JPH05502662A - 生物学的凍結保存 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的凍結保存 本発明は、繁殖期以外の時期でも例えば岬化場やバイオアッセイなどで使用でき るようにするための、軟体動物門に属する幼生の凍結保存に関する。

胛化場その他の軟体動物の養殖が行なわれる様々な場所においては、生殖周期の 季節性のために、−年のうちで胚及び幼生を利用できない時期がある。従って、 −年中かかる動物を養殖しようとすると不便である。

この問題を解決するためにかかる動物を「条件付け（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ）Ｊることが試みられているが、かかる試みには、高い栄養投入量の下、使用種 を産卵状態に誘導するのに適した水温に上昇させ、コントロールされた水施設中 で成熟体を飼育することが必要とされる。ある期間（通常は数週間程度）、一部 の動物が生殖状態に導かれる。しかしながら、この方法は時間がかかる上に費用 がかかるので、商業的な効率は悪い。さらに、結果がばらついて首尾一貫しない こともよくある。

コロミチラスーコラスＣｈｏ＋ｏｍｙｔｉｌｕ＋　ｃｈｏｒｕ＋というイガイの 受精後の非常に初期段階の胚を凍結保存することが知られている（Ｇａｌｔａ＋ ｄｏ、Ｃ，Ｓ、、　ｄｅｌ　Ｃａｍｐｏ、　Ｍ、Ｐ。

及び　Ｆｉｌｏｎ、Ｌ、、Ｃ＋ｙｏｂ＋ｏｌｏｇ７２５巻　５６５頁　（＾ｂ＋ ｌ＋ａｃｌ）１９８８、　ｒＰｒｅｌｉｍｉｐａｒ丁　ｔｒｉａｌｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ｃｒＹｏｐ＋＋ｓｅ＋ｖｉｎｇｏｆ　ｍａｒｉｎｅ　ｍｏｌｌｕｓｃ　ｅ ｍｂＢｏ＋　ａｔ　１ｌｌｕｓＨａｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅチリにある大学の 学科によるもので、胚は１乃至８個の細胞からなるが、かかる胚は１５℃で受精 数時間後に発生したものであろうと思われる。成功したと報告されているものの 、不可解なことに何等のデータも記載されておらず、実際の成功率は非常に低い ことが示唆される。

Ｊ、Ｄ、Ｔｏ１ｅｄａ他による、日本水産学会誌５５（Ａ）巻１６６１頁（１９ ８９年９月）には、アオイガイ（ｂｌｕｅ　ｍｏｒｓｅｌ。

Ｍｙｔｉｌυ５ｅｄｕｌｉ＋）の卵割期又はトロコフォラ（Ｉｔａｃｂｏρｈａ ｔａ）期にある胚を異なる冷却法で凍結保存することについて議論されており、 得られた生存率について報告されている。

バイオアッセイの実施についての例が、Ａｎｎｕａｌ　Ｂｏｏｋｏｆ　ＡＳＴＭ 　５ｔａｎｄａｒｄｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｌｏｔ　Ｔｅｒｔ ｉｎｇａｎｄ　Ｍａ＋ｅ＋ｉａｌ＋　１−１７頁（１９８０＋、分類番号Ｅ７２ ４−［１Ｇ（Ｄｅｉｉｇｎａｔｉｏｎ　Ｅ７２４−８０）、　ｒｃｏｎｄｏＨｉ ｎｇ　５ｔａｔｉｃ　ａｃｉｅｔｏｚｉｃｉｔｙ　ｌｅ＋ｌ＋　ｖｉｔｂ　１ａ ｒｖａｅ　ｏｆ　ｔｏｕｒ　＋ｐｅｅｉｅｓ　ｏｆｂｉｖａｌｖｅ　ｍｏｌｌｕ ＋ｃＪに記載されている。

