JPH05264525A

JPH05264525A - 超臨界流体クロマトグラフ

Info

Publication number: JPH05264525A
Application number: JP5017914A
Authority: JP
Inventors: Terry A Berger; テリー・エー・バーガー; William H Wilson; ウィリアム・エイチ・ウィルソン
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1992-01-10
Filing date: 1993-01-08
Publication date: 1993-10-12
Also published as: DE69208449T2; US5340476A; EP0551594B1; EP0551594A1; DE69208449D1; US5322627A

Abstract

(57)【要約】【目的】非揮発性で置換活性のある物質を迅速にかつ高
制度に分離する充填カラムを備えた超臨界流体クロマト
グラフ。【構成】本発明は少なくとも内径が0.5mm の充填カラム
群を備える超臨界クロマトグラフで、少なくとも50,00
0、好ましくは100,000 の理論段数を得ることができ、
さらにカラムにわたる圧力降下は少なくとも25バーであ
る。出口圧力は背圧調整器によって制御する。カラム群
は直列に連結した複数の個別カラムから構成される。本
発明のー実施例では少なくとも25段／分の速度で分離さ
せ、100 段／分の速度が好ましい。これにより、充填カ
ラムを装備した超臨界クロマトグラフでも良好なカラム
効率を得ることができ、従来キャピラリカラム超臨界流
体クロマトグラフで分析することが困難だった物質の分
離を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は充填カラムの超臨界流体
クロマトグラフィー(SFC) およびその改良に関するもの
である。

【０００２】

【従来技術とその問題点】SFC は多年にわたってクロマ
トグラフィー分析に利用されてきた。例えば、充填カラ
ムをSFC に使用する1972年のJ. Chrom.,vl.68 、303 〜
323 ページを参照されたい。米国特許4,479,380 号に記
載されているように開管あるいはキャピラリカラムでSF
C 分析を実施することはかなり以前から知られている。
SFC は、濃密な(dense) ガスを移動相として使用するク
ロマトグラフィーのタイプの一般的な名称である。SFC
では、移動相は一般にその臨界点付近の温度および圧力
を受ける流体である。このような条件における流体は液
体に非常に近い密度を有するが、しばしば液体よりも大
きい溶質拡散特性を示す。SFC では、溶媒の強さは密度
によって変化し、圧力降下によって密度および保持勾配
が生じる。

【０００３】ガスクロマトグラフィー(GC)は一般に揮発
性化合物の複雑な物質の分析を可能にする非常に高い分
解能を示すものとして知られている。しかしながら、一
般に安定な揮発性化合物だけがGCによって好適に分析す
ることができ、選択性を劇的に変化させることは通常は
容易なことではない。しばしば、あるのサンプルを化学
的に誘導し、GCでの利用を可能にしていた。しかしなが
ら、これは必ずしも完全な解決策ではない。ある化合物
は他よりも完全に反応し、この可変の変換度合は不確か
な結果を生み出す。サンプル中のすべての溶質をGCにお
いて十分安定で、揮発性にするためには多くの反応が要
求である。しかし、分離した溶質はサンプル中の最初の
溶質ではないためにさらに結果を不確かなものにする。

【０００４】液体クロマトグラフィー(LC)は不安定で比
較的非揮発性の化合物の分析を可能にするものとして知
られているが、一般に分解能が低い分析手段と考えられ
ている。LCにおいて代表的に用いられる液体移動相に対
して良好に作動する選択的または高感度の検出器は比較
的少ない。そのため混合物中の成分を分離させるため、
効率の代わりに選択性の調整が利用されることが多い。
LCでは、複雑なサンプルを容易に分離させることができ
ない。複雑なサンプルを複数の部位に分離させ、各部位
に異なる前処理と分析手段を与えることが要求される。
これは高価で、時間のかかる分析となる。

