JPH0541938B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、疎水性の膜を隔てて水溶液と疎水性
有機溶媒とを接触させ、膜を介して疎水性有機溶
媒中に抽出された水溶液中の測定対象物質を、疎
水性有機溶媒を移動させながら連続的に検出器で
検出測定する装置に関するものである。

近年、バイオテクノロジーの急速な進展によ
り、微生物の生体反応を利用してＬ−トリプトフ
アン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパなどの有用物質
を生産する方法が脚光を浴びてきている。しかし
ながら、これらの物質を生産するための基質、即
ち、原料であるインドール、アントラニル酸、フ
エノールなどは高濃度で反応液中に添加すると反
応を触媒する酵素に対して阻害を示すのが通常で
あり、これを回避するため反応液中のこれらの基
質を常時低濃度に保ちながら断続的または連続的
にこれらの原料を添加する反応方法がとられてい
る。この場合は反応液中の微量の基質濃度を連続
的に測定することが必要である。

従来、インドール、フエノール、アントラニル
酸などの物質の定量方法としては、サンプリング
をしたのちガス・クロマトグラフイーで定量する
方法またはサンプリングをしたのち有機溶媒で抽
出して紫外部吸収を測定する方法であるが、これ
らの方法は連続的測定方法ではないため分析に前
処理などを要し、定量するのに多くの時間を要す
る欠点を有している。また最近、フエノールの定
量などに関しては、固定化酵素または固定化菌体
センサーを用いて連続的に測定する方法も知られ
ているが、反応液中の夾雑物による酵素の阻害な
どの問題があり、必ずしも満足する測定方法には
至つていない。

本発明者らは、酵素反応に阻害を与えるインド
ール、フエノール、アントラニル酸などの連続定
量法について種々検討した結果、微細な孔隙を有
する疎水性の膜の孔隙を疎水性の有機溶媒で満し
た場合は、可成りの圧力で押してやらない限り水
は容易には膜中に浸透したいという事実を見出
し、この原理に基ずいて疎水性膜を用いたセンサ
ーを考案し、このセンサー内部の有機溶媒を例え
ばポンプ等で循環し、その循環経路に紫外吸光光
度計などの検出器を設置することによつてこれら
の物質を連続的に測定できることを見出し、本発
明に到達した。

即ち、本発明は、生体反応を利用して有用物質
を生産するに際し、反応液中の基質濃度を連続的
に測定する方法において、疎水性の膜を隔てて水
溶液と疎水性の有機溶媒とを接触させ水溶液中の
測定物質を有機溶媒中にセンサーを用いて抽出
し、該抽出溶媒を移動させ乍ら検出器に導き、連
続的かつ定量的に検出することを特徴とする微量
物質の連続測定方法である。

而して本発明の微量物質の連続測定方法におい
ては、検出器から排出された抽出有機溶媒を吸着
媒体、例えば活性炭などの吸着媒体を充填した吸
着塔を通過させて測定物質を吸着除去し、該有機
溶倍をセンサーに循環して再使用する装置、或は
検出器として紫外吸光光度計を採用する等の好ま
しい態様も含まれる。

以下本発明に使用される装置を図面によつて説
明する。

第１図において１はセンサー、２は検出器であ
り、３は好ましい態様として用いられる吸着塔で
あり、４はセンサーによつて測定物質を抽出した
抽出有機溶媒を移動させる為のポンプであり、５
は測定物質を吸着除去して有機溶媒をセンサーに
循環するためのポンプである。

疎水性の膜を隔てて水溶液と疎水性の有機溶媒
とを接触させ水溶液中の測定物質を有機溶媒中に
抽出する為のセンサーは、例えば第２図に示す様
な構造を採ることができる。図において６は
SUS３０４などを材質とするセンサー外筒、７
は疎水性の膜であるメンプランフイルターの押え
用の例えばネオプレンゴムを材質とするパツキ
ン、８は後述するメンブランフイルター、９は例
えば厚さ３mmで幅２mmの窓穴付のテフロン製丸
板、１０はメンブラインフイルター８をとめるネ
オプレンゴムなどを材質とするＯリング、１１は
SUS３１６などを材質とするセンサー内筒、１
２は例えば３mmφを有する抽出有機溶媒の出口
管、１３は例えば２mmφを有する有機溶媒入口
管、１４はセンサー外筒と内筒とをシールするた
めのネオオプレンゴムなどを材質とするパツキ
ン、１５はSUS３１６などを材質とするセンサ
ー内筒の押しガイドである。

第３図は上記したセンサーの各部材を、第２図
の下部部材を概ね右側に上部部材を左側になる様
に配列したものである。図において９のテフロン
製丸板は中央部に例えば幅２mmのスリツトが設け
られており、１３の有機溶媒入口管からの有機溶
媒はこのスリツト部分を通過して１２の抽出有機
溶媒出口管へと誘導され、この間に疎水性の膜で
あるメンブランフイルターを介して水溶液中の測
定物質が有機溶媒に抽出され抽出有機溶媒とな
る。

本発明において使用される疎水性の膜であるメ
ンブランフイルターとしては、例えばポリプロピ
ン、四フツ化エチレンが挙げられる。而してこれ
らのメンブランフイルターは通常0.1〜0.05mm程
度の膜厚を有するもので、水溶液相と有機溶媒相
とがメンブランフイルターを界して接触する面積
もこの材質、膜厚および測定物質の性質などとの
兼ね合いで変更することができる。

この様なメンブランフイルターとしては、例え
ばポリプラスチツク(株)製の商品名ジユラガード、
東洋濾紙(株)製の商品名ポリフロンフイルターPF
−１およびPT−20、ゲルマン・サイエンス・ジ
ヤパン(株)製の商品名TF−200などが使用可能であ
る。