発生段階のより進んだ胚については、多細胞構造の複雑さが凍結保存の諸問題を ひどく込み入ったものにする（Ｍ、Ｉ、Ａｓｈｗｏｏｄ−３ｍｉｔｈ及び１．　 Ｆａ＋＋ａ、ｎｔ編のｒＭｅｄｉｃｉｎｃａｎｄ　ＢｉｏｌＢＴ　Ｊ　１９〜４ ４頁（Ｐｉｔｍａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓ＋社７Ｔｕｎｂ＋ｉｄｇｅ　Ｗ ｅ１！ｓ、１９８０）に所載の［Ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅ＋ａｔｕ＋ｅｐ＋ｅｓｃｔ ｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｌｓ、ｌｉ＋＋ｕｅ＋　ａｎｄ　ｏ＋ｇａｎ＋　Ｊ 　、並びにＢ、Ｗ、Ｗ、Ｇｒｏｕｌ及びＧ）　Ｍｏｒｒｉｓ編のｒＴｈｅ　Ｅｆ ｆｅｃｔｓ　ｏｆＬｏｗ　Ｔｅｍｐｅ＋ａｌａ＋ｅｓ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　５７ｉｔ＋ｍ＋Ｊ　４３２−４５０頁（Ｅｄｗａｔｄ　Ａｒｎｏ［ｄ　Ｌ ｔｄ、社、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）に所載のｒＬｏｗ　ｌｅｍｐｅ＋Ｎｎｒｅ 　ｐ＋ｅ＋ｅｒｖａｌｉｏｎ　ｉｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄｖｅｌｅｒｉｎ ａＢ　＋ｃｉｅｎｃｅＪを参照のこと）。従って、論理的には、凍結保存を行う に当たって、単細胞又は少数の細胞の段階に適しているときには、何百もの細胞 を含んでいる幼生期を選択すると不利である。同様の複雑さに伴う理由にから、 哺乳類の胚を凍結保存する場合、成功するのは細胞の数が約１００個までのとき に限られる（上掲のｒＬｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｅｉｏｌｏｇ７Ｊに所載のり、 Ｇ、　Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ著ｒＰ＋１ｎｃｉｐｌｅ＋　ｏｌ　ｅ＋ｎｂ＋ｙ ｏ　ｐ＋ｅ＋ｅ＋ｖａｌｉｏｎＪを参照のこと）。従って、幼生を生しさせたい 場合に繁殖期に材料を集めておいて池の都合のよい時（例えば繁殖期以外の時期 ）まで保存しておくことのできるような、軟体動物胚などの生きた胚を発生停止 状態で保存する満足のいく方法は未だにない。

本発明の第一の態様によれば、トロコフォラ期又はそれ以降の段階にある軟体動 物門の幼生を凍結保存することを含んでなる方法が供せられる。

この方法によって、−年中何時でも、特に天然には幼生が十分な数存在しない時 期でも、幼生が利用できるようになる。さらに、本発明により、時期外れても養 殖場に貯蔵幼生を供給することができ、放流時期を延長することが可能になり、 生産サイクルの制御を高めることができる。

本発明の方法は、さらに、比較及び相互対４照（複数のバイオアッセイ間での） 用の標準を与えるという利点を有するが、このようなことはその都度新鮮な幼生 を使用する先行技術の方法では不可能であった。従って、本発明によって、長期 にわたり（数年でも）各種アッセイに同一バッチの幼生を用いた作業が可能にな る。これは、本凍結保存法によって幼生のバッチを長期間保存することが可能に なるからである。これに対して、先行技術の方法では一致した実験結果を得るこ とのできる時間は僅か数時間しかない。さらに、本出願の凍結保存法並びそれに 伴う保存上の利点によって、幼生（例えば同一バッチのもの）を世界中に輸送（ 例えば輸出）できるようになる。

幼生の凍結保存及び貯蔵の利点は、さらに、遺伝材料の保存並びに無病種の保存 という形でも現出する。さらに、本発明は、貴重な幼生資源を病気や汚染から保 護する上でも役立ち、遺伝学上貴重な幼生の保存、例えば新種、外来種及び認証 済無病群の採集及び保存を可能にする。

