JPH05322902A - アシルチオヒダントインのための開裂方法およびc−末端ペプチドシーケンシングへの該方法の使用 - Google Patents
アシルチオヒダントインのための開裂方法およびc−末端ペプチドシーケンシングへの該方法の使用Info
- Publication number
- JPH05322902A JPH05322902A JP4301618A JP30161892A JPH05322902A JP H05322902 A JPH05322902 A JP H05322902A JP 4301618 A JP4301618 A JP 4301618A JP 30161892 A JP30161892 A JP 30161892A JP H05322902 A JPH05322902 A JP H05322902A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thiohydantoin
- amino acid
- terminal
- terminal amino
- acyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
- C07K1/128—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
- G01N33/6821—Sequencing of polypeptides involving C-terminal degradation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 例えば、C−末端ペプチドシーケンシングに
使用するため、アシルチオヒダントイン結合の開裂を高
めるための方法を開示する。 【構成】 アシルチオヒダントインをアルキル化してチ
オヒダントイン上に付加物を形成し、付加物含有チオヒ
ダントインを、そのアシル結合にて、実質的に無水の酸
性条件下に開裂剤を用いて反応させて開裂させる。 【効果】 C−末端アミノ酸シーケンシングにおいて開
裂した生成物をC−末端アミノ酸を同定するために分析
することができる。
使用するため、アシルチオヒダントイン結合の開裂を高
めるための方法を開示する。 【構成】 アシルチオヒダントインをアルキル化してチ
オヒダントイン上に付加物を形成し、付加物含有チオヒ
ダントインを、そのアシル結合にて、実質的に無水の酸
性条件下に開裂剤を用いて反応させて開裂させる。 【効果】 C−末端アミノ酸シーケンシングにおいて開
裂した生成物をC−末端アミノ酸を同定するために分析
することができる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はアシルチオヒダントイン
結合を開裂するための改良された方法、およびこの方法
をC−末端アミノ酸シーケンシングにおいて使用するこ
とに関するものである。
結合を開裂するための改良された方法、およびこの方法
をC−末端アミノ酸シーケンシングにおいて使用するこ
とに関するものである。
【0002】
【従来の技術】次の参考文献が本発明において引用され
ている。 エドマン・ピー、アクタ・ケミカ・スカンディナビカ、
4:283-294 (1950);エドマン・ピー、アクタ・ケミカ
・スカンディナビカ、10:761-768 (1956);ボイドら、
米国特許第07/546,303号;ボイドら、テトラヘドロン・
レターズ、31:3849-3852 (1990);ホーク・ディ・エイ
チら、米国特許第07/454,666号;ホーク・ディ・エイチ
ら、米国特許第07/547,088号;ヘンドリックソンら、オ
ーガニック・ケミストリイ、第3版、697-738 頁 マクグロウーヒル、ニューヨーク、ニューヨーク(197
0);メウス・ジェイ・エルら、バイオケミストリイ、2
1:3750-3757 (1982);ベイリイら、バイオケミストリ
イ、29:3145-3156 (1990);ミラー・シイ・ジイら、ブ
ロテイン・ソサイアティの第3回シンポジウムからのア
ブストラクトT188、シアトル、WA(1989年7月29日−8
月2日);ミラー・シイ・ジイら、" テクニクス・イン・
プロテイン・ケミストリイ"(ヒュー・ティ・イー著) 、
アカデミック・プレス、67-78 頁(1989);パーハム・エ
ム・イーら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コンミュニケイションズ、80:7 (197
8);シュランクら、ホップス・セイラース・ゼット・フ
ィジカル・ケミストリイ、154 :126-171 (1926);スタ
ーク・ジイ・アール、メソッズ・イン・エンザイモロジ
イ、29:369-384 (1969);スターク・ジイ・アール・バ
イオケミストリイ、7:1796-1807 (1968);イングリス
・エイ、アナリチカル・バイオケミストリイ、195:183
-196 (1991);ロールセンら、“タンパク質配列分析にお
ける固相方法" 、メソッズ・オブ・バイオケミカル・ア
ナリシス、26:201-284 、グリック著、ジョン・ウイリ
イ・アンド・ソンズ(1980)。
ている。 エドマン・ピー、アクタ・ケミカ・スカンディナビカ、
4:283-294 (1950);エドマン・ピー、アクタ・ケミカ
・スカンディナビカ、10:761-768 (1956);ボイドら、
米国特許第07/546,303号;ボイドら、テトラヘドロン・
レターズ、31:3849-3852 (1990);ホーク・ディ・エイ
チら、米国特許第07/454,666号;ホーク・ディ・エイチ
ら、米国特許第07/547,088号;ヘンドリックソンら、オ
ーガニック・ケミストリイ、第3版、697-738 頁 マクグロウーヒル、ニューヨーク、ニューヨーク(197
0);メウス・ジェイ・エルら、バイオケミストリイ、2
1:3750-3757 (1982);ベイリイら、バイオケミストリ
イ、29:3145-3156 (1990);ミラー・シイ・ジイら、ブ
ロテイン・ソサイアティの第3回シンポジウムからのア
ブストラクトT188、シアトル、WA(1989年7月29日−8
月2日);ミラー・シイ・ジイら、" テクニクス・イン・
プロテイン・ケミストリイ"(ヒュー・ティ・イー著) 、
アカデミック・プレス、67-78 頁(1989);パーハム・エ
ム・イーら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コンミュニケイションズ、80:7 (197
8);シュランクら、ホップス・セイラース・ゼット・フ
ィジカル・ケミストリイ、154 :126-171 (1926);スタ
ーク・ジイ・アール、メソッズ・イン・エンザイモロジ
イ、29:369-384 (1969);スターク・ジイ・アール・バ
イオケミストリイ、7:1796-1807 (1968);イングリス
・エイ、アナリチカル・バイオケミストリイ、195:183
-196 (1991);ロールセンら、“タンパク質配列分析にお
ける固相方法" 、メソッズ・オブ・バイオケミカル・ア
ナリシス、26:201-284 、グリック著、ジョン・ウイリ
イ・アンド・ソンズ(1980)。
【0003】ペプチドのアミノ酸配列の決定は、その構
造を理解すること、並びにペプチドを類似体または擬似
体の所望の性質を得るように改変することが必須であ
る。ペプチドシーケンシングに最も広く使用されている
方法は、N−末端でフェニルイソチオシアネート(PIT
C) と反応させるエドマン分解として知られている方法
(エドマン)を含む。PITCと末端アミノ基との反応はフ
ェニルチオ尿素基を加えると、環化し開裂し、N−末端
アミノ酸の遊離アニリノチオゾラノン(ATZ)と短くなっ
たペプチドを形成する。N−末端アミノ酸のATZ 誘導体
は分離し、対応するフェニルチオヒダントイン(PTH) に
転換し、HPLCによって同定される。
造を理解すること、並びにペプチドを類似体または擬似
体の所望の性質を得るように改変することが必須であ
る。ペプチドシーケンシングに最も広く使用されている
方法は、N−末端でフェニルイソチオシアネート(PIT
C) と反応させるエドマン分解として知られている方法
(エドマン)を含む。PITCと末端アミノ基との反応はフ
ェニルチオ尿素基を加えると、環化し開裂し、N−末端
アミノ酸の遊離アニリノチオゾラノン(ATZ)と短くなっ
たペプチドを形成する。N−末端アミノ酸のATZ 誘導体
は分離し、対応するフェニルチオヒダントイン(PTH) に
転換し、HPLCによって同定される。
【0004】N−末端シーケンシングは隣にあるN−末
端アミノ酸をフリーのアミノ酸PTHに連続して転換し、
各連続して遊離したアミノ酸を同定して行われる。この
方法は一般に約20〜40個までのアミノ酸残基をシーケン
スするために信頼性があり、容易に自動化器具類で行わ
れる。勿論、さらに長いポリペプチドに対しては、N−
末端シーケンシングではC−末端配列情報は得られな
い。
端アミノ酸をフリーのアミノ酸PTHに連続して転換し、
各連続して遊離したアミノ酸を同定して行われる。この
方法は一般に約20〜40個までのアミノ酸残基をシーケン
スするために信頼性があり、容易に自動化器具類で行わ
れる。勿論、さらに長いポリペプチドに対しては、N−
末端シーケンシングではC−末端配列情報は得られな
い。
【0005】主として酵素による方法、物理的方法、ま
たは化学的方法に基づきC−末端ペプチドシーケンシン
グのための方法が幾つか提案された。酵素による戦略は
ペプチドのカルボキシペプチターゼによる処理で遊離し
たアミノ酸を分析することを含む。酵素による開裂の程
度、速度および特異性を制御することが困難なことが障
害となっている。
たは化学的方法に基づきC−末端ペプチドシーケンシン
グのための方法が幾つか提案された。酵素による戦略は
ペプチドのカルボキシペプチターゼによる処理で遊離し
たアミノ酸を分析することを含む。酵素による開裂の程
度、速度および特異性を制御することが困難なことが障
害となっている。
【0006】C−末端シーケンシングに使用される最も
一般的な物理的道具はFAB/MS(ファースト・アトム・ボ
ンバードメント・マス・スペクトロメトリー) 、および
NMR(核磁気共鳴) スペクトロスコピーである。FAB/MS
分析は1〜10ナノモル量のペプチドに応用ができるが、
高価な質量分析装置を必要とする。NMR による配列決定
は大量のペプチドを、代表的にはμモルの範囲で使用す
るが、これもまた高価な装置を必要とする。
一般的な物理的道具はFAB/MS(ファースト・アトム・ボ
ンバードメント・マス・スペクトロメトリー) 、および
NMR(核磁気共鳴) スペクトロスコピーである。FAB/MS
分析は1〜10ナノモル量のペプチドに応用ができるが、
高価な質量分析装置を必要とする。NMR による配列決定
は大量のペプチドを、代表的にはμモルの範囲で使用す
るが、これもまた高価な装置を必要とする。
【0007】C−末端シーケンシングを酵素および物理
的方法で行う限界を考えて、C−末端アミノ酸残基を決
定するため、あるいはC−末端シーケンシングのための
化学的方法を開発するためにかなりの努力が払われてき
た。C−末端シーケンシングに固有の困難は、アミノ基
に比べて、カルボキシル/カルボキシレート基が相対的
に化学的に不活性であることである。
的方法で行う限界を考えて、C−末端アミノ酸残基を決
定するため、あるいはC−末端シーケンシングのための
化学的方法を開発するためにかなりの努力が払われてき
た。C−末端シーケンシングに固有の困難は、アミノ基
に比べて、カルボキシル/カルボキシレート基が相対的
に化学的に不活性であることである。
【0008】幾つかの化学的方法がC−末端シーケンシ
ングのために提案された(イングリス)。これらのうち
のひとつは、ペプチドのC−末端でカルボキシアミド誘
導体を生成し、続いてビス(I,I−トリフルオロアセ
トキシ)ヨードベンゼンを誘導し、加水分解して短くな
ったカルボキシアミドペプチドとC−末端アミノ酸のア
ルデヒド誘導体を生成することを含む(ファーム)。二
番目の関連した方法はカルボキシ末端をピバロイルヒド
ロキシアミドと反応させてロッセン再配列を行うことを
含む。この方法のひとつの限界は、アスパラギン酸また
はグルタミン酸残基以外は反応が進まないことである
(ミラー、1977) 。
ングのために提案された(イングリス)。これらのうち
のひとつは、ペプチドのC−末端でカルボキシアミド誘
導体を生成し、続いてビス(I,I−トリフルオロアセ
トキシ)ヨードベンゼンを誘導し、加水分解して短くな
ったカルボキシアミドペプチドとC−末端アミノ酸のア
ルデヒド誘導体を生成することを含む(ファーム)。二
番目の関連した方法はカルボキシ末端をピバロイルヒド
ロキシアミドと反応させてロッセン再配列を行うことを
含む。この方法のひとつの限界は、アスパラギン酸また
はグルタミン酸残基以外は反応が進まないことである
(ミラー、1977) 。
【0009】最も広く研究されているC−末端シーケン
シングの化学はチオヒダントイン(TH)反応である。チオ
ヒダントイン法を行うためのひとつの一般的な方法は、
イソチオシアネート(ITC) 塩または酸の存在で、無水物
を用いてカルボキシル基を活性化させ、C−末端ITC 中
間体を経てC−末端ペプチジルチオヒダントインを生成
することである(スターク)。チオヒダントインは末端
アミノ酸の窒素、キラル炭素およびカルボニルを含む環
形成物である。これはC−末端および終りから2番目の
アミノ酸との間のアミド結合である結合によって、ペプ
チドの残りに結合している。C−末端チオヒダントイン
はそのアミド結合にて開裂し、短くなったペプチドとC
−末端アミノ酸のチオヒダントイン誘導体を生成するこ
とができる。この誘導体は分離して、例えば、HPLC(高
性能液体クロマトグラフィー)によって同定することが
できる。
シングの化学はチオヒダントイン(TH)反応である。チオ
ヒダントイン法を行うためのひとつの一般的な方法は、
イソチオシアネート(ITC) 塩または酸の存在で、無水物
を用いてカルボキシル基を活性化させ、C−末端ITC 中
間体を経てC−末端ペプチジルチオヒダントインを生成
することである(スターク)。チオヒダントインは末端
アミノ酸の窒素、キラル炭素およびカルボニルを含む環
形成物である。これはC−末端および終りから2番目の
アミノ酸との間のアミド結合である結合によって、ペプ
チドの残りに結合している。C−末端チオヒダントイン
はそのアミド結合にて開裂し、短くなったペプチドとC
−末端アミノ酸のチオヒダントイン誘導体を生成するこ
とができる。この誘導体は分離して、例えば、HPLC(高
性能液体クロマトグラフィー)によって同定することが
できる。
【0010】
【課題を解決するための手段】しかしながら、チオヒダ
ントインによる方法に使用される化学反応は、アミノ酸
シーケンシングに応用する際に2つの重要な欠点があ
る。C−末端アミノ酸チオヒダントインの最初の形成は
一般に反応時間が長く、無水物のような反応性の高い薬
剤を必要とする。(メウス、シベリイら)。このような
条件はペプチドが化学的に変化する場合が多い。TH反
応が出会う第2の欠点は、ペプチドからC−末端アミノ
酸チオヒダントインを有効に開裂することが難しいこと
である。チオヒダントイン基は良い脱離基ではないの
で、有効な開裂を行うために強い試薬(例えば強い酸、
塩基または求核試薬)とかなり激しい条件を必要とし、
これもまた残りのペプチドを分解してしまう。
ントインによる方法に使用される化学反応は、アミノ酸
シーケンシングに応用する際に2つの重要な欠点があ
る。C−末端アミノ酸チオヒダントインの最初の形成は
一般に反応時間が長く、無水物のような反応性の高い薬
剤を必要とする。(メウス、シベリイら)。このような
条件はペプチドが化学的に変化する場合が多い。TH反
