JPH0530966A - 金属キレート能を賦与した化学修飾酵素 - Google Patents
金属キレート能を賦与した化学修飾酵素Info
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- JPH0530966A JPH0530966A JP3123238A JP12323891A JPH0530966A JP H0530966 A JPH0530966 A JP H0530966A JP 3123238 A JP3123238 A JP 3123238A JP 12323891 A JP12323891 A JP 12323891A JP H0530966 A JPH0530966 A JP H0530966A
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- dfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生体内における多様な活性酸素種の発生を防
止する為、金属キレート剤と活性酸素分解能を有する酵
素とを組合せて、効率よく酸素傷害を防止する複合機能
をもった分子素子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅ）を創出すること。 【構成】 金属イオン除去能と活性酸素分解能を併せも
つ、金属キレート剤により化学修飾されたスーパーオキ
サイドジスムターゼを調製した。 【効果】 生体内における酸素傷害によって発生する不
整脈の抑制、肺及び心臓の浮腫の防止、制癌剤副作用軽
減、老化防止、発癌予防等への応用が考えられる。
止する為、金属キレート剤と活性酸素分解能を有する酵
素とを組合せて、効率よく酸素傷害を防止する複合機能
をもった分子素子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅ）を創出すること。 【構成】 金属イオン除去能と活性酸素分解能を併せも
つ、金属キレート剤により化学修飾されたスーパーオキ
サイドジスムターゼを調製した。 【効果】 生体内における酸素傷害によって発生する不
整脈の抑制、肺及び心臓の浮腫の防止、制癌剤副作用軽
減、老化防止、発癌予防等への応用が考えられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、金属イオン除去能と活
性酸素分解能を併せもつ、金属キレート剤により化学修
飾されたスーパーキオサイドジスムターゼに関する。
性酸素分解能を併せもつ、金属キレート剤により化学修
飾されたスーパーキオサイドジスムターゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】酸素は高等動物には必須な分子でありな
がら、ヒドロキシルラジカルや一重項酸素、スーパーオ
キサイド等の反応性の高い分子種を生じ、酸化分解等に
より、生体物質傷害、食品あるいは化成品の劣化をひき
おこす事が知られている。
がら、ヒドロキシルラジカルや一重項酸素、スーパーオ
キサイド等の反応性の高い分子種を生じ、酸化分解等に
より、生体物質傷害、食品あるいは化成品の劣化をひき
おこす事が知られている。
【０００３】特に生体においては、白血球等がこれらの
活性酸素を発生している。近年においては、キサンチン
−キサンチンオキシダーゼにより発生されるスーパーオ
キサイドが種々の活性酸素に変換される事実が明らかと
なり、下記に示すＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応が起って
いることが示された。
活性酸素を発生している。近年においては、キサンチン
−キサンチンオキシダーゼにより発生されるスーパーオ
キサイドが種々の活性酸素に変換される事実が明らかと
なり、下記に示すＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反応が起って
いることが示された。
【０００４】
【化１】
【０００５】特に、ヒドロキシルラジカルは、反応性が
高くこのラジカルが発生すればその周囲に存在するほと
んどの物質が多かれ少なかれ無差別に酸化されると考え
られる。
高くこのラジカルが発生すればその周囲に存在するほと
んどの物質が多かれ少なかれ無差別に酸化されると考え
られる。
【０００６】最近の研究によると、重金属イオンがこの
ような活性酸素の発生を増加させ、特に鉄イオンは下記
に示すように
ような活性酸素の発生を増加させ、特に鉄イオンは下記
に示すように
【０００７】
【化２】
【０００８】
【化３】
【０００９】触媒として働き、ヒドロキシルラジカルの
発生を大巾に増加させる働きがある。
発生を大巾に増加させる働きがある。
【００１０】これが、鉄触媒Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反
応である（Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．Ｇｕｔｌｅｒ
ｉｄｇｅ“Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”Ｐ１１８（１９
８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ
ｓｓ参照）。
応である（Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．Ｇｕｔｌｅｒ
ｉｄｇｅ“Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ”Ｐ１１８（１９
８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ
ｓｓ参照）。
【００１１】このヒドロキシルラジカル、スーパーオキ
サイドラジカル、過酸化水素等の活性酸素は、生体にお
いては老化、発ガン、炎症を、食品においては油脂や蛋
白質の劣化を、またファインケミカルにおいては分解や
機能の低下をひきおこす。
サイドラジカル、過酸化水素等の活性酸素は、生体にお
いては老化、発ガン、炎症を、食品においては油脂や蛋
白質の劣化を、またファインケミカルにおいては分解や
機能の低下をひきおこす。
【００１２】本発明はこのような活性酸素の効率的除去
による酸素傷害の防止と関連している。
による酸素傷害の防止と関連している。
【００１３】これら活性酸素の除去には、スーパーオキ
サイドジスムターゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、
グルタチオンパーオキシダーゼ、セルロプラスミン等の
酵素群が有効であり、特にスーパーオキサイドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤと略す）は、活性酸素に由来する疾患の治
療薬として注目を集めている。
サイドジスムターゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、
グルタチオンパーオキシダーゼ、セルロプラスミン等の
酵素群が有効であり、特にスーパーオキサイドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤと略す）は、活性酸素に由来する疾患の治