トロコフォラ期の幼生は繊毛を有しており、それによってその前段階の幼生と区 別し得る。幼生は好ましくは後トロコフォラ（ｐａｓｔ−ｔｒｏｃｈｏｐｈｏ＋ ａ１期又はそれ以降の段階にあるもので、例えばプロディソコンチＩｆｐ＋ｏｄ ｉ＋＋ｏｃｏｎｃｈ　ｌｉ期、即ち、直線状蝶番り型ｆ＋ｌ＋ａｉｇｈｔ　ｈｉ ｎｇｅ　Ｄ）幼生、Ｄ殻（Ｄ　＋ｂｅｌｌｌ幼生又は蝶番［ｈｉｎｇｅ）幼生な ととも呼ばれる（これらは殻を有しているからである）などである。好適な幼生 は受精後２４時間以上経過したもので、これは２２〜２８℃などの適当な温度で （例えば海水中で）発生させたにときにはプロプイソコンチェであると思われる 。この段階の幼生は、既に、心臓、胃、口、肛門及び殻腺などの十分に分化した 器官を多数供えており、痕跡的な殻とそれに関連する筋組織を伴っている。また 、幼生は、胚とは異なり、独力で運動し得る。全細胞数は何千という桁であり、 従って、この段階以降のものを生存状態で凍結保存するということは、先行技術 （例えば上掲のＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ）の教示とは相反する。凍結保存はプロ ディソコンチＩ期に行なうのが好ましいが、それ以降のＤ型幼生を用いることも できる。例えば、プロプイソコンチェ期にあるものなどである。従って、本発明 は、受精２４〜９６時間後（例えば２２〜２８℃の温度での岬卵後）の幼生の凍 結保存をも意図している。２〜３週齢の幼生を用いることもできるが、凍結保存 する幼生は受精後２４時間以降（例えば４８時間）のものがやはり好ましい。最 適な幼生はプロプイソコンチェ期にあるものである。この段階は、約２５℃で瞬 卵した場合など、受精後約４８時間後に生ずる。

図１は、典型的な二枚貝の初期幼生発生を図示したものである（縮尺率は同一で はない）。これは例示のためのものであって、本発明を限定するものではない。

胚Ａ〜Ｄは、受精卵Ａ（直径約２５〜４０ミクロン）から多細胞期りまでの多数 の即刻段階を示したものである。Ｅの段階で、幼生は繊毛を有しており、運動性 トロコフォラ（幅約５０〜７０ミクロン）と呼ばれる。Ｆはヴエリジャーで殻腺 から胎殻（プロプイソコンチェ）を分泌し、分泌が完了した幼生は直線蝶番又は Ｄ型殻期（Ｇ、幅約１００〜１３０ミクロン）にある。第二胎殻（プロディソコ ンチ■）の分泌はプロディソコンチＩ期の直後に始まる。

受精後の幼生を生じる成長段階は適当なものであれば当業者に公知の如何なる手 順を用いてもよいが、グルタミン酸などのアミノ酸存在下で幼生を生育するのが 好ましい。アミノ酸は通常、幼生を入れておく水性媒質中に与えておく。好まし くは、アミノ酸は５〜１５μＭ（例えば８〜１２μＭ）濃度で供し、至適濃度は 約１０μＭである。

幼生は少なくとも受精２時間後にアミノ酸存在下で生育させると有利である。そ うすると、凍結保存及びその後の融解後の幼生の生存率が格段に向上する。

生育時、即ち、好適には受精１８時間後から凍結保存までの間、藻類を飼料とし て幼生に与えるのが好ましい。

また、幼生は塩水中、例えば１５〜２５℃の温度で、生育させるのが好ましい。

水は好適には通気し、幼生は好ましくは頻繁に撹拌する。撹拌は幼生を損傷する 恐れがあるので、注意深く行なう必要があり、従って穴開きプランジャーを用い て撹拌するのが好ましい。

幼生は好ましくは、双殻類Ｂ１マ！１マ目綱（斧足類Ｐｅ１ｅｘ７ｐｏｄｓ綱） に属するもので、例えば弁鱈類Ｐ＋ｅ＋ｉｏｍｏ＋ｐｂｉａ　、異歯類Ｈｅｔｅ ＋ｏｄｏｎｔａ、古異歯類れる。特に好ましい幼生は、イガイ属Ｍｙｔｉｌｕ＋ 、イタボマルスダレガイ属ｖｃｎｕｉ　１　ビノスガイ属Ｍｅ「ｃｅｎａ＋ｉａ 、又は（特に）マガキ属Ｃｌ８８１０８１Ｔｅａに属するものである。