応が出会う第2の欠点は、ペプチドからC−末端アミノ
酸チオヒダントインを有効に開裂することが難しいこと
である。チオヒダントイン基は良い脱離基ではないの
で、有効な開裂を行うために強い試薬(例えば強い酸、
塩基または求核試薬)とかなり激しい条件を必要とし、
これもまた残りのペプチドを分解してしまう。
【0011】チオヒダントイン化学を改良するための最
近の努力はC−末端アミノ酸チオヒダントイン形成の有
効性を改良することに向けられてきた。例えば、ボイド
らの米国特許出願第07/546,303号は穏和な条件下に行う
ことができるC−末端アミノ酸チオヒダントイン形成の
改良方法を開示している。ホウクらは、米国特許出願第
07/454,666号および米国特許出願第07/457,088号に、ま
たチオヒダントイン形成のための改良方法を開示してい
る。これら参考文献のそれぞれは、ここに組み込まれて
参照される。
近の努力はC−末端アミノ酸チオヒダントイン形成の有
効性を改良することに向けられてきた。例えば、ボイド
らの米国特許出願第07/546,303号は穏和な条件下に行う
ことができるC−末端アミノ酸チオヒダントイン形成の
改良方法を開示している。ホウクらは、米国特許出願第
07/454,666号および米国特許出願第07/457,088号に、ま
たチオヒダントイン形成のための改良方法を開示してい
る。これら参考文献のそれぞれは、ここに組み込まれて
参照される。
【0012】本発明のひとつの一般的な目的は、ペプチ
ジル−チオヒダントイン結合のようなアシル−チオヒダ
ントイン結合を開裂する改良方法を提供することであ
る。本発明の関連する目的はC−末端アミノ酸シーケン
シングの改良方法を提供することである。
ジル−チオヒダントイン結合のようなアシル−チオヒダ
ントイン結合を開裂する改良方法を提供することであ
る。本発明の関連する目的はC−末端アミノ酸シーケン
シングの改良方法を提供することである。
【0013】
【課題を解決するための手段】本発明は、まず、アシル
チオヒダントインにおいてアシル−チオヒダントイン結
合を開裂するための方法を含む。この方法は (a)アルキ
ル化によってチオヒダントインに付加物を形成するため
に有効な条件下に、アシルチオヒダントインをアルキル
化剤と接触させ;そして (b) 上記 (a)からの付加物含
有アシル−チオヒダントインを、実質的に無水の酸性条
件下に開裂剤と反応させ、付加物含有チオヒダントイン
を遊離すると共に、アシル−チオヒダントイン結合を開
裂させる各工程を含む。
チオヒダントインにおいてアシル−チオヒダントイン結
合を開裂するための方法を含む。この方法は (a)アルキ
ル化によってチオヒダントインに付加物を形成するため
に有効な条件下に、アシルチオヒダントインをアルキル
化剤と接触させ;そして (b) 上記 (a)からの付加物含
有アシル−チオヒダントインを、実質的に無水の酸性条
件下に開裂剤と反応させ、付加物含有チオヒダントイン
を遊離すると共に、アシル−チオヒダントイン結合を開
裂させる各工程を含む。
【0014】C−末端アミノ酸シーケンシングに使用す
る場合、アシルチオヒダントインはC−末端アミノ酸の
側鎖を含むアシルチオヒダントインを用い、前記ペプチ
ドのC−末端アミノ酸にて形成されるペプチジルチオヒ
ダントインである。チオヒダントインと接触させるアル
キル化は好ましくは、遊離したチオヒダントインを検出
できる蛍光または他の光学的に吸収する成分のような標
識を含む。遊離した付加物含有チオヒダントインは、例
えばHPLCを用いて、その特定のアミノ酸側鎖によって識
別(同定)することができる。
る場合、アシルチオヒダントインはC−末端アミノ酸の
側鎖を含むアシルチオヒダントインを用い、前記ペプチ
ドのC−末端アミノ酸にて形成されるペプチジルチオヒ
ダントインである。チオヒダントインと接触させるアル
キル化は好ましくは、遊離したチオヒダントインを検出
できる蛍光または他の光学的に吸収する成分のような標
識を含む。遊離した付加物含有チオヒダントインは、例
えばHPLCを用いて、その特定のアミノ酸側鎖によって識
別(同定)することができる。
【0015】また、好適なアミノ酸シーケンシング方法
では、開裂剤はイソチオシアネートであり、開裂は終り
から2番目のC−末端アミノ酸と共にアシルチオヒダン
トインを生成するために有効である。好ましい開裂剤は
トリメチルシリルイソチオシアネートである。さらに特
定例において、ポリペプチドのC−末端アミノ酸シーケ
ンシングに使用するため、本方法はポリペプチドのC−
末端アミノ酸を、アシル−チオヒダントイン結合によっ
て終りから2番目のC−末端アミノ酸に結合するアシル
−チオヒダントインに最初に転換する工程を含む。次に
チオヒダントインは、アルキル化によってチオヒダント
インに付加物を形成するために有効な条件下にアルキル
化剤と接触させる。(b) からの付加物含有アシル−チオ
ヒダントインは実質的に無水の酸性条件下に開裂剤と反
応させて、アシル−チオヒダントイン結合を開裂し、残
っている短くなったポリペプチドから付加物含有チオヒ
ダントインを遊離する。短くなったポリペプチドのC−
末端はアシル−チオヒダントインに転換され、これらの
工程が繰り返される。
では、開裂剤はイソチオシアネートであり、開裂は終り
から2番目のC−末端アミノ酸と共にアシルチオヒダン
トインを生成するために有効である。好ましい開裂剤は
トリメチルシリルイソチオシアネートである。さらに特
定例において、ポリペプチドのC−末端アミノ酸シーケ
ンシングに使用するため、本方法はポリペプチドのC−
末端アミノ酸を、アシル−チオヒダントイン結合によっ
て終りから2番目のC−末端アミノ酸に結合するアシル
−チオヒダントインに最初に転換する工程を含む。次に
チオヒダントインは、アルキル化によってチオヒダント
インに付加物を形成するために有効な条件下にアルキル
化剤と接触させる。(b) からの付加物含有アシル−チオ
ヒダントインは実質的に無水の酸性条件下に開裂剤と反
応させて、アシル−チオヒダントイン結合を開裂し、残
っている短くなったポリペプチドから付加物含有チオヒ
ダントインを遊離する。短くなったポリペプチドのC−
末端はアシル−チオヒダントインに転換され、これらの
工程が繰り返される。
【0016】遊離した各連続した付加物含有チオヒダン
トインを単離して、例えばHPLCによって、その特徴的な
アミノ酸側鎖に従って同定する。本方法は、アルキル化
試薬によって与えられるUV標識を用いて、1.5 ナノモ
ルのポリペプチドの10個までのC−末端アミノ酸残基の
配列を決定するために使用された。以下、本発明の目的
と特徴を図面に基づいて詳細に説明する。
トインを単離して、例えばHPLCによって、その特徴的な
アミノ酸側鎖に従って同定する。本方法は、アルキル化
試薬によって与えられるUV標識を用いて、1.5 ナノモ
ルのポリペプチドの10個までのC−末端アミノ酸残基の
配列を決定するために使用された。以下、本発明の目的
と特徴を図面に基づいて詳細に説明する。
【0017】C−末端シーケンシングを行うため本発明
の方法を実施する際に、末端カルボン酸を最初に活性化
させ、次にペプチジルチオヒダントインを形成するよう
に反応させる(セクションA)。ペプチジルチオヒダン
トインは、塩基性のpHで、化学的にチオヒダントインを
改変(アルキル化)するアルキル化剤と反応させる(セ
クションB)。アルキル化ペプチジルTHは酸性の条件
下に開裂剤と反応させて開裂し、ペプチドから改変C−
末端アミノ酸を遊離する(セクションC)。遊離した改
変アミノ酸は分離して、例えば逆相HPLCによって同定さ
れる(セクションD)。活性化、TH形成と改変、続い
て開裂とアミノ酸の同定の繰り返しの工程(セクション
E)は、ペプチドとタンパク質のシーケンシングのため
の自動化したC−末端の方法を提供する。
の方法を実施する際に、末端カルボン酸を最初に活性化
させ、次にペプチジルチオヒダントインを形成するよう
に反応させる(セクションA)。ペプチジルチオヒダン
トインは、塩基性のpHで、化学的にチオヒダントインを
改変(アルキル化)するアルキル化剤と反応させる(セ
クションB)。アルキル化ペプチジルTHは酸性の条件
下に開裂剤と反応させて開裂し、ペプチドから改変C−
末端アミノ酸を遊離する(セクションC)。遊離した改
変アミノ酸は分離して、例えば逆相HPLCによって同定さ
れる(セクションD)。活性化、TH形成と改変、続い
て開裂とアミノ酸の同定の繰り返しの工程(セクション
E)は、ペプチドとタンパク質のシーケンシングのため
の自動化したC−末端の方法を提供する。
【0018】“ペプチド”または“ポリペプチド”の用
語はペプチドとタンパク質の両方を意味する。“チオヒ
ダントイン”または“TH”の用語は次式Iによって定
義されるような基を意味する。
語はペプチドとタンパク質の両方を意味する。“チオヒ
ダントイン”または“TH”の用語は次式Iによって定
義されるような基を意味する。
【0019】
【化1】
【0020】ここでは、チオヒダントインに従来の方法
で番号を付した。通常の場合、チオヒダントインはアミ
ノ酸から形成され、式中のRは会合したアミノ酸側鎖を
示す。もしくは、Rは電子を引きつける性質がアルキル
基のそれに似ているラジカル基のいずれでも良く、H、
アルキル基、および種々のメチレン結合のR基を含む。
“アシルチオヒダントイン”の用語は、次式IIによって
定義される基を意味する。
で番号を付した。通常の場合、チオヒダントインはアミ
ノ酸から形成され、式中のRは会合したアミノ酸側鎖を
示す。もしくは、Rは電子を引きつける性質がアルキル
基のそれに似ているラジカル基のいずれでも良く、H、
アルキル基、および種々のメチレン結合のR基を含む。
“アシルチオヒダントイン”の用語は、次式IIによって
定義される基を意味する。
【0021】
【化2】
【0022】式中のAはチオヒダントインがカルボニル
基を介して結合する化学基を示す。Aの同一性は、チオ
ヒダントイン化学を妨害しないという条件で不可欠では
ない。好ましくは、Aは、内部またはN−末端のアミノ
酸によって固相支持体に任意に結合することができるペ
プチド残基である。チオヒダントインをペプチドのC−
末端アミノ酸から形成する場合、AC(O)-部分はC−末端
アミノ酸とは別のペプチドの残部を示し、RはC−末端
アミノ酸の側鎖であり、上記式IはC−末端ペプチジル
チオヒダントイン呼ばれ、NI は元のC−末端アミノ酸
のアルファアミノ窒素であり、C4 はC−末端カルボキ
シレートの炭素原子である。また、この具体的表現で
は、ペプチドは任意に内部またはN−末端のアミノ基に
よって固体支持体に結合することができる。
基を介して結合する化学基を示す。Aの同一性は、チオ
ヒダントイン化学を妨害しないという条件で不可欠では
ない。好ましくは、Aは、内部またはN−末端のアミノ
酸によって固相支持体に任意に結合することができるペ
プチド残基である。チオヒダントインをペプチドのC−
末端アミノ酸から形成する場合、AC(O)-部分はC−末端
アミノ酸とは別のペプチドの残部を示し、RはC−末端
アミノ酸の側鎖であり、上記式IはC−末端ペプチジル
チオヒダントイン呼ばれ、NI は元のC−末端アミノ酸
のアルファアミノ窒素であり、C4 はC−末端カルボキ
シレートの炭素原子である。また、この具体的表現で
は、ペプチドは任意に内部またはN−末端のアミノ基に
よって固体支持体に結合することができる。
【0023】AC(O)基をチオヒダントイン環の窒素N1
に結合するアミド結合は、ここでは“アシルチオヒダン
トイン結合" と呼ばれる。“チオヒダントインの対応す
る付加物を形成するようにチオヒダントインをアルキル
化するために有効な試薬”の用語は次式III の試薬を意
味する。 X−R2 III 式中のXは脱離基であり、塩基性の条件下に付加物を形
成するようにチオヒダントインの基によって置換され
る。好ましくはXは塩素、臭素、ヨウ素、トシル、イミ
ダゾリル等から選ばれる脱離基である。R2 は好ましく
は、下記のR2 基によって例示されるような -CH2-R'を
形成するメチレンR基であるが、また -CH-R'R"を形成
するメチンのような他の基であってもよい。
に結合するアミド結合は、ここでは“アシルチオヒダン
トイン結合" と呼ばれる。“チオヒダントインの対応す
る付加物を形成するようにチオヒダントインをアルキル
化するために有効な試薬”の用語は次式III の試薬を意
味する。 X−R2 III 式中のXは脱離基であり、塩基性の条件下に付加物を形
成するようにチオヒダントインの基によって置換され
る。好ましくはXは塩素、臭素、ヨウ素、トシル、イミ
ダゾリル等から選ばれる脱離基である。R2 は好ましく
は、下記のR2 基によって例示されるような -CH2-R'を
形成するメチレンR基であるが、また -CH-R'R"を形成
するメチンのような他の基であってもよい。
【0024】試薬X-R2は、時には“アルキル化試薬" と
呼ばれることもあるが、この試薬は“アルキル" を厳密
な定義に限られるものではなく、この試薬がチオヒダン
トインとR2 置換基のメチレン基-(CH2)- との間に共有
結合を形成することを確認するために使用されていると
理解される。このR2 基は、チオヒダントインに共有結
合する場合、また“付加物”と呼ばれ、改変またはアル
キル化したチオヒダントインは“付加物含有”、“改変
した”、または“アルキル化した”チオヒダントインと
呼ばれる。
呼ばれることもあるが、この試薬は“アルキル" を厳密
な定義に限られるものではなく、この試薬がチオヒダン
トインとR2 置換基のメチレン基-(CH2)- との間に共有
結合を形成することを確認するために使用されていると
理解される。このR2 基は、チオヒダントインに共有結
合する場合、また“付加物”と呼ばれ、改変またはアル
キル化したチオヒダントインは“付加物含有”、“改変
した”、または“アルキル化した”チオヒダントインと
呼ばれる。
【0025】R2 に使用される特定の標識は、もしも通
常の手段によって容易に検出でき、直接的または間接的
に、改変したチオヒダントインの硫黄原子に結合したR
2 置換基のメチレン基に共有結合しているならば、不可
欠ではない。標識は代表的には蛍光的または他の光学的
に吸収する環部分、例えばベンジルまたはナフチル基で
ある。もしくはアルキル化基は放射活性標識を含み、こ
れはTH検出に対して最も敏感な標識を与える。さらに
一般的に、本発明の方法はTH開裂方法の一部として、
導入される広範囲の標識を認める。
常の手段によって容易に検出でき、直接的または間接的
に、改変したチオヒダントインの硫黄原子に結合したR
2 置換基のメチレン基に共有結合しているならば、不可
欠ではない。標識は代表的には蛍光的または他の光学的
に吸収する環部分、例えばベンジルまたはナフチル基で
ある。もしくはアルキル化基は放射活性標識を含み、こ
れはTH検出に対して最も敏感な標識を与える。さらに
一般的に、本発明の方法はTH開裂方法の一部として、
導入される広範囲の標識を認める。
【0026】本発明に使用するための検出できる標識を
含有する特に好ましい X-R2 化合物には、次の化合物が
例示される。 4−(ブロモメチル)−フェニル酢酸フェナシルエステ
ル、ベンジルブロマイド、置換したベンジルブロマイド
類、1−ブロモメチルナフタレン、2−ブロモメチルナ
フタレン、ヨードアセトアミド、5−ヨードアセトアミ
ドフルオレセイン、6−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン、(((ヨードアセチル) アミノ) メチル) フルオレ
セイン、4´, 5´−ジ(((ヨードアセチル) アミノ)
メチル) フルオレセイン、テトラメチルローダミン−5
−(および−6)−ヨードアセトアミド、ローダミンX
ヨードアセトアミド、エオシン−5−ヨードアセトアミ
ド、エリスロシン−5−ヨードアセトアミド、マラカイ
