JPH05227969A - ウシ成長ホルモン放出因子前駆体および関連のｄｎａ化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ウシ成長ホルモン放出因子（ｂＧＲＦ）、ｂ
ＧＲＦ前駆体、およびリーダーペプチドを随伴するｂＧ
ＲＦ前駆体をコードするＤＮＡ化合物、並びにｂＧＲＦ
前駆体、およびリーダーペプチドを伴うｂＧＲＦ前駆体
ポリペプチド、およびそれらの酸およびカルボン酸付加
塩、並びにｂＧＲＦ前駆体を含有する医薬組成物。 【効果】 このＤＮＡ化合物のいずれかを組み込んだ発
現ベクターを用いて原核性または真核性細胞内でｂＧＲ
Ｆポリペプチドを生産できる。組換え法また他の方法で
得られるポリペプチドは種々の動物の成長ホルモンの放
出誘導に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はウシ成長ホルモン放出因
子および関連のＤＮＡ化合物に関する。

【０００２】

【従来技術と発明が解決すべき課題】成長ホルモン放出
因子（ＧＲＦ）はヒトおよび動物の成長ホルモン産生を
誘導するのに有用である。ウシＧＲＦ（ｂＧＲＦ）は獣
医学の分野での使用において特に有益である。成熟ｂＧ
ＲＦのアミノ酸配列が解明された［エシェら（Ｅｓｃ
ｈ），ＢＢＲＣ １１７：７７２−７７９ （１９８
３）］。しかしながら、本発明以前には、天然のｂＧＲ
Ｆのアミノ酸配列は解明されていなかった。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明は従来不明であっ
た、２つの形のｂＧＲＦ前駆体およびｂＧＲＦペプチド
を含むポリペプチド化合物を提供する。本発明はまた、
本発明のポリペプチド化合物および成熟ｂＧＲＦをコー
ドするＤＮＡ化合物を提供する。

【０００４】本発明はウシ成長ホルモン放出因子をコー
ドするＤＮＡ配列、ｂＧＲＦ前駆体をコードするＤＮＡ
配列、およびｂＧＲＦリーダーペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含む、ＤＮＡ化合物を提供する。また本発明
は、ｂＧＲＦ前駆体および、ｂＧＲＦ前駆体に結合した
ｂＧＲＦリーダーペプチドを含む、ポリペプチド化合物
を提供する。本発明のポリペプチド化合物は式１：

【化７】 または式４：

【化８】 で示される化合物、その薬学上許容し得る酸またはカル
ボン酸付加塩である。本発明のＤＮＡ化合物には成熟ｂ
ＧＲＦ、ｂＧＲＦ前駆体、およびｂＧＲＦリーダーペプ
チドをコードするＤＮＡ配列が含まれる。好ましい成熟
ｂＧＲＦをコードするＤＮＡ配列は、式３：

【化９】 で示される。ｂＧＲＦ前駆体をコードする好ましいＤＮ
Ａ配列は式２：

【化１０】 で示される。リーダーペプチド配列に先行される好まし
いｂＧＲＦ前駆体をコードするＤＮＡ配列は式５：

【化１１】 で示される。

【０００５】本発明はまた、ｂＧＲＦ前駆体を含むポリ
ペプチド化合物を活性成分とする医薬組成物を提供す
る。最後に、本発明は成長ホルモンの放出を誘導する方
法であって、ｂＧＲＦ前駆体を含むポリペプチド化合物
を与えることからなる方法を提供するものである。本発
明の組成物および方法はヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ト
リおよび魚等の種々の動物での成長ホルモンの放出誘導
に有用である。本発明組成物および方法の好ましい使用
対象はウシである。以下に本発明を詳細に説明する。本
明細書に開示し、特許請求している本発明をより明瞭か
つ理解し易くするために、本明細書で使用する語句およ
び略語を以下のごとく定義する。

【０００６】定義 ＧＲＦ：成長ホルモン放出因子活性を有するポリペプチ
ド。 ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ₂：完全な能力に必要なＧＲＦ
の最小部分。 Ｅ．coli（大腸菌）における高レベル発現：クローン化
遺伝子にコードされているＧＲＦ類似体の生産であっ
て、遺伝子産物がクーマシーブルー染色によって検出可
能なレベルでの生産。 単離されたＤＮＡ配列：天然のゲノムＤＮＡ内での位置
とは異なる位置にある、構築または合成されたＤＮＡ配
列。この定義には、天然状態以外のあらゆる形で存在す
る単離されたＤＮＡ配列が包含される。例えば、ＤＮＡ
配列をプラスミドまたはファージベクターに挿入し、あ
るいはそれが由来するまたは他の生物のゲノムに挿入
し、遺伝子用量を増大させる。 成熟ｂＧＲＦ：ｂＧＲＦ（１−４４）；式６：

