JPH05502663A - 生物学的凍結保存 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的凍結保存 本発明は軟体動物門に属する卵の凍結保存に関し、より詳細には、繁殖期以外の 時期でも例えば鼾化場やバイオアッセイなどにおいて使用できるような未受精卵 の凍結保存に関する。

水中、特に海水中の汚染物質の検出・定量に関して、様々な検定法並びに技術が 知られている。バイオアッセイ法は生体を使用し、通常は、ある特定の発生段階 にある生体を汚染物質に暴露し、それをモニターする。かかるバイオアッセイは 以下の文献から公知であるＣ、Ｅ、　Ｗｏｅ！ｋｅ著、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ 　Ｄｃｐｔ、ｏｆ　Ｆｉ＋ｈｅ＋ｉｅ＋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏ＋＋　９ 巻　１−９３頁（１９８２）、ｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ）ｏｆ　ａ　ｒｅｃ！ ｉｖｉｎｇ　ｖａｔｃｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｂｉｏａ＋＋ａｙ　ｃ＋ｉＮ＋１ｏ ｎＡｎｎｕｘｌ　Ｂｏｏｋ　ｏｆ　ＡＳＴＭ　５ｌａｎｄｘ＋ｄ＋、　Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　ＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＴｅＳｌｌｎｇ　ａｎｄ　Ｍａｔｅ＋ｉａｌ＋ 　ｌ−１７頁（１９８０＋、分類番号Ｅ７２４−８０　（Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏ ｎ　Ｅ７２４−８０Ｌ　ｒｃｏｎｄｎｃｔｉｎｇ　＋ｆａｌｉｃａｂａｔｅ　１ ｏｘｉｃｉｌ）　ｆｅｉｔｉ　ｗｉｔｈ　１ａｔｖａｅ　ｏｆ　ｔｏｕｒ　＋ｐ ｅｃｉｅｓｏｒ　ｂｉｗａｌｖｅ　ｍｏｌｌｕｓｃ＋　Ｊ　；Ａ、Ｒ，Ｄ、Ｓｌ ｅｂｂｉｎｇ他著、Ｂｉｏａ＋＋ａ７．　Ｎｅｗ　Ｙｏ「ｋ、１３３−１４０頁 ［１９８５）、ｒＴｂｅ　ｆｌｅｅｔｓ　ｏｆ　５ｌｅｅｔＳａｎｄＰｏｌｌＩ ｌｔｉｏｎ　ＯＩＬ　Ｍａ＋ｉｎｃ　Ａｎｉｉａｌ＋　Ｊ　；及び＋、Ｅ、Ｔｈ ｚｉｎ及びＩ、Ｗａ口Ｓ著、Ｈ＋＋ｌｂｕ＋ｌ　Ｒａｐｐ、Ｐ−ｖＲｅｕｎ、Ｃ ０ＩＩＳ’、Ｉｎｔ、Ｅｘｐｌｏ＋、ｍｅ＋　１８７巻　＋０３−１０７頁（１ ９８７）。

「丁ｂｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｈ　ｂｉｏａｚａｙ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｃｈａ ｎｇｅｓ　１ｎｖａｌｚ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｘｚｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ 　ｂｌｏｏｍ　ＯｆＣＢｏｄｉｎｌｏｍ　ｉｕ＋ｅｏｌｏｍＪ　。

精子の凍結保存に関しては以下の文献に記載されている： １、Ｅ、Ｌａｎｎａｎ著、　Ｇｅｎｅｔｉｃ＋　６８巻５９９−６０１頁（＋９ ７り。

ｒＥｘｐｅ＋ｉｍｅｎｔａｌ　ｔｅｌｌ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｔ　 ｔｈｅ　ＰａｃｉｆｉｃＯｙｔｔｅ＋　Ｃ＋ａ＋ｔｏ＋ｌ＋ｅａ　Ｖｉｒｇｉｎ ｉｃａＪ　；１、Ｂ、ｔｌｕｇｈ＋ｓ著、　Ｃ＋ｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　１０巻３ ２４−３４４頁（１９７３）ｒ　Ａｎ　ｅｘａｍｉｎａしｏｎ　ｏｆ　ｅｇｇ＋ 　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　ｗｉｔｈｃ＋ｙｏｐ＋ｅｉｅ＋ｖｅｄ　ｓｐｅ＋ｍａ ｔａｘｏａ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　０ｙｓｔｅｒ。