特に好ましい種としては、クラソストリア・ギガス（Ｍａｎｉｌａ　ｃｌａｎ） 　）　、クラソストリア・ヴアージニカＣ＋ａｓｓ＋ｕｌ＋ｅａ　ｖｉ＋ｇｉｎ ｉｃａ　（パージニアガキ　（＾ｍｅ＋１ｃａｎＢ＋＋＋＋））　、メルセナリ ア１メルセナリア　Ｍｅ＋ｃｅｎａ＋１ａ（Ｎａｔｉｖｅ　ｐｘｌｏｕ＋ｄｅ） 　）　、アルボペクチン・イラディアンス　＾Ｂｏｐ＋ｃｌｅｎ　ｉ＋＋ａｄｉ ＋ｎ＋　（ホンアメリカイタヤガイ（Ｂａｙ　＋ｃａｌｌｏｐ））が含まれる。

好適には、幼生は水性媒質中で凍結保存する。特に好ましい凍結保存の技術は、 欧州特許公開（ＥＰ−Ａ）第０２４６８２４号並びにセル・システムズ社を出願 人として１９９０年８月１３日付けで出願された「氷核形成」と題する国際特許 出願に開示されている。例えば、幼生は好ましくは有機固体の氷核形成剤を使用 して水性媒質中で凍結保存し、該媒質は幼生の損傷を最小限に抑えるように該媒 質の凝固点又はその付近で核形成させる。好適な有機固体には、ステロイド、ア ミノ酸、アミノ酸のオリゴマーもしくはポリマー、及びポリヒドロキシル化化合 物が含まれる。コレステロールが特に好ましく、それも特にメタノール又は酢酸 から結晶化させたものが好ましい。

メタノールから結晶化させたコレステロールか最も好ましい氷核形成剤である。

有機固体は水性媒質中に例えば０．０００１〜Ｉ１．００１　ｇ　／　ｍｔの濃 度（０２■／　ｍｌ又はそれ以上など）で加える。好ましくは媒質は０２５〜１ ．５■／　ｍｌのコレステロールを含み、その至適濃度は０．７５〜１．２５■ ／ｍｌである。しかし、簡便には、有機固体を水性媒質と接触する支持体上に被 覆することもできる。この支持体は通常は凍結保存を行なう容器であり、例えば アンプル、ストロ−、バッグ又はチューブなどである。有機固体は高分子ビーズ 、例えばバイオ・ラッド社から市販のＢｉｏ−Ｂ！ａｄｓ　３Ｍ７のようなアク リルビーズ上に供してもよい。

指示体上の有機固体の被覆密度は好適には０．０００７■／唾２以上（例えば０ ．００１−０．　ｌ　ｍｇ／　ｍｍ　２の間）であり、約０．０３５■／　ｍｍ 　２が最適である。

水性媒質はさらに溶解性成分（凍結保護剤、糖、塩など）をほぼ濃度零（無限希 釈）から高濃度（ただし、凍結し得る自由水が依然として存在することを条件と する）までの濃度範囲で含んでいてもよい。好ましくは、水性媒質は、適当量、 例えば１〜６０％マ／ｖ（５〜１５％ｖ／ｖなど）、特に約１０％ｖ／ｖ、の凍 結保存剤（例えばグリセロール及び／又はジメチルスルホキシドなど）を含む。

これに代えて或いはこれに加えて、上記媒質はグルコース及び／又はトレハロー スなどの糖を、　０．１Ｍ−１０，０Ｍ、より好ましくは０８Ｍ〜１．２Ｍ、最 適にはＩ、　Ｏ！、ｔの濃度で、含んでいてもよい。

幼生の凍結保存の成功率は、用いる凍結／融解法によって影響される。本発明に おいては、幼生を少なくとも一３０℃、好ましくは一３５℃以下まで冷却するの か好ましい。短期保存は約−８０℃の深冷凍状態で達成できる。

好ましい保存温度は水のガラス転移温度未満となる一１３５℃未満であり、かか る温度は冷凍機中で達成できる。これは好ましくは沸点−１９６℃の液体窒素を 用いて達成する。

幼生を一１９６℃以下で凍結保存することによって、幼生の発生を完全に停止さ せることか可能になる。さらに、こうすることによって、例えば数十年もの非常 に長い凍結保存（従って貯蔵）期間が可能になる。