トグリーンヨードアセトアミド、7−ジエチルアミノ−
3−((4´−ヨードアセチルアミノ)フェニル)−4−
メチルコウマリン、N−(1−ピレン)ヨードアセトア
ミド、1−ピレネメチルヨードアセトアミド、2−(4
´−ヨードアセトアミド)アニリノ)ナフタレン−6−
スルホン酸、N−((2−ヨードアセトキシ)エチル)N
−メチル)アミノ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−
1,3−ジアゾール、5−(2−((ヨードアセチル) ア
ミノ) エチル) アミノ) ナフタレン−1−スルホン酸、
4−アセトアミド−4´−(2−ヨードアセチル)アミ
ノ)スチルベン−2,2´−ジスルホン酸、ルシフェル
イエローヨードアセトアミド、カスケードブルー(登録
商標)アミノエチルヨードアセトアミド、4−ヨードア
セトアミドサリチル酸、4−ジメチルアミノフェニルア
ゾフェニル−4´−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノ
ン−4−ヨードアセトアミド、N−(ビオチノイル)−
N´−(ヨードアセチル)エチレンジアミン、ビオシチ
ンヨードアセトアミド、p−ニトロフェニルヨードアセ
テート、R−フィコエリスリン、ヨードアセチル化、5
−(ブロモメチル)フルオレセイン、6−(ブロモメチ
ル)フルオレセイン、モノクロルビマン、モノブロモト
リメチルアンモニオビマン、N−(4−ブロモブチル)
フタルイミド、N−(3−ブロモプロピル)フタルイミ
ド、N−(2−ブロモエチル)フタルイミド、N−(ブ
ロモメチル)フタルイミド、 これらの化合物全部において特定のハロと呼ばれる原子
は、ブロモ、クロロ、ヨードまたは他の適当な脱離基で
あり、この発明に使用するために適した標識を付けたア
ルキル化試薬として提供することができる。
含有する特に好ましい X-R2 化合物には、次の化合物が
例示される。 4−(ブロモメチル)−フェニル酢酸フェナシルエステ
ル、ベンジルブロマイド、置換したベンジルブロマイド
類、1−ブロモメチルナフタレン、2−ブロモメチルナ
フタレン、ヨードアセトアミド、5−ヨードアセトアミ
ドフルオレセイン、6−ヨードアセトアミドフルオレセ
イン、(((ヨードアセチル) アミノ) メチル) フルオレ
セイン、4´, 5´−ジ(((ヨードアセチル) アミノ)
メチル) フルオレセイン、テトラメチルローダミン−5
−(および−6)−ヨードアセトアミド、ローダミンX
ヨードアセトアミド、エオシン−5−ヨードアセトアミ
ド、エリスロシン−5−ヨードアセトアミド、マラカイ
トグリーンヨードアセトアミド、7−ジエチルアミノ−
3−((4´−ヨードアセチルアミノ)フェニル)−4−
メチルコウマリン、N−(1−ピレン)ヨードアセトア
ミド、1−ピレネメチルヨードアセトアミド、2−(4
´−ヨードアセトアミド)アニリノ)ナフタレン−6−
スルホン酸、N−((2−ヨードアセトキシ)エチル)N
−メチル)アミノ−7−ニトロベンズ−2−オキサ−
1,3−ジアゾール、5−(2−((ヨードアセチル) ア
ミノ) エチル) アミノ) ナフタレン−1−スルホン酸、
4−アセトアミド−4´−(2−ヨードアセチル)アミ
ノ)スチルベン−2,2´−ジスルホン酸、ルシフェル
イエローヨードアセトアミド、カスケードブルー(登録
商標)アミノエチルヨードアセトアミド、4−ヨードア
セトアミドサリチル酸、4−ジメチルアミノフェニルア
ゾフェニル−4´−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノ
ン−4−ヨードアセトアミド、N−(ビオチノイル)−
N´−(ヨードアセチル)エチレンジアミン、ビオシチ
ンヨードアセトアミド、p−ニトロフェニルヨードアセ
テート、R−フィコエリスリン、ヨードアセチル化、5
−(ブロモメチル)フルオレセイン、6−(ブロモメチ
ル)フルオレセイン、モノクロルビマン、モノブロモト
リメチルアンモニオビマン、N−(4−ブロモブチル)
フタルイミド、N−(3−ブロモプロピル)フタルイミ
ド、N−(2−ブロモエチル)フタルイミド、N−(ブ
ロモメチル)フタルイミド、 これらの化合物全部において特定のハロと呼ばれる原子
は、ブロモ、クロロ、ヨードまたは他の適当な脱離基で
あり、この発明に使用するために適した標識を付けたア
ルキル化試薬として提供することができる。
【0027】“アミノ酸の側鎖”の用語は、アミノ酸の
キラル炭素原子に結合した基を意味し、自然に発生した
か、化学的に改変したか、または合成により生成したア
ミノ酸の置換側鎖のいずれかである。“実質的に無水
の”の用語は、溶媒の全重量につき約0.5 重量パーセン
ト以下の水を含む溶液を意味する。好ましくは、実質的
に無水の酸は約0.15重量パーセント以下の水を含むだろ
う。使用した特定の実質的に無水の酸または酸擬似物質
は不可欠ではないが、好ましくは、トリフルオロ酢酸、
フッ化水素、チオシアン酸、シリルトリフレート、シリ
ルイソチオシアネート等から成る群から選ばれる酸であ
る。酸擬似物質はシリルイソチオシアネート〔RXSi(SC
N)y、式中のRは1ないし6個の炭素原子のアルキル、
6ないし10個の炭素原子のアリール、7ないし14の炭素
原子のアルキルアリール、またはこれらのいずれかの組
み合わせであり、xは0ないし3の整数、yは1ないし
4の整数である。但しx+yの合計は4である〕を含
む。シリルトリフレート類は、これらの化合物がプロト
ンを欠けているという事実にもかかわらず、これらの群
が本発明の方法においてプロトンに似ていると思われる
ので酸として含まれる。
キラル炭素原子に結合した基を意味し、自然に発生した
か、化学的に改変したか、または合成により生成したア
ミノ酸の置換側鎖のいずれかである。“実質的に無水
の”の用語は、溶媒の全重量につき約0.5 重量パーセン
ト以下の水を含む溶液を意味する。好ましくは、実質的
に無水の酸は約0.15重量パーセント以下の水を含むだろ
う。使用した特定の実質的に無水の酸または酸擬似物質
は不可欠ではないが、好ましくは、トリフルオロ酢酸、
フッ化水素、チオシアン酸、シリルトリフレート、シリ
ルイソチオシアネート等から成る群から選ばれる酸であ
る。酸擬似物質はシリルイソチオシアネート〔RXSi(SC
N)y、式中のRは1ないし6個の炭素原子のアルキル、
6ないし10個の炭素原子のアリール、7ないし14の炭素
原子のアルキルアリール、またはこれらのいずれかの組
み合わせであり、xは0ないし3の整数、yは1ないし
4の整数である。但しx+yの合計は4である〕を含
む。シリルトリフレート類は、これらの化合物がプロト
ンを欠けているという事実にもかかわらず、これらの群
が本発明の方法においてプロトンに似ていると思われる
ので酸として含まれる。
【0028】“固体支持体”または“固相支持体”の用
語は、表面相関性を含むかまたは、ペプチドのアミノ基
によって直接または間接的に支持体にペプチドを結合す
るようにペプチドのアミン基と相互に作用することがで
きる表面相関性を含むように誘導できるいずれかの固体
支持体を意味する。このような結合は共有結合またはイ
オン性の相互作用または疎水性の相互作用のいずれかに
よる。適当な固体支持体は、これらに制限されるもので
はないが、セファローズ、アミノ−プロピルシリカ、ア
ミノプロピル−CPG (制御された有孔ガラス) 、アミノ
エチルセルロース、トリス−アリルR−NH、ガラスビー
ズ、ポリアクリルアミド粒子、ジイソチオシアネートガ
ラス(DITC)、およびポリスチレンを含む。
語は、表面相関性を含むかまたは、ペプチドのアミノ基
によって直接または間接的に支持体にペプチドを結合す
るようにペプチドのアミン基と相互に作用することがで
きる表面相関性を含むように誘導できるいずれかの固体
支持体を意味する。このような結合は共有結合またはイ
オン性の相互作用または疎水性の相互作用のいずれかに
よる。適当な固体支持体は、これらに制限されるもので
はないが、セファローズ、アミノ−プロピルシリカ、ア
ミノプロピル−CPG (制御された有孔ガラス) 、アミノ
エチルセルロース、トリス−アリルR−NH、ガラスビー
ズ、ポリアクリルアミド粒子、ジイソチオシアネートガ
ラス(DITC)、およびポリスチレンを含む。
【0029】A. アシルチオヒダントインの形成 アミノ酸またはC−末端ペプチドのいずれかのカルボキ
シル基からアシルチオヒダントインを調製するための方
法は文献に良く典拠を示されている。例えば、このよう
なチオヒダントインの調製のためのひとつの一般的な手
順では、カルボキシル基を無水酢酸のような無水物を用
いて、イソチオシアネート(ITC) 塩または酸の存在で活
性化し、C−末端ITC 中間体を経てC−末端ペプチジル
チオヒダントインを形成する(スターク)。チオヒダン
トイン生成のための他の手順ではペプチドを無水酢酸で
(例えば15分間、50℃で) 活性化させ、続いてトリメチ
ルシリルイソチオシアネートと反応させる(例えば、さ
らに30分間50℃にて、ホーク) 。あるいはペプチドのC
−末端アミノ酸のカルボキシル基を、イソチオシアン酸
およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物
を用いて、塩基性の実質的に非水条件下に反応させる
(ホーク)。
シル基からアシルチオヒダントインを調製するための方
法は文献に良く典拠を示されている。例えば、このよう
なチオヒダントインの調製のためのひとつの一般的な手
順では、カルボキシル基を無水酢酸のような無水物を用
いて、イソチオシアネート(ITC) 塩または酸の存在で活
性化し、C−末端ITC 中間体を経てC−末端ペプチジル
チオヒダントインを形成する(スターク)。チオヒダン
トイン生成のための他の手順ではペプチドを無水酢酸で
(例えば15分間、50℃で) 活性化させ、続いてトリメチ
ルシリルイソチオシアネートと反応させる(例えば、さ
らに30分間50℃にて、ホーク) 。あるいはペプチドのC
−末端アミノ酸のカルボキシル基を、イソチオシアン酸
およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物
を用いて、塩基性の実質的に非水条件下に反応させる
(ホーク)。
【0030】C−末端ペプチドのカルボキシル基からア
シルチオヒダントインを調製するための特に好ましい方
法は、もとの場所に生成したケテンイミンと反応させ、
続いてシリルイソチオシアネート(例えば、トリメチル
シリルイソチオシアネート)と反応させる。ボイドらを
参照し、ここに引用文献として組み込む。選択された反
応方法はC−末端ペプチジルチオヒダントインの生成に
導かれ、C−末端アミノ酸はC−末端アミノ酸チオヒダ
ントインに転換され、環窒素へのイミド結合によってペ
プチドの次のC−末端アミノ酸に結合する。具体的なア
ルキル化反応は実施例1および2に詳述されている。固
体支持体に結合したペプチジル−THを調製するための
具体的な条件は実施例4および5に示されている。
シルチオヒダントインを調製するための特に好ましい方
法は、もとの場所に生成したケテンイミンと反応させ、
続いてシリルイソチオシアネート(例えば、トリメチル
シリルイソチオシアネート)と反応させる。ボイドらを
参照し、ここに引用文献として組み込む。選択された反
応方法はC−末端ペプチジルチオヒダントインの生成に
導かれ、C−末端アミノ酸はC−末端アミノ酸チオヒダ
ントインに転換され、環窒素へのイミド結合によってペ
プチドの次のC−末端アミノ酸に結合する。具体的なア
ルキル化反応は実施例1および2に詳述されている。固
体支持体に結合したペプチジル−THを調製するための
具体的な条件は実施例4および5に示されている。
【0031】B.チオヒダントインのアルキル化 このセクションでは、チオヒダントインを改変した(ア
ルキル化した)チオヒダントインに転換するために用い
られる方法を述べる。特に、チオヒダントインはアルキ
ル化剤、X-R2と接触させ、改変したチオヒダントインを
生成するチオヒダントインに基を付加する。反応は一般
にチオヒダントインに関して等モルまたは過剰モルのア
ルキル化剤を用いて行われる。アルキル化剤が過剰であ
り、Rが水素である場合(例えば、C−末端アミノ酸が
グリシンである)、アルキル化剤もまた反応し、チオヒ
ダントインのC5 環原子に共有結合を形成することが予
期される。
ルキル化した)チオヒダントインに転換するために用い
られる方法を述べる。特に、チオヒダントインはアルキ
ル化剤、X-R2と接触させ、改変したチオヒダントインを
生成するチオヒダントインに基を付加する。反応は一般
にチオヒダントインに関して等モルまたは過剰モルのア
ルキル化剤を用いて行われる。アルキル化剤が過剰であ
り、Rが水素である場合(例えば、C−末端アミノ酸が
グリシンである)、アルキル化剤もまた反応し、チオヒ
ダントインのC5 環原子に共有結合を形成することが予
期される。
【0032】好ましくは、反応は少なくとも1モル当量
の第3アミンを用い、さらに好ましくは十分に過剰モル
の第3アミンを用いる。第3塩基は各アルキル基内に1
ないし6個の炭素原子をもつトリアルキルアミンであ
る。好ましいトリアルキルアミンは、トリメチルアミ
ン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等
を含む。
の第3アミンを用い、さらに好ましくは十分に過剰モル
の第3アミンを用いる。第3塩基は各アルキル基内に1
ないし6個の炭素原子をもつトリアルキルアミンであ
る。好ましいトリアルキルアミンは、トリメチルアミ
ン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等
を含む。
【0033】反応は実質的に無水の条件下に、チオヒダ
ントイン環の所望のアルキル化を生成するために十分な
温度と時間で行われる。好ましい温度範囲は、約30°な
いし100 ℃であり、さらに好ましい温度範囲は約45°な
いし約60℃である。反応は一般に0.1 ないし1時間で完
了する。実質的に無水の条件は、改変したチオヒダント
インが不可逆的に水と反応し、SR2 基を放出してヒダン
トインを生成することができるので必須である。このよ
うなヒダントイン類は実質的に無水の酸によって容易に
開裂しないだけでなく、容易に反応してチオヒダントイ
ンを生成しない。
ントイン環の所望のアルキル化を生成するために十分な
温度と時間で行われる。好ましい温度範囲は、約30°な
いし100 ℃であり、さらに好ましい温度範囲は約45°な
いし約60℃である。反応は一般に0.1 ないし1時間で完
了する。実質的に無水の条件は、改変したチオヒダント
インが不可逆的に水と反応し、SR2 基を放出してヒダン
トインを生成することができるので必須である。このよ
うなヒダントイン類は実質的に無水の酸によって容易に
開裂しないだけでなく、容易に反応してチオヒダントイ
ンを生成しない。
【0034】ペプチドがフリーの形で反応する場合(例
えば、固相支持体に結合せず、アミノ末端が保護されて
いる)、反応は一般に不活性溶媒を用いる液相で行われ
る。適当な不活性溶媒は、例えばアセトニトリル、塩化
メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタ
ン、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン等を
含む。
えば、固相支持体に結合せず、アミノ末端が保護されて
いる)、反応は一般に不活性溶媒を用いる液相で行われ
る。適当な不活性溶媒は、例えばアセトニトリル、塩化
メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタ
ン、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン等を
含む。
【0035】ペプチドを固体支持体に結合する場合、ア