Ｃ＋ａ＋ｔｏ＋Ｈｅａ　ＶｉＢｉｎｉｃａＪ　；及びＳ、Ｒ，１ｅｌｌ、Ｍ、［ １，Ｂａ＋ｎｆｏ＋ｄ及び　Ｈ，Ｈｉｄｕ著。

ＣＢｏｂｉｏｌｏｇｙ　１６巻４４８−４６０頁ｆ１９７９）　ｒｃ＋ｙｏｐ＋ ｅｓｅ＋ｖａｌｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　＋ｐｅ＋ｍｇｆｘＩｏｘ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ　０７ｉ１ｅｒ。

Ｃ＋ａｉｉｏｉＨｅａ　ＶｉＢｉｎｉｃａＪ。

ある変法においては、精子だけを汚染物質に暴露し、その後、卵を岬化させるの に使用する。Ｐ、Ａ、　Ｄｉｎｎｃｌ他著、Ａｒｃｈ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｃｏｎ ｔａｍ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、１６巻２３−３２頁ｆ１９８７）　ｒ　Ｉｍｐｒｏｖ ｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｆｏｒａ　ｉｅａ　ｕｒｃｈｉｎ＋ｐｅ＋ｍ　 ｃｅｌｌ　ｂｉｏａ＋＋ａ７　ｌｏｔ　ｍａｒｉｎｅ　ｗａ＋ｅｚ　Ｊ参照。精 子は卵を岬化させるために用いられるが、その際２つのパラメーターが記録され る。即ち、岬化率と生存胚の発生パターンの２つである。

ある公知の水質汚染物質のバイオアッセイ法においては、軟体動物胚の岬化から プロディソコンチ期（胎殻（ｐ＋ｏｄｉｓｓｏｃｏｎｃｈ１期、即ち、直線状蝶 番ｒＤＪ型幼生）までの発生をモニターする（上掲の＾ｎｎｕａｌ　Ｂｏｏｋ　 ０１ＡＳＴＭ　５ｔａｎｄａｒｄｓ参照）。しかしながら、かかるアッセイ法は 一年のうちその軟体動物が繁殖し得る状態にあるような特定の時期にしか実施で きないという制約がある。

季節に関係なく繁殖を起こさせるような幾つかの室内コンディショニング技術を 利用することも可能であるが、かかる技術は費用かかかり、しかも不便である。

従って、繁殖期にない軟体動物胚は利用できないという根本的問題は依然として 残る。さらに、バイオアッセイの使用は繁殖可能な軟体動物を入手できる場所に 限定され、適当な水施設をもたない団体や場所での使用かできない。

本発明は、これらの問題を解決（もしくは少なくとも軽減）することを目的とし たものであって、費用をさほど上昇させることなく一年中筒便にバイオアッセイ を実施し得るようにすることを目的とする。

従って、本発明の第一の態様によれば、軟体動物門の未受精卵を凍結保存する方 法か供せられる。かかる卵を凍結保存（冷凍）することによって、それらを長時 間保存することができ、年間を通して季節に関係なく卵を生存させておくことか 十分可能になる。卵は、岬化場又はバイオアッセイに使用する前、都合のよい時 に融解させることができる。

この方法によっそ、−年中何時でも、特に天然には卵が十分な数存在しない時期 でも、卵が利用できるようになる。さらに、本発明により、時期外れでも瞬化場 に貯蔵卵を供給することができ、放流時期を延長することが可能になり、生産サ イクルの制御を向上させることかできる。