冷却法は、場合によっては、通常１分〜ｌＯ分間（例えば４分〜８分間）の等温 維持を含む。以下の冷却法を用いると良好な結果を得ることかできる 次の（ａｌ）又は（ａｌ）のいずれかから始める；（ａｔ）　軟体動物門の幼生 を毎分１２〜１７℃の速度で−１５〜−２５℃の温度まで冷却し。

（ａｌ）軟体動物門の幼生を毎分４０〜５０℃の速度で−４０〜−５０℃の温度 まで冷却した後、幼生を毎分５〜１５°Ｃの速度で−１５〜−２５°Ｃの温度ま て温め：（ｂ）上記温度に幼生を５〜７分間維持し１ｆｃ）幼生を毎分１２〜１ ７℃の速度で−３０〜−４０℃の温度までさらに冷却し： （ｄ）任意には、上記温度に幼生を２分以内維持し：かつ （ｅ）任意には、幼生を液体窒素に入れる。

好ましい冷却法は以下の工程からなる・次の（ａｌ）又は（ａｌ）のいずれかか ら始める；（ａｌ）軟体動物門の幼生を毎分約１５℃の速度で約−２０℃の温度 まで冷却し。

（ａｌ）　軟体動物門の幼生を毎分約４５℃の速度で−４４〜−４６℃の温度（ 例えば約４５℃）まで冷却した後、幼生を毎分約１０℃の速度で約−２０℃の温 度まで温め： （ｂ）約−２０℃に幼生を約６分間維持し。

（Ｃ）幼生を毎分約１５℃の速度で約−３５℃の温度までさらに冷却し。

（ｄ）幼生を約−３５℃に１分以内維持し、かつ（ｅ）幼生を液体窒素に入れる 。

好ましい冷却法は当然ながら幼生の最初の温度と幼生を懸濁する水性媒質の種類 に依存する。特に、ストロ−中で幼生を凍結保存するときは、冷却は上記（ａ　 ｌ）の選択肢から始めるのが好ましい。この場合、１５％Ｖ／マのＤＭＳＯと　 １．（ＩＭのトレハロースを含有する水性媒質を使用し、かつメタノールから結 晶化したコレステロールを氷核形成剤として使用するのが特に好ましい。該水性 媒質の容積は好適には約０．５ｍｌである。

バッグ中で冷却を行なうときは、上記（ａ２）の選択肢が冷却法としてはより好 ましい。かかるバッグは好ましくはアルミニウムホイル製で、しかもヒートシー ル可能なものが適している。

本発明の第二の態様においては、凍結保存したトロコフォラ期以降の軟体動物門 の幼生が供せられる。本発明の第二態様の好ましい特色並びに特徴は、第一態様 に必要な修正を加えたものと同様である。

本発明は、最も広義には、自然の繁殖期以外の時期に凍結保存幼生を、例えば養 殖場又はバイオアッセイなどの用途に、供することを意図する。従って、本発明 の第三の態様は、軟体動物門の幼生を養殖する方法にして、（ａ）　トロコフォ ラ期以降の軟体動物門の幼生を凍結保存し。

（ｂ）該幼生を融解する ことを含んでなる方法に関する。

凍結保存と融解の方法は、実用に足るだけの十分な数の幼生が生存するものであ れば、如何なる方法を用いてもよい。例えば、融解は２２℃から２８℃の温度（ 例えば約２５°Ｃ）で行なうことができる。これは空気中で行なってもよいし、 水（好適には塩類溶液）などの適当な液体媒質中で行なってもよい。その他の好 ましい特色並びに特徴は、本発明の第一態様に必要な修正を加えたものと同様で ある。

本発明は、最も広義には、凍結保存した軟体動物門の幼生をバイオアッセイに用 いることを意図する。従って、本発明の第四の態様によると、凍結保存したトロ コフォラ期以降の軟体動物門の幼生を検査すべき試料と接触させることを含んで なるバイオアッセイの実施方法が供せられる。