療薬として注目を集めている。
【００１４】例えば、虚血心を再灌流した直後に発生す
る不整脈に対して、ＳＯＤが有効なことはＢｅｒｎｉｅ
ｒらによって報告されている（Ｂｅｒｎｉｅｒ，Ｍ．，
Ｈｅａｒｓｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ａ．Ｓ．，
Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５８，３３１〜３４０（１９８６）
参照）。
る不整脈に対して、ＳＯＤが有効なことはＢｅｒｎｉｅ
ｒらによって報告されている（Ｂｅｒｎｉｅｒ，Ｍ．，
Ｈｅａｒｓｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ａ．Ｓ．，
Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５８，３３１〜３４０（１９８６）
参照）。
【００１５】さらに肺動脈閉塞、再灌流後に生じる肺水
腫をＳＯＤが抑制するとの報告もある（Ｍ．Ｊ．Ｈｏｒ
ｇａｎ，Ｈ．Ｌｕｍ，Ａ．Ｂ．Ｍａｌｉｋ，Ａｍ．Ｒｅ
ｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４０ １４２１〜１４２
８（１９８９））。
腫をＳＯＤが抑制するとの報告もある（Ｍ．Ｊ．Ｈｏｒ
ｇａｎ，Ｈ．Ｌｕｍ，Ａ．Ｂ．Ｍａｌｉｋ，Ａｍ．Ｒｅ
ｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４０ １４２１〜１４２
８（１９８９））。
【００１６】しかしＳＯＤを静脈投与した場合、急速に
血中より消失し効力を発揮する時間が短かいことから、
ポリアルキレンオキサイドで化学修飾したＳＯＤを調製
し（Ｈ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．Ｙｏ
ｋｏｙａｍａ，Ｙ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ａｓｐｅｃｔ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ，
Ｐ６１５〜６１８（１９８９）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃ
ｉ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，および特開昭６１−２４９３
８８参照）、ラットの再灌流不整脈がこれによってｉｎ
ｖｉｖｏでも有効に予防できることを報告されている
（Ｍ．Ｇａｌｃｉａ−Ａｌｖｅｓ，Ｙ．Ｋａｄｏｗａｋ
ｉ，Ｙ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｎｉｓｈｉ，Ｊａｐａ
ｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１，１９９〜２０９
（１９８９）参照）。
血中より消失し効力を発揮する時間が短かいことから、
ポリアルキレンオキサイドで化学修飾したＳＯＤを調製
し（Ｈ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．Ｙｏ
ｋｏｙａｍａ，Ｙ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ａｓｐｅｃｔ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ，
Ｐ６１５〜６１８（１９８９）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃ
ｉ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，および特開昭６１−２４９３
８８参照）、ラットの再灌流不整脈がこれによってｉｎ
ｖｉｖｏでも有効に予防できることを報告されている
（Ｍ．Ｇａｌｃｉａ−Ａｌｖｅｓ，Ｙ．Ｋａｄｏｗａｋ
ｉ，Ｙ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｎｉｓｈｉ，Ｊａｐａ
ｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１，１９９〜２０９
（１９８９）参照）。
【００１７】一方、前述したＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ反
応が鉄イオンの存在によって加速される事から明らかな
ように、鉄イオンの除去も、ヒドロキシルラジカル発生
の防止に有用と考えられる。Ｆｅｂｅｒらは、強力な鉄
キレート剤であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）の投与が
虚血後の心臓機能の回復に有効なことを示されている
（Ｎ．Ｅ．Ｆａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔ
ｔｉ，Ｈ．Ｓ．Ｊａｃｏｂ，Ｇ．Ｍ．Ｄｅｐｐｅｒ，
Ｇ．Ｍ．Ｇｒｏｓｓ，Ｃｉｒｃ・Ｒｅｓ．６３，３５１
〜３６０（１９８８）参照）。
応が鉄イオンの存在によって加速される事から明らかな
ように、鉄イオンの除去も、ヒドロキシルラジカル発生
の防止に有用と考えられる。Ｆｅｂｅｒらは、強力な鉄
キレート剤であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）の投与が
虚血後の心臓機能の回復に有効なことを示されている
（Ｎ．Ｅ．Ｆａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔ
ｔｉ，Ｈ．Ｓ．Ｊａｃｏｂ，Ｇ．Ｍ．Ｄｅｐｐｅｒ，
Ｇ．Ｍ．Ｇｒｏｓｓ，Ｃｉｒｃ・Ｒｅｓ．６３，３５１
〜３６０（１９８８）参照）。
【００１８】また薬物等による肺血管傷害に対して、Ｄ
ＦＯが有効であるとの報告もなされている（Ｇ．Ｏ．Ｔ
ｉｌｌ，Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐ
ｒｏｃ．４５，１３〜１８（１９８６））。
ＦＯが有効であるとの報告もなされている（Ｇ．Ｏ．Ｔ
ｉｌｌ，Ｐ．Ａ．Ｗａｒｄ，Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐ
ｒｏｃ．４５，１３〜１８（１９８６））。
【００１９】しかし、これまでの研究においてもＳＯＤ
の活性酸素除去能は完全でなく、その薬効についても必
ずしも十分とは云えない。これは、一つには生体内で発
生する酸素種が多様であり、一種の活性酸素消去剤だけ
ではこれらを完全に除くことが出来ないことを示唆して
いる。
の活性酸素除去能は完全でなく、その薬効についても必
ずしも十分とは云えない。これは、一つには生体内で発
生する酸素種が多様であり、一種の活性酸素消去剤だけ
ではこれらを完全に除くことが出来ないことを示唆して
いる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、多様
な活性酸素種を除去するため、金属キレート剤と活性酸
素分解能を有する酵素とを組合せて、効率よく酸素傷害
を防止する複合機能をもった分子素子（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を創出することにある。