本発明の方法は、さらに、比較及び相互対照（複数のバイオアッセイ間での）用 の基準を与えるという利点を有するが、このようなことはその都度新鮮な卵を使 用する先行技術の方法では不可能であった。従って、本発明によって、長期にわ たり（数年でも）各種アッセイに同一バッチの卵を用いた作業が可能になる。こ れは、本凍結保存法によって卵のバッチを長期間保存することが可能になるから であるが、先行技術の方法では一致した実験結果を得ることのできる時間は僅か 数時間しかない。

さらに、本出願の凍結保存法並び保存上の利点によって、卵（例えば同一バッチ の）を世界中に輸送（例えば輸出）できるようになる。

卵の凍結保存及び貯蔵の利点は、さらに、遺伝材料の保存並びに無病種の保存と いう形でも現れる。さらに、本発明は、病気及び汚染から貴重な卵資源を保護す る上でも役立ち、遺伝学上貴重な卵の保存、例えば新種、外来種及び認証済無病 群の採集及び保存を可能にする。

特に適した卵は双殻類　Ｂｉｖａｌｖｈ綱（斧足類Ｌａｍｅｌｌｉ）ｚａｎｃｂ ｉａ亜綱に属する例えば翼形類られる。好ましい卵は、イガイ属Ｍ７１ｉ１ｕ＋ 、イタポガキ属０＋Ｎｅａ、ホタテガイ属Ｐａ１ｉｎｏｐｅｃｔｅｎ、イタヤガ イ属ＡＢｏｐｅｃｌｅｎ、マルスダレガイ属Ｖｅｎｕ≦、ヒノスガイ属軟体動物 類、及びカキ類を用いることができる。特にマガキ属Ｃ＋ａ＋ｓｏ［＋ｅａの卵 が好ましい。

特に好ましい種としては、クラソストリア・ギガスＣ＋ａ＋５ｏｓｔ＋ｅａ　ｇ ｉｇａ＋　（マガキ（Ｐａｃｉｆｉｃ　ｏｙｓｔｅｒ））　、タペス・フィリピ ナルム　Ｔａｐｅ＋　ｐｈｉｌｌｉｐｉｎａｒｕｍ　（アサリ（Ｍａｎｉｌａ　 ｃｌａｍ）　）　、クラソストリア・ヴアーシニカＣｒａｓ＋ｏ＋ｔ＋ｅａ　ｖ ｉｒｇｉｎｉｃａ　（パージニアガキ（Ａｍｅ［１ｃａｎ＋Ｉｅ「））　、メル セナリア・メルセナリアＭｅｒｃｅｎａｔｉａｍｅ＋ｅｅｎａ＋ｉａ　（ホンビ ノスガイ　（Ｈｔ＋ｄ　ｃｌａｗ））　、タペス・デクサータ　Ｔａｐｅｓ　ｄ ｅｃｕｓｓａ＋ａ　（ヨーロッパアサリ（Ｎａｔｉｖｅ　ｐａｌｏｕ＋ｄｅ）　 ）　、アルボペクチン・イラディアンスＡ＋Ｂｐｅｃｌｅｎ　ｉ＋＋ａｄｉａｎ ｓ　（ホンアメリカイタヤガイ（Ｂａｙ　＋ｃａｌｌｏｐ））が含まれる。

一般に、卵は適当な水性媒質中で凍結保存するか、水性媒質は好適には凍結保護 剤を含有する。ただし、該水性媒質は好ましくは塩類を含まない。卵は好適には それらを海水にさらす前に動物から例えば外科的摘ａなどで取り出す。従って、 例えば、卵は自然産卵の前に取り出し、凍結保存用媒質中に直接入れる。該媒質 に加える前に卵を海水中に放つと、凍結・融解後の生存率か低くなってしまう。