ルキル化試薬と第3アミンは液相または蒸気相のいずれ
かで用いることができる。液相を用いる場合、試薬は一
般に不活性溶媒、例えばアセトニトリル、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタン、ジ
メチルホルムアミド、N−メチルピロリドン等と混合さ
れる。蒸気相を用いる場合、アルキル化試薬と第3アミ
ンは一般に、例えば、窒素、アルゴン等の不活性気体と
混合される。もしくは、アルキル化試薬と第3アミンは
別々に不活性気体と混合し、逐次反応に用いることがで
きる。蒸気相を用いる場合、アルキル化試薬と第3アミ
ンは用いられる反応温度にて十分な蒸気圧に対して供給
するように選択される。特に好ましい系は、塩基として
トリメチルアミン、またアルキル化試薬としてベンジル
ハライド類、またはそれらの誘導体およびシンナミルハ
ライド類(例えばシンナミルブロマイド)または誘導体
を含む。
ルキル化試薬と第3アミンは液相または蒸気相のいずれ
かで用いることができる。液相を用いる場合、試薬は一
般に不活性溶媒、例えばアセトニトリル、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタン、ジ
メチルホルムアミド、N−メチルピロリドン等と混合さ
れる。蒸気相を用いる場合、アルキル化試薬と第3アミ
ンは一般に、例えば、窒素、アルゴン等の不活性気体と
混合される。もしくは、アルキル化試薬と第3アミンは
別々に不活性気体と混合し、逐次反応に用いることがで
きる。蒸気相を用いる場合、アルキル化試薬と第3アミ
ンは用いられる反応温度にて十分な蒸気圧に対して供給
するように選択される。特に好ましい系は、塩基として
トリメチルアミン、またアルキル化試薬としてベンジル
ハライド類、またはそれらの誘導体およびシンナミルハ
ライド類(例えばシンナミルブロマイド)または誘導体
を含む。
【0036】ペプチドがフリーの形である場合、改変さ
れたチオヒダントイン生成物を濾過によって分離し、ア
ミン塩を除去することができる。ペプチドが固体支持体
に結合している場合、改変されたチオヒダントイン生成
物を単離し不活性溶媒を用いて液体洗浄し、および/ま
たは不活性気体を用いて気体浄化によって精製するこが
できる。あるいはペプチドを含む固体支持体をさらに単
離および/または精製することなく、次の工程で用いる
こともできる。
れたチオヒダントイン生成物を濾過によって分離し、ア
ミン塩を除去することができる。ペプチドが固体支持体
に結合している場合、改変されたチオヒダントイン生成
物を単離し不活性溶媒を用いて液体洗浄し、および/ま
たは不活性気体を用いて気体浄化によって精製するこが
できる。あるいはペプチドを含む固体支持体をさらに単
離および/または精製することなく、次の工程で用いる
こともできる。
【0037】図3A−3Cおよび図4Aと4Bは上記ア
ルキル化反応の提案された反応機構を示すものである。
図3A−3Cにおいて、アシルチオヒダントイン(3
A)は塩基性溶液中で脱プロトンされ、環のN原子また
はS原子で親電子的に攻撃するのに都合がよい共鳴形態
に導かれる(3Bと3C)。予備的なNMR データーは、
アルキル化がS原子で都合がよいことを示している。S
原子でのアルキル化はまた、図4Aと4Bに見られるよ
うに、チオアルキル化チオヒダントインの共鳴形態が可
能であるため、共鳴安定性によって好都合である。
ルキル化反応の提案された反応機構を示すものである。
図3A−3Cにおいて、アシルチオヒダントイン(3
A)は塩基性溶液中で脱プロトンされ、環のN原子また
はS原子で親電子的に攻撃するのに都合がよい共鳴形態
に導かれる(3Bと3C)。予備的なNMR データーは、
アルキル化がS原子で都合がよいことを示している。S
原子でのアルキル化はまた、図4Aと4Bに見られるよ
うに、チオアルキル化チオヒダントインの共鳴形態が可
能であるため、共鳴安定性によって好都合である。
【0038】図1Aと1Bは、ペプチジルチオヒダント
インを塩基性の条件下に XR2でアルキル化するチオ−ア
ルキル化反応を示している。チオ−アルキル化反応を示
しているが、1個以上のチオヒダントイン環原子でのア
ルキル化(さらに加えて、または代りにチオ−アルキル
化)の可能性は除くことができない。いずれにせよ、以
下に述べるようにアルキル化反応はアシル−チオヒダン
トイン結合の開裂を容易にするために有効であり、チオ
ヒダントインに結合したアルキル化付加物は、このよう
な開裂の後にチオヒダントインに結合したままである。
例示的なアルキル化反応は実施例6と7に示されてい
る。
インを塩基性の条件下に XR2でアルキル化するチオ−ア
ルキル化反応を示している。チオ−アルキル化反応を示
しているが、1個以上のチオヒダントイン環原子でのア
ルキル化(さらに加えて、または代りにチオ−アルキル
化)の可能性は除くことができない。いずれにせよ、以
下に述べるようにアルキル化反応はアシル−チオヒダン
トイン結合の開裂を容易にするために有効であり、チオ
ヒダントインに結合したアルキル化付加物は、このよう
な開裂の後にチオヒダントインに結合したままである。
例示的なアルキル化反応は実施例6と7に示されてい
る。
【0039】C.改変されたチオヒダントインの開裂 このセクションは本発明の方法の開裂工程を述べてお
り、この方法は、改変されたチオヒダントインがアシル
基、例えばペプチドの終りから2番目のC−末端アミノ
酸のアシル基に結合するアシルチオヒダントイン結合を
開裂するために有効な酸性の開裂条件下に、改変された
ペプチジルチオヒダントインを処理することを含む。
り、この方法は、改変されたチオヒダントインがアシル
基、例えばペプチドの終りから2番目のC−末端アミノ
酸のアシル基に結合するアシルチオヒダントイン結合を
開裂するために有効な酸性の開裂条件下に、改変された
ペプチジルチオヒダントインを処理することを含む。
【0040】開裂条件は過剰モルの開裂剤を用いる。こ
のような開裂剤は、トリフルオロ酢酸、フッ化水素、チ
オシアン酸、シリルトリフルオロアセテート、トリメチ
ルシリルトリフルオロメタンスルホネート(トリフレー
ト)、シリルイソチオシアネート等を含む。シリルイソ
チオシアネート類は RxSi(SCN)y の式であり、シリルト
リフルオロアセテートは〔CF3C(O)O〕ySiRx(式中のR
は1ないし6個の炭素原子のアルキル、6ないし10個の
炭素原子のアリール、7個ないし14個の炭素原子のアル
キルアリール、またはこれらのいずれかの組み合わせで
あり、xは0から3までの整数、yは1ないし4までの
整数である、但しx+yの合計は4である) の式であ
る。
のような開裂剤は、トリフルオロ酢酸、フッ化水素、チ
オシアン酸、シリルトリフルオロアセテート、トリメチ
ルシリルトリフルオロメタンスルホネート(トリフレー
ト)、シリルイソチオシアネート等を含む。シリルイソ
チオシアネート類は RxSi(SCN)y の式であり、シリルト
リフルオロアセテートは〔CF3C(O)O〕ySiRx(式中のR
は1ないし6個の炭素原子のアルキル、6ないし10個の
炭素原子のアリール、7個ないし14個の炭素原子のアル
キルアリール、またはこれらのいずれかの組み合わせで
あり、xは0から3までの整数、yは1ないし4までの
整数である、但しx+yの合計は4である) の式であ
る。
【0041】開裂反応は一般に約20℃から約60℃までの
温度で、代表的には約0.1 ないし2時間の反応時間で行
われる。反応の過程は開裂した生成物および/または短
くなったペプチドを、下記の分析方法に従って試験する
ことによって容易に追跡することができる。ペプチドを
フリーの形で反応させる場合(例えば、固体支持体に結
合せず、アミノ末端を保護する)、開裂反応は一般に不
活性溶媒を用いる液相で行われる。適当な不活性溶媒
は、例えば、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホ
ルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタン等を含む。この構
成では、残りのペプチドは減圧下の濃縮、蒸留、クロマ
トグラフィー等を含む従来の手段によって単離、精製す
ることができる。
温度で、代表的には約0.1 ないし2時間の反応時間で行
われる。反応の過程は開裂した生成物および/または短
くなったペプチドを、下記の分析方法に従って試験する
ことによって容易に追跡することができる。ペプチドを
フリーの形で反応させる場合(例えば、固体支持体に結
合せず、アミノ末端を保護する)、開裂反応は一般に不
活性溶媒を用いる液相で行われる。適当な不活性溶媒
は、例えば、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホ
ルム、ベンゼン、トルエン、ヘプタン等を含む。この構
成では、残りのペプチドは減圧下の濃縮、蒸留、クロマ
トグラフィー等を含む従来の手段によって単離、精製す
ることができる。
【0042】ペプチドが固体支持体に結合する場合、開
裂試薬を液相または蒸気相のいずれかで用いる。液相で
用いる場合、試薬は一般に、例えばアセトニトリル、塩
化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプ
タン等を含む不活性溶媒のいずれかを用いて混合する。
蒸気相を用いる場合、開裂試薬は一般に例えば窒素、ア
ルゴン等を含む不活性気体のいずれかを用いて混合す
る。この具体例では、開裂試薬は使用される反応温度に
て十分に蒸気圧を与えるように選択される。この構成で
は、残りのペプチドは、不活性溶媒を用いる液体洗浄お
よび/または不活性気体を用いる気体浄化によって単離
し、精製することができる。適当な不活性溶媒と不活性
気体は上記の通りである。
裂試薬を液相または蒸気相のいずれかで用いる。液相で
用いる場合、試薬は一般に、例えばアセトニトリル、塩
化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ヘプ
タン等を含む不活性溶媒のいずれかを用いて混合する。
蒸気相を用いる場合、開裂試薬は一般に例えば窒素、ア
ルゴン等を含む不活性気体のいずれかを用いて混合す
る。この具体例では、開裂試薬は使用される反応温度に
て十分に蒸気圧を与えるように選択される。この構成で
は、残りのペプチドは、不活性溶媒を用いる液体洗浄お
よび/または不活性気体を用いる気体浄化によって単離
し、精製することができる。適当な不活性溶媒と不活性
気体は上記の通りである。
【0043】本発明を支持するために行われた研究で
は、上記の開裂条件が、改変されたチオヒダントインを
含むアシル−チオヒダントイン結合を開裂するために有
効であり、反応が完全にまたは殆ど完全に進行している
ことを示している。これに対して、改変されていないチ
オヒダントインは同じ条件下では開裂しないかまたはほ
んの少し開裂しているに過ぎない。
は、上記の開裂条件が、改変されたチオヒダントインを
含むアシル−チオヒダントイン結合を開裂するために有
効であり、反応が完全にまたは殆ど完全に進行している
ことを示している。これに対して、改変されていないチ
オヒダントインは同じ条件下では開裂しないかまたはほ
んの少し開裂しているに過ぎない。
【0044】図1B−1DはC−末端シーケンシング反
応の一部として、ペプチジルチオヒダントインで行われ
たアシルチオヒダントイン開裂反応において提案された
工程を示している。ここではチオヒダントインはC−末
端アミノ酸から形成され、チオヒダントインR基はアミ
ノ酸の側鎖を示し、アシル−チオヒダントイン結合は次
にある(終りから2番目の)アミノ酸配列(側鎖R´を
もつ)のカルボニル基とチオヒダントインとの間に形成
される。
応の一部として、ペプチジルチオヒダントインで行われ
たアシルチオヒダントイン開裂反応において提案された
工程を示している。ここではチオヒダントインはC−末
端アミノ酸から形成され、チオヒダントインR基はアミ
ノ酸の側鎖を示し、アシル−チオヒダントイン結合は次
にある(終りから2番目の)アミノ酸配列(側鎖R´を
もつ)のカルボニル基とチオヒダントインとの間に形成
される。
【0045】ペプチジルチオヒダントインと実質的に無
水のトリフルオロ酢酸(TFA)との処理はチオヒダントイ
ンを脱離し、不安定な混合した無水物中間体の形成を可
能にする(図1C)。少量の水の存在で、中間体は迅速
に加水分解され、隣りにあるアミノ酸残基のカルボン酸
基を形成する(図1D)。ひとつの好ましい開裂方法で
は、特にC−末端シーケンシングに使用するために、ア
シルチオヒダントインはトリフルオロ酢酸とシリルイソ
チオシアネートの混合物によって、またはトリフルオロ
酢酸を添加し続いてシリルイソチオシアネートを添加し
て開裂される。これらの条件下では、トリフルオロ酢酸
は無水トリフルオロ酢酸の中間体混合無水物を形成する
ことができ(図2C)、シリルイソチオシアネートと迅
速に反応し、アシルイソチオシアネートを形成し、環化
して隣りにあるアミノ酸のチオヒダントインを形成する
(図2D)。
水のトリフルオロ酢酸(TFA)との処理はチオヒダントイ
ンを脱離し、不安定な混合した無水物中間体の形成を可
能にする(図1C)。少量の水の存在で、中間体は迅速
に加水分解され、隣りにあるアミノ酸残基のカルボン酸
基を形成する(図1D)。ひとつの好ましい開裂方法で
は、特にC−末端シーケンシングに使用するために、ア
シルチオヒダントインはトリフルオロ酢酸とシリルイソ
チオシアネートの混合物によって、またはトリフルオロ
酢酸を添加し続いてシリルイソチオシアネートを添加し
て開裂される。これらの条件下では、トリフルオロ酢酸
は無水トリフルオロ酢酸の中間体混合無水物を形成する
ことができ(図2C)、シリルイソチオシアネートと迅
速に反応し、アシルイソチオシアネートを形成し、環化
して隣りにあるアミノ酸のチオヒダントインを形成する
(図2D)。
【0046】あるいは、トリフルオロ酢酸は、アシルチ
オヒダントイン結合を開裂し、次にあるアミノ酸のチオ
ヒダントイン基を形成する際に、シリルイソチオシアネ
ートの反応に触媒作用を及ぼすように働くことができ
る。この方法は、両方の試薬を気相に任意に送ることが
できるので好ましい。この方法の形態は液体溶媒の使用
および不利な水の含有が避けられ、改変したチオヒダン
トインをヒダントインまたは非アルキル化チオヒダント
インに不可逆的に転換することができ、また改変したチ
オヒダントインを開裂することができる(C−末端酸基
を形成する)。
オヒダントイン結合を開裂し、次にあるアミノ酸のチオ
ヒダントイン基を形成する際に、シリルイソチオシアネ
ートの反応に触媒作用を及ぼすように働くことができ
る。この方法は、両方の試薬を気相に任意に送ることが
できるので好ましい。この方法の形態は液体溶媒の使用
および不利な水の含有が避けられ、改変したチオヒダン
トインをヒダントインまたは非アルキル化チオヒダント
インに不可逆的に転換することができ、また改変したチ
オヒダントインを開裂することができる(C−末端酸基
を形成する)。
【0047】無水HF(気相)のような他の酸を、無水
トリフルオロ酢酸の代りに、シリルイソチオシアネート
との混合で使用することができ、両者がC−末端アミノ
酸上の改変されたチオヒダントインを開裂し、隣りにあ
るアミノ酸とチオヒダントインを形成するようにするこ
とができることが予想される。本発明で行われるTH開
裂が高められたひとつの理由は、アルキル化で形成でき
るイミダゾール様のTH構造に関係しているのかも知れ
ない。この特徴は図4Aと4Bに示され、アルキル化T
Hの2つの可能な共鳴形態を示している。図4Bに示さ
れる形態は、良好な脱離基であることが知られているイ
ミダゾールに似ている。
トリフルオロ酢酸の代りに、シリルイソチオシアネート
との混合で使用することができ、両者がC−末端アミノ
酸上の改変されたチオヒダントインを開裂し、隣りにあ