【０００５】SFC はGCとLCの中間のものであると考えら
れている。一般に、充填カラムSFCは比較的短い分析時
間を実現する上で開管SFC よりも優れている。しかしな
がら、開管SFC カラムは同じ圧力降下(pressure drop)
においてより大きな理論段数を提供する。迅速な分析の
ために充填カラムが利用されるとき、そして高性能分離
のためにキャピラリカラムが要求されるときに許容され
る最大圧力降下が決定されると多くの人が考えてきた。
例えば、米国特許4,479,380 号を参照されたい。カラム
における圧力降下がかなり大きくなると容量因子(capac
ity factor) を増加させ、したがってブロードなピーク
が生じると信じられていた。1987年１月のChromatograp
hia,vl.23 、No.1、21〜25ページを参照されたい。1987
年のChromatographic vl.24 の51〜57ページでは、充填
SFC カラムを使用したカラム圧力降下の影響が論じられ
ている。３回の試験の圧力降下に対する理論段数対カラ
ム効率[N] をプロットしたグラフが示される図１では、
カラム効率が約20バールにおいては約25,000段という最
大値にあり、約25バール以上のより高い圧力において徐
々に減少している。

【０００６】1982年のAnal. Chem.,vl.54 、736 〜740
ページでは、高い圧力降下、例えば図３に示される184
バールにおいて、小粒径充填カラムを用いたSFC が報告
されている。しかしながら、このような圧力降下におい
てはカラム効率は18,750という理論段数であったことも
述べられている。

【０００７】

【発明の目的】本発明の目的は上述の問題点を解消し、
充填カラムSFC を用いて比較的非揮発性で置換活性のあ
る物質を迅速に分離し、高精度に検出することにある。

【０００８】

【発明の概要】本発明に係る充填SFC カラムによって、
比較的非揮発性で置換活性のある(labile)化合物を迅速
に分離することができ、良好な感度とカラム効率の組合
わせが得られることが見出された。このような結果は、
少なくとも約0.5mm の内径を備え、出口において背圧制
御装置によって制御される約25バールを超える圧力降下
を有する少なくとも約50,000の理論段数を提供するのに
十分な長さを有する充填SFC カラムの利用を含む本発明
によって得られることは予想されていなかった。本発明
は特許請求の範囲において指摘されており、そして添付
された図面を参照して次に説明される好適な実施例で明
らかとなる。

【０００９】

【発明の実施例】本発明は約0.5mm 以上の内径を有する
SFC のための充填カラム構造の利用を含む。カラムの内
径の上限は、例えば、ファインケミカル(fine chemical
s)の製造あるいはバイオテクノジー技術において利用さ
れる市販のクロマトグラフ寸法の１m に至るまでカラム
の内径を広い範囲で変化させることができる。内径の範
囲は、通常、約0.5mm 〜20cm、好ましくは１mm〜10cmの
範囲である。カラムの構造は一つの連続的な充填SFC カ
ラムで、図１に示されるように直列(series)に接続され
た複数のカラムによって組立てられていることが好まし
い。このようなカラムの数は特に重要ではないが、約３
から約20の範囲であることが多い。好適なカラムはLCに
利用されている充填カラムで、例えば、内径が4.6mm、
長さが200mm で、平均粒径5 μm のシリカ充填材料が充
填されたヒューレット・パッカード・カンパニー製のHy
persilカラム799/6SI −574 がある。

【００１０】カラム構造には好適なSFC 充填材料、例え
ばシリカ、アルミナその他の周知の適切な材料が充填さ
れる。充填材料は全体として硬い（非多孔性の）内部を
有する多孔質のコーティングが施された多孔性、薄膜状
(pellicular)またはビーズである。周知の接着相が粒子
に施される。充填粒子は通常は約0.5 μm 〜50μm の範
囲、好ましくは約1.5 μm 〜10μm の範囲の平均粒径を
有する。カラム構造の長さは充填物の粒径に関係する所
望の理論段数に基づいて決定される。概略の計算は、最
小単位理論段高さ(h_min) は平均充填物粒径の２倍に等
しい(h_min＝2 ×粒径) 。例えば粒径が約5 μm である
ならば、単段高さは約10μm である。理論段数が約30,0
00のカラムが望まれれば、カラムの長さは約30,000×10
μm ＝300,000 μm ＝30cmとなる。所望の理論段数は少
なくとも50,000でなければならず、本当の上限はないが
通常は約1,000,000 を超えない。好ましい範囲は約100,
000 〜約500,000 の理論段数である。

