JPH0549060B2 - - Google Patents
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- JPH0549060B2 JPH0549060B2 JP62037535A JP3753587A JPH0549060B2 JP H0549060 B2 JPH0549060 B2 JP H0549060B2 JP 62037535 A JP62037535 A JP 62037535A JP 3753587 A JP3753587 A JP 3753587A JP H0549060 B2 JPH0549060 B2 JP H0549060B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は肝機能検査方法に関し、詳しくは血中
の胆汁アルコールを測定することを特徴とする肝
機能検査方法に関する。 〔従来の技術及び問題点〕 肝機能検査方法としては従来、血中トランスア
ミナーゼ（GOT、GPT等）、コリンエステラー
ゼ、血中胆汁酸測定等、多種の検査方法がある
が、未だ十分な測定法は見出されていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は鋭意研究の結果、肝疾患の有無およ
びその程度をみるのに有用な方法を見出し本発明
に至つた。 即ち、本発明は、血中に存在する、下記(1)〜(6)
から選ばれる１種又は２種以上の胆汁アルコール
を測定することを特徴とする肝機能検査方法に係
わるものである。 (1) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25−ペントール（血中胆汁アルコールの主
成分） (2) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25，26−ヘキソール (3) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，26−ペ
ントール (4) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25−ペ
ントール (5) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，25，26−ペ
ントール (6) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25，26
−ヘキソール 胆汁アルコールとは、肝臓中でコレステロール
が胆汁酸まで代謝される過程に生じた中間体で、
ステロイドの一種である。 例えば、上記(4)の化合物を構造式で示せば以下
の如くである。 (4) これらの胆汁アルコールは体内に存在している
と考えられるが、本発明者はヒト血中に上記の胆
汁アルコールが存在することを初めて見出し、し
かも肝炎、肝硬変などの肝障害患者の血中には、
驚くべきことに正常人と比較して多量の各種の胆
汁アルコールが存在することを初めて見出し、本
発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は、血中の胆汁アルコールを測定
して肝機能を検査するものである。 従つて、本発明の目的は、新規な肝機能検査方
法を提供するにある。 血中の胆汁アルコールを測定する方法は種々考
えられ、いかなる方法でも良いが、例えばヒトの
血清から各種のクロマトグラフイーを適宜使用し
て、胆汁アルコールを抽出し、次いでこれを例え
ばガスクロマトグラフイー・マスフラグメントグ
ラフイーなどを用いて定量する方法が代表的な方
法である。 血中の27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントールの測定例を以下に実施
例として示す。 〔実施例〕 空腹時（早朝）採血した5.0mlの血清を0.1規定
の水酸化ナトリウム水溶液で５〜６倍に希釈し、
64℃、30分間加熱撹拌する。その後上記混合液を
オクタデシルシラン（ODS）が充填されている
逆相系シリカゲルカートリツジ（SEP−PAKC18
カートリツジ、Waters社製）に流速1.5〜2.0ml／
minで通導し、胆汁アルコールを粗抽出する。次
にこのカートリツジを10mlの蒸留水で洗浄した
後、90％エタノール3.0mlを流速2.0ml／minにて
通導し胆汁アルコールを溶出させる。 90％エタノールに溶解した粗抽出胆汁アルコー
ルをPHP−LH−20イオン交換ゲル（島津製作所
製、京都）を用いたカラム（６mm×20mm、ゲル乾
燥重量として100mg相当）にかけ、90％エタノー
ル8.0mlでカラムを洗浄後、0.2モルギ酸／90％エ
タノール溶液6.0mlを0.5ml／minの速度にて通導
し、グルクロン酸抱合型胆汁アルコールを分画、
分取する。 次に減圧下で溶媒を留去したグルクロン酸抱合
型胆汁アルコールを0.1モル酢酸バツフアー（PH
5.0）10.0ml、5000単位のβ−グルクロニダーゼ
（EC3.2.32.、Sigma社製、Type Ｈ−１）にて37
℃、48時間インクベートして加水分解を行う。 ここで内部標準として〔２，２，４，４，D4〕
27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，
25−ペントールを100μｇ添加する。 尚、この内部標準物質は、血中、尿中に存在す
る天然型の27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントールの重水素誘導体であ
り、次に示す構造式を有する。 構造式 Ｄ：重水素 次に、加水分解反応を終了した液を0.1モルリ
ン酸バツフアー（PH7.4）にて２倍に希釈し、
SEP−PAK C18カートリツジに流速1.5〜2.0ml／
minで通導させ、蒸留水10mlで洗浄後3.0mlの90
％エタノールで脱抱合型胆汁アルコールを溶出せ
しめる。この溶液を再びPHP−LH−20イオン交