これは、恐らく、海水にさらされることによって卵膜の透過性が変化し、凍結保 護剤に対する透過性が低下するためだと思われる。摘出した雌生殖腺には卵重外 の他の残渣も含まれていることがあり、凍結保存する前に例えば濾過などによっ て精製しなければならないこともある。

放出前のこの段階で卵を選択するような前例はない。

卵はこの段階では受精「準備が整っていない」と思われていたからである。さら に、卵が正常に発生を続けるような媒質（即ち海水）に卵を触れさせないでおき 、しかも受精可能な状態におくという前例もない。

凍結保存の好ましい方法は欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０２４６８２４号並びに セル・システムズ社を出願人として１９９０年８月１３日付けで出願された「氷 核形成」と題する国際特許出願に開示されているが、実用に足るだけの十分な数 の卵の生存が確保されるような適当な凍結保存法であれば如何なる方法を用いて もよい。例えば、卵は好ましくは水性媒質中で有機固体と接触させて凍結保存す る。この固体は核形成剤として作用するもので、水性媒質の凝固点又はその付近 で水性媒質中の水が核形成し、卵の損傷を最小限に抑えるようにする。好適な有 機固体には、ステロイド、アミノ酸、アミノ酸のオリゴマーもしくはポリマー、 及びポリヒドロキシル化化合物が含まれる。コレステロールが特に好ましく、そ れも特にメタノール又は酢酸から結晶化させたものが好ましい。メタノールから 結晶化させたコレステロールか最も好ましい氷核形成剤である。

有機固体は水性媒質中に例えば０．０００１〜０゜００１ｇ／ｍｌの濃度（０２ ■／ｍｌ又はそれ以上など）で加える。好ましくは媒質は０．２５〜１５■／ｍ ｌのコレステロールを含み、その至適濃度は０７５〜１．２５■／ｍｌである。

しかし、簡便には、有機固体を水性媒質と接触する支持体上に被覆することもで きる。支持体は通常は凍結保存を行なう容器、例えばアンプル、ストロ−、バッ グ又はチューブなどである。有機固体は高分子ビーズ、例えばバイオ・ラッド社 から市販のＢｉｏ−Ｂｅａｄ＋　Ｓｍ７のようなアクリルビーズ上に供してもよ い。

指示体上の有機固体の被覆密度は好適には０．０００７■／′酎２以上（例えば ０．００１〜０．　ｉ　ｍｇ／　ｍｍ　’の間）であり、約００３５■／闘２が 最適である。

水性媒質はさらに溶解性成分（凍結保護剤、糖及び／′又は塩など）をほぼ濃度 零（無限希釈）から高濃度（ただし、凍結し得る自由水が依然として存在するこ とを条件とする）までの濃度範囲で含んでいてもよい。好ましくは水性媒質に、 例えばグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドなどの凍結保存剤を加える 。好適には、凍結保存剤は１〜６０％ｖ／ｖ、例えば５〜１５％Ｖ／マ（約１０ ％マ／Ｖなど）の量で存在する。水性媒質はマンニトール及び／又はトレハロー スなどの糖を、例えば０．１Ｍ〜ｌＯ，ＯＭ、より好ましくは０．８Ｍ〜１２Ｍ １最適には１．ＣＭの濃度で、含んでいてもよい。

凍結保存を確実にするために、卵は少なくとも一３０℃まで冷却しなければなら ない。しかし、いったん冷却した後は、長期保存を望む場合は卵を液体窒素に移 す。短期保存は約−８０℃の深冷凍状態で達成できる。好ましい保存温度は水の ガラス転移温度未満となる一１３５°Ｃ未満てあり、かかる温度は冷凍機中で達 成できる。これは好ましくは沸点−１９６℃の液体窒素を用いて達成する。卵は 注意深く冷却しなければならないことに留意すべきであって、急速冷却は致命的 になる場合もある。冷却法は、場合によっては、少なくとも１回の等温維持、好 ましくは２乃至３回の等温維持を含み、それぞれ通常１分〜１０分間（例えば４ 分〜８分間）持続する。卵は通常室温（例えば約２０℃）から冷却し始める。好 ましくは冷却法は以下の通りである （ａ）任意には、卵を毎分２〜６°Ｃの速度で＋３〜−５℃の温度まで冷却し。