【化１２】 ｂＧＲＦ前駆体：ｂＧＲＦ（１−７６）；式１：

【化１３】 図面の説明 図面は等尺で記載されていない。図１はプラスミドｐＨ
Ｓ５０７の制限部位および機能地図である。

【０００７】発明の詳しい説明 本発明は成熟成長ホルモン放出因子、ｂＧＲＦ前駆体、
およびｂＧＲＦ前駆体に結合したｂＧＲＦリーダーペプ
チドをコードする、単離されたＤＮＡ化合物を提供する
ものである。本発明はまたポリペプチド化合物を提供す
るものである。成熟ｂＧＲＦの形のアミノ酸構造は既に
決定されているが［エッシェら（Eschet al.）Biochem.
Biophys.Res.Commun.127:772(1983)］ 、本発明は従来
知られていなかったｂＧＲＦ前駆体を提供するものであ
る。本発明は式１で示される前駆体化合物および薬学上
許容される酸またはカルボン酸付加塩を提供する。ｂＧ
ＲＦ前駆体は大腸菌によって高レベルに産生し得る、ｂ
ＧＲＦ活性を持った化合物への当該技術分野の要求を満
たすものであり、特に有用である。化合物は大腸菌内に
おける成熟ＧＲＦの発現が遭遇する重大な分解から免れ
る程度の大きさである［キルシナーら（Kirschner et a
l.） J.Biotech. 12:247, 248 (1989)参照］。

【０００８】本発明の他のポリペプチド化合物は前駆体
のアミノ末端にリーダーペプチドが結合した形のｂＧＲ
Ｆ前駆体である。式４で示される化合物およびその薬学
上許容される酸またはカルボン酸付加塩である。式４の
化合物は哺乳類細胞での生産に特に有用である。リーダ
ーペプチドはポリペプチド生産物を分泌させる。リーダ
ーペプチドの切断は分泌後に起こる。

【０００９】本発明の全ペプチド化合物は固相ペプチド
合成や組換え法等の当該技術分野で周知の化学的方法で
製造され得る。両方法共、本明細書で引用する米国特許
４，６１７，１４９に記載されている。高収率が望まれ
る場合には組換え法が好ましい。あらゆる望ましいＤＮ
Ａ配列の構築のための一般的な方法が引用のブラウンら
[Ｂrown et al., Methods in Enzymology 68:109 (197
9)]によって示された。ＤＮＡ配列はＡＢＳ（Applied Bi
osystems, 850Lincoln Centre Drive, Foster City, CA
94404)等の自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成すること
ができる。ＤＮＡ配列はまたポリメラーゼ鎖反応によっ
ても製造することができる。米国特許公開番号０２５８
０１７、１９８７年３月２日公開、参照。

【００１０】大部分のアミノ酸が１以上のＤＮＡトリプ
レットによってコードされるので、本発明のポリペプチ
ド化合物のアミノ酸配列は複数の異なるＤＮＡ配列によ
ってコードされる。これらの異なるＤＮＡ配列は同じア
ミノ酸配列をコードするので、本発明はこれらの異なる
配列をも包含する。当業者は大腸菌内でのポリペプチド
の発現はメチオニン残基から始まることを知っている。
本発明のポリペプチドはメチオニンから始まらない。従
って、この化合物は幾つかの方法で製造することができ
る。ポリペプチド化合物の発現後、メチオニンまたはメ
チオニンと余分のアミノ酸からなるリーダー配列を周知
の幾つかの方法のいずれかで除去する。例えば米国特許
４，７４５，０６９および４，７８２，１３９；ビラら
（Villa et al.） Eur.J.Biochem. 171:137 (1988);セ
リら（Geli et al.） Gene 80:129 (1989) および欧州
特許公開Ｎo.０１９９０１８参照。

