPRT酵素が存在しないことを要求する条件下で該細胞をインキュベート することからなる請求の範囲第34項の方法。35, said cell is HPRT enzyme deficient and said selectable gene sequence is active PRT enzyme is expressed, and the first selective culture conditions are such that the PRT enzyme is present in the cells in order to grow. Incubating the cells under conditions requiring the presence of active HPRT enzyme The second selective culture conditions are such that the second selective culture conditions require activity within the cells in order to grow. Incubating the cells under conditions requiring the absence of active HPRT enzymes. 35. The method of claim 34, comprising:
36、該細胞がAPRT酵素欠損性であり、該選択可能な遺伝子配列が活性なA PRT酵素を発現し、該第1の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に 活性なAPRT酵素が存在することを要求する条件下で該細胞をインキュベート することからなり、該第2の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に活 性なAPRT酵素が存在しないことを要求する条件下で該細胞をインキュベート することからなる請求の範囲第34項の方法。36, said cell is APRT enzyme deficient and said selectable gene sequence is active A PRT enzyme is expressed, and the first selective culture conditions are such that the PRT enzyme is present in the cells in order to grow. Incubating the cells under conditions requiring the presence of active APRT enzyme The second selective culture conditions are such that the second selective culture conditions require activity within the cells in order to grow. Incubating the cells under conditions requiring the absence of active APRT enzyme. 35. The method of claim 34, comprising:
37、該細胞がTK酵素欠損性であり、該選択可能な遺伝子配列が活性なTK酵 素を発現し、該第1の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に活性なT K酵素が存在することを要求する条件下で該細胞をインキュベートすることから なり、該第2の選択的培養条件が、生育するためには該細胞内に活性なTK酵素 が存在しないことを要求する条件下で該細胞をインキュベートすることからなる 請求の範囲第34項の方法。37, said cell is TK enzyme deficient and said selectable gene sequence is an active TK enzyme The first selective culture conditions require active T in the cells to grow. by incubating the cells under conditions requiring the presence of the K enzyme. and the second selective culture conditions require active TK enzyme in the cells for growth. consisting of incubating said cells under conditions requiring the absence of The method of claim 34.
明細書 動物細胞および植物細胞における相同的組換え法関連出願の相互参照 本出願は米国特許出願第071537458号(1990年6月14日比願)の 一部継続出願である。Specification Cross-reference of applications related to homologous recombination in animal cells and plant cells This application is based on U.S. Patent Application No. 071537458 (filed in the Philippines on June 14, 1990). This is a partial continuation application.
発明の分野 本発明は組換えDNA技術に関し、より具体的にはキメラ動植物あるいは形質転 換動植物中の内因性遺伝子を修飾する方法に関する。さらに本発明は、本方法の 適用によって作成される動物/植物に関し、また医学および農学における本方法 の使用に関する。本発明は(米国)政府の基金によって支援されたものである。field of invention The present invention relates to recombinant DNA technology, and more specifically to chimeric animals and plants or transformation. This invention relates to a method for modifying endogenous genes in motile plants. Furthermore, the present invention provides that the method The present method in relation to animals/plants produced by application and in medicine and agriculture. Regarding the use of. This invention was supported by (US) Government funds.
(米国)政府は本発明に関して一定の権利を有する。The (US) Government has certain rights in this invention.
発明の背景 ■、キメクラ物および形質転換動物 組換えDNAおよび遺伝子技術の最近の進歩は、所望の遺伝子配列を受容動物中 に導入し、これを受容動物中で発現させることを可能とした。このような方法を 用いて、未改変の動物中に通常は存在しない遺伝子配列または未改変の動物中に 天然には存在しない遺伝子配列を保持するように、動物が加工処理されてきた。Background of the invention ■, Chimekrates and transformed animals Recent advances in recombinant DNA and gene technology have made it possible to transfer desired gene sequences into recipient animals. This made it possible to express this in recipient animals. A method like this gene sequences not normally present in unmodified animals or in unmodified animals. Animals have been engineered to carry genetic sequences that do not occur naturally.
またこれらの技術は、天然に存在する遺伝子配列の発現様式が変化した動物を作 成するためにも使用されてきた。These techniques also allow the creation of animals with altered expression patterns of naturally occurring gene sequences. It has also been used to create
これらの方法を用いることによって作成された動物は、“キメラ”動物もしくは “形質転換(トランスジェニック)”動物として知られている。“キメラ”動物 の場合、導入された遺伝子配列を含有し、これを発現する細胞はその動物の細胞 の一部に過ぎず、その他の細胞は未改変のままである。キメラ動物が導入された 遺伝子配列をその子孫に伝達する能力は、導入された遺伝子配列がその動物の生 殖細胞中に存在するかどうかに依存する。したがって、所望の遺伝子配列をその 子孫に伝え得るキメラ動物は特定のものに限られる。Animals created by using these methods are “chimeric” or Known as "transgenic" animals. “Chimera” animals In this case, the cells that contain and express the introduced gene sequence are those of that animal. The rest of the cells remain unaltered. chimeric animals were introduced The ability to transmit a gene sequence to its offspring depends on whether the introduced gene sequence is present in the animal's life. Depends on whether it is present in the reproductive cells. Therefore, the desired gene sequence can be There are only certain types of chimeric animals that can be passed on to offspring.
これとは対照的に“形質転換”動物の細胞はすべて、導入された遺伝子配列を含 有している。したがって、形質転換動物は導入された遺伝子配列をその子孫に伝 達することができる。In contrast, all cells of a “transformed” animal contain the introduced gene sequence. have. Therefore, transformed animals transmit the introduced gene sequence to their offspring. can be reached.
■、形質転換動物の作成:顕微注入(マイクロインジェクション)法形質転換動 物を作成するために最も広く用いられてきた方法には、受精卵の雄前核中へのD NA分子の注入が含まれる(Brinster、 R,L、ら、Ce1127: 223(1981) :Co5tantini、 F、ら、Nature 29 4:92(1981) :■arbers、 K、ら、Nature 293: 54O(1981) ; fagner、 E、 F、ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sc i、 (U、 S、^) 78:5016(1981) ;@Gordon、 J、 ?、ら、Pr oc、 Natl、 Acad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 73: 1260(1976))。■ Creation of transformed animals: Microinjection method Transformation The most widely used method for creating the Involves injection of NA molecules (Brinster, R, L, et al. Ce1127: 223 (1981): Co5tantini, F. et al., Nature 29 4:92 (1981):■arbers, K. et al., Nature 293: 54O (1981); fagner, E, F, et al., Proc, Natl, Acad, Sc i, (U, S, ^) 78:5016 (1981); @Gordon, J.? , et al., Pr. oc, Natl, Acad, Sci, (U, S, A,) 73: 1260 (1976)).
導入される遺伝子配列が、何らかの種類の自己複製型のプラスミドまたはウィル ス中に組込まれている必要はない(Jaenisch、 R,、5cience 、 240:1468−1474(1988))。実際、ベクターDNAの存在 は多くの場合、望ましくないことがわかっている(Hammer、 R,E、ら 、 5cience 235:53(1987) ; Chada、 K ら、 Nature 319:6W5(1986) ; K。The introduced gene sequence is a self-replicating plasmid or virus of some kind. (Jaenisch, R., 5science). , 240:1468-1474 (1988)). In fact, the presence of vector DNA is often found to be undesirable (Hammer, R.E., et al. , 5science 235:53 (1987); Chada, K. et al. Nature 319:6W5 (1986); K.
11ias、 G ら、Ce1146:89(1986) ; 5hani、 M、 、 Mo1ec、 Ce11. Biol、6:26Q4(1986) ; Cha da、 K、ら、 Nature 314:377(1985) ; Town es、 T ら、 EMBOJ、 4:1715(1985j)。11ias, G et al., Ce1146:89 (1986); 5hani, M, , Mo1ec, Ce11. Biol, 6:26Q4 (1986) ; Cha da, K. et al., Nature 314:377 (1985); Town es, T et al., EMBOJ, 4:1715 (1985j).
DNA分子は、受容受精卵中に注入された後、互いに結合し直して頭−尾コンカ テマ−(鎖状体)を形成すると考えられている。このようなコンカテマーが卵の 染色体中の任意の部位の二本鎖DNA開裂部分で生じ、このような部位中にコン カテマーが挿入され、組込まれると提唱されている(Brinster、 R, L、ら、 Proc、 Natl^cad、 Sci、 (It、 S、 A、 ) 82:443g(1985))。したがって注入されたDNA分子は受精 卵染色体内の数箇所に取り込まれ得るのであるが、はとんどの場合、観測される 挿入部位はただ1つである(Jaenisch、 R,、5cience、 2 40:1468−1474(1988) : Meade、 hll ら、米国特許4873316)。After the DNA molecules are injected into the recipient fertilized egg, they recombine with each other to form a head-to-tail concatenation. It is thought to form a temer (chain-like body). This kind of concatemer is the egg Occurs at the double-stranded DNA cleavage site at any site in the chromosome, and constructs at such sites It has been proposed that catemers are inserted and incorporated (Brinster, R. L, et al., Proc, Natl^cad, Sci, (It, S, A, ) 82:443g (1985)). Therefore, the injected DNA molecules are fertilized can be incorporated into several locations within the egg chromosome, but is most often observed There is only one insertion site (Jaenisch, R., 5science, 2 40:1468-1474 (1988): Meade, hll et al., U.S. Pat. No. 4,873,316).
DNA分子を受精卵細胞中に注入したら、その細胞を受容雌の子宮中に移植し、 動物に発育させる。その動物の細胞はすべて、移植された受精卵に由来するので 、得られる動物の細胞のすべてが(生殖系列細胞も含めて)、導入された遺伝子 配列を含有するはずである。導入された遺伝子配列が細胞のゲノムと統合する前 に最初の細胞分裂が起こる場合(これは約30%の確率で起こる)、得られる動 物はキメラ動物になるであろう。Once the DNA molecule is injected into the fertilized egg cell, the cell is implanted into the uterus of the recipient female. develop in animals. All of the animal's cells are derived from the transplanted fertilized egg. , all of the resulting animal cells (including germline cells) contain the introduced gene. It should contain the sequence. Before the introduced gene sequence integrates with the cell's genome If the first cell division occurs in (which happens about 30% of the time), the resulting dynamics Things will become chimeric animals.
このような動物を交配あるいは同系交配させることによって、異型接合および同 型接合形質転換動物を作成することが可能となっている。このような形質転換動 物の形成に関する予測不能性にもかかわらず、これらの動物が一般に安定であり 、導入された遺伝子配列を保持してこれを発現する子孫を生み出し得ることがわ かっている。By breeding or inbreeding such animals, heterozygous and homozygous It has become possible to create type-conjugated transgenic animals. Such transformation behavior Despite the unpredictability of object formation, these animals are generally stable. It has been shown that it is possible to produce offspring that retain and express the introduced gene sequence. I know.
顕微注入は注入されたDNAの受精卵のゲノムへの組み込みをもたらすが、その 過程にはその挿入部位における卵染色体のヌクレオチド配列の破壊および改変が 伴うので、注入されたDNAが挿入する部位の内因性卵遺伝子の機能の改変、破 壊、もしくは欠失をもたらすことが観察されてきた。さらに、挿入されたDNA に隣接する内因性卵配列の本質的な改変(欠失、複製、配置転換、および転位) が観察されている(Mahon、 K、 A、ら、Proc、 Natl、 A cad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 85:11U5(1988) ; Covarrubias、 Y、ら、 Proc、 Natl、Acad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 83 :6020(P986) ; M ark、 Y、ら。Microinjection results in integration of the injected DNA into the genome of the fertilized egg, but The process involves disruption and modification of the nucleotide sequence of the egg chromosome at the insertion site. Therefore, the function of the endogenous egg gene at the site where the injected DNA is inserted may be altered or destroyed. It has been observed that this results in disruption or deletion. Furthermore, the inserted DNA Substantial modifications (deletions, duplications, transpositions, and transpositions) of endogenous egg sequences adjacent to has been observed (Mahon, K., A. et al., Proc. Natl., A. cad, Sci, (U, S, A,) 85:11U5 (1988) ; Covarrubias, Y., et al., Proc., Natl., Acad. Sci, (U, S, A,) 83:6020 (P986); M ark, Y, et al.
Co1d Spr、 Harb、 Symp、 Quant、 Biol、 5 0 +453(1985))。実際、致死的な変異あるいは著しい形態学的異常 が観察されている(Jaenisch、 R,、5cience 240: 1 468−1474(1988) ; First、 N、 L、ら、 Amer 、 Meat Sci、 As5n、 39th Reciprocal Me at bonf、39:41(198 6))。Col1d Spr, Harb, Symp, Quant, Biol, 5 0+453 (1985)). In fact, lethal mutations or significant morphological abnormalities has been observed (Jaenisch, R., 5science 240:1 468-1474 (1988); First, N., L. et al., Amer , Meat Sci, As5n, 39th Reciprocal Me at bonf, 39:41 (198 6)).
意味深いことに、たとえ顕微注入されるDNA分子の所望の遺伝子配列が受容卵 のゲノム中に天然に認められるものであっても、所望の遺伝子配列の組込みがそ の天然の遺伝子の部位で起こることは稀であることが観察されている(Brin ster、 R,Lら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 ( U、 S、 A、 ) 86: 701117−7091(198X))。さら に、所望の 遺伝子配列の導入は元々存在する卵遺伝子の配列を一般には改変しない。Significantly, even if the desired genetic sequence of the microinjected DNA molecule is Even if the desired gene sequence is naturally found in the genome of It has been observed that Brin rarely occurs at the natural genetic site of ster, R, L et al., Proc, Natl, Acad, Sci, ( U, S, A, ) 86: 701117-7091 (198X)). Sara to the desired Introduction of a gene sequence generally does not alter the originally existing egg gene sequence.
注入されたDNAが最終的に組込まれる受精卵ゲノム中の部位を予め決定するこ とは不可能であるが、動物中で所望の遺伝子配列の発現が器官または組織特異的 な様式で起こるように、所望の遺伝子配列の発現を制御することは可能である( Westphal、 H,、FASEB J、 3:117(1989) : Jaenisch、 R,,5cience 240:1S6g−1474(1 98 8)に概説されている)。Determining in advance the site in the fertilized egg genome where the injected DNA will ultimately be integrated. expression of the desired gene sequence in the animal is organ- or tissue-specific. It is possible to control the expression of a desired gene sequence so that it occurs in a Westphal, H., FASEB J, 3:117 (1989): Jaenisch, R,,5science 240:1S6g-1474(1 98 8)).
形質転換動物作成の成功率はマウスが最も高い。DNAを注入して雌に移植した 受精マウス卵の約25%が形質転換動物になるであろう。現在まてのところ、ウ サギ、ヒツジ、ウシおよびブタでの成功率はこれより低い(Jaenisch、 R,、5cience 240:1468−1474(1988) : Il lammer、 R,E、ら、 J、 Animal、 Sci、63:269 i1986) : HamIIler。Mice have the highest success rate for creating transgenic animals. The DNA was injected and transplanted into a female. Approximately 25% of fertilized mouse eggs will become transgenic animals. As of now, Success rates are lower in herons, sheep, cattle and pigs (Jaenisch, R, 5science 240:1468-1474 (1988): Il lammer, R.E., et al., J. Animal, Sci. 63:269 i1986): HamIIler.
R,E、ら、 Nature 315:680(1985) : Wagner 、 T、 E ら、Theriogenology 21:Q9(1984)) 。R, E, et al. Nature 315:680 (1985): Wagner , T., E. et al., Theriogenology 21:Q9 (1984)) .
この低い成功率は、マウスが遺伝子系としてより詳細に理解されていること、あ るいは多くの家畜動物の受精卵の雄前核の可視化が困難であることの反映である う(Wagner、 T、 E ら、Theriogenology 21:2 9(1984))。This low success rate may be due to the fact that the mouse is better understood as a genetic system, This is a reflection of the difficulty in visualizing the male pronucleus in fertilized eggs of many domestic animals. (Wagner, T., E. et al., Theriogenology 21:2 9 (1984)).
したがって、DNAの顕微注入による形質転換動物の作成は少なくとも2つの主 要な欠点を有する。第1に、この方法は動物の生存過程の単細胞段階中にしか行 えない。第2に、この方法はDNAの天然の配列の破壊を必要とし、それゆえに しばしば突然変異原性あるいは催奇原性である(Gridley、 Tら、Tr ends Genet。Therefore, the creation of transgenic animals by microinjection of DNA involves at least two main approaches. It has important drawbacks. First, this method can only be performed during the single-cell stage of animal life. No. Second, this method requires disruption of the natural sequence of DNA and therefore often mutagenic or teratogenic (Gridley, T. et al., Tr. ends Genet.
3:162(1987))。3:162 (1987)).
■ キメラ動物および形質転換動物の作成・組換えウィルス法および組換えレト ロウィルス法 キメラ動物および形質転換動物を組換えウィルス技術または組換えレトロウィル ス技術を用いて作成することもできる。この技術では多細胞段階中に遺伝子配列 を動物に導入する。このような方法では、所望の遺伝子配列をウィルスまたはレ トロウィルス中に導入する。このウィルスに感染した細胞は、導入された遺伝子 配列を獲得する。このウィルスまたはレトロウィルスがその動物のすべての細胞 に感染すれば、この方法によって形質転換動物がもたらされる。しかしウィルス がその動物の細胞の一部にしか感染しない場合には、キメラ動物が作成されるこ とになる。■ Creation of chimeric animals and transformed animals, recombinant virus methods, and recombinant retrovirus methods Lovirus method Chimeric and transformed animals can be produced using recombinant virus technology or recombinant retroviruses. It can also be created using standard technology. This technique involves gene sequencing during the multicellular stage. introduced into animals. In such methods, the desired genetic sequence is transferred to a virus or Introduced into torovirus. Cells infected with this virus are infected with the introduced gene. Get array. This virus or retrovirus is present in all cells of the animal. This method produces transformed animals. but the virus Chimeric animals can be created if the virus infects only some of the animal's cells. It becomes.
ウィルスまたはレトロウィルスによる形質転換動物作成法の、非複製DNAの顕 微注入を伴う方法に対する一般的利点は、単細胞段階に遺伝子操作を行う必要が ないということである。さらに感染は、所望の細胞中にDNAを導入する極めて 効果的な方法である。Expression of non-replicating DNA in viral or retroviral transgenic animal production methods A general advantage over methods involving microinjection is that genetic manipulation does not need to be performed at the single-cell stage. That means no. Furthermore, infection is extremely difficult to introduce DNA into the desired cells. This is an effective method.
キメラ動物または形質転換動物を作成するための組換えレトロウィルス法は、レ トロウィルスが宿主のゲノムに正確な様式で統合し、(複数挿入も起こり得るも のの)一般的には、組込まれたレトロウィルスの存在が1つだけになるという利 点を有する。組込み部位における宿主染色体の配置転換は一般に微小な欠失に限 られる(Jaenisch、 R,、5cience 240:1468−14 74(1988) ; Varmus、 H,、“RNA@Tumor V iruses″(Weiss、 R,ら編、コールドスプリングハーバ−プレス 、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−)の369−512頁(1982 )をも参照のこと)。しかしながら、この方法は顕微注入と同程度に変異原性で ある。Recombinant retroviral methods for creating chimeric or transformed animals are Toroviruses integrate into the host genome in a precise manner (although multiple insertions may occur). (Nono) In general, the advantage is that there is only one integrated retrovirus. Has a point. Relocation of the host chromosome at the integration site is generally limited to small deletions. (Jaenisch, R, 5science 240:1468-14 74 (1988); Varmus, H., “RNA@Tumor V iruses'' (Weiss, R. et al., eds., Cold Spring Harbor Press) (Cold Spring Harbor, New York), pp. 369-512 (1982). ). However, this method is as mutagenic as microinjection. be.
キメラ動物は、例えば宿主動物の細胞に感染し得るウィルス(ウシパピローマウ ィルスやポリオーマなど)中に所望の遺伝子を組込むことによって作成されてき た。感染すれば、ウィルスは染色体外エピソームとして感染細胞中に維持され得 る(Elbrecht、 A、ら、 1Jolec、 Ce11. Biol、 7:1276(1987) : Lacey、 M、ら、@Nature 32 2: 609(1986) : Leopold、 P、ら、Ce1151:885( 1987))。この方法はキメラ/形質転換動物形成の変異原性を減少させるが 、この減少は、生殖系列の安定性が減少し、腫瘍原性が増大することによって起 こる。Chimeric animals can be used, for example, for viruses that can infect the cells of a host animal (bovine papilloma mouse). It is created by inserting the desired gene into a virus, polyoma, etc.). Ta. Once infected, the virus can be maintained in infected cells as extrachromosomal episomes. (Elbrecht, A. et al., 1Jolec, Ce11.Biol, 7:1276 (1987): Lacey, M. et al. @Nature 32 2: 609 (1986): Leopold, P. et al. Ce1151:885 ( 1987)). Although this method reduces the mutagenicity of chimera/transgenic animal formation, , this decrease is caused by decreased germline stability and increased tumorigenicity. Koru.
多能性胚幹細胞(“ES“細胞と呼ばれている)は、胚形成の着床後初期段階ま でに胚から得ることができる細胞である。これらの細胞は培養中で増殖させるこ とができ、試験管内で分化することもできるし、腫瘍としてマウスに移植すれば 生体内でも分化することができる。ES細胞は通常の抜型を有する(Evans 、 M、 J、ら。Pluripotent embryonic stem cells (referred to as “ES” cells) are used during the early post-implantation stages of embryogenesis. cells that can be obtained from embryos. These cells cannot be grown in culture. It can be differentiated in vitro, and if transplanted as a tumor into mice, It can also be differentiated in vivo. ES cells have a normal cutting pattern (Evans , M., J. et al.
Nature 292:154−156(1981) ; Martin、 G 、 R,ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sc堰A (U、 S、 A、 ) 78ニア634−7638(1981))。Nature 292:154-156 (1981); Martin, G. , R, et al., Proc, Natl, Acad, Sc weir A (U, S, A,) 78 Near 634-7638 (1981)).
発育中の胚の胞胚中に注入すれば、ES細胞は増殖し、分化し、したがってキメ ラ動物の創出をもたらすであろう。ES細胞はこのようなキメラ動物の体細胞系 列および生殖系列の両系列にコロニーをつくり得る(Robertson、 E 、ら、 Co1d Spring Harb、 Conf、 Ce1l Pro lif、lo:647−663(1983) ; Bradley、 A、ら、 Nat浮窒■@309:255 −256(1984) : Bradley、 A ら、 Curr、 Top 、 Devel、 Biol、 20:357−371(1X86) : Wa gner、 E。When injected into the blastula of a developing embryo, ES cells proliferate, differentiate, and thus It will bring about the creation of la animals. ES cells are the somatic cell system of such chimeric animals. can colonize both the column and germline (Robertson, E. , et al., Co1d Spring Harb, Conf, Ce1l Pro lif, lo: 647-663 (1983); Bradley, A. et al. Nat buoyancy ■@309:255 -256 (1984): Bradley, A. et al., Curr, Top , Devel, Biol, 20:357-371 (1X86): Wa gner, E.
F、ら、Co1d Spring Harb、 Symp、 Quant、 B iol、 50:691−700(1985) ;これらの■■■ すべて本明細書の一部を構成する)。F, et al., Cold Spring Harb, Symp, Quant, B iol, 50:691-700 (1985); these ■■■ (all of which are incorporated herein by reference).
この方法では、ES細胞を試験管内で培養し、興味ある遺伝子配列を含有するウ ィルスベクターまたはレトロウィルスベクターに感染させる。レトロウィルスベ クターを用いて作成したキメラ動物は、導入した遺伝子配列が欠失した生殖細胞 か、あるいは導入した配列を含有するが、導入した配列を発現し得る子孫細胞を 生み出す能力が欠失した生殖細胞を有することがわかっている(Evas、 M 、 J、ら、ColdSpring Harb、 Symp、 Quant、 BioL 50:685−689(1985) : 5tevart、 CCL 、ら、EMBO1 4:3701−3709(1985) ; Robertson、 L、ら、N ature (1986) ;これらの文献は本明細書の一部を構成する)。In this method, ES cells are cultured in vitro, and cells containing the gene sequence of interest are grown. infection with viral or retroviral vectors. retro virus vector Chimeric animals created using vectors are germ cells in which the introduced gene sequence has been deleted. or alternatively, generate progeny cells that contain the introduced sequences but are capable of expressing the introduced sequences. It is known that they have germ cells lacking the ability to produce (Evas, M. , J, et al., ColdSpring Harb, Symp, Quant, BioL 50:685-689 (1985): 5tevart, CCL , et al. EMBO1 4:3701-3709 (1985); Robertson, L., et al., N. (1986); these documents constitute a part of this specification).
ES細胞は試験管内で増殖し得るので、体細胞遺伝学の技術を用いてこのような 細胞を操作することが可能である。したがって、(例えばヒポキサンチンホスホ リボンルトランスフエラーゼをコード化しているhprt遺伝子中などに)突然 変異を保持するES細胞を選択することが可能である(Booper、 Mら、 Nature 326:292−295(1987) ; Kuehn、 M、 Rら、Nature 326:295−298(1987))。次いで、この ■ うに選択された細胞を用いることによって、活性なHPRT酵素を発現し得ない キメラマウスまたは形質転換マウスを作成することができ、したがって、(例え ばHPRT欠損を特徴とするリーンユ・ナイハン症候群などの)疾患の動物モデ ルが得られる(Doetschman、 Tら、 Proc、 Natl、 A cad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 85 :8T83−8587( 19 88))。Since ES cells can be grown in vitro, somatic cell genetics techniques can be used to It is possible to manipulate cells. Therefore, (e.g. hypoxanthine phospho (e.g. in the hprt gene, which encodes ribbon letransferase) It is possible to select ES cells that retain mutations (Booper, M et al. Nature 326:292-295 (1987); Kuehhn, M. R et al., Nature 326:295-298 (1987)). Then this ■ By using cells selected in such a way that they cannot express active HPRT enzymes. Chimeric or transgenic mice can therefore be created (e.g. animal models of diseases (such as Leanyu-Nyhan syndrome, which is characterized by HPRT deficiency). (Doetschman, T. et al., Proc. Natl., A. cad, Sci, (U, S, A,) 85:8T83-8587( 19 88)).
上述のように、(導入された遺伝子配列を含有する生殖系列細胞を有する)キメ ラ動物から同系交配によって形質転換動物を作成することが可能である。As mentioned above, the texture (with germline cells containing the introduced gene sequence) It is possible to create transgenic animals from La animals by inbreeding.
上述の方法は、トランスフェクトされたES細胞を胞胚中に導入する前に、所望 の遺伝子改変についてスクリーニングすることを可能にする。しかしながら、こ れらの方法の1つの欠点は、ベクターの組込みの部位あるいは性質を制御し得な いことである。The above-described method requires that the desired This makes it possible to screen for genetic modifications. However, this One drawback of these methods is that the site or nature of vector integration cannot be controlled. That's a good thing.
