JPH05336997A - ヒドロキシラジカルの測定方法 - Google Patents
ヒドロキシラジカルの測定方法Info
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- JPH05336997A JPH05336997A JP4147797A JP14779792A JPH05336997A JP H05336997 A JPH05336997 A JP H05336997A JP 4147797 A JP4147797 A JP 4147797A JP 14779792 A JP14779792 A JP 14779792A JP H05336997 A JPH05336997 A JP H05336997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 特異性が高く、かつ容易で高精度なヒドロキ
シラジカルの測定方法を提供する。 【構成】 活性酸素を含む検体にスーパーオキシドジス
ムターゼとカタラーゼとを加えて前処理を行う。これに
よりスーパーオキシドアニオンや過酸化水素等を除去し
た後に、ｐ−ニトロソジメチルアニリン法にてヒドロキ
シラジカル濃度を測定する
シラジカルの測定方法を提供する。 【構成】 活性酸素を含む検体にスーパーオキシドジス
ムターゼとカタラーゼとを加えて前処理を行う。これに
よりスーパーオキシドアニオンや過酸化水素等を除去し
た後に、ｐ−ニトロソジメチルアニリン法にてヒドロキ
シラジカル濃度を測定する
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、活性酸素の測定法に関
し、特にヒドロキシラジカルの測定方法に関する。
し、特にヒドロキシラジカルの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、特に臨床医学分野で活性酸素と疾
患に関する報文が雑誌を賑わしている。しかし、活性酸
素は一般に反応性が高いため、生体内で仮に発生したと
しても、それをすばやく捕捉して測定まで持っていける
方法がほとんどないのが現状である。
患に関する報文が雑誌を賑わしている。しかし、活性酸
素は一般に反応性が高いため、生体内で仮に発生したと
しても、それをすばやく捕捉して測定まで持っていける
方法がほとんどないのが現状である。
【０００３】従って、活性酸素が測定可能なのは主とし
て閉鎖系である試験管内で進行する反応であるといって
も過言ではなく、生体内の活性酸素の測定には困難が予
想される1)。
て閉鎖系である試験管内で進行する反応であるといって
も過言ではなく、生体内の活性酸素の測定には困難が予
想される1)。
【０００４】一般に、活性酸素としては以下のものが知
られている。
られている。
【０００５】（ａ）三重項状態の酸素が１電子還元を受
けて生じるスーパーオキシドアニオン（Ｏ2 -） （ｂ）三重項状態の酸素が２電子還元を受けて生じる過
酸化水素(Ｈ2Ｏ2) （ｃ）過酸化水素のＯ−Ｏ結合が、１電子還元を受けて
生じるヒドロキシラジカル（・ＯＨ） 尚、（ａ）〜（ｃ）以外に活性酸素には1０2があるが、
液体中での寿命が短く全く無視できる4)ので、上記の測
定法に誤差を与える要因とはならない。
けて生じるスーパーオキシドアニオン（Ｏ2 -） （ｂ）三重項状態の酸素が２電子還元を受けて生じる過
酸化水素(Ｈ2Ｏ2) （ｃ）過酸化水素のＯ−Ｏ結合が、１電子還元を受けて
生じるヒドロキシラジカル（・ＯＨ） 尚、（ａ）〜（ｃ）以外に活性酸素には1０2があるが、
液体中での寿命が短く全く無視できる4)ので、上記の測
定法に誤差を与える要因とはならない。
【０００６】以下、各活性酸素の測定法について説明す
る。
る。
【０００７】スーパーオキシドアニオンは、２−メチル
−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ（１，２−
ａ）ピラジン−３−オンのＰ−メトキシ誘導体を用いて
特異的に測定できる。
−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ（１，２−
ａ）ピラジン−３−オンのＰ−メトキシ誘導体を用いて
特異的に測定できる。
【０００８】過酸化水素は、スーパーオキシドアニオン
に比べて安定であり中性溶液ではほとんど過酸化水素状
態にある。測定法には、ペルオキシダーゼやチタニウム
法など種々報告されている。
に比べて安定であり中性溶液ではほとんど過酸化水素状
態にある。測定法には、ペルオキシダーゼやチタニウム
法など種々報告されている。
【０００９】ヒドロキシラジカルはｐ−ニトロジメチル
アニリン法、メチオナール法等の化学的測定法が知られ
ているが、これらの測定方法は特異性が低いという致命
的欠点を持つため、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）法が用い