【００１１】他の製造工程も当業者には周知である。例
えば、化合物はＳＶ４０誘導ベクターを用いて真核性細
胞で製造することができる。真核性細胞での発現はｂＧ
ＲＦ前駆体ｃＤＮＡによって達成される。そのような方
法は米国特許４，７７５，６２４に記載されている。幾
つかの発現の変法がサムブルック(J.Sambrook)、フリッ
ツ(E.F.Fritsch)、マニアティス(T.maniatis)のMolecul
ar Cloning : A Laboratory Manual 16.3-17.44 (1989)
に記載されている。サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae)内での遺伝子発現は文献［１Cur
rent Protocolsin Molecular Biology：アウスベル(F.
M.Ausubel）、ブレント（ R.Brent）、キングストン（
R.E.Kingston）、ムーア（ D.D.Moore）、セイドマン
（ J.D.Seidman）、スミス（ J.A.Smith）、ストラール
（ K.Struhl） 1989］に記載されている。本発明のＤＮ
Ａ配列は本発明のポリペプチド化合物および成熟ｂＧＲ
Ｆをコードしている。成熟ｂＧＲＦのアミノ酸配列は既
知であるがそれをコードするＤＮＡは本発明以前は未知
であった。

【００１２】本発明のポリペプチド化合物には、その薬
学上許容される非毒性の酸付加塩およびその薬学上許容
される非毒性のカルボン酸付加塩が包含される。「薬学
上許容される非毒性酸付加塩」という語句は、例えば、
塩酸、フッ化水素酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマ
ル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン
酸、りん酸、クエン酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコ
ルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸等の有機およ
び無機酸付加塩の両方を包含する。好ましくは酸付加塩
は塩酸、酢酸、またはクエン酸から調製される。上記の
塩のいずれも常法に従って調製される。

【００１３】「カルボン酸付加塩」という語句は例え
ば、アミン、アンモニウム、４級アンモニウム、および
カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、リ
チウム等のアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩を含
む。本発明はまた活性成分として、配列式４で示される
ポリペプチド化合物またはその薬学上許容される酸また
はカルボン酸付加塩と、固体または液体担体とを含有す
る医薬組成物を提供する。本発明はまた、配列式４で示
されるポリペプチド化合物またはその薬学上許容される
酸またはカルボン酸付加塩の有効量を投与することから
なる成長ホルモンの放出誘導法を提供する。本発明の前
駆体化合物の用量を成長ホルモンの放出刺激が要求され
る期間、受容体に投与する。受容体の体重および投与の
方式は、特定の応答を誘導するのに必要な用量の規模に
影響を及ぼすであろう。ウシの場合、好ましい用量は約
３mg／日と見積もられる。

【００１４】本発明のポリペプチド化合物の非経口投与
では、注射に適した剤形は滅菌水溶液または分散剤、お
よび滅菌注射溶液または分散剤として再構築することが
できる滅菌粉剤である。担体は水、エタノール、ポリオ
ール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液
状ポリエチレングリコール等）、その適当な混合物、ま
たは植物油等の溶媒または分散媒である。適当な流動性
は、例えば、分散剤の場合、レシチン等によるコーティ
ングにより、必要な粒子径を維持することにより、また
は界面活性剤を用いることで保持し得る。微生物作用か
らの予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、ソルビン酸等の種々の抗細菌または抗真菌性物
質で保証される。多くの場合、糖類、塩化ナトリウム等
の等張化剤を加えることが望ましいであろう。注射用製
剤の長期的な吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニ
ウムおよびゼラチンのような吸収遅延化剤を用いて行う
ことができる。

【００１５】滅菌注射溶液は本発明化合物を、必要量の
適当な溶媒に、所望により様々な他の物質と一緒に導入
することで調製される。所望により、より効率の良い分
布のために、化合物をポリマーマトリクス、リポソー
ム、ミクロスフェアー等の徐放性または標的化デリバリ
ー（到達）システムに組み込んでもよい。化合物は機械
的放出装置、浸透圧ポンプ、または連続的、またはパル
ス的なデリバリーを与える他の放出装置またはシステム
を介して到達させることができる。ペプチド化合物の医
薬投与技術はまだ初期段階なので、この技術分野では重
要な発展が予期される。本発明化合物はこれらの新らし
い方法に有用であろう。

【００１６】投与の容易さと用量の均一化のために本発
明化合物を一回投与剤形に製剤化することが好ましい。
本明細書中、一回投与剤形とは、処置すべき対象のため
の単一用量として物理的に独立した単位を意味する。各
単位は所望の治療効果を産生すると計算された、既定量
の化合物と薬学上許容される担体とを含有する。具体的
な単位用量は直接には（ａ）特定化合物の特有の性質お
よび（ｂ）達成すべき特定の治療効果に基づいて決定さ
れる。以下に実施例を挙げ本発明を説明する。これらの
実施例は本発明の範囲を限定する意図ではない。

【００１７】

【実施例】実施例１ ｂＧＲＦ前駆体の大腸菌内での発現 プラスミドｐＨＳ５０７はＮＲＲＬから、受託番号Ｂ−
１８７６６（寄託日：１９９１年２月９日）の下でＥ．
coli株ＤＨ５α／ｐＨＳ５０７として入手可能である。
ｂＧＲＦ前駆体は本明細書で引用する米国特許４，８２
８，９８８の方法を用いて発現される。

【００１８】実施例２ ｂＧＲＦ前駆体の精製 Ｓ Ｓepharose^R（Pharmacia,800 Centennial Ave., Pis
cataway, NJ 08854）を用いて陽イオン交換カラムを調
製する。カラムは物質５０ｇに対して樹脂１Ｌを含有す
る。流速０.１Ｌ／ｃｍ²／時でカラムにｂＧＲＦ含有物
質を負荷し、２カラム容量の０.０５Ｎ酢酸−７Ｍ尿素
中０.１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄する。それぞれ３カラ
ム容量の酢酸−尿素中０.２５−１.６Ｍ塩化ナトリウム
線状グラジエントを用いてポリペプチドを溶離し、０.
１カラム容量の画分を採取する。ポリペプチド含有画分
を電気伝導度、Ｏ．Ｄ．２７６、ＨＰＬＣ、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって同定する。次いで画分を
プールする。等量の酢酸−尿素溶液を、プールした画分
に加える。次いで、指示通り、酢酸−尿素によって樹脂
１Ｌに対してタンパク質が５０ｇとなるようにした物質
をＳＳepharose^R樹脂を含有するカラムに適用する。流
速は０.０２Ｌ／ｃｍ²／時である。ｂＧＲＦ前駆体画分
を酢酸−尿素中０.２５Ｍ塩化ナトリウム線状グラジエ
ントで溶離する。０.１カラム容量の画分を集める。画
分を前記と同様に分析し前駆体含有画分をプールする。

【００１９】先にプールした画分の５倍容量のカラム容
量で、０.０２Ｍグリシン、ｐＨ２.５中でＳephadex^R
Ｇ−１５（Pharmacia)カラムを調製する。Ｏ．Ｄ．２７
６ピークを含有する画分を単離する。次いで、１０％ア
セトニトリル−０.０２Ｍグリシン、ｐＨ２.５中のＳＰ
２０ＳＳ樹脂（Ｓephabeads, Mitsubishi Chemical, To
kyo)含有カラムを調製する。プールしたｂＧＲＦ前駆体
含有溶液をアセトニトリル中１０％に調製し、流速１.
５−２カラム容量／時でカラムに適用する。カラムを２
カラム容量のアセトニトリル−グリシン緩衝液で洗浄す
る。３カラム容量の５０％アセトニトリル−０.０２Ｍ
グリシンと３カラム容量の１０％アセトニトリル−０.
０２Ｍグリシンとの混合によって形成されるグラジエン
トによって溶離する。０.１カラム容量の画分を採取し
ｂＧＲＦ前駆体に関して分析する。次いで、ｂＧＲＦ前
駆体含有物質を０.２５Ｍ酢酸で平衡化したＳephadex^R
Ｇ−１５カラムでクロマトグラフする。次いでＯ．Ｄ．
２７６ピークを単離し以後の使用まで凍結乾燥してお
く。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＨＳ５０７の制限部位および機
能地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ジン・チャン アメリカ合衆国60616イリノイ州シカゴ、 ウエスト・トゥエンティフォース・プレイ ス318番 (72)発明者 マーク・ルイス・ヘイマン アメリカ合衆国46250インディアナ州イン ディアナポリス、スーザン・ドライブ・イ ースト5740番 (72)発明者 ハンセン・マックスウェル・シウン アメリカ合衆国46032インディアナ州イン ディアナポリス、コール・ポーター・レイ ン4760番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式１： 【化１】 で示されるアミノ酸配列をコードする単離されたＤＮＡ
   配列を含むＤＮＡ化合物。
2. 【請求項２】 式２： 【化２】 で示される請求項１の単離されたＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 式３： 【化３】 で示される単離されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ化合物。
4. 【請求項４】 式１： 【化４】 で示されるポリペプチド化合物。
5. 【請求項５】 式４： 【化５】 で示されるポリペプチド化合物。
6. 【請求項６】 式１： 【化６】 で示されるポリペプチド化合物、またはその薬学的に許
   容し得る酸またはカルボン酸付加塩と、薬学的に許容し
   得る固体または液体担体とを含有する医薬組成物。