■ キメラ動物および形質転換動物の作製 プラスミド法上述のキメラ動物およ び形質転換動物作成方法には本質的な欠点があるので、研究者はこのような動物 を作成し得る別の方法を同定しようと試みてきた。■ Production of chimeric animals and transformed animals Plasmid method The above chimeric animals and There are inherent shortcomings in the methods used to create transgenic and transgenic animals, making it difficult for researchers to We have attempted to identify other ways in which the .
例えばGossl、er、 Aらは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの 遺伝子(nptII遺伝子)を含有するように修飾したプラスミドベクターの使 用による培養ES細胞のトランスフェクションについて記述している。nptI I遺伝子の存在は、このプラスミドに感染したES細胞に抗生物質G418に対 する耐性を付与した(Gossler、 A、ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 (U、 S、^、) 83:9065−9069(P9 86) ;この文 献は本明細書の一部を構成する)。上記のプラスミドを受容し、G418に対し て耐性となったキメラ動物は、このベクターをその染色体中に組込んでいること がわかった。Takahashi、 Y、らは、プラスミドを使用して、トリの クリスタリン遺伝子を発現するキメラマウス細胞を作成したことを記述している (Development 102:258−269(1988) ;この文献 は本明細書の一部を構成する)。このトリ遺伝子はnptII遺伝子を含有する プラスミド中に組込まれた。得られたキメラ動物は上記トリ遺伝子を発現するこ とがわかった。For example, Gossl, er, A et al. Use of a plasmid vector modified to contain the gene (nptII gene) describes the transfection of cultured ES cells using nptI The presence of the I gene makes ES cells infected with this plasmid resistant to the antibiotic G418. conferred resistance to (Gossler, A., et al., Proc., Natl. Acad, Sci, (U, S, ^,) 83:9065-9069 (P9 86) ;This sentence (Contributions are incorporated herein by reference). received the above plasmid and directed against G418. Chimeric animals that have become resistant to this vector have integrated this vector into their chromosomes. I understand. Takahashi, Y., et al. used plasmids to develop avian Describes the creation of chimeric mouse cells that express the crystallin gene. (Development 102:258-269 (1988); this document constitutes a part of this specification). This avian gene contains the nptII gene integrated into a plasmid. The obtained chimeric animal is capable of expressing the above avian gene. I found out.
■、遺伝子配列の体細胞への導入 DNAを体細胞中に導入することによって様々な細胞系が作成されてきた。原o mat、cell Genet、 5:1031−1044(1979))。F olgerらは、培養されだ哺乳動物細胞の核中に顕微注入されたチミジンキナ ーゼ遺伝子(tk遺伝子)の運命を調べた。■ Introduction of gene sequence into somatic cells Various cell lines have been created by introducing DNA into somatic cells. Hara o Mat, Cell Genet, 5:1031-1044 (1979)). F Olger et al. reported that thymidinequina was microinjected into the nucleus of cultured mammalian cells. The fate of the tkase gene (tk gene) was investigated.
受容細胞は、その細胞ゲノムの1または数カ所でコンカテマーとして組込まれた 、導入した遺伝子配列の1ないし100コピーを含有することがわかった(Fo lger。The recipient cell has integrated concatemers at one or several locations in its genome. was found to contain 1 to 100 copies of the introduced gene sequence (Fo lger.
KRら、Mo1ec、Ce11.Biol、 2:1372−1387(198 2))。シリアンハムスター細胞中にRNAポリメラーシー遺伝子をDNAを介 して導入したことも報告されている(Ingles、 Cら、Mo1ec、Ce 11.Biol、2:666−673(1982))。KR et al., Molec, Ce11. Biol, 2:1372-1387 (198 2)). Introducing the RNA polymerase gene into Syrian hamster cells via DNA. It has also been reported that the introduction of 11. Biol, 2:666-673 (1982)).
宿主にネオマイシン耐性およびグアノシンホスホトランスフェラーゼ活性を付与 するプラスミドでチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクトするこト ニヨリ新規細胞系が作成されティる(Robson、 C,Nら、 Mutat 、 Res、 163:201−208(1986))。Confers neomycin resistance and guanosine phosphotransferase activity to the host Transfecting Chinese hamster ovary cells with a plasmid that New cell lines have been created (Robson, C, N et al., Mutat , Res, 163:201-208 (1986)).
■、キメクラ物または形質転換動物 近江、植物細胞の遺伝学および遺伝子技術の分野は著しい進展を遂げた。多くの 属の植物について、プロトプラスト再生技術を用いることによって単一細胞から 植物を再生させることができる(Friedt、 fら、Prog、Botan y 49:192−215(1987); Brunold、 Cら、 Mo1 ec、 Gen、 Genet、 208 :469−473(1987) ; Durand、 i、ら、Plant 5ci 62:263−272(1989) ;これらの文献は本明細書の一部を構成す る)。■ Chimecula or transformed animals In Omi, the field of plant cell genetics and gene technology has made significant progress. many from single cells by using protoplast regeneration techniques for plants of the genus Plants can be regenerated (Friedt, et al., Prog, Botan y 49:192-215 (1987); Brunold, C et al., Mo1 ec, Gen, Genet, 208:469-473 (1987); Durand, i, et al. Plant 5ci 62:263-272 (1989); these documents constitute a part of this specification. ).
外来遺伝子を植物細胞中に送達しこれを発現させるためにはいくつかの方法をT ら、 J、 Bacteriol、 166:8g−94(1986) : C zako、 M、ら、 Plant Mo1. BiolA 6 + 101− 109(19 86) ; Jones、 J、 D、 G、ら、EMBOJ、 4:2411 −2418(1985) ; 5hahin、 E、A、らA Theor、 Appl、 G enet、 73:164−169(1986))。形質転換の頻度は70%程 にもなり得、使用する植物の型に依存する(Friedt、 f、ら、 Pro g、 Botany 49:192−215(1987))。Several methods are available for delivering and expressing foreign genes into plant cells. et al., J. Bacteriol, 166:8g-94 (1986): C zako, M, et al., Plant Mo1. BiolA 6 + 101- 109 (19 86); Jones, J., D., G. et al., EMBOJ, 4:2411 -2418 (1985); 5hahin, E, A, et al. Theor, Appl, G enet, 73:164-169 (1986)). The frequency of transformation is about 70% depending on the type of plant used (Friedt, et al., Pro g, Botany 49:192-215 (1987)).
植物ウィルスも、植物への外来遺伝子送達および植物中での外来遺伝子発現用の ベクターとして探索されてきた。カリフラワーモザイクウィルス(Brisso n、 Nら、Nature 310:511−514(1984))はこの目的 にとって特に有用となっている(Shah。Plant viruses are also used for foreign gene delivery to and expression of foreign genes in plants. It has been explored as a vector. Cauliflower mosaic virus (Brisso) N, N et al., Nature 310:511-514 (1984)) for this purpose. It has become particularly useful for (Shah.
D、ll ら、 5cience 233:47g−481(1986) : Shevmaker、 C,K、ら、Virol、 140F281−288( 198 5))。RNAウィルスの誘導体からもベクターが作成されている(Frenc h、 R,ら、5cience 231:1294−1297(1986))。D, ll et al., 5science 233:47g-481 (1986): Shevmaker, C.K., et al., Virol, 140F281-288 ( 198 5)). Vectors have also been created from derivatives of RNA viruses (French et al. h, R, et al., 5science 231:1294-1297 (1986)).
顕微注入の技術(Crossvay、 Aら、 Mo1ec、 Gen、 Ge net、 202:179−185(1986) : Po狽窒凾■ us、 1.ら、 Mo1ec、 Gen、 Genet、 199: 169 −177(1985))を用いて、植物細胞への遺伝子配列の直接移入が達成さ れている。部位特異的組換えが可能なプラスミドによる形質転換を用いてコウジ カビ属への遺伝子配列導入が行われている(May、 G、 S、 、 J、 Ce11 Biol、 109:2267−2274(1989) ;この文献 は本明細書の一部を構成する)。Microinjection techniques (Crossvay, A et al., Molec, Gen, Ge net, 202:179-185 (1986): Po us, 1. et al., Molec, Gen, Genet, 199: 169 -177 (1985)), direct transfer of gene sequences into plant cells was achieved. It is. Koji using transformation with a plasmid capable of site-specific recombination. Gene sequences have been introduced into the fungal genus (May, G., S., J. Ce11 Biol, 109:2267-2274 (1989); this document constitutes a part of this specification).
エレクトロポレーション(電気穿孔法)は植物細胞にDNAを導入する方法とし て認識されている(Fromva、 M、 Eら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 82 :T824−5828 (1 985) ; Fromm、 M、 E ら、 Nature 319ニア9l −793(1986) : Morikawa、 Hら、G■獅■@41:12 1−1 24(1986) ; Langridge、 f、 H,R,ら、 Theo r、 Appl、 Genet、 67 :443−455i1984))。Electroporation is a method of introducing DNA into plant cells. (Fromva, M, E et al., Proc, Natl, Acad, Sci, (U, S, A,) 82: T824-5828 (1 985); Fromm, M, E et al., Nature 319 Near 9l -793 (1986): Morikawa, H et al., G■shi■@41:12 1-1 24 (1986); Langridge, f., H.R., et al., Theo r, Appl, Genet, 67:443-455i1984)).
転位因子を用いて植物細胞中に著しい遺伝子突然変異を作成することができる( Saedler、 K ら、 EMBOJ、 4 :585−590(1985 ) ; Peterson、 P、 A、 、 BioE唐唐≠凾刀@3:19 9−204(1 985))cこのような因子は染色体の配置転換、挿入、重複、欠失などを引き 起こし得る。上述の手法を用いることによって、このような細胞からキメラ植物 を再生させることができる。Significant genetic mutations can be created in plant cells using transposable elements ( Saedler, K. et al., EMBOJ, 4:585-590 (1985 ) ; Peterson, P, A, , BioE Tang Tang≠Katou@3:19 9-204 (1 985))c Such factors cause chromosomal rearrangements, insertions, duplications, deletions, etc. It can happen. Chimeric plants can be generated from such cells by using the techniques described above. can be played.
植物の遺伝子操作に関する現在の方法の主要な欠陥は、所望の組換え細胞を選択 することの困難さである(Bruaold、 C,ら、 Mo1ec、 Gen 、 Genet、 208:469−473(1987)j。A major flaw in current methods for plant genetic engineering is the selection of the desired recombinant cells. (Bruaold, C. et al., Molec, Gen. , Genet, 208:469-473 (1987)j.
この欠陥と取り組む試みとして、カンマイシン耐性および硝酸塩レダクターゼ欠 損が選択可能なマーカー(標識)として使用されている(Brunold、 C ,ら、 Mo1ec、 GenGenet、 208+469−473(198 7))。In an attempt to address this defect, kammycin resistance and nitrate reductase deficiency DNA loss is used as a selectable marker (Brunold, C. , et al., Molec, GenGenet, 208+469-473 (198 7)).
■、結論 上述の技術の応用は、古典的な遺伝学では作成され得ない型の植物および動物を 作成する潜在的能力を有する。例えば、ヒトの疾患(例えばAIDS、糖尿病、 癌など)に冒された動物であって、そのような疾患の療法の解明に有効であろう 動物を作成することができる。キメラ動植物および形質転換動植物は天然の遺伝 子発現のプローブ(精査手段)として重要な用途を有する。これらの技術を家畜 および食糧作物に適用すれば、これらの技術は改善された食物や繊維などを与え る潜在的能力を有する。■、Conclusion Application of the techniques described above has led to the creation of types of plants and animals that cannot be created using classical genetics. have the potential to create. For example, human diseases (e.g. AIDS, diabetes, animals affected by diseases such as cancer, which may be useful in elucidating treatments for such diseases. You can create animals. Chimeric and transformed animals and plants are natural genetic It has important uses as a probe (examination tool) for child expression. Livestock using these techniques and when applied to food crops, these techniques can provide improved food, fiber, etc. has the potential to
上述の技術の成功にもかかわらず、より変異原性が低く、特定の染色体位置にけ る挿入遺伝子配列の明確で特異的で精密な操作を可能にするキメラ動植物作成法 または形質転換動植物作成法が強く望まれる。Despite the success of the above-mentioned techniques, less mutagenic and specific chromosomal locations A method for creating chimeric animals and plants that enables clear, specific, and precise manipulation of inserted gene sequences. Alternatively, a method for producing transformed animals and plants is strongly desired.
図面の簡単な説明 図1は遺伝子標的法における置換ベクターおよび挿入ベクターの使用を表す。Brief description of the drawing FIG. 1 depicts the use of replacement and insertion vectors in gene targeting methods.
図IAは遺伝子標的法における置換遺伝子の使用に関する模式的表現であり、図 IBは所望の遺伝子配列中に微細な突然変異を作成するための挿入ベクターの使 用を表す。Figure IA is a schematic representation of the use of replacement genes in gene targeting methods; IB is the use of insertion vectors to create minute mutations in the desired gene sequence. Represents business.
図2は、意図した挿入部位に位置する異種構造領域を有するDNA分子の模式的 表現である。図2Aは2kbの異種構造領域を伴う構築物を表す。図2Bは、異 種構造領域の中央で直線化された26塩基長の異種構造領域を伴う構築物を表す 。Figure 2 shows a schematic diagram of a DNA molecule with a heterologous structural region located at the intended insertion site. It is an expression. Figure 2A represents a construct with a 2kb heterologous region. Figure 2B shows the difference Represents a construct with a 26 base long heterologous region linearized in the middle of the seed structure region .
図20は、その位置での組換えを望む相同領域の内部に位置する異種構造領域を 伴う構築物を表す。図20において、ベクターの正常なりamHI部位はNhe 1部位に変換されており、ベクターの正常なEcoRI部位はBamH1部位に 変換されている。このベクターはXhoIによって直線化される。Figure 20 shows the heterologous structural region located within the homologous region at which recombination is desired. represents the associated construct. In Figure 20, the normal amHI site of the vector is Nhe The vector's normal EcoRI site has been converted to a BamH1 site. has been converted. This vector is linearized with XhoI.
図3は、′擬人化した“遺伝子を一段階法で染色体遺伝子配列中に導入し得る機 構の模式的表現である。Figure 3 shows the mechanism by which ``anthropomorphic'' genes can be introduced into chromosomal gene sequences in a one-step process. This is a schematic representation of the structure.
図4は、大きい遺伝子を、その遺伝子が異種構造プロモーターの転写制御下に置 かれるように(例えば、ヒト遺伝子がマウス遺伝子の制御下に置かれるように) 染色体遺伝子配列中に導入し得る機構の模式的表現である。第1段階は付加的事 象であり、第2段階は置換的事象である。図4Aはこの過程の第1段階を示し、 図4Bはこの過程の第2段階を示す。所望により、マウスのコードエクソンのす べてが除去されるように修復組換え事象を構成させることができる。Figure 4 shows how a large gene is placed under the transcriptional control of a heterologous promoter. (e.g., so that human genes are placed under the control of mouse genes) Schematic representation of mechanisms that can be introduced into chromosomal gene sequences. The first stage is additional The second stage is a substitutional event. Figure 4A shows the first stage of this process; Figure 4B shows the second stage of this process. If desired, all mouse code exons are included. A repair recombination event can be configured such that all are removed.
図5は、染色体中に微細な突然変異を導入するための陽性選択/陰性選択“カセ ット″の使用を模式的に表現するものである。Figure 5 shows the positive selection/negative selection “cassette” for introducing small mutations into chromosomes. This is a schematic representation of the use of ``cut''.
図6は、小さいまたは大きい所望の遺伝子配列(複数)を細胞ゲノムの連続する 領域中に導入するための多段階法(図6A〜6E)を模式的に表現するものであ る。Figure 6 shows the sequence of small or large desired gene sequences in the cell genome. This is a schematic representation of the multi-step method (Figures 6A to 6E) for introduction into the domain. Ru.
この図は、大きい遺伝子座を構築するための重複(オーバーラッピング)クロー ンの連続的付加を容易にし得るベクターを例示している。各段階は選択可能であ る。This diagram shows overlapping clones for building large loci. 2 illustrates a vector that can facilitate sequential addition of molecules. Each stage is selectable. Ru.
第4段階および第5段階を必要な回数だけ繰り返し、HAT培地中で挿入につい て選択し、6−チオグアニンを補足した培地中で修復について選択することによ って、さらなる付加を行うことができる。必要であれば、この遺伝子座の他端で この手法を達成することもできる。Repeat steps 4 and 5 as many times as necessary to prepare the inserts in HAT medium. by selecting for repair in medium supplemented with 6-thioguanine. Further additions can be made. If necessary, at the other end of this locus This approach can also be achieved.
ン実験で使用するベクターの模式的表現である。This is a schematic representation of the vector used in this experiment.
図8は、I V6.8ベクターの相同的組換え後のhprt遺伝子の予期される 構造を表す。HRはこの相同的組換え事象の指標となる予想サイズの断片である 。Figure 8 shows the expected hprt gene after homologous recombination of the IV6.8 vector. Represents a structure. HR is a fragment of the expected size indicative of this homologous recombination event. .
End、Dは、この組換え事象によって重複される内因性断片である。Endは 、これらの実験で使用する部分的cDNAプローブによって検出される予想隣接 断片である。End, D is the endogenous fragment that is duplicated by this recombination event. End is , the expected neighbors detected by the partial cDNA probes used in these experiments. It is a fragment.
図9は、挿入ベクターによって生じる相同的組換え体の復帰を示す。Figure 9 shows the reversion of homologous recombinants generated by the insertion vector.
図10は、相同的組換え事象を選択するための手段としてのポリA選択の使用を 表す。Figure 10 shows the use of polyA selection as a means to select for homologous recombination events. represent.
図11は、ある細胞の所望の遺伝子の配列中に挿入物を導入するための本発明の 使用を表す。図11Aは、関連する制限部位を示したc−src遺伝子座の模式 図である(E =EcoRI ; N=NcoI ; X=XhoI : H= HindIエエ:B=BamH1; Nh=Nhel )。図11Bはc−s r c遺伝子座中に突然変異を導入するために使用する5rc14ベクターを表 し、図11cはこのベクターの使用によって導入される微細な突然変異を表す。FIG. 11 shows the method of the present invention for introducing an insert into the sequence of a desired gene in a cell. Represents use. Figure 11A is a schematic of the c-src locus showing relevant restriction sites. It is a diagram (E = EcoRI; N = NcoI; X = XhoI: H = HindI: B=BamH1; Nh=Nhel). Figure 11B is c-s 5rc14 vector used to introduce mutations into the rc locus However, Figure 11c depicts the subtle mutations introduced by the use of this vector.
図12は、ある細胞の所望の遺伝子の配列中に置換を導入するための本発明の使 用を表す。図12Aは関連する制限部位を示したc−s r c遺伝子座の模式 図である(E−EcoRI ;N=NcoI :X=Xhol ;H=Hind Iエエ;B=Ba+*HI:Nh=Nhel)。図12Bはc−s r c遺伝 子座中に突然変異を導入するために使用する5rc33ベクターを表し、図12 Cはこのベクターの使用によって導 ・入される微細な突然変異を表す。Figure 12 illustrates the use of the present invention to introduce substitutions into the sequence of a desired gene in a cell. Represents business. Figure 12A is a schematic of the c-src locus showing the relevant restriction sites. (E-EcoRI; N=NcoI: X=Xhol; H=Hind B=Ba+*HI:Nh=Nhel). Figure 12B shows c-src inheritance Figure 12 represents the 5rc33 vector used to introduce mutations into the child locus. C represents a minute mutation introduced/introduced by use of this vector.
図13は、標的組換え事象とランダム組換え事象の比較を表す。ランダム組換え 事象ではコンカテマーが重複物を切除できるが、ベクターの1コピーはゲノム中 に残らなくてはならない。対照的に標的組換え事象では、所望の配列を除くすべ ての配列がゲノムから切除される。Figure 13 depicts a comparison of targeted and random recombination events. random recombination In this event, concatemers can excise the duplicate, but one copy of the vector remains in the genome. must remain in In contrast, a targeted recombination event involves all steps to remove the desired sequence. all sequences are excised from the genome.
発明の要約 本発明は、予め規定された特異的な所望の改変をそのゲノム中に含有する所望の 動物細胞または非菌類植物細胞を得る方法を提供する。また本発明はこのような 細胞から生産され得るヒト以外の動植物に関する。さらに本発明はこのようなヒ ト以外の動植物およびそれらの子孫の研究、医薬および農業における使用に関す る。Summary of the invention The present invention provides a method for preparing a desired protein containing a predefined specific desired modification in its genome. Methods of obtaining animal cells or non-fungal plant cells are provided. Moreover, the present invention Relates to non-human animals and plants that can be produced from cells. Furthermore, the present invention Regarding the use of plants and animals other than humans and their descendants in research, medicine, and agriculture. Ru.
詳述すると、本発明は、細胞のゲノムの予定した遺伝子配列内に挿入された所望 の選択不可能な遺伝子配列を含有する所望の動物細胞または非菌類植物細胞を得 る方法であって、 A、所望の選択不可能な遺伝子配列を含有するDNA分子であって、かつ、所望 の遺伝子配列に前駆体細胞のゲノムの予定した遺伝子配列との相同的組換えを受 けさせるに足る、所望の遺伝子配列に隣接する2つの相同領域をさらに含有する DNA分子、と共に前駆体細胞をインキュベートし、B、DNA分子の前駆体細 胞中への導入を引き起こし、C6導入されたDNA分子に前駆体細胞のゲノムの 予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせることによって、所望の選択不 可能な遺伝子配列が予定の遺伝子配列中に挿入されている所望の細胞を作成し、 D 所望の細胞を回収する、 ことからなる方法を提供する。Specifically, the present invention provides a method for detecting a desired gene sequence inserted within a predetermined gene sequence of the genome of a cell. Obtain the desired animal or non-fungal plant cell containing the non-selectable gene sequence of A method of A, a DNA molecule containing a desired non-selectable gene sequence and a desired non-selectable gene sequence; undergoes homologous recombination with the expected gene sequence in the genome of the progenitor cell. further contains two homologous regions adjacent to the desired gene sequence sufficient to B. incubating the precursor cell with the DNA molecule; C6 introduces the introduced DNA molecules into the precursor cell genome. A desired selection defect is achieved by homologous recombination with a planned gene sequence. create a desired cell in which a possible gene sequence is inserted into the intended gene sequence; D. Collecting desired cells; Provides a method consisting of:
さらに本発明は、DNA分子が検出可能なマーカー遺伝子配列を含有し、かつ/ または、前駆体細胞とDNA分子をエレクトロポレーションにかけることによっ てDNA分子を前駆体細胞中に導入する(特にB段階において、前駆体細胞を検 出可能なマーカー遺伝子配列を含有する第2のDNA分子と共に同時にエレクト ロポレーションにかける)上述の方法の態様を包含する。Furthermore, the present invention provides that the DNA molecule contains a detectable marker gene sequence and/or Alternatively, by electroporating precursor cells and DNA molecules. DNA molecules are introduced into progenitor cells (particularly in step B, progenitor cells are detected). simultaneously with a second DNA molecule containing a marker gene sequence that can be roporation).
さらに本発明は、所望の細胞が菌類以外の植物細胞、体動物細胞(特にニワトリ 、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまた は雄ウシ、ヒト以外の霊長類、およびヒトからなる群から選択されるもの)、多 能性動物細胞(特にニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、 ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、およびヒト以外の霊長類からなる群から 選択されるもの)である上述の方法の態様を包含する。本発明は多能性細胞が体 幹細胞である態様を包含する。Furthermore, the present invention provides that the desired cells are plant cells other than fungi, somatic animal cells (particularly chicken , mouse, rat, hamster, rabbit, sheep, goat, fish, pig, cow or selected from the group consisting of bulls, non-human primates, and humans); Competent animal cells (especially chicken, mouse, rat, hamster, rabbit, sheep, From the group consisting of goats, fish, pigs, cows or bulls, and non-human primates (selected ones)). The present invention allows pluripotent cells to Includes embodiments that are stem cells.
また本発明は、所望の遺伝子配列が前駆体細胞の予定した遺伝子配列と本質的に 相同であり、かつ/または、所望の遺伝子配列が前駆体細胞の予定した配列の類 縁体(特にヒト類縁体)である上述の方法の態様を包含する。Further, the present invention provides that the desired gene sequence is essentially the same as the predetermined gene sequence of the precursor cell. homologous and/or the desired gene sequence is similar to the predetermined sequence of the progenitor cell. Embodiments of the above-described methods that are analogues (particularly human analogues) are included.
また本発明は、所望の遺伝子配列がホルモン、免疫グロブリン、レセプター(受 容体)分子、レセプター分子の配位子、および酵素からなる群から選択されるタ ンパク質をコード化している態様をも包含する。In addition, the present invention provides that a desired gene sequence is used for hormones, immunoglobulins, receptors. receptor molecules, ligands of receptor molecules, and enzymes. It also includes embodiments encoding proteins.
また本発明は、所望の遺伝子配列を含む導入された組換えDNA分子を含有する 非菌類植物細胞であって、その所望の遺伝子配列に該細胞のゲノムの予定した遺 伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る相同領域が該所望の遺伝子配列に 隣接している植物細胞をも包含する。The present invention also includes an introduced recombinant DNA molecule containing the desired gene sequence. a non-fungal plant cell, the desired gene sequence of which contains a predetermined gene sequence of the cell's genome; The desired gene sequence has enough homologous regions to undergo homologous recombination with the gene sequence. Also includes adjacent plant cells.
また本発明は、所望の遺伝子配列を含む導入された組換えDNA分子を含有する ヒト以外の動物細胞であって、その所望の遺伝子配列に該細胞のゲノムの予定し た遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る相同領域が該所望の遺伝子配 列に隣接している動物細胞をも包含する。The present invention also includes an introduced recombinant DNA molecule containing the desired gene sequence. A non-human animal cell, the desired gene sequence of which is present in the genome of the cell. The desired gene sequence has enough homologous regions to undergo homologous recombination with the desired gene sequence. It also includes animal cells that are adjacent to the column.
また本発明は、上述の方法のいずれかで作成される所望の細胞をも包含する。The invention also encompasses desired cells produced by any of the methods described above.
また本発明は、上記所望の細胞またはその子孫から誘導される細胞を含有する、 キメラ動物もしくは形質転換動物であるヒト以外の動物をも包含し、特に、ヒト 以外の動物および所望の細胞が同じ種に属し、その種がニワトリ、マウス、ラッ ト、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、およ びヒト以外の霊長類からなる群から選択される態様を包含する。The present invention also includes cells derived from the desired cells or their progeny. It also includes non-human animals that are chimeric or transformed animals, and in particular humans other animals and the desired cells belong to the same species, and the species is chicken, mouse, rat, etc. animals, hamsters, rabbits, sheep, goats, fish, pigs, cows or bulls, and and non-human primates.