【００１１】前述したように、本発明は充填SFC カラム
を利用して迅速な分離を可能にする。少なくとも約50段
／秒、好ましくは約100 段／秒の分離速度を得ることが
できる。500 段／秒あるいはそれ以上の速度が実現でき
ることも期待される。

【００１２】図１には、二酸化炭素などの液化圧縮ガス
の供給等の流体供給源10は、流体中に溶解したモディフ
ァイヤ(modifier)の二成分混合物を製造するためのモデ
ィファイヤ貯蔵器14を有する質量流制御ポンプ12に接続
される。ポンプ12は固定ループ注入装置16から超臨界流
体を所望の質量流量で個別の充填SFC カラム18の入口に
供給する。被分離サンプルは固定ループ注入装置からシ
リンジ15によって導入される。適切なポンプはヒューレ
ット・パッカード・カンパニー製のHP1050ポンプ(isocr
atic pump)である。適切な固定ループ注入装置はマイク
ロリットル流れループを有するRheodyne製の Model 741
0 である。HP 150ポンプは通常は一時に一つの流体しか
処理できないので、二つの改良ポンプを使用し、これら
流体用の第１のポンプとモディファイヤ用の第２ポンプ
である。

【００１３】カラム18からの流出物はカラム20の入口に
入る。カラム20は、図１に示されるように破線の括弧内
に直列に接続された複数の個別カラム20が存在すること
を示す記号（ｎ) が付される。通常、（ｎ) は約１〜約
18あるいはそれ以上の範囲で変化する。カラム20の流出
物は最後の個別カラム22の入口に入る。個別カラム18か
ら22のグループは超臨界付近での操作に必要な温度を維
持するオーブン24中に配置される。好適なオーブンは、
例えば、ヒューレット・パッカード・カンパニー製のHP
5890クロマトグラフ・オーブンである。

【００１４】カラム18から22に使用されるカラムは前述
のHypersilカラムであればよい。これらカラムは寸法と
充填物が同等であってもよいし、必要に応じて一方また
は両方が変化させてもよい。例えば、シリカを充填した
５個のカラムとC₁₈の接着相でコーティングされたシリ
カを充填したカラム５個を使用することができ、あるい
は内径の異なるカラムを使用することもできる。最終の
カラム22からの流出物はクロマトグラムを生成する紫外
線(UV)検出器26に通される。好適な紫外線検出器は改良
されたフローセルを有するヒューレット・パッカード・
カンパニー製のHP1050 MWDである。カラム22からの流出
物はまた流体リストリクタ30によってGC検出器に通すこ
とができる。好適なGC検出器は水素炎イオン化検出器(F
ID) である。

【００１５】UV検出器26からの流出物は背圧制御バルブ
を通ってそこから従来から周知の流体回収のための適切
な手段に入る。背圧制御バルブ32はカラム22の出口から
流れてくる流体が所望の流体密度あるいはその付近にと
どまるようにカラム18から22の全体を通じて効果的に圧
力を制御する。これにより、直列の個別カラムよりなる
カラム構造全体にわたる溶媒和を保証する。本発明によ
ればカラム18の入口からカラム22の出口までの圧力降下
は約25バール以上で、約50〜約400 バールの範囲である
ことが好ましい。

【００１６】移動相はその臨界点にあるか、その臨界点
以上にある流体あるいは臨界点以下であるが圧力が変化
すると急激に密度が変化し、それらの密度に応じて溶解
力を変化させる流体であればよい。これについては以下
に十分に論じられる。移動相はカラム全体にわたって単
一の相でなければならない。移動相は純粋であるかある
いは添加剤を含む三成分流体よりなる変性流体(modifie
d fluid)であればよい。例えば、純粋な流体としては、
二酸化炭素、亜酸化窒素、六フッ化硫黄、フルオロホル
ム(CHF₃)などを含むがこれらに限定されるものではな
い。変性流体としては、メタノールその他のアルコール
類、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ヘキサンお
よび前述の純粋な流体の一つと混合された他の流体が含
まれる。変性流体は一以上のモディファイヤまたは一以
上の主要流体または一以上のモディファイヤと一以上の
流体を含むものでよい。三成分流体(tertiary)は三フッ
化酢酸、イソプロピルアミンまたは文献に記述された多
くの他の化合物などの極性添加剤を伴う前述の変性流体
としての任意の混合物を包含する。モディファイヤの有
用な濃度は、より高い濃度が有用なこともあるが０〜約
50％の範囲である。添加剤ははるかに低い濃度、すなわ
ち10^-5M から数％で使用されることが多い。

【００１７】非充填キャピラリカラムと本願明細書に記
載されている充填カラムの操作の比較は本発明を理解す
る上で示唆に富んでいる。クロマトグラフのカラムを通
るキャリヤガスの最適速度は移動相中の溶質の二成分拡
散係数とカラム中の拡散経路の長さによって決定され
る。比較可能な拡散経路の寸法は、キャピラリの内径と
充填粒子の外径の２倍である。例えば、内径10μm のキ
ャピラリカラムは直径5 μm の粒子が充填された充填カ
ラムとほぼ同等の効率を有する。最適の線速度は同じ
で、単位長さ当たりの段数も同じである。これは、速度
と分解能は同じであることを意味する。しかしながら、
注入することのできるサンプルの量は非常に異なる。キ
ャピラリ中では注入できる最大量はカラムの内径の三乗
に比例する。この量は非常に小さい数となる傾向がある
が、注入できる量は非常に小さい数である。内径10μm
のキャピラリは２〜300 ピコ( 10^-12)リットル以上の注
入には耐えることができない。これに反して、充填カラ
ム中の最大注入体積は単一の粒子の寸法とは関連がな
い。その代わりに、ただ一つの最も重要な寸法はカラム
の内径で、これは粒子の直径よりも何桁も大きい可能性
がある。例えば内径4.6mm の充填カラムに少なくとも5
μl （および恐らく50μl ）を注入することができる。
この体積は単位長さ当たりの同じカラム効率を有するキ
ャピラリに注入することのできる体積の10⁴〜10⁵倍で
ある。例えば、充填カラムは少なくとも比較的濃厚でな
い溶質の量を検出する可能性を有する（同様な質量検出
だがはるかに大きな容積) 。

【００１８】10μm の細いキャピラリは製造することも
再現性よく利用することは困難なので滅多に使用されな
い。その代わりに、最も一般的なSFC キャピラリは内径
約50μm である。この型のカラムは5 μm の充填物の最
適線速度の1/5 の最適線速度を有する（拡散経路は５倍
長いので充填物は1/5 の速度で移動しなければならな
い）。また、同じ全効率を得るのに５倍長いカラムを必
要とする。例えば、典型的な内径50μm のキャピラリカ
ラムは5 μm の粒子を含む同じ効率を有する充填カラム
よりも25倍遅く、105 倍感度が低い。

【００１９】本発明は予想できないやり方で以前から存
在している成分の利用を可能とした。LCのために製造さ
れた標準カラムは、短い長さのキャピラリを使用して単
純に直列に接続した。スタック全体をガスクロマトグラ
フのオーブン中に置き、温度を自動的に調節した。二酸
化炭素中のメタノールと純粋な二酸化炭素との混合物を
クロマトグラフの移動相として使用した。出口圧力と流
量を制御した。ポンプにより2ml ／分の流量で5 μm の
粒子を充填した11個のカラム（全長さ2.2m）を通過する
圧力降下は流体の温度、圧力および組成に応じて100 〜
165 バールであった。高温度および低温度のどちらも有
用であるが、28〜100 ℃の範囲の温度を適用した。65〜
180 バールの出口圧力も試みられたが、やはりもっと広
い範囲の圧力が有用である。流量も0.5 〜4.5ml ／分の
範囲（最適値の約0.25〜２倍の線速度）で変化させた
が、やはりもっと広い範囲の流量が有用である。いかに
指摘するように流体は厳密に超臨界流体である必要はな
い。

【００２０】カラムは非常に高い効率を示した。理論段
についての次の式を利用して、使用される各カラムは個
々に少なくとも約20,000段を生み出した。Ｎ＝6.28(t_R/W_E)² この式においてＮは理論段数、 t_Rは溶質の保持時間、
W_Eはこの同じピークの面積／高さである。この面積／
高さの測定は半分の高さにおけるピーク幅と同様である
が、テーリングなどのピークの歪みをより正確に測定す
ることができる。最も近代的な記録積分器は半値幅の代
わりに面積／高さを利用する。この差異は定数の小さい
変化を必要とする（半値幅について使用される5.54の代
わりに6.28）。

【００２１】図２は直列に接続させたHypersil LC カラ
ム10個を使用して得られたクロマトグラムである。サン
プルはレモン油である。移動相は2ml ／分で供給し、31
5 バールの入口圧力および150 バールの出口圧力で、60
℃で二酸化炭素中に５％のメタノールを含むものを用い
た。流体の密度は入口で約0.9 であり、出口で約0.8で
ある。図示されているように、非常にシャープなピーク
が得られた(NV −0006.D:MWDC 、Sig ＝270 、4Ref＝45
0,80) 。ＡからＧまでの代表的なピークが図２に示され
ており、式Ｎ＝6.28(t_R/W_E)²を利用して次のように理
論段数を算出した。Ａ：79,000段、Ｂ：143,000 段、
Ｃ：141,000 段、Ｄ：164,000 段、Ｅ：223,700 段、
Ｆ：178,000 段およびＧ：257,000 段。

【００２２】移動相としての純粋な二酸化炭素と変性二
酸化炭素では、粘度は通常の液体よりもはるかに低い。
最適の線速度は、２〜2.5ml ／分のポンプにおける流れ
で得られた。圧力降下はこれらの流量において平均して
実質的に20バール／カラム以下であった（LCに比較し
て、３倍高い流れで1/4 の圧力降下）。同時に、効率は
非常に高く、理論値に対して平均して100 ％であった。
いくつかの離れたものは、1.43という低い段高さが測定
された。LC理論は、充填カラムSFC に十分に適合してい
ると考えられない。

【００２３】多数のカラムが直列に接続されるときに効
率が低下しないのは驚くべきことである。LCにおいては
わずか２〜３個のカラムを直列に接続して圧力降下が非
常に大きかった。もっと多くのカラムが使用されると
き、圧力降下はポンプ装置の圧力能力を超えるまで増加
傾向を示す。一つのカラムについての圧力降下はLCにお
いては相当に高いので、大抵の研究者はカラムを直列に
接続することを避ける傾向がある。それを試みた人達は
効率の重大な低下を経験してきた。別々に使用されるLC
カラムのそれぞれの効率の総和は直列に接続されたカラ
ムの観測する全効率よりもずっと高い。したがって、カ
ラムの長さが増加すると、効率は予想以上にゆっくりと
増加する。しかしながら、分析時間はカラムの長さに直
接に比例するので比較的に劣化な性能を得るのにより長
い時間がかかる。

【００２４】分離可能なピークの数は理論段の数の平方
根に比例する。これは、２倍多くのピークを分離するた
めには段の数を４倍だけ増加しなければならないことを
意味する。LCでは、解析するピークをこのように２倍に
することは非常に困難であり、カラムが４倍長くなり、
圧力降下が過大になる傾向を示すことが必要なためであ
る。一般的な解決策は、LCは効率の低い技術であること
を受入れ、特定の溶質対を分離するために選択性の調節
に全力を注ぐことである。

【００２５】LCにおいては順相カラムは通常あまり効果
がなく、直列に接続されると効率が低下し、そして全効
率を増加させる能力は非常に制約される。本発明におけ
るSFC の利用では、これらの制約は一つも適合しないと
考えられる。それぞれのカラムは非常に効率が高い。カ
ラムが直列に接続されるとき効率の低下がない。それぞ
れのカラムを通過しての圧力降下は最小となる。全圧力
降下が大きいことはピークの形状に悪影響を及ぼさな
い。段の総数は少なくとも３倍多くのピークが分離でき
る程度の大きさだけ増加させることができる。おこなっ
た実験から少なくとも400,000 段を有するカラムを作る
ことができる。典型的な順相LCカラムは、分配率(K')の
10個当たりの約17ピークをベースライン分離することが
できる10,000段を示す（すなわち、K'＝１とK'＝10の間
で16.7ピーク、K'＝10とK'＝100 の間で16.7ピークな
ど）。400,000 段のときに10個のK'について105 のピー
ク（K'＝１とK'＝10との間で105 ピークなど）を分離す
ることができる。

【００２６】SFC という用語の定義に関しては当該技術
分野で一致が得られていない。ある研究者はすべての臨
界値以下の操作はLCでありSFC の一部ではないことを主
張してきた。これは必ずしも正しくない。臨界値以下で
あるが流体が超臨界流体と全く同じ挙動を示す温度およ
び圧力の大きな領域がある。SFC は濃密なガスである移
動相を使用した一種のクロマトグラフィーに対する一般
的な名称である。IUPAC の定義の下では、使用される流
体はある時は液体で、ある時はガスである。しかしなが
ら、これらの定義は問題の領域においてあまり明確では
ない。利用できる体積を充満するように膨張する流体と
してのガスという定義を利用して、流体（二酸化炭素な
ど）が高い密度において著しくガスのように作用すると
いう条件の下で流体は臨界値以下であることも超臨界値
であることもできる。膨張のあとには圧力および密度の
低下を伴う。液体とは利用できる体積を充満しないで特
定の温度および圧力において特徴的な体積を有する流体
である。超臨界領域の近辺にある流体はIUPAC の定義に
従って液体として技術的に定義することができるが、前
述の定義を利用してむしろガスのような挙動を示す。こ
の領域における流体を利用することによってLCと異なる
クロマトグラフィーが得られる。最も注目すべき差異と
して、流体の圧縮性とカラムを通過する流体の不均一な
溶媒和力が含まれる。LCにおいてはカラム全体が実質的
に均一な条件の下で操作される。溶解力はあらゆる場合
に同じである。流体の組成が時間に対して変化する勾配
溶離LCにおいてさえも、変化の速度は一般に移動相の溶
解力はカラムを通過する間はほとんど一定であるように
十分小さい。SFC においては、溶解力は密度とともに変
化し、そして圧力降下は密度と保持の勾配を生成させ
る。臨界値以下の流体と超臨界流体の両方がこのような
勾配を生成させることができる。本発明の方法および装
置に適用されるのは効率の低下なしのこの種の挙動であ
る。

【００２７】

【発明の効果】キャピラリGCの高いカラム効率はLCの選
択性調整とサンプル容量によって達成することができ
る。キャピラリの代わりに充填カラムを使用することに
より、本発明は大容量の完全ループ注入を内径の大きい
充填SFC カラムに行うことができるようにして、キャピ
ラリカラムについて共通する精度と領域再現性が劣ると
いう問題を解消する。大容量注入は比較的低い濃度があ
る種の検出器（例えば、質量検出器）によって検出する
ことができ、感度がより高い分析をもたらす。最後に出
口圧力は大抵のキャピラリカラムに使用されている固定
リストリクタの代わりに背圧調整器を利用して制御する
ことができる。これにより、フロー・コントロール・モ
ードでのポンプの使用が可能になり、比較的長時間にわ
たる保持時間の再現性の改善と最適線速度における操作
がもたらされる。本発明は特定の実施例に基づいて例示
してきたが、本願明細書に記載される本発明の原理から
外れることなく変更がおこなうことが可能であることは
当業者にとって自明のことである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のー実施例である超臨界流体クロマトグ
ラフの概略図。

【図２】本発明のー実施例である超臨界流体クロマトグ
ラフで得られたクロマトグラム。

【符号の説明】

１０：流体供給源１２：ポンプ１４：モディファイヤ貯蔵器１５：シリンジ１６：固定ループ注入装置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】入口と出口を有する充填カラム構造と、前
記充填カラム構造に流体を流入させるポンプと、前記充
填カラム構造は少なくとも内径が0.5mm で、前記入口と
前記出口の間の長さが理論段数が少なくとも約50,000を
提供するのに十分な長さであり、前記出口の圧力を制御
し、前記入口と出口の圧力降下を少なくとも25バーに維
持し、前記流体を前記出口において臨界点付近に維持す
る前記出口に設けられた背圧調整器とを含むことを特徴
とする超臨界流体クロマトグラフ。