られている3)。
アニリン法、メチオナール法等の化学的測定法が知られ
ているが、これらの測定方法は特異性が低いという致命
的欠点を持つため、ＥＳＲ（電子スピン共鳴）法が用い
られている3)。
【００１０】しかし、ＥＳＲ法は測定装置が高価であ
り、操作に熟練を要するなど一般に普及しにくい。
り、操作に熟練を要するなど一般に普及しにくい。
【００１１】このヒドロキシラジカルは、生体系では主
として過酸化水素のＦe2+による分解反応（Fentou反
応）で生じる。
として過酸化水素のＦe2+による分解反応（Fentou反
応）で生じる。
【００１２】ヒドロキシラジカルと有機化合物との反応
は、拡散律速とほとんど等しい速度で進行するので、ヒ
ドロキシラジカルが生じた場所で速やかに消失し、この
ラジカル種の検出は容易ではない。従って、ヒドロキシ
ラジカルの検出は、in vitro（体外）の系で、しかもあ
まり有機物を含まない状態でのみ可能となる。
は、拡散律速とほとんど等しい速度で進行するので、ヒ
ドロキシラジカルが生じた場所で速やかに消失し、この
ラジカル種の検出は容易ではない。従って、ヒドロキシ
ラジカルの検出は、in vitro（体外）の系で、しかもあ
まり有機物を含まない状態でのみ可能となる。
【００１３】このヒドロキシラジカルの化学的方法とし
て、ｐ−ニトロソジメチルアニリン法とメチオナール法
がある。前者の特徴は、ヒドロキシラジカルとｐ−ニト
ロソジメチルアニリン（ＮＭＡ：黄色物質）と反応し
て、黄色から無色となることである。この反応の予想さ
れる反応機構を図１に示す。
て、ｐ−ニトロソジメチルアニリン法とメチオナール法
がある。前者の特徴は、ヒドロキシラジカルとｐ−ニト
ロソジメチルアニリン（ＮＭＡ：黄色物質）と反応し
て、黄色から無色となることである。この反応の予想さ
れる反応機構を図１に示す。
【００１４】このＰ−ニトロソジメチルアニリン法は、
反応系にＮＭＡを加えてＡ440の経時的減少を追うこと
によりヒドロキシラジカルの生成を知る方法であり、Ｎ
ＭＡ１molがヒドロキシラジカル1molと反応するものと
してヒドロキシラジカルの生成量をmolで表示する。
反応系にＮＭＡを加えてＡ440の経時的減少を追うこと
によりヒドロキシラジカルの生成を知る方法であり、Ｎ
ＭＡ１molがヒドロキシラジカル1molと反応するものと
してヒドロキシラジカルの生成量をmolで表示する。
【００１５】一方、後者の特徴はメチオナールとヒドロ
キシラジカルが反応し、図２に示す反応によりエチレン
を生じることである。生じたエチレンを採取してガスク
ロマトグラフィーで定量し、ヒドロキシラジカル１mol
よりエチレン1molが生じることになる。ガスクロマトグ
ラフィーの条件は、カラム：Chromosorb−102、カラム
の温度：７０〜８０℃、キャリアーガス：窒素とする。
キシラジカルが反応し、図２に示す反応によりエチレン
を生じることである。生じたエチレンを採取してガスク
ロマトグラフィーで定量し、ヒドロキシラジカル１mol
よりエチレン1molが生じることになる。ガスクロマトグ
ラフィーの条件は、カラム：Chromosorb−102、カラム
の温度：７０〜８０℃、キャリアーガス：窒素とする。
【００１６】しかし、両測定法ともにヒドロキシラジカ
ルの特異性は低い3)4)。
ルの特異性は低い3)4)。
【００１７】ヒドロキシラジカルの検出で、現在最も信
頼できる方法は、ＰＢＮ（α−phenyl−N−t−butylniy
orone）またはＤＭＰＯ（5,5−dimethyl−1−pyrroline
−N−oxide）などのスピントラップ剤を用い、ＰＢＮ−
ＯＨ付加物またはＤＭＰＯ−ＯＨ付加物（両者ともラジ
カル）をＥＳＲのスペクトロメトリーで解析する方法で
ある3)5)．1) （中野稔、呼吸、9−9、P1158、1990)2) (Nisida A.et,Clin.Chem.Acta,179,p177,1989)3) （中野稔、蛋白質 核酸 酵素、33−16、p2684、198
8）4) （金田尚志ら編、過酸化脂質実験法、p127，1983）5)4) ，ｐ２６９３
頼できる方法は、ＰＢＮ（α−phenyl−N−t−butylniy
orone）またはＤＭＰＯ（5,5−dimethyl−1−pyrroline
−N−oxide）などのスピントラップ剤を用い、ＰＢＮ−
ＯＨ付加物またはＤＭＰＯ−ＯＨ付加物（両者ともラジ
カル）をＥＳＲのスペクトロメトリーで解析する方法で
ある3)5)．1) （中野稔、呼吸、9−9、P1158、1990)2) (Nisida A.et,Clin.Chem.Acta,179,p177,1989)3) （中野稔、蛋白質 核酸 酵素、33−16、p2684、198
8）4) （金田尚志ら編、過酸化脂質実験法、p127，1983）5)4) ，ｐ２６９３
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】ｐ−ニトロソジメチル