バイオアッセイとは、生物学的機能、生産力、発生又に基づいて、試料中の基質 の効果、又はバイオアッセイに使用した生物材料（幼生）を取囲む周囲の状態を 決定するために行なわれる検定を意味する。試料は、毒物もしくは汚染物質で幼 生に与えるその影響を検査したいものを含んでいてもよい。例えば、試料は、汚 染された疑いのある環境（例えば海水）から（場合によっては希釈して）採取し たものであってもよいし、試料の懸濁液であってもよい。試料は環境から採取し た試料であってもよいし、実験室の物質又は化学物質で幼生に与えるその影響を 検査したいものを含んでいてもよい。従って、「試料」には分析用又は試薬用化 学物質も含まれる。

「汚染物質」並びに「毒物」という用語は、ある種の生体（特に野生生物及び人 間）に対して有害、有毒、危険もしくは毒性を有する如何なる物質をも包含する か、ただし必ずしも汚染物質が軟体動物門の幼生に同じ影響を与えるとは限らな いことに留意すべきである。実際、試料は幼生に有害な物質を含んでいなくても よく、幼生に対して好い影響を与える物質を含んでいてもよいことに留意すべき である。

バイオアッセイ（試料と幼生との接触）は、好ましくは４８時間以上行なわない 。これは、餌を与えないと幼生が餓死する危険性があるからである。バイオアッ セイ用の好ましい幼生は、４８時間齢のもの、或いはプロディソコンチ■期（即 ち、後トロコフォラ（ｐｏｓｔ−ｔｒｏｃｂｏｐｈ＋ｕａ）期）にあるものであ る。通常、異常な貝殻の発生に基づいて、半致死濃度（ＬＣ５０）と半有効濃度 （ＥＣ５０）の両方を測定する。

幼生は、精子と適当な成体から（摘出などによって）得た卵を接触させることに よっても用意できるし、産卵よっても用意することができる。産卵の誘導は以下 の諸方法で行なうことができる。

（８）（成体の置かれた）水温を５℃から１０℃に急激に上昇させる。

ｆｂｌ成体に塩化カリウムを注入する。

又は （ｃ）精子又は過酸化水素に雌を接触させる。

バイオアッセイの間、幼生は好ましくは水性媒質（例えば塩類溶液）中に好適に は１５〜２５℃で保持する。水性媒質は好ましくは通気する。有利には、媒質は 頻繁に撹拌する。撹拌は、幼生の損傷を避けるために好ましくは穴開きプランジ ャーを用いて行なう。

幼生密度は好ましくは１ｍｌ当り　１００個未満であり、好適には１　ｍｌ当り １個以上である。好ましい範囲は１　ｍｌ当り１０〜５０個、任意には１　ｍｌ 当り１５〜３０個である。

本発明の第五の態様は、凍結保存したトロコフオラ期以降の軟体動物門の幼生、 及び該幼生と試料とを接触させる手段を含んでなるバイオアッセイキットに関す る。

従って、このキットは、幼生と試料を互いに接触させることのできる１個以上の 容器又はウェルを含んでいてもよい。このキットは、第一態様で説明した有機固 体氷核形成剤で少なくとも部分的に被覆した表面（容器又はウェルの内面など） をさらに含んでいてもよい。

この第五の態様のその他の好ましい特色並びに特徴は前述の態様に必要に応じて 修正を加えたものである。

次に本発明を添付図面を参照して説明する。

図２は、アサリ（Ｔａｐｅ＋　ｐｈｉｌｌｉｐｉｎａｒｕｍ　）の幼生の、凍結 対照試料と本発明に従って凍結保存したものについて、それらの成長を図示した ものである。

図３は、マガキ（Ｃ＋ａｓ＋ｏ＋Ｈｅａ　ｇｉｇｘ＋　）の幼生の、非凍結対照 試料と本発明に従って凍結保存したものについて、それらの成長を図示したもの である。

以下の例を参照した例示により本発明を説明するが、これらの例は例示のための ものであって本発明の範囲を限定するものではない。

比較例Ｉ Ｔａｐｅｓ　ｐｂｉｌｌｉｐｉｎｘ＋ｕｍ　（アサリ）の成熟体を温度ショック によって産卵させ、数匹の雄から得た精子を混合した。これを個々の雌の卵を受 精するのに使用して、それらを培養した。受精卵を、１ｍｌ当り５０個の密度で ２５℃の海水中に通気せずに維持した。海水は瞬卵に先立って０．４５ミクロン のフィルターを通したもので、ＵＶ滅菌しておいたものである。クロラムフェニ コールを（幼生の細菌汚染を抑制するための抗生物質として）　１　ｐｐｍ加え た。受精して２時間後に１０１１Ｍのグルタミン酸を海水に加えた。受精して２ ４時間後に、適当な藻類を飼料として幼生に加え、４８時間後に３５ミクロンの 篩上で回収した。