るアミノ酸とチオヒダントインを形成するようにするこ
とができることが予想される。本発明で行われるTH開
裂が高められたひとつの理由は、アルキル化で形成でき
るイミダゾール様のTH構造に関係しているのかも知れ
ない。この特徴は図4Aと4Bに示され、アルキル化T
Hの2つの可能な共鳴形態を示している。図4Bに示さ
れる形態は、良好な脱離基であることが知られているイ
ミダゾールに似ている。
【0048】さらに開裂反応は遊離したチオヒダントイ
ンの安定性が増加することによって高められる。図5A
−5Cに見られるように、開裂したアルキル化チオヒダ
ントインは芳香族化に必要な必須の6pi電子をもち、従
って遊離した化合物の安定性を高め、その形態に導く遷
移状態のエネルギーを低くする。上述したように、C−
末端アミノ酸を含む開裂し改変したチオヒダントインの
構造は確実には知られていないが、R2 基が検出できる
標識を含む場合、この標識がペプチドから開裂したC−
末端アミノ酸に結合したままである。R2 基はC−末端
アミノ酸と共に残るので、R2 置換体中の検出できる標
識の使用は開裂したアミノ酸の検出を容易にする。
ンの安定性が増加することによって高められる。図5A
−5Cに見られるように、開裂したアルキル化チオヒダ
ントインは芳香族化に必要な必須の6pi電子をもち、従
って遊離した化合物の安定性を高め、その形態に導く遷
移状態のエネルギーを低くする。上述したように、C−
末端アミノ酸を含む開裂し改変したチオヒダントインの
構造は確実には知られていないが、R2 基が検出できる
標識を含む場合、この標識がペプチドから開裂したC−
末端アミノ酸に結合したままである。R2 基はC−末端
アミノ酸と共に残るので、R2 置換体中の検出できる標
識の使用は開裂したアミノ酸の検出を容易にする。
【0049】D.改変アミノ酸THの同定 ペプチドまたは短くなったペプチドから遊離したアミノ
酸を含む開裂生成物は分析してC−末端アミノ酸を同定
することができる。ペプチドが支持体に結合する場合、
ペプチドから遊離した開裂生成物は、例えば真空遠心分
離によって開裂反応溶媒を除去し、開裂生成物をアセト
ニトリルのような適当な溶媒で抽出することによって、
以下の実施例に詳述するように、容易に分離することが
できる。ペプチドが開裂反応混合物中でフリーである場
合、混合物は、当該分野で知られているような適当な手
段、例えば、化合物を同定するための方法の一部として
RP-HPLC 、イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピ
ラリー電気泳動によって、分離することができる。
酸を含む開裂生成物は分析してC−末端アミノ酸を同定
することができる。ペプチドが支持体に結合する場合、
ペプチドから遊離した開裂生成物は、例えば真空遠心分
離によって開裂反応溶媒を除去し、開裂生成物をアセト
ニトリルのような適当な溶媒で抽出することによって、
以下の実施例に詳述するように、容易に分離することが
できる。ペプチドが開裂反応混合物中でフリーである場
合、混合物は、当該分野で知られているような適当な手
段、例えば、化合物を同定するための方法の一部として
RP-HPLC 、イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピ
ラリー電気泳動によって、分離することができる。
【0050】実施例11に記載したHPLC法は参照基準品と
比較することによって開裂し、改変したアミノ酸を同定
するために適している方法の一つである。図7〜14は、
下記のようにして、数ラウンドのC−末端シーケンシン
グの後に得られた開裂した生成物を含むアミノ酸のHPLC
プロフィルである。
比較することによって開裂し、改変したアミノ酸を同定
するために適している方法の一つである。図7〜14は、
下記のようにして、数ラウンドのC−末端シーケンシン
グの後に得られた開裂した生成物を含むアミノ酸のHPLC
プロフィルである。
【0051】E.C−末端アミノ酸シーケンシング 上記セクションA−Dに記載した方法は、ペプチドのC
−末端アミノ酸残基を決定するために使用できる。本方
法の繰り返される応用はペプチドのC−末端アミノ酸シ
ーケンシングのために使用できることが認められるだろ
う。図6は好ましいシーケンシング方法を示している。
シーケンスするためのペプチドは固体支持体(Sで表わ
される)に結合する。次にペプチドは工程の第1ラウン
ドを通って運ばれ、(a) 末端アミノ酸を含むC−末端ペ
プチジルチオヒダントインを生成し(AAn-TH)、(b) C
−末端ペプチジルチオヒダントインをアルキル化し、そ
して(c)末端改変チオヒダントインを開裂し、C−末端
アミノ酸を含む開裂生成物(AAn-TH-R2) およびC−末
端残基がAAn-1である短くなったペプチドを生成する。
遊離したチオヒダントインは例えばHPLCによって同定す
るために捕えられる。
−末端アミノ酸残基を決定するために使用できる。本方
法の繰り返される応用はペプチドのC−末端アミノ酸シ
ーケンシングのために使用できることが認められるだろ
う。図6は好ましいシーケンシング方法を示している。
シーケンスするためのペプチドは固体支持体(Sで表わ
される)に結合する。次にペプチドは工程の第1ラウン
ドを通って運ばれ、(a) 末端アミノ酸を含むC−末端ペ
プチジルチオヒダントインを生成し(AAn-TH)、(b) C
−末端ペプチジルチオヒダントインをアルキル化し、そ
して(c)末端改変チオヒダントインを開裂し、C−末端
アミノ酸を含む開裂生成物(AAn-TH-R2) およびC−末
端残基がAAn-1である短くなったペプチドを生成する。
遊離したチオヒダントインは例えばHPLCによって同定す
るために捕えられる。
【0052】ペプチド支持体を洗浄後、短くなったペプ
チドを上記工程の第2ラウンドにかけて、開裂生成物
(AAn-1)の一部として隣にあるアミノ酸を遊離し、2つ
のC−末端残基によって短くなったペプチドを生成す
る。この手順はペプチドがシーケンスされるかまたは、
分解のロスがさらにシーケンシングを不可能にするまで
繰り返される。
チドを上記工程の第2ラウンドにかけて、開裂生成物
(AAn-1)の一部として隣にあるアミノ酸を遊離し、2つ
のC−末端残基によって短くなったペプチドを生成す
る。この手順はペプチドがシーケンスされるかまたは、
分解のロスがさらにシーケンシングを不可能にするまで
繰り返される。
【0053】好適例では、C−末端アミノ酸の開裂は隣
りにあるアミノ酸のチオヒダントインの生成と対になっ
ている。この例では、開裂剤を、チオシアン酸、シリル
イソチオシアネート、および実質的に無水の酸およびシ
リルイソチオシアネートの混合物から選択する。上記の
技法はペプチドのN−末端残基の自動化シーケンシング
のために知られている技術的方法を用いて容易に自動化
される。C−末端からペプチドを自動的にシーケンスす
るための装置のひとつの実施例では、反応容器に含まれ
た固体支持体を用い、この容器には新しい溶媒と試薬を
添加し、そこから、反応混合物と溶媒洗浄物を除去す
る。遊離したアミノ酸イソチオシアネートは支持体から
抽出し、オンラインRP-HPLC に分析のために移す。
りにあるアミノ酸のチオヒダントインの生成と対になっ
ている。この例では、開裂剤を、チオシアン酸、シリル
イソチオシアネート、および実質的に無水の酸およびシ
リルイソチオシアネートの混合物から選択する。上記の
技法はペプチドのN−末端残基の自動化シーケンシング
のために知られている技術的方法を用いて容易に自動化
される。C−末端からペプチドを自動的にシーケンスす
るための装置のひとつの実施例では、反応容器に含まれ
た固体支持体を用い、この容器には新しい溶媒と試薬を
添加し、そこから、反応混合物と溶媒洗浄物を除去す
る。遊離したアミノ酸イソチオシアネートは支持体から
抽出し、オンラインRP-HPLC に分析のために移す。
【0054】本発明に従って行われる自動化C−末端シ
ーケンシング反応は、試験した(各ケースでは5ラウン
ドだけを行った)2つのタンパク質の5個のC−末端残
基のシーケンシング(実施例11と12) 、およびシーケン
シングが分解の最後に行われた合成ペプチドの10個のC
−末端残基のシーケンシング(実施例13) を可能にし
た。
ーケンシング反応は、試験した(各ケースでは5ラウン
ドだけを行った)2つのタンパク質の5個のC−末端残
基のシーケンシング(実施例11と12) 、およびシーケン
シングが分解の最後に行われた合成ペプチドの10個のC
−末端残基のシーケンシング(実施例13) を可能にし
た。
【0055】
【発明の効果】上述のことから、本発明の種々の目的と
特徴がいかに合致しているかを評価できる。最初のアル
キル化反応を用いて標識をチオヒダントインに結合し、
例えばHPLCによって遊離したチオヒダントイン生成物を
検出するのに使用することができる。
特徴がいかに合致しているかを評価できる。最初のアル
キル化反応を用いて標識をチオヒダントインに結合し、
例えばHPLCによって遊離したチオヒダントイン生成物を
検出するのに使用することができる。
【0056】TH開裂反応は、ペプチド側鎖の望まない
改変を減らす穏和な条件下に行うことができる。同時に
反応は能率良く、完全に、またはほぼ完全に迅速に行う
ことができる。これは多分、主にアルキル化で生成した
イミダゾール様THに起因しており、および/または遊
離する芳香族TH環の安定性が高められたためであろ
う。
改変を減らす穏和な条件下に行うことができる。同時に
反応は能率良く、完全に、またはほぼ完全に迅速に行う
ことができる。これは多分、主にアルキル化で生成した
イミダゾール様THに起因しており、および/または遊
離する芳香族TH環の安定性が高められたためであろ
う。
【0057】開裂反応は隣りになるアミノ酸のチオヒダ
ントインの生成と対にすることができ、従って、繰り返
されるC−末端アミノ酸分析を一層能率良くすると共
に、シーケンシングを自動化システムで迅速に行うこと
を可能にする。組み合わさった長所により、決定される
C−末端残基の数をかなり増加することができる。以下
の実施例11−13に詳述したように、1.5 −3.6 ナノモル
だけのタンパク質の5−10個のC−末端残基をシーケン
スするための能力は、これまで入手できる他の方法を越
えた意義深い進歩である。
ントインの生成と対にすることができ、従って、繰り返
されるC−末端アミノ酸分析を一層能率良くすると共
に、シーケンシングを自動化システムで迅速に行うこと
を可能にする。組み合わさった長所により、決定される
C−末端残基の数をかなり増加することができる。以下
の実施例11−13に詳述したように、1.5 −3.6 ナノモル
だけのタンパク質の5−10個のC−末端残基をシーケン
スするための能力は、これまで入手できる他の方法を越
えた意義深い進歩である。
【0058】
【実施例】以下、実施例に基づき本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。これ
らの実施例において、次の略語は次に示すように定義さ
れる(もしも定義されていない場合は、一般に認められ
ている意味をもつ略語である)。 AAA …… アミノ酸分析、“BS3”…… スルホスクシ
ンイミジルスベレート、Boc またはt-BOC …… t−ブ
トキシカルボニル、BITC …… ベンゾイルイイソチオ
シアネート、CD3CN …… 重水素置換アセトニトリル、
CPG …… コントロール有孔ガラス、“DSS”…… ジ
スクシンイミジルスベレート、FMOC …… フルオレニ
ルメトキシカルボニル、HPLC …… 高性能液体クロマ
トグラフィー、ITC …… イソチオシアネート、MeCN
…… アセトニトリル (CH3CN)、MeOH …… メチル
アルコール (CH3OH)、NMP …… N−メチルピロリド
ン、NMR …… 1H核磁気共鳴、“スパロウ樹脂”…
… スパロウ博士によって調製されたポリアクリルアミ
ド樹脂、TEA …… トリエチルアミン、TFA …… トリ
フルオロ酢酸またはトリフルオロアセテート、TH ……
チオヒダントイン、TLC …… 薄層クロマトグラフィ
ー、TMS-N=C=S またはTMS-ITC …… トリメチルシリル
イソチオシアネート((CH3)3SiNCS)、WRK …… ウッド
ワーズ試薬K(2−エチル−5−フェニルイソキサゾリ
ウム−3´−スルホネート)。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。これ
らの実施例において、次の略語は次に示すように定義さ
れる(もしも定義されていない場合は、一般に認められ
ている意味をもつ略語である)。 AAA …… アミノ酸分析、“BS3”…… スルホスクシ
ンイミジルスベレート、Boc またはt-BOC …… t−ブ
トキシカルボニル、BITC …… ベンゾイルイイソチオ
シアネート、CD3CN …… 重水素置換アセトニトリル、
CPG …… コントロール有孔ガラス、“DSS”…… ジ
スクシンイミジルスベレート、FMOC …… フルオレニ
ルメトキシカルボニル、HPLC …… 高性能液体クロマ
トグラフィー、ITC …… イソチオシアネート、MeCN
…… アセトニトリル (CH3CN)、MeOH …… メチル
アルコール (CH3OH)、NMP …… N−メチルピロリド
ン、NMR …… 1H核磁気共鳴、“スパロウ樹脂”…
… スパロウ博士によって調製されたポリアクリルアミ
ド樹脂、TEA …… トリエチルアミン、TFA …… トリ
フルオロ酢酸またはトリフルオロアセテート、TH ……
チオヒダントイン、TLC …… 薄層クロマトグラフィ
ー、TMS-N=C=S またはTMS-ITC …… トリメチルシリル
イソチオシアネート((CH3)3SiNCS)、WRK …… ウッド
ワーズ試薬K(2−エチル−5−フェニルイソキサゾリ
ウム−3´−スルホネート)。
【0059】材料 これらの実施例では、ピリジン、塩化メチレン、アセト
ニトリル、トリエチルアミン、ベンゼンスルホニルクロ
ライド、トリメチルシリル ITC、およびベンゾイル ITC
はアルドリッチ・ケミカル社(ミルウォーキイ、WI) か
ら入手した。ロイシンエンケファリンは、シグマケミカ
ルカンパニー(セントルイス、ミズーリー63178)から入
手した。他のペプチド類、N−アセチルペプチド類、保
護アミノ酸、脱保護アミノ酸類はバケム・バイオサイエ
ンシーズ社(フィラデルフィア、PA) から入手したか、
または ABIにて標準方法によって調製した。核磁気共鳴
スペクトルはバリアン300で収集した。
ニトリル、トリエチルアミン、ベンゼンスルホニルクロ
ライド、トリメチルシリル ITC、およびベンゾイル ITC
はアルドリッチ・ケミカル社(ミルウォーキイ、WI) か
ら入手した。ロイシンエンケファリンは、シグマケミカ
ルカンパニー(セントルイス、ミズーリー63178)から入
手した。他のペプチド類、N−アセチルペプチド類、保
護アミノ酸、脱保護アミノ酸類はバケム・バイオサイエ
ンシーズ社(フィラデルフィア、PA) から入手したか、
または ABIにて標準方法によって調製した。核磁気共鳴
スペクトルはバリアン300で収集した。
【0060】実施例1 A.t-Boc-Leu-THの調製 5ミリモルのt-Boc-Leu を25mlのアセトニトリルに溶解
した。1当量とさらに10%過剰のエトキシカルボニルイ
ソチオシアネート(5.5ミリモル、0.649ml)および2当量
のピリジン(10ミリモル、0.833ml)を添加した。反応混
合物を2時間室温にて攪拌した。溶媒をロータリーエバ
ポレーターによって除去し、得られたオイルをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーを用いて、CH2Cl2:CH3OH
(9:1)の溶出で精製した。精製したBoc-保護 Leuチオヒ