換ゲル（上述した条件と同じ）を用いたカラムに
通過させ（0.5ml／minの速度）、溶出した90％エ
タノール分画を減圧下に溶媒留去する。 これをトリメチルシリル（TMS）誘導体に導
いた後、ガスクロマトグラフイー・マススペクト
ロメトリーを用いてマス・フラグメントグラフイ
ー（mass fragmentgraphy）法にて血中胆汁ア
ルコールを定性・定量する。 本実施例に用いたガスクロマトグラフイー・マ
ススペクトロメトリーは次の条件で行つた。 使用機器：島津製作所製QP−1000型ガスクロマ
トグラフ・マススペクトロメーター 使用カラム：0.35mm×25ｍ、OV−１ガラスキヤ
ピラリーカラム（Hewlett Packard社製） カラム温度：285℃ イオン源温度：250℃ イオン化エネルギー：70eV トラツプ電流：60μA 尚、定量は内部標準として加えた〔２，２，
４，４，D4〕27−ノル−5β−コレスタン−3α，
7α，12α，24，25−ペントールの分子イオンピー
クｍ／z257、325、415に対応する血中27−ノル−
5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25−ペント
ールの与える分子イオンピークｍ／z253、321、
411の面積比を求めることにより行う。 以上の測定方法をまとめて以下に示す。 血 清 ５ml ↓＋0.1N NaOH 25ml 加熱・撹拌（64℃、30分間） ↓ SEP−PAK C18カートリツジにて抽出 ↓ PHP−LH−20イオン交換クロマトグラフイー ↓ β−グルクロニダーゼにて加水分解（37℃、
48hrs） ↓ SEP−PAK C18カートリツジにて抽出 ↓ PHP−LH−20イオン交換クロマトグラフイー ↓ TMS 誘導体 ↓ GC・MS（Mass fragmentgraphy法）にて定
性・定量 正常人７名の血中胆汁アルコールの量を測定し
たところ表１に示すような結果が得られた。
の胆汁アルコールを測定することを特徴とする肝
機能検査方法に関する。 〔従来の技術及び問題点〕 肝機能検査方法としては従来、血中トランスア
ミナーゼ（GOT、GPT等）、コリンエステラー
ゼ、血中胆汁酸測定等、多種の検査方法がある
が、未だ十分な測定法は見出されていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者は鋭意研究の結果、肝疾患の有無およ
びその程度をみるのに有用な方法を見出し本発明
に至つた。 即ち、本発明は、血中に存在する、下記(1)〜(6)
から選ばれる１種又は２種以上の胆汁アルコール
を測定することを特徴とする肝機能検査方法に係
わるものである。 (1) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25−ペントール（血中胆汁アルコールの主
成分） (2) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25，26−ヘキソール (3) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，26−ペ
ントール (4) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25−ペ
ントール (5) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，25，26−ペ
ントール (6) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25，26
−ヘキソール 胆汁アルコールとは、肝臓中でコレステロール
が胆汁酸まで代謝される過程に生じた中間体で、
ステロイドの一種である。 例えば、上記(4)の化合物を構造式で示せば以下
の如くである。 (4) これらの胆汁アルコールは体内に存在している
と考えられるが、本発明者はヒト血中に上記の胆
汁アルコールが存在することを初めて見出し、し
かも肝炎、肝硬変などの肝障害患者の血中には、
驚くべきことに正常人と比較して多量の各種の胆
汁アルコールが存在することを初めて見出し、本
発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は、血中の胆汁アルコールを測定
して肝機能を検査するものである。 従つて、本発明の目的は、新規な肝機能検査方
法を提供するにある。 血中の胆汁アルコールを測定する方法は種々考
えられ、いかなる方法でも良いが、例えばヒトの
血清から各種のクロマトグラフイーを適宜使用し
て、胆汁アルコールを抽出し、次いでこれを例え
ばガスクロマトグラフイー・マスフラグメントグ
ラフイーなどを用いて定量する方法が代表的な方
法である。 血中の27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントールの測定例を以下に実施
例として示す。 〔実施例〕 空腹時（早朝）採血した5.0mlの血清を0.1規定
の水酸化ナトリウム水溶液で５〜６倍に希釈し、
64℃、30分間加熱撹拌する。その後上記混合液を
オクタデシルシラン（ODS）が充填されている
逆相系シリカゲルカートリツジ（SEP−PAKC18
カートリツジ、Waters社製）に流速1.5〜2.0ml／
minで通導し、胆汁アルコールを粗抽出する。次
にこのカートリツジを10mlの蒸留水で洗浄した
後、90％エタノール3.0mlを流速2.0ml／minにて
通導し胆汁アルコールを溶出させる。 90％エタノールに溶解した粗抽出胆汁アルコー
ルをPHP−LH−20イオン交換ゲル（島津製作所
製、京都）を用いたカラム（６mm×20mm、ゲル乾
燥重量として100mg相当）にかけ、90％エタノー
ル8.0mlでカラムを洗浄後、0.2モルギ酸／90％エ
タノール溶液6.0mlを0.5ml／minの速度にて通導
し、グルクロン酸抱合型胆汁アルコールを分画、
分取する。 次に減圧下で溶媒を留去したグルクロン酸抱合
