JPH0523395A - Blood purifying adsorbent - Google Patents
Blood purifying adsorbentInfo
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- JPH0523395A JPH0523395A JP3208647A JP20864791A JPH0523395A JP H0523395 A JPH0523395 A JP H0523395A JP 3208647 A JP3208647 A JP 3208647A JP 20864791 A JP20864791 A JP 20864791A JP H0523395 A JPH0523395 A JP H0523395A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は自己免疫疾患（重症筋無
力症、慢性リウマチなど）、免疫関連疾患（気管支喘
息、糸球体腎炎など）、癌（白血病など）、高脂血症な
どの治療、及び幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞など血中細胞成
分の分離を目的とし、血液を接触させることによって血
中の特定成分を分離する血液浄化吸着材に関するもので
ある。The present invention relates to treatment of autoimmune diseases (myasthenia gravis, chronic rheumatism etc.), immune related diseases (bronchial asthma, glomerulonephritis etc.), cancer (leukemia etc.), hyperlipidemia etc. The present invention also relates to a blood purification adsorbent for separating specific components in blood by contacting blood for the purpose of separating blood cell components such as stem cells, B cells and T cells.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、免疫不全、腫瘍、高脂血症など治
療には血漿交換法が有効とされ、広く行われている。し
かしながら、この療法では血漿をすべて交換するため、
（１）不必要成分のみならず、必要な成分までも除去さ
れてしまうこと、（２）除去した血漿に替えて体内に補
充される血漿、あるいは血漿製材の不足しているため、
大量かつ持続的な入手が困難である、（３）血清肝炎や
アレルギー、さらにはＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候
群）感染の危険性があること、など血漿交換法が内含す
る問題は多い。2. Description of the Related Art Conventionally, the plasmapheresis method has been effective and widely used for the treatment of immunodeficiency, tumor, hyperlipidemia and the like. However, this therapy replaces all plasma, so
(1) Not only unnecessary components but also necessary components are removed. (2) Plasma to be replaced in the body in place of the removed plasma or plasma lumber is insufficient,
There are many problems involved in the plasmapheresis, such as large-scale and continuous difficulty in obtaining, (3) serum hepatitis, allergies, and the risk of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) infection.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】こういった状況を背景
として、近年、病因関連物質の選択的除去による治療が
盛んに行われるようになってきた。このような方法は例
えば、メンブレンフィルターを用いるカスケード（Ｓｉ
ｅｂｅｌｔｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｃｈａｎ
ｇｅ，Ｐ．２９，Ｆ．Ｋ．Ｓｃｈａｔｔａｕｅｒ Ｖｅ
ｒｌｏｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９８０）、あるいは二重濾過法（阿岸鉄三ら，腎と透
析，１０（３），４７５，１９８１）、凍結濾過法
（Ｌ’Ａｂａｔｔｅ Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｅ
ｕｒ．Ｄｉａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ａｓｓｏ
ｃ．，１４，４８６，１９７７）、塩析血漿処理法（大
江宏明ら，人工臓器，１４０（１），４７２−４７５
（１９８５））が知られている。Against this background, treatment by selective removal of pathogen-related substances has been actively performed in recent years. Such a method is, for example, a cascade (Si
ebelth, H .; G. , Plasma Exchan
ge, P.G. 29, F.I. K. Schattauer Ve
rlog, Stuttgart-New York, 1
980), or double filtration (Tetsuzo Agishi et al., Kidney and dialysis, 10 (3), 475, 1981), freeze filtration (L'Abatte A., et al., Proc. E).
ur. Dial, Transplant. Asso
c. , 14, 486, 1977), salting-out plasma treatment method (Hiroaki Oe et al., Artificial organ, 140 (1), 472-475).
(1985)) is known.
【０００４】他の治療方法としては、各種薬剤の使用が
行われているが、一般に副作用の危険性があり、使用
量、使用期間などに細心の注意を払う必要がある。As other treatment methods, various drugs have been used, but generally there is a risk of side effects, and it is necessary to pay close attention to the amount used and the period of use.
【０００５】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輸出する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採するにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因
物質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及
び血液浄化法が望まれていた。As a therapeutic method capable of solving such a problem, a method of purifying own blood and then re-exporting it, that is, an extracorporeal circulation blood purifying method is desirable. In adopting this method, there has been a demand for a purification material and a blood purification method capable of sufficiently and selectively removing a pathogenic substance from own blood without causing side effects.
【０００６】従来、この目的に供し得る血液浄化材とし
ては、 （１）アフィニティー吸着材（例えば、特公平２−５０
９６、特公平２−２６９８８、特開平１−１５８９７０
など） （２）多孔性樹脂（例えば、特開昭５６−１４７７１
０、特公昭６２−２５４６、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ製の
「アンバーライトＸＡＤ−７」など） （３）イオン交換体（例えばカルボキシメチルセルロー
ル、ジエチルアミノエチルアガロースなど） （４）無機多孔体（例えば特公昭６２−２５４３、多孔
質ガラス、ジエチルアミノエチルアガロースなど）があ
る。Heretofore, as blood purifying materials that can be used for this purpose, (1) affinity adsorption materials (for example, Japanese Patent Publication No. 2-50)
96, JP-B-2-26988, JP-A-1-158970.
(2) Porous resin (for example, JP-A-56-14771)
0, Japanese Examined Patent Publication No. 62-2546, "Amberlite XAD-7" manufactured by Rohm & Haas, etc.) (3) Ion exchangers (for example, carboxymethyl cellulose, diethylaminoethyl agarose, etc.) (4) Inorganic porous substance (for example, Japanese Examined Patent Publication No. 62- 2543, porous glass, diethylaminoethyl agarose, etc.).
【０００７】しかし、多孔性樹脂やイオン交換体が吸着
能が小さい上に吸着特異性が低く、これを血液浄化材と
して用いると効果が充分でないばかりでなく、血中の必
須成分までも吸着してしまう可能性があり、安全性の面
でも問題がある。また、無機多孔体は吸着能、吸着特性
については比較的良好であるが、未だ実用に供するには
不十分であり、血液適合性に乏しいため、多量のヘパリ
ンの添加が必要となり、出血傾向等の副作用が生じる、
このような点から、将来的に最も可能性の大きいアフィ
ニティー吸着材による有用は血液浄化材の開発が望まれ
ている。However, porous resins and ion exchangers have low adsorption ability and low adsorption specificity, and when they are used as blood purification materials, not only the effect is not sufficient, but also essential components in blood are adsorbed. There is a possibility that it will end up, and there is a problem in terms of safety. In addition, although the inorganic porous material is relatively good in adsorption ability and adsorption characteristics, it is still insufficient for practical use and poor in blood compatibility, so that it is necessary to add a large amount of heparin, and bleeding tendency, etc. Side effects of
From this point of view, it is desired to develop a useful blood purification material with an affinity adsorbent, which has the greatest possibility in the future.
【０００８】アフィニティー吸着材は、生物学アフィニ
ティー吸着材（抗原抗体結合、補体結合、Ｆｃ結合等の
生物学的相互作用で血液中の病因物質と結合し、これを
吸着するもの）と物理化学的アフィニティー吸着材（静
電結合、水素結合、ファンデルワールス力当物理的また
は化学的相互作用によって血液中の病因物質と結合し、
これを吸着するもの）とに大別でき、さらに従来知られ
ている物理化学的アフィニティー吸着材は以下の６つに
分類することができる。 （１）カルボキシル基またはスルホン酸基を表面に有す
る多孔体（例えば、特開昭５６−１４７７１０、特開昭
５７−５６０３８、特開昭５７−７５１４１、特開昭５
７−１７０２６３、特開昭５７−１９７２９４、） （２）疎水性アミノ酸が結合されている親水性担体（例
えば、特開昭５７−１２２８７５、特開昭５８−１５９
２４、特開昭５８−１６５８５９、特開昭５８−１６５
８６１、旭メディカル製イムソーバー） （３）その他疎水性低分子化合物が固定されている担体
（例えば特開平１−１５８９７０） （４）変性免疫グロブリン（ＩｇＧ）が結合されている
親水性担体（例えば特開昭５７−７７６２４、特開昭５
７−７７６２５、特開昭５７−１５６０３５） （５）メチル化アルブミンが結合されている多孔体（例
えば特開昭５５−１２０８７５、特開昭５５−１２５８
７２） （６）糖または改質した糖が結合されている担体（例え
ば特開昭５７−１３４１６４、特開昭５８−１３３２５
７、鐘淵化学リポソーバー） （７）、プリン塩基またはピリミジン塩基、或いは糖燐
酸が結合されている多孔体（例えば特開昭５７−１９２
５６０、特開昭５８−６１７５２、特開昭５８−９８１
４２）[0008] The affinity adsorbent is a bioaffinity adsorbent (which binds to a pathogen in blood by biological interaction such as antigen-antibody binding, complement binding, Fc binding, etc. and adsorbs it) and physical chemistry. Affinity adsorbent (electrostatic bond, hydrogen bond, van der Waals force binding to bind to pathogens in blood by physical or chemical interaction,
This can be roughly classified into the following (6) and the conventionally known physicochemical affinity adsorbents can be classified into the following 6 types. (1) Porous material having a carboxyl group or a sulfonic acid group on its surface (for example, JP-A-56-147710, JP-A-57-56038, JP-A-57-75141, and JP-A-5-75141).
7-170263, JP-A-57-197294, (2) Hydrophilic carrier to which a hydrophobic amino acid is bound (for example, JP-A-57-122875, JP-A-58-159).
24, JP-A-58-165859, JP-A-58-165.
861, Asahi Medical Imsorber) (3) A carrier to which other hydrophobic low molecular weight compounds are fixed (for example, JP-A-1-158970) (4) A hydrophilic carrier to which modified immunoglobulin (IgG) is bound (for example, Kai 57-77624, JP-A-5
7-77625, JP-A-57-156035) (5) Porous substance to which methylated albumin is bound (for example, JP-A-55-10875 and JP-A-55-1258).
72) (6) Carrier to which sugar or modified sugar is bound (for example, JP-A-57-134164 and JP-A-58-13325)
7. Kanegafuchi Chemical Liposorber (7), a purine base or pyrimidine base, or a porous body to which sugar phosphate is bound (for example, JP-A-57-192).
560, JP-A-58-61752, JP-A-58-981
42)
【０００９】しかし、これら従来の物理化学的アフィニ
ティー吸着材も、体外循環血液浄化療法による自己免疫
疾患等の治療には充分とは言えず、血液適合性にも乏し
いことから、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除
去することができ、また体液に対する悪影響の少ない浄
化材が望まれている。However, these conventional physicochemical affinity adsorbents cannot be said to be sufficient for the treatment of autoimmune diseases and the like by extracorporeal blood purification, and are also poor in blood compatibility, and therefore have higher efficiency and specificity. There is a demand for a purification material that can remove the etiological agent and that has less adverse effect on body fluid.
【００１０】このようは概念に基づいて開発された血液
浄化材については、例えば、特開平１−１５８９７０と
いう特許が開示されている、この特許によって開示され
ている血液浄化材は、重合度１〜９０のイチレンオキサ
イド骨格を有する親水性スペーサーを介して、リガンド
となる低分子有機化合物を水不溶性多孔質固体表面に固
定し、これに直接血液を灌流して免疫グロブリンを吸着
することを特徴としている。Regarding the blood purifying material developed based on such a concept, for example, the patent JP-A-1-158970 is disclosed. The blood purifying material disclosed by this patent has a polymerization degree of 1 to 1. A low molecular organic compound serving as a ligand is immobilized on the surface of a water-insoluble porous solid through a hydrophilic spacer having 90 alkylene oxide skeleton, and blood is directly perfused on the surface to adsorb immunoglobulin. There is.
【００１１】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でない蛋白の付着を防止することである。親
水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。このた
め吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血球成分
の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水の層を
形成するスペーサーが運動することにより、さらに血球
成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱離しや
すくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制される
といった利点を有する。The significance of the hydrophilic spacer can be broadly divided into two. First, the blood cell components in blood,
This is to prevent the attachment of proteins that are not adsorbed substances. The hydrophilic spacer adsorbs water around the hydrophilic spacer. Therefore, the surface of the adsorbent is covered with a layer of water, and this layer of water prevents adhesion of blood cell components (excluded volume effect). Further, the movement of the spacer forming the water layer makes it more difficult to attach the blood cell component, and the attached blood cell component is likely to be detached. It also has the advantage that the activation of coagulation factors and complement is suppressed.
【００１２】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質とリガンド
の接近た困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやする、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。Second, it is expected that the adsorptivity can be improved by increasing the mobility of the ligand. Especially when the substance to be adsorbed is a macromolecule, it is difficult to bring the substance to be adsorbed and the ligand close to each other simply by immobilizing the ligand directly on the surface of the carrier, and even if some of them are bound, the number of binding sites is not sufficient. There is a high possibility that they will be easily removed. By interposing a hydrophilic spacer, the approach between the substance to be adsorbed and the ligand is promoted, and the flexibility of the movement of the ligand causes the surrounding ligand to participate in the binding with the substance to be adsorbed. Can produce a large number of strong bonds.
【００１３】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のイチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているのが、分子量５０００以上のリガン
ドの固定が必要は場合においては、スペーサーの重合度
が１〜９０ではリガンドの運動性が未だなお制限される
ため、被吸着物質との相互作用が弱くなり、満足すべき
充分な性能が得られない。In JP-A-1-158970, the degree of polymerization is 1
A hydrophilic spacer having an acetylene oxide skeleton of 90 is interposed. However, when immobilization of a ligand having a molecular weight of 5000 or more is required, the mobility of the ligand is still limited when the degree of polymerization of the spacer is 1 to 90. Therefore, the interaction with the substance to be adsorbed is weakened, and satisfactory performance cannot be obtained.
【００１４】さらに、スペーサーの重合度が９０以下で
は排除体積効果が未だ充分でなく、特開平１−１５８９
７０においても血液適合性向上のためアクリル酸誘導体
のコーティングを行っている。このような交差は煩雑で
あるばかりでなく、毒性をもった物質の溶出を招く可能
性も存在する。Further, when the degree of polymerization of the spacer is 90 or less, the excluded volume effect is not yet sufficient, and therefore, the method disclosed in JP-A-1-15989 is used.
Also in No. 70, an acrylic acid derivative is coated to improve blood compatibility. Such crossing is not only complicated, but may cause the elution of a toxic substance.
【００１５】[0015]
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、高分子リガンドの効果を充分に引き出
して、良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等
の煩雑な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った
血液浄化吸着材を提供することにより、副作用がなく、
自己の血液から病因物質を充分且つ選択的に除去するこ
とのできる効果的な体外循環血液浄化療法を実現しよう
としたものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention solves the above-mentioned drawbacks of the prior art, sufficiently brings out the effect of the polymer ligand, has a good adsorption capacity and adsorption characteristics, and requires complicated operations such as coating. By omitting and providing a blood purification adsorbent with sufficient blood compatibility, there are no side effects,
It is intended to realize an effective extracorporeal blood purification treatment capable of sufficiently and selectively removing a pathogenic substance from its own blood.
【００１６】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明の血液浄化吸着材
は、水不溶性固体表面に重合度１００から５００のポリ
アルキレンオキサイドおよびまたはその誘導体を介して
分子量５０００から１００００００のリガンドを固定
し、このリガンドによって血中の特定成分を除去または
捕集することを特徴とするものである。本発明の血液浄
化吸着材は、水不溶性固体がポリスチレン、ポリメタク
リル酸およびその誘導体或いはこれらの共重合体などの
合成有機高分子化合物、セルロース、キチン、キトサン
等の天然有機高分子化合物、またはアシルセルロース、
アシルキチン等の改質天然有機高分子化合物であること
が好ましい。これらの高分子化合物のうち、機械的高
度、親水性スペーサー導入の容易さ、親水性スペーサー
導入後の水不溶性の保持を考慮すると、適度に架橋した
ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルおよびその誘導
体或いはこれらの共重合体、セルロース、キトサンが望
ましく、さらに好ましくは架橋ポリスチレン、セルロー
スが望ましい。以下にジビニルビンゼンで架橋したポリ
スチレン（化１）、ジビニルベンゼンで架橋したポリメ
タクリル酸メチル（化２）、セルロース（化３）、キト
サン（化４）の部分構造を示した。The blood purification adsorbent of the present invention has a water-insoluble solid surface on which a ligand having a molecular weight of 5000 to 1,000,000 is immobilized via a polyalkylene oxide having a degree of polymerization of 100 to 500 and / or a derivative thereof. It is characterized in that a specific component in blood is removed or collected by a ligand. In the blood purification adsorbent of the present invention, the water-insoluble solid is a synthetic organic polymer compound such as polystyrene, polymethacrylic acid and its derivative or a copolymer thereof, a natural organic polymer compound such as cellulose, chitin, chitosan, or an acyl group. cellulose,
A modified natural organic polymer compound such as acyl chitin is preferable. Among these polymer compounds, considering mechanical strength, ease of introduction of hydrophilic spacer, and retention of water insolubility after introduction of hydrophilic spacer, moderately cross-linked polystyrene, polymethylmethacrylate and derivatives thereof or their Copolymers, cellulose and chitosan are preferable, and crosslinked polystyrene and cellulose are more preferable. The partial structures of polystyrene (chemical formula 1) crosslinked with divinylbinzene, polymethylmethacrylate (chemical formula 2), cellulose (chemical formula 3) and chitosan (chemical formula 4) crosslinked with divinylbenzene are shown below.
【００１７】[0017]
【化１】 [Chemical 1]
【００１８】[0018]
【化２】 [Chemical 2]
【００１９】[0019]
【化３】 [Chemical 3]
【００２０】[0020]
【化４】 [Chemical 4]
【００２１】本発明は親水性スペーサーとして重合度１
００から５００のポリアルキレンオキサイド、またはそ
の誘導体を用いることを特徴とするものである。ここで
言う誘導体とは、両端の水酸基を別の官能基で置き換え
たものた、オキシアルキレン鎖の水素原子をハロゲンや
官能基で置換したものなどを言う。ポリエチレンオキサ
イドの誘導体として、ＰＥＯ酸（化５）、ＰＥＯアミン
（化６）の構造を以下に記した。The present invention uses a hydrophilic spacer having a degree of polymerization of 1
It is characterized by using from 00 to 500 polyalkylene oxides or derivatives thereof. The term "derivative" as used herein refers to a derivative in which hydroxyl groups at both ends are replaced with another functional group, or a hydrogen atom in an oxyalkylene chain is replaced with a halogen or a functional group. The structures of PEO acid (Chemical formula 5) and PEO amine (Chemical formula 6) as the derivative of polyethylene oxide are shown below.
【００２２】[0022]
【化５】 [Chemical 5]
【００２３】[0023]
【化６】 [Chemical 6]
【００２４】親水性スペーサーの鎖長は吸着する物質の
大きさに応じて適当に変えることが推奨される。例え
ば、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着して除去する場合
は、重合度１００から３００、好ましくは１２０から２
５０が望ましい。これよりも重合度が小さいと巨大分子
であるＬＤＬはリガンドへの接近が困難になって充分な
吸着能が得られず、これよりも分子量が大きいと材料表
面のリガンドの存在密度が疎らになりすぎて吸着能の低
下を招いてしまう。It is recommended that the chain length of the hydrophilic spacer be appropriately changed according to the size of the substance to be adsorbed. For example, when LDL (low density lipoprotein) is adsorbed and removed, the degree of polymerization is 100 to 300, preferably 120 to 2
50 is desirable. If the degree of polymerization is smaller than this, LDL, which is a macromolecule, becomes difficult to access the ligand and sufficient adsorption capacity cannot be obtained, and if the molecular weight is larger than this, the density of ligands on the material surface becomes sparse. If it is too much, the adsorptivity will be reduced.
【００２５】本発明の吸着材が対象とする被吸着物質は
血液中に種々の特定物質であるが、より詳細には通常の
免疫グロブリン（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ）、抗ＤＮＡ抗
体、抗アセチルコリンレセプター抗体、抗血液型抗体、
抗血小板抗体などの自己抗体；抗原・抗体複合物；エン
ドドキシン；リウマチ因子；ＬＤＬ、ＶＬＤＬなどのリ
ポ蛋白；幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファー
ジ、ＴＩＬ（癌組織浸潤Ｔ細胞）などの血中細胞成分な
どが挙げられる。The substances to be adsorbed targeted by the adsorbent of the present invention are various specific substances in blood. More specifically, ordinary immunoglobulins (A, D, E, G, M) and anti-DNA antibodies are used. , Anti-acetylcholine receptor antibody, anti-blood group antibody,
Autoantibodies such as antiplatelet antibodies; antigen-antibody complexes; endotoxins; rheumatoid factors; lipoproteins such as LDL and VLDL; stem cells, B cells, T cells, monocytes, macrophages, TILs (cancer tissue infiltrating T cells), etc. Examples include cell components in blood.
【００２６】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状糖いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の現象、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、繊維状担体の繊維直径
は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは０．３μｍから
２５μｍが望ましく、さらに好ましくは０．５μｍから
１５μｍが望ましい。The shape of the water-insoluble solid used in the present invention may be any of known shapes such as particulate, fibrous and membranous sugars. From the viewpoint of easiness and the like, a particulate form or a fibrous form is desirable. It is desirable that the average particle size of the particulate carrier is in the range of 10 μm to 5 mm, but as the particle size becomes smaller, the flow resistance of blood cells increases, and when the particle size becomes larger, the phenomenon of carrier loading amount and eventually the effective surface area decrease. Therefore, it is desirable that the average particle size is in the range of 30 μm to 1 mm. More preferably, the average particle size is 50 μm to 500 μm. Regarding the particle shape, cells are less likely to be damaged, the strength against physical external force, and the fiber diameter of the fibrous carrier is 0.1 μm to 50 μm, preferably 0.3 μm to 25 μm, and more preferably 0.5 μm. 15 μm is desirable.
【００２７】担体には有効表面積を拡大するため微小孔
が存在することが好ましい。その平均孔径は粒子状担体
の場合、２０Åから２０００Å、好ましくは１００から
１５００Å、繊維状担体の場合２０Åから１０００Å、
好ましくは１００Åから８００Åである。これより平均
孔径が小さいと被吸着物質が微小孔内部まで到達でき
ず、これより大きいと有効表面積を拡大する効果が不十
分であり、また担体の強度低下を招くことになる。It is preferable that the carrier has micropores for expanding the effective surface area. The average pore size is 20Å to 2000Å, preferably 100 to 1500Å in the case of particulate carrier, 20Å to 1000Å in the case of fibrous carrier,
It is preferably 100Å to 800Å. If the average pore diameter is smaller than this, the substance to be adsorbed cannot reach the inside of the micropores, and if it is larger than this, the effect of expanding the effective surface area is insufficient and the strength of the carrier is lowered.
【００２８】本発明に使用される水不溶製固体へのスペ
ーサーの導入の方法は共有結合、電子線照射によるグラ
フト化など、特に制限されないが、架橋ポリスチレンに
スペーサーを導入する場合、例えば以下のような方法が
用いられる。 （１）架橋ポリクロロメチルスチレンの合成 ジビニルベンゼンを１〜７０ｗｔ％、好ましくは２〜５
０ｗｔ％含む化１の架橋ポリスチレンにクロロホルムを
加え、室温で１５分以上、好ましくは３０分以上攪拌し
て充分に膨潤させた後、クロロメチルメチルエーテルと
触媒を加え、２５℃〜１００℃、好ましくは３０℃〜６
０℃で３０分〜１２時間、好ましくは２時間〜７時間窒
素気流気下にて攪拌しながら反応させると、クロロメチ
ル基導入率１０％以上、好ましくは２５％以上の架橋ポ
ロクロロメチルスチレンが得られる。上記触媒として
は、塩化アルミニウムのようなアルミニウム系触媒、塩
化錫のような錫系触媒、塩化亜鉛のような亜鉛系触媒が
挙げられる。触媒は反応溶液中に０．３％〜２．０％、
好ましくは０．４％〜１．０％の含量で添加される。上
記クロロメチル化反応において、各成分の混合重量比は
次の通りである。ポリスチレンとクロロホルムの合計量
とクロロメチルメチルエーテルの混合重量比は３０／１
〜１／５、好ましくは１５／１〜１／３である。The method of introducing the spacer into the water-insoluble solid used in the present invention is not particularly limited, such as covalent bonding or grafting by electron beam irradiation. When introducing the spacer into the crosslinked polystyrene, for example, the following method is used. Various methods are used. (1) Synthesis of crosslinked polychloromethylstyrene 1-70 wt% of divinylbenzene, preferably 2-5
Chloroform was added to the crosslinked polystyrene of Chemical formula 1 containing 0 wt% and stirred at room temperature for 15 minutes or more, preferably 30 minutes or more to sufficiently swell, and then chloromethyl methyl ether and a catalyst were added, and 25 ° C to 100 ° C, preferably Is 30 ° C to 6
When the reaction is carried out at 0 ° C. for 30 minutes to 12 hours, preferably 2 hours to 7 hours with stirring under a nitrogen stream, a chloromethyl group introduction rate of 10% or more, preferably 25% or more of crosslinked porochloromethylstyrene is obtained. can get. Examples of the catalyst include aluminum-based catalysts such as aluminum chloride, tin-based catalysts such as tin chloride, and zinc-based catalysts such as zinc chloride. The catalyst is 0.3% to 2.0% in the reaction solution,
It is preferably added in a content of 0.4% to 1.0%. In the chloromethylation reaction, the mixing weight ratio of each component is as follows. The total weight of polystyrene and chloroform and the mixing weight ratio of chloromethyl methyl ether are 30/1.
˜1 / 5, preferably 15/1 to 1/3.
【００２９】（２）スペーサーの導入 重合度１００〜３００、好ましくは１２０〜２５０の化
６のＰＥＯアミンを不活性溶媒に溶解させる。これに上
記（１）で得たポリクロロメチルスチレンを加え、０℃
から徐々に室温まで反応温度を上げ、３０分〜１２時間
好ましくは１時間〜４時間に亘り反応させる。これに水
酸化ナトリウム水溶液を加え、約３０分攪拌した後、生
成物を回収する。以上の操作によってアミノ基含量０．
００１μｍｏｌ／ｇ〜１．０ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは
０．００５μｍｏｌ／ｇ〜０．５ｍｍｏｌ／ｇの化合物
下記（化７）が得られる。(2) Introduction of Spacer The PEO amine of the formula 6 having a polymerization degree of 100 to 300, preferably 120 to 250 is dissolved in an inert solvent. To this, add the polychloromethylstyrene obtained in (1) above,
The reaction temperature is gradually raised from 1 to room temperature, and the reaction is carried out for 30 minutes to 12 hours, preferably 1 hour to 4 hours. An aqueous sodium hydroxide solution is added to this, and the product is recovered after stirring for about 30 minutes. By the above operation, the amino group content was 0.
001 μmol / g to 1.0 mmol / g, preferably 0.005 μmol / g to 0.5 mmol / g of the following compound (Formula 7) is obtained.
【００３０】[0030]
【化７】 [Chemical 7]
【００３１】上記の反応に用いられる溶媒はテトラヒド
ロフラン、テトラヒドロピラン、ジオキサン等の環状エ
ーテル類が好ましい。上記反応におけるポリクロロメチ
ルスチレン中のクロロメチル基とＰＥＯアミンとの混合
モル比は３／１〜１／３０好ましくは１／１〜１／１５
である。The solvent used in the above reaction is preferably cyclic ethers such as tetrahydrofuran, tetrahydropyran and dioxane. The mixing molar ratio of the chloromethyl group in the polychloromethylstyrene and the PEO amine in the above reaction is 3/1 to 1/30, preferably 1/1 to 1/15.
Is.
【００３２】上記のような方法でスペーサーを導入した
担体にリガンドを導入する。固定するリガンドは被吸着
物質によって適宜変える必要があるが、抗原抗体結合、
補体結合、Ｆｃ結合等の生物学的相互作用を利用する種
々の生物学的リガンド；または、変性免疫グロブリン
（ＩｇＧ）、糖または改質した糖、含プリン塩基化合
物、含ピリミジン塩基化合物、糖燐酸などの、静電結
合、水素結合、ファンデルワールス力等物理的または化
学的相互作用を利用した種々の物理化学的リガンドが考
えられる。担体の固定方法は、共有結合、物理的吸着、
イオン結合、生化学的特異結合等特に制限されないが、
血液中での結合安定性を考慮すると、共有結合が好まし
い。The ligand is introduced into the carrier into which the spacer has been introduced by the above method. The ligand to be immobilized must be changed appropriately depending on the substance to be adsorbed,
Various biological ligands utilizing biological interactions such as complement fixation and Fc binding; or modified immunoglobulin (IgG), sugar or modified sugar, purine-containing base compound, pyrimidine-containing base compound, sugar Various physicochemical ligands such as phosphoric acid utilizing electrostatic or hydrogen bonding, physical or chemical interaction such as van der Waals force are conceivable. The method of immobilizing the carrier includes covalent bond, physical adsorption,
Ionic bond, biochemical specific bond, etc. are not particularly limited,
A covalent bond is preferable in view of the bond stability in blood.
【００３３】例えばＬＤＬの吸着除去を目的にするので
あれば以下のような方法で、鶏卵から得た抗ＬＤＬ抗体
であるＩｇＹを導入する方法が用いられ得る。化７のス
ペーサー導入済担体にジメチルスルホキシド（以下ＤＭ
ＳＯと略記する）を加えて室温で１５分以上、好ましく
は３０分以上攪拌して充分に膨潤させた後、Ｎ，Ｎ’−
ジシクロカルボジイミド（以下ＤＣＣと略記する）によ
るカップリング反応でＩｇＹを固定する。反応温度は０
〜３０℃で行うことが好ましい。For the purpose of adsorbing and removing LDL, for example, a method of introducing IgY which is an anti-LDL antibody obtained from chicken eggs can be used by the following method. Dimethyl sulfoxide (hereinafter DM
SO) is added and stirred at room temperature for 15 minutes or longer, preferably 30 minutes or longer to allow sufficient swelling, and then N, N′-
IgY is immobilized by a coupling reaction with dicyclocarbodiimide (hereinafter abbreviated as DCC). Reaction temperature is 0
It is preferable to carry out at -30 ° C.
【００３４】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の水不溶性固体表面上にスペーサーを導入し、続
いて被吸着物質に応じた適当はリガンドを固定した後、
これを適当な容器に充填チることによって本発明の血液
浄化吸着材が得られる。容器の材質はガラス、ステンレ
ス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等、特に
制限されないが、減菌等の取扱いを考慮すると、ポリプ
ロピレンやポリカーボネイトが好ましい。容器の形態に
ついても特に制限されないが、粒子状担体の場合は両端
を血液流入部、血液流出部とした円筒のカラム型、繊維
状担体の場合は粒子状担体の場合と同様のカラム型、或
いはシート状に成形した後、これを挟み込むような形態
にしたものが適当であろう。For example, by the method as described above, a spacer is introduced on the surface of a particulate or fibrous water-insoluble solid, and then a suitable ligand is fixed according to the substance to be adsorbed.
The blood purification adsorbent of the present invention can be obtained by filling it in a suitable container. The material of the container is not particularly limited, such as glass, stainless steel, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., but polypropylene and polycarbonate are preferable in consideration of handling such as sterilization. The form of the container is also not particularly limited, but in the case of a particulate carrier, a cylindrical column type with both ends of blood inflow part and blood outflow part, in the case of a fibrous carrier, a column type similar to the case of the particulate carrier, or It is suitable that the sheet is formed into a sheet and then sandwiched.
【００３５】[0035]
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は重量部を意味する。 〈実施例１〉１０％のジビニルベンゼンで架橋された粒
状多孔ポリスチレン（平均粒径２５０μｍ、平均孔径８
００Å）１００部を４口フラスコに取り、バキュームス
ターラー、上部に三方コックを取り付けた冷却管（水道
水を循環させる）、攪拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取
り付け、三方コックから脱気、質素吹送を数回繰り返し
て容器内を窒素置換した。クロロホルム１０００部を入
れ、充分膨潤するまで室温で１時間攪拌した。次いでク
ロロメチルメチルエーテル７０部、塩化亜鉛１０部を加
え、５０℃で５時間、窒素気流気下で反応させた。こう
して得られた生成物を回収し、ジオキサン、水、メタノ
ールで充分洗浄した後減圧乾燥し、ポリクロロメチルス
チレン（ＰＣＭＳ）を得た。塩素含量を元素分析によっ
て定量し、その値から全ベンゼン環に対するクロロメチ
ル基導入率を算出したところ、４５％であった。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples. Parts in the examples mean parts by weight. Example 1 Granular porous polystyrene crosslinked with 10% divinylbenzene (average particle size 250 μm, average pore size 8)
00 Å) 100 parts are put in a 4-necked flask, vacuum stirrer, cooling pipe (circulating tap water) with a three-way cock attached to the top, stirring rod, ball plug, rubber septum are attached, and degassing from the three-way cock and blowing air Was repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen. 1000 parts of chloroform was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour until it swelled sufficiently. Then, 70 parts of chloromethyl methyl ether and 10 parts of zinc chloride were added, and the reaction was carried out at 50 ° C. for 5 hours under a nitrogen stream. The product thus obtained was recovered, thoroughly washed with dioxane, water and methanol and then dried under reduced pressure to obtain polychloromethylstyrene (PCMS). The chlorine content was quantified by elemental analysis, and the chloromethyl group introduction rate to all benzene rings was calculated from the value, which was 45%.
【００３６】平均分子量６０００のＰＥＯアミン１２０
０部を４口フラスコに取り、バキュームスターラー、三
方コック攪拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三
方コックから脱気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を
窒素置換した後、テトラヒドロフラン１０００部を入
れ、充分溶解するまで室温で攪拌した。次いで上記ポリ
クロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ）１０部を加え、０℃
から徐々に室温まで反応温度を上げながら、窒素気流気
下で５時間攪拌して反応させた。この反応混合物に５％
水酸化ナトリウム水溶液５０部を加え、室温で３０分攪
拌した後生成したポリマーを回収し、水、メタノールで
充分に洗浄し、減圧乾燥した。以上の操作でアミノ基含
量０．２ｍｍｏｌ／ｇの下記化７で表されるスペーサー
導入ポリマー（ＰＳＰＥＯＡ）を得た。PEO amine 120 having an average molecular weight of 6000
Take 0 parts in a 4-neck flask, attach a vacuum stirrer, a three-way cock stirrer, a ball stopper, and a rubber septum. After degassing from the three-way cock and nitrogen blowing several times to replace the inside of the container with nitrogen, add 1000 parts of tetrahydrofuran. Then, the mixture was stirred at room temperature until it was completely dissolved. Then, add 10 parts of the above polychloromethylstyrene (PCMS) and
While gradually increasing the reaction temperature from room temperature to room temperature, the reaction was carried out by stirring under a nitrogen stream for 5 hours. 5% in this reaction mixture
After adding 50 parts of an aqueous sodium hydroxide solution and stirring the mixture at room temperature for 30 minutes, the produced polymer was collected, thoroughly washed with water and methanol, and dried under reduced pressure. Through the above operation, a spacer-introduced polymer (PSPEOA) represented by the following Chemical formula 7 having an amino group content of 0.2 mmol / g was obtained.
【００３７】[0037]
【化７】[Chemical 7]
【００３８】レグホンにヒトＬＤＬを完全アジュバント
とともに注射により投与し免役したレグホンの鶏卵から
抗ヒトＬＤＬ抗体を分離した。すなわち鶏卵の卵黄部分
を取り出しその５倍量の０．１％λカラギーナン水溶液
を混合して１５００×ｇ，１０分遠心分離し、その上清
をＤＥＡＥクロマトグラフィおよび塩析により精製し
た。鶏卵１個から約７０ｍｇの特異的ＩｇＹが得られ
た。Human LDL was administered to leghorn by injection together with complete adjuvant, and anti-human LDL antibody was isolated from the immunized egg of leghorn. That is, the yolk portion of the hen's egg was taken out, mixed with a 5-fold amount of 0.1% λ carrageenan aqueous solution and centrifuged at 1500 × g for 10 minutes, and the supernatant was purified by DEAE chromatography and salting out. About 70 mg of specific IgY was obtained from one chicken egg.
【００３９】ＩｇＹの上記スペーサー導入ポリマーへの
固定化はＤＭＳＯ溶液中でＤＣＣによるカップリング反
応により検討した。すなわち１０部のＩｇＹのＤＭＳＯ
溶液３０００部に１０００部のＰＳＰＥＯＡおよびＤＣ
Ｃ１部を加え、０℃で３時間攪拌した後室温に２０時間
放置後、固形分を濾別し、ＤＭＳＯで洗浄後、水洗し、
減圧乾燥した。Immobilization of IgY on the above-mentioned spacer-introduced polymer was examined by a coupling reaction with DCC in a DMSO solution. Ie 10 parts of IgY DMSO
1000 parts of PSPEOA and DC to 3000 parts of solution
C1 part was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 3 hours and allowed to stand at room temperature for 20 hours, then the solid content was separated by filtration, washed with DMSO, and then washed with water,
It was dried under reduced pressure.
【００４０】上記のＩｇＹ固定吸着材（ＰＳＰＥＯ−Ｉ
ｇＹ）を１００ｍｌのカラムに充填し、１００Ｕ／ｍｌ
のヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／
ｍｌのヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌでカラム
内、および血液回路内を洗浄した。一方、クエン酸加豚
血１１をビーカーにとり、カラムを通して再びこのビー
カーに戻すよう血液回路を組んだ。この装置を用いて血
液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで灌流実験を３時間連続して行
い、カラム前後の血中ＬＤＬの量を測定した。また、灌
流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小
板量を測定した。ＬＤＬの定量は和光純薬製β−リポ蛋
白Ｃ−テストワコーを用いてヘパリン沈澱・比色法によ
って行った。アルブミン量はブロムクレゾールグリーン
法、総蛋白量はビウレット法、血小板量は自動血球算定
装置を用いて定量した。結果は表１、表２に示した。な
お、ＬＤＬの量は実際の測定値、アルブミン、総蛋白、
血小板については３時間灌流前後の残存率で表示した。The above-mentioned IgY fixed adsorbent (PSPEO-I
gY) in a 100 ml column and 100 U / ml
100 ml of physiological saline containing heparin, followed by 1 U /
The inside of the column and the inside of the blood circuit were washed with 100 ml of physiological saline containing ml of heparin. On the other hand, a blood circuit was constructed so that the citrated pig blood 11 was placed in a beaker and returned to this beaker through a column. Using this apparatus, a perfusion experiment was continuously performed for 3 hours at a blood flow rate of 50 ml / min, and the amount of LDL in blood before and after the column was measured. In addition, albumin amount, total protein amount, and platelet amount in whole blood before and after the start of perfusion were measured. LDL was quantified by heparin precipitation / colorimetric method using β-lipoprotein C-Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries. The amount of albumin was determined by the bromcresol green method, the amount of total protein was determined by the Biuret method, and the amount of platelets was determined by an automatic hemocytometer. The results are shown in Tables 1 and 2. The amount of LDL is the actual measured value, albumin, total protein,
For platelets, the residual rate before and after perfusion for 3 hours was displayed.
【００４１】[0041]
【表１】 [Table 1]
【００４２】[0042]
【表２】 [Table 2]
【００４３】〈実施例２〉分子量約１００００のキトサ
ン３２０部を４口フラスコに取り、バキュームスターラ
ー、三方コック攪拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付
け、三方コックから脱気、窒素吹送を数回繰り返して容
器内を窒素置換した。アセトニトリル５００部、クロロ
スルホン酸１７５部を加えて、０℃から室温まで徐々に
温度を上昇させながら、窒素気流下で１２時間攪拌して
反応を行わせた。この反応混合物に冷水を加えて反応を
停止させた後、水、メタノールで充分に洗浄し、減圧乾
燥した。以上の操作でスルホン化キトサンを得た。Example 2 320 parts of chitosan having a molecular weight of about 10,000 was placed in a four-necked flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball plug and a rubber septum were attached, and deaeration and nitrogen blowing were repeated from the three-way cock several times. The inside of the container was replaced with nitrogen. Acetonitrile (500 parts) and chlorosulfonic acid (175 parts) were added, and the reaction was carried out by stirring for 12 hours under a nitrogen stream while gradually raising the temperature from 0 ° C to room temperature. After cold water was added to the reaction mixture to stop the reaction, it was thoroughly washed with water and methanol and dried under reduced pressure. Sulfonated chitosan was obtained by the above operation.
【００４４】エチレンジアミン４００部を４口フラスコ
に取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、玉
栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱気、
窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した後、テ
トラヒドロフラン４００部を入れ、室温で攪拌した。次
いで実施例１と同様の方法で得たポリクロロメチルスチ
レン（ＰＣＭＳ）１００部を加え、０℃から徐々に室温
まで反応温度を上げながら、窒素気流気下で５時間攪拌
して反応させた。この反応混合物に５％水酸化ナトリウ
ム水溶液５００部を加え、室温で３０分攪拌した後生成
したポリマーを回収し、水、メタノールで充分に洗浄
し、減圧乾燥した。以上の操作でアミノ基含量０．３ｍ
ｍｏｌ／ｇのアミノ化ポリマー（ＰＳＥＤＡ）を得た。400 parts of ethylenediamine was placed in a four-necked flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball plug, and a rubber septum were attached, and degassing was performed from the three-way cock.
After nitrogen blowing was repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen, 400 parts of tetrahydrofuran was added and stirred at room temperature. Next, 100 parts of polychloromethylstyrene (PCMS) obtained by the same method as in Example 1 was added, and the reaction was carried out by stirring for 5 hours under a nitrogen gas stream while gradually raising the reaction temperature from 0 ° C to room temperature. To this reaction mixture was added 500 parts of a 5% aqueous sodium hydroxide solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then the produced polymer was recovered, washed sufficiently with water and methanol, and dried under reduced pressure. Amino group content of 0.3m
Mol / g aminated polymer (PSEDA) was obtained.
【００４５】ＰＥＯ酸＃６０００を２５０部４口フラス
コに取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、
玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱
気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した。
クロロホルム１０００部、ＤＣＣ６．２部を加えて０℃
で約２０分間攪拌した後、上記アミノ化ポリマー（ＰＳ
ＥＤＡ）１００部を加え０℃で３時間、続いて室温で１
２時間窒素気流気下で攪拌して反応させた。生成物を
水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減圧乾燥した。
以上の操作で末端にカルボキシル基を持つスペーサーの
導入されたポリマー（ＰＳＰＥＯ−ＣＯＯＨ）を得た。
カルボキシル基含量は０．２ｍｍｏｌ／ｇであった。250 parts of PEO acid # 6000 was placed in a four-necked flask, and a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod,
A ball stopper and a rubber septum were attached, deaeration from the three-way cock and nitrogen blowing were repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen.
Add 1000 parts of chloroform and 6.2 parts of DCC and add 0 ° C.
After stirring for about 20 minutes, the above aminated polymer (PS
100 parts of EDA) was added and the mixture was added at 0 ° C. for 3 hours and then at room temperature for 1 hour.
The reaction was carried out by stirring under a nitrogen stream for 2 hours. The product was thoroughly washed with water, DMF and methanol and dried under reduced pressure.
By the above operation, a polymer (PSPEO-COOH) having a carboxyl group-terminated spacer introduced was obtained.
The carboxyl group content was 0.2 mmol / g.
【００４６】５０部の上記ＰＳＰＥＯ−ＣＯＯＨを４口
フラスコに取り、バキュームスターラー、三方コック攪
拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックか
ら脱気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換し
た。クロロホルム１０００部、ＤＣＣ２．２部を加えて
０℃で約２０分間攪拌した後、スルホン化キトサン１５
部を加え０℃で３時間、続いて室温で１２時間窒素気流
気下で攪拌して反応させた。生成物を５％水酸化ナトリ
ウム水溶液、水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減
圧乾燥した。以上の操作でスルホン化キトサン固定吸着
材（ＰＳＰＥＯ−Ｃhit.）を得た。このスルホン化キト
サン固定吸着材（ＰＳＰＥＯ−Ｃhit.）を用いて実施例
１と同様に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤ
Ｌの量、灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋
白量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。50 parts of the above PSPEO-COOH was placed in a four-necked flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirrer, a ball plug and a rubber septum were attached, and deaeration and nitrogen blowing were repeated from the three-way cock several times to fill the inside of the container with nitrogen. Replaced. After adding 1000 parts of chloroform and 2.2 parts of DCC and stirring at 0 ° C. for about 20 minutes, sulfonated chitosan 15 was added.
A part was added and the reaction was carried out at 0 ° C. for 3 hours and then at room temperature for 12 hours with stirring under a nitrogen stream. The product was thoroughly washed with a 5% aqueous sodium hydroxide solution, water, DMF and methanol, and dried under reduced pressure. By the above operation, a sulfonated chitosan-fixed adsorbent (PSPEO-Chit.) Was obtained. Using this sulfonated chitosan-immobilized adsorbent (PSPEO-Chit.), A blood perfusion experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and LD in blood before and after the column was analyzed.
The amount of L, the amount of albumin in the whole blood before and after the start of perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００４７】〈比較例１〉実施例２で得たアミノ化ポリ
マー（ＰＳＥＤＡ）に、スペーサーを介さずに実施例１
と同様の方法でＩｇＹを固定してＩｇＹ固定吸着材（Ｐ
ＳＥ−ＩｇＹ）をえた。このＩｇＹ固定吸着材（ＰＳＥ
−ＩｇＹ）を用いて実施例１と同様に血液灌流実験を行
い、カラム前後の血中ＬＤＬの量、灌流開始前後の全血
液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。
結果は表１、表２に示す。<Comparative Example 1> The aminated polymer (PSEDA) obtained in Example 2 was subjected to Example 1 without interposing a spacer.
IgY is fixed in the same manner as in, and the IgY fixed adsorbent (P
SE-IgY) was obtained. This IgY fixed adsorbent (PSE
-IgY) was used to conduct a blood perfusion experiment in the same manner as in Example 1 to measure the amount of LDL in blood before and after the column, the amount of albumin in total blood before and after the start of perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets.
The results are shown in Tables 1 and 2.
【００４８】〈比較例２〉マロン酸５部を４口フラスコ
に取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、玉
栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱気、
窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した。クロ
ロホルム５００部、ＤＣＣ３．５部を加えて０℃で約２
０分間攪拌した後、実施例２で得たアミノ化ポリマー
（ＰＳＥＤＡ）５０部を加え０℃で３時間、続いて室温
で１２時間窒素気流気下で攪拌して反応させた。生成物
を水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減圧乾燥し
た。<Comparative Example 2> 5 parts of malonic acid was placed in a 4-neck flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball plug and a rubber septum were attached, and degassing was performed from the three-way cock.
The interior of the container was replaced with nitrogen by repeating blowing of nitrogen several times. Add 500 parts of chloroform and 3.5 parts of DCC and add about 2 at 0 ℃.
After stirring for 0 minutes, 50 parts of the aminated polymer (PSEDA) obtained in Example 2 was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 3 hours and then at room temperature for 12 hours under a nitrogen stream to react. The product was thoroughly washed with water, DMF and methanol and dried under reduced pressure.
【００４９】このポリマーに、実施例２と同様の方法で
スルホン化キトサンを固定してスルホン化キトサン固定
吸着材（ＰＳＥ−Ｃhit.）を得た。このスルホン化キト
サン固定吸着材（ＰＳＥ−Ｃhit.）を用いて実施例１と
同様に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬの
量、灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白
量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。Sulfonated chitosan was fixed to this polymer in the same manner as in Example 2 to obtain a sulfonated chitosan fixed adsorbent (PSE-Chit.). Using this sulfonated chitosan-immobilized adsorbent (PSE-Chit.), A blood perfusion experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the amount of LDL in blood before and after the column, the amount of albumin in whole blood before and after the start of perfusion, and total protein. And platelet amount were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５０】〈比較例３〉実施例１で用いたのと同じ１
０％のジビニルベンゼンで架橋された粒状多孔ポリスチ
レン（ＰＳ．平均粒径２５０μｍ、平均孔径８００Å）
を未処理のまま１００ｍｌのカラムに充填し、実施例１
と同様に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ
の量、灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白
量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。<Comparative Example 3> Same as that used in Example 1
Granular porous polystyrene cross-linked with 0% divinylbenzene (PS. Average particle size 250 μm, average pore size 800Å)
Was untreated and packed in a 100 ml column.
Blood perfusion experiment was performed in the same manner as above, and blood LDL before and after the column
, The amount of albumin in the whole blood before and after the start of perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５１】上記の結果から明らかなように、本発明に
血液浄化吸着材は血中の特定成分（実施例で示したのは
高脂血症の原因となるＬＤＬ）を選択的かつ簡便に除去
でき、アルブミン、血小板といった他の血中成分に及ぼ
す影響も小さいことがわかった。この理由は次に示す通
りである。すなわち、本発明の血液浄化吸着材は親水性
のスペーサーを介して担体にリガンドが固定されてお
り、このスペーサーの排除体積効果によって良好な血液
適合性が実現される。また、スペーサーの流動性によ
り、リガンドのモービリティーが増加し、吸着能の向上
に貢献している。As is clear from the above results, the blood purification adsorbent according to the present invention selectively and simply removes a specific component in blood (LDL which causes hyperlipidemia in the examples). It was found that the effect on other blood components such as albumin and platelets was small. The reason for this is as follows. That is, in the blood purification adsorbent of the present invention, the ligand is immobilized on the carrier via the hydrophilic spacer, and good blood compatibility is realized by the excluded volume effect of this spacer. In addition, the mobility of the spacer increases the mobility of the ligand, which contributes to the improvement of the adsorption capacity.
【００５２】本発明の血液浄化吸着材は良好な血液適合
性を有しているため、あらかじめ血液から血漿成分を分
離して灌流をするという煩雑な方法を採る必要がなく、
血液を直接 流することによって充分な効果が期待でき
る。このため、簡便な操作で、血液中の病因物質の除去
による種々の疾病の治療、或いはＢ細胞、Ｔ細胞等特定
成分の選択的は分離に広く利用され得る。Since the blood purification adsorbent of the present invention has good blood compatibility, it is not necessary to separate the plasma component from blood in advance and carry out perfusion.
A sufficient effect can be expected by direct blood flow. Therefore, with a simple operation, it can be widely used for treatment of various diseases by removing pathogenic substances in blood, or selective separation of specific components such as B cells and T cells.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成４年４月１５日[Submission date] April 15, 1992
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Name of item to be corrected] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 血液浄化吸着材Title of the invention Blood purification adsorbent
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は自己免疫疾患（重症筋無
力症、慢性リウマチなど）、免疫関連疾患（気管支喘
息、糸球体腎炎など）、癌（白血病など）、高脂血症な
どの治療、及び幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞など血中細胞成
分の分離を目的とし、血液を接触させることによって血
中の特定成分を分離する血液浄化吸着材に関するもので
ある。The present invention relates to treatment of autoimmune diseases (myasthenia gravis, chronic rheumatism etc.), immune related diseases (bronchial asthma, glomerulonephritis etc.), cancer (leukemia etc.), hyperlipidemia etc. The present invention also relates to a blood purification adsorbent for separating specific components in blood by contacting blood for the purpose of separating blood cell components such as stem cells, B cells and T cells.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、免疫不全、腫瘍、高脂血症など治
療には血漿交換法が有効とされ、広く行われている。し
かしながら、この療法では血漿をすべて交換するため、
（１）不必要成分のみならず、必要な成分までも除去さ
れてしまうこと、（２）除去した血漿に替えて体内に補
充される血漿、あるいは血漿製剤の不足しているため、
大量かつ持続的な入手が困難である、（３）血清肝炎や
アレルギー、さらにはＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候
群）感染の危険性があること、など血漿交換法が内含す
る問題は多い。2. Description of the Related Art Conventionally, the plasmapheresis method has been effective and widely used for the treatment of immunodeficiency, tumor, hyperlipidemia and the like. However, this therapy replaces all plasma, so
(1) Not only unnecessary components but also necessary components are removed, and (2) Insufficient plasma or plasma preparations to be replaced in the body in place of the removed plasma.
There are many problems involved in the plasmapheresis method, such as difficulty in obtaining large quantities and sustained use, (3) serum hepatitis, allergies, and the risk of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) infection.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】こういった状況を背景
として、近年、病因関連物質の選択的除去による治療が
盛んに行われるようになってきた。このような方法は例
えば、メンブレンフィルターを用いるカスケード（Ｓｉ
ｅｂｅｌｔｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｐｌａｓｍａ Ｅｘｃｈａｎ
ｇｅ，Ｐ．２９，Ｆ．Ｋ．Ｓｃｈａｔｔａｕｅｒ Ｖｅ
ｒｌｏｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９８０）、あるいは二重濾過法（阿岸鉄三ら，腎と透
析，１０（３），４７５，１９８１）、凍結濾過法
（Ｌ’Ａｂａｔｔｅ Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｅ
ｕｒ．Ｄｉａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ａｓｓｏ
ｃ．，１４，４８６，１９７７）、塩析血漿処理法（大
江宏明ら，人工臓器，１４０（１），４７２−４７５
（１９８５））が知られている。Against this background, treatment by selective removal of pathogen-related substances has been actively performed in recent years. Such a method is, for example, a cascade (Si
ebelth, H .; G. , Plasma Exchan
ge, P.G. 29, F.I. K. Schattauer Ve
rlog, Stuttgart-New York, 1
980), or double filtration (Tetsuzo Agishi et al., Kidney and dialysis, 10 (3), 475, 1981), freeze filtration (L'Abatte A., et al., Proc. E).
ur. Dial, Transplant. Asso
c. , 14, 486, 1977), salting-out plasma treatment method (Hiroaki Oe et al., Artificial organ, 140 (1), 472-475).
(1985)) is known.
【０００４】他の治療方法としては、各種薬剤の使用が
行われているが、一般に副作用の危険性があり、使用
量、使用期間などに細心の注意を払う必要がある。As other treatment methods, various drugs have been used, but generally there is a risk of side effects, and it is necessary to pay close attention to the amount used and the period of use.
【０００５】このような問題を解決できる治療法として
は、自己の血液を浄化した後に再輸出する方法、すなわ
ち、体外循環血液浄化法が望ましいとされる。この方法
を採するにあたり、副作用がなく、自己の血液から病因
物質を充分且つ選択的に除去することのできる浄化材及
び血液浄化法が望まれていた。As a therapeutic method capable of solving such a problem, a method of purifying own blood and then re-exporting it, that is, an extracorporeal circulation blood purifying method is desirable. In adopting this method, there has been a demand for a purification material and a blood purification method capable of sufficiently and selectively removing a pathogenic substance from own blood without causing side effects.
【０００６】従来、この目的に供し得る血液浄化材とし
ては、 （１）アフィニティー吸着材（例えば、特公平２−５０
９６、特公平２−２６９８８、特開平１−１５８９７０
など） （２）多孔性樹脂（例えば、特開昭５６−１４７７１
０、特公昭６２−２５４６、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ製の
「アンバーライトＸＡＤ−７」など） （３）イオン交換体（例えばカルボキシメチルセルロー
ル、ジエチルアミノエチルアガロースなど） （４）無機多孔体（例えば特公昭６２−２５４３、多孔
質ガラス、ジエチルアミノエチルアガロースなど）があ
る。Heretofore, as blood purifying materials that can be used for this purpose, (1) affinity adsorption materials (for example, Japanese Patent Publication No. 2-50)
96, JP-B-2-26988, JP-A-1-158970.
(2) Porous resin (for example, JP-A-56-14771)
0, Japanese Examined Patent Publication No. 62-2546, "Amberlite XAD-7" manufactured by Rohm & Haas, etc.) (3) Ion exchangers (for example, carboxymethyl cellulose, diethylaminoethyl agarose, etc.) (4) Inorganic porous substance (for example, Japanese Examined Patent Publication No. 62- 2543, porous glass, diethylaminoethyl agarose, etc.).
【０００７】しかし、多孔性樹脂やイオン交換体が吸着
能が小さい上に吸着特異性が低く、これを血液浄化材と
して用いると効果が充分でないばかりでなく、血中の必
須成分までも吸着してしまう可能性があり、安全性の面
でも問題がある。また、無機多孔体は吸着能、吸着特性
については比較的良好であるが、未だ実用に供するには
不十分であり、血液適合性に乏しいため、多量のヘパリ
ンの添加が必要となり、出血傾向等の副作用が生じる、
このような点から、将来的に最も可能性の大きいアフィ
ニティー吸着材による有用は血液浄化材の開発が望まれ
ている。However, porous resins and ion exchangers have low adsorption ability and low adsorption specificity, and when they are used as blood purification materials, not only the effect is not sufficient, but also essential components in blood are adsorbed. There is a possibility that it will end up, and there is a problem in terms of safety. In addition, although the inorganic porous material is relatively good in adsorption ability and adsorption characteristics, it is still insufficient for practical use and poor in blood compatibility, so that it is necessary to add a large amount of heparin, and bleeding tendency, etc. Side effects of
From this point of view, it is desired to develop a useful blood purification material with an affinity adsorbent, which has the greatest possibility in the future.
【０００８】アフィニティー吸着材は、生物学アフィニ
ティー吸着材（抗原抗体結合、補体結合、Ｆｃ結合等の
生物学的相互作用で血液中の病因物質と結合し、これを
吸着するもの）と物理化学的アフィニティー吸着材（静
電結合、水素結合、ファンデルワールス力当物理的また
は化学的相互作用によって血液中の病因物質と結合し、
これを吸着するもの）とに大別でき、さらに従来知られ
ている物理化学的アフィニティー吸着材は以下の６つに
分類することができる。 （１）カルボキシル基またはスルホン酸基を表面に有す
る多孔体（例えば、特開昭５６−１４７７１０、特開昭
５７−５６０３８、特開昭５７−７５１４１、特開昭５
７−１７０２６３、特開昭５７−１９７２９４、） （２）疎水性アミノ酸が結合されている親水性担体（例
えば、特開昭５７−１２２８７５、特開昭５８−１５９
２４、特開昭５８−１６５８５９、特開昭５８−１６５
８６１、旭メディカル製イムソーバー） （３）その他疎水性低分子化合物が固定されている担体
（例えば特開平１−１５８９７０） （４）変性免疫グロブリン（ＩｇＧ）が結合されている
親水性担体（例えば特開昭５７−７７６２４、特開昭５
７−７７６２５、特開昭５７−１５６０３５） （５）メチル化アルブミンが結合されている多孔体（例
えば特開昭５５−１２０８７５、特開昭５５−１２５８
７２） （６）糖または改質した糖が結合されている担体（例え
ば特開昭５７−１３４１６４、特開昭５８−１３３２５
７、鐘淵化学リポソーバー） （７）、プリン塩基またはピリミジン塩基、或いは糖燐
酸が結合されている多孔体（例えば特開昭５７−１９２
５６０、特開昭５８−６１７５２、特開昭５８−９８１
４２）[0008] The affinity adsorbent is a bioaffinity adsorbent (which binds to a pathogen in blood by biological interaction such as antigen-antibody binding, complement binding, Fc binding, etc. and adsorbs it) and physical chemistry. Affinity adsorbent (electrostatic bond, hydrogen bond, van der Waals force binding to bind to pathogens in blood by physical or chemical interaction,
This can be roughly classified into the following (6) and the conventionally known physicochemical affinity adsorbents can be classified into the following 6 types. (1) Porous material having a carboxyl group or a sulfonic acid group on its surface (for example, JP-A-56-147710, JP-A-57-56038, JP-A-57-75141, and JP-A-5-75141).
7-170263, JP-A-57-197294, (2) Hydrophilic carrier to which a hydrophobic amino acid is bound (for example, JP-A-57-122875, JP-A-58-159).
24, JP-A-58-165859, JP-A-58-165.
861, Asahi Medical Imsorber) (3) A carrier to which other hydrophobic low molecular weight compounds are fixed (for example, JP-A-1-158970) (4) A hydrophilic carrier to which modified immunoglobulin (IgG) is bound (for example, Kai 57-77624, JP-A-5
7-77625, JP-A-57-156035) (5) Porous substance to which methylated albumin is bound (for example, JP-A-55-10875 and JP-A-55-1258).
72) (6) Carrier to which sugar or modified sugar is bound (for example, JP-A-57-134164 and JP-A-58-13325)
7. Kanegafuchi Chemical Liposorber (7), a purine base or pyrimidine base, or a porous body to which sugar phosphate is bound (for example, JP-A-57-192).
560, JP-A-58-61752, JP-A-58-981
42)
【０００９】しかし、これら従来の物理化学的アフィニ
ティー吸着材も、体外循環血液浄化療法による自己免疫
疾患等の治療には充分とは言えず、血液適合性にも乏し
いことから、さらに高い効率及び特異性で病因物質を除
去することができ、また体液に対する悪影響の少ない浄
化材が望まれている。However, these conventional physicochemical affinity adsorbents cannot be said to be sufficient for the treatment of autoimmune diseases and the like by extracorporeal blood purification, and are also poor in blood compatibility, and therefore have higher efficiency and specificity. There is a demand for a purification material that can remove the etiological agent and that has less adverse effect on body fluid.
【００１０】このようは概念に基づいて開発された血液
浄化材については、例えば、特開平１−１５８９７０と
いう特許が開示されている、この特許によって開示され
ている血液浄化材は、重合度１〜９０のイチレンオキサ
イド骨格を有する親水性スペーサーを介して、リガンド
となる低分子有機化合物を水不溶性多孔質固体表面に固
定し、これに直接血液を灌流して免疫グロブリンを吸着
することを特徴としている。Regarding the blood purifying material developed based on such a concept, for example, the patent JP-A-1-158970 is disclosed. The blood purifying material disclosed by this patent has a polymerization degree of 1 to 1. A low molecular organic compound serving as a ligand is immobilized on the surface of a water-insoluble porous solid through a hydrophilic spacer having 90 alkylene oxide skeleton, and blood is directly perfused on the surface to adsorb immunoglobulin. There is.
【００１１】親水性スペーサーの持つ意義は大きく二つ
に分けることができる。第一に、血液中の血球成分や、
被吸着物質でない蛋白の付着を防止することである。親
水性スペーサーはその周辺に水を吸着している。このた
め吸着材表面は水の層に覆われ、この水の層が血球成分
の付着を防いでいる（排除体積効果）。また、水の層を
形成するスペーサーが運動することにより、さらに血球
成分の付着は困難になり、付着した血球成分は脱離しや
すくなる。また、凝固因子や補体の活性化が抑制される
といった利点を有する。The significance of the hydrophilic spacer can be broadly divided into two. First, the blood cell components in blood,
This is to prevent the attachment of proteins that are not adsorbed substances. The hydrophilic spacer adsorbs water around the hydrophilic spacer. Therefore, the surface of the adsorbent is covered with a layer of water, and this layer of water prevents adhesion of blood cell components (excluded volume effect). Further, the movement of the spacer forming the water layer makes it more difficult to attach the blood cell component, and the attached blood cell component is likely to be detached. It also has the advantage that the activation of coagulation factors and complement is suppressed.
【００１２】第二に、リガンドの運動性を上昇させるこ
とによって吸着能の向上が期待できるということであ
る。特に被吸着物質が巨大分子である場合、リガンドを
担体表面に直接固定しただけでは被吸着物質とリガンド
の接近が困難であり、また一部で結合したとしても結合
サイトの数が充分ではなく、容易に脱着してしまう可能
性が大きい。親水性スペーサーを介在させることによっ
て被吸着物質とリガンドとの接近が促進され、またリガ
ンドの動きに融通性があるため周囲のリガンドが被吸着
物質との結合に参与しやすく、このため結合サイトの多
い強固な結合を生成することができる。Second, it is expected that the adsorptivity can be improved by increasing the mobility of the ligand. Particularly when the substance to be adsorbed is a macromolecule, it is difficult to approach the substance to be adsorbed and the ligand by directly fixing the ligand to the surface of the carrier, and even if some of them are bound, the number of binding sites is not sufficient. There is a high possibility that they will be easily removed. By interposing a hydrophilic spacer, the approach between the substance to be adsorbed and the ligand is promoted, and the flexibility of the movement of the ligand makes it easy for surrounding ligands to participate in the binding with the substance to be adsorbed. Many tight bonds can be generated.
【００１３】特開平１−１５８９７０では、重合度１〜
９０のエチレンオキサイド骨格を有する親水性スペーサ
ーを介在させているが、分子量５０００以上のリガンド
の固定が必要な場合においては、スペーサーの重合度が
１〜９０ではリガンドの運動性が未だなお制限されるた
め、被吸着物質との相互作用が弱くなり、満足すべき充
分な性能が得られない。In JP-A-1-158970, the degree of polymerization is 1
Although a hydrophilic spacer having an ethylene oxide skeleton of 90 is interposed, when the immobilization of a ligand having a molecular weight of 5000 or more is required, the mobility of the ligand is still limited when the degree of polymerization of the spacer is 1 to 90. Therefore, the interaction with the substance to be adsorbed is weakened, and satisfactory performance cannot be obtained.
【００１４】さらに、スペーサーの重合度が９０以下で
は排除体積効果が未だ充分でなく、特開平１−１５８９
７０においても血液適合性向上のためアクリル酸誘導体
のコーティングを行っている。このような操作は煩雑で
あるばかりでなく、毒性をもった物質の溶出を招く可能
性も存在する。Further, when the degree of polymerization of the spacer is 90 or less, the excluded volume effect is not yet sufficient, and therefore, the method disclosed in JP-A-1-15989 is used.
Also in No. 70, an acrylic acid derivative is coated to improve blood compatibility. Such an operation is not only complicated, but may cause the elution of a toxic substance.
【００１５】[0015]
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来技術
の欠点を解決し、高分子リガンドの効果を充分に引き出
して、良好な吸着能、吸着特性を有し、コーティング等
の煩雑な操作を省略してなお充分な血液適合性を持った
血液浄化吸着材を提供することにより、副作用がなく、
自己の血液から病因物質を充分且つ選択的に除去するこ
とのできる効果的な体外循環血液浄化療法を実現しよう
としたものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention solves the above-mentioned drawbacks of the prior art, sufficiently brings out the effect of the polymer ligand, has a good adsorption capacity and adsorption characteristics, and requires complicated operations such as coating. By omitting and providing a blood purification adsorbent with sufficient blood compatibility, there are no side effects,
It is intended to realize an effective extracorporeal blood purification treatment capable of sufficiently and selectively removing a pathogenic substance from its own blood.
【００１６】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明の血液浄化吸着材
は、水不溶性固体表面に重合度１００から５００のポリ
アルキレンオキサイドおよびまたはその誘導体を介して
分子量５０００から１００００００のリガンドを固定
し、このリガンドによって血中の特定成分を除去または
捕集することを特徴とするものである。本発明の血液浄
化吸着材は、水不溶性固体がポリスチレン、ポリメタク
リル酸およびその誘導体或いはこれらの共重合体などの
合成有機高分子化合物、セルロース、キチン、キトサン
等の天然有機高分子化合物、またはアシルセルロース、
アシルキチン等の改質天然有機高分子化合物であること
が好ましい。これらの高分子化合物のうち、機械的高
度、親水性スペーサー導入の容易さ、親水性スペーサー
導入後の水不溶性の保持を考慮すると、適度に架橋した
ポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその誘導体或い
はこれらの共重合体、セルロース、キトサンが望まし
く、さらに好ましくは架橋ポリスチレン、セルロースが
望ましい。以下にジビニルビンゼンで架橋したポリスチ
レン（化１）、ジビニルベンゼンで架橋したポリメタク
リル酸メチル（化２）、セルロース（化３）、キトサン
（化４）の部分構造を示した。The blood purification adsorbent of the present invention has a water-insoluble solid surface on which a ligand having a molecular weight of 5000 to 1,000,000 is immobilized via a polyalkylene oxide having a degree of polymerization of 100 to 500 and / or a derivative thereof. It is characterized in that a specific component in blood is removed or collected by a ligand. In the blood purification adsorbent of the present invention, the water-insoluble solid is a synthetic organic polymer compound such as polystyrene, polymethacrylic acid and its derivative or a copolymer thereof, a natural organic polymer compound such as cellulose, chitin, chitosan, or an acyl group. cellulose,
A modified natural organic polymer compound such as acyl chitin is preferable. Considering mechanical strength, ease of introduction of hydrophilic spacers, and retention of water insolubility after introduction of hydrophilic spacers among these polymer compounds, moderately cross-linked polystyrene, polymethacrylic acid and its derivatives or their Polymers, cellulose and chitosan are preferable, and crosslinked polystyrene and cellulose are more preferable. The partial structures of polystyrene (chemical formula 1) crosslinked with divinylbinzene, polymethylmethacrylate (chemical formula 2), cellulose (chemical formula 3) and chitosan (chemical formula 4) crosslinked with divinylbenzene are shown below.
【００１７】[0017]
【化１】 [Chemical 1]
【００１８】[0018]
【化２】 [Chemical 2]
【００１９】[0019]
【化３】 [Chemical 3]
【００２０】[0020]
【化４】 [Chemical 4]
【００２１】本発明は親水性スペーサーとして重合度１
００から５００のポリアルキレンオキサイド、またはそ
の誘導体を用いることを特徴とするものである。ここで
言う誘導体とは、両端の水酸基を別の官能基で置き換え
たものた、オキシアルキレン鎖の水素原子をハロゲンや
官能基で置換したものなどを言う。ポリエチレンオキサ
イドの誘導体として、ＰＥＯ酸（化５）、ＰＥＯアミン
（化６）の構造を以下に記した。The present invention uses a hydrophilic spacer having a degree of polymerization of 1
It is characterized by using from 00 to 500 polyalkylene oxides or derivatives thereof. The term "derivative" as used herein refers to a derivative in which hydroxyl groups at both ends are replaced with another functional group, or a hydrogen atom in an oxyalkylene chain is replaced with a halogen or a functional group. The structures of PEO acid (Chemical formula 5) and PEO amine (Chemical formula 6) as the derivative of polyethylene oxide are shown below.
【００２２】[0022]
【化５】 [Chemical 5]
【００２３】[0023]
【化６】 [Chemical 6]
【００２４】親水性スペーサーの鎖長は吸着する物質の
大きさに応じて適当に変えることが推奨される。例え
ば、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）を吸着して除去する場合
は、重合度１００から３００、好ましくは１２０から２
５０が望ましい。これよりも重合度が小さいと巨大分子
であるＬＤＬはリガンドへの接近が困難になって充分な
吸着能が得られず、これよりも分子量が大きいと材料表
面のリガンドの存在密度が疎らになりすぎて吸着能の低
下を招いてしまう。It is recommended that the chain length of the hydrophilic spacer be appropriately changed according to the size of the substance to be adsorbed. For example, when LDL (low density lipoprotein) is adsorbed and removed, the degree of polymerization is 100 to 300, preferably 120 to 2
50 is desirable. If the degree of polymerization is smaller than this, LDL, which is a macromolecule, becomes difficult to access the ligand and sufficient adsorption capacity cannot be obtained, and if the molecular weight is larger than this, the density of ligands on the material surface becomes sparse. If it is too much, the adsorptivity will be reduced.
【００２５】本発明の吸着材が対象とする被吸着物質は
血液中に種々の特定物質であるが、より詳細には通常の
免疫グロブリン（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ）、抗ＤＮＡ抗
体、抗アセチルコリンレセプター抗体、抗血液型抗体、
抗血小板抗体などの自己抗体；抗原・抗体複合物；エン
ドトキシン；リウマチ因子；ＬＤＬ、ＶＬＤＬなどのリ
ポ蛋白；幹細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファー
ジ、ＴＩＬ（癌組織浸潤Ｔ細胞）などの血中細胞成分な
どが挙げられる。The substances to be adsorbed targeted by the adsorbent of the present invention are various specific substances in blood. More specifically, ordinary immunoglobulins (A, D, E, G, M) and anti-DNA antibodies are used. , Anti-acetylcholine receptor antibody, anti-blood group antibody,
Autoantibodies such as antiplatelet antibodies; antigen-antibody complexes; endotoxins; rheumatoid factors; lipoproteins such as LDL and VLDL; stem cells, B cells, T cells, monocytes, macrophages, TILs (cancer tissue infiltrating T cells), etc. Examples include cell components in blood.
【００２６】本発明に使用される水不溶性固体の形状
は、粒子状、繊維状、膜状等いずれの公知の形状も用い
られ得るが、通液性、表面積確保、吸着材調製時の取扱
いの容易さなどの点から、粒子状もしくは繊維状が望ま
しい。粒子状担体の平均粒径は１０μｍから５ｍｍの範
囲にあることが望ましいが、粒径が小さくなると血球の
流通抵抗が大きくなり、粒径が大きくなると担体充填量
の現象、ひいては有効表面積の減少を招くので、平均粒
径３０μｍから１ｍｍの範囲にあることが望ましい。さ
らに好ましくは平均粒径５０μｍから５００μｍが望ま
しい。粒子形状については、細胞に損傷を与えにくいこ
とや、物理的外力に対する強度、繊維状担体の繊維直径
は０．１μｍから５０μｍ、好ましくは０．３μｍから
２５μｍが望ましく、さらに好ましくは０．５μｍから
１５μｍが望ましい。The shape of the water-insoluble solid used in the present invention may be any known shape such as particle shape, fibrous shape, and film shape. From the viewpoint of easiness and the like, a particulate form or a fibrous form is desirable. It is desirable that the average particle size of the particulate carrier is in the range of 10 μm to 5 mm, but as the particle size becomes smaller, the flow resistance of blood cells increases, and when the particle size becomes larger, the phenomenon of carrier loading amount and eventually the effective surface area decrease. Therefore, it is desirable that the average particle size is in the range of 30 μm to 1 mm. More preferably, the average particle size is 50 μm to 500 μm. Regarding the particle shape, cells are less likely to be damaged, the strength against physical external force, and the fiber diameter of the fibrous carrier is 0.1 μm to 50 μm, preferably 0.3 μm to 25 μm, and more preferably 0.5 μm. 15 μm is desirable.
【００２７】担体には有効表面積を拡大するため微小孔
が存在することが好ましい。例えば、リガンドとして抗
ＬＤＬ（低比重リポ蛋白質）抗体を固定して、血液中の
ＬＤＬを選択的に除去する吸着材として用いる場合、そ
の平均孔径は粒子状担体の場合、２０Åから２００００
Å、好ましくは１００から１５０００Å、さらに好まし
くは１０００Åから１２０００Å、繊維状担体の場合２
０Åから３０００Å、好ましくは１００Åから２０００
Åである。これより平均孔径が小さいと被吸着物質が微
小孔内部まで到達できず、これより大きいと有効表面積
を拡大する効果が不十分であり、また担体の強度低下を
招くことになる。It is preferable that the carrier has micropores for expanding the effective surface area. For example, when an anti-LDL (low-density lipoprotein) antibody is immobilized as a ligand and is used as an adsorbent for selectively removing LDL in blood, the average pore size of the particulate carrier is 20Å to 20,000.
Å, preferably 100 to 15000 Å, more preferably 1000 Å to 12000 Å, in case of fibrous carrier 2
0Å to 3000Å, preferably 100Å to 2000
It is Å. If the average pore diameter is smaller than this, the substance to be adsorbed cannot reach the inside of the micropores, and if it is larger than this, the effect of expanding the effective surface area is insufficient and the strength of the carrier is lowered.
【００２８】本発明に使用される水不溶性固体へのスペ
ーサーの導入の方法は共有結合、電子線照射によるグラ
フト化など、特に制限されないが、架橋ポリスチレンに
スペーサーを導入する場合、例えば以下のような方法が
用いられる。 （１）架橋ポリクロロメチルスチレンの合成 ジビニルベンゼンを１〜７０ｗｔ％、好ましくは２〜５
０ｗｔ％含む化１の架橋ポリスチレンにクロロホルムを
加え、室温で１５分以上、好ましくは３０分以上攪拌し
て充分に膨潤させた後、クロロメチルメチルエーテルと
触媒を加え、２５℃〜１００℃、好ましくは３０℃〜６
０℃で３０分〜１２時間、好ましくは２時間〜７時間窒
素気流気下にて攪拌しながら反応させると、クロロメチ
ル基導入率１０〜１００％、好ましくは２５〜９５％の
架橋ポロクロロメチルスチレンが得られる。上記触媒と
しては、塩化アルミニウムのようなアルミニウム系触
媒、塩化錫のような錫系触媒、塩化亜鉛のような亜鉛系
触媒が挙げられる。触媒は反応溶液中に０．３％〜５．
０％、好ましくは０．４％〜３．０％の含量で添加され
る。上記クロロメチル化反応において、各成分の混合重
量比は次の通りである。ポリスチレンとクロロホルムの
重量比は２／１〜１／１０、好ましくは１／１〜１／
７、ポリスチレンとクロロホルムの合計量とクロロメチ
ルメチルエーテルの混合重量比は３０／１〜１／５、好
ましくは１５／１〜１／３である。The method of introducing the spacer into the water-insoluble solid used in the present invention is not particularly limited, such as covalent bonding and grafting by electron beam irradiation. When introducing the spacer into the crosslinked polystyrene, for example, the following method is used. A method is used. (1) Synthesis of crosslinked polychloromethylstyrene 1-70 wt% of divinylbenzene, preferably 2-5
Chloroform was added to the crosslinked polystyrene of Chemical formula 1 containing 0 wt% and stirred at room temperature for 15 minutes or more, preferably 30 minutes or more to sufficiently swell, and then chloromethyl methyl ether and a catalyst were added, and 25 ° C to 100 ° C, preferably Is 30 ° C to 6
When the reaction is carried out at 0 ° C. for 30 minutes to 12 hours, preferably 2 hours to 7 hours while stirring under a nitrogen stream, the crosslinked porochloromethyl group having a chloromethyl group introduction rate of 10 to 100%, preferably 25 to 95%. Styrene is obtained. Examples of the catalyst include aluminum-based catalysts such as aluminum chloride, tin-based catalysts such as tin chloride, and zinc-based catalysts such as zinc chloride. The catalyst is 0.3% to 5.% in the reaction solution.
It is added in a content of 0%, preferably 0.4% to 3.0%. In the chloromethylation reaction, the mixing weight ratio of each component is as follows. The weight ratio of polystyrene to chloroform is 2/1 to 1/10, preferably 1/1 to 1 /
7. The total weight of polystyrene and chloroform and the mixing weight ratio of chloromethyl methyl ether are 30/1 to 1/5, preferably 15/1 to 1/3.
【００２９】（２）スペーサーの導入 重合度１００〜３００、好ましくは１２０〜２５０の化
６のＰＥＯアミンを不活性溶媒に溶解させる。これに上
記（１）で得たポリクロロメチルスチレンを加え、０℃
から徐々に室温まで反応温度を上げ、３０分〜１２時間
好ましくは１時間〜４時間に亘り反応させる。これに水
酸化ナトリウム水溶液を加え、約３０分攪拌した後、生
成物を回収する。以上の操作によってアミノ基含量０．
００１μｍｏｌ／ｇ〜１．０ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは
０．００５μｍｏｌ／ｇ〜０．５ｍｍｏｌ／ｇの化合物
下記（化７）が得られる。(2) Introduction of Spacer The PEO amine of the formula 6 having a polymerization degree of 100 to 300, preferably 120 to 250 is dissolved in an inert solvent. To this, add the polychloromethylstyrene obtained in (1) above,
The reaction temperature is gradually raised from 1 to room temperature, and the reaction is carried out for 30 minutes to 12 hours, preferably 1 hour to 4 hours. An aqueous sodium hydroxide solution is added to this, and the product is recovered after stirring for about 30 minutes. By the above operation, the amino group content was 0.
001 μmol / g to 1.0 mmol / g, preferably 0.005 μmol / g to 0.5 mmol / g of the following compound (Formula 7) is obtained.
【００３０】[0030]
【化７】 [Chemical 7]
【００３１】上記の反応に用いられる溶媒はクロロホル
ム、ベンゼンなどの有機溶媒、アルカリ水溶液などの水
系溶媒も用いられ得るが、テトラヒドロフラン、テトラ
ヒドロピラン、ジオキサン等の環状エーテル類が好まし
い。上記反応におけるポリクロロメチルスチレン中のク
ロロメチル基とＰＥＯアミンとの混合モル比は３／１〜
１／３０好ましくは１／１〜１／１５である。The solvent used in the above reaction may be an organic solvent such as chloroform or benzene, or an aqueous solvent such as an alkaline aqueous solution, but cyclic ethers such as tetrahydrofuran, tetrahydropyran and dioxane are preferable. In the above reaction, the mixing molar ratio of the chloromethyl group in polychloromethylstyrene and the PEO amine is 3/1 to
It is preferably 1/30 to 1/1 to 1/15.
【００３２】上記のような方法でスペーサーを導入した
担体にリガンドを導入する。固定するリガンドは被吸着
物質によって適宜変える必要があるが、抗原抗体結合、
補体結合、Ｆｃ結合等の生物学的相互作用を利用する種
々の生物学的リガンド；または、変性免疫グロブリン
（ＩｇＧ）、糖または改質した糖、含プリン塩基化合
物、含ピリミジン塩基化合物、糖燐酸などの、静電結
合、水素結合、ファンデルワールス力等物理的または化
学的相互作用を利用した種々の物理化学的リガンドが考
えられる。担体の固定方法は、共有結合、物理的吸着、
イオン結合、生化学的特異結合等特に制限されないが、
血液中での結合安定性を考慮すると、共有結合が好まし
い。The ligand is introduced into the carrier into which the spacer has been introduced by the above method. The ligand to be immobilized must be changed appropriately depending on the substance to be adsorbed,
Various biological ligands utilizing biological interactions such as complement fixation and Fc binding; or modified immunoglobulin (IgG), sugar or modified sugar, purine-containing base compound, pyrimidine-containing base compound, sugar Various physicochemical ligands such as phosphoric acid utilizing electrostatic or hydrogen bonding, physical or chemical interaction such as van der Waals force are conceivable. The method of immobilizing the carrier includes covalent bond, physical adsorption,
Ionic bond, biochemical specific bond, etc. are not particularly limited,
A covalent bond is preferable in view of the bond stability in blood.
【００３３】例えばＬＤＬの吸着除去を目的にするので
あれば以下のような方法で、鶏卵から得た抗ＬＤＬ抗体
であるＩｇＹを導入する方法が用いられ得る。化７のス
ペーサー導入済担体にクエン酸緩衝液を加えて室温で１
５分以上、好ましくは３０分以上攪拌し、Ｎ−シクロヘ
キシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ド−メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（以下ＣＭＥＣと
略記する）によるカップリング反応でＩｇＹを固定す
る。反応温度は０〜３０℃で行うことが好ましい。For the purpose of adsorbing and removing LDL, for example, a method of introducing IgY which is an anti-LDL antibody obtained from chicken eggs can be used by the following method. Add citrate buffer to the spacer-introduced carrier of Chemical formula 1 and
Stir for 5 minutes or more, preferably 30 minutes or more, and fix IgY by a coupling reaction with N-cyclohexyl-N ′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth-p-toluenesulfonate (hereinafter abbreviated as CMEC). To do. The reaction temperature is preferably 0 to 30 ° C.
【００３４】例えば上記の様な方法で、粒子状もしくは
繊維状の水不溶性固体表面上にスペーサーを導入し、続
いて被吸着物質に応じた適当はリガンドを固定した後、
これを適当な容器に充填することによって本発明の血液
浄化吸着材が得られる。容器の材質はガラス、ステンレ
ス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等、特に
制限されないが、減菌等の取扱いを考慮すると、ポリプ
ロピレンやポリカーボネイトが好ましい。容器の形態に
ついても特に制限されないが、粒子状担体の場合は両端
を血液流入部、血液流出部とした円筒のカラム型、繊維
状担体の場合は粒子状担体の場合と同様のカラム型、或
いはシート状に成形した後、これを挟み込むような形態
にしたものが適当であろう。For example, by the method as described above, a spacer is introduced on the surface of a particulate or fibrous water-insoluble solid, and then a suitable ligand is fixed according to the substance to be adsorbed.
The blood purification adsorbent of the present invention can be obtained by filling this in a suitable container. The material of the container is not particularly limited, such as glass, stainless steel, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., but polypropylene and polycarbonate are preferable in consideration of handling such as sterilization. The form of the container is also not particularly limited, but in the case of a particulate carrier, a cylindrical column type with both ends of blood inflow part and blood outflow part, in the case of a fibrous carrier, a column type similar to the case of the particulate carrier, or It is suitable that the sheet is formed into a sheet and then sandwiched.
【００３５】[0035]
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明する。実
施例中の部は重量部を意味する。 〈実施例１〉１０％のジビニルベンゼンで架橋された粒
状多孔ポリスチレン（平均粒径２５０μｍ、平均孔径８
００Å）１００部を４口フラスコに取り、バキュームス
ターラー、上部に三方コックを取り付けた冷却管（水道
水を循環させる）、攪拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取
り付け、三方コックから脱気、窒素吹送を数回繰り返し
て容器内を窒素置換した。クロロホルム１０００部を入
れ、充分膨潤するまで室温で１時間攪拌した。次いでク
ロロメチルメチルエーテル７０部、塩化亜鉛１０部を加
え、５０℃で５時間、窒素気流気下で反応させた。こう
して得られた生成物を回収し、ジオキサン、水、メタノ
ールで充分洗浄した後減圧乾燥し、ポリクロロメチルス
チレン（ＰＣＭＳ）を得た。塩素含量を元素分析によっ
て定量し、その値から全ベンゼン環に対するクロロメチ
ル基導入率を算出したところ、４５％であった。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples. Parts in the examples mean parts by weight. Example 1 Granular porous polystyrene crosslinked with 10% divinylbenzene (average particle size 250 μm, average pore size 8)
(00Å) 100 parts is put into a 4-neck flask, vacuum stirrer, cooling pipe (circulating tap water) equipped with a three-way cock on the top, stirring rod, ball plug, rubber septum is attached, and degassing and nitrogen blowing from the three-way cock Was repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen. 1000 parts of chloroform was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour until it swelled sufficiently. Then, 70 parts of chloromethyl methyl ether and 10 parts of zinc chloride were added, and the reaction was carried out at 50 ° C. for 5 hours under a nitrogen stream. The product thus obtained was recovered, thoroughly washed with dioxane, water and methanol and then dried under reduced pressure to obtain polychloromethylstyrene (PCMS). The chlorine content was quantified by elemental analysis, and the chloromethyl group introduction rate to all benzene rings was calculated from the value, which was 45%.
【００３６】平均分子量６０００のＰＥＯアミン１２０
０部を４口フラスコに取り、バキュームスターラー、三
方コック攪拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三
方コックから脱気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を
窒素置換した後、テトラヒドロフラン１０００部を入
れ、充分溶解するまで室温で攪拌した。次いで上記ポリ
クロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ）１０部を加え、０℃
から徐々に室温まで反応温度を上げながら、窒素気流気
下で５時間攪拌して反応させた。この反応混合物に５％
水酸化ナトリウム水溶液５０部を加え、室温で３０分攪
拌した後生成したポリマーを回収し、水、メタノールで
充分に洗浄し、減圧乾燥した。以上の操作でアミノ基含
量０．２ｍｍｏｌ／ｇの下記化７で表されるスペーサー
導入ポリマー（ＰＳＰＥＯＡ）を得た。PEO amine 120 having an average molecular weight of 6000
Take 0 parts in a 4-neck flask, attach a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball stopper, and a rubber septum. After degassing and nitrogen blowing from the three-way cock several times to replace the inside of the container with nitrogen, add 1000 parts of tetrahydrofuran. Then, the mixture was stirred at room temperature until it was completely dissolved. Then, add 10 parts of the above polychloromethylstyrene (PCMS) and
While gradually increasing the reaction temperature from room temperature to room temperature, the reaction was carried out by stirring under a nitrogen stream for 5 hours. 5% in this reaction mixture
After adding 50 parts of an aqueous sodium hydroxide solution and stirring the mixture at room temperature for 30 minutes, the produced polymer was collected, thoroughly washed with water and methanol, and dried under reduced pressure. Through the above operation, a spacer-introduced polymer (PSPEOA) represented by the following Chemical formula 7 having an amino group content of 0.2 mmol / g was obtained.
【００３７】ＰＳＰＥＯＡは、前記した化７に示す、要
部構造を有するものである。PSPEOA has the structure of the essential part shown in the chemical formula 7 above.
【００３８】レグホンにヒトＬＤＬを完全アジュバント
とともに注射により投与し免役したレグホンの鶏卵から
抗ヒトＬＤＬ抗体を分離した。すなわち鶏卵の卵黄部分
を取り出しその５倍量の０．１％λカラギーナン水溶液
を混合して１５００×ｇ，１０分遠心分離し、その上清
をＤＥＡＥクロマトグラフィおよび塩析により精製し
た。鶏卵１個から約７０ｍｇの特異的ＩｇＹが得られ
た。Human LDL was injected into leghorn along with complete adjuvant by injection, and anti-human LDL antibody was isolated from the immunized egg of leghorn. That is, the yolk portion of the hen's egg was taken out, mixed with a 5-fold amount of 0.1% λ carrageenan aqueous solution and centrifuged at 1500 × g for 10 minutes, and the supernatant was purified by DEAE chromatography and salting out. About 70 mg of specific IgY was obtained from one chicken egg.
【００３９】ＩｇＹの上記スペーサー導入ポリマーへの
固定化はＤＭＳＯ溶液中でＤＣＣによるカップリング反
応により検討した。すなわち１０部のＩｇＹのＤＭＳＯ
溶液３０００部に１０００部のＰＳＰＥＯＡおよびＤＣ
Ｃ１部を加え、０℃で３時間攪拌した後室温に２０時間
放置後、固形分を濾別し、ＤＭＳＯで洗浄後、水洗し
て、ＩＧＹ固定吸着材ＰＳＰＥＯ−ＩＧＹ（ＩｇＹ）を
得た。Immobilization of IgY on the above-mentioned spacer-introduced polymer was examined by a coupling reaction with DCC in a DMSO solution. Ie 10 parts of IgY DMSO
1000 parts of PSPEOA and DC to 3000 parts of solution
C1 part was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 3 hours and left at room temperature for 20 hours, then the solid content was filtered off, washed with DMSO, and washed with water to obtain an IGY-immobilized adsorbent PSPEO-IGY (IgY).
【００４０】上記のＩｇＹ固定吸着材（ＰＳＰＥＯ−Ｉ
ｇＹ）を１００ｍｌのカラムに充填し、１００Ｕ／ｍｌ
のヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌ、続いて１Ｕ／
ｍｌのヘパリンを含む生理食塩液１００ｍｌでカラム
内、および血液回路内を洗浄した。一方、クエン酸加豚
血１１をビーカーにとり、カラムを通して再びこのビー
カーに戻すよう血液回路を組んだ。この装置を用いて血
液流量５０ｍｌ／ｍｉｎで灌流実験を３時間連続して行
い、カラム前後の血中ＬＤＬの量を測定した。また、灌
流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血小
板量を測定した。ＬＤＬの定量は和光純薬製β−リポ蛋
白Ｃ−テストワコーを用いてヘパリン沈澱・比色法によ
って行った。アルブミン量はブロムクレゾールグリーン
法、総蛋白量はビウレット法、血小板量は自動血球算定
装置を用いて定量した。結果は表１、表２に示した。な
お、ＬＤＬの量は実際の測定値、アルブミン、総蛋白、
血小板については３時間灌流前後の残存率で表示した。The above-mentioned IgY fixed adsorbent (PSPEO-I
gY) in a 100 ml column and 100 U / ml
100 ml of physiological saline containing heparin, followed by 1 U /
The inside of the column and the inside of the blood circuit were washed with 100 ml of physiological saline containing ml of heparin. On the other hand, a blood circuit was constructed so that the citrated pig blood 11 was placed in a beaker and returned to this beaker through a column. Using this apparatus, a perfusion experiment was continuously performed for 3 hours at a blood flow rate of 50 ml / min, and the amount of LDL in blood before and after the column was measured. In addition, albumin amount, total protein amount, and platelet amount in whole blood before and after the start of perfusion were measured. LDL was quantified by heparin precipitation / colorimetric method using β-lipoprotein C-Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries. The amount of albumin was determined by the bromcresol green method, the amount of total protein was determined by the Biuret method, and the amount of platelets was determined by an automatic hemocytometer. The results are shown in Tables 1 and 2. The amount of LDL is the actual measured value, albumin, total protein,
For platelets, the residual rate before and after perfusion for 3 hours was displayed.
【００４１】[0041]
【表１】 [Table 1]
【００４２】[0042]
【表２】 [Table 2]
【００４３】〈実施例２〉平均分子量１００００（ＧＰ
ＣでＰＥＧ分子量換算）のキトサン３２０部を４口フラ
スコに取り、バキュームスターラー、三方コック、攪拌
棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付けた。ｐＨ９．５の
炭酸緩衝液５００部を加え、三酸化硫黄・ピリジン錯体
２３８部を少しずつ４時間かけて加え、さらに約１時間
攪拌を続けてキトサンのＮスルホン化を行なった。この
溶液をベンゼンで洗浄した後、濃縮し、スルホン化キト
サン（スルホン化キトサン含量約３０％の濃厚溶液）を
得た。Example 2 Average molecular weight of 10,000 (GP
320 parts of chitosan (converted into PEG molecular weight by C) was placed in a four-necked flask, and a vacuum stirrer, a three-way cock, a stirring rod, a ball stopper, and a rubber septum were attached. 500 parts of carbonate buffer of pH 9.5 was added, and 238 parts of sulfur trioxide / pyridine complex was added little by little over 4 hours, and stirring was continued for about 1 hour to carry out N-sulfonation of chitosan. This solution was washed with benzene and then concentrated to obtain sulfonated chitosan (concentrated solution having a sulfonated chitosan content of about 30%).
【００４４】エチレンジアミン４００部を４口フラスコ
に取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、玉
栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱気、
窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した後、テ
トラヒドロフラン４００部を入れ、室温で攪拌した。次
いで実施例１と同様の方法で得たポリクロロメチルスチ
レン（ＰＣＭＳ）１００部を加え、０℃から徐々に室温
まで反応温度を上げながら、窒素気流気下で５時間攪拌
して反応させた。この反応混合物に５％水酸化ナトリウ
ム水溶液５００部を加え、室温で３０分攪拌した後生成
したポリマーを回収し、水、メタノールで充分に洗浄
し、減圧乾燥した。以上の操作でアミノ基含量０．３ｍ
ｍｏｌ／ｇのアミノ化ポリマー（ＰＳＥＤＡ）を得た。400 parts of ethylenediamine was placed in a four-necked flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball stopper, and a rubber septum were attached, and degassing was performed from the three-way cock.
After nitrogen blowing was repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen, 400 parts of tetrahydrofuran was added and stirred at room temperature. Next, 100 parts of polychloromethylstyrene (PCMS) obtained in the same manner as in Example 1 was added, and the reaction was carried out by stirring for 5 hours under a nitrogen stream while increasing the reaction temperature from 0 ° C. to room temperature. To this reaction mixture was added 500 parts of a 5% aqueous sodium hydroxide solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then the produced polymer was recovered, washed sufficiently with water and methanol, and dried under reduced pressure. Amino group content of 0.3m
Mol / g aminated polymer (PSEDA) was obtained.
【００４５】ＰＥＯ酸＃６０００を２５０部４口フラス
コに取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、
玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱
気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した。
クロロホルム１０００部、ＤＣＣ６．２部を加えて０℃
で約２０分間攪拌した後、上記アミノ化ポリマー（ＰＳ
ＥＤＡ）１００部を加え０℃で３時間、続いて室温で１
２時間窒素気流気下で攪拌して反応させた。生成物を
水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減圧乾燥した。
以上の操作で末端にカルボキシル基を持つスペーサーの
導入されたポリマー（ＰＳＰＥＯ−ＣＯＯＨ）を得た。
カルボキシル基含量は０．２ｍｍｏｌ／ｇであった。250 parts of PEO acid # 6000 was placed in a four-necked flask, and a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod,
A ball stopper and a rubber septum were attached, deaeration from the three-way cock and nitrogen blowing were repeated several times to replace the inside of the container with nitrogen.
Add 1000 parts of chloroform and 6.2 parts of DCC and add 0 ° C.
After stirring for about 20 minutes, the above aminated polymer (PS
100 parts of EDA) was added and the mixture was added at 0 ° C. for 3 hours and then at room temperature for 1 hour.
The reaction was carried out by stirring under a nitrogen stream for 2 hours. The product was thoroughly washed with water, DMF and methanol and dried under reduced pressure.
Through the above operation, a polymer (PSPEO-COOH) into which a spacer having a carboxyl group at the terminal was introduced was obtained.
The carboxyl group content was 0.2 mmol / g.
【００４６】５０部の上記ＰＳＰＥＯ−ＣＯＯＨを４口
フラスコに取り、バキュームスターラー、三方コック攪
拌棒、玉栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックか
ら脱気、窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換し
た。クロロホルム１０００部、ＤＣＣ２．２部を加えて
０℃で約２０分間攪拌した後、スルホン化キトサン（上
記で得た濃厚スルホン化キトサン溶液）５０部を加え０
℃で３時間、続いて室温で１２時間窒素気流気下で攪拌
して反応させた。生成物を５％水酸化ナトリウム水溶
液、水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減圧乾燥し
た。以上の操作でスルホン化キトサン固定吸着材（ＰＳ
ＰＥＯ−Ｃhit.）を得た。このスルホン化キトサン固定
吸着材（ＰＳＰＥＯ−Ｃhit.）を用いて実施例１と同様
に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬの量、
灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白量、血
小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。Fifty parts of the above PSPEO-COOH was placed in a four-necked flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball stopper, and a rubber septum were attached, and deaeration and nitrogen blowing were repeated several times to fill the inside of the container with nitrogen. Replaced. After adding 1000 parts of chloroform and 2.2 parts of DCC and stirring at 0 ° C. for about 20 minutes, 50 parts of sulfonated chitosan (concentrated sulfonated chitosan solution obtained above) was added to 0.
The reaction was carried out by stirring under a nitrogen stream for 3 hours at 0 ° C. and then for 12 hours at room temperature. The product was thoroughly washed with a 5% aqueous sodium hydroxide solution, water, DMF and methanol, and dried under reduced pressure. By the above operation, the sorbed material of sulfonated chitosan (PS
PEO-Chit.) Was obtained. Using this sulfonated chitosan-immobilized adsorbent (PSPEO-Chit.), A blood perfusion experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the amount of LDL in blood before and after the column was measured.
The albumin amount, total protein amount, and platelet amount in whole blood before and after the start of perfusion were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００４７】〈比較例１〉実施例２で得たアミノ化ポリ
マー（ＰＳＥＤＡ）に、スペーサーを介さずに実施例１
と同様の方法でＩｇＹを固定してＩｇＹ固定吸着材（Ｐ
ＳＥ−ＩｇＹ）をえた。このＩｇＹ固定吸着材（ＰＳＥ
−ＩｇＹ）を用いて実施例１と同様に血液灌流実験を行
い、カラム前後の血中ＬＤＬの量、灌流開始前後の全血
液中のアルブミン量、総蛋白量、血小板量を測定した。
結果は表１、表２に示す。<Comparative Example 1> The aminated polymer (PSEDA) obtained in Example 2 was subjected to Example 1 without interposing a spacer.
IgY is fixed in the same manner as in, and the IgY fixed adsorbent (P
SE-IgY) was obtained. This IgY fixed adsorbent (PSE
-IgY) was used to conduct a blood perfusion experiment in the same manner as in Example 1 to measure the amount of LDL in blood before and after the column, the amount of albumin in total blood before and after the start of perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets.
The results are shown in Tables 1 and 2.
【００４８】〈比較例２〉マロン酸５部を４口フラスコ
に取り、バキュームスターラー、三方コック攪拌棒、玉
栓、ラバーセプタムを取り付け、三方コックから脱気、
窒素吹送を数回繰り返して容器内を窒素置換した。クロ
ロホルム５００部、ＤＣＣ３．５部を加えて０℃で約２
０分間攪拌した後、実施例２で得たアミノ化ポリマー
（ＰＳＥＤＡ）５０部を加え０℃で３時間、続いて室温
で１２時間窒素気流気下で攪拌して反応させた。生成物
を水、ＤＭＦ、メタノールで充分洗浄し、減圧乾燥し
た。<Comparative Example 2> 5 parts of malonic acid was placed in a 4-neck flask, a vacuum stirrer, a three-way cock stirring rod, a ball plug and a rubber septum were attached, and degassing was performed from the three-way cock.
The interior of the container was replaced with nitrogen by repeating blowing of nitrogen several times. Add 500 parts of chloroform and 3.5 parts of DCC and add about 2 at 0 ℃.
After stirring for 0 minutes, 50 parts of the aminated polymer (PSEDA) obtained in Example 2 was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 3 hours and then at room temperature for 12 hours under a nitrogen stream to react. The product was thoroughly washed with water, DMF and methanol and dried under reduced pressure.
【００４９】このポリマーに、実施例２と同様の方法で
スルホン化キトサンを固定してスルホン化キトサン固定
吸着材（ＰＳＥ−Ｃhit.）を得た。このスルホン化キト
サン固定吸着材（ＰＳＥ−Ｃhit.）を用いて実施例１と
同様に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬの
量、灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白
量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。Sulfonated chitosan was fixed to this polymer in the same manner as in Example 2 to obtain a sulfonated chitosan fixed adsorbent (PSE-Chit.). Using this sulfonated chitosan-immobilized adsorbent (PSE-Chit.), A blood perfusion experiment was conducted in the same manner as in Example 1, and the amount of LDL in blood before and after the column, the amount of albumin in whole blood before and after the start of perfusion, and total protein were measured. And platelet amount were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５０】〈比較例３〉実施例１で用いたのと同じ１
０％のジビニルベンゼンで架橋された粒状多孔ポリスチ
レン（ＰＳ．平均粒径２５０μｍ、平均孔径８００Å）
を未処理のまま１００ｍｌのカラムに充填し、実施例１
と同様に血液灌流実験を行い、カラム前後の血中ＬＤＬ
の量、灌流開始前後の全血液中のアルブミン量、総蛋白
量、血小板量を測定した。結果は表１、表２に示す。<Comparative Example 3> Same as that used in Example 1
Granular porous polystyrene cross-linked with 0% divinylbenzene (PS. Average particle size 250 μm, average pore size 800Å)
Was untreated and packed in a 100 ml column.
Blood perfusion experiment was performed in the same manner as above, and blood LDL before and after the column
, The amount of albumin in the whole blood before and after the start of perfusion, the amount of total protein, and the amount of platelets were measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５１】上記の結果から明らかなように、本発明に
血液浄化吸着材は血中の特定成分（実施例で示したのは
高脂血症の原因となるＬＤＬ）を選択的かつ簡便に除去
でき、アルブミン、血小板といった他の血中成分に及ぼ
す影響も小さいことがわかった。この理由は次に示す通
りである。すなわち、本発明の血液浄化吸着材は親水性
のスペーサーを介して担体にリガンドが固定されてお
り、このスペーサーの排除体積効果によって良好な血液
適合性が実現される。また、スペーサーの流動性によ
り、リガンドのモービリティーが増加し、吸着能の向上
に貢献している。As is clear from the above results, the blood purification adsorbent according to the present invention selectively and simply removes a specific component in blood (LDL which causes hyperlipidemia in the examples). It was found that the effect on other blood components such as albumin and platelets was small. The reason for this is as follows. That is, in the blood purification adsorbent of the present invention, the ligand is immobilized on the carrier via the hydrophilic spacer, and good blood compatibility is realized by the excluded volume effect of this spacer. In addition, the mobility of the spacer increases the mobility of the ligand, which contributes to the improvement of the adsorption capacity.
【００５２】〈実施例３〉実施例１と同じＩｇＹ１０部
をｐＨ４．５のクエン酸緩衝液２００部に溶解し、ＣＭ
ＥＣ０．５を加えて０℃で２０分攪拌した。固形分を濾
別し、充分に水洗してＩｇＹ固定吸着材ＰＳＰＥＯ−Ｉ
ｇＹ’を得た。このＰＳＰＥＯ−ＩｇＹ’の性能を実施
例１と同様の方法で評価した。結果は表１、表２に示
す。<Example 3> 10 parts of the same IgY as in Example 1 was dissolved in 200 parts of a citrate buffer solution having a pH of 4.5 to prepare CM.
EC0.5 was added and the mixture was stirred at 0 ° C for 20 minutes. The solid content is filtered off, washed thoroughly with water, and the IgY fixed adsorbent PSPEO-I
gY 'was obtained. The performance of this PSPEO-IgY ′ was evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５３】〈比較例４〉実施例２で得たアミノ化ポリ
マー（ＰＳＥＤＡ）に、スペーサーを介さずに実施例３
と同様のほうほうでＩｇＹを固定してＩｇＹ固定吸着材
（ＰＳＰＥＯ−ＩｇＹ’）を得た。このＰＳＰＥＯ−Ｉ
ｇＹ’の性能を実施例１と同様の方法で評価した。結果
は表１、表２に示す。Comparative Example 4 The aminated polymer (PSEDA) obtained in Example 2 was used in Example 3 without a spacer.
IgY was fixed by the same method as described above to obtain an IgY-immobilized adsorbent (PSPEO-IgY ′). This PSPEO-I
The performance of gY ′ was evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Tables 1 and 2.
【００５４】[0054]
【発明の効果】本発明の血液浄化吸着材は良好な血液適
合性を有しているため、あらかじめ血液から血漿成分を
分離して灌流をするという煩雑な方法を採る必要がな
く、血液を直接 流することによって充分な効果が期待
できる。このため、簡便な操作で、血液中の病因物質の
除去による種々の疾病の治療、或いはＢ細胞、Ｔ細胞等
特定成分の選択的は分離に広く利用され得る。EFFECT OF THE INVENTION Since the blood purification adsorbent of the present invention has good blood compatibility, it is not necessary to use the complicated method of separating the plasma component from blood and perfusing in advance, and the blood can be directly absorbed. A sufficient effect can be expected by pouring. Therefore, with a simple operation, it can be widely used for treatment of various diseases by removing pathogenic substances in blood, or selective separation of specific components such as B cells and T cells.
Claims (1)
００のポリアルキレンオキサイドおよびまたはその誘導
体を介して分子量５０００から１００００００のリガン
ドを固定し、このリガンドによって血中の特定成分を除
去または捕集することを特徴とする血液浄化吸着材。Claims: 1. A water-insoluble solid surface having a degree of polymerization of 100 to 5
A blood purification adsorbent characterized in that a ligand having a molecular weight of 5,000 to 1,000,000 is immobilized via a polyalkylene oxide of 00 and / or a derivative thereof, and a specific component in blood is removed or collected by this ligand.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3208647A JPH0523395A (en) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | Blood purifying adsorbent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3208647A JPH0523395A (en) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | Blood purifying adsorbent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0523395A true JPH0523395A (en) | 1993-02-02 |
Family
ID=16559713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3208647A Pending JPH0523395A (en) | 1991-07-24 | 1991-07-24 | Blood purifying adsorbent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0523395A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005037881A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | Affinity resin |
| JP2008202170A (en) * | 2007-02-20 | 2008-09-04 | National Institute For Materials Science | Chitosan matrix, and substrate for cell culture, wound coating material and nerve regenerating material using the same |
| US8020068B2 (en) | 2007-02-08 | 2011-09-13 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Memory system and command handling method |
| CN108586794A (en) * | 2018-05-04 | 2018-09-28 | 南开大学 | The immunosorbent and preparation method thereof of blood perfusion rheumatoid factor |
-
1991
- 1991-07-24 JP JP3208647A patent/JPH0523395A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2005037881A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | Affinity resin |
| US8778613B2 (en) | 2003-10-17 | 2014-07-15 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | Affinity resin |
| US8020068B2 (en) | 2007-02-08 | 2011-09-13 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Memory system and command handling method |
| US8037390B2 (en) | 2007-02-08 | 2011-10-11 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Memory system and command handling method |
| US8205135B2 (en) | 2007-02-08 | 2012-06-19 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Memory system and command handling method |
| JP2008202170A (en) * | 2007-02-20 | 2008-09-04 | National Institute For Materials Science | Chitosan matrix, and substrate for cell culture, wound coating material and nerve regenerating material using the same |
| CN108586794A (en) * | 2018-05-04 | 2018-09-28 | 南开大学 | The immunosorbent and preparation method thereof of blood perfusion rheumatoid factor |
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