また本発明は、上記所望の非菌類植物細胞から誘導される細胞を含有する、キメ ラ植物もしくは形質転換植物である非菌類植物をも包含する。The present invention also provides textured cells containing cells derived from the desired non-fungal plant cells. It also includes non-fungal plants that are plants or transformed plants.
また本発明は、遺伝子治療を必要とする受容者に所望の選択不可能な遺伝子配列 を導入することからなる遺伝子治療の方法であって、A、所望の選択不可能な遺 伝子配列を含有するDNA分子であって、かつ、所望の遺伝子配列に受容者の前 駆体細胞中に存在する予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る 、所望の遺伝子に隣接する2つの相同領域をさらに含有するDNA分子、の有効 量を受容者に与え、B、該DNA分子の前駆体細胞中への導入を可能にし、C9 導入されたDNA分子に前駆体細胞との相同的組換えを受けさせることによって 、所望の選択不可能な遺伝子配列が予定した遺伝子配列中に挿入されている所望 の細胞を作成する、 ことからなり、受容者の細胞中の導入された遺伝子配列の存在または発現が遺伝 子療法を構成する方法を包含する。The present invention also provides a method for providing a desired non-selectable gene sequence to a recipient in need of gene therapy. A method of gene therapy comprising introducing A. a desired unselectable gene; A DNA molecule containing a genetic sequence, and in which the desired genetic sequence is present in the recipient. sufficient to undergo homologous recombination with the intended gene sequence present in the progenitor cell. , a DNA molecule that further contains two homologous regions flanking the desired gene. amount of C9 to the recipient, B. allowing the introduction of said DNA molecule into the precursor cell; By causing the introduced DNA molecule to undergo homologous recombination with the precursor cell , the desired non-selectable gene sequence is inserted into the predetermined gene sequence. create cells of This means that the presence or expression of the introduced gene sequence in the cells of the recipient is inheritable. Includes methods of structuring child therapy.
具体的には、本発明は、受容者が非菌類植物またはヒトあるいはヒト以外の動物 (具体的にはニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、 魚、ブタ、雌ウシまたは雄ウシ、ヒト以外の霊長類およびヒトからなる群から選 択されるヒト以外の動物)である上述の方法の態様を包含する。Specifically, the invention provides that the recipient is a non-fungal plant or a human or non-human animal. (Specifically chicken, mouse, rat, hamster, rabbit, sheep, goat, Selected from the group consisting of fish, pigs, cows or bulls, non-human primates and humans. Embodiments of the above-described method include embodiments of the above-described method in which a non-human animal is selected.
また本発明は、その細胞のゲノムの予め決定した遺伝子配列内に挿入された所望 の選択不可能な遺伝子配列を含有する所望の動物細胞または菌類以外の植物細胞 を得る方法であって、 A、前駆体細胞を非選択的培養条件下または第1の選択的培養条件下で次のi) およびif)の遺伝子配列を含有するDNA分子と共に培養し、[i)所望の選 択不可能な遺伝子配列(ここに上記DNA分子はさらに、所望の遺伝子配列に前 駆体細胞のゲノムの予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるに足る、 所望の遺伝子配列に隣接する2つの相同領域を含有する)、および、 it)選択可能な遺伝子配列であって、前駆体細胞におけるその存在または発現 を、第1の選択的培養条件下で該細胞を培養することによって選択することがで き、かつ、前駆体細胞におけるその存在または発現を、第2の選択的培養条件下 で該細胞を培養することによって否定的に選択することができる遺伝子配列]B 、該DNA分子の該前駆体細胞中への導入を可能にし、C1導入されたDNA分 子に前駆体細胞のゲノムの予定した遺伝子配列との相同的組換えを受けさせるこ とによって、所望の選択不可能な遺伝子配列が予定した遺伝子配列中に挿入され ている所望の細胞を作成し、D、第1の選択的培養条件下で該細胞を培養し、次 いで非選択的培養条件下で該細胞に染色体内組換えを受けさせ、次いで第2の選 択的培養条件下で該細胞をインキュベートすることによって、所望の細胞を回収 する、ことからなる方法を提供する。The present invention also provides for the insertion of a desired gene sequence into a predetermined gene sequence of the genome of the cell. a desired animal cell or non-fungal plant cell containing a non-selectable gene sequence of A method of obtaining A, Progenitor cells were subjected to the following i) under non-selective culture conditions or under first selective culture conditions: and if) a DNA molecule containing the gene sequence of [i) the desired selection. unselectable gene sequence (where the above DNA molecule is further sufficient to cause homologous recombination with the intended gene sequence in the genome of the progenitor cell, containing two homologous regions flanking the desired gene sequence), and it) a selectable gene sequence, the presence or expression of which in a progenitor cell; can be selected by culturing the cells under first selective culture conditions. and its presence or expression in the progenitor cells is determined under second selective culture conditions. Gene sequences that can be negatively selected by culturing the cells with]B , allows the introduction of the DNA molecule into the precursor cell, and allows the introduction of the DNA molecule into the precursor cell. Allowing the offspring to undergo homologous recombination with the desired gene sequence in the genome of the progenitor cell. The desired non-selectable gene sequence is inserted into the predetermined gene sequence by D. Cultivate the cells under the first selective culture conditions; The cells are allowed to undergo intrachromosomal recombination under non-selective culture conditions, followed by a second selection. Harvest the desired cells by incubating the cells under selective culture conditions Provide a method consisting of:
本発明は、細胞がHPRT、APRTまたはTK酵素欠損性であり、かつ、選択 可能な遺伝子配列が活性なHPRT、APRTまたはTK酵素を発現し、がっ、 第1の選択的培養条件が、生育のためには活性なHPRT、APRTまたはTK 酵素が細胞内に存在することを必要とする条件下で細胞をインキュベートするこ とからなり、かつ、第2の選択的培養条件が、生育のためには活性なHPRT。The present invention provides that the cells are HPRT, APRT or TK enzyme deficient and Possible gene sequences express active HPRT, APRT or TK enzymes, The first selective culture conditions are active HPRT, APRT or TK for growth. Incubating cells under conditions that require the enzyme to be present within the cell and the second selective culture condition is HPRT active for growth.
APRTまたはTK酵素が細胞内に存在しないことを必要とする条件下で細胞を インキュベートすることからなる態様をも包含する。Cells are grown under conditions that require the absence of APRT or TK enzymes within the cells. It also includes embodiments consisting of incubating.
好ましい態様の説明 本発明は、受容動植物細胞のゲノム中にDNAを導入する方法に関する。キメラ 動物または形質転換動物を作成するべく、動物(特に醤歯目(即ちマウス、ラッ ト、ハムスターなど)、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシおよびヒト以外 の霊長類)の生殖系列細胞中にそのようなりNAを導入するために本性を用いる ことができる。またキメラ植物または形質転換植物を作成するべ(、本性を用い て植物細胞中にDNAを導入し、次いでそれを操作することもできる。Description of preferred embodiments The present invention relates to a method of introducing DNA into the genome of a recipient animal or plant cell. Chimera In order to create animals or transgenic rabbits, sheep, goats, fish, pigs, cows, and non-humans The use of natural DNA to introduce such NA into germline cells of primates) be able to. You should also create chimeric or transformed plants (using natural DNA can also be introduced into plant cells and then manipulated.
あるいは、動物(ヒトを含む)または植物の体細胞を改変するために本性を用い ることができる。ここに開示する方法を適用することによって操作することがで きる植物および植物細胞にはあらゆる多細胞高等(即ち非菌類または非酵母)植 物が含まれる。or use nature to modify the somatic cells of animals (including humans) or plants. can be done. can be operated by applying the methods disclosed herein. All multicellular higher (i.e., non-fungal or non-yeast) plants and plant cells Contains things.
■、相同的組換え 本発明は所望の遺伝子配列を動植物細胞中に導入する方法を提供する。したがっ て、明確で特異的な遺伝子改変を有するキメラ動植物または形質転換動植物を作 成することができる。■, homologous recombination The present invention provides methods for introducing desired gene sequences into animal and plant cells. Therefore to create chimeric or transgenic animals and plants with defined and specific genetic modifications. can be achieved.
本発明を完全に理解するためには、相同的組換えの過程を理解することが望まし い(latson、 J、 D、 、“Mo1ecular Biology of the Gene”、第3版、W、A、ベンジャミン、インコーポレイテ ッド、カリフォルニア州メンロパーク(1977)、この文献は本明細書の一部 を構成する)。In order to fully understand the present invention, it is desirable to understand the process of homologous recombination. (latson, J, D, “Mo1ecular Biology of the Gene”, 3rd edition, W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif. (1977), which document is incorporated herein by reference. ).
簡単に述べると、相同的組換えはよく研究された天然の細胞過程であり、この過 程によって、同一の配列もしくは本質的に類似する配列を有する(即ち“相同な ”)2つの核酸分子の切断とその2分子の連結が起こって、最初に存在したそれ ぞれの分子の一領域が最初に存在した他方の分子のある領域に連結されることに なる(Sedivy、 J、 M、 、 Bio−TechnoL6 : 11 92−1196(1988)、この文献は本明細書の一部を構成する)。Briefly, homologous recombination is a well-studied natural cellular process, and this have the same or essentially similar sequence (i.e. “homologous”) ”) The cleavage of two nucleic acid molecules and the joining of the two molecules occur, resulting in the formation of the original One region of each molecule is linked to a region of the other molecule that was originally present. (Sedivy, J. M., Bio-TechnoL6: 11 92-1196 (1988), which is incorporated herein by reference).
したがって相同的組換えは配列特異的な過程であり、細胞はこの過程によって、 あるDNA分子のDNA“領域″を別のDNA分子に移送することができる。本 明細書で用いる場合、DNAの“領域”とはあらゆる核酸分子を一般的に指すも のとする。この領域は、1塩基からかなりの長さの染色体断片までのいかなる長 さのものであってもよい。Homologous recombination is therefore a sequence-specific process that allows cells to A DNA "region" of one DNA molecule can be transferred to another DNA molecule. Book As used herein, a “region” of DNA refers generally to any nucleic acid molecule. To be. This region can be of any length, from a single base to a considerable length of a chromosomal fragment. It may be of the same name.
相同的組換えが2つのDNA分子間で起こるためには、それらの分子が互いに“ 相同領域”を保持していなければならない。このような相同領域は少な(とも2 塩基対長でなければならない。あるDNA分子が第2のDNA分子のある領域に 対して、相同的組換えが起こり得るほどに類似する配列からなる領域を含有する 場合、これら2つのDNA分子がそのような“相同領域”を保持するという。For homologous recombination to occur between two DNA molecules, those molecules must “ Homologous regions” must be retained. Such homologous regions are few (both 2 and 3). Must be base pair length. one DNA molecule in a region of a second DNA molecule In contrast, it contains a region consisting of sufficiently similar sequences that homologous recombination can occur. In this case, these two DNA molecules are said to possess such "regions of homology".
組換えは原核細胞と真核細胞の両方に天然に存在する酵素によって触媒される。Recombination is catalyzed by enzymes that occur naturally in both prokaryotic and eukaryotic cells.
DNAの一領域の移動は多段階過程を通して起こると想像され得る。Transfer of a region of DNA can be imagined to occur through a multistep process.
2つの関与分子の一方が環状分子であるならば、上記組換え事象によって他方の 関与分子への環状分子の組込みがもたらされる。If one of the two participating molecules is a circular molecule, the recombination event described above This results in the incorporation of the cyclic molecule into the participating molecule.
重要なことに、ある特定の領域に相同領域(複数)(同一であってもよいが、異 なっていることが好ましい)が隣接している場合には、2回の組換え事象が起こ って2つのDNA分子間でDNA領域の交換が起こり得る。組換えは“相互的” であり得るので、組換えによって2つの組換え性DNA分子間のDNA領域の交 換がもたらされ得る。あるいは組換えが“非相互的“(“遺伝子変換”とも呼ば れる)であって、同じヌクレオチド配列を有する共に組換え性のDNA分子をも たらすこともある。2事象組換え交換で交換される領域の大きさまたは配列に関 して制約はない。Importantly, a given region has multiple homologous regions (which may be the same but different). (preferably) are adjacent, two recombination events occur. Therefore, exchange of DNA regions can occur between two DNA molecules. Recombination is “reciprocal” recombination can cause the crossing of DNA regions between two recombinant DNA molecules. exchange may result. Or, recombination is “non-reciprocal” (also called “gene conversion”). DNA molecules that are both recombinant and have the same nucleotide sequence Sometimes it is. Regarding the size or sequence of the region exchanged in two-event recombination exchange. There are no restrictions.
導入するDNAを組換えを刺激する物質で処理することによって、2つのDNA 分子間の組換え頻度を増大させることができる。そのような物質の例にはトリメ チルプソラレン、Uv光などが含まれる。By treating the introduced DNA with a substance that stimulates recombination, two DNA The frequency of recombination between molecules can be increased. Examples of such substances include Includes chillpsoralen, UV light, etc.
■、キメクラ物および形質転換動物の作成:遺伝子標的性明確に定められた特異 的な遺伝子改変を有する動物を作成するための一方法として、腫瘍m胞中及び二 倍体ヒト線維芽細胞と四倍体マウス赤白血病細胞との融合物中で、導入されるマ ーカー遺伝子配列の組込み部位を制御するために相同的組換えが用いられている (Sa+1thies、 O,ら、Nature 317:230−234(1 985))。■Creation of chimeric organisms and transgenic animals: gene targeting, clearly defined specificity One way to create animals with major genetic modifications is to In a fusion of ploid human fibroblasts and tetraploid murine erythroleukemia cells, the transduced matrices Homologous recombination is used to control the integration site of the marker gene sequence. (Sa+1thies, O, et al., Nature 317:230-234(1 985)).
この方法はThomas、 K、 R,とその共同研究者らによってさらに活用 され、彼らは、形質転換動物を作成するためにES細胞中の予め選択された所望 の遺伝子配列に標的突然変異を起こさせるための一般的方法(これは“遺伝子標 的法”として知らている)にツイテ記述した(Mansour、 S、 L、ら 、 Nature 336:348−352(198g) ; Capecc■ i、 M、 Ro、 Trends Genet、 5 : 7O−76(19 89) ; Capecchi、 M、 R,ら、Cure獅煤@Commun ication s in MoLecular Biology−、Capecchi、 M、 11.編、コールドスプリングハーバ−プレス。This method was further exploited by Thomas, K. R., and co-workers. and they pre-selected desired cells in ES cells to create transgenic animals. A general method for making targeted mutations in gene sequences (this is called “gene targeting”). Mansour, S, L, et al. , Nature 336:348-352 (198g); Capecc■ i, M, Ro, Trends Genet, 5: 7O-76 (19 89) ; Capecchi, M., R. et al., Cure Shibut@Commun cation s in MoLular Biology-, Capecchi, M. 11. ed., Cold Spring Harbor Press.
ニ二−ヨーク州コールドスプリングハーバ−(1989)、 45−52頁:こ れらの文献は本明細書の一部を構成する)。Cold Spring Harbor, NY (1989), pp. 45-52: (These documents constitute a part of this specification).
遺伝子標的法は、β2−ミクログロブリン遺伝子座中にnptII遺伝子が挿入 されているキメラマウス及び形質転換マウスの作成に用いられているCKoll erら、B。The gene targeting method involves insertion of the nptII gene into the β2-microglobulin locus. CKoll used to create chimeric mice and transgenic mice er et al., B.
■、ら、 Proc、 Natl、 Acad−Sci、 (U、 S、 A、 ) 86 :8932−8935(1989) :Zij撃唐狽窒=v、ら、 Nature 342:435−43に1989) :Zijlstra、 M、ら、 Nat ure 344 : 742−746(1989) ;Debhiabaら、 Nat rure 345ニア8−80(1990))。同様の実験によって、nptI I遺伝子の挿入によッテ破壊されたc−abl遺伝子を有するキメラ動物及び形 質転換動物の作成が可能になっている(Schwartzberg、 P、 L 、ら、5cience 246:799−803(1989))。この技術は、 ユ且1■遺伝子の挿入によって!」二λ遺伝子が破壊されているキメラマウスを 作成するためにも用いられている(Joyner、 A、 L、ら、Natur e 338:153−155(1989))。■, Ra, Proc, Natl, Acad-Sci, (U, S, A, ) 86: 8932-8935 (1989): Zij Gekikarasoni = v, et al. Nature 342:435-43 (1989): Zijlstra, M. et al., Nat. ure 344: 742-746 (1989); Debhiaba et al. Nat rure 345 Near 8-80 (1990)). Similar experiments revealed that nptI Chimeric animals and forms with c-abl gene disrupted by insertion of I gene It has become possible to create transgenic animals (Schwartzberg, P., L. , et al., 5science 246:799-803 (1989)). This technology is By inserting the 1■ gene! ” Chimeric mice with two λ genes disrupted It is also used to create (Joyner, A. L. et al., Natur E 338:153-155 (1989)).
また遺伝子標的法は、hprt−ES細胞系中のhprt欠損を修正するために も使用されている。この欠損が修正された細胞を用いて、キメラ動物が作成され た。意味深いことに、修正された細胞のすべてがhprt遺伝子座に隣接する領 域の著しい破壊を示し、試験された細胞はすべてが、上記欠損の修正に使用され たベクターの少なくとも1コピーをhprt遺伝子座に組込んで含有することが わかった(Thompson、 S、ら、Ce1156:313−321(19 89) ; Koller、 B、 Ill、ら、 Pr盾メA Natl ^cad、 Sci、 (U、 S、 A、 )86:8927−8931(1 989))。Gene targeting methods have also been used to correct hprt defects in hprt-ES cell lines. is also used. Chimeric animals were created using cells with this defect corrected. Ta. Significantly, all of the corrected cells contained regions adjacent to the hprt locus. showed significant destruction of the area and all of the cells tested were used to correct the above defects. and containing at least one copy of the vector integrated into the hprt gene locus. Got it (Thompson, S. et al., Ce1156:313-321 (19 89); Koller, B., Ill., et al., Pr. Natl. ^cad, Sci, (U, S, A,) 86:8927-8931 (1 989)).
“遺伝子標的法”を利用するためには、興味ある遺伝子が予めクローン化されて おり、かつ、そのイントロン−エクソン境界が決定されていなければならない。In order to use the “gene targeting method,” the gene of interest must be cloned in advance. and its intron-exon boundaries must be determined.
この方法は、興味ある特定遺伝子の翻訳される領域中へのマーカー遺伝子(即ち nptII遺伝子)の挿入をもたらす。したがって、この遺伝子標的法の使用に より、興味ある遺伝子の著しい破壊がもたらされる。This method involves injecting a marker gene (i.e. nptII gene). Therefore, the use of this gene targeting method This results in significant disruption of the gene of interest.
最近、ホメオボックスbox 1.1アレルを保持するキメラマウスが、この遺 伝子標的法の変法を用いて作成されている(Zimmer、 A、ら、Natu re 338:150−154(1989))。この変法では、ベクター配列を 伴わずにhox 1.1アレルの部分のみを含有する直線状DNA分子をES細 胞に顕微注入することによって、ベクター配列の組込みが避けられた。このDN Aが細胞の、圧旦五アレルの遺伝子変換を引き起こすことがわかった。“変換さ れた”ES細胞の回収を容易にするための選択は用いられず、これはポリメラー ゼ連鎖反応(“PCR”)を用いて同定された。“変性もしくは試料の汚染を推 定している。これらのキメラマウスのなかで、“変換された”遺伝子をその子孫 に伝えることができるとわかったものはなかった(Zimmer、 A、ら、 −Current Com+*unications in Mo1ecula r Biology”、 Capecc■堰A M、 R,編、コ ールドスプリングハーバ−プレス、ニューヨーク州コールトスプリングツ\−バ ー(1989)、 53−58頁)。Recently, chimeric mice carrying the homeobox box 1.1 allele have been It has been created using a modification of the gene targeting method (Zimmer, A., et al., Natu re 338:150-154 (1989)). In this variant, the vector array is A linear DNA molecule containing only the hox 1.1 allele without any Integration of vector sequences was avoided by microinjecting the cells. This DN It was found that A causes gene conversion of the five alleles of cells. “Transformed "Selection to facilitate recovery of ES cells was not used; this It was identified using PCR chain reaction (“PCR”). “Proposes denaturation or sample contamination.” It is established. In these chimeric mice, the “converted” genes are passed on to their offspring. (Zimmer, A., et al.) -Current Com+*unications in Mo1ecula r Biology'', Capecc■Weir A M, R, ed., Co. Cold Spring Harbor Press, Cold Springs, New York (1989), pp. 53-58).
遺伝子標的法の使用を図IAに表す。この図では、hprt遺伝子の配列のエク ソン(領域“3”と示したもの)中にnptII遺伝子が挿入されている遺伝子 構築物が作成される。次に、この構築物に細胞のhprt遺伝子との組換えを受 けさせる。このような組換えは、細胞のエクソン3配列の、上記構築物の破壊さ れたエクソン3−nptII配列との置換をもたらす。意義深いことに、図IA に示されるように、細胞の遺伝子を改変するために遺伝子標的法を使用するとそ の遺伝子の配列中に著しい改変の生成がもたらされる。図IAに示すように、こ の遺伝子標的法の効率はおよそ1/300である。The use of gene targeting methods is depicted in Figure IA. This figure shows an extract of the hprt gene sequence. A gene in which the nptII gene is inserted into the son (indicated as region “3”) A construct is created. Next, this construct undergoes recombination with the cell's hprt gene. make it worse Such recombination results in disruption of the above construct to the exon 3 sequence of the cell. resulting in a replacement with the exon 3-nptII sequence. Significantly, Figure IA As shown in This results in the production of significant modifications in the sequence of the gene. As shown in Figure IA, this The efficiency of the gene targeting method is approximately 1/300.
■ キメラ動物及び形質転換動物の作成:挿入ベクターの使用上述の方法とは対 照的に、本発明は、細胞の所望の遺伝子配列中に微細で正確で予め決定された突 然変異を作成することができる。本発明にはいくつかの態様があるが、その最も 簡単なものを図IBに示す。■ Creation of chimeric and transformed animals: use of insertion vectors In contrast to the methods described above. In contrast, the present invention provides the ability to create minute, precise, predetermined irregularities in the desired genetic sequence of a cell. Can create natural mutations. The present invention has several aspects, but the most A simple one is shown in Figure IB.
図IBに示すように、挿入ベクターを用いてhprt遺伝子のヌクレオチド配列 に突然変異を誘発する。このベクター型を第2の選択可能な復帰事象と組み合わ せて使用すると、nl)tII遺伝子またはベクター配列による染色体の破壊が 防止される。したがって、本発明によって受容染色体の著しい歪みが避けれらる 。As shown in Figure IB, the nucleotide sequence of the hprt gene was prepared using an insertion vector. induce mutations in. Combining this vector type with a second selectable return event nl) chromosomal disruption caused by the tII gene or vector sequence. Prevented. Therefore, the present invention avoids significant distortion of the recipient chromosome. .
さらに、遺伝子標的の効率がかなり改善された(即ち1/300に対して1/3 2)。Furthermore, gene targeting efficiency was significantly improved (i.e. 1/300 versus 1/3 2).
受容細胞中に導入されるべきDNA分子は、細胞ゲノムの領域と相同な領域を含 有することが好ましい。好ましい態様では、該DNA分子が多能性細胞のゲノム (染色体とエピソームの両方)と相同な2つの領域を含有するであろう。これら の相同領域が、細胞ゲノムに組込まれることを望む”所望の遺伝子配列′に隣接 することが好ましいであろう。上述のように、これらの相同領域は2塩基長より 大きければどのような大きさでもよい。最も好ましくは、これらの相同領域が1 0塩基長より大きいであろう。The DNA molecule to be introduced into the recipient cell contains regions homologous to regions of the cell's genome. It is preferable to have. In a preferred embodiment, the DNA molecule comprises the genome of a pluripotent cell. It will contain two regions of homology (both chromosomal and episomal). these homologous region adjacent to the “desired gene sequence” that is desired to be integrated into the cell genome. It would be preferable to do so. As mentioned above, these homologous regions are less than 2 bases long. It can be of any size as long as it is large. Most preferably, these homologous regions are 1 It will be greater than 0 bases in length.
該DNA分子は一本鎖であってもよいが、二本鎖であることが好ましい。該DN A分子を、逆転写酵素または他の手段によってDNAに変換され得る1以上のR NA分子として細胞に導入することができる。好ましくは、該DNA分子は二本 鎖直線状分子であろう。本発明を行うための最良の方法として、閉環した共有結 合環状分子を切断して直線状分子にすることによってこのような分子を得る。The DNA molecule may be single-stranded, but is preferably double-stranded. The DN A molecule can be converted into DNA by reverse transcriptase or other means. It can be introduced into cells as an NA molecule. Preferably, the DNA molecules are two It would be a chain linear molecule. As the best method for carrying out the invention, a closed covalent bond is Such molecules are obtained by cleaving a fused ring molecule into a linear molecule.
好ましくは、単一の部位でその分子を切断して平滑末端または突出末端の直線状 分子を与えることができる制限エンドヌクレアーゼを使用する。最も好ましくは 、この制限部位の各側にあるヌクレオチドが、導入されるDNA分子と細胞ゲノ ムの間で相同な好ましい2つ領域の少な(とも一部を構成するであろう。Preferably, the molecule is cleaved at a single site to produce blunt or overhanging straight ends. Using restriction endonucleases that can give molecules. most preferably , the nucleotides on each side of this restriction site are linked to the introduced DNA molecule and the cellular genome. The two preferred regions of homology between the two systems would constitute a small portion.
このように本発明は、動植物のゲノムの特定の染色体位置に“所望の遺伝子配列 ”を導入する方法を提供する。“所望の遺伝子配列”はどのような長さであって もよく、どのようなヌクレオチド配列を有してもよい。またこれは完全なタンパ ク質をコード化する1以上の遺伝子配列、そのような遺伝子配列の断片、調節配 列などからなってもよい。所望の遺伝子と受容細胞の天然の遺伝子がわずかに異 なるだけであってもよい(例えば天然の遺伝子と比較して1塩基または複数塩基 の改変、挿入または欠失を含有するものであってもよい)ことは重要である。こ のような所望の遺伝子配列の使用は、受容細胞のゲノム中に微細で正確な変化を 作成することを可能にする。したがって本発明は、遺伝子の発現と制御を操作し 変調させる手段を提供する。In this way, the present invention provides a method for injecting "desired gene sequences into specific chromosomal locations in the genomes of animals and plants." ``The desired gene sequence'' can be of any length. It may have any nucleotide sequence. Also this is a complete tamper one or more gene sequences encoding a protein, fragments of such gene sequences, regulatory sequences; It may also consist of columns. The desired gene and the recipient cell's native gene are slightly different. (e.g. one base or multiple bases compared to the natural gene) Importantly, it may contain modifications, insertions or deletions. child The use of desired gene sequences such as enable you to create. Therefore, the present invention provides methods for manipulating gene expression and regulation. Provides a means for modulating.