アニリン法のＮＭＡはスーパーオキシドアニオンとは反
応しないという報告はある4)6)が、このＮＭＡはヒドロ
キシラジカルとともに過酸化水素とも反応すると思われ
る。
アニリン法のＮＭＡはスーパーオキシドアニオンとは反
応しないという報告はある4)6)が、このＮＭＡはヒドロ
キシラジカルとともに過酸化水素とも反応すると思われ
る。
【００１９】メチオナール法は、ヒドロキシラジカルば
かりでなく種々の有機ペルオキシラジカルにより、酸化
されてエチレンを生じる4)7)。このように、従来のヒド
ロキシラジカルの化学的測定法は、上記両法ともにヒド
ロキシラジカルの検出の特異性の点で、致命的欠点を有
する。
かりでなく種々の有機ペルオキシラジカルにより、酸化
されてエチレンを生じる4)7)。このように、従来のヒド
ロキシラジカルの化学的測定法は、上記両法ともにヒド
ロキシラジカルの検出の特異性の点で、致命的欠点を有
する。
【００２０】また、ヒドロキシラジカル検出で最も信頼
できる測定法であるＥＳＲ法は、 （ｉ）装置が高価で、普及率も低い （ｉｉ）解析に熟練を有する 等の欠点がある。そこで、ヒドロキシラジカルの特異的
な簡易測定法が要望されていた。
できる測定法であるＥＳＲ法は、 （ｉ）装置が高価で、普及率も低い （ｉｉ）解析に熟練を有する 等の欠点がある。そこで、ヒドロキシラジカルの特異的
な簡易測定法が要望されていた。
【００２１】本発明は上記背景のもとになされたもので
あり、特異性が高く、かつ容易で高精度なヒドロキシラ
ジカルの測定方法を提供することを目的とする。
あり、特異性が高く、かつ容易で高精度なヒドロキシラ
ジカルの測定方法を提供することを目的とする。
【００２２】6)（Rose W.,et.,Eur.J.Biochem.,95,p62
1,1979）7) （Pryor W.A.,et.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,78,
418,1977）
1,1979）7) （Pryor W.A.,et.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,78,
418,1977）
【００２３】
【課題を解決するための手段及び作用】上記課題を解決
するため、本発明は活性酸素を含む検体にスーパーオキ
シドジスムターゼとカタラーゼとを加えた後に、ｐ−ニ
トロソジメチルアニリン法にてヒドロキシラジカルを測
定することを特徴とする。
するため、本発明は活性酸素を含む検体にスーパーオキ
シドジスムターゼとカタラーゼとを加えた後に、ｐ−ニ
トロソジメチルアニリン法にてヒドロキシラジカルを測
定することを特徴とする。
【００２４】上記ように、活性酸素を含む検体にスーパ
ーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とカタラーゼを加え
て前処理することにより、スーパーオキシドアニオンと
過酸化水素が除去される。
ーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とカタラーゼを加え
て前処理することにより、スーパーオキシドアニオンと
過酸化水素が除去される。
【００２５】また、活性酸素には1０2があるが、液体中
での寿命が短く全く無視できる4)ので、上記の測定法に
誤差を与える要因とはならない。
での寿命が短く全く無視できる4)ので、上記の測定法に
誤差を与える要因とはならない。
【００２６】従って、上記前処理を行った後に通常の化
学的測定によりヒドロキシラジカル濃度の測定を行うこ
とにより、他の活性酸素の影響を殆ど受けずに真のヒド
ロキシラジカル濃度を測定することができる。
学的測定によりヒドロキシラジカル濃度の測定を行うこ
とにより、他の活性酸素の影響を殆ど受けずに真のヒド
ロキシラジカル濃度を測定することができる。
【００２７】特に、上記化学的測定法としてｐ−ニトロ
ソジメチルアニリン法を用いてヒドロキシラジカルを検
出することにより、スーパーオキシドアニオンや過酸化
水素濃度等を含まない、真のヒドロキシラジカル濃度を
容易かつ高精度も求めることができる。
ソジメチルアニリン法を用いてヒドロキシラジカルを検
出することにより、スーパーオキシドアニオンや過酸化
水素濃度等を含まない、真のヒドロキシラジカル濃度を
容易かつ高精度も求めることができる。
【００２８】
【実施例】本実施例においては、種々の活性酸素を含む
検体を予めスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と
カタラーゼにより処理してスーパーオキシドアニオンと
過酸化水素を除去した後に、ｐ−ニトロソジメチルアニ
リン法でヒドロキシラジカルを検出した。
検体を予めスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と