な活性酸素種を除去するため、金属キレート剤と活性酸
素分解能を有する酵素とを組合せて、効率よく酸素傷害
を防止する複合機能をもった分子素子（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を創出することにある。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明は、金属キレート
剤とスーパーオキサイドジスムターゼを共有結合で結合
し協同的に働かすことによって解決する手段を提供する
ものである。
剤とスーパーオキサイドジスムターゼを共有結合で結合
し協同的に働かすことによって解決する手段を提供する
ものである。
【００２２】このためには、金属キレート剤とＳＯＤを
一定の距離をもって固定し、協同効果を発しうるものと
することが重要である。
一定の距離をもって固定し、協同効果を発しうるものと
することが重要である。
【００２３】本発明に用いられる、スーパーオキサイド
ジスムターゼの由来はヒトを含む哺乳類あるいは微生物
であってもよい。また大腸菌や酵母を用いる遺伝子組替
えによって調製された酵素であってもよい。金属キレー
ト剤としては、デフェロキサミン、ジアンチピリルメタ
ン、エチレンジアミン四酢酸、トリエタノールアミン等
が反応性の官能基を有する点から用い易い。
ジスムターゼの由来はヒトを含む哺乳類あるいは微生物
であってもよい。また大腸菌や酵母を用いる遺伝子組替
えによって調製された酵素であってもよい。金属キレー
ト剤としては、デフェロキサミン、ジアンチピリルメタ
ン、エチレンジアミン四酢酸、トリエタノールアミン等
が反応性の官能基を有する点から用い易い。
【００２４】また２，２′−ビピリジル等に適当な官能
基を賦与した誘導体も用いることが出来るが特に鉄に対
して特異性の高いデフェロキサミンが好ましい。
基を賦与した誘導体も用いることが出来るが特に鉄に対
して特異性の高いデフェロキサミンが好ましい。
【００２５】キレート剤を直接、酵素のアミノ基やカル
ボキシル基へ結合してもよいが、これらの化学修飾酵素
は血中寿命が短いのでスペーサーを介して結合させる方
がより好ましい。
ボキシル基へ結合してもよいが、これらの化学修飾酵素
は血中寿命が短いのでスペーサーを介して結合させる方
がより好ましい。
【００２６】金属キレート剤をスペーサーを介して酵素
に結合する際は、ポリアルキレンオキサイド（ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールあるいはそ
の共重合体等）、マレイン酸無水物を含む高分子、酸性
アミノ酸ポリマー、また多糖類をコハク酸等で修飾した
もの、あるいは蛋白質と架橋化剤の組合せ（例えばＪ．
Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｈ．Ｄｒｅｖｉｎ，Ｒ．Ａｘｅｎ，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３〜７３７（１９７
８）参照）等を用いることができる。
に結合する際は、ポリアルキレンオキサイド（ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールあるいはそ
の共重合体等）、マレイン酸無水物を含む高分子、酸性
アミノ酸ポリマー、また多糖類をコハク酸等で修飾した
もの、あるいは蛋白質と架橋化剤の組合せ（例えばＪ．
Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｈ．Ｄｒｅｖｉｎ，Ｒ．Ａｘｅｎ，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３，７２３〜７３７（１９７
８）参照）等を用いることができる。
【００２７】特にポリオキシエチレン類は、血中での金
属キレート−酵素結合体の寿命を有効に延長する特質を
持つことから特にスペーサーとして好ましい。
属キレート−酵素結合体の寿命を有効に延長する特質を
持つことから特にスペーサーとして好ましい。
【００２８】
【作用】本発明の化合物は、金属キレート能と活性酸素
分解能をもつことから、生体内における酸素傷害によっ
て発生する疾患、例えば炎症、虚血後再灌流時の梗塞部
位の拡大あるいは不整脈等の治療への応用が期待でき
る。さらに血中に存在する不要の鉄イオンの除去、酸素
ラジカルの発生の防止を通じて老化防止、発癌予防への
応用も考えられる。
分解能をもつことから、生体内における酸素傷害によっ
て発生する疾患、例えば炎症、虚血後再灌流時の梗塞部
位の拡大あるいは不整脈等の治療への応用が期待でき
る。さらに血中に存在する不要の鉄イオンの除去、酸素
ラジカルの発生の防止を通じて老化防止、発癌予防への
応用も考えられる。
【００２９】とりわけ、本発明の化合物特にＤＦＯと結
合した化学修飾ＳＯＤは、外傷や手術時の灌流傷害ある
いは薬物の作用等により生じる各臓器の浮腫、特に肺水
腫に対して有用である。その場合、本発明の化合物を手
術前あるいは手術中に直接投与、あるいは灌流液中に添
加する方法等により使用することにより効果が得られ
る。使用用量としてはかかる治療を必要とする患者に対
して患者当たり０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量
範囲で使用することができ、この用量は手術の状況、患
者の状態あるいは薬物等により予想される状況を考慮し
て変化させることができる。
合した化学修飾ＳＯＤは、外傷や手術時の灌流傷害ある
いは薬物の作用等により生じる各臓器の浮腫、特に肺水
腫に対して有用である。その場合、本発明の化合物を手
術前あるいは手術中に直接投与、あるいは灌流液中に添
加する方法等により使用することにより効果が得られ
る。使用用量としてはかかる治療を必要とする患者に対
して患者当たり０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの用量
範囲で使用することができ、この用量は手術の状況、患
者の状態あるいは薬物等により予想される状況を考慮し
て変化させることができる。
【００３０】また本発明の化合物は制癌剤によって生ず
る副作用の抑制に対しても有用である。各種の癌の治療
に用いられる化学療法剤、例えばアドリアマイシン、マ
イトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン等は強い
抗腫瘍効果を持つ反面、種々の副作用を示すことが知ら
れている。その場合、制癌剤を投与する前、または投与
直後より１日１〜２回程度本発明の化合物を投与するこ
とにより著しい副作用抑制効果が得られる。使用用量と
してかかる治療を必要とする患者に対して患者当たり
０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与するこ
とができ、制癌剤の使用量、患者の状態等、また当事者
が認める他の因子によって変化させることができる。
る副作用の抑制に対しても有用である。各種の癌の治療
に用いられる化学療法剤、例えばアドリアマイシン、マ
イトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン等は強い