具体的には、本発明は、“選択不可能な”所望の遺伝子配列1で遺伝子配列を置 換することによって遺伝子の発現とタンパク質の構造を操作し変化させる手段を 提供する。受容細胞内におけるある遺伝子配列の存在または発現が使用される培 養条件下でのその細胞の生存にとって有利な要因を提供しない場合、その遺伝子 配列は選択不可能であるという。したがって、定義として、“選択不可能な”遺 伝子配列を受容した細胞を選択することはできない。対照的に、“優性な”遺伝 子配列とは、ある状況下で受容細胞の生存にとって有利な要因を提供することが できるものである。nptII遺伝子によって付与されるネオマイシン耐性はネ オマイシンまたはG418の存在下で培養される細胞の生存にとって有利な要因 である。Specifically, the present invention provides for replacing a gene sequence with a "non-selectable" desired gene sequence 1. A means of manipulating and changing gene expression and protein structure by provide. The presence or expression of a certain gene sequence in the recipient cell determines the If the gene does not provide an advantage for the survival of that cell under nutrient conditions, Arrays are said to be unselectable. Therefore, by definition, “unselectable” It is not possible to select which cells receive the gene sequence. In contrast, “dominant” inheritance A child sequence is a sequence that, under certain circumstances, can provide factors advantageous to the survival of the recipient cell. It is possible. Neomycin resistance conferred by the nptII gene is Factors favorable for survival of cells cultured in the presence of omycin or G418 It is.
具体的には、本発明は、受容細胞中に“類似する”配列を伴って存在する遺伝子 配列の置換を可能にする。2つの配列がその配列に関して本質的に類似している が、その互いの配列に1塩基の置換、欠失または挿入に対応する微小な変化があ る場合、あるいは2つの配列が“微小な”複数塩基改変を保持する場合、これら の一方の配列を他方の類似配列であるという。優性な選択可能マーカー遺伝子の 挿入はこのような改変から除外される。Specifically, the present invention relates to genes that are present with "similar" sequences in recipient cells. Allows array substitution. two sequences are essentially similar with respect to their sequence However, there is a minute change in their mutual sequences that corresponds to a single base substitution, deletion, or insertion. or if the two sequences carry “minor” multiple base alterations, these One sequence is said to be a similar sequence to the other. of the dominant selectable marker gene. Insertions are excluded from such modifications.
受容細胞と相同な領域(複数)が隣接している所望の遺伝子を、両末端がそれら の相同領域に対応する直線状二本鎖分子として導入する場合、細胞のゲノムとの 1回の組換え事象がトランスフェクトされた細胞のほぼ5%で起こるであろう。The desired gene, which is flanked by regions homologous to the recipient cell, is inserted at both ends. When introduced as a linear double-stranded molecule corresponding to the homologous region of One recombination event will occur in approximately 5% of transfected cells.
このような1回の組換え事象は受容細胞のゲノムへの直線状分子全体の組込みを 導くであろう。A single such recombination event results in the integration of the entire linear molecule into the genome of the recipient cell. will guide you.
該直線状分子の組込みによって生成する構造は、次なる第2の組換え事象(1細 胞世代あたり約10−5〜10−’)を起こすであろう。この第2の組換え事象 は隣接する相同領域及び所望のDNA配列を除くすべてのDNAの、統合構造か らの除去をもたらすであろう。The structure generated by the incorporation of the linear molecule is generated by a subsequent second recombination event (one approximately 10-5 to 10-') per cell generation. This second recombination event is the integrated structure of all DNA excluding adjacent homologous regions and the desired DNA sequence? This will result in the removal of
したがって第2の組換え事象の結果は、その細胞のゲノム中の隣接相同領域の間 に通常存在するDNA配列を所望のDNA配列と置換し、遺伝子置換の不安定性 を除去することである。The result of the second recombination event is therefore between adjacent homologous regions in the genome of that cell. The instability of gene replacement is eliminated by replacing the DNA sequence normally present in the gene with the desired DNA sequence The goal is to remove the
導入される分子にその相同領域での組換えを受けさせるであろうあらゆる方法に よって、所望の遺伝子配列を含有するDNA分子を多能性細胞中に導入すること ができる。直接的顕微注入やリン酸カルシウム形質転換法などい(つかの方法は 、導入される分子が組込み時にコンカテマーを形成する原因となり得る。これら のコンカテマーは自分自身を分解して非コンカテマー組込み構造を形成し得る。any method that would cause the introduced molecule to undergo recombination in its homologous regions. Therefore, introducing a DNA molecule containing the desired gene sequence into a pluripotent cell Can be done. Some methods include direct microinjection and calcium phosphate transformation. , which can cause the introduced molecules to form concatemers upon incorporation. these The concatemers of can disassemble themselves to form non-concatemer incorporation structures.
コンカテマーの存在は望ましくないので、コンカテマーを形成させる方法は好ま しくない。好ましい態様として、該DNAをエレクトロポレーションによって導 入する(Toneguzzo、 F、ら、Nucleic Ac1ds Res 、 16:5515−5532(1988) ; Quil撃■煤A A、ら。Since the presence of concatemers is undesirable, methods that allow concatemer formation are preferred. It's not right. In a preferred embodiment, the DNA is introduced by electroporation. (Toneguzzo, F. et al., Nucleic Ac1ds Res , 16:5515-5532 (1988); Quil et al.
J、 Immunol、 141 :17−20(1988) ; Machy 、 P、ら、 Proc、 Natl、 Acad、 Sc堰A (U、 S、 A、 ) 85 :8027−8031(1988) ;これらの文献はすべ て本明細書の一部を構成する)。J. Immunol, 141:17-20 (1988); , P, et al., Proc, Natl, Acad, Sc weir A (U, S, A,) 85:8027-8031 (1988); all of these documents (which constitutes a part of this specification).
DNA分子の導入を可能にした後、細胞を、当該技術分野で公知の従来の条件下 で培養する。After allowing the introduction of the DNA molecule, the cells are subjected to conventional conditions known in the art. Cultivate with
所望の遺伝子配列を含有するDNA分子を受容した細胞の回収を容易にするため には、所望の遺伝子配列を含有するDNAを、検出可能なマーカ遺伝子配列を含 有する第2の遺伝子配列と組合わせて導入することが好ましい。本発明の目的の ためには、細胞内におけるその遺伝子配列の存在がその細胞の認知とクローン的 単離を可能にするような、あらゆる遺伝子配列を検出可能な遺伝子配列として使 用することができる。To facilitate recovery of cells that have received DNA molecules containing the desired gene sequence DNA containing the desired gene sequence and a detectable marker gene sequence. It is preferable to introduce it in combination with a second gene sequence having the same gene sequence. Purpose of the invention The presence of that gene sequence in a cell is important for the cell's cognition and clonality. Any gene sequence that allows isolation can be used as a detectable gene sequence. can be used.
一態様として、受容細胞中の検出可能なマーカー配列の存在をハイブリッド形成 、放射線ラベルしたヌクレオチドの検出、あるいは検出可能なマーカー配列の発 現を必要としない他の検出検定法によって認識する。好ましくは、PCRを用い てこのような配列を検出する(Mullis、 K、ら、 Co1d Spri ng Harbor Symp、 Quant、 Biol、 51:263− 273(1986) ; Er1ich Hら、 EP50424 ; EP8 4796. EP258017.@EP237362 ; Mu llis、 K、 、 EP201184 ; Mullis K、ら、 US 4683202 ; Er1ich、 H,、US4582V88 : 5ai ki、 R,ら。In one embodiment, the presence of a detectable marker sequence in the recipient cell hybridizes , detection of radiolabeled nucleotides, or generation of detectable marker sequences. recognition by other detection assays that do not require Preferably using PCR Detecting lever-like sequences (Mullis, K. et al., Cold Spri ng Harbor Symp, Quant, Biol, 51:263- 273 (1986); Erlich H et al., EP50424; EP8 4796. EP258017. @EP237362 ; Mu Mullis, K., EP201184; Mullis K., et al., US 4683202; Erlich, H,, US4582V88: 5ai ki, R, et al.
US461113194 ;これらの文献は本明細書の一部を構成する)。US461113194; these documents form part of this specification).
PCRは、増幅されるべき配列の領域(複数)に相補的な2つのオリゴヌクレオ チドブライマーを用いることにより特定の核酸配列の増幅を達成するものである 。PCR uses two oligonucleotides that are complementary to the region(s) of the sequence to be amplified. Amplification of specific nucleic acid sequences is achieved by using tidebrimers. .
次に、上記プライマーを組み込んだ伸長産物がそれ以降の複製段階の鋳型となる 。Next, the extension product incorporating the above primer becomes the template for the subsequent replication steps. .
PCRは、ある核酸分子の濃度を、たとえその分子が過去に精製されたことがな く、特定の試料中に1コピーしか存在していない場合でも、選択的に増大させる ための方法を提供する。この方法は、−末鎖DNAの増殖にも、二本鎖DNAの 増殖にも使用することができる。PCR is used to determine the concentration of a nucleic acid molecule, even if the molecule has never been purified before. selectively expands even when only one copy is present in a particular sample provide a method for This method can be used both for the propagation of -end-strand DNA and for the propagation of double-strand DNA. It can also be used for propagation.
しかしながら最も好ましくは、該検出可能なマーカー遺伝子配列がその受容細胞 中で発現し、選択可能な表現型をもたらすであろう。このような好ましい検出可 能な遺伝子配列の例には、hprt遺伝子(Littlefield、 J、 1. 、5cience 145ニア09−710(1964) ;この文献は 本明細書の一部を構成する)、キサンチンーグアニンホoratory Man ual″″、第2版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニュ菖 ら、 Mutat、 Res、 214:223−232(1989) ;この 文献は本明細書の一部を構成する)、nptII遺伝子(Thomas、 K、 R,ら、 Ce1l 51 :503−512(1987) ; Manso ur、 S、 LAら、 Natur e 336:348−352(1988) :これら両文献は本明細書の一部を 構成する)、あるいはアミノ酸類縁体、ヌクレオシド類縁体または抗生物質など に対する耐性を付与するその他の遺伝子が含まれる。そのような遺伝子の例には 、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)酵素、アデノシンデアミナーゼ(AD A)、アスパラギンシンセターゼ(AS)、ハイグロマリシンBホスホトランス フェラーゼあるいはCAD酵素(カルバミルリン酸シンセターゼ、アルバラギン 酸トランスカルバミラーゼ及びジヒドロオロターゼ)などの酵素をコード化する 遺伝子配列が含まれる(Sambrookら、 ”Mo1ecular Clo ning A Laboratory 1lanual−、第2版、コールドス プリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニューヨーク州(191119) ;こ の文献は本明細書の一部を構成する)。Most preferably, however, the detectable marker gene sequence is and will result in a selectable phenotype. Such a preferable detectable Examples of possible gene sequences include the hprt gene (Littlefield, J. 1. , 5science 145 Near 09-710 (1964); This document (Constituting a Part of this Specification), Xanthine-Guanine Oratory ual'''', 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Iris et al., Mutat, Res. 214:223-232 (1989); (Documents are incorporated herein by reference), nptII gene (Thomas, K. R, et al. Ce1l 51:503-512 (1987); Manso ur, S, LA et al., Natur e 336:348-352 (1988): Both of these documents include a part of this specification. ), or amino acid analogs, nucleoside analogs or antibiotics, etc. Other genes that confer resistance to are included. Examples of such genes include , dihydrofolate reductase (DHFR) enzyme, adenosine deaminase (AD A), asparagine synthetase (AS), hygromarin B phosphotrans ferase or CAD enzyme (carbamyl phosphate synthetase, albaragin) encodes enzymes such as acid transcarbamylase and dihydroorotase) Gene sequences are included (Sambrook et al., “Molecular Clo ning A Laboratory 1lanual-, 2nd edition, Coldos Pring Harbor Laboratory Press, New York (191119); (This document is incorporated herein by reference).
活性なチミジンキナーゼ(TK)酵素、ヒポキサンチン−ホスホリボシルトラン スフェラーゼ(HPRT)酵素、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランス フェラーゼ(XGPRT)酵素あるいはアデノシンホスホリボシルトランスフェ ラーゼ(APRT)酵素を含有しない細胞はヒポキサンチン、アミノプテリン、 および/またはミコフェノール酸(好ましくはアデニン、キサンチンおよび/ま たはチミジン)、およびチミジンを含有する培地中で生育することができないが 、5−ブロモデオキシウリジン、6−チオグアニン、8−アザプリンなどのヌク レオシド類縁体を含有する培地中で生育することができる(Littlefie ld、 J、 W、 、 5cience 145ニア09−710(1964 ) ; Sambrookら、“Mo1ecular Cloning A L aboratory Manual”A第2版、コ ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニューヨーク州(1989)) 。Active thymidine kinase (TK) enzyme, hypoxanthine-phosphoribosyltrans spherase (HPRT) enzyme, xanthine-guanine phosphoribosyltrans ferase (XGPRT) enzyme or adenosine phosphoribosyl transfer Cells that do not contain the enzyme (APRT) contain hypoxanthine, aminopterin, and/or mycophenolic acid (preferably adenine, xanthine and/or or thymidine), and cannot grow in media containing thymidine. , 5-bromodeoxyuridine, 6-thioguanine, 8-azapurine, etc. can be grown in media containing leoside analogs (Littlefie ld, J, W,, 5science 145 Near 09-710 (1964 ) ; Sambrook et al., “Mo1ecular Cloning AL laboratory Manual” A 2nd edition, Ko Old Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)) .
逆に、このような活性な酵素を含有する細胞は上記の培地中で生育することがで きるが、5−ブロモデオキシウリジン、6−チオグアニン、8−アザプリンなど のヌクレオシド類縁体を含有する培地中では生育することができない(Samb rookら、“Mo1ecular Cloning A Laborator y 1ianual”、第2版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレ ス、ニューヨーク州(1989))。Conversely, cells containing such active enzymes are capable of growing in the above media. Kiruga, 5-bromodeoxyuridine, 6-thioguanine, 8-azapurine, etc. cannot grow in media containing nucleoside analogs of Samb. rook et al., “Molecular Cloning A Laboratory y annual'', 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press S., New York (1989)).
活性なチミジンキナーゼを発現する細胞はHATGを含有する培地中で生育する ことができるが、5−アザシチジンなどのヌクレオシド類縁体を含有する培地中 では生育することができない(Giphart−Gassler、 M、ら、1 lutat、Res、 214:223−232(1989))。活性なH3V −tk遺伝子を含有する細胞はガングシロビル(gangcylovir)また は類似の薬剤の存在下で生育することができない。Cells expressing active thymidine kinase grow in medium containing HATG but in a medium containing nucleoside analogs such as 5-azacytidine. (Giphart-Gassler, M. et al., 1 Res. 214:223-232 (1989)). active H3V -Cells containing the tk gene are treated with gangcylovir or cannot grow in the presence of similar drugs.
検出可能なマーカー遺伝子は、認識可能な細胞の欠損性を補うことができる遺伝 子であればなんでもよい。したがって、例えば、HPRT活性を欠(細胞を使用 する場合にはHPRTの遺伝子を検出可能なマーカー遺伝子配列として使用する ことができよう。したがってこの遺伝子は、その発現産物を突然変異細胞の選択 またはこの遺伝子産物を発現する細胞の“陰性選択”に使用し得る遺伝子の一例 thies、 O,ら、 Nature 317:230−234(1985) ;これらの文献は本明細書の一部を構成する)が最も好ましい検出可能なマー カー遺伝子配列である。1に遺伝子またはhprt遺伝子の一方とnptII遺 伝子を共に含有する構築物がとりわけ好ましい。A detectable marker gene is a genetic marker that can compensate for a recognizable cellular defect. Anything is fine as long as it's a child. Thus, for example, using cells lacking HPRT activity In this case, use the HPRT gene as a detectable marker gene sequence. I could do that. Therefore, this gene has its expression product selected for mutant cells. or an example of a gene that can be used for “negative selection” of cells expressing this gene product. Ties, O. et al., Nature 317:230-234 (1985) ; these documents are incorporated herein by reference) are the most preferred detectable markers. This is the car gene sequence. 1, one of the genes or the hprt gene and the nptII gene. Particularly preferred are constructs containing the genes together.
A、検出可能なマーカー配列と所望の遺伝子配列の両方を含有する単−DNA分 子の使用 第1の好ましい態様として、相同領域(複数)が隣接した検出可能なマーカー遺 伝子配列を所望の遺伝子配列を含有するDNA分子と同じDNA分子上に入れて 受容細胞に提供する。上に議論したように、このDNA分子は直線状分子である ことが好ましい。A. A single DNA segment containing both a detectable marker sequence and the desired gene sequence. child usage In a first preferred embodiment, the homologous region(s) are adjacent detectable marker genes. Place the gene sequence on the same DNA molecule that contains the desired gene sequence. Provide to recipient cells. As discussed above, this DNA molecule is a linear molecule It is preferable.
所望のDNA分子を組込んだ細胞を(例えばその検出可能なマーカー遺伝子配列 が発現可能なnptH遺伝子配列である場合にはG418耐性細胞を選択するこ とによって)選択した後、その細胞を培養し、導入したDNA分子の存在を上述 のように確認する。約107細胞を培養し、これを天然配列(即ち受容細胞中に 通常に天然に存在する遺伝子配列)の置換をもたらす第2の組換え事象(上述) を起こした細胞についてスクリーニングする。Cells that have integrated the desired DNA molecule (e.g., their detectable marker gene sequence) If the nptH gene sequence is expressible, G418-resistant cells can be selected. After selection (by Check as follows. Approximately 107 cells were cultured and this was combined with the native sequence (i.e. into the recipient cells) a second recombination event (described above) resulting in the replacement of the normally naturally occurring gene sequence) Screen for cells that have caused this.
第2の組換え事象を起こした細胞を同定するためには、様々な方法のいずれを用 いてもよい。クローンの直接的スクリーニング、PCRの使用、ノ\イブリッド 形成プローブの使用などはすべてこの目的に使用できる。好ましい態様として、 該DNA分子は、所望の遺伝子配列、隣接する相同領域及び検出可能なマーカー 遺伝子配列に加えて、第2の組換え事象を起こした細胞の選択または認識を可能 にする追加の遺伝子配列を含有するであろう。この追加の遺伝子配列は、第2の 組換え事象の直接の結果として、細胞のゲノムから切り出されるであろう。した がって、この目的に適する遺伝子配列には、細胞からその遺伝子配列が欠失した ことを検出または選択し得るあらゆる遺伝子配列が含まれる。このような“陰性 選択”遺伝子配列の例には亘且L1遺伝子及びIK遺伝子(特に単純庖疹ウイル ス第1の好ましい態様では、第2の組換え事象の頻度は10−S程度である。し かし、“陰性選択”遺伝子配列の使用により、このような組換え細胞をほぼ10 0%の頻度で同定することができる。Any of a variety of methods can be used to identify cells that have undergone a second recombination event. You can stay there. Direct screening of clones, use of PCR, hybrids The use of shaping probes, etc. can all be used for this purpose. As a preferred embodiment, The DNA molecule contains the desired gene sequence, adjacent homologous regions and a detectable marker. In addition to the gene sequence, it is possible to select or recognize cells that have undergone a second recombination event. It will contain additional gene sequences to make it. This additional gene sequence It will be excised from the cell's genome as a direct result of a recombination event. did Therefore, gene sequences suitable for this purpose include those that have been deleted from cells. Any gene sequence that can be detected or selected for is included. Such “negative” Examples of "selection" gene sequences include the transgenic L1 gene and the IK gene (particularly the herpes simplex virus). In a first preferred embodiment, the frequency of the second recombination event is on the order of 10-S. death However, the use of "negative selection" gene sequences has reduced the number of such recombinant cells to approximately 10 Can be identified with a frequency of 0%.
図2に示すように、該DNA分子は意図した挿入部位に位置する異種構造領域を 有し得る。このようなベクターの挿入によって、(他の潜在的部位ではなく)挿 入部位で組換わった組換え体を選択することが可能になる。組換えが所望の挿入 部位で起これば、それによって該DNA分子の意図した挿入部位に位置する異種 構造の配列(例えば図2AではHSVtk)の欠失が導かれるであろう。他の組 換え事象がもたらす挿入はこの異種構造配列を保持するであろう。したがって、 検定可能な遺伝子産物をコード化する異種構造領域または“陰性選択可能な”マ ーカーとして使用することができる異種構造領域を使用することによって、受容 細胞の挿入の遺伝子座が所望の正確な配列を含有することを容易に決定すること ができる。図2Aに示すように、このようなベクターの効率は約1/197であ る。As shown in Figure 2, the DNA molecule contains a region of heterologous structure located at the intended insertion site. may have. Insertion of such vectors allows the insertion (rather than other potential sites) It becomes possible to select recombinants that have recombined at the entry site. Insertion where recombination is desired site, thereby locating the foreign species at the intended insertion site of the DNA molecule. Deletion of the sequence of the structure (eg HSVtk in Figure 2A) will be induced. other group Insertions resulting from recombination events will retain this heterologous structural sequence. therefore, A heterologous structural region or “negatively selectable” marker that encodes an assayable gene product. By using a heterogeneous structure region that can be used as a marker, Easily determine that the locus of cellular insertion contains the exact sequence desired Can be done. As shown in Figure 2A, the efficiency of such vectors is approximately 1/197. Ru.
該DNA分子の挿入部位に導入され得る異種構造領域は短くても(例えば26塩 基対二図2B)あるいはかなりの大きさく例えば2kb :図2A)であっても よい。直線化の部位はその異種構造領域の5゛側、3゛側またはその異種構造領 域内であり得る。直線化の部位が異種構造領域内にある場合、遺伝子標的の効率 は1/63である。The heterologous structural region that can be introduced into the insertion site of the DNA molecule may be short (e.g. 26 salts). Even if the base pair is 2 (Fig. 2B) or quite large, for example 2 kb (Fig. 2A) good. The site of linearization is the 5° side, 3° side of the heterogeneous structure region, or the heterogeneous structure region. It can be within the area. Efficiency of gene targeting when the site of linearization is within a heterologous structural region is 1/63.
図2Cに示すように、異種構造領域が所望の組換えが起こる相同領域の内部に位 置してもよい。所望の組換え部位の遺伝子座以外の部位で細胞遺伝子のある遺伝 子座中に微細な突然変異を導入したい場合に、このような構築物を使用すること ができる。As shown in Figure 2C, the heterologous structural region is positioned within the homologous region where the desired recombination occurs. You may place Inheritance of cellular genes at sites other than the locus of the desired recombination site Use such constructs when you want to introduce subtle mutations into the child locus. Can be done.
B、異なるDNA分子を使用して検出可能なマーカー配列と所望の遺伝子配列を 提供する方法 第2の好ましい態様として、相同領域(複数)が隣接した検出可能なマーカー遺 伝子配列を、所望の遺伝子配列を含有するDNA分子とは異なるDNA分子に乗 せて受容細胞に提供する。これらの分子は直線状分子であることが好ましい。B. Detectable marker sequences and desired gene sequences using different DNA molecules How to provide In a second preferred embodiment, the homologous region(s) are adjacent detectable marker genes. The gene sequence is multiplied onto a DNA molecule different from the DNA molecule containing the desired gene sequence. delivered to the recipient cell. Preferably, these molecules are linear molecules.
別個のDNA分子に乗せて提供する場合には、検出可能なマーカー遺伝子配列と 所望の遺伝子配列を同時エレクトロポレーションまたは他の等価な技術によって 受容細胞に提供することが最も好ましいであろう。If provided on a separate DNA molecule, a detectable marker gene sequence and desired gene sequences by co-electroporation or other equivalent techniques. Most preferably, it will be provided to the recipient cell.
このような受容体を(好ましくはnptII遺伝子を発現する検出可能なマーカ ー配列を使用して抗生物質G418に対する細胞耐性を付与することによって) 選択した後、それらの細胞を成長させ、挿入事象を確認するために(好ましくは PCRを用いて)スクリーニングする。A detectable marker expressing such a receptor (preferably the nptII gene) - by conferring cellular resistance to the antibiotic G418 using the sequence After selection, grow those cells and confirm insertion events (preferably (using PCR).
全(選択を行わない場合には、107細胞中わずか1細胞が予期される組換え構 造を有するに過ぎないと予測され得る。しかし、検出可能なマーカー配列(旦p tII遺伝子など)を含有しこれを発現する受容細胞を選択すれば、両方のDN A分子を吸収している細胞を103ないし105倍濃縮することができる。典型 的には、このような濃縮によって、わずか800〜1500細胞をスクリーニン グするだけで(導入されたDN、Aがその細胞のゲノムに組込まれている)所望 の受容細胞を同定することが可能になる。このようなスクリーニングはPCRま たは他の等価な方法を用いて行うことが好ましい。上記陰性選択技術を用いるこ とにより、そのベクターコピー数を操作することができる。All (if no selection, only 1 out of 107 cells will contain the expected recombinant construct) It can be predicted that there will be no more than a structure. However, a detectable marker sequence (dan p If recipient cells containing and expressing the tII gene (e.g., tII gene) are selected, both DN Cells absorbing A molecules can be concentrated 103 to 105 times. typical Typically, such enrichment allows screening as few as 800-1500 cells. (The introduced DNA, A, has been integrated into the genome of that cell) This makes it possible to identify recipient cells. Such screening can be done by PCR or or other equivalent methods. Using the above negative selection technique The vector copy number can be manipulated by
導入された2つのDNA分子は一般的にはその受容細胞ゲノムの同じ部位には組 込まれない。したがって、ある場合には、所望の遺伝子配列が、隣接する相同領 域の間の天然の細胞遺伝子配列を置換するような様式で組込まれているであろう 。検出可能なマーカー遺伝子が組込まれる遺伝子座は、それが所望の遺伝子配列 と同じ遺伝子座に遺伝学的に連結されない限り、本発明の目的にとっては重要で ない。しかしながら所望であれば、検出可能なマーカー配列を含有するDNAと 共に陰性選択が可能な遺伝子配列を組込むことも可能である。したがって、導入 した選択可能マーカー遺伝子配列DNAが欠失した細胞を最終的に選択すること ができる。The two introduced DNA molecules are generally not assembled at the same site in the recipient cell's genome. Not included. Therefore, in some cases, the desired gene sequence may have been integrated in such a manner as to replace the natural cellular genetic sequence between the regions. . The locus into which the detectable marker gene is integrated is are of no significance for the purposes of this invention unless they are genetically linked to the same locus as do not have. However, if desired, DNA containing a detectable marker sequence and It is also possible to incorporate gene sequences that allow negative selection. Therefore, the introduction to finally select cells in which the selected selectable marker gene sequence DNA has been deleted. Can be done.