型胆汁アルコールを0.1モル酢酸バツフアー（PH
5.0）10.0ml、5000単位のβ−グルクロニダーゼ
（EC3.2.32.、Sigma社製、Type Ｈ−１）にて37
℃、48時間インクベートして加水分解を行う。 ここで内部標準として〔２，２，４，４，D4〕
27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，
25−ペントールを100μｇ添加する。 尚、この内部標準物質は、血中、尿中に存在す
る天然型の27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントールの重水素誘導体であ
り、次に示す構造式を有する。 構造式 Ｄ：重水素 次に、加水分解反応を終了した液を0.1モルリ
ン酸バツフアー（PH7.4）にて２倍に希釈し、
SEP−PAK C18カートリツジに流速1.5〜2.0ml／
minで通導させ、蒸留水10mlで洗浄後3.0mlの90
％エタノールで脱抱合型胆汁アルコールを溶出せ
しめる。この溶液を再びPHP−LH−20イオン交
換ゲル（上述した条件と同じ）を用いたカラムに
通過させ（0.5ml／minの速度）、溶出した90％エ
タノール分画を減圧下に溶媒留去する。 これをトリメチルシリル（TMS）誘導体に導
いた後、ガスクロマトグラフイー・マススペクト
ロメトリーを用いてマス・フラグメントグラフイ
ー（mass fragmentgraphy）法にて血中胆汁ア
ルコールを定性・定量する。 本実施例に用いたガスクロマトグラフイー・マ
ススペクトロメトリーは次の条件で行つた。 使用機器：島津製作所製QP−1000型ガスクロマ
トグラフ・マススペクトロメーター 使用カラム：0.35mm×25ｍ、OV−１ガラスキヤ
ピラリーカラム（Hewlett Packard社製） カラム温度：285℃ イオン源温度：250℃ イオン化エネルギー：70eV トラツプ電流：60μA 尚、定量は内部標準として加えた〔２，２，
４，４，D4〕27−ノル−5β−コレスタン−3α，
7α，12α，24，25−ペントールの分子イオンピー
クｍ／z257、325、415に対応する血中27−ノル−
5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25−ペント
ールの与える分子イオンピークｍ／z253、321、
411の面積比を求めることにより行う。 以上の測定方法をまとめて以下に示す。 血 清 ５ml ↓＋0.1N NaOH 25ml 加熱・撹拌（64℃、30分間） ↓ SEP−PAK C18カートリツジにて抽出 ↓ PHP−LH−20イオン交換クロマトグラフイー ↓ β−グルクロニダーゼにて加水分解（37℃、
48hrs） ↓ SEP−PAK C18カートリツジにて抽出 ↓ PHP−LH−20イオン交換クロマトグラフイー ↓ TMS 誘導体 ↓ GC・MS（Mass fragmentgraphy法）にて定
性・定量 正常人７名の血中胆汁アルコールの量を測定し
たところ表１に示すような結果が得られた。
【表】
次に肝疾患患者（肝硬変症）の血中胆汁アルコ
ール（27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントール）量を測定したところ
第１図に示すような結果が得られた。尚、図中ｎ
は症例数を示す。 第１図から明らかな如く、肝硬変症患者では正
常人に比べて血中胆汁アルコール量は著しく増加
している。また肝硬変症患者でも代償性肝硬変症
患者より非代償性肝硬変症患者、更に肝性昏睡を
伴うようになるにつれ、即ち悪化につれて胆汁ア
ルコール量が次第に増加していくことがわかる。 又、肝障害患者（慢性肝炎、肝硬変症患者、
各々４名＋23名）で各種肝機能検査と血中胆汁ア
ルコール量（27−ノル−5β−コレスタン−3α，
7α，12α，24，25−ペントール）との相関を調べ
た。その相関係数(r)と危険率(p)を以下に示す。 血中総ビリルビンとの関係 相関係数(r)…ｒ＝0.769 危険率(p)…ｐ＜0.01 ICG（15分停滞率）との関係 相関係数(r)…ｒ＝0.713 危険率(p)…ｐ＜0.01 血中コリンエステラーゼとの関係 相関係数(r)…ｒ＝−0.546 危険率(p)…ｐ＜0.01 これらの結果（血中総ビリルビン値、ICG（15
分停滞率）、血中コリンエステラーゼ値）は、い
ずれも血中胆汁アルコール量が肝機能の悪化に伴
い、既存のパラメータと同様増減を示しており、
肝機能のマーカーとして有用であることを示す。 本発明においては、測定可能な胆汁アルコール
としては、いかなるものでも良いが、代表的なも
のとしては前述の６種類の胆汁アルコールを挙げ
ることができる。 本発明は、血中の胆汁アルコールを測定するこ
とにより、肝機能を検査できるものであり、その
操作は簡便であり、しかも精密な診断をすること
ができるもので、本発明の価値は極めて高い。
ール（27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントール）量を測定したところ
第１図に示すような結果が得られた。尚、図中ｎ
は症例数を示す。 第１図から明らかな如く、肝硬変症患者では正
常人に比べて血中胆汁アルコール量は著しく増加
している。また肝硬変症患者でも代償性肝硬変症
患者より非代償性肝硬変症患者、更に肝性昏睡を
伴うようになるにつれ、即ち悪化につれて胆汁ア
ルコール量が次第に増加していくことがわかる。 又、肝障害患者（慢性肝炎、肝硬変症患者、
各々４名＋23名）で各種肝機能検査と血中胆汁ア
ルコール量（27−ノル−5β−コレスタン−3α，
7α，12α，24，25−ペントール）との相関を調べ
た。その相関係数(r)と危険率(p)を以下に示す。 血中総ビリルビンとの関係 相関係数(r)…ｒ＝0.769 危険率(p)…ｐ＜0.01 ICG（15分停滞率）との関係 相関係数(r)…ｒ＝0.713 危険率(p)…ｐ＜0.01 血中コリンエステラーゼとの関係 相関係数(r)…ｒ＝−0.546 危険率(p)…ｐ＜0.01 これらの結果（血中総ビリルビン値、ICG（15