抗腫瘍効果を持つ反面、種々の副作用を示すことが知ら
れている。その場合、制癌剤を投与する前、または投与
直後より１日１〜２回程度本発明の化合物を投与するこ
とにより著しい副作用抑制効果が得られる。使用用量と
してかかる治療を必要とする患者に対して患者当たり
０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与するこ
とができ、制癌剤の使用量、患者の状態等、また当事者
が認める他の因子によって変化させることができる。
【００３１】また、本発明の金属キレート能を賦与した
化学修飾酵素は、医療用として使用するものであり、塩
の形態であってもよく、例えば非経口投与として無菌溶
剤液で処方し、利用することができる。注射のための無
菌組成物は、例えば注射用蒸留水に緩衝剤、酸化防止剤
等を必要に応じて混合させたものによって調製される。
化学修飾酵素は、医療用として使用するものであり、塩
の形態であってもよく、例えば非経口投与として無菌溶
剤液で処方し、利用することができる。注射のための無
菌組成物は、例えば注射用蒸留水に緩衝剤、酸化防止剤
等を必要に応じて混合させたものによって調製される。
【００３２】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００３３】
【実施例１】
（１） デフェロキサミン（以下ＤＦＯと略す）（シグ
マ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）０．９９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を８
１ｍｌの０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶解させ、これにポリオキシエチレンをＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミドによって活性エステル化した活性
化α−カルボキシメチル−ω−カルボキシメトキシポリ
オキシエチレン（以下活性化ＰＯＥと略す）（平均分子
量約３０００ダルトン）（日本油脂（株）製）２．５ｇ
（８．８×１０−１ｍｍｏｌ）を添加し、素早く一様に
攪拌し、室温にて１時間放置し反応させた。その後反応
液は、分子量阻止５０００ダルトンの限外濾過膜ＹＭ５
（アミコン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により限外濾過をくり返
し、未反応のＤＦＯ，ＤＯＥ及び塩類を除去した。ａｓ
ａｈｉｐａｃｋ ＥＳ−５０２Ｎ（旭化成工業（株）
製）カラムを使用した反応生成物のクロマトグラフィー
の結果を図１に示す。
マ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）０．９９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を８
１ｍｌの０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶解させ、これにポリオキシエチレンをＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミドによって活性エステル化した活性
化α−カルボキシメチル−ω−カルボキシメトキシポリ
オキシエチレン（以下活性化ＰＯＥと略す）（平均分子
量約３０００ダルトン）（日本油脂（株）製）２．５ｇ
（８．８×１０−１ｍｍｏｌ）を添加し、素早く一様に
攪拌し、室温にて１時間放置し反応させた。その後反応
液は、分子量阻止５０００ダルトンの限外濾過膜ＹＭ５
（アミコン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）により限外濾過をくり返
し、未反応のＤＦＯ，ＤＯＥ及び塩類を除去した。ａｓ
ａｈｉｐａｃｋ ＥＳ−５０２Ｎ（旭化成工業（株）
製）カラムを使用した反応生成物のクロマトグラフィー
の結果を図１に示す。
【００３４】（２） （１）で得られた溶液を「Ｑセフ
ァロース、ハイパフォーマンス」（ファルマシア、Ｓｗ
ｅｄｅｎ）カラムを用いて分離し、図２に示すほぼ単一
なピークを単離した。その後（１）と同様ＹＭ５膜を用
いて脱塩、濃縮後、溶液をＨＣｌにてｐＨ２に調整し、
凍結乾燥し、５７０ｍｇの反応物を得た。このものにつ
き（４００ＭＨｚ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、
ＰＯＥとＤＦＯが一対一に結合したもの（ＰＯＥ−ＤＦ
Ｏ）であることを確認した。
ァロース、ハイパフォーマンス」（ファルマシア、Ｓｗ
ｅｄｅｎ）カラムを用いて分離し、図２に示すほぼ単一
なピークを単離した。その後（１）と同様ＹＭ５膜を用
いて脱塩、濃縮後、溶液をＨＣｌにてｐＨ２に調整し、
凍結乾燥し、５７０ｍｇの反応物を得た。このものにつ
き（４００ＭＨｚ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、
ＰＯＥとＤＦＯが一対一に結合したもの（ＰＯＥ−ＤＦ
Ｏ）であることを確認した。
【００３５】（３） （２）で得られたＰＯＥ−ＤＦＯ
を以下の方法に従って再び活性エステル化した。すなわ
ち、ＰＯＥ−ＤＦＯ １３００ｍｇ（０．３５６ｍｍｏ
ｌ）を無水ピリジン４．２ｍｌに溶解し、ＤＦＯ中のア
ミノ基を保護するためこの溶液にトリメチルシリルクロ
ライド（東京化成工業（株））０．１８４ｍｌ（１．４
２８ｍｍｏｌ）を攪拌下滴下した。滴下終了後、５時間
室温下で攪拌を続けた。得られた反応液より溶媒を留去
し、容器に付着した粘稠な生成物を４．２ｍｌのジメチ
ルホルムアミドに溶解させた。この反応液に、１６２ｍ
ｇ（１．４２８ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドと２９２ｍｇ（１．４２８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ′−
ジシクロヘキシルカルボジイミドを順次加え、３５℃で
一夜攪拌した。析出したウレアを除去した後、濾液を２
０ｍｌのジエチルエーテル中に滴下することにより生成
物を結晶化させた。この結晶性物質を高真空下で乾燥さ
せることによりＰＯＥ−ＤＦＯの活性エステル１２３５
ｍｇ（収率９５％）を得た。尚、ＰＯＥの再活性化は１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認した。
を以下の方法に従って再び活性エステル化した。すなわ
ち、ＰＯＥ−ＤＦＯ １３００ｍｇ（０．３５６ｍｍｏ
ｌ）を無水ピリジン４．２ｍｌに溶解し、ＤＦＯ中のア
ミノ基を保護するためこの溶液にトリメチルシリルクロ
ライド（東京化成工業（株））０．１８４ｍｌ（１．４
２８ｍｍｏｌ）を攪拌下滴下した。滴下終了後、５時間
室温下で攪拌を続けた。得られた反応液より溶媒を留去
し、容器に付着した粘稠な生成物を４．２ｍｌのジメチ
ルホルムアミドに溶解させた。この反応液に、１６２ｍ
ｇ（１．４２８ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドと２９２ｍｇ（１．４２８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ′−