ダントインは、1H-NMRスペクトロスコピー(器具:300M
HZバリアン、溶媒:CD3CN)によって確認した;特徴のあ
るピーク:9.7(-NH-プロトン)、4.4(-CH-環) 、1.87-
1.74(-CH2-)、0.86(CH3-)、および0.88(CH3-)。
した。1当量とさらに10%過剰のエトキシカルボニルイ
ソチオシアネート(5.5ミリモル、0.649ml)および2当量
のピリジン(10ミリモル、0.833ml)を添加した。反応混
合物を2時間室温にて攪拌した。溶媒をロータリーエバ
ポレーターによって除去し、得られたオイルをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーを用いて、CH2Cl2:CH3OH
(9:1)の溶出で精製した。精製したBoc-保護 Leuチオヒ
ダントインは、1H-NMRスペクトロスコピー(器具:300M
HZバリアン、溶媒:CD3CN)によって確認した;特徴のあ
るピーク:9.7(-NH-プロトン)、4.4(-CH-環) 、1.87-
1.74(-CH2-)、0.86(CH3-)、および0.88(CH3-)。
【0061】B.Leu-TH参照標準の調製 Leu チオヒダントインをt-Boc Leu から調製し、上記の
ように、Boc 保護基を除去して得られた。無水または水
性(25%) のTFA を用いて60℃にて30分間処理して全部
のN−タンパク質を十分に除去した。Leu-THを上記のよ
うにNMR によって分析した。特徴のあるピーク:9.35(-
NH-プロトン) 、8.05(-NH-)、4.16(-CH-環) 、1.78(-CH
-側鎖) 、1.58(-CH2-) 、0.93(CH3-)、および0.91(CH
3-)。
ように、Boc 保護基を除去して得られた。無水または水
性(25%) のTFA を用いて60℃にて30分間処理して全部
のN−タンパク質を十分に除去した。Leu-THを上記のよ
うにNMR によって分析した。特徴のあるピーク:9.35(-
NH-プロトン) 、8.05(-NH-)、4.16(-CH-環) 、1.78(-CH
-側鎖) 、1.58(-CH2-) 、0.93(CH3-)、および0.91(CH
3-)。
【0062】実施例2 ペプチジル−THの調製 A.モデルペプチドの調製 テストペプチドは、ABI モデル431Aペプチド合成器を用
いて標準ABI Fastmoc(登録商標)反応サイクルで、0.2
5ミリモルのスケールで合成した。最終の脱保護、開裂
および精製は標準方法によった。生成物はHPLCとアミノ
酸分析によって特定化した。 テストペプチドシーケンス: “GAPFLY”:Fmoc-GlyAlaProLysGlyLysGlyLysTyrPheLeu
Tyr “A14G” :Fmoc-AlaLysGlyLysGlyLysLeuPheTyrGlyLeu
PheTyrGly “A14L” :Fmoc-AlaLysGlyLysGlyLysGlyPheTyrLeuGly
PheTyrLeu “A15G” :Fmoc-AlaLysGlyLysLeuTyrPheGlyLeuTyrGln
PheGly ロイシンエンケファリン:TyrGlyGlyPheLeu B.アセチル-AlaAlaAla-TH の調製 0.2g(0.73 ミリモル) のアセチル-AlaAlaAlaを25mlのCH
3CN に懸濁させた。2当量のピリジン(0.12ml)および2
当量のエトキシカルボニルイソチオシアネート(0.2ml)
を添加し、混合物を一晩攪拌し、透明な均質溶液を生成
した。溶媒をロータリーエバポレーターで一部除去しオ
イルを生成した。アセチルAlaAlaAla-THをオイルからシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーによってCH2Cl2:CH3
OH (9.2:0.8)の溶出で精製した。精製したペプチジルチ
オヒダントインは1H-NMRスペクトロスコピー(器具:30
0MHzバリアン、溶媒:CD3CN)によって特定化した; 特徴
のあるピーク:6.02(1Hαプロトン、中間Ala)、4.6(-C
H-環) 、4.3(αプロトン、Ala)、1.88(アセチルCH3-プ
ロトン) 、1.42、1.32、1.2 (3組のAla CH3-) 。
いて標準ABI Fastmoc(登録商標)反応サイクルで、0.2
5ミリモルのスケールで合成した。最終の脱保護、開裂
および精製は標準方法によった。生成物はHPLCとアミノ
酸分析によって特定化した。 テストペプチドシーケンス: “GAPFLY”:Fmoc-GlyAlaProLysGlyLysGlyLysTyrPheLeu
Tyr “A14G” :Fmoc-AlaLysGlyLysGlyLysLeuPheTyrGlyLeu
PheTyrGly “A14L” :Fmoc-AlaLysGlyLysGlyLysGlyPheTyrLeuGly
PheTyrLeu “A15G” :Fmoc-AlaLysGlyLysLeuTyrPheGlyLeuTyrGln
PheGly ロイシンエンケファリン:TyrGlyGlyPheLeu B.アセチル-AlaAlaAla-TH の調製 0.2g(0.73 ミリモル) のアセチル-AlaAlaAlaを25mlのCH
3CN に懸濁させた。2当量のピリジン(0.12ml)および2
当量のエトキシカルボニルイソチオシアネート(0.2ml)
を添加し、混合物を一晩攪拌し、透明な均質溶液を生成
した。溶媒をロータリーエバポレーターで一部除去しオ
イルを生成した。アセチルAlaAlaAla-THをオイルからシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーによってCH2Cl2:CH3
OH (9.2:0.8)の溶出で精製した。精製したペプチジルチ
オヒダントインは1H-NMRスペクトロスコピー(器具:30
0MHzバリアン、溶媒:CD3CN)によって特定化した; 特徴
のあるピーク:6.02(1Hαプロトン、中間Ala)、4.6(-C
H-環) 、4.3(αプロトン、Ala)、1.88(アセチルCH3-プ
ロトン) 、1.42、1.32、1.2 (3組のAla CH3-) 。
【0063】注:中間 Alaのαプロトン (約4.3 ないし
6.0)に対して認められたダウンフィールドシフトは、チ
オヒダントイン環の近接C=Sによって生じた脱シール
ド異方性効果が原因であった。実施例3 固体支持体に結合したペプチドの調製 A.スパロウ樹脂に結合したペプチドの調製 10mgのスパロウ樹脂(7ミリ当量、NH2/mg樹脂) を1ml
のキャップの付いたチューブに、10%のTEA を含有する
0.5ml のCH3CN と共に入れて、10分間膨潤させた。液体
を除去し、樹脂をまず 0.5mlのCH3CN で洗浄し、続いて
0.5mlのN−メチルピロリドン ("NMP")によって洗浄し
た。12mg(3当量/樹脂のアミン)の二官能価の架橋試
薬、スルホスクシンイミジルスベレート ("BS3")を50μ
l のNMP-10% TEAに溶解した。予備溶解したBS3 溶液を
洗浄した樹脂に添加し、10分後5μl のピリジンを添加
し、室温にて1〜2時間、時々攪拌しながら反応させ
た。次に樹脂を3回、それぞれ0.5 mlのNMP を用いて洗
浄した。0.5 mlのNMP-10%ピリジン中のペプチド(約1
〜3当量/樹脂アミン)を添加し、一晩、室温にて振動
しながら反応させた。次に樹脂を2回、それぞれ 0.5ml
のNMP 、H2O 及びCH3CN を用いて洗浄し、サバントスピ
ードバク真空下に乾燥させた。吸着収量はアミノ酸分析
および/または Fmoc-ピペリジンアッセイによって決定
した。通常収率は約20〜100 ナノモルのペプチド/mg樹
脂の間で変化した。
6.0)に対して認められたダウンフィールドシフトは、チ
オヒダントイン環の近接C=Sによって生じた脱シール
ド異方性効果が原因であった。実施例3 固体支持体に結合したペプチドの調製 A.スパロウ樹脂に結合したペプチドの調製 10mgのスパロウ樹脂(7ミリ当量、NH2/mg樹脂) を1ml
のキャップの付いたチューブに、10%のTEA を含有する
0.5ml のCH3CN と共に入れて、10分間膨潤させた。液体
を除去し、樹脂をまず 0.5mlのCH3CN で洗浄し、続いて
0.5mlのN−メチルピロリドン ("NMP")によって洗浄し
た。12mg(3当量/樹脂のアミン)の二官能価の架橋試
薬、スルホスクシンイミジルスベレート ("BS3")を50μ
l のNMP-10% TEAに溶解した。予備溶解したBS3 溶液を
洗浄した樹脂に添加し、10分後5μl のピリジンを添加
し、室温にて1〜2時間、時々攪拌しながら反応させ
た。次に樹脂を3回、それぞれ0.5 mlのNMP を用いて洗
浄した。0.5 mlのNMP-10%ピリジン中のペプチド(約1
〜3当量/樹脂アミン)を添加し、一晩、室温にて振動
しながら反応させた。次に樹脂を2回、それぞれ 0.5ml
のNMP 、H2O 及びCH3CN を用いて洗浄し、サバントスピ
ードバク真空下に乾燥させた。吸着収量はアミノ酸分析
および/または Fmoc-ピペリジンアッセイによって決定
した。通常収率は約20〜100 ナノモルのペプチド/mg樹
脂の間で変化した。
【0064】B. CPGガラスビーズに結合したペプチド
の調製 100mgのコントロールした有孔ガラスビーズ("CPG")(100
0Å、40μモルアミン/gビーズ) をキャップ付き1mlの
エッペンドルフチューブに入れた。15mg(10当量/樹脂
アミン)の二官能価の架橋試薬ジスクシンイミジルスベ
レート("DSS")を5〜10%TEA を含有する 400μl のNMP
に溶解した。予備溶解したDSS 溶液を添加し、10分後
5μl のピリジンを添加し、1〜2時間室温にて反応を
進行させた。次にガラスビーズを3回、それぞれ0.5 ml
のNMP を用いて洗浄した。0.3mlのNMP-10%ピリジン中
のペプチド(1当量)を添加し、一晩室温にて振とうし
ながら反応させた。次に樹脂を NMP、H2O およびCH3CN
で洗浄し、サバントスピードバクで真空下に乾燥させ
た。吸着収量は、アミノ酸分析によって決定し、一般的
に1ナノモルペプチド/mgビーズであった。
の調製 100mgのコントロールした有孔ガラスビーズ("CPG")(100
0Å、40μモルアミン/gビーズ) をキャップ付き1mlの
エッペンドルフチューブに入れた。15mg(10当量/樹脂
アミン)の二官能価の架橋試薬ジスクシンイミジルスベ
レート("DSS")を5〜10%TEA を含有する 400μl のNMP
に溶解した。予備溶解したDSS 溶液を添加し、10分後
5μl のピリジンを添加し、1〜2時間室温にて反応を
進行させた。次にガラスビーズを3回、それぞれ0.5 ml
のNMP を用いて洗浄した。0.3mlのNMP-10%ピリジン中
のペプチド(1当量)を添加し、一晩室温にて振とうし
ながら反応させた。次に樹脂を NMP、H2O およびCH3CN
で洗浄し、サバントスピードバクで真空下に乾燥させ
た。吸着収量は、アミノ酸分析によって決定し、一般的
に1ナノモルペプチド/mgビーズであった。
【0065】実施例4 固体支持体に結合したペプチジル−THの調製 2mlCH3CN に62mg(0.25ミリモル)のウッドワーズ試薬
K("WRK":2−エチル−5−フェニルイソキサゾリウム
−3´−スルホネート) を懸濁させ、50μl(1当量、0.
25ミリモル)のジイソプロピルエチルアミン("DIEA" )
を添加して、溶液中にケテンイミンを生成した。懸濁液
は透明な黄色溶液(約15分間) になるまでモニターして
から使用した。
K("WRK":2−エチル−5−フェニルイソキサゾリウム
−3´−スルホネート) を懸濁させ、50μl(1当量、0.
25ミリモル)のジイソプロピルエチルアミン("DIEA" )
を添加して、溶液中にケテンイミンを生成した。懸濁液
は透明な黄色溶液(約15分間) になるまでモニターして
から使用した。
【0066】実施例3に述べたように、固体支持体(樹
脂またはガラスビーズ)に結合したペプチドを調製し
た。約0.1 〜1.0 μモルのペプチドを含む10〜100mg の
固体支持体を1mlのキャップ付きエッペンドルフチュー
ブ中に上記からの新しく生成した0.5 mlのケテンイミン
溶液に混合した。混合物を4時間続けて振とうしながら
室温にて反応させた。次に固体支持体を3回 CH3CNを用
いて洗浄した。
脂またはガラスビーズ)に結合したペプチドを調製し
た。約0.1 〜1.0 μモルのペプチドを含む10〜100mg の
固体支持体を1mlのキャップ付きエッペンドルフチュー
ブ中に上記からの新しく生成した0.5 mlのケテンイミン
溶液に混合した。混合物を4時間続けて振とうしながら
室温にて反応させた。次に固体支持体を3回 CH3CNを用
いて洗浄した。
【0067】0.5 mlのCH3CN 中10%のTMSITCを、上記で
生成した活性化カルボキシレート基をもつ固体支持体上
のペプチドに添加した。再び反応容器のふたをして一晩
室温で保管した。固体支持体を次に CH3CN、NMP、H2O
で洗浄し、再び CH3CNで洗浄し、サバントスピードバク
で真空下に乾燥させた。実施例5 Leu-THのPAM リンカーを用いた改変 上記の1Aで調製したt-BocLeuTHを2g(0.0074モル) 、
10mlの CH3CNに溶解した。1当量の4−(ブロモメチ
ル)−フェニル酢酸フェナシルエステル、"PAM"リンカ
ー(2.2g、0.0074モル) 、および1当量のTEA (1ml、0.
0072モル) を添加した。反応混合物を約60〜80℃まで8
分間加熱し、次に−20℃で一晩保管した。TEA・HBrの沈
澱を濾過によって除去し、上澄液を減圧下に濃縮し、オ
イルを生成した。オイルをTFA (100%) を用いて50℃で
45分間処理した。続いてTFA を完全に除去して白色固体
を生成した。この固体を溶解しシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーを用いてCH2Cl2:CH3OH(9: 1)の溶出で精
製し、生成物は約0.5 のrfを示した。精製した物質を上
記のようにNMR で分析した。その特徴のあるピーク:7.
89-7.23(芳香族) 、5.34(O-CH2-C=O) 、4.34(O-CH2-A
r)、4.1-3.9(CH- 環) 、3.74(Ar-CH2-C=O)、1.9-1.6(側
鎖-CH-および-CH2) 、0.905(2個のCH3-) 。
生成した活性化カルボキシレート基をもつ固体支持体上
のペプチドに添加した。再び反応容器のふたをして一晩
室温で保管した。固体支持体を次に CH3CN、NMP、H2O
で洗浄し、再び CH3CNで洗浄し、サバントスピードバク
で真空下に乾燥させた。実施例5 Leu-THのPAM リンカーを用いた改変 上記の1Aで調製したt-BocLeuTHを2g(0.0074モル) 、
10mlの CH3CNに溶解した。1当量の4−(ブロモメチ
ル)−フェニル酢酸フェナシルエステル、"PAM"リンカ
ー(2.2g、0.0074モル) 、および1当量のTEA (1ml、0.
0072モル) を添加した。反応混合物を約60〜80℃まで8
分間加熱し、次に−20℃で一晩保管した。TEA・HBrの沈
澱を濾過によって除去し、上澄液を減圧下に濃縮し、オ
イルを生成した。オイルをTFA (100%) を用いて50℃で
45分間処理した。続いてTFA を完全に除去して白色固体
を生成した。この固体を溶解しシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーを用いてCH2Cl2:CH3OH(9: 1)の溶出で精
製し、生成物は約0.5 のrfを示した。精製した物質を上
記のようにNMR で分析した。その特徴のあるピーク:7.