分停滞率）、血中コリンエステラーゼ値）は、い
ずれも血中胆汁アルコール量が肝機能の悪化に伴
い、既存のパラメータと同様増減を示しており、
肝機能のマーカーとして有用であることを示す。 本発明においては、測定可能な胆汁アルコール
としては、いかなるものでも良いが、代表的なも
のとしては前述の６種類の胆汁アルコールを挙げ
ることができる。 本発明は、血中の胆汁アルコールを測定するこ
とにより、肝機能を検査できるものであり、その
操作は簡便であり、しかも精密な診断をすること
ができるもので、本発明の価値は極めて高い。
第１図は肝硬変症患者及び正常人の血中胆汁ア
ルコール（27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントール）量を示すグラフであ
る。
ルコール（27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，
12α，24，25−ペントール）量を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 血中に存在する、下記(1)〜(6)から選ばれる１
種又は２種以上の胆汁アルコールを測定すること
を特徴とする肝機能検査方法。 (1) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25−ペントール (2) 27−ノル−5β−コレスタン−3α，7α，12α，
24，25，26−ヘキソール (3) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，26−ペ
ントール (4) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25−ペ
ントール (5) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，25，26−ペ
ントール (6) 5β−コレスタン−3α，7α，12α，24，25，26
−ヘキソール。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3753587A JPS63205565A (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 肝機能検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3753587A JPS63205565A (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 肝機能検査方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63205565A JPS63205565A (ja) | 1988-08-25 |
| JPH0549060B2 true JPH0549060B2 (ja) | 1993-07-23 |
Family
ID=12500217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3753587A Granted JPS63205565A (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 肝機能検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63205565A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58170500A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-07 | Japan Spectroscopic Co | ３βの水酸基を有する胆汁酸の分析方法 |
| JPS5940254A (ja) * | 1982-08-31 | 1984-03-05 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析方法 |
| JPS5992348A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析方法 |
| JPS5992349A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析法 |
-
1987
- 1987-02-20 JP JP3753587A patent/JPS63205565A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58170500A (ja) * | 1982-03-30 | 1983-10-07 | Japan Spectroscopic Co | ３βの水酸基を有する胆汁酸の分析方法 |
| JPS5940254A (ja) * | 1982-08-31 | 1984-03-05 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析方法 |
| JPS5992348A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析方法 |
| JPS5992349A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-05-28 | Kureha Chem Ind Co Ltd | 生体試料の分析法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63205565A (ja) | 1988-08-25 |
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