ジシクロヘキシルカルボジイミドを順次加え、３５℃で
一夜攪拌した。析出したウレアを除去した後、濾液を２
０ｍｌのジエチルエーテル中に滴下することにより生成
物を結晶化させた。この結晶性物質を高真空下で乾燥さ
せることによりＰＯＥ−ＤＦＯの活性エステル１２３５
ｍｇ（収率９５％）を得た。尚、ＰＯＥの再活性化は１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認した。
【００３６】（４） Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｃ
ｙｔｅ由来ＳＯＤ（シグマ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、５００ｍ
ｇ（１５．６μｍｏｌ）２０８０ｕｎｉｔ／ｍｇを０．
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１０ｍｌに溶
解させ、これに上記（３）にて得られた活性化ＰＯＥ−
ＤＦＯ １０００ｍｇ（２７３．５μｍｏｌ）を添加
し、４℃にて１時間撹拌して反応させた。その後、この
溶液を分子量阻止３万の限外濾過膜ＹＭ３０（アミコ
ン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて脱塩、濃縮後、凍結乾燥を
行い、ＳＯＤにＰＯＥ−ＤＦＯが結合したもの、すなわ
ち、ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ５７３ｍｇを得た。尚、Ｓ
ＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ中のＳＯＤ含量を６６３ｎｍの吸
光度より求めると、３５８ｍｇ（タンパク収率７１．６
％）であった。
ｙｔｅ由来ＳＯＤ（シグマ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、５００ｍ
ｇ（１５．６μｍｏｌ）２０８０ｕｎｉｔ／ｍｇを０．
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１０ｍｌに溶
解させ、これに上記（３）にて得られた活性化ＰＯＥ−
ＤＦＯ １０００ｍｇ（２７３．５μｍｏｌ）を添加
し、４℃にて１時間撹拌して反応させた。その後、この
溶液を分子量阻止３万の限外濾過膜ＹＭ３０（アミコ
ン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて脱塩、濃縮後、凍結乾燥を
行い、ＳＯＤにＰＯＥ−ＤＦＯが結合したもの、すなわ
ち、ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ５７３ｍｇを得た。尚、Ｓ
ＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ中のＳＯＤ含量を６６３ｎｍの吸
光度より求めると、３５８ｍｇ（タンパク収率７１．６
％）であった。
【００３７】（５） 上記（４）で得られたＳＯＤ−Ｐ
ＯＥ−ＤＦＯの分析結果を以下に示す。
ＯＥ−ＤＦＯの分析結果を以下に示す。
【００３８】
ＳＯＤ活性値 １６２０ｕｎｉｔ／ＳＯＤ１ｍｇ当り
活性保持率 ７７．９％（活性収率５５．８％）
ＳＯＤ１分子当りの平均ＰＯＥ結合数４．５個
【００３９】尚、ＳＯＤ活性はマッコードらの方法
（Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ，Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４ ６０４９〜６０５５
（１９６９）参照）により測定し、ＳＯＤタンパク濃度
は６６３ｎｍの吸光度より求めた。また活性保持率は、
反応前のＳＯＤ活性値に対する保持率で求めた。
（Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ，Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４ ６０４９〜６０５５
（１９６９）参照）により測定し、ＳＯＤタンパク濃度
は６６３ｎｍの吸光度より求めた。また活性保持率は、
反応前のＳＯＤ活性値に対する保持率で求めた。
【００４０】ＳＯＤ１分子当りの平均ＰＯＥ結合数は、
元素分析を行い、Ｃ／Ｎ比を求めることにより算出し
た。
元素分析を行い、Ｃ／Ｎ比を求めることにより算出し
た。
【００４１】また、このものの「ＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ
ＷＸＬ」（東ソー（株）製）カラムを用いた分子量分布
を示すクロマトグラフィーの結果を図３に示す。
ＷＸＬ」（東ソー（株）製）カラムを用いた分子量分布
を示すクロマトグラフィーの結果を図３に示す。
【００４２】また、ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ中のＦｅ
３＋の除去能であるＤＦＯ活性はＫａｓａｉらの方法
（Ｙ．Ｋａｓａｉ，Ｔ．Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｚ．Ｔａｍ
ｕｒａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４７，３４〜３７（１９
７５））により確認した。
３＋の除去能であるＤＦＯ活性はＫａｓａｉらの方法
（Ｙ．Ｋａｓａｉ，Ｔ．Ｔａｎｉｍｕｒａ，Ｚ．Ｔａｍ
ｕｒａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４７，３４〜３７（１９
７５））により確認した。
【００４３】
【実施例２】ポリエチレングリコール平均分子量４００
０ダルトン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ，Ｃｏ）とモノ
クロル酢酸をアルカリ存在下トルエン溶媒中で反応さ
せ、α−カルボキシメチルポリエチレングリコールを得
た。生成物をイオン交換樹脂で精製したのち、塩化シア
ヌル、ひき続き、ＤＦＯと反応させて、下記の化合物を
得た。
０ダルトン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ，Ｃｏ）とモノ
クロル酢酸をアルカリ存在下トルエン溶媒中で反応さ
せ、α−カルボキシメチルポリエチレングリコールを得
た。生成物をイオン交換樹脂で精製したのち、塩化シア
ヌル、ひき続き、ＤＦＯと反応させて、下記の化合物を
得た。
【００４４】
【化４】
【００４５】この化合物を、実施例１で述べた方法によ
り、コハク酸イミドの活性エステルとした。
り、コハク酸イミドの活性エステルとした。
【００４６】上記のＤＦＯを末端に有するポリオキシエ
チレンの活性化エステル１６０ｍｇ（３４．４μｍｏ
ｌ）を遺伝子組替え法で作られたヒトＳＯＤ（宇部興産
（株）、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）３５ｍｇ（１．１μ
ｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
５）０．７ｍｌに加えた。実施例１に述べた方法と同様
に反応させたのち、脱塩凍結乾燥後、ＤＦＯを含むＳＯ
Ｄ修飾体４６ｍｇを得た。