幼生は、凍結保護剤中でインキュベートする前に、清浄な海水（クロラムフェニ コールなし）で洗浄した。

集めた幼生を１５ミクロンの篩上に置き、できる限り海水を除去した。幼生を２ ５℃の凍結保護剤（ＣＰＡ）に入れた。

ＣＰＡ：０．４２５Ｍグルコース、０．４２５ｉｆトレハロース及び１５％Ｙ／ マのＤＭＳＯを含む蒸留水。

コレステロールで被覆した０、５ｍｌのプラスチック製ストロ−に幼生を入れ、 ＣＰＡ中でのインキュベートを開始して丁度１０分後に冷却を開始した。

冷却の手順は以下の通りであった： 毎分１５℃の速度で２０℃から一２０℃まで冷却ニー２０℃に６分間維持。

毎分３℃の速度で一２０℃から一３５℃まで冷却。

−３５℃にして１分以内に液体窒素に入れる。

融解は、最後の氷層が消失するまで、ストロ−を７５〜８０℃の水に漬けること によって行なった。ストロ−を直ぐに取り出して水気を拭き取った。ストロ−の 端を切り取って、内容物を２０℃の海水０．５ｍｌ中に投入した。

１分後にさらに１ｍｌの海水を加え、その１〜２分後にさらに２ｍｌを加えた。

２分経過後に、試料を失うことなく容積を最低限に減少させるように上清を除去 し、次いで５ｍｌの海水を加えた。沈降後に上清を再び除去し、最終的に使用す るための海水中に入れた。

対照となる幼生は、凍結保存に付さないことを除いては上述した通りに得た。幼 生の大きさは成長期間中に、融解した時点又は（対照群の場合）対照でないと仮 定した場合の凍結保存した時点から起算して、４度（０日、７日、２６日及び３ ５日）測定した。結果を図２に示す。凍結保存した幼生の融解して３５日後の生 存率は非凍結保存対照群の８４％であった。

比較例２ の幼生を用いたことを除いては、比較例１の手順を繰り返した。対照でない幼生 については、受精して２４時間後に上記冷却手順を開始し、４回実験を繰り返し た。４回の（凍結保存）実験及び対照群の各々の生存率を融解してから（対照群 の受精２４時間後から）１０日目に測定した。その結果を図３に示す。

汽１ １９９０年春に北馬の９か所で採取した堆積物の水簸物（ｅｌｕ目目＋ｅｓ）を 使用して、２種類の幼生についてノくイオアッセイを行なった。Ｍ　Ａ　Ｆ　Ｆ 　（ＭｉｎｉｓｌＢ　ｏｆＡｇ＋１ｃｕｌｌｕ＋ｅ、　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ、ａ ｎｄ　Ｆｏｏｄ　；英国農漁食糧省）から提供された清浄な水を使用して対照実 験を行なった。

使用した幼生は、比較例１に記載の通り０．５ｍｌのストロ−中で凍結保存して 融解した。

各バイオアッセイにおいて、１ｍｌ当り１０個の幼生の濃度の試料４０ｍ１を使 用し、２０℃でインキュベートした。暴露後にすべての試料をホルマリンで固定 して評価した。