89-7.23(芳香族) 、5.34(O-CH2-C=O) 、4.34(O-CH2-A
r)、4.1-3.9(CH- 環) 、3.74(Ar-CH2-C=O)、1.9-1.6(側
鎖-CH-および-CH2) 、0.905(2個のCH3-) 。
【0068】実施例6 エチルブロモアセテートを用いたペプチジルTHの改変 100mg(0.31ミリモル) のアセチル-AlaAlaAla-TH を実施
例2に記載したように調製し、1mlのアセトニトリルに
溶解した。1モル当量(36.8μl)のエチルブロモアセテ
ートを1当量(43.7 μl)のTEA と共に添加した。反応は
60℃にて10分間進行させた。反応混合物を−20℃にて一
晩置いた。 TEA・HBR の沈澱を濾過によって除去し、上
澄液を減圧下に濃縮し、オイルを生成した。オイルを1H
NMR によって分析し、アセチル-(Ala)2-Ala-TH- エチル
アセテート付加物として確認した:4.7-4.15(αプロト
ン、Ala)、4.15(O-CH2-)、3.85(S-CH2-C=O) 、1.85(ア
セチル CH3-)、1.6、1.5、1.3(3組のAla CH3-) 、1.15
(O-CH2CH3)。
例2に記載したように調製し、1mlのアセトニトリルに
溶解した。1モル当量(36.8μl)のエチルブロモアセテ
ートを1当量(43.7 μl)のTEA と共に添加した。反応は
60℃にて10分間進行させた。反応混合物を−20℃にて一
晩置いた。 TEA・HBR の沈澱を濾過によって除去し、上
澄液を減圧下に濃縮し、オイルを生成した。オイルを1H
NMR によって分析し、アセチル-(Ala)2-Ala-TH- エチル
アセテート付加物として確認した:4.7-4.15(αプロト
ン、Ala)、4.15(O-CH2-)、3.85(S-CH2-C=O) 、1.85(ア
セチル CH3-)、1.6、1.5、1.3(3組のAla CH3-) 、1.15
(O-CH2CH3)。
【0069】注:真中のAla αプロトンの先に観察され
たダウンフィールドシフト(6.0) のロス、これは隣接す
るC=Sに起因する 注:これらの結果はまた、残りのTEA(トリエチルアミ
ン) およびTH出発物質の異性体からの複雑な共鳴信号を
含んでいた。実施例7 臭化ベンジルを用いたペプチジルTHの改変 エチルブロモアセテートの代りに一当量の臭化ベンジル
を用いて実施例6に記載した方法を行った。生成物は1H
NMR によって分析し、アセチル-(Ala)2-Ala-TH- ベンジ
ル付加物として確認した: 7.55-7.1(芳香族) 、4.8-4.
2(αプロトン、Ala)、4.35(S-CH2-Ala) 、1.85 (アセチ
ル CH3-)、1.6 、1.5 、1.3(3組のAlaCH3-) 。
たダウンフィールドシフト(6.0) のロス、これは隣接す
るC=Sに起因する 注:これらの結果はまた、残りのTEA(トリエチルアミ
ン) およびTH出発物質の異性体からの複雑な共鳴信号を
含んでいた。実施例7 臭化ベンジルを用いたペプチジルTHの改変 エチルブロモアセテートの代りに一当量の臭化ベンジル
を用いて実施例6に記載した方法を行った。生成物は1H
NMR によって分析し、アセチル-(Ala)2-Ala-TH- ベンジ
ル付加物として確認した: 7.55-7.1(芳香族) 、4.8-4.
2(αプロトン、Ala)、4.35(S-CH2-Ala) 、1.85 (アセチ
ル CH3-)、1.6 、1.5 、1.3(3組のAlaCH3-) 。
【0070】これらの結果もまた残りのTEA およびTH出
発物質の異性体からの複雑な共鳴信号を含んでいた。ペ
プチジルチオヒダントインの改変はまた、上に引用した
アルキル化試薬を単に換えて異なるアルキル化試薬を使
用して行うこともできる。このような試薬は開裂生成物
の検出を容易にするように標識をもつことが好ましい。
発物質の異性体からの複雑な共鳴信号を含んでいた。ペ
プチジルチオヒダントインの改変はまた、上に引用した
アルキル化試薬を単に換えて異なるアルキル化試薬を使
用して行うこともできる。このような試薬は開裂生成物
の検出を容易にするように標識をもつことが好ましい。
【0071】実施例8 TMSITCを用いた改変C−末端アミノ酸の開裂 アセチル-AlaAlaAlaTH- ベンジルを実施例7に上述した
ように調製し、CD3CNに溶解して、反応物と生成物のNMR
モニターを行った。数滴のTMSITCを添加して混合物を6
0℃にて1.5 時間加熱した。NMR スペクトルから、既知
のアセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加物と比較し
た。結果は、アセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加
物の両方が存在していた。アセチル-AlaAla-TH:6.08
(αプロトン、Ala)、1.8(アセチル CH3-)、1.43、1.32
(Ala CH3-); AlaTH-ベンジル付加物: 4.6(-CH2-Ar)、4.
5(-CH-)、1.5(Ala CH3)。
ように調製し、CD3CNに溶解して、反応物と生成物のNMR
モニターを行った。数滴のTMSITCを添加して混合物を6
0℃にて1.5 時間加熱した。NMR スペクトルから、既知
のアセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加物と比較し
た。結果は、アセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加
物の両方が存在していた。アセチル-AlaAla-TH:6.08
(αプロトン、Ala)、1.8(アセチル CH3-)、1.43、1.32
(Ala CH3-); AlaTH-ベンジル付加物: 4.6(-CH2-Ar)、4.
5(-CH-)、1.5(Ala CH3)。
【0072】実施例9 TMSITC/TFAを用いた改変C−末端アミノ酸の開裂 数滴のTFA を混合物に同様に添加した以外は、実施例8
に上述したようにアセチル-AlaAlaAlaTH- ベンジルを調
製し処理した。NMR でのモニターは60℃10分後にて、優
勢なものはアセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加物
であることを示した。
に上述したようにアセチル-AlaAlaAlaTH- ベンジルを調
製し処理した。NMR でのモニターは60℃10分後にて、優
勢なものはアセチル-AlaAla-THとAlaTH ベンジル付加物
であることを示した。
【0073】実施例10 TFAを用いた改変C−末端アミノ酸の開裂 アセチル-AlaAlaAlaTH- ベンジルを直接無水のTFA に溶
解し、60℃にて10分間加熱した。TFA をサバントスピー
ドバクを使用して除去し、生成物をNMR 分析のためにCD
3CN に溶解した。予想された信号が認められた。
解し、60℃にて10分間加熱した。TFA をサバントスピー
ドバクを使用して除去し、生成物をNMR 分析のためにCD
3CN に溶解した。予想された信号が認められた。
【0074】これらの結果を表1にまとめて示す。メチ
ル以外のR2 置換基では約1時間以内に開裂が完全に進
行しているが、R2 がメチルの場合には開裂がないこと
が認められる。
ル以外のR2 置換基では約1時間以内に開裂が完全に進
行しているが、R2 がメチルの場合には開裂がないこと
が認められる。
【0075】
【表1】
【0076】実施例11 アポミオグロビンの自動化C−末端シーケンシング この実施例ではアポミオグロビンの5個の末端アミノ酸
のC−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用を
示す。この方法ではDITCガラスに結合した4.3mgのアポ
ミオグロビン(約3.6 ナノモル) をシグマから購入し
た。5個のC−末端残基のアミノ酸配列は次に示す。 R−LeuGlyPheGlnGly C−末端カルボキシル基は実施例4の方法に似た方法で
反応させて、チオヒダントインを生成した。
のC−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用を
示す。この方法ではDITCガラスに結合した4.3mgのアポ
ミオグロビン(約3.6 ナノモル) をシグマから購入し
た。5個のC−末端残基のアミノ酸配列は次に示す。 R−LeuGlyPheGlnGly C−末端カルボキシル基は実施例4の方法に似た方法で
反応させて、チオヒダントインを生成した。
【0077】A.ペプチド活性化、改変および末端アミ
ノ酸開裂 このペプチドのC−末端チオヒダントインは、実質的に
無水のTMS-ITC を用いて改変チオヒダントインを開裂
し、続いてABI モデル477 パルス液気相自動化シーケン
サーを用いてC−末端方向からアミノ酸シーケンシング
に委ねた。
ノ酸開裂 このペプチドのC−末端チオヒダントインは、実質的に
無水のTMS-ITC を用いて改変チオヒダントインを開裂
し、続いてABI モデル477 パルス液気相自動化シーケン
サーを用いてC−末端方向からアミノ酸シーケンシング
に委ねた。
【0078】材料を、以下に工程の概略を示すが、最適
プログラムによって調整するように開裂サイクルに委ね
た。開裂した物質はアミノ酸付加物の分析のためオンラ
インHPLCに移した。C−末端アミノ酸(改変チオヒダン
トインの一部として)を開裂するため必要な工程を行う
ために要した時間は全体で約1時間であった。サイクル
において、プログラムによって指示したように、ペプチ
ジル−THを含む支持体をMeCN中10%のDEA で湿らせて、
次にアルゴンをフラッシュしてMeCNを除去した。アルキ
ル化剤、1−(ブロモメチル)−ナフタレンを1:1 MeCN
/NMP中で添加し、次に支持体をアルゴンでフラッシュし
てMeCNを除去し、系を10分間60℃で反応させた。手順を
繰り返して全TH基を改変させた。残りの反応物をMeCNで
系から洗い流し、続いてアルゴンをフラッシュしてMeCN
を除去した。
プログラムによって調整するように開裂サイクルに委ね
た。開裂した物質はアミノ酸付加物の分析のためオンラ
インHPLCに移した。C−末端アミノ酸(改変チオヒダン
トインの一部として)を開裂するため必要な工程を行う
ために要した時間は全体で約1時間であった。サイクル
において、プログラムによって指示したように、ペプチ
ジル−THを含む支持体をMeCN中10%のDEA で湿らせて、
次にアルゴンをフラッシュしてMeCNを除去した。アルキ
ル化剤、1−(ブロモメチル)−ナフタレンを1:1 MeCN
/NMP中で添加し、次に支持体をアルゴンでフラッシュし
てMeCNを除去し、系を10分間60℃で反応させた。手順を
繰り返して全TH基を改変させた。残りの反応物をMeCNで
系から洗い流し、続いてアルゴンをフラッシュしてMeCN
を除去した。
【0079】支持体上の改変ペプチジルTHを実質的に無
水のMeCN中、10%のTMS-ITC で処理し、次に生のTFA の
蒸気相を用いて、アルキル化C−末端アミノ酸THの開裂
に触媒作用を及ぼした。15分の反応時間後、開裂したア
ミノ酸誘導体を水中 100%のMeOHで支持体から洗い出
し、分離と同定のためにHPLCに移した。
水のMeCN中、10%のTMS-ITC で処理し、次に生のTFA の
蒸気相を用いて、アルキル化C−末端アミノ酸THの開裂
に触媒作用を及ぼした。15分の反応時間後、開裂したア
ミノ酸誘導体を水中 100%のMeOHで支持体から洗い出
し、分離と同定のためにHPLCに移した。
【0080】B.HPLC分離と同定: 改変したアミノ酸−THの分離はオンラインHPLCシステム
(モデル120A、ABI)を用いて行った。このシステムは狭
い口径のカラム(C-18、ABI PTC-カラム、220×2.1mm
、5ミクロン)を備える。流速は2000 psiの操作圧で
300μl/分であった。勾配溶出は2溶媒系:溶媒A=50
ミリモルの酢酸ナトリウム、pH=5.4、溶媒B=10%溶媒
A中、90%(容量/容量) のアセトニトリルを用いた。
12分後の7%Bで平衡になった後、試料をカラムに注入
し、溶媒を20分間60%Bまで直線勾配で供給した。次に
溶媒組成を5分で100 %Bまで傾斜をつけ、さらに5分
間同じ組成で保持した。溶出液を254nm でモニターし
た。
(モデル120A、ABI)を用いて行った。このシステムは狭
い口径のカラム(C-18、ABI PTC-カラム、220×2.1mm
、5ミクロン)を備える。流速は2000 psiの操作圧で
300μl/分であった。勾配溶出は2溶媒系:溶媒A=50
ミリモルの酢酸ナトリウム、pH=5.4、溶媒B=10%溶媒
A中、90%(容量/容量) のアセトニトリルを用いた。
12分後の7%Bで平衡になった後、試料をカラムに注入
し、溶媒を20分間60%Bまで直線勾配で供給した。次に
溶媒組成を5分で100 %Bまで傾斜をつけ、さらに5分
間同じ組成で保持した。溶出液を254nm でモニターし
た。
【0081】図7の7AはC−末端シーケンシング第1
ラウンドのHPLCプロフィルを示す。カラムに注いだ試料
は遊離した改変アミノ酸THを含んでいた。アミノ酸THの
ピークは既知の標準の改変アミノ酸THに対してHPLC上の
移動によって立証された。HPLCプロフィルの他のピーク
はサイクルからサイクルまで観察されたバックグラウン
ドピークである。
ラウンドのHPLCプロフィルを示す。カラムに注いだ試料
は遊離した改変アミノ酸THを含んでいた。アミノ酸THの
ピークは既知の標準の改変アミノ酸THに対してHPLC上の
移動によって立証された。HPLCプロフィルの他のピーク
はサイクルからサイクルまで観察されたバックグラウン
ドピークである。
【0082】C.繰返したシーケンシングサイクル 上記の反応シーケンスは、4ラウンドのシーケンシング
を通して繰り返され、それらの結果は図7の7B−図8
の7Eに示した。第2のアミノ酸チオヒダントインは容
易に Glnと同定され、第3のは Pheと、第4のは Gly
と、第5のは Leuと同定された。
を通して繰り返され、それらの結果は図7の7B−図8
の7Eに示した。第2のアミノ酸チオヒダントインは容
易に Glnと同定され、第3のは Pheと、第4のは Gly
と、第5のは Leuと同定された。
【0083】実施例12 β−ラクトグロブリンの自動化C−末端シーケンシング この実施例はβ−ラクトグロブリンの5個の末端アミノ
酸のC−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用
を示す。この方法では、ポリスチレン上の2.65mgのβ−
ラクトグロブリン(約1.5 ナノモル) を上記のようにポ
リスチレンに結合してシーケンスした。5個のC−末端
ペプチドのアミノ酸配列を次に示す。
酸のC−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用
を示す。この方法では、ポリスチレン上の2.65mgのβ−
ラクトグロブリン(約1.5 ナノモル) を上記のようにポ
リスチレンに結合してシーケンスした。5個のC−末端
ペプチドのアミノ酸配列を次に示す。
【0084】R−GluGlnCysHisIle ペプチドをポリスチレン樹脂に結合した後、N−末端と
リシンのイプシロンアミン基を介して、C−末端カルボ
キシル基を実施例の方法と同様の方法で反応させて、チ
オヒダントインを生成した。固体支持体上のポリペプチ
ドを実施例11に示した自動化シーケンサー工程を用い
て、5ラウンドのC−末端シーケンシングに委ねた。5
ラウンドのTH生成と開裂のHPLCプロフィルを図9−10
に、それぞれ示す。最初のアミノ酸チオヒダントインは
容易に Ileと同定され、第2のは Hisと、第3のは Cys
と、第4のは Glnと、第5のは Gluと同定された。
リシンのイプシロンアミン基を介して、C−末端カルボ
キシル基を実施例の方法と同様の方法で反応させて、チ
オヒダントインを生成した。固体支持体上のポリペプチ
ドを実施例11に示した自動化シーケンサー工程を用い
て、5ラウンドのC−末端シーケンシングに委ねた。5
ラウンドのTH生成と開裂のHPLCプロフィルを図9−10
に、それぞれ示す。最初のアミノ酸チオヒダントインは
容易に Ileと同定され、第2のは Hisと、第3のは Cys
と、第4のは Glnと、第5のは Gluと同定された。
【0085】実施例13 A15Gペプチドの自動化C−末端シーケンシング この実施例はペプチドA15Gの10個の末端アミノ酸のC
−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用を示
す。この方法では、ポリスチレン上の1.1mg のペプチド
(約2.5 ナノモル) を上述のようにシーケンスした。ペ
プチドのアミノ酸配列を次に示す。
−末端アミノ酸配列を決定するための方法の使用を示
す。この方法では、ポリスチレン上の1.1mg のペプチド
(約2.5 ナノモル) を上述のようにシーケンスした。ペ
プチドのアミノ酸配列を次に示す。
【0086】 Fmoc-AlaLysGlyLysLeuTyrPheGlyLeuTyrGlnPheGly ペプチドをポリスチレン樹脂に結合した後、C−末端カ
ルボキシル基を、実施例4の方法と同様の方法で反応さ
せ、チオヒダントインを生成した。固体支持体上のポリ
ペプチドを、実施例11に示した自動化シーケンサー工程
を用いて、10ラウンドのC−末端シーケンシングに委ね
た。10ラウンドのTH生成と開裂のHPLCプロフィルを図11
−14に示す。
ルボキシル基を、実施例4の方法と同様の方法で反応さ
せ、チオヒダントインを生成した。固体支持体上のポリ
ペプチドを、実施例11に示した自動化シーケンサー工程
を用いて、10ラウンドのC−末端シーケンシングに委ね
た。10ラウンドのTH生成と開裂のHPLCプロフィルを図11
−14に示す。
【0087】はっきりと検出できるアミノ酸チオヒダン
トインの信号は第9ラウンドまでのサイクルから得られ
た。本発明は特定の試薬および方法に関して述べてきた
が、他の種々の具体例、用途および試薬を本発明から離
れずに用いることができることは明らかであろう。
トインの信号は第9ラウンドまでのサイクルから得られ
た。本発明は特定の試薬および方法に関して述べてきた
が、他の種々の具体例、用途および試薬を本発明から離
れずに用いることができることは明らかであろう。
【図1】図1A−1Dは、アルキル化剤とペプチジルチ
オヒダントインを反応させて(1A)、付加物含有アシルチ
オヒダントインを生成し(1B)、付加物含有チオヒダント
インとTFA を反応させて、提案された中間体を経て、チ
オヒダントインを開裂し(1C)、開裂し短くなったペプチ
ドを生成する(1D)工程図である。
オヒダントインを反応させて(1A)、付加物含有アシルチ
オヒダントインを生成し(1B)、付加物含有チオヒダント
インとTFA を反応させて、提案された中間体を経て、チ
オヒダントインを開裂し(1C)、開裂し短くなったペプチ
ドを生成する(1D)工程図である。
【図2】図2A−2Dは、アルキル化剤とペプチジルチ
オヒダントインを反応させて(2A)、付加物含有アシルチ
オヒダントインを生成し(2B)、付加物含有チオヒダント
インとトリメチルシリルイソチオシアネート(TMS-ITC)
を反応させて、提案された中間体を経て、チオヒダント
インを開裂し(2C)、C−末端アミノ酸が対応するアシル
チオヒダントインに転換した開裂し短くなったペプチド
を生成する(2D)工程図である。
オヒダントインを反応させて(2A)、付加物含有アシルチ
オヒダントインを生成し(2B)、付加物含有チオヒダント
インとトリメチルシリルイソチオシアネート(TMS-ITC)
を反応させて、提案された中間体を経て、チオヒダント
インを開裂し(2C)、C−末端アミノ酸が対応するアシル
チオヒダントインに転換した開裂し短くなったペプチド
を生成する(2D)工程図である。
【図3】図3A−3Cは塩基中でアシルチオヒダントイ
ンを脱プロトン化し(3A)、脱プロトン化したアシルチオ
ヒダントインの可能な共鳴を生成する(3Bおよび3C) 工
程図である。
ンを脱プロトン化し(3A)、脱プロトン化したアシルチオ
ヒダントインの可能な共鳴を生成する(3Bおよび3C) 工
程図である。
【図4】図4A−4Bは脱プロトン化したアシルチオヒ
ダントイン(図3Bおよび3C) とアルキル化剤(XR´) を
反応させ、アルキル化(付加物含有)チオヒダントイン
の可能な共鳴形態(4Aと4B) を示す図である。
ダントイン(図3Bおよび3C) とアルキル化剤(XR´) を
反応させ、アルキル化(付加物含有)チオヒダントイン
の可能な共鳴形態(4Aと4B) を示す図である。
【図5】図5A−5Cは酸性条件下にアシルチオヒダン
トインを開裂した後、アルキル化チオヒダントインの可
能な共鳴形態を示す図である。
トインを開裂した後、アルキル化チオヒダントインの可
能な共鳴形態を示す図である。
【図6】図6は本発明によるペプチドのC−末端アミノ
酸シーケンシングを行う好ましい方法のための反応シー
ケンスを示す図である。
酸シーケンシングを行う好ましい方法のための反応シー
ケンスを示す図である。
【図7】図7の7A−7Cは、3.6 ナノモルのアポミオ
グロビンのC−末端シーケンシングにおける第1から第
5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムである。