チレンの活性化エステル１６０ｍｇ（３４．４μｍｏ
ｌ）を遺伝子組替え法で作られたヒトＳＯＤ（宇部興産
（株）、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）３５ｍｇ（１．１μ
ｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
５）０．７ｍｌに加えた。実施例１に述べた方法と同様
に反応させたのち、脱塩凍結乾燥後、ＤＦＯを含むＳＯ
Ｄ修飾体４６ｍｇを得た。
【００４７】反応収率：蛋白質として８２．３％
ＳＯＤ活性値 ４１００ｕｎｉｔ／ＳＯＤ１ｍｇ当り
ＳＯＤ活性収率 ８１．５％
【００４８】この分子量分布を図４に示す。但し、活性
値、蛋白質定量は実施例１に用いたマッコードの方法お
よび６７２ｎｍにおける吸光度によった。結合したＰＯ
Ｅ数は、ＳＯＤあたり４．０個であり、またＤＦＯのＦ
ｅ３＋キレート能は実施例１に用いた方法によって確認
した。
値、蛋白質定量は実施例１に用いたマッコードの方法お
よび６７２ｎｍにおける吸光度によった。結合したＰＯ
Ｅ数は、ＳＯＤあたり４．０個であり、またＤＦＯのＦ
ｅ３＋キレート能は実施例１に用いた方法によって確認
した。
【００４９】
【実施例３】Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ由来
ＳＯＤ（シグマ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）．３５ｍｇ（１．１μ
ｍｏｌ）２２２０ｕｎｉｔ／ｍｇを０．１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．５）０．７ｍｌに溶解させ、実施
例１と同様にして得られた活性化ＰＯＥ−ＤＦＯ ６０
ｍｇ（１６．４μｍｏｌ）を添加し、実施例１と同様に
して反応、脱塩、濃縮後、凍結乾燥し、ＳＯＤ−ＰＯＥ
−ＤＦＯ４４ｍｇを得た。ＳＯＤ含量を６７２ｎｍの吸
光度より求めると、１４．９ｍｇ（タンパク収率４２．
６％）であった。ＳＯＤ活性値を実施例１と同様にして
測定した。
ＳＯＤ（シグマ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）．３５ｍｇ（１．１μ
ｍｏｌ）２２２０ｕｎｉｔ／ｍｇを０．１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．５）０．７ｍｌに溶解させ、実施
例１と同様にして得られた活性化ＰＯＥ−ＤＦＯ ６０
ｍｇ（１６．４μｍｏｌ）を添加し、実施例１と同様に
して反応、脱塩、濃縮後、凍結乾燥し、ＳＯＤ−ＰＯＥ
−ＤＦＯ４４ｍｇを得た。ＳＯＤ含量を６７２ｎｍの吸
光度より求めると、１４．９ｍｇ（タンパク収率４２．
６％）であった。ＳＯＤ活性値を実施例１と同様にして
測定した。
【００５０】
ＳＯＤ活性値 ８００ｕｎｉｔ／ＳＯＤ１ｍｇ当り
活性保持率 ３６．０％（活性収率 １５．３％）
【００５１】また分子量分布を図５に示す。
【００５２】
【実施例４】スチレン−無水マレイン酸共重合体（以下
ＳＭＡ１０００と略す）（平均分子量１６００ダルト
ン、川原油化（株））１．０ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を
８ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解させ、これに
ＤＦＯ ０．８２ｇ（１．２６ｍｍｏｌ）を添加し、９
０℃で６時間攪拌を続けた。得られた反応液より溶媒を
濃縮した後、濾液を５０ｍｌのジエチルエーテル中に滴
下することにより、生成物を結晶化させた。この結晶性
物質を高真空下で乾燥させることにより、目的とするＤ
ＦＯを結合したスチレン−無水マレイン酸共重合体（以
下ＳＭ−ＤＦＯと略す）を０．８６ｇ得た。この物質の
赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ，ＫＢｒディスク
法）を測定し、１７８０ｃｍ−１（無水マレイン酸残基
ＣＯ伸縮振動）と１７００ｃｍ−１（スチレン残基
ＣＨ面外振動）（図６）の比から残存無水マレイン酸残
基の含有率を求めたところ、約４５％であった。
ＳＭＡ１０００と略す）（平均分子量１６００ダルト
ン、川原油化（株））１．０ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を
８ｍｌの無水ジメチルホルムアミドに溶解させ、これに
ＤＦＯ ０．８２ｇ（１．２６ｍｍｏｌ）を添加し、９
０℃で６時間攪拌を続けた。得られた反応液より溶媒を
濃縮した後、濾液を５０ｍｌのジエチルエーテル中に滴
下することにより、生成物を結晶化させた。この結晶性
物質を高真空下で乾燥させることにより、目的とするＤ
ＦＯを結合したスチレン−無水マレイン酸共重合体（以
下ＳＭ−ＤＦＯと略す）を０．８６ｇ得た。この物質の
赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ，ＫＢｒディスク
法）を測定し、１７８０ｃｍ−１（無水マレイン酸残基
ＣＯ伸縮振動）と１７００ｃｍ−１（スチレン残基
ＣＨ面外振動）（図６）の比から残存無水マレイン酸残
基の含有率を求めたところ、約４５％であった。
【００５３】遺伝子組替え法で作られたヒトＳＯＤ（宇
部興産（株））、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）６０ｍｇ
（１．８７５μｍｏｌ）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水
溶液（ｐＨ８．５）２．０ｍｌに溶解させ、これに上記
で得られたＳＭ−ＤＦＯ ５４ｍｇを添加し、室温にて
１時間攪拌して反応させた。その後、この溶液を分子量
阻止３万の限外濾過膜ＹＭ３０（アミコン、Ｕ．Ｓ．
Ａ．）を用いて脱塩、濃縮後、凍結乾燥を行い、ＳＯＤ
にＳＭ−ＤＦＯが結合したもの、すなわちＳＯＤ−ＳＭ
−ＤＦＯ５３ｍｇを得た。その分析結果を以下に示す。
部興産（株））、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）６０ｍｇ
（１．８７５μｍｏｌ）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水
溶液（ｐＨ８．５）２．０ｍｌに溶解させ、これに上記
で得られたＳＭ−ＤＦＯ ５４ｍｇを添加し、室温にて
１時間攪拌して反応させた。その後、この溶液を分子量
阻止３万の限外濾過膜ＹＭ３０（アミコン、Ｕ．Ｓ．
Ａ．）を用いて脱塩、濃縮後、凍結乾燥を行い、ＳＯＤ
にＳＭ−ＤＦＯが結合したもの、すなわちＳＯＤ−ＳＭ
−ＤＦＯ５３ｍｇを得た。その分析結果を以下に示す。
【００５４】
ＳＯＤ活性値 １４３０ｕｎｉｔ／ＳＯＤ１ｍｇ当り
活性保持率 ３７％
ＳＯＤ１分子当りの平均ＤＦＯ結合数 ２．１個
【００５５】但し、活性値、蛋白質定量は実施例１に用
いたマッコードの方法及び６７２ｎｍにおける吸光度に
よった。ＳＯＤ１分子当りの平均ＤＦＯ結合数はＦｅＳ
Ｏ４溶液を用いたＤＦＯ−鉄比色法により求め、併せて
ＤＦＯのＦｅ３＋キレート能も確認した。また、生成物
の確認は、ゲルろ過カラムを用いた液体クロマトグラフ
ィー（図７）及び電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用い
て行なった。また液体クロマトグラフィーからも示され
るようにＳＭ−ＤＦＯによる架橋型ＳＯＤの生成も認め
られた。
いたマッコードの方法及び６７２ｎｍにおける吸光度に
よった。ＳＯＤ１分子当りの平均ＤＦＯ結合数はＦｅＳ
Ｏ４溶液を用いたＤＦＯ−鉄比色法により求め、併せて
ＤＦＯのＦｅ３＋キレート能も確認した。また、生成物
の確認は、ゲルろ過カラムを用いた液体クロマトグラフ
ィー（図７）及び電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用い
て行なった。また液体クロマトグラフィーからも示され
るようにＳＭ−ＤＦＯによる架橋型ＳＯＤの生成も認め
られた。
【００５６】
【実施例５】実施例１にて得られたＳＯＤ−ＰＯＥ−Ｄ
ＦＯを用い、以下に示す実験を行った。
ＦＯを用い、以下に示す実験を行った。
【００５７】Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットをペントバルビタ
ール腹腔内投与により麻酔し、気管切開後人工呼吸下に
おき、第４肋間にて左胸を開胸した。続いて心嚢膜を破
り心臓を胸廓外に露出させた。
ール腹腔内投与により麻酔し、気管切開後人工呼吸下に
おき、第４肋間にて左胸を開胸した。続いて心嚢膜を破
り心臓を胸廓外に露出させた。
【００５８】冠状血管左前下行枝に直径４ｍｍの吸引杯
をとり付け、電気式吸引機により２００〜４００ｍｍＨ
ｇの陰圧をかけ血管閉塞を１５分間行った。吸引杯をは
ずすことにより再灌流を行い血流量を測定することによ
り血流が再開したことを確認した。その後、３０分間の
インターバルをおき同様の操作をもう一度繰り返した。
をとり付け、電気式吸引機により２００〜４００ｍｍＨ
ｇの陰圧をかけ血管閉塞を１５分間行った。吸引杯をは
ずすことにより再灌流を行い血流量を測定することによ
り血流が再開したことを確認した。その後、３０分間の
インターバルをおき同様の操作をもう一度繰り返した。
【００５９】薬物は以下に示すものを２回目の血管閉塞
の前に大腿静脈より投与した。
の前に大腿静脈より投与した。
【００６０】１群 生理食塩水
２群 ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ
【００６１】２群はＳＯＤ量で３ｍｇ／ｋｇの投与量と
なるように投与した。２回目の血流再開を確認した後、
心臓及び肺を摘出し、重量を測定し、Ｗｅｔ−Ｗｅｉｇ
ｈｔとし、これをさらに真空凍結乾燥して重量を測定
し、Ｄｒｙ−Ｗｅｉｇｈｔとした。これらから以下に示
す式により心臓及び肺の組織当たりの水分含量を計測し
た。
なるように投与した。２回目の血流再開を確認した後、
心臓及び肺を摘出し、重量を測定し、Ｗｅｔ−Ｗｅｉｇ
ｈｔとし、これをさらに真空凍結乾燥して重量を測定
し、Ｄｒｙ−Ｗｅｉｇｈｔとした。これらから以下に示
す式により心臓及び肺の組織当たりの水分含量を計測し
た。
【００６２】
【数１】
【００６３】結果を図８及び図９に示す。
【００６４】心臓、肺いずれもＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ
を投与した群ではＴｏｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ Ｗａｔｅ
ｒが有意に減少しており、明確な浮腫の抑制効果がみら
れた。ここでＳＯＤ１分子に対するＤＦＯの結合数は実
施例１（５）より４．５個と求められており、従ってＤ
ＦＯの投与量としては約０．３ｍｇ／ｋｇであり、すで
に浮腫抑制効果が知られているＤＦＯの投与量２０ｍｇ
／ｋｇ（Ｎ．Ｅ．Ｆｅｒｂｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｃｅｌ
ｌｏｔｔｉ，Ｈ．Ｓ．Ｊａｃｏｂ，Ｇ．Ｍ．ＤｅＰＰｅ
ｒ，Ｇ．Ｍ．Ｇｒｏｓｓ，Ｇｉｒｃ．Ｒｅｓ．６３，３
５１〜３６０（１９８８））よりもはるかに少ない投与
量できわめて顕著な効果が得られていることがわかる。
なお、有意差の検定はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定により、
コントロール群との比較を行った。
を投与した群ではＴｏｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ Ｗａｔｅ
ｒが有意に減少しており、明確な浮腫の抑制効果がみら
れた。ここでＳＯＤ１分子に対するＤＦＯの結合数は実
施例１（５）より４．５個と求められており、従ってＤ
ＦＯの投与量としては約０．３ｍｇ／ｋｇであり、すで
に浮腫抑制効果が知られているＤＦＯの投与量２０ｍｇ
／ｋｇ（Ｎ．Ｅ．Ｆｅｒｂｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｃｅｌ
ｌｏｔｔｉ，Ｈ．Ｓ．Ｊａｃｏｂ，Ｇ．Ｍ．ＤｅＰＰｅ
ｒ，Ｇ．Ｍ．Ｇｒｏｓｓ，Ｇｉｒｃ．Ｒｅｓ．６３，３
５１〜３６０（１９８８））よりもはるかに少ない投与
量できわめて顕著な効果が得られていることがわかる。
なお、有意差の検定はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定により、
コントロール群との比較を行った。
【００６５】
【実施例６】実施例１にて得られたＳＯＤ−ＰＯＥ−Ｄ
ＦＯ及び遺伝子組替え法で作られたヒトＳＯＤ（宇部興
産（株）、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）を用い、以下に示
す実験を行った。
ＦＯ及び遺伝子組替え法で作られたヒトＳＯＤ（宇部興
産（株）、４１４０ｕｎｉｔ／ｍｇ）を用い、以下に示
す実験を行った。
【００６６】ＣＤ−１（ＩＣＲ）系雄マウスを用いアド
リアマイシン群（「ＡＤＭ群」と略す）及びアドリアマ
イシンとＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯを併用した群（「ＡＤ
Ｍ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群と略す）、アドリアマイ
シンとＳＯＤを併用した群（「ＡＤＭ＋ＳＯＤ群」と略
す）（各ｎ＝１０）に対して１５ｍｇ／ｋｇのアドリア
マイシンを腹腔内に投与した。
リアマイシン群（「ＡＤＭ群」と略す）及びアドリアマ
イシンとＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯを併用した群（「ＡＤ
Ｍ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群と略す）、アドリアマイ
シンとＳＯＤを併用した群（「ＡＤＭ＋ＳＯＤ群」と略
す）（各ｎ＝１０）に対して１５ｍｇ／ｋｇのアドリア
マイシンを腹腔内に投与した。
【００６７】１群 コントロール群
２群 ＡＤＭ群
３群 ＡＤＭ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群
４群 ＡＤＭ＋ＳＯＤ群
【００６８】また、ＡＤＭ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群
とＡＤＭ＋ＳＯＤ群に対しては同じ日からＳＯＤ−ＰＯ
Ｅ−ＤＦＯ及びＳＯＤを４ｍｇ／ｋｇずつ１日１回尾静
脈内投与し、ＡＤＭ群には生理食塩液を１４日間静脈内
投与した。評価は２２日間の生存率の比較により行なっ
た（図１０）。各生存率を比較した結果、コントロール
群が９０％であったのに対し、ＡＤＭ群では１０％と生
存率が著しく低下した。それに対し、ＡＤＭ＋ＳＯＤ群
は２０％と、ＳＯＤによる効果が得られなかったが、Ａ
ＤＭ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群では、５０％と生存率
に顕著な効果が得られた。このようにＳＯＤ−ＰＯＥ−
ＤＦＯはアドリアマイシン投与による生存率を上昇させ
ることが明らかとなった。
とＡＤＭ＋ＳＯＤ群に対しては同じ日からＳＯＤ−ＰＯ
Ｅ−ＤＦＯ及びＳＯＤを４ｍｇ／ｋｇずつ１日１回尾静
脈内投与し、ＡＤＭ群には生理食塩液を１４日間静脈内
投与した。評価は２２日間の生存率の比較により行なっ
た（図１０）。各生存率を比較した結果、コントロール
群が９０％であったのに対し、ＡＤＭ群では１０％と生
存率が著しく低下した。それに対し、ＡＤＭ＋ＳＯＤ群
は２０％と、ＳＯＤによる効果が得られなかったが、Ａ
ＤＭ＋ＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ群では、５０％と生存率
に顕著な効果が得られた。このようにＳＯＤ−ＰＯＥ−
ＤＦＯはアドリアマイシン投与による生存率を上昇させ
ることが明らかとなった。
【００６９】
【発明の効果】本発明の金属キレート能を賦与したスー
パーオキサイドジスムターゼは、金属キレート能と活性
酸素分解能とを併せ持ち、多様な酸素種を除去すること
ができるので医薬産業上有用である。
パーオキサイドジスムターゼは、金属キレート能と活性
酸素分解能とを併せ持ち、多様な酸素種を除去すること
ができるので医薬産業上有用である。
【図１】実施例１におけるＰＯＥ−ＤＦＯ反応溶液のＨ
ＰＬＣチャートである。上段はＵＶ吸収（２２９ｎｍ）
下段は屈折率を示す。
ＰＬＣチャートである。上段はＵＶ吸収（２２９ｎｍ）
下段は屈折率を示す。
【図２】実施例１におけるＰＯＥ−ＤＦＯ単離溶液のＨ
ＰＬＣチャートである。上段はＵＶ吸収（２２９ｎｍ）
下段は屈折率を示す。
ＰＬＣチャートである。上段はＵＶ吸収（２２９ｎｍ）
下段は屈折率を示す。
【図３】実施例１におけるＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ溶液
のＨＰＬＣチャートである。
のＨＰＬＣチャートである。
【図４】実施例２におけるＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ溶液
のＨＰＬＣチャートである。
のＨＰＬＣチャートである。
【図５】実施例３におけるＳＯＤ−ＰＯＥ−ＤＦＯ溶液
のＨＰＬＣチャートである。
のＨＰＬＣチャートである。
【図６】実施例４におけるＳＭ−ＤＦＯのＩＲのスペク
トルを示している。
トルを示している。
【図７】実施例４におけるＳＯＤ−ＳＭ−ＤＦＯ溶液の
ＨＰＬＣチャートである。
ＨＰＬＣチャートである。
【図８】実施例５における心臓の組織あたりの水分含量
測定の結果を示している。
測定の結果を示している。
【図９】実施例５における肺の組織あたりの水分含量測
定の結果を示している。
定の結果を示している。
【図１０】実施例６における生存率の変化を示してい
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ａ６１Ｋ 37/50 ＡＤＤ
ＡＧＺ
(72)発明者 岩下 雄二
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の
素株式会社中央研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 金属キレート剤とスーパーオキサイドジ
スムターゼが結合した化合物 - 【請求項２】 金属キレート剤が反応基を有するスペー
サーを介してスーパーオキサイドジスムターゼと結合し
た化合物 - 【請求項３】 金属キレート剤がデフェロキサミン、ト
リエタノールアミン、ジアンチピリルメタン、またはエ
チレンジアミン四酢酸である請求項１または２記載の化
合物 - 【請求項４】 スペーサーが、ポリアルキレンオキサイ
ド、無水マレイン酸を含む重合体、多糖類、ポリアミノ
酸または蛋白質である請求項２記載の化合物
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3123238A JPH0530966A (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 金属キレート能を賦与した化学修飾酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3123238A JPH0530966A (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 金属キレート能を賦与した化学修飾酵素 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2418126A Division JPH04210591A (ja) | 1989-12-25 | 1990-12-21 | 金属キレート能を賦与した化学修飾酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0530966A true JPH0530966A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=14855619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3123238A Pending JPH0530966A (ja) | 1991-03-05 | 1991-03-05 | 金属キレート能を賦与した化学修飾酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0530966A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5600056A (en) * | 1994-06-20 | 1997-02-04 | Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha | Air/fuel ratio detection system for multicylinder internal combustion engine |
| US7720672B1 (en) | 1995-12-29 | 2010-05-18 | Wyse Technology Inc. | Method and apparatus for display of windowing application programs on a terminal |
-
1991
- 1991-03-05 JP JP3123238A patent/JPH0530966A/ja active Pending
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