生存率（％） 使用幼生 Ｃ＋ｘｓｓｏｓｌ＋ｅａ　ｇｉｇａｓ　Ｔａｐｅｓ　ｐｂｉｌｌｉｐｉｎａ＋ｕ ｍ２４時間　４８時間 採取場所 対照　９８９８ Ｆ工ＧＵＲＥ　Ｉ Ａ　ＰＩ　ＣＤ 図２ 図３ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．トロコフォラ期以降の軟体動物門の幼生を凍結保存することを含んでなる方 法。
2. ２．請求項１記載の方法において、幼生が双殻類Ｂｉｖａｌｖｉａ綱に属するこ とを特徴とする方法。
3. ３．請求項１記載の方法において、幼生がイガイ属Ｍｙｔｉｌｕｓ、イタボガキ 属Ｏｓｔｒｅａ、リュウキュウアサリ属Ｔａｐｅｓ又はマガキ属Ｃｒａｓｓｏｓ ｔｒｅａに属することを特徴とする方法。
4. ４．請求項１記載の方法において、幼生が少なくとも受精後２４時間のものであ ることを特徴とする方法。
5. ５．請求項１記載の方法において、幼生を水性媒質中で凍結保存することを特徴 とする方法。
6. ６．請求項５記載の方法において、前記水性媒質がコレステロールと接触してい ることを特徴とする方法。
7. ７．請求項６記載の方法において、コレステロールが指示体上に被覆されている ことを特徴とする方法。
8. ８．請求項７記載の方法において、コレステロールがアンプル、ストロー、バッ グ又はチューブ上に被覆されていることを特徴とする方法。
9. ９．請求項１記載の方法において、以下の工程：次の（ａ１）又は（ａ２）のい ずれかから始める；（ａ１）幼生を毎分１２〜１７℃の速度で−５〜−２５℃の 温度まで冷却し； （ａ２）幼生を毎分４０〜５０℃の速度で−４０〜−５０℃の温度まで冷却した 後、幼生を毎分５〜１５℃の速度で−１５〜−２５℃の温度まで温め； （ｂ）幼生を上記温度に５〜７分間維持し；（ｃ）幼生を毎分１２〜１７℃の速 度で−３０〜−４０℃の温度までさらに冷却し； （ｄ）任意には、幼生を上記温度に２分以内維持し；かつ （ｅ）任意には、幼生を液体窒素に入れるを含んでなることを特徴とする方法。
10. １０．請求項１記載の方法において、以下の工程：次の（ａ１）又は（ａ２）の いずれかから始める；（ａ１）幼生を毎分約１５℃の速度で約−２０℃の温度ま で冷却し； （ａ２）幼生を毎分約４５℃の速度で−４４〜−４６℃の温度まで冷却した後、 幼生を毎分約１０℃の速度で約−２０℃の温度まで温め； （ｂ）幼生を約−２０℃に約６分間維持し；（ｃ）幼生を約−３５℃の温度まで さらに冷却し；（ｄ）幼生を約−３５℃に１分以内維持し；かつ（ｅ）幼生を液 体窒素に入れる を含んでなることを特徴とする方法。
11. １１．凍結保存した軟体動物門のプロディソコンチ幼生にして、トロコフォラ期 以降の段階にある幼生。
12. １２．請求項１１記載の幼生において、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項 記載の方法で凍結保存したことを特徴とする幼生。
13. １３．軟体動物門の幼生を養殖する方法にして、（ａ）トロコフォラ期以降の軟 体動物門の幼生を凍結保存し； （ｂ）該幼生を融解する ことを含んでなる方法。
14. １４．請求項１３記載の方法において、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項 記載の方法を使用することを特徴とする方法。
15. １５．バイオアッセイの実施方法にして、該方法が、凍結保存したトロコフォラ 期以降の軟体動物門の幼生を検定すべき試料と接触させることを含んでなること を特徴とする方法。
16. １６．請求項１５記載の方法において、幼生と試料を４８時間以上は接触させな いことを特徴とする方法。
17. １７．請求項１５記載の方法において、幼生がプロディソコンチ期１以降の段階 にあることを特徴とする方法。
18. １８．請求項１５記載の方法において、幼生を１５〜２５℃の温度の塩類溶液中 に保持することを特徴とする方法。
19. １９．請求項１８記載の方法において、塩類溶液を穴開きプランジャーを用いて 頻繁に撹拌することを特徴とする方法。
20. ２０．請求項１８記載の方法において、幼生の密度が塩類溶液１ｍｌ当り１５〜 ３０個であることを特徴とする方法。
21. ２１．凍結保存したトロコフォラ期以降の軟体動物門の幼生及び該幼生と試料と を接触させる手段を含んでなるバイオアッセイキット。