（ｂ）任意には、上記温度に卵を約４〜６分間維持し：（ｃ）卵を毎分２〜６℃ の速度で−１５〜−２５℃の温度まで冷却し； （ｄ）上記温度に卵を約３〜７分間維持し。

ｆｅ）　さらに卵を毎分２〜６℃の速度で−３０〜−４０’Ｃの温度まで冷却し ； （［）任意には、上記温度に卵を２分以内維持し、か（ｇ）任意には、卵を液体 窒素に入れる。

最も好ましい冷却法は以下の工程からなる（ａ）軟体動物門の卵を毎分３℃の速 度で約０°Ｃの温度まで冷却し： （ｂ）約０℃に卵を約５分間維持し； （ｃ）卵を毎分約３℃の速度で約−２０°Ｃの温度までさらに冷却し： （ｄ）上記温度に卵を約５分間維持し。

（ｅ）卵を毎分約り℃／分の速度で一３５℃の温度まで冷却し； （１）約−３５℃に卵を１分以内維持し、かつ（ｇ）卵を液体窒素に入れる。

本発明の第二の態様においては、軟体動物門の凍結保存した未受精卵が供せられ る。本発明の第二態様の好ましい特色並びに特徴は、第一態様に必要な修正を加 えたものである。本発明はさらに、軟体動物門の凍結保存米受精卵の提供法にま で拡大されるが、この方法は第一態様の方法とそれに続く卵の融解を含んでなる 。

本発明は、最も広義には、汚染物質の検出のための各種バイオアッセイを意図し たものである。

本発明の第三の態様はバイオアッセイを行なう方法に関するが、この方法は、軟 体動物門の凍結保存米受精卵又は軟体動物門の凍結保存米受精卵の受精によって 得られる幼生を検定試料と接触させることを含んでなる。

このように、バイオアッセイは凍結保存卵そのもの又は受精卵についても行ない 得るし、得られる幼生についても行ない得る。

従って、バイオアッセイを行なう好ましい方法は以下の工程からなる （ａ）軟体動物門の未受精卵を凍結保存し。

（ｂ）上記卵を融解し： （ｃ）任意には上記卵を受精させて軟体動物門の幼生を生しさせ：かつ （ｄ）検定すべき試料を、上記卵（工程（＋）を行なう場合には幼生）と接触さ せる。

卵はいったん受精すると、胚、ヴエリジャ−（被面子幼生）及びプロディソコン チなどの何段階かを経て発生するが、本明細書中で用いる「幼生」という用語は 、これらのすべての段階を包含したものであって、卵の精子との受精に起因して 受精の瞬間以降に得られる生体を意味する。

バイオアッセイ（試料との接触）は好ましくは４８時間以内である。これは、餌 を与えないと幼生が餓死する危険性があるからである。バイオアッセイ用の好ま しい幼生は、４８時間齢のもの、或いはプロプイソコンチェ期（即ち、後トロコ フォラ（ｐｏｓｔ−ｔ＋ｏｃｈｏｐｈｏ＋ａｊ期）にあるものである。通常、異 常な貝殻の発生に基づいて、半致死濃Ｉｆ　（ＬＣ５０）と半有効濃度（ＥＣ５ Ｑ）の両方を測定する。

バイオアッセイの間、幼生は好ましくは水性媒質（例えば塩類溶液）中に好適に は１５〜２５℃で保持する。水性媒質は好ましくは通気する。有利には、媒質は 頻繁に撹拌する。撹拌は、幼生の損傷を避けるために好ましくは穴開きプランジ ャーを用いて行なう。