グロビンのC−末端シーケンシングにおける第1から第
5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムである。
【図8】図8の7D−7Eは、同様に、3.6 ナノモルの
アポミオグロビンのC−末端シーケンシングにおける第
1から第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
アポミオグロビンのC−末端シーケンシングにおける第
1から第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
【図9】図9の8A−8Cは、1.5 ナノモルのβ−ラク
トアルブミンのC−末端シーケンシングにおける第1か
ら第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムである。
トアルブミンのC−末端シーケンシングにおける第1か
ら第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラムである。
【図10】図10の8D−8Eは、同様に1.5 ナノモル
のβ−ラクトアルブミンのC−末端シーケンシングにお
ける第1から第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラ
ムである。
のβ−ラクトアルブミンのC−末端シーケンシングにお
ける第1から第5までのサイクルの各HPLCクロマトグラ
ムである。
【図11】図11の9A−9Cは、2.5 ナノモルのA15
GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおける第1
から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおける第1
から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
【図12】図12の9D−9Fは、同様に2.5 ナノモル
のA15GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおけ
る第1から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラム
である。
のA15GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおけ
る第1から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラム
である。
【図13】図13の9G−9Iは、同様に2.5 ナノモル
のA15GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおけ
る第1から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラム
である。
のA15GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおけ
る第1から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラム
である。
【図14】図14の9Jは、同様に2.5 ナノモルのA15
GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおける第1
から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
GポリペプチドのC−末端シーケンシングにおける第1
から第10までのサイクルの各HPLCクロマトグラムであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 99:00 (72)発明者 ゲラルド・ゾン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サンカルロス,フィル ストリー ト 199
Claims (11)
- 【請求項1】 (a) アルキル化によってチオヒダントイ
ンに付加物を形成するために有効な条件下に、アシルチ
オヒダントインをアルキル化剤と接触させ;そして(b)
上記(a)からの付加物含有アシル−チオヒダントイン
を、実質的に無水の酸性条件下に開裂剤と反応させ、付
加物含有チオヒダントインを遊離すると共にアシル−チ
オヒダントイン結合を開裂させる各工程から成る、アシ
ルチオヒダントインにおけるアシル−チオヒダントイン
結合の開裂方法。 - 【請求項2】 前記接触が7よりも大きい有効pHで行わ
れる請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記アシルチオヒダントインが前記ペプ
チドのC−末端アミノ酸にて形成されたペプチジルチオ
ヒダントインであり、前記アシルチオヒダントインおよ
び遊離した付加物含有チオヒダントインが前記C−末端
アミノ酸の側鎖を含む請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 ポリペプチドのC−末端アミノ酸シーケ
ンシングに使用するため、前記開裂剤がイソチオシアネ
ートであり、前記開裂が終りから2番目のC−末端アミ
ノ酸を有するアシルチオヒダントインを生成するために
有効である請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記開裂剤がトリメチルシリルイソチオ
シアネートを含む請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 遊離したチオヒダントインが生成された
アミノ酸を同定する工程をさらに含む請求項4記載の方
法。 - 【請求項7】 アルキル化剤が検出できる標識を含む請
求項6記載の方法。 - 【請求項8】 (a) ポリペプチドのC−末端アミノ酸
を、アシル−チオヒダントイン結合によって終りから2
番目のC−末端アミノ酸に結合しているアシル−チオヒ
ダントインに転換し;(b) (a)のC−末端ペプチジルア
シル−チオヒダントインを、アルキル化によってチオヒ
ダントインに付加物を形成するために有効な条件下にア
ルキル化剤と接触させ;(c) 上記(b)からの付加物含有
アシル−チオヒダントインを、実質的に無水の酸性条件
下に開裂剤と反応させ、残っている短くなったポリペプ
チドから付加物含有チオヒダントインを遊離すると共
に、アシルチオヒダントイン結合を開裂させ;(d) 短く
なったポリペプチドのC−末端を、アシル−チオヒダン
トイン結合によって短くなったポリペプチドの終りから
2番目のC−末端アミノ酸に結合するアシル−チオヒダ
ントインに転換し;(e) 遊離したチオヒダントインを残
っている短くなったポリペプチドから分離して、遊離し
た生成物中のアミノ酸残基を同定し;そして(f) 各連続
的に短くなったポリペプチドを用いて (b)−(e) の工程
を繰り返す各工程から成るポリペプチドのC−末端アミ
ノ酸シーケンシング方法。 - 【請求項9】 (C) および(d) の工程を、開裂剤とし
て、実質的に無水の酸性イソチオシアネートまたはトリ
フルオロ酢酸とシリルイソチオシアネートの混合物を使
用して一緒にする請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 前記開裂剤がトリメチルシリルイソチ
オシアネートを含む請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 アルキル化剤が検出できる標識を含
み、前記同定が遊離した標識生成物のHPLCにおける
移動特性を既知の標準と比較することを含む請求項8記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/775,771 US5185266A (en) | 1991-10-15 | 1991-10-15 | Cleavage method for acyl thiohydantoins and use of the method in c-terminal peptide sequencing |
US07/775771 | 1991-10-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05322902A true JPH05322902A (ja) | 1993-12-07 |
JP2544286B2 JP2544286B2 (ja) | 1996-10-16 |
Family
ID=25105449
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4301618A Expired - Fee Related JP2544286B2 (ja) | 1991-10-15 | 1992-10-15 | アシルチオヒダントインのための開裂方法およびc−末端ペプチドシ―ケンシングへの該方法の使用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5185266A (ja) |
EP (1) | EP0537981B1 (ja) |
JP (1) | JP2544286B2 (ja) |
DE (1) | DE69225764T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5521097A (en) * | 1991-08-28 | 1996-05-28 | Seiko Instruments Inc. | Method of determining amino acid sequence of protein or peptide from carboxy-terminal |
US5432092A (en) * | 1991-12-03 | 1995-07-11 | City Of Hope | C-terminal peptide sequencing using diphenyl phosphoroisothiocyanatidate and pyridine |
US5998213A (en) * | 1991-12-03 | 1999-12-07 | City Of Hope | C-terminal sequencing of peptides which may include proline |
WO1993019082A1 (en) * | 1992-03-25 | 1993-09-30 | Garvan Institute Of Medical Research | Method for preparation of amino acid thiohydantoins |
US5602207A (en) * | 1993-01-11 | 1997-02-11 | The Perkin-Elmer Corporation | Support and method for immobilizing polypeptides |
US5665603A (en) * | 1993-07-26 | 1997-09-09 | The Perkin-Elmer Corporation | Thiohydantoin formation and selective modification of the carboxy terminus of an aspartic acid- and/or glutamic acid-containing protein |
EP0697112A4 (en) * | 1993-07-26 | 1998-07-29 | Hope City | SEQUEN AGE C-TERMINAL OF PEPTIDES THAT MAY CONTAIN PROLINE |
US5468843A (en) * | 1994-09-08 | 1995-11-21 | Perkin-Elmer | Acetic anhydride activation for C-terminal protein sequencing |
US5641685A (en) * | 1995-04-24 | 1997-06-24 | Smithkline Beecham Corporation | Method carboxy terminal protein or peptide sequencing |
US6277644B1 (en) * | 1999-03-22 | 2001-08-21 | Beckman Coulter, Inc. | Method for compositional tag sequencing |
US7611834B2 (en) * | 2005-09-30 | 2009-11-03 | Sandia Corporation | Methods and devices for protein assays |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62156562A (ja) * | 1985-09-26 | 1987-07-11 | ベツクマン・リサ−チ・インステイテユ−ト・オブ・ザ・シテイ・オブ・ホ−プ | ペプチドの逐次配列認定用試薬及び方法 |
US4935494A (en) * | 1988-11-15 | 1990-06-19 | City Of Hope | C-terminal peptide and protein sequencing |
US5051368A (en) * | 1990-06-29 | 1991-09-24 | Applied Biosystems, Inc. | Method for forming an amino acid thiohydantoin using an N-substituted ketenimine activator |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5066785A (en) * | 1988-11-15 | 1991-11-19 | City Of Hope | Carboxyl terminal peptide and protein sequencing |
US5041388A (en) * | 1989-12-21 | 1991-08-20 | Applied Biosystems, Inc. | C-terminal peptide sequencing, activated support and reagent system therefor, and method of producing the activated support |
US5049507A (en) * | 1989-12-21 | 1991-09-17 | Applied Biosystems, Inc. | Method of C-terminal peptide sequencing |
US5059540A (en) * | 1990-08-13 | 1991-10-22 | City Of Hope | Sequential C-terminal degradation of peptides and proteins using cleaving reagents such as sodium trimethylsilanolate or trimethylamine N-oxide |
-
1991
- 1991-10-15 US US07/775,771 patent/US5185266A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-13 DE DE69225764T patent/DE69225764T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-13 EP EP92309313A patent/EP0537981B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-15 JP JP4301618A patent/JP2544286B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62156562A (ja) * | 1985-09-26 | 1987-07-11 | ベツクマン・リサ−チ・インステイテユ−ト・オブ・ザ・シテイ・オブ・ホ−プ | ペプチドの逐次配列認定用試薬及び方法 |
US4935494A (en) * | 1988-11-15 | 1990-06-19 | City Of Hope | C-terminal peptide and protein sequencing |
US5051368A (en) * | 1990-06-29 | 1991-09-24 | Applied Biosystems, Inc. | Method for forming an amino acid thiohydantoin using an N-substituted ketenimine activator |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69225764D1 (de) | 1998-07-09 |
EP0537981A2 (en) | 1993-04-21 |
EP0537981B1 (en) | 1998-06-03 |
JP2544286B2 (ja) | 1996-10-16 |
US5185266A (en) | 1993-02-09 |
EP0537981A3 (en) | 1994-10-12 |
DE69225764T2 (de) | 1998-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2544286B2 (ja) | アシルチオヒダントインのための開裂方法およびc−末端ペプチドシ―ケンシングへの該方法の使用 | |
CA2105181C (en) | Compounds and methods for sequencing amino acids | |
JPS59150341A (ja) | タンパク質配列分析法および試薬 | |
US5049507A (en) | Method of C-terminal peptide sequencing | |
JP2602461B2 (ja) | アミノ酸チオヒダントイン法および試薬 | |
US5534440A (en) | Compounds and methods for sequencing amino acids | |
US5468843A (en) | Acetic anhydride activation for C-terminal protein sequencing | |
US5304497A (en) | Method of forming N-protected amino acid thiohydantoins | |
EP1267170A1 (en) | Method for characterising polypeptides | |
JP4627086B2 (ja) | タンパク質又はペプチドのc末端修飾法、c末端固定化法、及び解析法 | |
JPH06504378A (ja) | ジフェニルホスホロイソチオシアナチデートとピリジンを用いたペプチドc末端配列決定 | |
US7041472B2 (en) | Method for selectively collecting N-terminal peptide fragment of protein | |
JP4120580B2 (ja) | タンパク質のn末端フラグメントを選択的に回収する方法 | |
WO1992000284A2 (en) | Method for forming an amino acid thiohydantoin using an n-substituted ketenimine activator | |
JPH01250863A (ja) | タンパク質等のc末端アミノ酸の決定方法 | |
Bailey et al. | Strategies For Increasing The Sensitivity of N-Terminal Sequence Analysis | |
Tischio | Studies on Solid Phase Synthesis and Degradation of Polypeptides and Proteins | |
Chang | Protein sequence studies using chromophoric reagent | |
Walker | Protein and Peptide Sequence Determination | |
JPH0753481A (ja) | ペプチド又はアミノ酸の分離方法及びキット | |
JPH0291097A (ja) | プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法 | |
AU2002310610A1 (en) | Characterising polypeptides | |
JPH07504271A (ja) | ジアルキルチオカルバモイルハライドを用いるn末端ペプチド分解 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |