JPH05241074A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

共焦点顕微鏡

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JPH05241074A
JPH05241074A JP4043400A JP4340092A JPH05241074A JP H05241074 A JPH05241074 A JP H05241074A JP 4043400 A JP4043400 A JP 4043400A JP 4340092 A JP4340092 A JP 4340092A JP H05241074 A JPH05241074 A JP H05241074A
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pinhole
optical axis
confocal microscope
point
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Masayuki Inoguchi
猪口正幸
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NIPPON DENSHI SYST TECHNOL KK
Jeol Ltd
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NIPPON DENSHI SYST TECHNOL KK
Jeol Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 共焦点顕微鏡において、試料の結像点以外か
らの光を取り除いて検出できるようにして、光軸方向及
び光軸に垂直な方向の分解能を向上させる。 【構成】 試料面に共役に光軸にほぼ直交するピンホー
ル6を配置し、ピンホール6を通過した光量を検出する
ことにより試料面の像を得る共焦点顕微鏡において、光
軸に沿って別のピンホール8をピンホール6と両者の孔
が一致して交差するように配置して、光軸方向及び光軸
に垂直な方向の検出点Ob以外の隣接する試料点から出
た光を、これらピンホール6、8により遮って検出しな
いようにし、光軸方向及び光軸に垂直な方向の分解能を
向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、顕微鏡に関し、特に、
走査レーザ顕微鏡等に用いられる共焦点顕微鏡に関す
る。
【0002】
【従来の技術】まず、共焦点顕微鏡の原理について、図
4の光路図を参照にして説明する。点光源1から出た光
は、ビームスプリッタ2で反射され、対物レンズ3を通
って焦点面(結像面)4にある試料5に点光源像として
結像される。試料5はこの点光源像によって照射され、
試料5の性質に応じて散乱、吸収、偏光、蛍光等が生じ
る。それらの光の中、焦点面4にある試料5から散乱、
反射され、対物レンズ3とビームスプリッタ2を通った
光は、ピンホール6面に試料像として結像する。ピンホ
ール6面上の試料像の中、ピンホール6上にある光束の
みがピンホール6を通過し、光検出器7に到達する。こ
のため、ピンホール6を相対的に走査して光検出器7か
ら得られる像は、ピンホール6がない場合の像に比較し
て分解能が高くなる。また、図4に示すような共焦点顕
微鏡は、通常の光学顕微鏡に比較して、光軸(z軸)方
向の分解能が高いという特徴がある。この特徴を利用し
て、z軸に垂直なx−y平面で試料をスライスした像を
得ることができる(このようなスライスする機能は、一
般に、オプティカルセクショニングと呼ばれてい
る。)。このスライス像の1利用法として、z軸方向に
一定の刻みで薄くスライスした像を多数取り込み、それ
らをコンピュータ処理することによって立体的な像を構
築するという利用方法がある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】上記のオプティカルセ
クショニングを利用した立体像の構築の例では、どれだ
け正確な立体像が構築できるかは、x−y平面での分解
能に加え、z軸方向の分解能に左右される。従来の共焦
点顕微鏡では、z軸方向の分解能は高いとはいえ、下記
の理由(a)、(b)で、正しい輝度像を得ることがで
きない。したがって、精度の高い立体像を得ようとする
と、充分な分解能でスライスすることができず、正しい
像を構築することができない場合が多い。
【0004】(a)従来の共焦点顕微鏡では、図5に示
すように、z軸方向のピンホール6と共役な位置から外
れた点からの光も拾って検出するため、正しい輝度値が
得られない。すなわち、図5において、Fa、Fb、F
cは、それぞれz軸上にある対象Oa、Ob、Oc点の
投影像である。z軸上のFbの投影点にピンホール6を
設置したとき、z軸上のFa、Fc点へ結像する像の光
束の一部がピンホール6を通過する(通過光量はピンホ
ール6の径に比例)。このため、本来Fb点の光束のみ
をピンホール6で捉えたいのだが、Fa、Fc点等への
光束の一部もFb点の光束に加算されて検出されてしま
うので、それらの輝度が無視できない場合に、偽の輝度
を捉えてしまうことになり、正しい輝度値が得られな
い。
【0005】(b)従来の共焦点顕微鏡では、図6に示
すように、x−y方向に外れた点からの光も拾いやすい
ため、正しい輝度が得られない。すなわち、図6におい
て、Fa、Fb、Fcは、それぞれ同一焦点面にある対
象Oa、Ob、Oc点の投影像である。z軸上のFbの
投影位置にピンホール6を設置したとき、ピンホール6
の径よりz軸に近い位置(内側)に合焦した点Fa、F
c点への光束は、その全部あるいは一部がピンホール6
を通過する。このため、本来Fb点への光束のみを捉え
たいのだが、Fa、Fc点等への光束の一部もこれに加
算されてしまうので、それらの輝度が無視できない場合
に、偽の輝度を捉えてしまうことになり、正しい輝度値
が得られない。
【0006】また、従来技術では、共焦点顕微鏡の分解
能を向上させるために、主に光源の波長を短くするとい
う方法がとられている。しかし、この方法は、光源が高
価であったり、大きかったり、寿命が短かったり、ある
いは、光学系が高価になったりと、望ましくない点も多
い。
【0007】本発明はこのような状況に鑑みてなされた
ものであり、その目的は、試料面に共役にピンホール又
はスリットを配置し、ピンホール又はスリットを通過し
た光量を検出することにより試料面の像を得る共焦点顕
微鏡において、試料の結像点以外からの光を取り除いて
検出できるようにして、光軸方向及び光軸に垂直な方向
の分解能を向上させることである。
【0008】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成する本発
明の共焦点顕微鏡は、試料面に共役に光軸にほぼ直交す
るピンホール又はスリットを配置し、前記ピンホール又
はスリットを通過した光量を検出することにより試料面
の像を得る共焦点顕微鏡において、光軸に沿って別のピ
ンホール又はスリットを前記ピンホール又はスリットと
両者の孔が一致して交差するように配置して、光軸方向
及び光軸に垂直な方向の分解能を向上させるようにした
ことを特徴とするものである。
【0009】
【作用】本発明においては、光軸にほぼ直交して設けた
ピンホール又はスリットに加えて、光軸に沿って別のピ
ンホール又はスリットを第1のピンホール又はスリット
と両者の孔が一致して交差するように配置したので、光
軸方向及び光軸に垂直な方向の検出点以外の隣接する試
料点から出た光は、これらピンホール又はスリットによ
り遮られて検出されず、光軸方向及び光軸に垂直な方向
の分解能が向上する。
【0010】
【実施例】以下、本発明の共焦点顕微鏡の実施例につい
て、図面を参照にして説明する。図1は、本発明による
共焦点顕微鏡の1実施例の模式的な光路図であり、特
に、ピンホール部分を拡大して示してある。本発明にお
いて、重要な点は、共焦点顕微鏡において、光検出器7
の前方に配置される本来のピンホール6以外に、このピ
ンホール6に直交して光軸に沿って設けられた別のピン
ホール8(図1中、黒塗の部分。アキシャルピンホール
という。)を設けることである。以下、本来のピンホー
ル6とアキシャルピンホール8とを総称してクロスピン
ホールと呼ぶことにする。
【0011】本発明による共焦点顕微鏡は、図1に示す
ように、対物レンズ3、光検出器7、光検出器7の前で
図示しない試料と共役な位置に光軸(z軸)に垂直に配
置されたピンホール6、ピンホール6に直交して光軸に
沿って設けられたアキシャルピンホール8等からなり、
試料照明用の点光源、ビームスプリッタ、走査機構等は
図示が省略されている。図に示すように、Fa、Fb、
Fcは、それぞれz軸上にある対象Oa、Ob、Oc点
の投影像点であり、z軸上のFbの投影点にクロスピン
ホールの中心点(両ピンホール6、8の孔が位置する
点)が設置されているものとする。
【0012】この時、Fa、Fcへ結んだ像は、クロス
ピンホールの衝立部(アキシャルピンホール8部分)で
遮られて(図中、点線)、光検出器7には全く届かな
い。このようにして、本来取り込みたいFb点の光束の
みを選択的に取り込んで検出することができる。この時
のz軸方向の分解能は、z軸方向クロスピンホール径Z
δに依存する。すなわち、Zδが小さい程、z軸方向の
分解能がよくなる(ただし、Zδを小さくすると、衝立
部(アキシャルピンホール8)の厚みを薄くしない限
り、検出光量が減少する。衝立部を薄くするにも限界が
あるから、衝立部の厚さと、Zδ、光検出器7の感度が
z軸方向の分解能を左右することになる。)。
【0013】クロスピンホールについては、その表面を
適当に加工、表面処理、干渉吸収膜のコーティング等を
して、ピンホールの孔以外の表面に当たった光線を全て
吸収して、散乱あるいは反射により光検出器7へ光を導
かないように作製する必要がある。
【0014】図1は、クロスピンホールによるz軸方向
の分解能の向上について説明しているが、図1と同様な
図2を参照にして、x−y方向の分解能の向上について
説明する。この図2の場合、Fa、Fb、Fcは、それ
ぞれ同一焦点面にある対象Oa、Ob、Ocの投影像点
であり、z軸上のFbの投影点にクロスピンホールの中
心点を設置したとする。また、クロスピンホールのz軸
上の衝立部は充分長く対物レンズ3近くまで届いている
ものとする。この時、Fa、Fc点へ結像するために対
物レンズ3を通過してくる光束の半分は、クロスピンホ
ールの衝立部(アキシャルピンホール8)により遮られ
て(図中、点線)、光検出器7には達しない。このた
め、光検出器7に本来取り込みたいFb点以外への光束
を減ずることができ、相対的に、x−y平面における分
解能を向上させることができる。
【0015】ところで、以上の実施例においては、アキ
シャルピンホール8は、薄い板に微小な孔を設けてなる
ものを考えていたが、図3に示すように、クロスピンホ
ールの中心点を中心にz軸方向上下に断面が増大するく
さび形あるいは円錐形のクロスピンホール8′を用いる
ようにしてもよい。
【0016】以上の実施例では、光検出器の前に配置す
る光束制限部材としてピンホールを考えていたが、その
代わりにスリットを用いる共焦点顕微鏡が知られてい
る。この場合は、アキシャルピンホールの代わりに、光
軸に沿って別のスリットを用い、両者のスリットが結像
点で交差するように配置することにより、上記と同様
に、光軸方向及び光軸に垂直な方向の分解能を向上させ
ることができる。
【0017】以上、本発明の共焦点顕微鏡を実施例に基
づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例に限定さ
れず種々の変形が可能である。また、本発明は、走査レ
ーザ顕微鏡に限らす、白色光を用いる従来の走査顕微鏡
にも適用できる。なお、クロスピンホールは、屈折、全
反射、回折、干渉等の光学的性質を利用して実現するこ
とも可能である。
【0018】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の共焦点顕微鏡によると、光軸にほぼ直交して設けたピ
ンホール又はスリットに加えて、光軸に沿って別のピン
ホール又はスリットを第1のピンホール又はスリットと
両者の孔が一致して交差するように配置したので、光軸
方向及び光軸に垂直な方向の検出点以外の隣接する試料
点から出た光は、これらピンホール又はスリットにより
遮られて検出されず、光軸方向及び光軸に垂直な方向の
分解能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明による共焦点顕微鏡の1実施例の模式的
な光路図である。
【図2】光軸に垂直な方向の分解能の向上を説明するた
めの図1と同様な図である。
【図3】別の実施例の模式的な光路図である。
【図4】従来の共焦点顕微鏡の原理を説明するための光
路図である。
【図5】従来の共焦点顕微鏡の光軸方向非合焦点からの
影響を説明するための図である。
【図6】従来の共焦点顕微鏡の光軸垂直方向合焦点から
の影響を説明するための図である。
【符号の説明】
1…点光源 2…ビームスプリッタ 3…対物レンズ 4…焦点面(結像面) 5…試料 6…ピンホール 7…光検出器 8、8′…アキシャルピンホール

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料面に共役に光軸にほぼ直交するピン
    ホール又はスリットを配置し、前記ピンホール又はスリ
    ットを通過した光量を検出することにより試料面の像を
    得る共焦点顕微鏡において、光軸に沿って別のピンホー
    ル又はスリットを前記ピンホール又はスリットと両者の
    孔が一致して交差するように配置して、光軸方向及び光
    軸に垂直な方向の分解能を向上させるようにしたことを
    特徴とする共焦点顕微鏡。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003500692A (ja) * 1999-05-19 2003-01-07 カール ツァイス イエナ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 蛍光層の感知を主目的とする走査装置

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2003500692A (ja) * 1999-05-19 2003-01-07 カール ツァイス イエナ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 蛍光層の感知を主目的とする走査装置

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