C3直接選択を利用して相同的組換え事象を同定する方法上述の好ましい態様は いずれも、細胞のアレルの1つが所望の遺伝子配列を含有するように突然変異し ている細胞の単離を可能にするものであるが、各態様は、所望の組換え細胞を同 定するためにかなりの数の候補細胞のスクリーニングを必要とする。しかし、上 述の態様の変法を用いることによって所望の組換え細胞を直接的に選択すること ができる。本発明のこの態様を図13に表す。図13に例示した方法において星 印(*)の下に位置する配列がneo遺伝子であるとすると、切除事象を選択す るために6−チオグアニン及び6418選択を適用すれば、突然変異復帰体のみ が選択されるであろう。Preferred embodiments of the method for identifying homologous recombination events using C3 direct selection include: In both cases, one of the cell's alleles is mutated to contain the desired gene sequence. Although each embodiment allows for the isolation of desired recombinant cells, Requires screening of a significant number of candidate cells to determine. But above directly selecting the desired recombinant cells by using a variation of the embodiments described above; Can be done. This aspect of the invention is depicted in FIG. In the method illustrated in Figure 13, the star If the sequence located under the mark (*) is the neo gene, select the excision event. If we apply 6-thioguanine and 6418 selection to will be selected.
所望の細胞を直接選択するためのこの方法は、標的細胞と非標的細胞の表現型の 相違と陽性選択と陰性選択の両方に使用できる単一の遺伝子の使用に拠っている 。This method for direct selection of desired cells allows for the phenotypic differentiation of target and non-target cells. relies on differences and the use of a single gene that can be used for both positive and negative selection .
典型的には、挿入ベクターを用いて行ったいずれの相同的組換え実験においても 、3つの細胞集団が生成するであろう。第1の細胞群は所望のDNA分子を受容 し損じた細胞であろう。この群はその実験の完了時に単離される候補細胞の基本 的にすべてを含むであろう。第2の細胞群は所望の遺伝子がランダムな挿入部位 (即ち、突然変異を誘発しようとする遺伝子外の部位)に組込まれている細胞で あろう。103〜104個の全細胞のうち約1細胞がこの群に属するであろう。Typically, in any homologous recombination experiment performed with an insertion vector, , three cell populations will be generated. The first group of cells receives the desired DNA molecule It is probably a cell that has failed. This group is the basis of candidate cells that will be isolated upon completion of the experiment. will include everything. The second group of cells contains the desired gene at a random insertion site. (i.e., at the extragenic site where the mutation is to be induced) Probably. Approximately 1 out of 103-104 total cells will belong to this group.
第3の細胞群は、所望の遺伝子配列が相同的組換えによって所望の遺伝子中の部 位に組込まれている細胞であろう。105〜106個の全細胞のうち約1細胞が この群に属するであろう。In the third cell group, the desired gene sequence is inserted into the desired gene by homologous recombination. It is probably a cell that has integrated into the site. Approximately 1 cell out of 105-106 total cells It would belong to this group.
上述の態様では、第1群の細胞(トランスフェクトされなかった細胞)を陽性選 択によって除去することができ、したがって所望の組換え細胞を同定するために はわずか約1000細胞をスクリーニングする必要が残るに過ぎない。本態様で は、第3群の細胞(相同的組換え体)と第2群の細胞(ランダム挿入体)の間に 表現型の相違が存在すれば、第3群の細胞を第2群の細胞から選択することがで きる。In the embodiment described above, the first group of cells (cells that were not transfected) are positively selected. To identify the desired recombinant cells, which can be removed by selection, Only about 1000 cells remain to be screened. In this mode is between the cells of the third group (homologous recombinants) and the cells of the second group (random inserts). If phenotypic differences exist, the cells of the third group can be selected from the cells of the second group. Wear.
ランダムな組込み部位は(細胞をトランスフェクトする際のDNA濃度に依存し て)はんの少数の単一コピークローンを伴うコンカテマー性である可能性が高い ので、このような組込み事象は本質的に不安定である。したがって、このような コンカテマー性構築物は典型的には染色体内組換えを起こすであろう。このよう な組換えは常に、そのベクターの無傷な1コピーをそのゲノム中に残すであろう 。したがって、陰性選択可能なマーカーがそのベクター上に含まれている場合に は、すべてのランダム挿入事象をその集団から否定的に選択することができる。Random integration sites (depending on DNA concentration when transfecting cells) likely to be concatameric with a small number of single-copy clones Therefore, such an incorporation event is inherently unstable. Therefore, something like this Concatemeric constructs will typically undergo intrachromosomal recombination. like this Recombination will always leave one intact copy of the vector in its genome. . Therefore, if a negative selectable marker is included on the vector. can negatively select all random insertion events from the population.
対照的に、所望の遺伝子配列が相同的組換えによって所望の遺伝子中に組み込ま れている細胞は、比較的高い頻度(重複する構造の大きさに依存して1細胞分裂 につき104〜10’中約1)で復帰して、ベクター配列を含有しない突然変異 した所望の遺伝子を生み出すであろう。したがって、そのベクターが陰性選択可 能な遺伝子配列を含有している場合であっても、そのような細胞は陰性選択に生 き残り、これを回収することができるであろう。相同的組換え細胞の大半は復帰 を起こさず、陰性選択によって除去されるであろう。このように、これらの選択 の総和が所望の組換え体の単離をもたらすであろう。In contrast, the desired gene sequence is integrated into the desired gene by homologous recombination. Cells with a relatively high frequency of cell division (depending on the size of the overlapping structures) Mutations that revert at approximately 1 in 104 to 1) and do not contain vector sequences will produce the desired gene. Therefore, the vector is capable of negative selection. Even if they contain functional gene sequences, such cells will not survive negative selection. There will be some leftovers that will be able to be recovered. Most homologous recombinant cells revert will not occur and will be removed by negative selection. In this way, these selections will result in the isolation of the desired recombinant.
本法は、“前駆体細胞”(即ち本法を適用することによって“所望の”組換え細 胞に変化すべき細胞)を非選択的培養条件下もしくは第1の選択的培養条件下で インキュベートすることからなる。ある培養条件(即ち、培地や温度など)が前 駆体細胞、所望の細胞及び中間体細胞型(即ち、前駆体細胞が所望の細胞に進行 する過程で得られる細胞)の生育を促進(またはその生存能を維持)することが できる場合に、その培養条件を“非選択的である“という。ある培養条件が特定 の細胞(即ち、特定の遺伝子型を有し、それゆえに特定の遺伝子産物を活性型も しくは不活性型で含有している細胞)のみの生育を促進(またはその生存能を維 持)することができる場合に、その培養条件を“選択的である”という。This method uses “precursor cells” (i.e., “desired” recombinant cells by applying this method). cells to be transformed into cells) under non-selective culture conditions or under the first selective culture conditions. It consists of incubating. Certain culture conditions (i.e., medium, temperature, etc.) progenitor cells, desired cells and intermediate cell types (i.e., precursor cells progress to desired cells) It is possible to promote the growth (or maintain the viability) of cells obtained in the process of If possible, the culture conditions are said to be "non-selective." Certain culture conditions are specific cells (i.e., have a specific genotype and therefore also produce a specific gene product in the active form) promotes the growth (or maintains the viability of cells contained in an inactive form). Cultivation conditions are said to be "selective" if the culture conditions can be maintained.
したがって、好ましい選択的培養条件は前駆体細胞の遺伝子型に依存する。上述 のように、活性なチミジンキナーゼ(TK)酵素、ヒボキサンチン−ホスホリボ シルトランスフェラーゼ(HPRT)酵素、キサンチン−グアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ(XGPRT)酵素またはアデノシンホスホリボシルトラ ンスフェラーゼ(APRT)酵素を含有しない細胞は、ヒボキサンチン、アミノ ビテリン、および/またはミコフェノール酸(好ましくはアデニン、キサンチン および/またはチミジン)、およびチミジンを含有する培地中で生育することが できないが、5−ブロモデオキシウリジン、6−チオグアニン、8−アザプリン などのヌクレオシド類縁体を含有する培地中で生育することができる。逆に、そ のような活性酵素を含有する細胞は上記培地中で生育することができるが、5− ブロモデオキシウリジン、6−チオグアニン、8−アザプリンなどのヌクレオシ ド類縁体を含有する培地中では生育することができない。Therefore, preferred selective culture conditions depend on the genotype of the progenitor cells. mentioned above As in the active thymidine kinase (TK) enzyme, hyboxanthin-phosphoribo siltransferase (HPRT) enzyme, xanthine-guanine phosphoribosi XGPRT enzyme or adenosine phosphoribosyltransferase (XGPRT) enzyme or adenosine phosphoribosyltransferase Cells that do not contain the enzyme spherase (APRT) contain hyboxanthin, amino vitellin, and/or mycophenolic acid (preferably adenine, xanthine) and/or thymidine) and thymidine-containing media. Not possible, but 5-bromodeoxyuridine, 6-thioguanine, 8-azapurine can be grown in media containing nucleoside analogs such as. On the contrary, that Cells containing active enzymes such as 5- Nucleosylated substances such as bromodeoxyuridine, 6-thioguanine, and 8-azapurine It cannot grow in media containing the analogues.
このようなインキュベーションを、所望の選択不可能な遺伝子配列を含有するD NA分子の存在下で行う。好ましくは、該DNA分子が、この所望の遺伝子配列 に隣接し、かつ、所望の遺伝子配列に前駆体細胞のゲノムの予定した遺伝子配列 との相同的組換えを受けさせるに足る2つの相同領域を追加して含有する。該D NA分子は選択可能な遺伝子配列であって、第1の選択的培養条件下で細胞を培 養することによって細胞内におけるその存在または発現を選択することができ、 かつ、第2の選択的培養条件下で細胞を培養することによって細胞内におけるそ の存在または発現を否定的に選択することができる選択可能な遺伝子配列を追加 して含有する。Such incubation is carried out with D containing the desired non-selectable gene sequence. Performed in the presence of NA molecules. Preferably, the DNA molecule contains this desired gene sequence. the planned gene sequence of the progenitor cell's genome adjacent to and to the desired gene sequence Contains two additional regions of homology sufficient to undergo homologous recombination with The D The NA molecule is a selectable gene sequence that allows cells to be cultured under first selective culture conditions. Its presence or expression within the cell can be selected by feeding the and culturing the cells under the second selective culture conditions. Added selectable gene sequences that can negatively select for the presence or expression of and contain it.
好ましい選択可能な遺伝子配列の例には、活性なチミジンキナーゼ(TK)酵素 、ヒボキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)酵素、キサ ンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)酵素または アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ(A P RT)酵素をコード化 する遺伝子配列が含まれる。このような遺伝子配列は陽性選択と陰性選択の両方 に使用することができる。Examples of preferred selectable gene sequences include active thymidine kinase (TK) enzymes. , hyboxanthin-phosphoribosyltransferase (HPRT) enzyme, xa tingin-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT) enzyme or Encodes the adenosine phosphoribosyltransferase (APRT) enzyme Contains gene sequences that Such gene sequences are subject to both positive and negative selection. It can be used for.
選択可能な遺伝子配列として使用できるさらなる遺伝子配列には、ジヒドロ葉酸 レダクターゼ(DHFR)酵素、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アスパラ ギンンンセターゼ(AS)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、ま たはCAD酵素(カルバミルリン酸シンセターゼ、アスパラギン酸トランスカル バミラーゼおよびジヒドロオロターゼ)などの酵素をコード化するものが含まれ る。Additional gene sequences that can be used as selectable gene sequences include dihydrofolate reductase (DHFR) enzyme, adenosine deaminase (ADA), asparagus Ginncetase (AS), hygromycin B phosphotransferase, or CAD enzymes (carbamyl phosphate synthetase, aspartate transcal Contains those encoding enzymes such as vermylase and dihydroorotase) Ru.
これらの酵素の発現が欠損した細胞を作成する方法はSambrookら(”M o1ecular Cloning A Laboratory Manuaド 、第2版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニューヨーク州( 1989) ;この文献は本明細書の一部を構成する)によって記述されている 。これらの遺伝子配列は陽性選択にのみ使用できる。A method for creating cells deficient in the expression of these enzymes is described by Sambrook et al. o1ecular Cloning A Laboratory Manual , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ( 1989); this document is incorporated herein by reference. . These gene sequences can only be used for positive selection.
前駆体細胞中への該DNA分子の導入を可能にするに足る条件下でインキュベー ションを行う。次いで、このように導入されたDNA分子は前駆体細胞のゲノム の予定した遺伝子配列との相同的組換えを起こすことができ、それによって、所 望の選択不可能な遺伝子配列が予定の遺伝子配列中に挿入されている所望の細胞 が生成する。Incubating under conditions sufficient to allow introduction of the DNA molecule into precursor cells. tion. The DNA molecule thus introduced is then integrated into the genome of the progenitor cell. can undergo homologous recombination with the predetermined gene sequence, thereby A desired cell in which the desired non-selectable gene sequence has been inserted into the intended gene sequence. is generated.
第1の選択的培養条件下でその細胞を培養し、次いで、非選択的培養条件下でそ の細胞に染色体内組換えを受けさせ、次いで、第2の選択的培養条件下でその細 胞をインキュベートすることによって、上記のような所望の細胞を回収すること ができる。The cells are first cultured under selective culture conditions, and then the cells are cultured under non-selective culture conditions. cells to undergo intrachromosomal recombination and then culture the cells under second selective culture conditions. Harvesting the desired cells as described above by incubating the cells Can be done.
したがって、好ましい一態様では、該前駆体細胞が活性なヒポキサンチン−ホス ホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)酵素、キサンチン−グアニンホスホ リボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)酵素、またはアデノシンホスホリボ シルトランスフェラーゼ(APRT)酵素を欠き、かつ、該選択可能な遺伝子配 列が活性なHPRT、XGPRT、またはAPRT酵素を発現する。第1の選択 可能な培養条件では、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび/またはミコフェ ノール酸(好ましくはアデニン、キサンチンおよび/またはチミジン)を含有す る培地を使用する。第2の選択可能な培養条件では、5−ブロモデオキシウリジ ン、6−チオグアニン、8−アザプリンなどのヌクレオシド類縁体を含有する培 地を使用する。Therefore, in a preferred embodiment, the progenitor cells are active hypoxanthine-phosphors. holibosyltransferase (HPRT) enzyme, xanthine-guanine phospho ribosyltransferase (XGPRT) enzyme, or adenosine phosphoribo siltransferase (APRT) enzyme and the selectable gene sequence. The cells express active HPRT, XGPRT, or APRT enzymes. 1st choice Possible culture conditions include hypoxanthine, aminopterin and/or mycopherin. Containing nolic acid (preferably adenine, xanthine and/or thymidine) Use a suitable medium. In the second selectable culture condition, 5-bromodeoxyuridine Culture media containing nucleoside analogues such as N, 6-thioguanine, and 8-azapurine. Use the ground.
第2の好ましい態様では、該前駆体細胞が活性なTK酵素を欠き、かつ、該選択 可能な遺伝子配列が活性なTK酵素を発現する。第1の選択可能な培養条件では 、ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地を使用する。In a second preferred embodiment, said progenitor cell lacks an active TK enzyme and said selected A possible gene sequence expresses an active TK enzyme. In the first selectable culture condition A medium containing , hypoxanthine, aminopterin and thymidine is used.
第2の選択可能な培養条件では、ガングンクロビル(gangcyclovir )またはFIAU (Borrelli、 Proc、 Nat’ 1. Ac ad、 Sci、 (U、 S、 A、 ) 85 ニア572(1988j) などのチミジン類 縁体を含有する培地を使用するか(H3Vtk遺伝子を使用する場合)、あるい は5−ブロモデオキシウリジンなどを含有する培地を使用する(細胞tk遺伝子 を使用する場合)。In the second selectable culture condition, gangcyclovir (gangcyclovir) ) or FIAU (Borrelli, Proc, Nat' 1. Ac ad, Sci, (U, S, A,) 85 Near 572 (1988j) Thymidine such as (if using the H3Vtk gene) or use a medium containing 5-bromodeoxyuridine etc. (cell tk gene ).
好ましい陰性選択可能なマーカーはhprt遺伝子である(活性なHPRT酵素 を発現する細胞は6−チオグアニンなど特定のヌクレオシド類縁体の存在下では 生育することができない)。6−チオグアニン選択の効率は細胞密度依存性であ るから、陰性選択剤として6−チオグアニンを用いる場合には、104細胞/c I112の密度を使用することが好ましい。トランスフェクトされた細胞107 個を用いる典型的な実験では、連続的な選択の後、およそ10個の復帰体細胞が 得られるであろう。第1回の選択に“ポリA選択”を用いることによって、復帰 体クローンの相対収率を本質的に増大させることができる。“ポリA選択”につ いては後述の実施例6で詳細に議論する。A preferred negative selectable marker is the hprt gene (active HPRT enzyme In the presence of certain nucleoside analogs such as 6-thioguanine, cells expressing cannot grow). The efficiency of 6-thioguanine selection is cell density dependent. Therefore, when using 6-thioguanine as a negative selection agent, 104 cells/c Preferably, a density of I112 is used. Transfected cells 107 In a typical experiment using individuals, after successive selections approximately 10 revertant cells You will get it. By using “poly A selection” for the first selection, you can return The relative yield of body clones can be substantially increased. Regarding “Poly A selection” This will be discussed in detail in Example 6 below.
■、キメクラ物および形質転換動物の作成本発明のキメラ動物または形質転換動 物は、1以上のDNA分子を前駆体多能性細胞(最も好ましくはES細胞)また はその等硬物中に導入することによって作成される(Robertson、 E 、 J、 、 ”Current Communications in Mo 1ecular Bi盾撃盾■凵h、 Ca pecchi、 M、 R,編、コールドスプリングハーバ−プレス、ニューヨ ーク州コールドスプリングハーバ−(1989)、 39−44頁;この文献は 本明細書の一部を構成する)。“前駆体”という用語は、多能性細胞が本発明の 教示に従って作成される所望の(“トランスフェクトされた”)多能性細胞への 前駆体であることのみを意味するものとする。多能性(前駆体またはトランスフ ェクトされた)細胞を当該技術分野で公知の方法(Evans、 M、 J、ら 、Nature 292:154−156(1981))で生体内で培養してキ メラ動物または形質転換動物を形成させることができる。■ Creation of chimeric animals and transformed animals The chimeric animals or transformed animals of the present invention the one or more DNA molecules into precursor pluripotent cells (most preferably ES cells) or is created by introducing it into the isohard material (Robertson, E. , J, , “Current Communications in Mo 1ecular Bi shield attack shield ■凵h, Ca pecchi, M. R., ed., Cold Spring Harbor Press, New York. Cold Spring Harbor, Ark. (1989), pp. 39-44; (which forms part of this specification). The term "precursor" refers to the pluripotent cells of the present invention. to the desired (“transfected”) pluripotent cells created according to the teachings. It shall only be meant as a precursor. Pluripotency (precursor or transfection) transfected cells) using methods known in the art (Evans, M. J., et al. , Nature 292:154-156 (1981)). Mela animals or transgenic animals can be formed.
どのようなES細胞も本発明に従って使用することができる。しかしES細胞の 一次単離物を使用することが好ましい。このような単離物は、Robertso n、 E、 J、 。Any ES cell can be used according to the invention. However, ES cells Preference is given to using primary isolates. Such isolates are described by Robertso n, E, J,.
−Current Co+amunications in Mo1ecula r Biology’、 Capecchi、M、 R,編Aコールドス プリングハーバ−プレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−(198 9)、 39−44頁)に開示されているCCE細胞系などの胚から直接的に、 あるいはCCE細胞系由来のES細胞のクローン単離C3chwartzber g、 P、 A、ら、 5cience 246二799−803(1989) :この文献は本明細書の一部を構成する)から得ることができる。このような りローン単離は、E、 J、 Robertsonの方法に従って達成すること ができる(ゴeratocarcinomas and Enbryonic Stem Ce1ls:A Practical Approach″、 EA J、 Roberts on編Jプレス、オフスフオード、 1987 、この文献及び方法は本明細書 の一部を構成する)。このようなりローン増殖の目的は、動物への分化効率がよ り高いES細胞を得ることにある。クローン的に選択されたES細胞は、形質転 換動物の生成に関してその先祖細胞系CCEより約10倍効果的である。クロー ン選択は、本発明の組換え法には利益を提供しない。胚からクローン的に誘導さ れたES細胞系の例はES細胞系ABI(hprtつまたはAB2.1(hpr t−)である。-Current Co+communications in Mo1ecula r Biology’, Capecchi, M, R, ed. A Colds Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (198 9), pp. 39-44) directly from the embryo, such as the CCE cell line disclosed in Alternatively, clonal isolation of ES cells derived from CCE cell line C3chwartzber G, P, A, et al. 5science 2462799-803 (1989) (This document forms part of this specification). like this Loan isolation can be accomplished according to the method of E. J. Robertson. (Go eratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach'', EA J. Roberts on ed. J Press, Ofsford, 1987, this document and method are incorporated herein by reference. ). The purpose of such lawn propagation is to increase the efficiency of differentiation into animals. The aim is to obtain ES cells with higher yield. Clonally selected ES cells are transformed It is approximately 10 times more effective than its progenitor cell line CCE in producing moults. claw This selection provides no benefit to the recombinant method of the invention. clonally derived from embryos Examples of ES cell lines used are the ES cell lines ABI (hprt) or AB2.1 (hpr t-).
ES細胞をE、 J、 Robertson(ゴeratocarcinoma s and Enbryonfc Stem Ce1ls:` P ractical Approach”、 E、 J、 Robertson編 、 IRLブレス、オフスフオード、 1987.71−1P2 頁;この文献は本明細書の一部を構成する)に記述されているように小孔細胞( STo細胞(特に5NC4STO細胞)および/または一次胚性線維芽細胞など )上で培養することが好ましい。小孔(および/または線維芽)細胞は異常なE S細胞のクローン的過剰成長を除去するように機能する。最も好ましくは、白血 球阻子因子(“Iif”)の存在下テコれらの細胞を培養する(Gough、 N、 M、ら、 Reprod、 Fertil、 Dev、 1 :281− 288(1989) ; YaIllamori、 Y、ら、5cience 246:1412−141U(1989) ;これら 両文献は本明細書の一部を構成する)。Iifをコード化する遺伝子はすでにク ローン化されているので(Gough、 N、 M、ら、 Reprod、 F ertil、 Dev、 1 :281−288(1989j)、 当該技術分野で公知の手段を用いてこの遺伝子で小孔細胞を形質転換し、次いで 1ifを培養培地中に分泌する形質転換した小孔細胞上でES細胞を培養するこ とが特に好ましい。ES cells were prepared by E, J, Robertson (Goeratocarcinoma s and Enbryonfc Stem Ce1ls:`P Ractical Approach”, edited by E. J. Robertson. , IRL Bulletin, Ofsford, 1987.71-1P2 page; this document is incorporated herein by reference). STo cells (particularly 5NC4STO cells) and/or primary embryonic fibroblasts, etc. ) is preferred. Stolum (and/or fibroblast) cells have abnormal E Functions to eliminate clonal overgrowth of S cells. most preferably leukemia Culturing these cells in the presence of globulin factor (“Iif”) (Gough, N, M, et al., Reprod, Fertil, Dev, 1:281- 288 (1989); YaIllamori, Y. et al., 5science 246:1412-141U (1989); these (Both documents are incorporated herein by reference). The gene encoding Iif has already been cloned. Since it has been loaned (Gough, N, M, et al., Reprod, F Ertil, Dev, 1:281-288 (1989j), Transforming stoma cells with this gene using means known in the art and then Culturing ES cells on transformed stomal cells that secrete 1if into the culture medium is particularly preferred.
醤歯目(即ち、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚 、ブタ、ウシ、霊長類およびヒトなどの哺乳動物から誘導または単離されるES 細胞が好ましいものの、ES細胞系はどのような種(例えばニワトリなど)から も誘導または単離することができる。Logomorpha (i.e. mice, rats, hamsters, etc.), rabbits, sheep, goats, fish ES derived or isolated from mammals such as pigs, cows, primates and humans. Although cells are preferred, ES cell lines can be derived from any species (e.g. chicken). can also be induced or isolated.
■、キメクラ物および形質転換植物の作成本発明のキメラ植物および形質転換植 物は、本明細書に開示される方法の使用によってDNA分子を受容した植物細胞 の再生を通して作成される。■ Creation of chimeric plants and transformed plants The chimeric plants and transformed plants of the present invention A plant cell that has received a DNA molecule by use of the methods disclosed herein created through the reproduction of
プロトプラストを単離することができ、これを培養することによって完全な再生 植物体を与えることができる植物はすべて、導入された遺伝子配列を含有する完 全な植物を回収すべ(、本発明によって形質転換することができる。好適な植物 のい(つかには例えば以下の属の種が含まれる:オランダイチゴ属、ロータス属 、ウマゴヤシ属、オノブリチス(Onobrychis)属、シャジクソウ属、 トリゴネラ(Trigonella)*、ササゲ属、ミカン属、リニウム(Li num)属、ツウロウソウ属、マニコット(Manicot)属、ニンジン属、 アラビドプシス(Arabidopsis)属、アブラナ属、ダイコン属、ンナ ビス(Sinapis)属、アトロバ(Atropa)属、トウガラシ属、チョ ウセンアサガオ属、ヒヨス属、トマト属、タバコ属、ナス属、ツクバネアサガオ 属、キツネノテブクロ属、マジョラナ(llajorana)属、チコリラム( Cichorium)属、ヒマワリ属、アキノノゲシ属、スズメノチャヒキ属、 アスパラガス属、キンギョソウ属、ワスレグサ属、アフリカランラン属、テンジ クアオイ属、キビ属、チカラシバ属、キンポウゲ属、サワギク属、サルメンバナ 属、キュウリ属、ブロワリア(Brovallia)属、ダイズ属、ロリウム( Lolium)属、トウモO)シ属、コムギ属、モロコン属、サツマイモ属、ト ケイソウ属、シクラメン属、リンゴ属、サクラ属、バラ属、キイチゴ属、ハコヤ ナギ属、サンタルム(Santarum)属、ネギ属、ユリ属、スイセン属、ア ナナス属、ナンキンマメ属、インゲンマメ属、エントウ属、及びチョウセンアサ ガオ属。Protoplasts can be isolated and cultured to achieve complete regeneration. All plants that are capable of giving plant matter contain a complete plant containing the introduced gene sequence. Whole plants (which can be transformed according to the present invention) should be harvested. The genus includes, for example, species of the following genera: Strawberry, Lotus , Alfalfa genus, Onobrychis genus, Rhododendron genus, Trigonella*, cowpea, citrus, linium (Li) num) genus, Manicot genus, Manicot genus, Carrot genus, Arabidopsis, Brassica, Radish, Nanna Sinapis spp., Atropa spp., Capsicum spp. Asus genus, Hyos genus, Tomato spp, Tobacco spp, Solanum spp, Tsukubane spp. Genus, Foxglove, Majorana, Chicorylum ( genus Cichorium, genus Helianthus, genus Cichorium, genus Cichorium, Asparagus, Snapdragon, Forget-me-not, African Orchid, Tenji genus Quaifolia, genus Millet, genus Chikarasiba, genus Ranunculum, genus Prunus genus, Salumana genus. Genus, Cucumber, Brovallia, Soybean, Lolium ( genus Lolium, genus Triticum, genus Triticum, genus Morocon, genus Sweetpotato, genus Triticum Diatomina, Cyclamen, Apple, Prunus, Rose, Rubus, Jakoya Allium genus, Santarum genus, Allium genus, Lily genus, Narcissus genus, Solanum, Bean, Bean, Trifolium, and Datura Genus Gao.