幼生密度は好ましくは１ｍｌ当り１００個未満であり、好適には１　ｍｌ当り１ 個以上である。好ましい範囲は１　ｍｌ当り１０〜５０個、任意には１　ｍｌ当 り１５〜３０個である。

バイオアッセイは、生物学的機能、生産力、発生又は挙動に基ついて、試料中の １種又は複数種の基質の効果、又はバイオアッセイに使用した生物材料を取囲む 周囲の状態を決定するために行なわれる。試料は毒物もしくは汚染物質を含んで いてもよいが、バイオアッセイは生物活性に悪影響を与える基質に限定されるも のではない。

バイオアッセイは、各種の添加剤の効果、例えば塗料添加剤が油掘削装置に塗布 すべき塗料に関連する各種生活形に与える影響、を決定するのに用いることもて きる。

試料は、汚染されている疑いのある環境（例えば海水）から、場合によっては希 釈して、採取してもよいし、試料の懸濁液（通常は水に懸濁する）であってもよ い。

「汚染物質」並びに「毒物」という用語は、ある種の生体（特に野生生物及び人 間）に対して有害、有毒、危険もしくは毒性を有する如何なる物質をも包含し、 必ずしも軟体動物門の未受精卵だけに有害、有毒、危険もしくは毒性を有するも のでなくてもよい。しかし、「試料」という用語は汚染物質だけでなく、生物活 性に対する影響（好い影響も含む）を検査しようとする物質をも包含する。実際 、バイオアッセイには環境から得た試料を用いないで行なうものもあり、従って 本明細書中でいう「試料」には市販品として入手し得る分析用又は試薬用の化学 物質も含まれる。かかるバイオアッセイの実際の手順の詳細は当業者には周知で ある。

未受精卵は好適にはます本発明の第一態様に従って凍結保存しておく。バイオア ッセイの実施方法の好ましい具体例は以下の工程を含んでなる ｆａ）軟体動物門の未受精卵を凍結保存し：（ｂ）上記卵を融解し： （ｃ）上記卵を受精させて幼生を生じさせ、かつｆｄ＋上記幼生を、検定すべき 試料、例えば汚染物質又は毒物との疑いのある試料、と接触させる。

凍結保存と融解の方法は、実用に足るだけの十分な数の未受精卵が生存するもの であれば、如何なる方法を用いてもよい。融解は１５℃から２５°Ｃの温度（例 えば室温）で行なうことができ、空気中でも行ない得るし、好適には水などの液 体媒質中で行なってもよい。卵はバイオアッセイに用いる前に、穏やかに（例え ば１５ミクロンのフィルター上で）濾過してもよい。

このように、バイオアッセイはなるべくなら軟体動物門の幼生について行なう。

従って、かかるノ々イオア・ソセイを繁殖期以外の時期に行なうためには、受精 用の精子も同様に凍結保存しておくのが好ましい。卵につｌ、ｓで説明した第一 態様の凍結保存法か、必要な修正を加えることによって精子にも応用できる。し かし、精子に対して特に好ましい冷却方法は、精子を水性媒質（好ましくは１． ０Ｍマンニトール、１．０Ｍレノ１０−ス、１５％Ｖ／ＶのＤＭＳＯ）に約１・ １の体積比で加える。次に、この混合物を、メタノールから結晶化させたコレス テロールを加えた（例えばＯ２■／　ｍｌ）　（１，５ｍｌのストロ−に入れる 。

これを毎分４０〜６０℃の速度（例えば毎分５０℃）で室温から一１００℃まで 冷却する。次いで、これを液体窒素に入れる。精子は好ましくは約４０°Ｃの例 えば水に漬けて融解する。この方法の受精率は非凍結対照群の約８８％以上であ る。

以上の通り、特に好ましい具体例においては、バイオアッセイの実施方法は以下 の工程をふくんでなる（ａ）軟体動物門の未受精卵と精子をそれぞれ別個に凍結 保存し。

Ｌｂ）上記の卵と精子を融解し。

（Ｃ）上記卵を上記の精子で受精させて幼生を生しさせ、かつ （ｄ）上記幼生を検定すべき試料と接触させる。

本発明の第四の態様は、軟体動物門の凍結保存米受精卵、及び該未受精卵又は該 卵の受精によって得られる幼生と試料とを接触させる手段を含んでなるバイオア ッセイキットに関する。従って、このキットは、卵又は幼生と試料を相互に接触 させることのできる１個以上の容器又はウェルを含んでいてもよい。このキット は、第一態様で説明した有機固体氷核形成剤で少なくとも部分的に被覆した表面 （容器又はウェルの内面など）をさらに含んでいてもよい。キットは好ましくは 凍結保存精子をも含む。こうすることによって、卵もしくは精子か人手できるか 否かを問わず、何時どこでも都合のよいときにバイオアッセイを行なうことがで きる。

第五の態様のその他の好ましい特色並びに特徴は前述の態様に必要に応じて修正 を加えたものである。

以下、本発明を実施例を用いて説明するが、この例は例示のためのものであって 本発明の範囲を限定するもの体を、生殖可能な状態として確立された固体数に維 持しかつ条件付けられた実験室から得た。成熟体の外表面から水を吸い取った後 、切開した。中に含まれていた液体をすべて吸い取って生殖組織を露出させた。

清潔で先の尖ったガラス製パスツールピペットを生殖線の外膜に刺し込んで、除 圧を加えて内容物を穏やかに取り出した。かなりの機械的振動を与えないとピペ ットをいっばいにするのが難しくなるまで内容物を採取した。

生殖腺から得た材料を採取時に乾いたペトリ皿に移し最終的な生殖腺由来懸濁液 を１５ミクロンの篩の上に上層して、できる限り卵巣由来の液体を除いた。次に 、卵を以下の適当な凍結保護剤（ＣＰ　Ａ）中に直接入れた。

ＣＰＡ：０．８５Ｍのトレハロース及び１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む蒸留水。

コレステロールで被覆した［）、５ｍｌのプラスチック製ストロ−に、１ｍｌ当 り５０Ｍ個から１００万個の間の卵を入れた。卵をＣＰＡに加えて丁度１０分後 に冷却を開始した。

冷却の手順は以下の通りであった ２０℃から毎分３℃の速度で０℃まで冷却。

０℃に５分間維持： ０℃から毎分３℃の速度で一２０°Ｃまて冷却。

−２０℃に５分間維持： 毎分３°Ｃの速度で一３５℃まで冷却ニー３５℃に１分以内維持；かつ 液体窒素に入れる。

融解は８０℃の水にストロ−全体を漬けることによって行なった。

最後の氷層が消失すると同時にストロ−の端を切り取って、内容物を室温の海水 ０５ｍ１に投入した。３０秒後に１ｍｌの海水を加えて５分間放置した。さらに 、容積か１０ｍ１となるまで１ｍｌの海水を５分おきに加えた。ピペットを用い て卵を１５ミクロンのフィルター上に乗せ、フィルター上で清浄な海水中に再懸 濁して１分間穏やかに撹拌した。その後、卵をフィルターから取って２００　ｍ ｌの清浄な海水に再懸濁した。