カタラーゼにより処理してスーパーオキシドアニオンと
過酸化水素を除去した後に、ｐ−ニトロソジメチルアニ
リン法でヒドロキシラジカルを検出した。
【００２９】次に、比較例として従来の測定方法である
ｐ−ニトロソジメチルアニリン法にて、上記種々の活性
酸素を含む検体を測定してその測定結果を比較すること
により、本実施例に係るヒドロキシラジカルの化学的測
定法の特異性と有効性を検証した。以下にその詳細を示
す。
ｐ−ニトロソジメチルアニリン法にて、上記種々の活性
酸素を含む検体を測定してその測定結果を比較すること
により、本実施例に係るヒドロキシラジカルの化学的測
定法の特異性と有効性を検証した。以下にその詳細を示
す。
【００３０】まず、ＥＳＲ法でスーパーオキシドアニオ
ン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルを含むことを確認
できた検体を用意する。
ン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルを含むことを確認
できた検体を用意する。
【００３１】次に、上記検体0.3mlと、1×10-6MＳＯ
Ｄ、1×10-4Mカタラーゼ、１×10-4MＥＤＴＡを含む0.0
5Mリン酸カリ緩衝液（pＨ7.8）3mlを試験管に順次加
え、３７℃にて１５分間前処理を行う。
Ｄ、1×10-4Mカタラーゼ、１×10-4MＥＤＴＡを含む0.0
5Mリン酸カリ緩衝液（pＨ7.8）3mlを試験管に順次加
え、３７℃にて１５分間前処理を行う。
【００３２】上記前処理済み検体にＮＭＡを加えてｐ−
ニトロソジメチルアニリン法で測定する。これにより図
１に示されるようにヒドロキシラジカルとｐ−ニトロソ
ジメチルアニリン（ＮＭＡ：黄色物質）とが反応して、
黄色から無色となる。
ニトロソジメチルアニリン法で測定する。これにより図
１に示されるようにヒドロキシラジカルとｐ−ニトロソ
ジメチルアニリン（ＮＭＡ：黄色物質）とが反応して、
黄色から無色となる。
【００３３】この際のＡ440の経時的減少を追うことに
よりヒドロキシラジカルの生成を知ることができ、ＮＭ
Ａ１molがヒドロキシラジカル1molと反応するものとし
てＮＭＡ換算のヒドロキシラジカル濃度を求めた。
よりヒドロキシラジカルの生成を知ることができ、ＮＭ
Ａ１molがヒドロキシラジカル1molと反応するものとし
てＮＭＡ換算のヒドロキシラジカル濃度を求めた。
【００３４】上記方法により３種の検体試料１、２、３
についてヒドロキシラジカル濃度を測定した結果を表１
に示す。
についてヒドロキシラジカル濃度を測定した結果を表１
に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】次に、上記実施例と同一の検体試料１、
２、３を、上記前処理を行わずにｐ−ニトロソジメチル
アニリン法で測定してＡ440の経時的減少を追い、ＮＭ
Ａ換算のヒドロキシラジカル濃度を求めた。その結果を
上記表１に併せて示す。
２、３を、上記前処理を行わずにｐ−ニトロソジメチル
アニリン法で測定してＡ440の経時的減少を追い、ＮＭ
Ａ換算のヒドロキシラジカル濃度を求めた。その結果を
上記表１に併せて示す。
【００３７】この表により、本実施例の測定方法におい
ては比較例である従来の測定法に比べてヒドロキシラジ
カル濃度が低くなっていることがわかる。
ては比較例である従来の測定法に比べてヒドロキシラジ
カル濃度が低くなっていることがわかる。
【００３８】ここで、上記のようにＥＳＲ法にて上記３
検体を測定した結果、上記３検体にはスーパーオキシド
アニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルが含まれて
いることが確認されている。
検体を測定した結果、上記３検体にはスーパーオキシド
アニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルが含まれて
いることが確認されている。
【００３９】また、ＳＯＤ，カタラーゼで前処理した検
体をＥＳＲ法にて測定した結果、これらの前処理を行っ
た検体においてはスーパーオキシドアニオン、過酸化水
素が除去されており、活性酸素としてヒドロキシラジカ
ルのみが存在するこが確認された。
体をＥＳＲ法にて測定した結果、これらの前処理を行っ
た検体においてはスーパーオキシドアニオン、過酸化水
素が除去されており、活性酸素としてヒドロキシラジカ
ルのみが存在するこが確認された。
【００４０】これらの結果より、従来の測定法にては特
異性が低く、ヒドロキシラジカルだけでなくスーパーオ
キシドアニオン、過酸化水素等も検出されてしまい、結
果として真のヒドロキシラジカル濃度よりも高い値が得
られていることがわかる。
異性が低く、ヒドロキシラジカルだけでなくスーパーオ
キシドアニオン、過酸化水素等も検出されてしまい、結
果として真のヒドロキシラジカル濃度よりも高い値が得
られていることがわかる。
【００４１】これに対し、本実施例においては上記前処
理を行った後にｐ−ニトロソジメチルアニリン法を適用
することにより、真のヒドロキシラジカル濃度が得られ
ている。
理を行った後にｐ−ニトロソジメチルアニリン法を適用
することにより、真のヒドロキシラジカル濃度が得られ
ている。
【００４２】
【発明の効果】以上説明したように、本実施例に係るヒ
ドロキシラジカルの測定法においては上記前処理を行う
ことにより、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素等
が除去されている。
ドロキシラジカルの測定法においては上記前処理を行う
ことにより、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素等
が除去されている。
【００４３】従って、上記前処理を行った後にｐ−ニト
ロソジメチルアニリン法等の化学的測定法を適用するこ
とにより、ヒドロキシラジカルを特異的に求めることが
でき、容易かつ高精度にヒドロキシラジカル濃度を求め
ることができる。
ロソジメチルアニリン法等の化学的測定法を適用するこ
とにより、ヒドロキシラジカルを特異的に求めることが
でき、容易かつ高精度にヒドロキシラジカル濃度を求め
ることができる。
【図１】ｐ−ニトロソジメチルアニリンとヒドロキシラ
ジカルの反応機構の説明図
ジカルの反応機構の説明図
【図２】メチオナールとヒドロキシラジカルの反応機構
の説明図
の説明図
Claims (1)
- 【請求項１】 活性酸素を含む検体にスーパーオキシド
ジスムターゼとカタラーゼとを加えた後に、ｐ−ニトロ
ソジメチルアニリン法にてヒドロキシラジカルを測定す
ることを特徴とするヒドロキシラジカルの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4147797A JPH05336997A (ja) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | ヒドロキシラジカルの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4147797A JPH05336997A (ja) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | ヒドロキシラジカルの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336997A true JPH05336997A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=15438431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4147797A Pending JPH05336997A (ja) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | ヒドロキシラジカルの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336997A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002340877A (ja) * | 2001-05-16 | 2002-11-27 | Univ Hiroshima | ヒドロキシラジカル自動計測装置 |
| WO2019244464A1 (ja) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | パナソニック株式会社 | 有機塩とこれを備えるヒドロキシラジカルセンサ及び検出メディア |
-
1992
- 1992-06-09 JP JP4147797A patent/JPH05336997A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002340877A (ja) * | 2001-05-16 | 2002-11-27 | Univ Hiroshima | ヒドロキシラジカル自動計測装置 |
| WO2019244464A1 (ja) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | パナソニック株式会社 | 有機塩とこれを備えるヒドロキシラジカルセンサ及び検出メディア |
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|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
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