王な穀物種、サトウキビ、トウヂサ属の各種(ビートや砂糖大根など)、綿、果 樹およびその他の樹木、豆果および野菜などを含む(ただしこれらに限定される わけではない)、実質上すべての植物を培養細胞または培養組織から再生させる ことができるという一連の証拠が増加しつつある。The main grain species, sugarcane, various species of the genus Euphorbia (such as beets and sugar beets), cotton, fruit including (but not limited to) trees and other trees, legumes and vegetables; ), virtually all plants can be regenerated from cultured cells or tissues. There is a growing body of evidence that it can be done.
培養プロトプラストからの植物再生については、Evansら、“プロトプラス トの単離と培養(原題:Protoplast l5olation and Cu1ture)”、 &ndbook of Plant C■P I Cu1ture 1:124−176(マクミランパブリッシングカンパニ ー、ニューヨーク、 1983)、M、 R,Davey、 ”植物プロトプラ ストの培養と再生に関する最近の進歩(原題:Recent Developm ents in the Cu1ture and Regeneration of Plant Protopl≠唐狽刀j”、Pr otoplasts、 1983−Lecture Proceedings、 19−29頁(ビルクハウザー、バーゼル、 1983)A P、 J、 Dale、“穀類およびその他の扱いにくい農作物のプロトプラス ト培養と植物再生(原題:Protoplast Cu1ture and P lant Regeneration of Cereals and 0狽■ ■秩@R ecalcitrant Crops)”、 Protoplasts 198 3−Lecture Proceedings、 31−4P頁(ビルク ハウザー、バーゼル、 1983)、H,Binding、 −植物の再生(原 題:Regeneration of Plants)−、Plant Pro toplasts、 21−37頁(CRCプレス、ボカシートン、 1985 )に記述されている。For plant regeneration from cultured protoplasts, see Evans et al., “Protoplasts Isolation and culture of Protoplast (original title: Protoplast l5olation and Culture)”, &ndbook of Plant C■P I Curture 1:124-176 (Macmillan Publishing Company) -, New York, 1983), M., R., Davey, “Plant Protoplasts” Recent Developments in the Cultivation and Regeneration of Stroke ents in the Culture and Regeneration of Plant Protopl≠Karakuto j”, Pr otoplasts, 1983-Lecture Proceedings, Pages 19-29 (Birkhauser, Basel, 1983) A P., J. Dale, “Protoplus for Cereals and Other Difficult Crops” Protoplast Culture and Plant Regeneration (Original title: Protoplast Culture and P lant Regeneration of Cereals and 0■ ■Chichi@R ecalcitrant Crops)”, Protoplasts 198 3-Lecture Proceedings, page 31-4 (Birk Hauser, Basel, 1983), H. Binding, - Plant Regeneration (Original Title: Regeneration of Plants)-, Plant Pro toplasts, pp. 21-37 (CRC Press, Boca Seton, 1985 ) is described.
再生は植物種間で様々であるが、一般的には導入された遺伝子配列を含有する形 質転換されたプロトプラストの懸濁液を形成させる。次に、このプロトプラスト 懸濁液からの胚形成を誘発して天然の胚と同様の熟成および発芽段階に至らせる ことができる。培養培地は一般に種々のアミノ酸並びにオーキシンやサイトキニ ンなどのホルモンを含有するであろう。グルタミン酸とプロリンを培地中に添加 することも(とりわけトウモロシやアルファルファなどの種については)有利で ある。通常、苗条と根は同時に発育する。効率的な再生は培地、遺伝子型および その培養の経歴に依存するであろう。これら3つの変数を制御すれば、再生には 完全な再現性があり繰り返すことができる。Regeneration varies between plant species, but is generally a form containing the introduced gene sequence. A suspension of transformed protoplasts is formed. Next, this protoplast Induce embryogenesis from suspension to ripening and germination stages similar to natural embryos be able to. Culture media generally contain various amino acids as well as auxins and cytokines. It may contain hormones such as Add glutamic acid and proline to the medium It is also advantageous (particularly for species such as corn and alfalfa) to be. Usually shoots and roots develop at the same time. Efficient regeneration depends on media, genotype and It will depend on its culture history. By controlling these three variables, playback Fully reproducible and repeatable.
同系交配植物を作成するために、形質転換した植物細胞から成長した成熟した植 物を自家授粉させる。同系交配植物は導入した遺伝子配列を含有する種子を生産 する。これらの種子を生育することによって、この所望の遺伝子配列を発現する 植物を作成することができる。Mature plants grown from transformed plant cells to create inbred plants Let things self-pollinate. Inbred plants produce seeds containing the introduced gene sequence do. Express this desired gene sequence by growing these seeds Can create plants.
再生した植物から得られる花、種子、葉、枝、果実などの部分は本発明によって 包含される。再生した植物の子孫および変種並びに突然変異体も本発明の範囲に 包含される。Parts such as flowers, seeds, leaves, branches, and fruits obtained from regenerated plants can be processed according to the present invention. Included. Progeny and varieties and mutants of regenerated plants are also within the scope of the invention. Included.
本明細書で使用する場合、変種とは、子孫植物に有性的に伝達される遺伝性変化 を含む、安定な遺伝性の表現型変化をいう。As used herein, variety refers to a heritable change that is sexually transmitted to progeny plants. A stable, heritable phenotypic change that includes
■、遺伝子発現 一態様として、本発明の方法に従って受容細胞中に導入されるべきDNA分子を 、宿主細胞内で自律的に複製することができるプラスミドまたはウィルスベクタ ー(またはその誘導体)中に組込むであろう。■, Gene expression In one embodiment, the DNA molecule to be introduced into the recipient cell according to the method of the invention is , a plasmid or viral vector that can replicate autonomously within a host cell - (or derivatives thereof).
好ましい原核細胞ベクターには大腸菌中で複製することができるプラスミド(例 えばpBR322、CoIEl、psclol、pAcYc181、πvXなど )などのプラスミドが含まれる。このようなプラスミドは例えばManiati s、 T、ら(1o1ecular Cloning、^Laboratory 1lanual’、コールドスプリング/ % −/ <−ブレス。Preferred prokaryotic vectors include plasmids that can replicate in E. coli (e.g. For example, pBR322, CoIEl, pscol, pAcYc181, πvX, etc. ) and other plasmids. Such plasmids are for example Maniati s, T, et al. (1o1ecular Cloning, ^Laboratory 1lanual', Cold Spring/%-/<- Breath.
ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−(1982))によって開示されて いる。Cold Spring Harbor, New York (1982)) There is.
バチルスプラスミドにはpc194、pc221、pT127などが含まれる。Bacillus plasmids include pc194, pc221, pT127, and the like.
このようなプラスミドはGryczan、 T、 (−恥1ecular Bi ology of the Bacilli”、アカデミツクプレス、ニューヨ ーク州(1982)、 307−329頁)によって開示されている。好適なス トレプトマイセスプラスミドにはp I J 101 (Kendall、 K 、 J、ら、J、Bacteriol、 169+4177−4183(198 7))およびφC31(Chater、 K、 F、ら、 −3ixth In terna狽奄盾獅■ I Symposium on Actinomycetales Biolo gy”、アカデミアイφカイト―ブダペストハンガリー(1986)、 45− 54頁)などのストレプトマイセスlくクテリオファージが含まれる。’/s− トモナスプラスミドについてはJohn、 J、 F、ら(Rev、 Infe ct、 Dis、 8:693−704(1986))およびIzaki、 K 、 (Jpn、 J、 Bacteriol、 33ニア29−29−742( 1X7の総説が ある。Such plasmids are described by Gryczan, T. "ology of the Bacilli", Academic Press, New York (1982), pp. 307-329). Preferred spot The Treptomyces plasmid contains pIJ101 (Kendall, K. , J, et al., J, Bacteriol, 169+4177-4183 (198 7)) and φC31 (Chater, K, F, et al. -3ixth In terna Koenshi Shield Lion ■ I Symposium on Actinomycetales Biolo gy”, Akademiai φ Kaito - Budapest Hungary (1986), 45- Streptomyces and cteriophages such as p. 54) are included. '/s- tomonas plasmid by John, J., F., et al. (Rev, Infe ct, Dis, 8:693-704 (1986)) and Izaki, K. , (Jpn, J, Bacteriol, 33 Near 29-29-742 ( A review of 1X7 be.
好適な酵母ベクターには酵母2ミクロン環状体、発現プラスミドYEP13、Y CPおよびYRPまたはそれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当 該技術分野でよ(知られている(Botstein、 D、ら」iami Th tr、 Sy+sp、 19 +265−274(19g2) : Broac h、 J、 R,、ゴhe Mo1ecular Biology of th e Yeast Sacchar盾高凾モ■刀@: Lif e Cycle and Inheritance−、)−ルドスプリング/ \−/ <−ラボラトリ−、二x−ヨーク州コールドスプリングハーバ−、44 5−470頁(1981) ; Broach、 J、 R,、Ce1l 28 二203−204(1982))。Suitable yeast vectors include the yeast 2 micron circular, expression plasmids YEP13, Y Included are CP and YRP or derivatives thereof. Such plasmids are Well known in the technical field (Botstein, D. et al. tr, Sy+sp, 19+265-274 (19g2): Broac h, J, R,, he Mo1ecular Biology of th e Yeast Sacchar Shield Takakamo ■ Katana @: Lif e Cycle and Inheritance-,)-Led Spring/ \-/<-Laboratory, 2x-Cold Spring Harbor, York, 44 pp. 5-470 (1981); Broach, J. R., Ce1l 28 2203-204 (1982)).
哺乳類宿主中でDNA分子を複製するために使用できるベクターの例には、ウシ パピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルスまたはSV40ウィ ルスなどの動物ウィルスが含まれる。Examples of vectors that can be used to replicate DNA molecules in mammalian hosts include the bovine papillomavirus, polyomavirus, adenovirus or SV40 virus Contains animal viruses such as Rus.
■1本発明の使用 本発明の方法は所望の遺伝子配列を動物細胞または植物細胞中に導入することを 可能にする。■1 Use of the present invention The method of the present invention allows the introduction of a desired gene sequence into animal or plant cells. enable.
第1の態様として、所望の遺伝子配列を含有するキメラ動物または形質転換細胞 を作成すべく、動物の生殖系列細胞中にDNAを導入するために本発明の方法を 用いることができる。ここに記述する方法を適用することによって作成され得る 動物には、ニワトリ、ヒト以外の哺乳動物(特に、薔歯目(即ちマウス、ラット 、ハムスターなど)、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ウシ、ヒト以外の霊長類)が 含まれる。In a first embodiment, a chimeric animal or transformed cell containing the desired gene sequence The method of the present invention can be used to introduce DNA into the germline cells of an animal to create a Can be used. can be created by applying the method described here Animals include chickens, non-human mammals (particularly members of the Order Rodentia (i.e. mice, rats). , hamsters, rabbits, sheep, goats, fish, cows, non-human primates). included.
上述のように、所望の遺伝子配列はどのような長さであってもよく、またどのよ うなヌクレオチド配列を有してもよい。具体的には、ある細胞の予め選択された 遺伝子中に1塩基または複数塩基の改変、挿入または欠失を作成するために、所 望の遺伝子配列の配列を設計することができる。As mentioned above, the desired gene sequence can be of any length and of any length. It may have a nucleotide sequence such as Specifically, a preselected cell In order to create single or multiple base alterations, insertions or deletions in a gene, A desired gene sequence can be designed.
このような変化が天然の遺伝子配列の翻訳される領域内にある場合には、天然タ ンパク質の新しいタンパク質変種を得ることができる。例えば改善された(即ち 、より安定な、より活性な、など)酵素、結合タンパク質、レセプター、レセプ ター配位子などを生産する動物を作成するために、このような手法を用いること ができる。If such changes are within the translated region of the natural gene sequence, the natural protein New protein variants of proteins can be obtained. For example, improved (i.e. , more stable, more active, etc.) enzymes, binding proteins, receptors, receptors Using such techniques to create animals that produce ter-ligands etc. Can be done.
天然の遺伝子が異種構造遺伝子と置換している細胞を作成するために本発明の方 法を用いることができる。ある遺伝子がある形質転換細胞の種とは異なる種から 誘導され得る場合、その遺伝子はその形質転換細胞にとって異種構造であるとさ れる。The method of the present invention is used to create cells in which natural genes are replaced with foreign structural genes. The law can be used. A given gene is from a different species than that of the transformed cell. If it is inducible, the gene is considered to be a foreign construct to the transformed cell. It will be done.
1つの態様として、この置換を1段階で達成することができるcrg:I3)。In one embodiment, this substitution can be accomplished in one step crg:I3).
このような置換を達成するためには、所望の遺伝子配列及び相同領域を含有する DNA分子を受容細胞中に導入する。その細胞中に選択可能なマーカー遺伝子を も導入し、組換えを起こした細胞を選択するためにこれを使用する。この方法は 、相同領域に隣接する正常な配列の、所望のDNA配列を有する異種構造配列と の置換をもたらす。To accomplish such a replacement, one that contains the desired gene sequence and homologous regions must be A DNA molecule is introduced into a recipient cell. a selectable marker gene in the cell. This is also used to select cells that have undergone recombination. This method is , a heterologous structural sequence having the desired DNA sequence of the normal sequence adjacent to the homologous region; results in the replacement of
第2の態様として、この置換を2段階で行うことができるC図4)。上述の態様 と同様に、所望の遺伝子配列および相同領域を含有するDNA分子を細胞に提供 する。このDNA分子は、組換え事象が起こって導入したDNA分子が相同部位 で染色体中に挿入されている細胞を選択するために使用する選択可能なマーカー 遺伝子をも含有する。このような挿入部位の構造を図4Aに表す。In a second embodiment, this substitution can be performed in two steps (Fig. 4). Aspects mentioned above Similarly, providing cells with a DNA molecule containing the desired gene sequence and homologous regions do. When a recombination event occurs, this DNA molecule is introduced into a homologous site. a selectable marker used to select cells that have been inserted into the chromosome in It also contains genes. The structure of such an insertion site is shown in FIG. 4A.
重要なことに、この態様では、導入したDNA分子が“陰性選択可能な”マーカ ー遺伝子をも含有するであろう。この“陰性選択可能な”マーカー遺伝子は、第 2の組換え事象が起こって挿入したDNAの欠失がもたらされた細胞を選択する ために使用することができる。Importantly, in this embodiment, the introduced DNA molecule contains a "negatively selectable" marker. - will also contain genes. This “negatively selectable” marker gene Select cells in which the recombination event of step 2 has occurred resulting in the deletion of the inserted DNA. can be used for.
図4Bに示すように、遺伝子置換を完了させるために第2のDNA分子を使用す る。この第2のDNA分子が何らかの選択可能なマーカー遺伝子を含有する必要 はない。第2のDNA分子を受容すると、第2の組換え事象が起こって、“第2 の”DNA分子と組込まれている“第1の”DNA分子(これは所望のDNA配 列、選択可能なマーカー配列及びその分子に含有されている“陰性選択可能な“ マーカー配列を含む)が交換される。本発明のこの側面を図4Bに示す。As shown in Figure 4B, using a second DNA molecule to complete the gene replacement Ru. This second DNA molecule must contain some selectable marker gene. There isn't. Upon receipt of the second DNA molecule, a second recombination event occurs and the “second a “first” DNA molecule that is integrated with the “first” DNA molecule (this is the desired DNA sequence) sequence, selectable marker sequence and “negatively selectable” contained in the molecule. (including marker sequences) are exchanged. This aspect of the invention is illustrated in Figure 4B.
本発明のもう1つの態様として、陽性選択マーカー(nptII遺伝子または産 且工遺伝子など)と陰性選択マーカー(1区遺伝子など)の両方を含有する“カ セット”構築物を用いることによって、微細な突然変異を所望の遺伝子座に導入 することができる。この態様では、まずその構築物の陽性選択能力を用いてこれ ら2つの選択マーカーを所望の遺伝子座中に導入する。次に、所望の突然変異を 含有するDNA分子を細胞に提供することによって、所望の微細な突然変異(置 換、挿入、欠失など)を導入する。(陰性選択マーカーを利用して)上記“カセ ット”の欠失を選択することによりごカセット°配列の、所望の突然変異を含有 するDNA配列との置換をもたらす組換え事象を選択することができる。本発明 のこの態様を図5に表す。Another aspect of the invention includes a positive selection marker (nptII gene or and a negative selection marker (such as the 1st district gene). Introducing small mutations at desired loci by using “set” constructs can do. In this embodiment, the positive selection ability of the construct is first used to and two selectable markers are introduced into the desired genetic locus. Then add the desired mutation to By providing cells with DNA molecules containing (replacements, insertions, deletions, etc.). (using a negative selection marker) Contain the desired mutations in your cassette ° sequence by selecting deletions in the A recombination event can be selected that results in a replacement of the DNA sequence. present invention This aspect of is represented in FIG.
染色体の隣接する領域(複数)を所望の遺伝子配列と置換するために本発明の方 法を使用することもできる。したがって本発明には、改変または置換され得るD NA領域の大きさに関する制約がない。本発明のこの側面を5段階からなる一連 の操作(図6A〜6E)として図6に表す。この方法はどのような遺伝子配列に も適用できる。これは、異種構造免疫グロブリン(免疫グロブリンの重鎮遺伝子 座など)を含有する細胞を作成する際にとりわけ有用である。The method of the present invention can be used to replace adjacent regions of a chromosome with a desired gene sequence. You can also use the method. Therefore, the present invention includes D which may be modified or substituted. There are no restrictions regarding the size of the NA area. This aspect of the invention can be described in a five-step sequence. The operations are shown in FIG. 6 as (FIGS. 6A to 6E). What kind of gene sequence can this method be used for? can also be applied. This is a heterologous structural immunoglobulin (a major immunoglobulin gene). It is particularly useful in creating cells containing cells such as loci).
染色体の大きな領域を所望の遺伝子配列と置換する際の第1段階には初期標的の 設定が含まれる。この段階では、所望の置換配列全体の“第1断片”を含有する DNA分子を受容細胞に与える(図6A)。この所望の置換配列の“第1断片″ は選択可能なマーカー配列(最も好ましくはnp tI工遺伝子)をその末端に 含有する。The first step in replacing a large region of a chromosome with the desired gene sequence is to identify the initial target. Contains settings. This step contains the "first fragment" of the entire desired replacement sequence. DNA molecules are given to recipient cells (Figure 6A). “First fragment” of this desired replacement sequence has a selectable marker sequence (most preferably the nptI engineered gene) at its end. contains.
またこのDNA分子は、陽性選択法と陰性選択法の両方が存在する遺伝子配列の 非機能的断片をコード化する“二重選択”遺伝子配列をも含有する。hprt− 細胞に関連して使用する場合、このような遺伝子の例は産旦↓遺伝子である。機 能的な呈且1遺伝子を発現する細胞は、それらのHAT培地中での生育能によっ て選択することができる。機能的な呈旦工遺伝子を欠く細胞は、それらの6−チ オグアニン存在下での生育能によって選択することができる。This DNA molecule also contains genetic sequences for which both positive and negative selection methods exist. It also contains "dual selection" gene sequences encoding non-functional fragments. hprt- When used in connection with cells, an example of such a gene is the parturition ↓ gene. machine Cells that are functional and express one gene are determined by their ability to grow in HAT medium. can be selected. Cells lacking a functional cellulose gene have their 6-ti It can be selected based on its ability to grow in the presence of oguanine.
相同的組換えは、相同領域における該DNA分子の細胞ゲノムへの挿入をもたら す(図6A)。重要なことに、この段階は選択可能なマーカー遺伝子を含有する ゲノムを持つ細胞の生成をもたらすので、所望の組換え事象を選択することが可 能である。Homologous recombination results in the insertion of the DNA molecule into the cell genome at a homologous region. (Figure 6A). Importantly, this step contains a selectable marker gene It is possible to select the desired recombination event as it results in the generation of cells with the genome. It is Noh.
本性の第2段階では、篤2のDNA分子を上記細胞に与える。この第2DNA分 子は所望の置換配列の“第2断片”と共に内部欠失ゆえに機能的な遺伝子産物を コード化し得ない二重選択遺伝子の配列を含有する。相同的組換えは、機能的な 二重選択遺伝子が生成する様式で、細胞ゲノムへの第2DNA分子の挿入をもた らす(図6B)。また組換えは二重選択遺伝子の非機能的断片の組込みをももた らす。重要なことに、この段階は機能的二重選択遺伝子を含有するゲノムを持つ 細胞の生成をもたらすので、所望の組換え事象を選択することが可能である。The second step in nature is to provide the cells with Atsushi 2 DNA molecules. This second DNA The offspring will have a functional gene product due to the internal deletion along with a “second fragment” of the desired replacement sequence. Contains the sequence of a double selection gene that cannot be encoded. Homologous recombination is a functional a double-selected gene that results in the insertion of a second DNA molecule into the genome of the cell. (Figure 6B). Recombination also allows for the integration of non-functional fragments of dual selection genes. Ras. Importantly, this step is necessary to ensure that genomes containing functional dual selection genes are It is possible to select the desired recombination event as it results in the generation of cells.
本性の第3段階では、上記細胞に第3のDNA分子を与える。この第3DNA分 子は、所望の置換配列の“第1′断片及び“第2”断片を共に含有する。相同組 換えは、機能的な二重選択遺伝子を削除する様式で、細胞ゲノムへの第3DNA 分子の挿入をもたらす。二重選択遺伝子の非機能的断片(第2段階で生成したも の)はこの組換えによって影響を受けず、保持される(図6C)。重要なことに 、この段階は二重選択遺伝子を欠くゲノムを持つ細胞の生成をもたらすので、所 望の組換え事象を選択することが可能である。The third step in nature provides the cells with a third DNA molecule. This third DNA The offspring contains both the "first" and "second" fragments of the desired replacement sequence. The modification involves adding a third DNA to the cell genome in a manner that deletes a functional dual selection gene. results in the insertion of molecules. Non-functional fragments of double selection genes (also generated in the second step) ) is unaffected by this recombination and is retained (Fig. 6C). importantly , this step results in the generation of cells with genomes lacking the dual selection gene, so It is possible to select the desired recombination event.
本性の第4段階では、上記細胞に第4のDNA分子を与える。この第4DNA分 子は所望の置換配列の“第3断片”、及び、第2段階と同様に内部欠失ゆえに機 能的な遺伝子産物をフード化し得ない二重選択遺伝子の配列を含有する。相同的 組換えは、機能的な二重選択遺伝子が生成する様式で、細胞ゲノムへの第4DN A分子の挿入をもたらす(図6D)。また組換えは、二重選択遺伝子の非機能的 断片の挿入をももたらす。重要なことに、この段階は機能的な二重選択遺伝子を 含有するゲノムを持つ細胞の生成をもたらすので、所望の組換え事象を選択する ことが可能である。The fourth step in nature provides the cells with a fourth DNA molecule. This fourth DNA The child is the “third fragment” of the desired replacement sequence and, as in the second step, a mechanism due to an internal deletion. Contains the sequence of a dual selection gene that cannot food a functional gene product. homologous Recombination adds the fourth DN to the cell genome in a manner that produces a functional dual selection gene. resulting in insertion of the A molecule (Fig. 6D). Recombination also causes non-functionalization of double-selected genes. It also results in the insertion of fragments. Importantly, this step generates functional dual selection genes. Select the desired recombination event as it will result in the generation of cells with the containing genome Is possible.
本性の第5段階では、上記細胞に第5のDNA分子を与える。この第5DNA分 子は所望の置換配列の“第2”断片および“第3”断片を共に含有する。相同的 組換えは、機能的な二重選択遺伝子を削除する様式で、細胞ゲノムへの第5DN A断片の挿入をもたらす。二重選択遺伝子の非機能的断片(第4段階で生成した もの)はこの組換えによって影響を受けず、保持される(図60)。重要なこと に、この段階は二重選択遺伝子を欠くゲノムを持つ細胞の生成をもたらすので、 所望の組換え事象を選択することが可能である。The fifth step in nature provides the cells with a fifth DNA molecule. This fifth DNA The child contains both the "second" and "third" fragments of the desired replacement sequence. homologous Recombination adds the fifth DN to the cell genome in a manner that deletes a functional dual selection gene. resulting in the insertion of the A fragment. Non-functional fragments of double selection genes (generated in the fourth step) (Fig. 60) is unaffected by this recombination and is retained (Fig. 60). important things , since this step results in the generation of cells with genomes lacking the dual selection genes, It is possible to select the desired recombination event.
理解されるであろうように、上記の段階の正味の効果は、特定の所望の遺伝子の “第1”、“第2°および“第3”の“断片”を連続的な様式で含有するように 加工されたゲノムを有する細胞が作成されることである。この細胞のゲノム中に 追加の“断片”を導入するためにこれらの段階を必要なだけ繰り返すことができ る。この方法で、単一のベクターの使用では導入することができなかった異種構 造遺伝子、染色体断片または染色体を含有する細胞を構築することができる。上 述のように、本性の各段階は選択可能である。As will be appreciated, the net effect of the above steps is to to contain "first", "second" and "third" "fragments" in a sequential manner. The goal is to create cells with engineered genomes. in the genome of this cell These steps can be repeated as many times as necessary to introduce additional “fragments”. Ru. In this way, heterogeneous constructs that could not be introduced using a single vector can be Cells containing synthetic genes, chromosomal fragments or chromosomes can be constructed. Up As mentioned, each stage of nature is selectable.
具体的には、“擬人化“抗体(即ちヒト中で非免疫原性であるヒト以外の抗体X Robinson、 R,R,ら1国際特許公開P CT/ U S 8610 2269 ; Akira、 Lら、欧州特許出願184187 : Tani guchi、 M、 、欧州特許出願171496 ; Morrison、 Sル、ら、欧州特許出願173494 : Neuberger、 M、 S、 ら、PCT出願WOg6101533 ; Cabilly、 S、ら、欧州特 許出願125023 ; Better、 M、ら、 5cience 240 :10104l−1043(198; Liu、^、Y、ら、 oroc、 N atl。Specifically, "anthropomorphic" antibodies (i.e., non-human antibodies that are non-immunogenic in humans) Robinson, R, R, et al. 1 International Patent Publication P CT/U S 8610 2269; Akira, L et al., European Patent Application 184187: Tani Guchi, M., European Patent Application 171496; Morrison, S Le, et al., European Patent Application 173494: Neuberger, M, S, et al., PCT Application WOg6101533; Cabilly, S. et al., European Patent Application Patent application 125023; Better, M. et al., 5science 240 :10104l-1043(198; Liu, ^, Y, et al., oroc, N atl.
^cad、 Sci、 USA84 :3439−3443(1911t7) ; Liu、 A、 Y、ら、 J、 ImmunoL 1R9:3521−3 526(1987) ; Sun、 L、 K、ら、 Proc、 Natl、^cad、 Sci、 USA 84:214−218(1987) ; N15■堰{aura、 Y、ら、Can c、 Res、 47:999−1005(1987) : food、 C, R,ら、 Nature 314:446−449(198T)) : 5ha vら、J。^cad, Sci, USA84: 3439-3443 (1911t7) ; Liu, A, Y, et al., J, ImmunoL 1R9:3521-3 526 (1987) ; Sun, L, K, et al., Proc, Natl, ^cad, Sci, USA 84:214-218 (1987); N15 ■ Weir {aura, Y, et al, Can c, Res, 47:999-1005 (1987): food, C, R, et al. Nature 314:446-449 (198T)): 5 ha v et al., J.
Natl、 Cancer In5t、 80:I553−1559(198g ))を作成するために本発明のこの側面を用いることができる。Natl, Cancer In5t, 80:I553-1559 (198g )) This aspect of the invention can be used to create.
また、疾患に対して優れた耐性を有する動物、改善された食物供給源を構成また は生産する動物、より望ましい特性を有する繊維、皮革などを提供する動物を作 成するために本性を用いることもできる。またヒトの遺伝的疾患の新しい動物モ デルを作成するために本性を用いることもできる。例えば本性を用いて動物のC D4fi縁体を“擬人化”すれば、AIDSのための動物モデルを提供すること ができる。このような動物モデルを薬剤試験に用いることによって、遺伝的疾患 の新しい療法の開発を促進することができる。Also, animals with better resistance to disease, or constituting an improved food source. produce animals that provide fibers, leather, etc. with more desirable characteristics. You can also use your true nature to accomplish something. Also new animal models of human genetic diseases. You can also use nature to create dels. For example, using the nature of an animal, C Anthropomorphizing the D4fi body could provide an animal model for AIDS Can be done. By using such animal models for drug testing, genetic disease can facilitate the development of new therapies.
さらに本発明は、医学的または臨床的に重要な異種構造遺伝子中に突然変異を含 有する細胞または形質転換動物の形成をも可能にする。ある遺伝子がヒトまたは 動物の疾患または状態に関連するタンパク質のイソタイプを発現する場合に、そ の遺伝子を、医学的または臨床的に重要であるという。このような遺伝子の例に は、トポイソメシーゼp180,5−αレダクターゼ、ACAT、5−リポキシ ゲナーゼ、インスリンレセプター、インターロイキン−2レセプター、表皮成長 因子レセプター、セラトニンレセプター、ドーパミンレセプター、GABAレセ プター、Vzバソプレシンレセブター、Gタンパク質(信号伝達)、ホスホリパ ーゼCタンパク質およびインスリンをコードする遺伝子が含まれる。顕微注入に よって作成されたヒトインスリンを発現する形質転換マウスが5elden、 R,F、ら(欧州特許公開番号247494 :この文献は本明細書の一部を構 成する)によって報告されている。Furthermore, the present invention provides for medically or clinically important heterologous structural genes containing mutations. It also allows the formation of cells or transformed animals with A gene is human or If it expresses an isotype of a protein that is associated with a disease or condition in animals. A gene is said to be of medical or clinical importance. An example of such a gene is topoisomesase p180, 5-α reductase, ACAT, 5-lipoxy genase, insulin receptor, interleukin-2 receptor, epidermal growth factor receptor, seratonin receptor, dopamine receptor, GABA receptor protein, Vz vasopressin receptor, G protein (signal transduction), phospholipa This includes the genes encoding the enzyme C protein and insulin. For microinjection Therefore, the transgenic mouse that expresses human insulin was created. R, F, et al. (European Patent Publication No. 247494: This document forms part of this specification. reported by
ヒト遺伝子の調節を研究するために上述の形質転換細胞及び形質転換動物を用い ることができる。例えば、トポイソメラーゼp180.5−α レダクターゼ、 ACAT、5−リポキンゲナーゼ、ホルモンレセプターまたはサイトカインレセ ブターのヒトイソタイプを発現する形質転換動物は、生体内薬物スクリーニング における用途を有するであろう。トポイソメラーゼp180の発現は化学療法に 対する耐性に関連している。したがってこの酵素を妨害する物質を、化学療法の 有効性を増大させるために使用することができよう。5−α レダクターゼ(特 に前立腺中のもの)のヒトイソタイプを発現することができる動物(特にラット )は非常に望ましいであろう。ACATは脂質代謝における鍵酵素であり、その 調節に関する動物モデルは極めて価値があるであろう。5−リポキシゲナーゼを 発現する動物は多くの研究計画(特にイソタイプ選択的阻害剤のスクリーニング )にとって重要であり得る。ヒトのホルモンレセプタータンパク質またはサイト カインレセブタータンパク質を発現する動物はレセプター作用の作用剤および拮 抗剤を同定する際に価値があるであろう。同様に、ヒトの信号伝達系の構成要素 (即ちGタンパク質およびホスホリパーゼCなど)を発現する動物は、これらの タンパク質の機能上の損傷の病態生理学的結果を研究するために使用できるであ ろう。Using the above-mentioned transformed cells and animals to study the regulation of human genes. can be done. For example, topoisomerase p180.5-α reductase, ACAT, 5-lipokingenase, hormone receptor or cytokine receptor Transgenic animals expressing human isotypes of pigs can be used for in vivo drug screening would have uses in Expression of topoisomerase p180 is associated with chemotherapy related to resistance to Therefore, substances that interfere with this enzyme should be used in chemotherapy. could be used to increase effectiveness. 5-α reductase (special Animals (particularly rats) that can express human isotypes (those in the prostate) ) would be highly desirable. ACAT is a key enzyme in lipid metabolism; Animal models of regulation would be extremely valuable. 5-Lipoxygenase Expressing animals are used in many research programs, especially screening for isotype-selective inhibitors. ) can be important for Human hormone receptor protein or site Animals expressing kine receptor proteins are known to be agonists and antagonists of receptor action. It would be of value in identifying anti-drugs. Similarly, components of the human signal transduction system (i.e., G proteins and phospholipase C). It can be used to study the pathophysiological consequences of functional damage to proteins. Dew.
輸送タンバグ質(即ち、消化管、血液脳関門、腎臓などの膜を他の分子やイオン が通過することを容易または可能にするタンパク質)のヒトインタイブを発現す る細胞および動物を作成するために本発明を使用することができる。次いで、代 謝におけるこのようなタンパク質の役割を研究するために上記の細胞または動物 を使用することができる。具体的には、タンパク質構造またはタンパク質配列の 特定の相違の薬物動力学的結果を調べるために、このようなイソタイプによって 媒介される共役の程度および様式を研究することができる。ゲルコロニドトラン スフェラーゼ、グリシン共役およびサルファ化、メチラーゼ、並びにグルタチオ ン共役はこの点に関して特に興味ある酵素の例である。Transport proteins (i.e., membranes in the gastrointestinal tract, blood-brain barrier, kidneys, etc.) that transport proteins and other molecules and ions. Expressing human proteins (proteins that facilitate or allow the passage of The present invention can be used to create cells and animals that can Next, the generation cells or animals mentioned above to study the role of such proteins in metabolism. can be used. Specifically, the protein structure or protein sequence. by such isotypes to investigate the pharmacokinetic consequences of specific differences. The degree and mode of conjugation mediated can be studied. gelcolonidetran Spherase, glycine conjugation and sulfation, methylase, and glutathione Conjugates are an example of an enzyme of particular interest in this regard.
多くの化合物の浄化はエステラーゼによって媒介される。このような浄化作用を 研究する際には、このようなエステラーゼの異種構造イソタイプを発現する細胞 または動物を利用することができる。Purification of many compounds is mediated by esterases. This kind of purifying effect When studying cells expressing heterologous structural isotypes of such esterases, Or animals can be used.
アゾまたはニトロ還元の過程に関する研究にとっては、アゾまたはニトロ還元に 関与するタンパク質のイソタイプを発現する細胞または動物が望ましいであろう 。For research on the process of azo or nitro reduction, Cells or animals expressing the isotype of the protein involved would be desirable .
意義深いことに、潜在的治療物質がある動物モデルでは毒性効果を誘発するが、 別の動物モデルでは毒性効果を誘発しないということがしばしば認められる。こ のような物質の潜在的能力を解明するためには、様々な種における代謝様式を決 定し、次いでその中間代謝物の毒性を決定する必要があることが多い。本発明は このような決定を容易にし得る形質転換細胞または形質転換動物の作成を可能に する。Significantly, some potential therapeutic substances induce toxic effects in animal models; It is often found that other animal models do not induce toxic effects. child In order to elucidate the potential of substances such as It is often necessary to determine the toxicity of the intermediate metabolite. The present invention Allows for the creation of transformed cells or animals that may facilitate such determinations do.
天然の遺伝子配列の調節領域に改変を施すために本発明の方法を使用することが できる。したがって本発明は、その調節領域によって調節される天然遺伝子配列 の転写または翻訳の性質または制御を変化させる手段を提供する。例えばフィー ドバック阻害を除去し、それゆえに増大した遺伝子発現をもたらす突然変異を導 入することが可能である。同様に、遺伝子発現を減少させるために、ある配列の 転写能を損なうことも可能である。このような改変は遺伝子療法の手法として、 並びにヒト疾患の改善された動物モデルを開発する際に、特に価値がある。例え ばインスリン遺伝子の転写または翻訳を増大させ得ることは、糖尿病の潜在的遺 伝子療法を提供する。同様に、β−グロビン鎖の合成を損ない得ることは、β− タラセミアの動物モデルを提供する。The methods of the invention can be used to make modifications to regulatory regions of natural gene sequences. can. The present invention therefore provides for the natural gene sequences regulated by their regulatory regions. provides a means of altering the nature or control of transcription or translation of. For example, fee Introducing mutations that remove back-back inhibition and therefore result in increased gene expression. It is possible to enter Similarly, to reduce gene expression, It is also possible to impair transcriptional ability. Such modifications are used as gene therapy techniques. It is also of particular value in developing improved animal models of human disease. example The ability to increase transcription or translation of the insulin gene, for example, is a potential genetic cause of diabetes. Provide gene therapy. Similarly, impairing the synthesis of β-globin chains can also impair β-globin chain synthesis. Provides an animal model for thalassemia.
本発明の方法を、獣医学およびヒトの医学におけるそれらの使用とは全く別に、 動物における遺伝子の調節、発現および組織化を研究するために使用することが できる。The methods of the invention, apart from their use in veterinary and human medicine, Can be used to study gene regulation, expression and organization in animals can.
本発明の方法はDNAの修復と組換えの過程を利用するので、末法を阻害または 損傷する物質はこれらの過程に影響を与えることによって作用するのであろう。Since the method of the present invention utilizes DNA repair and recombination processes, it is possible to inhibit or Damaging substances may act by influencing these processes.
DNAの修復と組換えを損傷する物質は潜在的に抗新生物剤としての用途を有す るので、本発明は新規な抗新生物剤を同定する手段を提供する。Substances that impair DNA repair and recombination potentially have use as anti-neoplastic agents As such, the present invention provides a means to identify novel antineoplastic agents.
さらに、遺伝子配列のクローニングと染色体または染色体異常のマツピングの両 方を容易にするために、本発明を使用することもできる。Furthermore, both cloning of gene sequences and mapping of chromosomes or chromosomal aberrations The present invention can also be used to facilitate this.
所望の遺伝子配列が受容細胞の何らかの天然遺伝子配列と相同または類似である 必要はないので、本発明の方法は外来遺伝子配列を含有してこれを発現する動物 の作成を可能にする。細胞が類似する遺伝子を発現する場合、そのような類似細 胞遺伝子に加えて所望の遺伝子配列を発現させることができる(例えば動物は″ 擬人化”レセプターとそれに類似する天然のレセプターの両方を発現することが できる)。したがって、例えば本発明は、重要なヒトタンパク質(例えばヒトの インターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ホルモン(インスリンお よび成長ホルモンなど)、血液因子(因子■など))を発現する動物を作成する 手段を提供する。the desired gene sequence is homologous or similar to some natural gene sequence in the recipient cell The method of the invention does not require that an animal contain and express a foreign gene sequence. enables the creation of If cells express similar genes, such similar details Desired gene sequences can be expressed in addition to the cell genes (e.g., animals can express It is possible to express both the anthropomorphic “anthropomorphic” receptor and its natural analogue. can). Thus, for example, the present invention provides important human proteins, e.g. interferon, tissue plasminogen activator, hormones (insulin and Create animals that express blood factors (e.g., growth hormone) and blood factors (e.g., factor ■) provide the means.
第2の態様として、キメラ植物または形質転換植物を作成するために、本発明の 方法を用いて植物細胞中にDNAを導入した後、これを操作することができる。In a second aspect, the present invention can be used to create chimeric or transformed plants. After the method is used to introduce DNA into plant cells, it can be manipulated.
ユニに開示する方法を適用することによって作成され得る植物には、多細胞高等 (即ち非菌類)植物が含まれる。非菌類植物とは菌類または酵母でないあらゆる 植物をいう。Plants that can be created by applying the methods disclosed in Uni include multicellular higher (i.e., non-fungal) plants. A non-fungal plant is any plant that is not a fungus or yeast. refers to plants.
第3の態様として、遺伝的疾患の治療(即ち“遺伝子療法”)を提供するべく、 動物(特にヒトを含む哺乳動物)または植物の体細胞中にDNAを導入するため に本発明の方法を用いることができる。遺伝子療法の原理は01dhat R, K、の成書(“Pr1nciples of Biotherapy”、シーバ ンプレス、ニューヨーク州、 1987)や類似の教科書に開示されている。In a third aspect, to provide treatment for genetic diseases (i.e. "gene therapy"), For introducing DNA into somatic cells of animals (especially mammals including humans) or plants The method of the present invention can be used for. The principle of gene therapy is 01dhat R, K.'s book "Pr1nciples of Biotherapy", Sheba Empress, New York, 1987) and similar textbooks.
この第3の態様では、疾患を引き起こす遺伝子損傷を好ましい遺伝子産物をコー ド化する遺伝子配列と置換する。このような遺伝子損傷の例は嚢胞性繊維症、フ ェニルケトン尿症、血友病、7オン・ウィルプラント病、鎌状赤血球貧血、タラ セミア、ガラクトース血症、果糖不耐性、グリコーゲン貯蔵の疾患、高コレステ ロール血症、若年性糖尿病、甲状腺機能不全症、アルツハイマー病、ハンチント ン病、痛風、リーシュ・ナイハン症候群などである(Bondy、 P、 Lら 、“Disordersof Carbohydrate iletaboli sm”、 221−340頁、サランダース(1974) ; Coleman 、 i、ら。In this third aspect, disease-causing genetic lesions are encoded with preferred gene products. Replace with the gene sequence to be coded. Examples of such genetic damage are cystic fibrosis, phenylketonuria, hemophilia, 7-year-old Willplant disease, sickle cell anemia, cod Semia, galactosemia, fructose intolerance, glycogen storage disorders, high cholesterol Rollemia, juvenile diabetes, thyroid dysfunction, Alzheimer's disease, Huntington These include Bond's disease, gout, and Riesch-Nyhan syndrome (Bondy, P., L. et al. , “Disorders of Carbohydrate iletaboli sm”, pp. 221-340, Salanders (1974); Coleman , i,et al.
“Mo1ecular Mechanisms of Disease”、−r −−ルユニバーシティプレス、 (1975))。遺伝子療法の方法と使用につ いては、Boggs、 S、 S、 (Int、 J、Ce1l C1on、 8:gO−96(1990))、Karson、 E、 M、 (Biol、 Reprod、 42:39−49(1990))、Ledley、 F、 D 、 、“B奄盾狽■モ■獅盾撃盾■凵A^ Comprehensive Treatise”、第7B巻、 −Gene Technology−、V CHバブリッシャー、インコーポレイテッド、ニ ューヨーク州、 339−458頁(1989))によって開示されている(こ れらの文献はすべて本明細書の一部を構成する)。“Mo1ecular Mechanisms of Disease”, -r --Le University Press, (1975)). Gene therapy methods and uses Boggs, S, S, (Int, J, Ce1l C1on, 8:gO-96 (1990)), Karson, E., M. (Biol, Reprod, 42:39-49 (1990)), Ledley, F., D. ,, “B Amakusa Shield ■Mo■ Shidan Geshishi■凵 A^ Comprehensive Treatise”, Volume 7B, -Gene Technology-, V CH Publisher, Inc. State of New York, pp. 339-458 (1989)). (All of these documents are incorporated herein by reference).
第4の態様として、受容動物または受容植物をウィルス、昆虫または除草剤(植 物の場合)、殺虫剤、毒素などから保護するための処置を提供するために本発明 の方法を使用することができる。この態様では、導入された遺伝子がその受容体 に、例えば除草剤または毒素を減成し得る酵素または他のタンパク質の増大した 発現もしくはその新規な発現を媒介することができる遺伝子配列を提供するであ ろう。例えば、キチナーゼの増大した発現またはその新規な発現を媒介し得る遺 転子配列を植物細胞に与えることによって昆虫寄生生物に対する増大した耐性を 付与することができる。In a fourth embodiment, the recipient animal or plant is treated with a virus, insect or herbicide (plant). The present invention provides a treatment for protection against pesticides, toxins, etc.) method can be used. In this embodiment, the introduced gene is for example, increased amounts of enzymes or other proteins that can degrade herbicides or toxins. to provide a gene sequence capable of mediating expression or de novo expression thereof. Dew. For example, genes that can mediate increased expression of chitinase or its de novo expression. Increased resistance to insect parasites by imparting trochanteric sequences to plant cells can be granted.
所望の遺伝子配列を動物の細胞に提供する場合には、医薬的に許容される担体( 即ちリポソームなど)を使用することが好ましい。このような遺伝子配列を公知 の方法に従って製剤化して医薬的に有用な組成物を調製することができる。この 製剤化によって、これらの物質またはそれらの機能的誘導体は医薬的に許容され る担体賦形剤と混合される。好適な賦形剤およびそれらの製剤については、例え ばN1colau、 C,ら(Crit、 Rev、 Ther、 Drug Carrier 5yst、 6 :239−271(19W9) :この文献 は本明細書の一部を構成する)に記述されている。When providing a desired gene sequence to animal cells, a pharmaceutically acceptable carrier ( That is, liposomes, etc.) are preferably used. Such gene sequences are known Pharmaceutically useful compositions can be prepared by formulating according to the method described in . this By formulation, these substances or their functional derivatives are pharmaceutically acceptable. It is mixed with a carrier excipient. For suitable excipients and their formulation, see e.g. N1colau, C, et al. (Crit, Rev, Ther, Drug Carrier 5yst, 6:239-271 (19W9): This document (which is incorporated herein by reference).
効果的な投与に好適な医薬的に許容される組成物を調製するべく、上記組成物は 適量の担体賦形剤と共に所望の遺伝子配列の有効量を含有するであろう。To prepare a pharmaceutically acceptable composition suitable for effective administration, the composition may be It will contain an effective amount of the desired genetic sequence along with appropriate amounts of carrier excipients.
作用の持続時間を制御するために追加の医薬的方法を使用することができる。Additional pharmaceutical methods can be used to control the duration of action.
制御放出調製物は、所望の遺伝子配列(担体と結合してものまたは担体と結合し ていないもの)を錯化もしくは吸収するためのポリマーを使用することによって 達成することができる。制御された送達は、放出の制御に適した巨大分子(例え ばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテ ート、メ・チルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン )と巨大分子の濃度並びに混合法を選択することによって達成され得る。制御放 出調製物によって作用の持続時間を制御するもう1つの考え得る方法は、ポリエ ステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、またはエチレン/ビニル酢酸共 重合体などのポリマー材料の粒子中に薬剤を組み入れることである。別法として 、これらの薬剤をポリマー粒子に組み入れるかわりに、例えばコアセルベーショ ン技術や界面重合(例:それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン− マイクロカプセルおよびポ1バメチルメタクリレート)マイクロカプセル)によ って調製したマイクロカプセル中にこれらの物質を封入するか、あるいは例えば リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカ プセルなどのコロイド薬物送達系中またはマクロエマルジョン中にこれらの物質 を封入することができる。Controlled release preparations contain the desired gene sequence (conjugated to a carrier or unconjugated to a carrier). by using polymers to complex or absorb can be achieved. Controlled delivery can be achieved by using macromolecules suitable for controlled release (e.g. Polyester, polyamino acid, polyvinylpyrrolidone, ethylene vinyl acetate methylcellulose, carboxymethylcellulose or protamine sulfate ) and the concentration of macromolecules as well as the mixing method. controlled release Another possible way to control the duration of action by means of polyester preparations is to ester, polyamino acid, hydrogel, polylactic acid, or ethylene/vinyl acetate The incorporation of drugs into particles of polymeric materials, such as polymers. alternatively , instead of incorporating these drugs into polymer particles, e.g. technology or interfacial polymerization (e.g. hydroxymethylcellulose or gelatin, respectively) microcapsules and poly(methyl methacrylate) microcapsules) These substances can be encapsulated in microcapsules prepared by e.g. Liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocarriers these substances in colloidal drug delivery systems such as capsules or in macroemulsions. can be included.
第5の態様として、植物またはヒト以外の動物の食物特性または繊維特性を改善 するために本発明の方法を使用することができる。例えば、タンパク質合成の総 レベルを増大させることによって、より速く成長する植物またはヒト以外の動物 をもたらしたり、食物価値の増大した植物およびヒト以外の動物の作成をもたら すために、本法を用いることができる。In a fifth aspect, improving the food or fiber properties of plants or non-human animals The method of the invention can be used to For example, total protein synthesis plants or non-human animals that grow faster by increasing levels resulting in the creation of plants and non-human animals of increased food value. This method can be used to
ここに本発明を一般的に記述し終えたので、以下の実施例を参照して本発明をよ り容易に理解することができるであろう。以下の実施例は例示のために記載され るのであって、特に明言しない限り本発明の限定を意図するものではない。Having now generally described the invention, reference is now made to the following examples to further illustrate the invention. It will be easier to understand. The following examples are included for illustrative purposes only. They are not intended to limit the invention unless expressly stated otherwise.
エレクトロポレーションを以下のように行った。Electroporation was performed as follows.
DNAの調製 エレクトロポレーションに使用するDNAをCsC1勾配遠心分離によって精製 した。そのDNAを適当な制限酵素と共にインキュベートすることにより、この 精製DNAの大量消化物を調製した。この大量消化物の500ngをミニゲルに かけることによって、その完全な消化について試験した。大量消化物のDNA濃 度が1μg/μmを越えてはならない。Preparation of DNA Purify DNA used for electroporation by CsC1 gradient centrifugation did. This can be achieved by incubating the DNA with appropriate restriction enzymes. A large-scale digest of purified DNA was prepared. 500ng of this large amount of digested material is made into a mini gel. Its complete digestion was tested by multiplying by DNA concentration of large amount of digested material The concentration must not exceed 1 μg/μm.
次に、この大量消化物を等体積のフェノール/クロロホルムで一回抽出し、等体 積のクロロホルムで1回抽出した。2.4体積のエタノールでDNAを沈殿させ 、遠心分離によってペレット化し、スピード−バクを用いて乾燥した。Next, this large amount of digested product was extracted once with an equal volume of phenol/chloroform, and an equal volume of The mixture was extracted once with chloroform. Precipitate the DNA with 2.4 volumes of ethanol , pelleted by centrifugation and dried using Speed-Vac.
次に、ペレット化したDNAを所望の濃度(通常は1μg/μm)で0.IXT Eなどの滅菌Tr i 5−EDTA緩衝液に再懸濁した(1エレクトロポレー シヨンあたり25μmのDNA)。次に、そのDNA濃度を蛍光計で測定した。Next, the pelleted DNA is added to the desired concentration (usually 1 μg/μm) at 0.05 μg/μm. IXT Resuspend in sterile 5-EDTA buffer such as E (1 electroporated 25 μm of DNA per section). Next, the DNA concentration was measured using a fluorometer.
エレクトロポレーション用の細胞の調製E、 J、 Robertsonの方法 (ゴeratocarcinomas and Embryonic Stem Ce1ls :^orac tical Approach”、 E、 J、 Robertson編、IR Lブレス、オフスフオード、 1987.71−112頁)に従って、ABI細 胞系の胚性幹細胞を約80%全面成長まで培養した。培養培地中にlifを発現 する小孔細胞の存在下で細胞を培養した。エレクトロポレーションの前日に1: 2に継代し、収集の4時間前に接種した。Preparation of cells for electroporation E. J. Robertson method (Goeratocarcinomas and Embryonic Stem Ce1ls: ^orac tical Approach”, edited by E. J. Robertson, IR ABI specification according to L.Bress, Ofsford, 1987.71-112). Embryonic stem cells of the vesicle lineage were cultured to approximately 80% full growth. Expressing lif in the culture medium Cells were cultured in the presence of stomal cells. 1 day before electroporation: 2 and inoculated 4 hours before harvest.
細胞をトリプシン処理し、培地に再懸濁することによって細胞を収集した(2× 10CI11のプレートから得た細胞を合計IQmlに合わせて15vlチユー ブに入れた)。Cells were harvested by trypsinizing them and resuspending them in medium (2× Cells from 10CI11 plates were combined into a 15vl tube for a total IQml. ).
細胞を遠心分離によってペレット化し、その上清を吸引によって除去した。次に 、それらの細胞をリン酸緩衝化食塩水10m1に再懸濁し、その20μmを計数 することにより細胞総数を決定した。通常の収量は10cmプレートあたり30 ×106細胞である。Cells were pelleted by centrifugation and the supernatant was removed by aspiration. next , the cells were resuspended in 10 ml of phosphate buffered saline and 20 μm were counted. The total number of cells was determined by. Typical yield is 30 per 10cm plate ×106 cells.
次に、これらの細胞を遠心分離によってペレット化し、その上清を吸引によって 除去した。細胞をllXl0’細胞/mlの密度で再懸濁した。その20μmを 計数することによりこの細胞密度を確認した。These cells are then pelleted by centrifugation, and the supernatant is removed by aspiration. Removed. Cells were resuspended at a density of 11X10' cells/ml. That 20 μm This cell density was confirmed by counting.
エレクトロポレーション 上述のように調製した細胞を適量のDNAの存在下で15m1チユーブ中でイン キュベートした。各エレクトロポレーションには25μmのDNAとQ、9ml の細胞を使用した。electroporation Cells prepared as above were incubated in a 15ml tube in the presence of an appropriate amount of DNA. Cubated. For each electroporation, 9 ml of 25 μm DNA and Q cells were used.
この混合物を室温で5分間インキュベートした(ただしこの段階は省略すること ができる)。The mixture was incubated at room temperature for 5 minutes (this step may be omitted). ).
次に、この細胞/DNA混合物を注意深くエレクトロポレーションキユベ・ソト 中に分注した(1キ;ペットにつきQ、 9ml ;この体積は重要である)。This cell/DNA mixture was then carefully electroporated into a tube. (1 kg; Q per pet, 9 ml; this volume is important).
そのキュベツトを薄片電極を伴うエレクトロポレーションホルダー中に金属製の 保持用留具と接触させて設置した。The cuvette was placed in a metal electroporation holder with a thin-piece electrode. It was placed in contact with the retaining fastener.
230V、500μF(これは電気容量拡張子を必要とする)に設定したバイオ ラッド・シーンパルサーを用いてエレクトロポレーションを行った。時定数は5 .6と7.0の間を示すべきである。Bio set to 230V, 500μF (this requires a capacitance extension) Electroporation was performed using a Rad Sheen Pulser. The time constant is 5 .. It should indicate between 6 and 7.0.
キュベツトを室温で5分間放置し、次いで細胞を適当な密度(2X 10’細胞 /100mff1プレートまたは6X10’細胞/6011111プレートまで )でプレートに接種した。G418は細胞を殺し始めるまでに3〜4日を要し、 プレートが全面成長を越えてしまうであろうから、G418を選択剤として使用 する場合にはこの細胞密度を越えてはならない。G418選択を適用すべき場合 にはエレクトロポレーションの24時間後にこれを適用する。G418濃度はバ ッチ毎に滴定しなければならない。Leave the cuvette at room temperature for 5 minutes, then add the cells to the appropriate density (2X 10' cells). /100mff1 plate or up to 6X10' cells/6011111 plate ) to inoculate the plates. G418 takes 3-4 days to start killing cells; G418 was used as a selective agent since the plate would have grown beyond full surface growth. Do not exceed this cell density if When to apply G418 selection It is applied 24 hours after electroporation. G418 concentration is must be titrated every time.
最初の6〜7日間(コロニーが目に見えるようになり、はとんどの細胞残渣が除 去されるまで)は毎日プレートに新鮮な培地+0418を再供給した。FIAU (0,2μM)選択を使用する場合、これは同時に進行し得る。During the first 6-7 days (the colonies become visible and most of the cell debris has been removed) The plates were re-fed daily with fresh medium +0418 until removed). FIAU When using (0,2 μM) selection, this can proceed simultaneously.
RV 4 、 O(Thomas、 L R,ら、Ce1l 51:503−5 12(1987))に関する典型的収量は104コロニー/107細胞/100 +amプレートまでである。この収量は、他の構築物を用いた場合に得られる収 量とは有意に(そして意外にも)相違し得るが、本法の使用は常に、エレクトロ ボレートされたDNAを含有する細胞のいくつかのコロニーの回収をもたらす。RV 4, O (Thomas, LR, et al. Ce1l 51:503-5 12 (1987)) is 104 colonies/107 cells/100 +am plate. This yield is higher than that obtained using other constructs. Although the amount may differ significantly (and surprisingly), the use of this method always Resulting in the recovery of several colonies of cells containing borated DNA.
8日はどでコロニーを選び取ることかで赤る。10〜11日付近にコロニーを選 び取ることがもっとも好ましい。しかし、エレクトロポレーションの18〜21 日後まではコロニーを回収することができる。On the 8th, it turns red depending on where you choose the colony. Select colonies around 10-11 days It is most preferable to remove it. However, 18-21 of electroporation Colonies can be collected up to a day later.
本発明を例示するために、Xhol制限エンドヌクレアーゼで処理することに5 kbのHPRTベクターであるAD8(Sac Iで直線化したもの)を用いて 、胚性幹(“ES”)細胞を同時エレクトロポレートした(図7)。エレクトロ ポレーション(230V、500μF)をQ、9mlのCCEp24細胞(7, 5X10’細胞/■1)DNA:HPRT DNA)のモル比で行った。与えた DNAの総量は25.50、100または200μgのいずれかであった。この 実験で使用するベクターを図7に明示する。この実験の結果を表1に示す。To illustrate the invention, five Using the kb HPRT vector AD8 (linearized with Sac I) , embryonic stem ("ES") cells were co-electroporated (Figure 7). electro poration (230V, 500μF) of Q, 9ml of CCEp24 cells (7, The molar ratio was 5 x 10' cells/1) DNA: HPRT DNA). Gave The total amount of DNA was either 25.50, 100 or 200 μg. this The vectors used in the experiment are clearly shown in Figure 7. The results of this experiment are shown in Table 1.
表−1 ユ且1■遺伝子配列とhprt遺伝子配列の同時エレクトロボレーシコンlXl 0’細胞あたりに生成したコロニー数の平均値1:10 460 3 16 0 5 g、70 7 nd ndて、nptIIDNA分子とhprt DNA 分子の両方の組換えがもたらされることを示している。Table-1 Simultaneous electrophoresis of gene sequence and hprt gene sequence Average number of colonies generated per 0' cell 1:10 460 3 16 0 5 g, 70 7 nd nd, nptII DNA molecule and hprt DNA It is shown that recombination of both molecules results.
組換えの頻度を次の表2に示す B 1:1 100 10.1 1.0 1/1010C1:100 200 0.8 0.2 1/400*反応は上述のように行った。実験結果の再現性を 調べた。この実験の結果を表3に示す。The frequency of recombination is shown in Table 2 below. B 1:1 100 10.1 1.0 1/1010C1:100 200 0.8 0.2 1/400*The reaction was carried out as described above. Reproducibility of experimental results Examined. The results of this experiment are shown in Table 3.
嚢一旦 比アたりの の コロニー G418R()ランスフエクトされたNeo: D NA 回数 (総数) 細胞あたり)50 3 ’ 192010 67 1・10 200 16 60g/7 1/868 43 、471:100 200 5 400/1 1/400 8100 7 30010 4.5 実施例3 相同的組換え 受容細胞の染色体中への上記ベクターのベクター組換え【二よって生成する染色 体の構造を調べるために、以下の実験を行った。once the sac Philippine colony G418R () transfected Neo: D NA Number of times (total number) per cell) 50 3' 192010 67 1.10 200 16 60g/7 1/868 43, 471:100 200 5 400/1 1/400 8100 7 30010 4.5 Example 3 homologous recombination Vector recombination of the above-mentioned vector into the chromosome of the recipient cell. The following experiment was conducted to investigate the structure of the body.
この目的のために、細胞のhprt遺伝子座と相同な5.5kbの領域を含有す るベクターを使用した。このベクターは選択可能なマーカーとして1ptII遺 伝子をも含有する。このベクターをXholで直線化し、上述のよう1ニエレク トロポレーシヨンによってES細胞に与えた。G4181:対して耐性となった 細胞を選択し、それらのDNAを分析することにより、それカベ予期される組込 み構造と合致する制限断片を含有するかどうかを決定した。For this purpose, we included a 5.5 kb region homologous to the cellular hprt locus. A vector was used. This vector uses the 1ptII gene as a selectable marker. It also contains genes. Linearize this vector with ES cells were fed by troporation. G4181: Became resistant to By selecting cells and analyzing their DNA, it is possible to detect the expected integration. It was determined whether the selected structure contained restriction fragments that matched the structure.
使用したベクターおよび予期される組込み構造を図8(;表す。細胞DNAの制 限消化物のゲル電気泳動により、G418耐性細胞力(図8(=示すhprt構 造を含有することを確認した。この調査結果により、該ベクターが該細胞の染色 体中ベクターが保持する相同領域の大きさが組換えの復帰頻度に与える効果を決 定した。hprt遺伝子座と相同な5.gkbを有するベクターを含有する組換 え体を実施例3に記述したように調製した。同じ方法を用いて、hprt遺伝子 座との相同部分が1.3kbLかない類似のベクターを含有する組換え体をも調 製した。The vector used and the expected integration structure are shown in Figure 8 (; represents the regulation of cellular DNA. G418-resistant cell power (Figure 8 (=hprt structure shown) was determined by gel electrophoresis of the limited digest. It was confirmed that it contained structure. The results of this investigation indicate that the vector can be used to stain the cells. The size of the homologous region carried by vectors in the body determines the effect on recombination frequency. Established. 5. homologous to the hprt locus. Recombinant vector containing gkb Fish were prepared as described in Example 3. Using the same method, the hprt gene A recombinant containing a similar vector with less than 1.3 kb of homology with the locus was also prepared. Manufactured.
この5,8kbベクターの挿入部位の構造を図8に記載する。上記2つの構築物 の復帰頻度を表4に示す。挿入体の復帰によって得られる構造を図9に示す。The structure of the insertion site of this 5,8 kb vector is shown in FIG. The above two constructs Table 4 shows the return frequency. The structure obtained by returning the insert is shown in FIG.
挿入ベクターおよび置換ベクターの標的頻度一連の異なるベクターを用いて、本 発明の方法を使用することによって達成される標的頻度を調べた。これらのベク ターはネズミのhprt遺伝子と相同な6゜8kbを含有し、直線化部位または 内部に異種構造の領域を有した(図2)。Target frequency of insertion and replacement vectors Using a series of different vectors, this study The target frequency achieved by using the method of the invention was investigated. These vectors The tar contains 6°8 kb homologous to the murine hprt gene, and contains the linearization site or It had a region of heterogeneous structure inside (Fig. 2).
この目的のために、108細胞を上述のように調製したES細胞へエレクトロボ レートし、10X90關プレートに接種した。24時間後、G418(350μ g/ml)を培地に添加した。5日間の選択後、10−5M6−チオグアニンを 9プレートに添加し、1プレートはトランスフェクション対照としてG418選 択下選択下にしておいた。さらに7日間選択を続けた。この時点でコロニーを記 録し、サザン分析のために分離したクローンとしてコロニーを広げた。標的効率 をこれらのベクターのそれぞれについて詳述する(図2=表5)。For this purpose, 108 cells were electroporated into ES cells prepared as described above. and inoculated into 10×90 plates. After 24 hours, G418 (350μ g/ml) was added to the medium. After 5 days of selection, 10-5M6-thioguanine 9 plates and 1 plate containing G418 selection as a transfection control. I left it under selection. The selection continued for another 7 days. At this point, mark the colony. The colonies were expanded as isolated clones for Southern analysis. target efficiency are detailed for each of these vectors (Figure 2 = Table 5).
サザン分析は、6−TG”クローンの大部分が、図8 CH1ndIII消化に ついて描かれている予期される組込み構造を有することを示した。Southern analysis showed that most of the 6-TG” clones were digested with CH1ndIII. It was shown to have the expected built-in structure as depicted.
HATltを測定することによってこれらのhprtクローンの復帰を行った。Reversion of these hprt clones was performed by measuring HATlt.
細胞分裂によって多数のコロニーを生じさせる重複要素の初期の組換え的欠失に よって引き起こされる“ジャックポット(大当たり)”効果を防止するために、 細胞を6−TG選択下でクローン的に拡張した。107細胞を得た時、それらの 細胞を選択を伴わない90市プレート上に48時間再接種した。48時間後、H AT選択選択用適用耐性コロニーをその10日後に記録したところ、典型的な場 合、接種した107細胞あたり20〜200コロニーが観察された(表4)。各 コロニーは類似する頻度で復帰したことを試験した。Initial recombinant deletion of duplicate elements that gives rise to large numbers of colonies by cell division In order to prevent the “jackpot” effect caused by this, Cells were clonally expanded under 6-TG selection. When we obtained 107 cells, their Cells were reseeded on 90 plates without selection for 48 hours. 48 hours later, H Application of AT selection resistant colonies were recorded 10 days later and showed that typical In this case, 20-200 colonies were observed per 107 cells inoculated (Table 4). each Colonies tested returned at similar frequencies.
表5 置換ベクターおよび挿入ベクター:標的および頻度遺伝子 相同性 ベクター 頻度 Hox2.6 3.2kb IV+ 1/33Rv:置換ベクター、IV:挿入 ベクター導入されたDNAを相同的組換えによって組込んでいる細胞の選択を増 進するために“ポリA選択”を使用することができる。Table 5 Replacement vectors and insertion vectors: target and frequency genes homology vectors frequency Hox2.6 3.2kb IV+ 1/33Rv: Replacement vector, IV: Insertion Increases selection of cells that have integrated vector-transduced DNA by homologous recombination. "PolyA selection" can be used to advance.
導入されたDNA分子が仮に宿主染色体中にランダムに組込まれるとすれば、一 般的には、必須の3°ポリアデニル化部位に隣接した部位には組み込まれないで あろう。したがって、このようにランダムに挿入された構築物の転写によって生 成するmRNAは一般にポリアデニル化を欠(であろう。導入された遺伝子配列 が天然のポリアデニル化部位の隣に組込まれるような(即ち、ランダム挿入では なく相同的組換えによる)組換え事象を選択することを可能にするベクターを用 いることによって、この事実を利用することができる。If the introduced DNA molecule were to be randomly integrated into the host chromosome, one In general, it should not be incorporated into sites adjacent to the essential 3° polyadenylation site. Probably. Therefore, transcription of such randomly inserted constructs results in The resulting mRNA will generally lack polyadenylation. is incorporated next to the natural polyadenylation site (i.e., random insertion The use of vectors that allows for selection of recombination events (not due to homologous recombination) You can take advantage of this fact by being present.
9中に位置する。1つのHinDIII部位がエクソン9内に存在し、1つのE coRI部位がこのエクソンの末端の後ろに位置する。Located in the middle of 9. One HinDIII site is present within exon 9 and one E A coRI site is located behind the end of this exon.
使用した第1のベクターは5.0kbの領域を含有し、したがってエクソン9の ポリアデニル化部位を含有した(ベクター6、図10)。表6に示すように、そ の挿入頻度は高かった(即ち、G418耐性コロニーの頻度は24X10−5で あっおよびG418耐性は1/941コロニーが示したに過ぎなかった。したが っていくらかのランダム組込みが起こっている。The first vector used contained a 5.0 kb region and therefore contained a region of exon 9. It contained a polyadenylation site (vector 6, Figure 10). As shown in Table 6, The insertion frequency was high (i.e., the frequency of G418-resistant colonies was 24×10−5). Only 1/941 colonies showed G418 resistance. However, There's some random integration going on.
同様に、ベクター6のXbaI部位からEcoR1部位までのDNAを含有する 3゜5kbのベクター(ベクター10)を使用した場合、挿入の頻度は高かった (即ち、0418耐性コロニーの頻度は21X10−’であった)が、所望の組 換え体を特徴づけ得る二重のチオグアニン耐性およびG418耐性は1/770 コロニーが示したに過ぎなかった(表6)。この結果はいくらかのランダム組込 みが起こることを明らかにしている。Similarly, it contains the DNA from the XbaI site to the EcoR1 site of vector 6. When a 3°5kb vector (vector 10) was used, the frequency of insertion was high. (i.e., the frequency of 0418-resistant colonies was 21×10−’) The double thioguanine resistance and G418 resistance that characterize the recombinants are 1/770. Only colonies showed (Table 6). This result has some random embedding It is clear that something will happen.
しかしエクソン9のポリアデニル化部位を欠くベクター(即ちベクター9)を使 用すれば、ランダムな組込みは機能的なnptrz転写物の発現をもたらさない 。However, using a vector lacking the polyadenylation site of exon 9 (i.e., vector 9), If used, random integration does not result in expression of a functional nptrz transcript. .
したがって、G418耐性コロニーの頻度は低い(1,4X10−’)。ランダ ムな組込み証明するコロニー数が抑制されるので、所望の組換え体回収の総合頻 度が増大する(即ち、二重耐性コロニーに関して1/100の総合効率(表6) )。このようにポリA遺択はほぼ10倍近い総合効率の増大をもたらす。したが ってランダム組換えと相同的組換えを区別するためのコロニーのスクリーニング を最小限に抑えるかもしくはこれを避けることが望まれる状況下ではポリA選択 を有利に使用することができる。Therefore, the frequency of G418-resistant colonies is low (1,4 x 10-'). Landa The overall frequency of recombinant recovery as desired is reduced because the number of colonies that demonstrate undesirable integration is suppressed. degree (i.e. 1/100 overall efficiency for dual resistant colonies (Table 6)) ). The polyA selection thus results in an increase in overall efficiency of nearly 10 times. However, Colony screening to distinguish between random and homologous recombination In situations where it is desired to minimize or avoid the can be used to advantage.
表6 ポリA選択 ベクター サイズ G418’ TG” TG’10418′1番号 (kb) (XIO−’) (XIO−’)6 5.0 24 2.5 1/9419 3.0 1.4 1.4 1/10010 3.5 21 2.7 1/770 するために本発明の方法を用いることによって、本発明の方法をさらに例示した 。Table 6 Poly A selection Vector size G418' TG" TG'10418'1 number (kb) (XIO-') (XIO-') 6 5.0 24 2.5 1/9419 3.0 1.4 1.4 1/10010 3.5 21 2.7 1/770 The method of the invention was further illustrated by using the method of the invention to .
c−s r c遺伝子座は数個のエクソンを含有し、図11ではこれらを“四角 く囲んだ”領域2および3゛として表す。図11Aに示すように、エクソン3′ の天然のアレルはHindIII部位を含有しない。The c-src locus contains several exons, which are labeled as “squares” in Figure 11. The regions 2 and 3 are shown as encircled areas. As shown in Figure 11A, exon 3' The natural allele of does not contain a HindIII site.
エクソン3′の一部の配列を図110に示す。図110に示すように、このエク ソンへの9bpの挿入がHinDIII部位の形成をもたらすであろう。The sequence of part of exon 3' is shown in FIG. 110. As shown in Figure 110, this A 9 bp insertion into Son will result in the formation of a HinDIII site.
エクソン3′におけるこの変化を達成するために、1つのベクター(src14 )を調製した。図11Bに示すように、5rc14ベクターはc−s r c遺 伝子座の一領域と相同である。しかし、このベクターのエクソン3′配列はH1 ndIII部位を作成するために必要な上記9塩基対挿入部を含有するよう改変 されている(図110)。To accomplish this change in exon 3', one vector (src14 ) was prepared. As shown in Figure 11B, the 5rc14 vector It is homologous to a region of the constellation Genericus. However, the exon 3' sequence of this vector is H1 Modified to contain the above 9 base pair insert necessary to create the ndIII site. (Figure 110).
nptIIを含有する第2のベクター(PGKneo)と5rC14ベクターを 、総DNA濃度25μgoalおよびモル比1:5(標的ベクターに対するne oベクターの比)で上述の方法で、同時エレクトロポレーションによってES細 胞中に導入した。The second vector containing nptII (PGKneo) and the 5rC14 vector , total DNA concentration 25μgoal and molar ratio 1:5 (ne to target vector ES cells by simultaneous electroporation using the method described above at introduced into cells.
nptII遺伝子が組込まれている組換え細胞を選択するために、細胞を041 8の存在下で12日間培養した。次に、PCRを用いて、天然のエクソン3°遺 伝子座が5rc14ベクターのHinDIII部位含有エクソン3′配列と置換 するという結果をもたらす組換え事象を起こした細胞に関して、これらの組換え 細胞をスクリーニングした。To select recombinant cells that have integrated the nptII gene, cells were 8 for 12 days. Next, we used PCR to identify the natural exon 3° Gene locus replaced with HinDIII site-containing exon 3' sequence of 5rc14 vector For cells that have undergone recombination events that result in Cells were screened.
プローブBおよびプローブC(図11B)を用いたPCRスクリーニングによっ て同定されたコロニーのサザン分析により、天然のエクソン3°遺伝子座が改変 されて所望の通りHinDIII部位を含有していることが明らかになった。こ の実験により、どのような細胞遺伝子中にも微細な挿入を導入できることが立証 された。by PCR screening using probe B and probe C (Figure 11B). Southern analysis of colonies identified in It was revealed that the protein contained the HinDIII site as desired. child Experiments demonstrate that microscopic insertions can be introduced into any cellular gene. It was done.
複雑な予定の突然変異を受容細胞のゲノム中に導入する本発明の能力をさらに図 12Aに示すように、エクソン3°°の天然のアレルはNhe1部位またはEc 。The ability of the present invention to introduce complex targeted mutations into the genome of recipient cells is further illustrated. As shown in 12A, the natural allele of exon 3° is either the Nhe1 site or the Ec .
RT部位を含有しない。しかし図12Cに示すように、エクソン3′′の天然の 配列ACCTGG TTCをTAG CTA GCTという配列で置換すればN heI部位が形成されるであろう。同様にエクソン3゛′中のACAf−GAA で置換すればEcoRI部位が生成するであろう(図120)。Contains no RT site. However, as shown in Figure 12C, the natural If you replace the sequence ACCTGG TTC with the sequence TAG CTA GCT, N A heI site will be created. Similarly, ACAf-GAA in exon 3′ Substitution with will generate an EcoRI site (Figure 120).
エクソン °′の配列におけるこれらの変化を達成するために、1つのベクター 上記の置換を含有するように改変されている(図12C)。To achieve these changes in the sequence of exon °', one vector Modified to contain the above substitutions (Figure 12C).
5rc33ベクターをrltII遺伝子を含有する第2のベクターと協奏的に上 述の方法でES細胞中に導入した。nptII遺伝子が組込まれている組換え細 胞を選択するために、細胞を0418の存在下で培養した。次に、PCRを用い て、天然のエクソン3°′遺伝子座が5rc33ベクターのエクソン3゛と置換 するという結果をもたらす組換え事象を起こした細胞に関して、これらの組換え 細胞をスクリーニングした。5rc33 vector in concert with a second vector containing the rltII gene. It was introduced into ES cells by the method described above. Recombinant cells containing the nptII gene To select for cells, cells were cultured in the presence of 0418. Next, using PCR Therefore, the natural exon 3°′ locus was replaced with exon 3′ of the 5rc33 vector. For cells that have undergone recombination events that result in Cells were screened.
プローブAおよびプローブC(図120)を用いたPCRスクリーニングで同定 されたコロニーのサザン分析により、天然のエクソン3パ遺伝子座が所望の通り に改変されてNhe1部位とEcoRI部位の両方を含有していることが立証さ れた。Identified by PCR screening using probe A and probe C (Figure 120) Southern analysis of the isolated colonies revealed that the native exon 3 locus was as desired. It has been demonstrated that it has been modified to contain both an Nhe1 site and an EcoRI site. It was.
この実験によりどのような細胞遺伝子にも微細な置換を導入できることが立証さ れた。This experiment demonstrated that it is possible to introduce minute substitutions into any cellular gene. It was.
本発明をその特定の態様と関連させて記述したが、さらなる改変も可能であり、 本出願が、一般に本発明の原理に従う本発明のあらゆる変法、使用または適用( これらには本発明に関連する技術分野で公知または慣用となるような本開示から の逸脱、並びに上述の基本的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱および 本願の請求の範囲に包含されるような本開示からの逸脱が含まれる)を包含する ことを意図するものであることは理解されるであろう。Although the invention has been described in connection with particular embodiments thereof, further modifications are possible. This application does not cover any variations, uses, or adaptations of the invention generally in accordance with its principles. These include information from this disclosure that is known or commonly used in the technical field related to the present invention. and deviations from the present disclosure as may apply to the above-mentioned essential features and including deviations from this disclosure that fall within the scope of the claims of this application) It will be understood that this is intended.
1^置換ベクター:hprt遺伝子座を標的とする6、8kbの相同構造IB挿 入ベクター:6.8kbの相同構造Fl(、LINE l ^挿入部位に異種構造を有する挿入ベクター:直線化部位に2kbの挿入物2B 挿入部位に異種構造を有する挿入ベクター:直線化部位に26bpの挿入物FI CIJRE 2 2C付加された異種構造を有する挿入ベクター:相同構造の内部picu肛2( 続き) A第1段階、相同的組換え:挿入ベクターによるヒト置換体の付加: マウス非 コードエクソン 口 ヒト非コードエクソン zz ヒトコードエクソン 臣支 マウスコードエクソン FIC,URE @ ncu旺4 (続き) 小さいゲノム変化および大きいゲノム変化の選択的導入第1段階−標準的置換ベ クター 案2段階A−小さい突然変異の導入 完全なあるいは部分的な置換 FICLJRE 5 6^ 第1段階初期標的の設定 断片B、jlt遺伝子の末端からプラスミド配ダ」までFIClJRE & 第3段階:A−B接合部の修復、6TG中での選択(100%)A+B接合接合 クレ ーン末端gpt遺伝子 F)GURE6 (続き) 第5段階・B+C接合クローンの修復、5TG中での選択(100%)FICL JRE b (続き) 同時二しクトロポレーション Xh。1^ Replacement vector: 6,8 kb homologous structure IB insert targeting the hprt locus. Input vector: 6.8 kb homologous structure Fl (, LINE l ^ Insertion vector with a heterologous structure at the insertion site: 2kb insert 2B at the linearization site Insertion vector with a heterologous structure at the insertion site: 26 bp insert FI at the linearization site CIJRE 2 Insertion vector with 2C added heterologous structure: homologous structure internal picuary 2 ( continuation) A 1st step, homologous recombination: addition of human substitutes by insertion vector: mouse non- code exon Mouth human non-coding exon zz human code exon Shinshi mouse code exon FIC,URE @ ncuo 4 (continued) Selective introduction of small and large genomic changes First step - standard substitution bases ctor Plan 2 Step A - Introduction of small mutations complete or partial replacement FICLJRE 5 6^ 1st stage initial target setting Fragment B, FIClJRE & Stage 3: A-B junction repair, selection (100%) A+B junction junction in 6TG Cree gpt gene F) GURE6 (continued) Step 5: Repair of B+C mating clones, selection in 5TG (100%) FICL JRE b (continued) Simultaneous double chotroporation Xh.
4bp Pvul 挿入 F)GURE 7 IV68ベクターの相同的組込み後のhprt遺伝子座の予想構造町Cυ1’L X 挿入ベクターによって生じる相同的組換え体の復帰Fl(、URE 9 6□ 5.Okb 9 3、Okb 10□ 3.5 kb FIGURE 10 ■ 要約書 相同的組換えによって予定した遺伝子配列中に挿入された所望の遺伝子配列を含 有する動物細胞を作成する方法。末法は遺伝子の配列および発現に微細で正確な 修飾が施されている動物細胞の生産を可能にする。4bp Pvul insert F) GURE 7 Predicted structure of the hprt locus after homologous integration of the IV68 vector Cυ1'L X Reversion Fl of homologous recombinants generated by the insertion vector (, URE 9 6□ 5. Okb 9 3, Okb 10□ 3.5 kb FIGURE 10 ■ abstract Contains the desired gene sequence inserted into the predetermined gene sequence by homologous recombination. A method of creating animal cells with The final method provides detailed and accurate information on gene sequence and expression. Enables the production of modified animal cells.
国際調査報告 LLIImelIIt^−一” FCT/US91104006合衆国7703 0テキサス、ヒユーストン、ノース・ブレイス3番international search report LLIImelIIt^-1” FCT/US91104006 United States 7703 0 Texas, Hyuston, North Brace 3
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