卵を最低でも２０分間再水和したままにしておいた後、濾過海水中において２５ ℃で授精させた。

クラソストリアｅギガスＣ＋ａｕｏ＋ｔ＋ｅａ　ｇｉｇａ＋の卵を用いた場合、 凍結保存から回収した無傷の（ｉｎｔａｃｔ）成熟卵母細胞の５５％が、適当に 条件付けした雄から摘出した新鮮な精子て受精した。得られた胚を、濾過しかつ ＵＶ処理した２５℃の海水中で２４時間培養した。卵を凍結していない対照群と 卵を凍結保存した実験材料とは、Ｄ型幼生の発生に関して同等であった。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．軟体動物門の卵を凍結保存することを含んでなる方法。
2. ２．請求項１記載の方法において、卵がマガキ属Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａに属す ることを特徴とする方法。
3. ３．請求項１記載の方法において、卵を水性媒質中で凍結保存することを特徴と する方法。
4. ４．請求項３記載の方法において、前記水性媒質がコレステロールと接触してい ることを特徴とする方法。
5. ５．請求項４記載の方法において、コレステロールが指示体上に被覆されている ことを特徴とする方法。
6. ６．請求項１記載の方法において、卵を少なくとも−３０℃まで冷却することを 特徴とする方法。
7. ７．請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法において、 （ａ）任意には、卵を毎分２〜６℃の速度で＋３〜−５℃の温度まで冷却し； （ｂ）任意には、上記温度付近に卵を約４〜６分間維持し； （ｃ）卵を毎分２〜６℃の速度で−１５〜−２５℃の温度まで冷却し； （ｄ）上記温度付近に卵を約３〜７分間維持し；（ｅ）さらに卵を毎分２〜６℃ の速度で−３０〜−４０℃の温度まで冷却し； （ｆ）任意には、上記温度に卵を２分以内維持し；かつ （ｇ）任意には、卵を液体窒素に入れることを含んでなる方法。
8. ８．請求項７記載の方法において、 （ａ）卵を毎分約３℃の速度で約０℃の温度まで冷却し； （ｂ）約０℃に卵を約５分間維持し； （ｃ）卵を毎分約約７℃の速度で約−２０℃の温度までさらに冷却し； （ｄ）上記温度に卵を約５分間維持し；（ｅ）卵を毎分約３℃／分の速度で−３ ５℃の温度まで冷却し； （ｆ）約−３５℃に卵を１分以内維持し；かつ（ｇ）卵を液体窒素に入れる ことを含んでなる方法。
9. ９．請求項７記載の方法において、卵の融解をさらに含んでなることを特徴とす る方法。
10. １０．軟体動物門の凍結保存卵。
11. １１．双殻類Ｂｉｖａｌｖｉａ綱に属する請求項１０記載の卵。
12. １２．請求項１０又は請求項１１記載の卵において、請求項１乃至請求項９のい ずれか１項記載の方法で凍結保存したことを特徴とする卵。
13. １３．軟体動物門の未受精卵又は凍精保存未受精卵から得られる軟体動物門の幼 生を、検定すべき試料と接触させることを含んでなるバイオアッセイの実施方法 。
14. １４．請求項１３記載の方法において、（ａ）軟体動物門の未受精卵を凍結保存 し；（ｂ）上記未受精卵を融解し； （ｃ）上記卵を受精させて軟体動物門の幼生を生じさせ；かつ （ｄ）上記幼生を検定すべき試料と接触させることを含んでなる方法。
15. １５．請求項１３記載の方法において、卵又は幼生と試料を４８時間以上は接触 させないことを特徴とする方法。
16. １６．請求項１３記載の方法において、幼生がプロディソコンチ１期以降の段階 にあることを特徴とする方法。
17. １７．請求項１３記載の方法において、幼生を１５〜２５℃の温度の塩類溶液中 に保持することを特徴とする方法。
18. １８．請求項１７記載の方法において、塩類溶液を穴開きプランジャーを用いて 頻繁に撹拌することを特徴とする方法。
19. １９．請求項１８記載の方法において、幼生の密度が塩類溶液１ｍｌ当り１５〜 ３０個であることを特徴とする方法。
20. ２０．請求項１４記載の方法において、凍結保存を請求項１乃至請求項９のいず れか１項記載の方法で行ない、かつ／或いは使用する未受精卵が請求項１０記載 のものであることを特徴とする方法。
21. ２１．軟体動物門の凍結保存未受精卵、及び該未受精卵又は該卵の受精によって 得られる幼生と試料とを接触させる手段を含んでなるバイオアッセイキット。
22. ２２．請求項２１記載のキットにおいて、凍結保存精子をさらに含んでいること を特徴とするキット。