本発明の方法により微量物質を測定する際に使
用する疎水性を有機溶媒としてはメチレンクロラ
イド、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ノル
マルパラフイン類などを使用することができる。

本発明の方法において使用される検出器として
は、例えば紫外吸光光度計が挙げられるが、赤外
吸光光度計の様なものでも差支えがなく、水溶液
中に溶存している測定物質および使用する有機溶
媒の性質などによつて適宜変えることができる。

本発明の好ましい態様としては、抽出有機溶媒
中に溶存する測定物質を測定終了後吸着媒体に吸
着せしめて測定物質および場合により水溶液より
抽出させたその他の不純物を同時に吸着除去し、
有機溶媒のみをセンサーに循環使用すればより経
済的である。而してこの際、使用される吸着媒体
としては活性炭がより一般的であり、例えば測定
物質如何によつてはイオン交換体なども使用でき
る。

猶、有機溶媒入口管１３と抽出有機溶媒出口管
１２の管径は出口管１２の管径を入口管１３の管
径より太くすることによつてメンブランフイルタ
ー８の膨出を防止することができる。抽出有機溶
媒の移動は測定物質の抽出速度、検出器の検出精
度等によつて適宜条件を設定することができる。

本発明の微量物質の連続的測定方法は、疎水性
の膜を有効に利用して水溶液中の微量の測定物質
を連続的に検出測定し得るので、微生物の生体反
応を利用する際の微量の基質濃度変化をとらえる
ことが可能であり、バイオテクノロジーの発展に
寄与することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。

実施例 １ 水溶液中の微量インドールを測定する目的で、
疎水性膜として東洋濾紙(株)ポリフロンフイルター
PT−20を用いてセンサーを製作し、抽出用有機
溶媒としてはノルマルデカンを使用して日本分光
(株)製の紫外吸光光度計により検出波長280mm、ポ
ンプ流量2.2ml／minで水溶液中のインドール濃
度をパルスで変化させることによりその濃度を連
続的に測定した場合の検量線を求め、その結果を
第４図に示した。なおこれらの結果からこの測定
方法によるインドールの検出濃度範囲は25〜
300ppmの範囲であり、応答時間は150秒であるこ
とが認められた。

実施例 ２ インドールとDL−セリを反応主原料として、
トリプトフアン・シンセターゼ生産菌を用いてＬ
−トリプトフアン合成反応を30反応器で実施し
た。この場合、トリプトフアン・シンセターゼ生
産菌はインドールの濃度が高くなると反応阻害を
受けるので反応中、反応液中のインドール濃度を
200ppm以下に保つ必要がある。このため、実施
例１記載のインドールセンサーを用いて反応液中
のインドール濃度を連続的に測定し、インドール
濃度が200ppm以下になつたらインドールフイー
ダーを作動させてインドールをフイードし、
200ppm以上でインドールフイーダーをストツプ
させるという方法で、表１の組成の反応液を用い
てトリプトフアン合成反応を30℃、PH8.5で24時
間実施した。抽出用有機溶媒のノルマルデカンを
和光純薬工業(株)のクロマトグラム用活性炭充填塔
を通し、流出液中にインドールが検出されないこ
とを確認し充填塔からの流出ノルマルデカンを循
環再使用した。この結果、反応はインドールの阻
害なく順調に進行し、最終的に128ｇ／のトリ
プトフアンを合成できた。対インドールのモル収
率は98.5％、対セリンのモル収率は90％であつ
た。

表１ 反応液組成 Kg DL−セリン 1.095 ピリドキサールリン酸 0.0015 硫 安 0.45 シンセターゼ生産菌体（含水率85％） 1.15 ラセマーゼ生産菌体（含水率75％） 0.6 水 11.7 実施例 ３ 水溶液中の微量のフエノールを測定する目的
で、有機溶媒としてクロロホルムを用いて紫外吸
光光度計の検出波長276nｍ、ポンプ流量５ml／
minで測定した他は実施例１と同様の操作を施し
て被検液中のフエノールの濃度の検量線を求め、
その結果を第５図に示した。なお、これらの結果
からこの測定方法のフエノール検出濃度範囲は５
〜50ppmであり、応答時間は180秒であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用される微量物質の連続的
測定装置の好適な配置図の１例であり、第２図お
よび第３図は本発明の装置に使用されるセンサー
の構造の１例であり、第４図および第５図は本発
明の方法を用いて測定した場合の紫外線検出器出
力信号と被検液中の測定物質濃度との関係を示し
たものである。 図において、１……センサー、２……検出器、
３……吸着塔、４及び５……ポンプ、６……セン
サー外筒、７……パツキン、８……メンブランフ
イルター、９……テフロン製丸板、１０……Ｏリ
ング、１１……センサー内筒、１２……抽出有機
溶媒出口管、１３……有機溶媒出口管、１４……
Ｏリング、１５……センサー内筒。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素反応における反応液中の基質濃度を連続
   的に測定する方法において、疎水性の膜を隔てて
   反応液と疎水性の有機溶媒とを接触させて反応液
   中の基質を有機溶媒中に抽出し、該抽出溶媒を移
   動させ乍ら検出器に導き、連続的かつ定量的に検
   出することを特徴とする微量な基質の連続測定方
   法。 ２ 検出器から排出された抽出有機溶媒を吸着媒
   体を充填した吸着塔を通過させて測定物質を吸着
   除去し、該有機溶媒を測定物質の抽出用に循環す
   るようにした特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 検出器が紫外吸光光度計である特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の方法。 ４ 吸着媒体が活性炭である特許請求の範囲第２
   項記載の方法。